AT504157A1 - Verfahren zur herstellung von hydrolysierter stutenmilch - Google Patents

Description

  Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von hydrolysierter Stutenmilch.
Die Geschichte der ernährungsmedizinischen Bedeutung von Stutenmilch reicht bis in das 8. Jahrhundert v. Chr. (Homer beschrieb in der Ilias die Pferdemelker als Hypomologen) . Auch die Skythen (8. bis 3. Jahrhundert v. Chr.), die Mongolen unter Dschingis-Khan (12. Jahrhundert n. Chr.) und verschiedene russische Nomadenstämme verwendeten Stutenmilch und deren Gärprodukt "Kumyss" als Nähr- und Heilmittel. Im 19. und 20. Jahrhundert wurde Stutenmilch in mehreren Dutzenden osteuropäischen Sanatorien zur Therapie immunologischer, dermatologischer und pulmonaler Erkrankungen (Tuberkulose) eingesetzt.

   Insbesondere im Bereich immunologischer (Allergien) und dermatologischer (Neurodermitis, Psoriasis, Akne) Erkrankungen erlebte Stutenmilch während der letzen Jahrzehnte eine naturwissenschaftliche Renaissance und war Inhalt mikrobiologischer, klinisch-analytischer und klinischer Forschungsarbeiten.
Stutenmilch wird - wie eingangs erwähnt - im asiatischen Raum seit Jahrhunderten bei entzündlichen Erkrankungen und als Diätetikum verwendet. Heute ist bekannt, dass die Milch antibakterielle, entzündungshemmende und das Immunsystem aktivierende Inhaltsstoffe enthält. Verschiedene Inhaltsstoffe und immunologisch wirksame Komponenten (u.a. Lysozym, Lactoferrin, sekretorisches IgA) zeigen die bakteriziden Eigenschaften und diätetischen Wirkungen auf.

   Ferner konnte nachgewiesen werden, dass Stutenmilch sich insbesondere auch zur Behandlung von Hautkrankheiten, wie beispielsweise Neurodermitis und Psoriasis, eignet (US 2005/170007). Die im Vergleich zu Milch anderer Tierarten hohe Ähnlichkeit von Stutenmilch mit Muttermilch ermöglicht die Verwendung von Stutenmilch als Muttermilchersatz. Insbesondere das Casein der Stutenmilch gerinnt im Magen analog der Muttermilch weich und flockig und gelangt schnell in den Dünndarm (geringe Belastung des Magens) . Dagegen bildet Kuhmilch feste Gerinnungspartikel, die aufgrund der langsamen Auflösung durch Verdauungssäfte im Magen länger verweilen.
Stutenmilch zeichnet sich gegenüber Kuhmilch durch einen geringeren Gehalt an Trockensubstanz, Fett, Eiweiss und Phosphat, sowie durch einen hohen Gehalt an Milchzucker (Laktose) aus.

   Eine wesentliche Eigenheit der Stutenmilch ist das muttermilchähnliche Verhältnis von Casein: Hauptmolkenproteinen 
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(Albumin/Globulin) von etwa 55:45 gegenüber Kuhmilch von etwa 85:15, zudem gerinnt das Casein bei Säuerung feinflockiger als das der Kuhmilch.
Das Fett der Stutenmilch ist feiner verteilt als in Kuhmilch, die Fettkügelchen sind etwa um ein Drittel kleiner. Diese Eigenschaft und das hinzukommende Vorhandensein von Lecithinen und einer Lipase mit hoher Aktivität sprechen für eine leichte Fettverdaulichkeit und -absorption. Ferner zeichnet sich Stutenmilch aufgrund des hohen Anteils an ungesättigten Fettsäuren aus.
Stutenmilch hat wie alle Albumin-Milcharten einen wesentlich geringeren Säuregrad als Kuhmilch. Das ist in erster Linie auf den sehr geringen Keimgehalt der Stutenmilch zurückzuführen.

   Die Gesamtkeimzahl beträgt in der Regel weniger als 10.000 Keime je ml. Für Kuhmilch, die zu Trinkmilch verarbeitet wird, sind gegenwärtig maximal 100.000 Keime je ml zugelassen.
Die geringe Keimzahl beruht vor allem auf dem kleinen Fassungsvermögen des Euters (2-31) und der häufigen Milchentnahme (2-stündliches Melken bzw. etwa 80 Saugakte je Tag) .
Trotz der geringen Keimzahl in der Stutenmilch ist diese insbesondere aufgrund der vorhandenen ungesättigten Fettsäuren nur bedingt lagerfähig. Um dieses Problem zu umgehen wird Stutenmilch getrocknet und insbesondere in Form von Pulver oder Kapseln produziert. Die Trocknung von Stutenmilch muss aufgrund der Oxidationsempfindlichkeit der ungesättigten Fettsäuren schonend erfolgen. Hierbei werden insbesondere Gefriertrocknung, Sprühtrocknung und Verdampfungstrocknung angewendet.

   Als besonders vorteilhaft für die Herstellung von lagerstabiler Stutenmilch (vorzugsweise bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von mehr als einem Jahr) hat sich die Zugabe einer hochdispersen Matrix herausgestellt (siehe z.B. die AT 393 961) .
Dennoch weisen die im Stand der Technik beschriebenen Stutenmilch-Präparate einige entscheidende Nachteile auf. Einerseits können die in der Stutenmilch vorhandenen Proteine Milchund Protein-Unverträglichkeiten bzw. -Allergien auslösen. Andererseits weist Stutenmilch einen Eigengeruch auf, der viele Konsumenten davon abhält Stutenmilchpräparate zu konsumieren bzw. zu sich zu nehmen.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung Stutenmilchpräparate bzw. Verfahren zur Herstellung derartiger Präparate zur Verfügung zu stellen, die die Nachteile des Standes der Technik nicht aufweisen.

   Insbesondere sollen Stutenmilchpräparate zur Verfügung gestellt werden, die zu keiner allergischen Reaktion bei der Verabreichung führen, aber dennoch die vorteilhaften Eigenschaften von natürlicher Stutenmilch und herkömmlichen Stutenmilchpräparaten aufweisen. Ferner, obwohl Stutenmilch im Vergleich zu z.B. Kuhmilch bekannt ist besser verdaulich zu sein, besteht durchaus noch Bedarf die Verdaulichkeit und Bekömmlichkeit zusätzlich zu verbessern.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von hydrolysierter Stutenmilch umfassend die Schritte:
- Bereitstellen einer Stutenmilch und
- Inkubieren der Stutenmilch mit mindestens einer Protease.
Es hat sich überraschenderweise herausgestellt, dass Stutenmilch mit Hilfe von Proteasen inkubiert bzw. behandelt werden kann, ohne dass die an sich bekannten Eigenschaften von Stutenmilch bzw.

   Stutenmilchpräparaten negativ beeinflusst werden. Durch die Inkubation von Stutenmilch mit Proteasen können die in der Milch enthaltenen Proteine gespalten werden. Entsprechend den gewählten Inkubationsbedingungen, die einerseits abhängig sind von den eingesetzten Proteasen (z.B. Temperaturoptimum, pHOptimum usw.) und andererseits von den gewünschten Produkteigenschaften (z.B. Beibehaltung der ungesättigten Fettsäuren usw.), kann die Stutenmilch einen unterschiedlichen Hydrolisierungsgrad aufweisen. Bereits ein Hydrolysierungsgrad von mindestens 10%, vorzugsweise von mindestens 20%, noch mehr bevorzugt von mindestens 30%, am meisten bevorzugt von mindestens 40%, insbesondere von mindestens 50%, ist erfindungsgemäss ausreichend um "hydrolysierte" Stutenmilch zu erzeugen.

   Der Hydrolisierungsgrad der in der Stutenmilch vorhandenen Proteine bezieht sich auf eine nicht mit Proteasen behandelte, vorzugsweise native, Stutenmilch. Dieser Wert kann in einfacher Weise mit im Stand der Technik bekannten Verfahren bestimmt werden (z.B. Elektrophorese, insbesondere SDS-PAGE) .
Herkömmliche Hydrolyseverfahren, wie z.B. die saure Hydrolyse, sind zur Aufspaltung der Stutenmilch-Proteine nur bedingt geeignet, da sie einerseits den Geschmack der Stutenmilch stark verändern, andererseits durch die starken pH-Änderungen die nativen Enzyme der Stutenmilch zerstören. Proteasen, die weitge hend im pH-Bereich nativer Stutenmilch aktiv sind, entfalten ihre hydrolytischen Aktivitäten während der Inkubation, aber auch im Zuge weiterer Verarbeitungsschritte, wie z.B. während Evaporationsprozessen.

   Ferner sind Proteasen, insbesondere pflanzliche Proteasen, als Lebensmittel gängig und verkehrsfähig. Das hydrolisierte Endprodukt weist auch organoleptische (geruchliche, geschmackliche) Vorteile auf.
Im Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung wird zumindest eine Protease verwendet, wobei es aber durchaus auch möglich ist mindestens zwei, drei, vier, fünf, sechs oder sieben unterschiedliche Proteasen zu verwenden.
Durch die Verwendung von Proteasen im erfindungsgemässen Verfahren werden hydrolysierte Stutenmilchpräparate hergestellt, die neben den zumindest teilweise hydrolysierten Stutenmilchkomponenten Proteasen enthalten, sofern diese nicht nach der Inkubation, z.B.

   chromatographisch, entfernt werden.
Im erfindungsgemässen Verfahren können Proteasen jeglicher Art verwendet werden, wobei diese jedoch vorzugsweise ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Serinproteasen, Threoninproteasen, Cysteinproteasen, Aspartatproteasen, Metalloproteasen und Glutamatprotease.
Im gegenständlichen Verfahren können selbstverständlich auch unterschiedliche Kombinationen von Proteasen eingesetzt werden.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Protease pflanzlichen, tierischen oder mikrobiellen Ursprungs.
Die im Verfahren verwendeten Proteasen können aus unterschiedlichen Quellen stammen, wobei es aber besonders bevorzugt ist pflanzliche Proteasen zu verwenden, da diese an sich in der Regel keinen gesetzlichen Beschränkungen unterliegen und selbst als Nahrungsmittel bzw.

   Nahrungsergänzungsmittel angesehen werden.
Die Proteasen pflanzlichen Ursprungs sind vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Papain, Bromelain, Ficin und Kombinationen davon.
Besonders bevorzugt werden im erfindungsgemässen Verfahren Papain und/oder Bromelain verwendet.
Der getrocknete Milchsaft (Latex) unreifer Papayas enthält neben Papain (3 Untereinheiten) auch das säurestabilere Chymopapain (4 Untereinheiten) . Ähnliche pflanzliche Enzyme sind das Bromelain aus Ananas und das Ficin aus Feigen.
Papain ist eine Endopeptidase (EC 3.4.22.2), die aus 211 Aminosäuren besteht und zur Klasse der Thiolproteasen gehört.

   Papain hat eine breite Substratspezifität, wobei aber Arg oder Lys in Pl Position bevorzugt gespalten werden.
Auf Grund seiner hohen Temperatur- und pH-Stabilität wird Papain in vielen biotechnologischen Prozessen verwendet (z.B. als Fleischzartmacher in der Lebensmittelindustrie, zur Klärung von Getränken, als Eiweissfleckenentferner in der Waschmittelindustrie sowie in der Lederindustrie und bei der Herstellung von Zahnprothesereinigern) .
Die Proteasen tierischen Ursprungs sind vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Trypsin, Pepsin, Chymotrypsin und Kombinationen davon.
Gemäss einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Protease mikrobiellen Ursprungs Nattokinase.
Unter Proteasen mikrobiellen Ursprungs werden erfindungsgemäss Proteasen subsumiert, die aus Mikroorganismen, wie z.B.

   Bakterien, Pilzen und Hefen, isoliert werden können und in diesen Organismen natürlicherweise vorkommen. D.h. Proteasen aus anderen Organismen (z.B. aus Tieren oder Pflanzen), die in Mikroorganismen rekombinant hergestellt werden, werden erfindungsgemäss nicht als Proteasen mikrobiellen Ursprungs angesehen.
Die im erfindungsgemässen Verfahren verwendeten Proteasen können entweder rekombinant hergestellt werden oder natürlichen Ursprungs sein.
Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Polypeptiden und Proteinen, insbesondere von Proteasen, sind dem Fachmann hinreichend bekannt (siehe z.B. Sambrook, J. et al. Molecular Cloning 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001) . Bevorzugte Wirtszellen, in denen die erfindungsgemässen Proteasen exprimiert werden, sind bakterielle Zellen (z.B. E. Coli, B. Subtilis), Hefezellen (z.B. P. Pastoris, H.

   Polymorpha) , tierische Zellen in Zellkulturen und Insektenzellen (z.B. Baculovirus-System) . Selbstverständlich ist es bei der rekombinanten Herstellung auch möglich am C- oder N-Terminus der Proteasen Peptide und Polypeptidfragmente vorzusehen, die eine Reinigung der Proteasen aus einem Zellkulturüberstand oder aus den Zellen ermöglichen. 
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Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die mindestens eine Protease in einer Menge von 0,1 bis 10g, vorzugsweise von 0,2 bis 5g, noch mehr bevorzugt von 0,3 bis 2g, besonders bevorzugt von 0,4 bis lg, pro Liter Stutenmilch zugesetzt.
Die Menge der mindestens einen Protease, die im erfindungsgemässen Verfahren eingesetzt wird, kann variieren und richtet sich vorzugsweise anhand der gewählten Reaktionsbedingungen (z.B. Inkubationstemperatur in der Nähe des Temperaturoptimums der Protease) .

   Soll beispielsweise die Inkubationszeit kurz gehalten werden, wird vorzugsweise eine höhere Menge an Enzym eingesetzt.
Die Inkubation der Stutenmilch mit der mindestens einen Protease erfolgt vorzugsweise für mindestens 30 Minuten, vorzugsweise für mindestens 1 Stunde, noch mehr bevorzugt für mindestens 2 Stunden, besonders bevorzugt für mindestens 5 Stunden, insbesondere für mindestens 10 Stunden.
Die Inkubationsdauer der Protease mit der Stutenmilch hängt insbesondere von der Art der Protease, der Menge der eingesetzten Protease, der Inkubationstemperatur und der gewünschten Hydrolyserate ab.
Gemäss einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der pH-Wert vor der Inkubation der Stutenmilch mit der mindestens einen Protease in einen Bereich von 4 bis 9, vorzugsweise in einen Bereich von 5 bis 8, eingestellt.
Der pH-Wert, der im Zuge bzw.

   vor der Inkubation eingestellt wird, richtet sich insbesondere nach dem pH-Optimum und der pHStabilität der Proteasen bzw. der Stutenmilch.
Um die hydrolysierte Stutenmilch haltbar zu machen, insbesondere um deren oxidationsempfindliche Inhaltsstoffe zu konservieren, wird nach oder während des Inkubierens der Stutenmilch mit der mindestens einen Protease das Gemisch getrocknet. Die enzymatischen Reaktionen der eingesetzten Proteasen können selbstverständlich noch im Zuge der Trocknung vonstatten gehen.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Trocknung durch Evaporation, vorzugsweise durch Evaporation unter vermindertem Atmosphärendruck, insbesondere durch Evaporation unter Vakuum.
Stutenmilch und hydrolysierte Stutenmilch umfassen oxidationsempfindliche Substanzen, wie z.B. ungesättigte Fettsäuren.

   Um die Oxidation derartiger Stoffe zu verhindern bzw. weitestgehend zu unterdrücken, wird die Trocknung vorzugsweise unter reduzierter Sauerstoffatmosphäre durchgeführt.
Die Trocknung erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur von weniger als 80[deg.]C, vorzugsweise von weniger als 70[deg.]C, besonders bevorzugt von weniger als 60 [deg.]C, noch mehr bevorzugt von weniger als 50[deg.]C, insbesondere von weniger als 40[deg.]C.
Um die Inhaltsstoffe der hydrolysierten Stutenmilch zu schonen, erfolgt die Trocknung vorzugsweise bei einer Temperatur von weniger als 80[deg.]C.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird vor der Trocknung die hydrolysierte Stutenmilch mit einer hochdispersen Matrix, vorzugsweise mit hochdispersem Siliziumdioxid,

   versetzt.
Wird beispielsweise die hydrolysierte Stutenmilch bei einer Temperatur von unter 40[deg.]C und unter Sauerstoff-Ausschluss, um das in der Milch enthaltene Wasser zu entfernen, getrocknet und somit aufkonzentriert, entsteht aufgrund des Gehaltes an niedermolekularen Oligosacchariden, Oligopeptiden sowie hochwertigen Ölen ein Stutenmilch-Konzentrat mit einer viskos-amorphen Masse, die in dieser Form galenisch nur schwer weiterverarbeitbar wäre.

   Um diesen technologischen Nachteil auszugleichen, wurde beispielsweise in der AT 393 961 offenbart, dass Stutenmilch vor einer Vakuum-Destillation mit inertem, hochdispersem Siliciumdioxid (Kieselerde) als Trägermatrix versetzt werden soll, sodass sich nach der Vakuum-Destillation ein kristallines, pulveriges Trockenkonzentrat ergibt.
Diese Stutenmilch-Trockenkonzentrate mit hochdisperser Matrix wurden somit entwickelt, um das Herstellungsverfahren unter Beibehaltung der hochwertigen Inhaltsstoffe zu vereinfachen, sowie auch um die Stutenmilch über längere Zeit hinweg lagern zu können, ohne dass es zu Qualitätsverlusten kommt.

   Durch das Siliciumdioxid erhält das Produkt weiters eine verbesserte Rieselfähigkeit.
Durch die auf diese bevorzugte Weise getrocknete Stutenmilch ist es möglich, die Temperatur-und Sauerstoff-empfindlichen Inhaltsstoffe, insbesondere die Fettsäuren, schonend und ohne Verluste zu konzentrieren und zu trocknen, so dass die hochwertigen Inhaltsstoffe temperaturschonend getrocknet werden. Dadurch wird ein Stutenmilchkonzentrat zur Verfügung gestellt, dass nicht nur eine maximale biologische Wertigkeit aufweist, sondern bei Raumtemperatur lagerstabil ist und sich überraschenderweise besser als die herkömmlichen Präparate zur Behandlung von Hauterkrankungen eignet.

   Im Vergleich beispielsweise zu einer Behandlung mit sprühgetrockneter Stutenmilch tritt bei der erfindungsgemässen Verwendung eine Besserung des Krankheitsverlaufes rasch ein und die Heilung dauert auch länger an.
Unter dem Begriff "hochdisperse Matrix" kann erfindungsgemäss eine Matrix mit grosser Oberfläche von zumindest 50m<2>/g verstanden werden. Dabei ist es wichtig, dass die Matrix biologisch inert ist, sodass die Stutenmilch chemisch nicht verändert wird und so an biologischer Wertigkeit verliert. Dadurch, dass die Stutenmilch auf der hochdispersen Matrix getrocknet wird, wird erreicht, dass die Stutenmilchtröpfchen auf den Matrixteilchen fein verteilt angelagert werden und es zu einer für eine schonende Trocknung wichtigen optimalen feinen Oberflächenverteilung der Milch kommt. Die Milch wird somit auf möglichst geringem Volumen möglichst stark verteilt.

   Dadurch wird die Milch rasch und unter sanften Bedingungen getrocknet und kann in hoher Konzentration lagerstabil zur Verfügung gestellt werden. Durch die Matrix wird nicht nur eine feine Verteilung der Milch auf einer möglichst grossen Oberfläche erreicht, sondern die Matrix bietet auch einen gewissen Schutz vor anderen Stoffen, die die empfindlichen Inhaltsstoffe der Milch, beispielsweise die ungesättigten Fettsäuren, angreifen.

   Die Milch kann beispielsweise durch Aufsprühen auf die hochdisperse Matrix aufgebracht werden.
Gemäss einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird vor und/oder nach der Inkubation der Stutenmilch mit der mindestens einen Protease zumindest ein Antioxidans, vorzugsweise Ascorbinsäure, Ascorbate, Ascorbinsäureester, Tocopherole, insbesondere [alpha]-Tocopherol, zugesetzt.
Um die Wertigkeit und Anwendungsmöglichkeiten der mit dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten hydrolysierten Stutenmilch zu steigern bzw. zu erweitern, können weitere Stoffe im Zuge des Verfahrens zugesetzt werden.
Die getrocknete hydrolysierte Stutenmilch wird vorzugsweise vermählen und gegebenenfalls abgepackt. Durch einer der Trocknung nachgeschaltene Vermahlung kann die Korngrösse des Stutenmilchpulvers verändert und den weiteren Verarbeitungsschritten (z.B.

   Tablettierung, Einfüllen in Kapseln) angepasst werden. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft hydrolysierte Stutenmilch oder hydrolysiertes Stutenmilchpulver erhältlich nach dem erfindungsgemässen Verfahren.
Die hydrolysierte Stutenmilch, die nach dem erfindungsgemässne Verfahren bzw. durch Inkubation von Stutenmilch mit Proteasen hergestellt werden kann, beinhaltet dieselben hochwertigen Inhalststoffe (wie z.B. ungesättigte Fettsäuren) wie native Stutenmilch. Ferner werden durch die Hydrolyse mit Proteasen die in der Stutenmilch nativ vorkommenden Proteine gespalten, so dass das allergene Potential nativer Stutenmilch teilweise bzw. bis zur Gänze reduziert werden kann.

   Das durch das erfindungsgemässe Verfahren gewonnene Stutenmilchtrockenkonzentrat weist ferner eine Haltbarkeit von mehr als 24 Monaten, insbesondere von 24 bis 36 Monaten, auf. Überraschenderweise verschwand nach dem Hydrolyse-Verfahren auch der (bei herkömmlichen Stutenmilch-Präparaten übliche) typische penetrante Geruch und Geschmack.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäss hergestellten hydrolysierten Stutenmilch als Lebensmittel, insbesondere als flüssiges, festes oder pastöses Lebensmittel, als Nahrungsergänzungsmittel, als Arzneimittel oder als kosmetische Präparation.
Hydrolysierte Stutenmilch kann aufgrund ihrer Eigenschaften beispielsweise als Lebensmittel bzw. Nahrungsmittel für Säuglinge (als Muttermilchersatz) verwendet werden.

   Auch eignet sich das erfindungsgemässe Lebensmittel zum Verzehr durch Menschen, die eine Proteinunverträglichkeit gegen Proteine beispielsweise der Kuhmilch aufweisen.
Stutenmilch kann ferner als Nahrungsergänzungsmittel bzw. Arzneimittel z.B. in Form von Kapseln oder Salben verwendet werden. Es ist nämlich bekannt, dass Stutenmilch beruhigend auf Hautreizungen und -rötungen (somit auch als kosmetische Präparation), aber auch immunstimulierend wirkt. Auch ist bekannt Stutenmilch z.B. gegen Psoriasis und Neurodermitis zu verwenden (siehe z.B.

   WO 03/090728).
Die vorliegende Erfindung wird weiters anhand der folgenden Figuren und Beispiele erläutert, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein.
Fig. 1 zeigt die Zusammensetzung der einzelnen Versuchsansätze.
Fig. 2 zeigt ein SDS-PAGE Gel mit Stutenmilchpulver und mit 
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Papain hydrolysiertem Stutenmilchpulver (2 und 10 h Trocknungszeit) .
Fig. 3 zeigt ein SDS-PAGE Gel mit Stutenmilchpulver und mit Papain bzw. Bromelain hydrolysiertem Stutenmilchpulver.
Fig. 4 zeigt ein Nativ-PAGE Gel mit Stutenmilchpulver und mit Papain bzw. Bromelain hydrolysiertem Stutenmilchpulver.
Fig. 5 zeigt ein Nativ-PAGE Gel mit Stutenmilchpulver und mit Papain bzw. Bromelain hydrolysiertem Stutenmilchpulver.
Fig. 6 zeigt eine BSA-Standardkurve zur Proteinbestimmung.
BEISPIEL:
1 . 1 . Hydrolyse und Trocknung:
Die Milchhydrolyse von Stutenmilch wurde mit pflanzlichen Hydrolasen durchgeführt.

   Es wurden mehrere Ansätze mit unterschiedlichen pflanzlichen Enzymmengen (Papain- bzw. Bromelainengen) und Hydrolysezeiten getestet.
Die im Beispiel untersuchten Enzyme Papain und Bromelain werden als Lebensmittel betrachtet und bedürfen im allgemeinen keiner weiteren toxikologischen Prüfung.
Die Trocknungstemperatur überstieg 40[deg.]C nicht, wodurch gewährleistet war, dass die Proteine bzw. die entstehenden niedermolekularen Proteine, Polypeptide bzw. Peptide der Stutenmilch in nativer Form bestehen bleiben und die natürlichen Eigenschaften der Stutenmilch möglichst wenig verändert wurden.
Der Hydrolysegrad wurde durch die Dauer der Hydrolyse und durch späteres Einbringen der Enzymlösung und/oder durch die Zugabe unterschiedlicher Enzymmengen variiert.
Im Detail wurde die Hydrolyse wie folgt durchgeführt.

   Die Stutenmilch wurde langsam aufgetaut und 250 ml in einen Birnenkolben überführt. Anschliessend wurde nach dem Hinzufügen der jeweiligen Enzymmenge (0,8g/l Stutenmilch) das Gemisch am Rotavapor (Rotavapor Water Bath Büchi 461) bei max. 40[deg.]C getrocknet. Die Reaktionszeit wurde mit dem Vakuum geregelt, sprich die Trocknung erst durch Anlegen eines Vakuums gestartet. Die Enzymeinheiten im Versuchsansatz betrugen für Papain 1920 FIP-Units/1 und für Bromelain 384 FIP-Units/1.
Nach dem Trocknen wurde das erhaltende Stutenmilchpulver bzw. Stutenmilchhydrolysat vermählen (händisch mittels Mörser) und in dunkle Fläschchen abgefüllt.
Für die weiteren Untersuchungen wurden Lösungen aus dem Stutenmilchpulver bzw. Stutenmilchhydrolysatpulver hergestellt. Im vorliegenden Beispiel wurden insgesamt 6 Ansätze hergestellt (siehe Fig. 1) .

   Als Ausgangsbasis dienten jeweils 250 ml Stutemilch. Bei dem Ansatz A handelt es sich um reines Stutenmilchpulver, welches nicht hydrolysiert wurde und als Referenz mitgeführt wurde.
Die Trocknungsdauer wurde auf ca. 2,5 Stunden eingestellt. Um zu sehen, wie und ob sich der Hydrolysegrad der Milch mit zunehmender Dauer der Trocknung verändert, wurde die Probe C 10 Stunden getrocknet bzw. die Trocknung nach 7,5 Stunden aktiviert.
Die 6 Ansätze in Pulverform wurden für die Gelelektrophoresen in dest. Wasser gelöst.
1 . 2. SDS-Pa[sigma]e
Acrylamid/Bis (30%T, 2,67%C, 1:37,5):
146,0 g Acrylamid 4,0 g Bis mit dest. Wasser auf 500 rnL, filtrieren und im Dunkeln bei 4[deg.]C lagern.
1,5 M Tris-HCl, pH 8,8 (Trenngelp.)
54,45 g Tris-Base
120 mL dest. Wasser mit 6 N HCI auf pH 8,8 einstellen; mit dest.

   Wasser auf 300 mL auffüllen
0,5 M Tris-HCl, pH 6,8 (Sammelgelp.)
6, 00 g Tris-Base
60 mL dest. Wasser mit 6 N HCI auf pH 6,8 einstellen; mit dest. Wasser auf 100 mL auffüllen
10% ( /v) Ammonpersulfat (APS):
50 mg Ammonpersulfat 500 [mu]L dest. Wasser
Stock-2xSB:
2,0 mL 0,5 M Tris-HCl pH 6,8
1,6 mL Glycerin (20%)
3,2 mL 15% SDS (6%)
0,4 L 0,5% (w/v) Bromphenolblau
5x Running buffer pH 8,3:
15, 15 g Tris-Base
72,0 g Glycin
5,00 g SDS mit dest. Wasser auf 1000 mL; pH-Wert nicht einstellen; bei 4[deg.]C lagern und vor Gebrauch 1:5 verdünnen.
Ix Running buffer pH 8,3:
160 mL 5x Running buffer pH 8,3 640 L dest. Wasser
2x Sample buffer:
900 [mu]L Stock-2XSB
100 [mu]L ss-Mercaptoethanol
10% (w/v) SDS:
1,0 g SDS
10 mL dest. Wasser
N,N,N'^'-Tetramethyl-ethyIendiamin (TEMED)
Die SDS-PAGE Gele wurden wie folgt hergestellt:
Trenngel Sammelg.
Monomerkonz. 15% 4%
 <EMI ID=11.1> 
dest.

   Wasser 2,29 mL 2,97 mL Trenngel Sammelg.
1,5 M Tris-HCl 2,50 mL -
0,5 M Tris-HCl - 1250 [mu]L
Acrylamid/Bis 5,00 mL 670 [mu]L
10% (w/v) SDS 100 [mu]L 50 [mu]L
10% APS 100 [mu]L 50 [mu]L
 <EMI ID=12.1> 
TEMED 10 [mu]L 10 [mu]L
Nach dem Giessen des Trenngels wurde es mit ein wenig 2-Butanol überschichtet, damit eine Trenngellinie zustande kam. Das Gel wurde etwa 30-45 min polymerisiert. Danach wurde das Butanol entfernt, mit dest. Wasser gespült und die Zone für das Sammelgel mit Filterpapier trockengesaugt.
Im nächsten Schritt wurde das Sammelgel mit einer Höhe von 1 cm gegossen und die Kämme mit 10 Slots eingesetzt. Die Polymerisationszeit des Sammelgels belief sich auf ca. 30-45 min.
Nach dem Entfernen des Kammes wurde die Elektrophorese-Apparatur zusammengestellt.
Die Gele wurden in die Elektrophoresekammer gestellt und mit 1 x Laufpuffer aufgefüllt.

   Die Proben wurden in gleichem Volumen 2x Sample buffer aufgenommen, und ca. 4 min bei 95[deg.]C erhitzt und danach ca. 1 min zentrifugiert . Die Proben wurden mittels einer Hamilton-Spritze von links nach rechts aufgetragen.
Anschliessend wurde Spannungsquelle bei const. 200 V und max. 70 mA pro Gel angelegt.
Um später die Richtung des Probenauftragens nachvollziehen zu können, wurde die linke Ecke des Gels abgeschnitten bzw. markiert.
Anschliessend wurde das Gel einer Färbung (vorzugsweise einer Coo massie-Färbung) zugeführt.
Um die entstehenden Banden den einzelnen Stutenmilchproteinen zuweisen zu können, ist ein SDS-PAGE Marker mitgelaufen. Dieser setzte sich zusammen aus Myosin (Kaninchenmuskel, 205,0 kDa) , beta-Galactosidase (E.

   Coli, 116,0 kDa) , Phosphorylase b (Kaninchenmuskel, 97,0 kDa), Fructose-6-phosphat-Kinase (Kaninchenmuskel, 84,0 kDa), Albumin (Rinderserum, 66,0 kDa), Glutamat-Dehydrogenase (Rinderleber, 55,0 kDa), Ovalbumin (Hühnerei, 45,0 kDa), Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (Kaninchenmuskel, 36,0 kDa), Carboanhydrase (Rindererythrocyten, 29,0 kDa), Trypsinogen (Rinderpankreas, 24,0 kDa), Trypsin-Inhibitor (Sojabohne, 20,0 kDa), alpha-Lactalbumin (Rindermilch, 14,2 kDa) und Aprotinin (Rinderlunge, 6,5 kDa).
Es wurden Stammlösungen mit möglichst gleichen Konzentrationen hergestellt, damit eine semi-qualitative Interpretation der Gele (siehe Fig. 2) ermöglicht wird.
Bandennr:

   Ansatz Bandenbeschreibung von Figur 2
1 SDS Marker
Stutenmilchpulver (eingetrocknet mit Rotava[not]
2 A por)
Stutenmilchpulver hydrolysiert mit Papain Dau[not]
3 B er bis zur Eintrocknung ca.2 h
Stutenmilchpulver hydrolysiert mit Papain Dau[not]
4 C
 <EMI ID=13.1> 
er bis zur Eintrocknung ca. 10 h
Auf der Bahn 1 ist der SDS Marker gelaufen. Dieser ermöglicht eine eindeutige Zuteilung von den Banden und den jeweiligen Proteinen.
Die hochmolekularen Immunglobuline, welche einen geringen Prozentteil ausmachen, und Serumalbumin sind am oberen Ende des SDS-Gels aufzufinden.
Im Mittelfeld sind die Caseine zu finden. Die Caseine stellen mit ca. 55 Prozent den grössten Anteil dar, gefolgt von den Molkenproteinen, die am unteren Teil des Gels zu finden sind, mit ca. 40 Prozent.
Auf Bahn 2 wurde in dest.

   Wasser gelöstes Stutenmilchpulver aufgetragen.
Auf Bahn 3 wurde Stutemmilchhydrolysat aufgetragen, wobei erkennbar ist, dass die Caseinbanden deutlich abgenommen haben.
Bei der Bahn 4 handelt sich um Stutenmilch die 10 h hydrolysiert wurde, hier kommt es zu einer weiteren Verminderung der Caseinbanden bzw. sind keine eindeutigen Banden mehr erkennbar.
Eine weitere SDS-PAGE wurde mit allen 6 Ansätzen durchgeführt (siehe Fig. 3) :
Bandennr: Ansatz Bandenbeschreibung von Figur 3
1 F Stutenmilchpulver + 0,2g Bromelain Dauer ca.2, 5 h
 <EMI ID=13.2> 
2 E Stutenmilchpulver + 0,2g Papain pH 8 (NH3)ca.2,5 h 
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Bandennr:

   Ansatz Bandenbes[sigma]hreibung von Figur 3
3 D Stutenmilchpulver + 0,2g Papain Dauer ca.2, 5 h
4 SDS Marker
5 A Stutenmilchpulver (eingetrocknet mit Rotavapor)
6 B Stutenmilchpulver + 0,2g Papain Dauer ca. 2,5 h
7 C Stutenmilchpulver + 0,2g Papain Dauer ca. 10 h
Stutenmilchpulver (eingetrocknet mit Rotavapor)
8 A 1 : 2 verdünnt
Stutenmilchpulver + 0,2g Papain Dauer ca. 2,5 h
9 B -1:2 verdünnt
Stutenmilchpulver + 0,2g Papain Dauer ca. 10 h -
10 C
 <EMI ID=14.1> 
1 : 2 verdünnt
1.3. Nativ-PAGE:
Acrylamid Bis (30%T, 2,67%C, Vernetzungsgrad 1:37,5):
146,0 g Acrylamid 4,0 g Bis mit dest. Wasser auf 500 mL, filtrieren und im Dunkeln bei 4[deg.]C lagern.
1,5 M Tris-Citrat, pH 8,8 (Trenngelpuffer.)
54, 45 g Tris-Base
120 mL dest. Wasser mit Citronensäure-Kristallen auf pH
8, [delta]einstellen; mit dest.

   Wasser auf 300 mL auffüllen bei 4[deg.]C lagern.
0,5 M Tris-HCl, pH 6,8 (Sammelgelp.)
6,00 g Tris-Base
60 mL dest. Wasser mit Citronensäure-Kristallen auf pH
6,8 einstellen; mit dest. Wasser auf 100 mL auffüllen. bei 4[deg.]C lagern.
10% (w/v) Ammonpersulfat (APS):
50 mg Ammonpersulfat 500 [mu]L dest. Wasser
Saccharose
2,0 mL 0,5 M Tris-HCl pH 6,8
1,6 mL Glycerin (20%)
3,2 mL 15% SDS (6%)
0,4 mL 0,5% (w/v) Bromphenolblau
5x Running buffer pH 8,3:
15,15 g Tris-Base
72,0 g Glycin mit dest. Wasser auf 1000 mL; pH-Wert nicht einstellen; bei 4[deg.]C lagern und vor Gebrauch 1: verdünnen.
Ix Running buffer pH 8,3
1 16600 mmLL 55xx RRuuinnning buffer pH 8,3 664400 mmLL ddeesstt.. Wasser
Bromphenolblau
N-NjNSN'-Tetramethyl-ethylendiamin ^EMED) 
Die Nativ-PAGE Gele wurden wie folgt hergestellt:
Trenngel Sammelg.
Monomerkonz. 15% 4% dest.

   Wasser 2,39 mL 3,02 mL l,5MTris-CitratpH 2,50 mL 8,8
0,5MTris-CitratpH - 1250 [mu]L 6,8
Acrylamid/Bis 5,00 mL 670 [mu]L
10% APS 100 [mu]L 50 [mu]L
TEMED 10 [mu]L 10 [mu]L
 <EMI ID=15.1> 
Total 10,0 mL 5,0 mL
Die Herstellung und die Verwendung der Nativ-PAGE Gele erfolgt analog zu den SDS-PAGE Gelen.
Eine Nativ-PAGE wurde mit allen folgenden Ansätzen durchgeführt (siehe Fig. 4 und Fig. 5, bei der die Proben 1:5 verdünnt wurden) :
Bandennr :

   Ansatz Bandenbeschreibung von Figuren 4+5
1 A Stutenmilchpulver (eingetrocknet mit Rotavapor)
2 B Stuten ilchpulver + 0,2g Papain Dauer ca. 2,5 h
3 C Stutenmilchpulver + 0,2g Papain Dauer ca. 10 h
4 SDS Marker
5 D Stutenmilchpulver + 0,2g Papain Dauer ca.2, 5 h
6 E Stutenmilchpulver + 0,2g Papain pH 8 (NH3)ca.2,5 h
7 F Stutenmilchpulver + 0,2g Bromelain Dauer ca.2, 5 h
Stutenmilchpulver (eingetrocknet mit Rotavapor)
8 = 1 A 1 : 2 verdünnt
9 = 2 B Stutenmilchpulver + 0,2g Papain Dauer ca. 2,5 h
 <EMI ID=15.2> 
10 = 3 C Stutenmilchpulver + 0,2g Papain Dauer ca. 10 h
1.4. Proteinbestimmung nach Bradford
Die Bestimmung beruht auf der Beobachtung, dass das Absorptionsmaximum für eine saure Coomassie Brilliant Blue G-250 Lösung von 465 nm nach 595 nm wandert, wenn eine Bindung an ein Protein erfolgt.

   Der Farbstoff bindet primär an basische (im speziellen Arginin) und aromatische Aminosäure-Reste. Diese Beobachtung wurde von Bradford erstmals für die Proteinbestimmung angewendet. Zur quantitativen Auswertung kann das LambertBeersche-Gesetz herangezogen werden.
Färbelösung (B)
100 mg Coomassie Blue G in 52 mL 92,4 % Et anol losen 100 mL 85% Phosphorsäure auf 1000 mL mit dest. Wasser
Färbelösung:
Rinderserumalbumin BSA (Sigma)
Entfarbelösung:
40% (v/v) Methanol 10% (v/v) Eisessig 50% (v/v) dest . Wasser
Versuchsanordnung Bradford:
Blank-B Probe/Stand . -B Blank-H20 Probe/Stand . -H20
60 [mu]l 60 [mu]l
60 [mu]l H20 60 [mu]l H20 Probe/Stand . Probe/Stand .
3 ml B 3 ml B 3 ml H20 3 ml H20
Ep-H20 =^ Eprobe=
EB-B = 0 Ep-B Ess-H20<=>0
 <EMI ID=16.1> 
Ep-B - Ep-H20
Probenbestimmung :
60 [mu]l der Probe bzw.

   Standard (Null-Stellen mit 60 [mu]l dest, Wasser)
150 [mu]l 1 M NaOH. mit 3 ml Färbelösung (B) gut vermischen.
5 min inkubieren.
Absorption bei 595 nm messen.
Erstellen der Standardkurve :
10 mg BSA wurden in 1 ml dest. Wasser gelöst (c = 10 000 [mu]g/ml) . Von dieser Lösung wurden 5 Verdünnungsstufen (200, 300, 500, 750, 1000 [mu]g/ml) hergestellt.

   Die Auswertung erfolgte mit Hilfe der Standardkurve (siehe Fig. 6) .
BSA Standard Konzentrationen [[mu]g/ml] OD S S
1.095,60 0,547
830,00 0,511
 <EMI ID=16.2> 
547,80 0,404 237, 90 0,238
136,95 0,117
Achsenabschnitt Steigung
 <EMI ID=17.1> 
0,1130 0,0004
Die Standardkurve wurde herangezogen, um die Proteinmenge in den Proben vor und nach der Hydrolyse und somit den Hydrolysegrad zu bestimmen.
Protein- Restproteinge- Hydrolyse[not]
OD595-
Ansätze Ansatzbeschreibung gehalt halt grad Wert [[mu]g/ml] [%] [%]
Stutenmilchpulver (ein[not]
A getrocknet mit Rotava0,4325 726,82 100,00% 0,00% por)
Stutenmilchpulver + 0,2g
B 0,3210 473,21 64,60% 35,40% Papain Dauer ca. 2,5 h
Stutenmilchpulver + 0,2g
C 0,2170 236,65 32,31% 67,69% Papain Dauer ca.

   10 h
Stutenmilchpulver + 0,2g
D 0,3280 489,13 66,77% 33,23% Papain Dauer ca.2, 5 h
Stutenmilchpulver + 0,2g
E 0,3050 436,81 59,63% 40,37% Papain pH 8 (NH3)ca.2,5 h
Stutenmilchpulver + 0,2g
F 0,2935 410,66 56,06% 43,94%
 <EMI ID=17.2> 
Bromelain Dauer ca.2, 5 h
1.5. Diskussion
Es wurden 6 Ansätze getestet. Der Hydrolysegrad nach 2 Stunden bei 37 [deg.]C konnte mit ca. 35% ermittelt werden und nach 10 Stunden mit ca. 65%.
Auch ist die Adaptierung des bestehenden Stutenmilchtrocknungsverfahren mit der neuen Methode ohne zusätzlichen Aufwand möglich.
Die Versuchsmengen wurden mit 250 ml Stutenmilch und 0,2 g Enzym festgelegt. Variationen wurden in Enzymart, pH-Wert und Dauer durchgeführt.
Die mikrobielle Belastung im Zuge des Verfahrens spielte keine entscheidende Rolle, obwohl es zu einer Aufkonzentration kam.

   Diese Art der Milchhydrolyse wurde schon bei der Käseerzeugung angewandt. Die Enzyme Papain und Bromelain wurden dabei als Labersatz eingesetzt, jedoch wurde dieses Verfahren wieder verworfen, da die erzeugten Proteinspaltprodukte einen bitteren Geschmack aufwiesen und dadurch keine Kosumentenakzeptanz fanden. Das durch diese Art der Milchhydrolyse gewonnene Stutenmilch-Hydrolisat weist überraschenderweise einen neutralen, leicht süsslichen Geruch und Geschmack auf.
Da diese Enzyme hauptsächlich nur die Caseine spalten, bleiben die grundsätzlichen Eigenschaften der Milch erhalten. Weiters wurden solche Enzyme zur Trockenmilch hinzugefügt um eine bessere Verdauung der Milchproteine zu erreichen.

Claims (18)

Patentansprüche :

1. Verfahren zur Herstellung von hydrolysierter Stutenmilch umfassend die Schritte:

- Bereitstellen einer Stutenmilch und

- Inkubieren der Stutenmilch mit mindestens einer Protease.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Protease eine Serinprotease, eine Threoninprotease, eine Cysteinprotease, eine Aspartatprotease, eine Metalloprotease oder eine Glutamatprotease ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Protease pflanzlichen, tierischen oder mikrobiellen Ursprungs ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Protease pflanzlichen Ursprungs ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Papain, Bromelain, Ficin und Kombinationen davon.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Protease tierischen Ursprungs ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Trypsin, Pepsin, Chymotrypsin und Kombinationen davon.

6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Protease mikrobiellen Ursprungs Nattokinase ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Protease rekombinant hergestellt wird oder natürlichen Ursprungs ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Protease in einer Menge von 0,1 bis 10g, vorzugsweise von 0,2 bis 5g, noch mehr bevorzugt von 0,3 bis 2g, besonders bevorzugt von 0,4 bis lg, pro Liter Stutenmilch zugesetzt wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubation der Stutenmilch mit der mindestens einen Protease für mindestens 30 Minuten, vorzugsweise für mindestens 1 Stunde, noch mehr bevorzugt für mindestens 2 Stunden, besonders bevorzugt für mindestens 5 Stunden, insbesondere für mindestens 10 Stunden, erfolgt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert vor der Inkubation der Stutenmilch mit der mindestens einen Protease in einen Bereich von 4 bis 9, vorzugsweise in einen Bereich von 5 bis 8, eingestellt wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass nach oder während des Inkubierens der Stutenmilch mit der mindestens einen Protease das Gemisch getrocknet wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Trocknung durch Evaporation, vorzugsweise durch Evaporation unter vermindertem Atmosphärendruck, insbesondere durch Evaporation unter Vakuum, erfolgt.

13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass vor der Trocknung die hydrolysierte Stutenmilch mit einer hochdispersen Matrix, vorzugsweise mit hochdispersem Siliziumdioxid, versetzt wird.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Trocknung bei einer Temperatur von weniger als 80[deg.]C, vorzugsweise von weniger als 70[deg.]C, besonders bevorzugt von weniger als 60 [deg.]C, noch mehr bevorzugt von weniger als 50[deg.]C, insbesondere von weniger als 40[deg.]C erfolgt.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass vor und/oder nach der Inkubation der Stutenmilch mit der mindestens einen Protease mindestens ein Antioxidans, vorzugsweise Ascorbinsäure, Ascorbat, Ascorbinsäureester, Tocopherol, insbesondere [alpha]-Tocopherol, zugesetzt wird.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die getrocknete hydrolysierte Stutenmilch vermählen und gegebenenfalls abgepackt wird.

17. Hydrolysierte Stutenmilch oder hydrolysierte Stutenmilchpulver erhältlich nach einem der Ansprüche 1 bis 16.

18. Verwendung einer hydrolysierten Stutenmilch nach Anspruch 17 als Lebensmittel, insbesondere als flüssiges, festes oder pastöses Lebensmittel, als Nahrungsergänzungsmittel, als Arzneimittel oder als kosmetische Präparation.