AR133243A1

AR133243A1 - Methods to improve the thermostability of plant immune receptors

Info

Publication number: AR133243A1
Application number: ARP240101819A
Authority: AR
Inventors: Marta Karolina Grech-Baran; Jaroslaw Tomasz Poznanski; Kamil Witek; Jacek Mariusz Hennig
Original assignee: Two Blades Found
Priority date: 2023-07-14
Filing date: 2024-07-12
Publication date: 2025-09-10
Also published as: WO2025019283A1

Abstract

Se proporcionan métodos para mejorar la termoestabilidad de receptores inmunitarios de plantas, particularmente proteínas de repetición rica en leucina con dominio de unión a nucleótidos. Los métodos comprenden realizar una o más sustituciones de aminoácidos en una o más posiciones predeterminadas en una a-hélice en el dominio de unión a nucleótidos o en la hoja b en el dominio de repetición rica en leucina (LRR) de la proteína NLR para producir una proteína NLR termostable. Además, se proporcionan métodos para crear plantas que contengan las proteínas NLR termostables. Adicionalmente, se proporcionan las proteínas NLR termostables, así como las moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas NLR termostables, y las plantas y células vegetales que contienen las proteínas NLR termostables. Reivindicación 1: Un método para mejorar la termoestabilidad de una proteína de repetición rica en leucina (NLR) de unión a nucleótidos de plantas que es capaz de conferir a una planta resistencia a una enfermedad vegetal, en donde el método comprende realizar al menos una sustitución amino en una posición predeterminada en una a-hélice en el adaptador de unión a nucleótidos compartido por las proteínas APAF-1, R, y el dominio CED-4 (NB-ARC) o la lámina b en el dominio de repetición rica en leucina (LRR) de la proteína NLR para producir una proteína NLR termoestable, en donde la sustitución de al menos un aminoácido: (a) genera una interacción interdominio entre un primer aminoácido en la a-hélice y un segundo aminoácido en la lámina b y/o (b) elimina una interacción desestabilizadora entre el primer aminoácido en la a-hélice y el segundo aminoácido en la lámina b; en donde la al menos una sustitución de aminoácidos comprende reemplazar un aminoácido en la proteína NLR por un aminoácido sustituto. Reivindicación 17: Una proteína NLR termoestable producida por el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 16 o una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína NLR termoestable. Reivindicación 18: Una planta o célula vegetal que comprende la proteína NLR termoestable y/o la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 17. Reivindicación 19: Un método para mejorar la termoestabilidad de una proteína NLR en una planta, el método comprende modificar la secuencia de nucleótidos de un gen NLR que codifica la proteína NLR en al menos una célula vegetal para producir al menos una célula vegetal modificada que comprende la secuencia de nucleótidos modificada, en donde la secuencia de nucleótidos modificada codifica una proteína NLR termoestable con al menos una sustitución de aminoácidos en una posición predeterminada en una a-hélice en el dominio NB-ARC o la lámina beta en el dominio LRR de la proteína NLR, en donde la al menos una sustitución de aminoácidos: (a) genera una interacción interdominio entre un primer aminoácido en la a-hélice y un segundo aminoácido en la lámina b y/o (b) elimina una interacción desestabilizadora entre el primer aminoácido en la a-hélice y el segundo aminoácido en la lámina b; en donde la al menos una sustitución de aminoácidos comprende reemplazar un aminoácido en la proteína NLR por un aminoácido sustituto. Reivindicación 35: Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID Nº 7, 9, u 11; y (b) una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID Nº 8, 18, o 12. Reivindicación 38: Un casete de expresión que comprende un promotor operativamente unido a la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 35 o un vector que comprende la molécula de ácido nucleico. Reivindicación 40: Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID Nº 8, 10, o 12; y (b) la secuencia de aminoácidos codificada la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID Nº 7, 9, u 11. Reivindicación 41: Una planta o célula vegetal que comprende el polipéptido de acuerdo con la reivindicación 40.Methods are provided for improving the thermostability of plant immune receptors, particularly leucine-rich repeat (LRR) proteins with a nucleotide-binding domain. The methods comprise making one or more amino acid substitutions at one or more predetermined positions in an α-helix in the nucleotide-binding domain or in the β-sheet in the leucine-rich repeat (LRR) domain of the NLR protein to produce a thermostable NLR protein. Furthermore, methods are provided for creating plants containing the thermostable NLR proteins. Additionally, thermostable NLR proteins, as well as nucleic acid molecules encoding the thermostable NLR proteins, and plants and plant cells containing the thermostable NLR proteins are provided. Claim 1: A method for improving the thermostability of a plant nucleotide-binding leucine-rich repeat (NLR) protein that is capable of conferring resistance to a plant disease to a plant, wherein the method comprises making at least one amino acid substitution at a predetermined position in an α-helix in the nucleotide-binding adaptor shared by the APAF-1, R, and CED-4 (NB-ARC) proteins or the β-sheet domain in the leucine-rich repeat (LRR) domain of the NLR protein to produce a thermostable NLR protein, wherein the at least one amino acid substitution: (a) generates an interdomain interaction between a first amino acid in the α-helix and a second amino acid in the β-sheet and/or (b) eliminates a destabilizing interaction between the first amino acid in the α-helix and the second amino acid in the β-sheet; wherein the at least one amino acid substitution comprises replacing an amino acid in the NLR protein with a substitute amino acid. Claim 17: A thermostable NLR protein produced by the method according to any one of claims 1 - 16 or a nucleic acid molecule encoding a thermostable NLR protein. Claim 18: A plant or plant cell comprising the thermostable NLR protein and/or the nucleic acid molecule according to claim 17. Claim 19: A method for improving thermostability of an NLR protein in a plant, the method comprising modifying the nucleotide sequence of an NLR gene encoding the NLR protein in at least one plant cell to produce at least one modified plant cell comprising the modified nucleotide sequence, wherein the modified nucleotide sequence encodes a thermostable NLR protein with at least one amino acid substitution at a predetermined position in an α-helix in the NB-ARC domain or the β-sheet in the LRR domain of the NLR protein, wherein the at least one amino acid substitution: (a) generates an interdomain interaction between a first amino acid in the α-helix and a second amino acid in the β-sheet and/or (b) eliminates a destabilizing interaction between the first amino acid in the α-helix and the second amino acid in the β-sheet; wherein the at least one amino acid substitution comprises replacing an amino acid in the NLR protein with a substitute amino acid. Claim 35: A nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of: (a) the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 7, 9, or 11; and (b) a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8, 18, or 12. Claim 38: An expression cassette comprising a promoter operably linked to the nucleic acid molecule according to claim 35 or a vector comprising the nucleic acid molecule. Claim 40: A polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of: (a) the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8, 10, or 12; and (b) the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID No. 7, 9, or 11. Claim 41: A plant or plant cell comprising the polypeptide according to claim 40.