NO865333L - PROCEDURE AND MIXING FOR MOLECULE WEIGHT DETERMINATION OF PROTEINS. - Google Patents
PROCEDURE AND MIXING FOR MOLECULE WEIGHT DETERMINATION OF PROTEINS.Info
- Publication number
- NO865333L NO865333L NO865333A NO865333A NO865333L NO 865333 L NO865333 L NO 865333L NO 865333 A NO865333 A NO 865333A NO 865333 A NO865333 A NO 865333A NO 865333 L NO865333 L NO 865333L
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- molecular weight
- proteins
- protein
- mixture
- components
- Prior art date
Links
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 69
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 69
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 37
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 31
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 12
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 11
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims description 10
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 10
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 10
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 9
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 9
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 9
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 claims description 6
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 claims description 5
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 50
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 20
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 13
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 12
- 241000894007 species Species 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 8
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 3
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 3
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 3
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 3
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101710154643 Filamentous hemagglutinin Proteins 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 2
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 2
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- BQWBEDSJTMWJAE-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-[(2-iodoacetyl)amino]benzoate Chemical compound C1=CC(NC(=O)CI)=CC=C1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O BQWBEDSJTMWJAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SWWQQSDRUYSMAR-UHFFFAOYSA-N 1-[(4-hydroxyphenyl)methyl]-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-6,7-diol;hydrochloride Chemical group Cl.C1=CC(O)=CC=C1CC1C2=CC(O)=C(O)C=C2CCN1 SWWQQSDRUYSMAR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010032597 Cohn fraction II Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 150000001335 aliphatic alkanes Chemical class 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 230000002152 alkylating effect Effects 0.000 description 1
- 238000005937 allylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- -1 diazophenylthio Chemical group 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- ZLFRJHOBQVVTOJ-UHFFFAOYSA-N dimethyl hexanediimidate Chemical compound COC(=N)CCCCC(=N)OC ZLFRJHOBQVVTOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 1
- 229940099472 immunoglobulin a Drugs 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005932 reductive alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate Chemical compound C1CC(CN2C(C=CC2=O)=O)CCC1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/416—Systems
- G01N27/447—Systems using electrophoresis
- G01N27/44704—Details; Accessories
- G01N27/44717—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones
- G01N27/44721—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones by optical means
- G01N27/44726—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones by optical means using specific dyes, markers or binding molecules
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Description
MOLEKYLVEKTBESTEMMELSE AV PROTEINER MOLECULAR WEIGHT DETERMINATION OF PROTEINS
Oppfinnelsen vedrører blandinger for bruk ved bestemmelse av molekylvekter av proteiner og vedrører fremgangsmåter for anvendelse av disse blandinger. The invention relates to mixtures for use in determining molecular weights of proteins and relates to methods for using these mixtures.
Teknikken med Western- overføring og protein-avsetning av elektroforetisk separerte proteinblandinger anvendes nå i stor utstrekning innenfor biologiske vitenskaper. Teknikken anvender elektrisk strøm for å bevirke overføringen av proteiner som er fordelt på polyakrylamid (eller andre polymere) geler på overflaten av behandlet halvfast eller fast membran- eller papirbærer som binder proteinene sterkt. Teknikken ble drøftet av S. Gershoni og G. Paladie (Anal.Bioch. (1983) 131, 1 - 15). Metoder for klassifisering av de overførte proteiner i henhold til deres molekylvekt krever at egnede proteinstandarder med kjent molekylvekt også samtidig overføres fra de samme, tilliggende eller ikke-tilstøtende områder av separeringsgelen på de samme, tilliggende eller ikke-tilstøtende områder av den samme halvfaste eller faste papir- eller membran-bærer. Området av papir- eller membran-bæreren som inneholder elektroforetisk overførte molekylvektmarkører fjernes og farges for protein. Molekylvektmarkører egnet for de ovennevnte metoder kan fås.i handelsen fra flere firmaer. The technique of Western transfer and protein deposition of electrophoretically separated protein mixtures is now widely used in the biological sciences. The technique uses electric current to effect the transfer of proteins distributed on polyacrylamide (or other polymeric) gels onto the surface of treated semi-solid or solid membrane or paper supports that strongly bind the proteins. The technique was discussed by S. Gershoni and G. Paladie (Anal.Bioch. (1983) 131, 1 - 15). Methods for classifying the transferred proteins according to their molecular weight require that suitable protein standards of known molecular weight are also simultaneously transferred from the same, adjacent or non-adjacent areas of the separation gel onto the same, adjacent or non-adjacent areas of the same semi-solid or solid paper or membrane carrier. The area of the paper or membrane support containing electrophoretically transferred molecular weight markers is removed and stained for protein. Molecular weight markers suitable for the above methods are commercially available from several companies.
Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer nye molekylvekt-markører som frembyr følgende fordeler fremfor de kjente protein-molekylvektmarkører: (i) de kan detekteres på alle bærere. Proteinfargings-metoder kan ikke anvendes på alle bærere (f.eks. kat-ioniserte nylonmembraner) pga. av at fargereagensene også farger bæreren slik at identifisering av molekyl-vektmarkørene forhindres. (ii) deteksjon av molekylvektmarkører og prøveprotein skjer vanligvis samtidig og bare en prosedyre er nødvendig. The present invention provides new molecular weight markers which offer the following advantages over the known protein molecular weight markers: (i) they can be detected on all supports. Protein staining methods cannot be used on all carriers (e.g. cation-ionized nylon membranes) due to of the coloring reagents also coloring the support so that identification of the molecular weight markers is prevented. (ii) detection of molecular weight markers and sample protein usually occurs simultaneously and only one procedure is required.
En separat fargeprosedyre kreves når andre protein-molekylvektmarkører anvendes. (iii) deteksjon av markører krever ikke fjernelse av baner inneholdende markørene fra resten av bæreren. Bærere som inneholder andre protein-molekylvektmarkører må fjernes for den separate deteksjonsprosedyre - disse prosedyrer kan påvirke dimensjonene av bæreren og gjøre det vanskelig å bringe immunodetekterte komponenter på linje med molekylvektmarkørene. A separate staining procedure is required when other protein molecular weight markers are used. (iii) detection of markers does not require removal of lanes containing the markers from the rest of the support. Supports containing other protein molecular weight markers must be removed for the separate detection procedure - these procedures can affect the dimensions of the support and make it difficult to align immunodetected components with the molecular weight markers.
En serie av "<*>"^C merkede protein-molekylvektmarkører kan fås fra Amersham (Buckinghamshire, England). Disse markører kan detekteres samtidig med immunodetekterte komponenter, men de er dyre og kan bare anvendes når immunodeteksjonsprosedyren anvender radioaktive merkinger (f.eks. radiomerkede antistoffer eller protein A). A series of "<*>"^C labeled protein molecular weight markers are available from Amersham (Buckinghamshire, England). These markers can be detected simultaneously with immunodetected components, but they are expensive and can only be used when the immunodetection procedure uses radioactive labels (eg, radiolabeled antibodies or protein A).
I henhold til et første aspekt av oppfinnelsen tilveiebringes en blanding for bruk ved bestemmelse av molekylvekten eller vektene av protein eller proteiner, omfattende i det minste et protein eller polypeptid med kjent molekylvekt valgt fra gruppen bestående av immunoglobuliner og fragmenter og polymerer derav (i det følgende benevnt Ig-komponenter). According to a first aspect of the invention, a mixture is provided for use in determining the molecular weight or weights of a protein or proteins, comprising at least one protein or polypeptide of known molecular weight selected from the group consisting of immunoglobulins and fragments and polymers thereof (hereinafter called Ig components).
Mens den foreliggende oppfinnelse omfatter bruk av alle While the present invention encompasses the use of all
klasser av immunoglobuliner, inklusive f.eks. immunoglobulin A og immunoglobulin M, er hittil foretrukne blandinger i samsvar med oppfinnelsen blandinger omfattende i det minste et protein eller polypeptid med kjent molekylvekt eller molekylvekter classes of immunoglobulins, including e.g. immunoglobulin A and immunoglobulin M, hitherto preferred mixtures in accordance with the invention are mixtures comprising at least one protein or polypeptide of known molecular weight or molecular weights
valgt fra gruppen bestående av immunoglobulin G og fragmenter og polymerer derav (i det følgende benevnt IgG komponenter). selected from the group consisting of immunoglobulin G and fragments and polymers thereof (hereinafter referred to as IgG components).
Foretrukket vil blandinger i henhold til dette aspekt av oppfinnelsen omfatte to eller flere Ig-komponenter, foretrukket i like mengder, og typisk i det minste fire eller fem slike komponenter. Ved slike foretrukne blandinger velges Ig-komponentene slik at de har kalibrerte molekylvekter som faller med intervaller, foretrukket med omtrent regulære intervaller over et område av molekylvekter. Som eksempel kan IgG komponenter velges til å dekke området av omtrent 200 - 25 KDa, foretrukket med regulære molekylvektintervaller mellom komponentene. Ig-komponentene kan avledes fra forskjellige dyrearter som beskrevet mer detaljert i det følgende. Preferably, mixtures according to this aspect of the invention will comprise two or more Ig components, preferably in equal amounts, and typically at least four or five such components. In such preferred mixtures, the Ig components are selected to have calibrated molecular weights that fall at intervals, preferably at approximately regular intervals over a range of molecular weights. As an example, IgG components can be chosen to cover the range of approximately 200 - 25 KDa, preferably with regular molecular weight intervals between the components. The Ig components can be derived from different animal species as described in more detail below.
Ved dette aspekt tilveiebringer således oppfinnelsen en blanding omfattende proteiner med definert molekylvekt avledet fra forskjellige lg klasser, foretrukket fra immunoglobulin G (gammaglobulin) som kan anvendes for å tilveiebringe molekyl-vektmarkører på SDS-polyakrylamidgeler og på Western avsetninger. Når den anvendes for å tilveiebringe molekylvektmark-kører på Western avsetninger tillater blandinger i samsvar med oppfinnelsen samtidig deteksjon av antigen eller antigener og molekylvektstandarder slik at det tilveiebringes et mål på effektiviteten av overførings- og deteksjonsprosedyren når markører av samme elle kryssreagerende arter til det eller de antigenspesien eller spesiene anvendes. In this aspect, the invention thus provides a mixture comprising proteins with defined molecular weight derived from different lg classes, preferably from immunoglobulin G (gammaglobulin), which can be used to provide molecular weight markers on SDS-polyacrylamide gels and on Western blots. When used to provide molecular weight markers on Western blots, compositions in accordance with the invention permit the simultaneous detection of antigen or antigens and molecular weight standards so as to provide a measure of the efficiency of the transfer and detection procedure when markers of the same or cross-reacting species to the the antigenic species or species used.
Området av molekylvektkomponenter i balndinger i samsvarmed \ oppfinnelsen kan oppnås ved fragmentering av et immunoglobu-linmolekyl som f.eks. IgG molekylet ved hjelp av kjente metoder i de forskjellige kombinasjoner av tunge og lette kjede-komponenter og andre komponenter ved delvis eller fullstendig reduktiv alkylering, enzymatisk oppslutning, kjemisk spaltning med polymerisering av de forskjellige fragmenter om nødvendig. The range of molecular weight components in compounds according to the invention can be obtained by fragmentation of an immunoglobulin molecule such as, for example The IgG molecule using known methods in the various combinations of heavy and light chain components and other components by partial or complete reductive alkylation, enzymatic digestion, chemical cleavage with polymerization of the various fragments if necessary.
Ved et annet espekt tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for deteksjon og/eller bestemmelse av molekylvekten eller molekylvektene av ett eller flere prøveproteiner, idet fremgangsmåten oppfatter trinnene med: In another aspect, the invention provides a method for detecting and/or determining the molecular weight or molecular weights of one or more sample proteins, the method comprising the steps of:
a. samtidig underkastes prøveproteinet eller prøveproteinene a. at the same time subject the sample protein or sample proteins
og en blanding i samsvar med den foreliggende oppfinnelse and a mixture in accordance with the present invention
i det foregående for elektroforetisk fordeling på en polymergel, og in the foregoing for electrophoretic distribution on a polymer gel, and
b. det eller de fordelte prøveproteiner og Ig-komponenter detekteres for å detektere og/eller bestemme molekylvekten eller molekylvektene av prøveproteinet eller prøveprote-inene. b. the distributed sample protein(s) and Ig components are detected to detect and/or determine the molecular weight or molecular weights of the sample protein(s).
Trinnet med elektroforetisk fordeling kan gjennomføres under en- eller to-dimensjonale betingelser. Foretrukket anvendes en natriumdedecylsulfat-polyakrylamidgel for denne fordeling. The step of electrophoretic distribution can be carried out under one- or two-dimensional conditions. A sodium dedecyl sulfate-polyacrylamide gel is preferably used for this distribution.
Detektering av det eller de fordelte prøveproteiner og Ig-komponenter kan gjennomføres direkte i polymergelen. Alternativt kan et mellomliggende overføringstrinn gjennomføres hvor-ved de fordelte materialer overføres på en separat bærer, idet trinnet med deteksjon og sammenlikning gjennomføres på de overførte materialer, f.eks. ved elektroforetisk overføring på en halvfast eller fast bærer etter teknikken med Western-overføring og proteinavsetning beskrevet i det foregående. Detection of the distributed sample protein(s) and Ig components can be carried out directly in the polymer gel. Alternatively, an intermediate transfer step can be carried out whereby the distributed materials are transferred onto a separate carrier, the step of detection and comparison being carried out on the transferred materials, e.g. by electrophoretic transfer on a semi-solid or solid support following the technique of Western blotting and protein deposition described above.
Pga. de gunstige egenskaper av immunoglobulin-fragmentene og særlig IgG fragmentene, kan de elektroforetisk overføres på halvfaste eller fast polymere filmer hvor de kan detekteres under anvendelse av en rekke forskjellige reagenser inklusive protein A, enzymtilknyttede antiimmuniglobuliner (intakt, H-eller L-kjede) og radiomerkede analoger. Ved å anvende immunoglobulner og fragmenter derav fra forskjellige og passende arter, inklusive menneske, mus, geit, okse, kanin etc. tillater således denne metode politelige molekylvektbe-stemmelser og også kvantifisering av overførings- og immuno-deteksjonseffektiviteten. Som eksempel kan humane immunoglo-bulinfragmenter anvendes i deteksjonssystemer hvor anit-human-immuniglobluliner anvendes som sekundære antistoffer. Because of. the favorable properties of the immunoglobulin fragments and especially the IgG fragments, they can be electrophoretically transferred onto semi-solid or solid polymeric films where they can be detected using a number of different reagents including protein A, enzyme-linked anti-immunoglobulins (intact, H- or L-chain) and radiolabelled analogues. Thus, by using immunoglobulins and fragments thereof from different and appropriate species, including human, mouse, goat, ox, rabbit, etc., this method allows precise molecular weight determinations and also quantification of transfer and immunodetection efficiency. As an example, human immunoglobulin fragments can be used in detection systems where anti-human immunoglobulins are used as secondary antibodies.
Utgangsmaterialer for fremstilling av de foretrukne IgG komponenter i blandinger i samsvar med oppfinnelsen inkluderer renset gammaglobulin fra en rekke dyrespesier (f.eks. menneske kanin, rotte, mus, geit etc.) avledet direkte fra blod eller monoklonale kilder. Foretrukket består utgangsmaterialet bare av den vesentlige subtype av IgG hvor denne kan anvendes. Starting materials for the preparation of the preferred IgG components in mixtures according to the invention include purified gamma globulin from a variety of animal species (e.g. human rabbit, rat, mouse, goat etc.) derived directly from blood or monoclonal sources. Preferably, the starting material only consists of the essential subtype of IgG where this can be used.
Desosiasjon av gammaglobulinkjeder i kombinasjoner av tunge (H) og lette (L) polypeptider kan oppnås ved inkubering av gammaglobulinet med et reduksjonsmiddel (f.eks. ditiotreitol, merkaptoetanol) over en område av konsentrasjoner og deretter alkylere de reduserte proteiner med et passende alkylerings-middel som f.eks. jodacetamid eller jodeddiksyre. Denne frem-bringer stabile blandinger av IgG L og H kjedemonomerer, dimerer, trimerer og tetramerer av kombinasjonene t^L^, Dissociation of gamma globulin chains in combinations of heavy (H) and light (L) polypeptides can be achieved by incubating the gamma globulin with a reducing agent (eg dithiothreitol, mercaptoethanol) over a range of concentrations and then alkylating the reduced proteins with an appropriate alkylating agent means such as iodoacetamide or iodoacetic acid. This produces stable mixtures of IgG L and H chain monomers, dimers, trimers and tetramers of the combinations t^L^,
f^L, H^, HL, H og L med forskjellig rikelighet og som kan anvendes direkte for molekylvektkalibrering. Alternativt kan komponentene i disse blandinger isoleres ved en rekke forskjellige kromatografiske metoder inklusive gelfiltrering (størrelseseksklusjon) ionebytterkromatografi og affinitets-kromatografering som f.eks. med protein A som ligand. Av hensyn til deteksjonseffektiviteten oppnås det foretrukne reagens ved passende rekonstitusjon av disse kombinasjoner til å danne et produkt med like mengder av disse komponenter. Alternativt kan disse komponenter etter isolering behandles med forskjellige fornetningsreagenser, f.eks. med formaldehyd eller glutaraldehyd, med bisoksiranene, eller med bifunksjonelle reagenser inklusive para-azidofenacetylbromid, N-suksinimidyl-ester (f.eks. N-suksinimidyl-(4-jodacetyl)-aminobenzoat; suksinimidyl-4-(N-maleimidometyl)-cykloheksan-l-karboksylat) og C6-8 alkandiimidater (f.eks. dimetyladipimidat; demetyl-pimelimidat, etc.) over et område av konsentrasjoner for frem-stillinger av oligomere IgG fragmenter. Ved rekonstituering av disse blandinger kan det oppnås et produkt med lik masse av hver av disse forskjellige oligomerer. f^L, H^, HL, H and L with different abundances and which can be used directly for molecular weight calibration. Alternatively, the components in these mixtures can be isolated by a number of different chromatographic methods including gel filtration (size exclusion), ion exchange chromatography and affinity chromatography such as e.g. with protein A as ligand. For reasons of detection efficiency, the preferred reagent is obtained by appropriate reconstitution of these combinations to form a product with equal amounts of these components. Alternatively, after isolation, these components can be treated with various crosslinking reagents, e.g. with formaldehyde or glutaraldehyde, with the bisoxiranes, or with bifunctional reagents including para-azidophenacetyl bromide, N-succinimidyl ester (e.g. N-succinimidyl-(4-iodoacetyl)-aminobenzoate; succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane -1-carboxylate) and C6-8 alkane diimidates (e.g. dimethyl adipimidate; demethyl pimelimidate, etc.) over a range of concentrations for the production of oligomeric IgG fragments. By reconstitution of these mixtures, a product with equal mass of each of these different oligomers can be obtained.
Molekylvektmarkører kan også utvikles fra dette immunoglobulin G utgangsmaterial ved enzymatisk oppslutning. Ved denne prosedyre oppsluttes IgG med forskjellige proteolytiske enzymer Molecular weight markers can also be developed from this immunoglobulin G starting material by enzymatic digestion. In this procedure, IgG is digested with various proteolytic enzymes
(f.eks. papain, pepsin, plasmin) til å gi de ønskde fragmenter IgG fragmentene med forskjellig molekylvekt isoleres så. Isoleringen kan oppnås ved en rekke forskjellige metoder inklusive gelfiltrering, ionebytterkromatografering og affini-tetskromatografering som f.eks. protein A affinitetskromato-grafering. Etter isolering kan fragmentene behandles med et fornetningsmiddel (f.eks. glutaraldehyd, para-azidofenacyl-bromid, etc.) over et område av konsentrasjoner for å frembringe blandinger av IgG fragmenter med forskjellige polymeri-sasjonsgrader. Også her, utvikles et produkt med like mengder av hver molekylvektkomponent ved rekonstitusjon av disse blandinger. (eg papain, pepsin, plasmin) to give the desired fragments The IgG fragments of different molecular weight are then isolated. The isolation can be achieved by a number of different methods including gel filtration, ion exchange chromatography and affinity chromatography such as e.g. protein A affinity chromatography. After isolation, the fragments can be treated with a cross-linking agent (eg glutaraldehyde, para-azidophenacyl bromide, etc.) over a range of concentrations to produce mixtures of IgG fragments with different degrees of polymerization. Here too, a product with equal amounts of each molecular weight component is developed by reconstitution of these mixtures.
Alternativt kan IgG fragmentene utvikles ved hjelp av andre metoder med kjemisk fragmentering (f.eks. under anvendelse av cyanbromid), med etterfølgende behandling og fornetning som beskrevet for de alkylerte og enzymatisk avledede fragmenter. Alternatively, the IgG fragments can be developed using other methods of chemical fragmentation (eg using cyan bromide), with subsequent treatment and cross-linking as described for the alkylated and enzymatically derived fragments.
IgG fragmenter oppnådd ved den ene eller hvilken som helst av de ovennevnte metoder kan blandes for å oppnå et produkt med denønskede balnding av fragmenter. IgG fragments obtained by one or any of the above methods can be mixed to obtain a product with the desired mixture of fragments.
Som beskrevet i det foregående kan de foretrukne gammaglobulin-avledede molekylvektmarkører i samsvar med oppfinnelsen anvendes på SDS-polyakrylamidgeler som standarder. Tilsvar-ende virker de etter overføring som standarder ved "Western Blot" avsetninger. Produktene kan anvendes på alle SDS-PAGE systemer (f.eks. Reisfeld, R.A., Lewis, U.J. og Williams, D.E. Nature (1962) 195 281-283; Laemmeli, U.K., Nautre (1970) 227 680-685; Weber, K. og Osborne, M., J. Biol.Chem. (1969) 244 4406-4412) som krever molekylvektmarkører. As described above, the preferred gamma globulin-derived molecular weight markers in accordance with the invention can be used on SDS-polyacrylamide gels as standards. Correspondingly, after transfer they act as standards for "Western Blot" depositions. The products can be used on all SDS-PAGE systems (eg Reisfeld, R.A., Lewis, U.J. and Williams, D.E. Nature (1962) 195 281-283; Laemmeli, U.K., Nautre (1970) 227 680-685; Weber, K . and Osborne, M., J. Biol.Chem.(1969) 244 4406-4412) which require molecular weight markers.
De immunoglobulin-avledede molekylvektmarkører i samsvar med oppfinnelsen kan velges fra hvilke som helst species av IR når de anvendes som molekylvektstandarder på SDS-PAGE-geler. For anvendelse som mylekylvektstandarder på Western avsetninger er den anvendte spegies av lg viktig. I disse prosedyrer blir prøveprotein eller prøveproteiner og Ig-komponenter som molekylvektstandarder elektroforesebehandlet på en SDS polyakrylamidgel og elektrooverført til en ladet eller reaktiv bærer (f.eks. nitrocellulose- eller nylon-membraner eller diazofenyltio-papir) for å frembringe en "Western Blot" avsetning. Reaktive eller ladete steder på bæreren som ikke opptas blokkeres med en blokkeringsbuffer vanligvis inneholdende en detergent (f.eks. "Triton X-100," "Tween 20") og/eller protein (f.eks. gelatin, albumin), deretter inkuberes bæreren med buffer inneholdende antistoff (det primære antistoff) rettet mot det nødvendige antigen. Ig komponenten anvendt som molekylvektsstandarder bør være av samme species som det primære antistoff. Bundet primært antistoff og Ig-komponentene kan detekteres ved inkubering av avsetningen med en rekke forskjellige reagenser inklusive merket eller enzym-konjugert protein A eller et merket eller enzym-konjugert sekundært antistoff rettet mot species Ig av det primære antistoff. Således oppnås samtidig deteksjon av antigen og molekylvekt-markører. Bruken av immunoglobulin-avledete molekylvektmar-kører tilveiebringer også et mål på følsomheten av immuno-deteksjons- og overførings-prosedyrene. The immunoglobulin-derived molecular weight markers according to the invention can be selected from any species of IR when used as molecular weight standards on SDS-PAGE gels. For use as molecular weight standards on Western blots, the species of lg used are important. In these procedures, sample protein or sample proteins and Ig components as molecular weight standards are electrophoresed on an SDS polyacrylamide gel and electrotransferred to a charged or reactive support (eg, nitrocellulose or nylon membranes or diazophenylthio paper) to produce a "Western Blot" provision. Reactive or charged sites on the support that are not taken up are blocked with a blocking buffer usually containing a detergent (eg, "Triton X-100," "Tween 20") and/or protein (eg, gelatin, albumin), then incubated the carrier with buffer containing antibody (the primary antibody) directed against the required antigen. The Ig component used as molecular weight standards should be of the same species as the primary antibody. Bound primary antibody and the Ig components can be detected by incubating the deposit with a number of different reagents including labeled or enzyme-conjugated protein A or a labeled or enzyme-conjugated secondary antibody directed against species Ig of the primary antibody. Thus simultaneous detection of antigen and molecular weight markers is achieved. The use of immunoglobulin-derived molecular weight markers also provides a measure of the sensitivity of the immunodetection and transfer procedures.
De følgende eksempler illustrerer blandinger og fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen ytterligere, med henvisning til de vedføyde tegninger, hvori: Fig. 1 er en kalibreringskurve for IgG molekylvektstandarder mot konvensjonelle molekylvektstandarder ((M, H og R refererer til omtrent 5^ug mengder av immunostandard fra henholdsvis mus, mennesker og kanin IgG og disse omgis av 5^ug mengder av henholdsvis lav molekylvekt- og høy molekylvekt-standarder av et kommersielt reagens (Pharmacia); og Fig. 2 illustrerer bruken av IgG molekylvektstandarder i en Western-avsetningsprosedyre. En beskrivelse av protokollene av de forskjellige baner finner i eks. 4. The following examples further illustrate compositions and the method according to the invention, with reference to the attached drawings, in which: Fig. 1 is a calibration curve for IgG molecular weight standards against conventional molecular weight standards ((M, H and R refer to approximately 5 µg amounts of immunostandard from mouse, human, and rabbit IgG, respectively, and these are surrounded by 5 µg amounts of low molecular weight and high molecular weight standards, respectively, by a commercial reagent (Pharmacia); and Fig. 2 illustrates the use of IgG molecular weight standards in a Western blotting procedure. description of the protocols of the different lanes can be found in example 4.
EKSEMPEL 1 EXAMPLE 1
Human gammaglobulin fra Cohn Fraction II pasta ble redusert Human gamma globulin from Cohn Fraction II paste was reduced
med ditiotreitol i henhold til følgende prosedyre: with dithiothreitol according to the following procedure:
IgG med 2,5 mg/ml ble inkubert med 0,5 mM og 5mM ditiotreitol. Reaksjonen fikk foregå i 30 minutter ved romtemperatur og ble stanset ved tilsetning av jodacetamid til å gi en sluttkonsentrasjon av jodacetamid på 10 mM. Alkylering fikk foregå i 10 minutter ved romtemperatur. Oppløsningene ble så dialysert ved 4°C i 50 mM Tris HC1, 50 mM NaCl pH 8,0. Ubehandlet gammaglobulin og redusert og alkylert gammaglobulin ble så underkastet SDS-PAGE i henhold til metoden til Laemmeli på en 10% gel. 2^ug protein ble anvendt pr. prøve. Gelen ble så farget for protein ved hjelp av sølvfargemetoden til Wray. IgG at 2.5 mg/ml was incubated with 0.5 mM and 5 mM dithiothreitol. The reaction was allowed to proceed for 30 minutes at room temperature and was stopped by the addition of iodoacetamide to give a final concentration of iodoacetamide of 10 mM. Alkylation was allowed to take place for 10 minutes at room temperature. The solutions were then dialyzed at 4°C in 50 mM Tris HCl, 50 mM NaCl pH 8.0. Untreated gamma globulin and reduced and alkylated gamma globulin were then subjected to SDS-PAGE according to the method of Laemmeli on a 10% gel. 2 µg protein was used per try. The gel was then stained for protein using the silver staining method of Wray.
(Wray W., Boulikas, T., Wray, V.P. & Hancock, R. Analytical Biochem. (1981) 118 197-203). (Wray W., Boulikas, T., Wray, V.P. & Hancock, R. Analytical Biochem. (1981) 118 197-203).
Sølvfargingen viste at alle mulig nedbrytningsprodukter fra reduksjonen og alkyleringen av gammaglobulin ble utviklet under anvendelse av begge konsentrasjoner av ditiotreitol, og tilsvarer H^ L^, ^ 2^' H2'HL'H°^L-kjeder. Logarit- The silver staining showed that all possible degradation products from the reduction and alkylation of gamma globulin were developed using both concentrations of dithiothreitol, and correspond to H^ L^, ^ 2^' H2'HL'H°^L chains. logarithm-
misk avsettelse av molekylvekten mot relativ mobilitet viste lineære avhengigheter for de forskjellige IgG momponenter, som inkluderte komponenter med molekylvekt henholdsvis 150, 125, misc plotting the molecular weight against relative mobility showed linear dependencies for the different IgG components, which included components with molecular weights of 150, 125,
100, 75, 50 og 25 KDa. 100, 75, 50 and 25 KDa.
EKSEMPEL 2 EXAMPLE 2
Gammaglobulinfragmenter ble fremstilt og underkastet elektroforese som beskrevet i eksempel 1 og elektro-overført til nitrocellulose i ehnhold til metoden til Towbin (Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Proe.Nati.Acad.Sei.USA (1979) 76 4350-4354). Elektro-overføring ble gjennomført i 3 timer ved 70 volt ved 2°C. Etter overføringen ble nitrocellulose-membranen (NCM) inkubert ved 20 mM Tris/HCl pH 7,5, 0,05% Gammaglobulin fragments were prepared and subjected to electrophoresis as described in Example 1 and electrotransferred to nitrocellulose according to the method of Towbin (Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Proe.Nati.Acad.Sei.USA (1979) 76 4350-4354). Electrotransfer was carried out for 3 hours at 70 volts at 2°C. After the transfer, the nitrocellulose membrane (NCM) was incubated at 20 mM Tris/HCl pH 7.5, 0.05%
Triton X-100, 5% gelatin, 150 mM NaCl buffer (Buffer A) i 60 minutter ved romtemperatur og deretter inkubert i 5 ml Buffer A inneholdende 2 x 10 5 markeringer pr. minutter pr. mL av merket protein A. NCM ble så gitt tre ti-minutters vaskinger i buffer A, ble deretter grundig renset med vann og deretter tørket. Bundet I 12 5-protein A ble så detektert ved hjelp av autoradiografering. Triton X-100, 5% gelatin, 150 mM NaCl buffer (Buffer A) for 60 minutes at room temperature and then incubated in 5 ml Buffer A containing 2 x 10 5 markers per minutes per mL of labeled protein A. The NCM was then given three ten-minute washes in buffer A, then thoroughly washed with water and then dried. The bound I 12 5 protein A was then detected by autoradiography.
Fem separate bånd ble detektert og tilsvarte H^ L^, t^L, Five separate bands were detected and corresponded to H^ L^, t^L,
W^, HL og H komponenter av gammaglobulin. W^, HL and H components of gamma globulin.
EKSEMPEL 3 EXAMPLE 3
Gammaglobulinfragmentene ble oppnådd fra IgG fra tre species (human, mus og kanin) som følger: Humant IgG ble isolert fra myelomserum ved hjelp av protein A separose og besto hovedsakelig av IgG^. The gamma globulin fragments were obtained from IgG from three species (human, mouse and rabbit) as follows: Human IgG was isolated from myeloma serum using protein A separose and consisted mainly of IgG^.
Like store prøver med proteinkonsentrasjon 3,75 mg/mL ble innstilt til 1 mM og 4 mM i forhold til ditiotreitol og inkubert ved romtemperatur i 30 minutter. Reduksjonsreaksjonen ble stanset ved tilsetning av jodacetamid (sluttkonsentrasjon 8 mM) og etter 10 minutter med romtemperatur ble oppløsningene dialysert .mot 50 mM Tris/HCl, 50 mM NaCl pH8,0. Etter foregående analyse og 5-16% polyakrylamidgeler i nærvær av SDS og visualisering av proteinene ved hjelp av sølvfargemetoden til Wray (Wray, S., Boulikas, T., Wray, V.P. og Hancock, R., Analytical Biochem. (1981) 118 197-203), ble de to oppløsning-er blandet for å frembringe et reagens med omtrent like mengder av alle mulige kombinasjoner av lette og tunge kjeder. Equal-sized samples with a protein concentration of 3.75 mg/mL were adjusted to 1 mM and 4 mM in relation to dithiothreitol and incubated at room temperature for 30 minutes. The reduction reaction was stopped by the addition of iodoacetamide (final concentration 8 mM) and after 10 minutes at room temperature the solutions were dialyzed against 50 mM Tris/HCl, 50 mM NaCl pH8.0. After previous analysis and 5-16% polyacrylamide gels in the presence of SDS and visualization of the proteins by the silver method of Wray (Wray, S., Boulikas, T., Wray, V.P. and Hancock, R., Analytical Biochem. (1981) 118 197-203), the two solutions were mixed to produce a reagent with approximately equal amounts of all possible combinations of light and heavy chains.
Muse-monoklonalt IgG ble isolert fra ascites fluid ved hjelp av protein A sepharose. Like store prøver med proteinkonsen-tras jon 0,2 mg/mL ble innstilt til 0,25, 1 og 4 mM med hensyn til ditiotreitol og inkubert ved romtemperatur i 30 minutter. Reduksjonsreaksjonen ble stanset ved tilsetning av jodacetamid (sluttkonsentrasjon 8 mM) og etter 10 minutter ved romtempera tur ble oppløsningene dialysert mot 50 mM NaCl pH 8,0. Etter foregående analyse på 5 - 16% polyakrylamidgeler i nærvær av SDS og visualisering av proteinene med sølvfarginsmetoden til Wray, ble de tre oppløsninger blandet for å frembringe et reagens med omtrent like store mengder av alle mulige kombinasjoner av lette og tunge kjeder. Mouse monoclonal IgG was isolated from ascites fluid using protein A sepharose. Equal-sized samples with a protein concentration of 0.2 mg/mL were adjusted to 0.25, 1 and 4 mM with respect to dithiothreitol and incubated at room temperature for 30 minutes. The reduction reaction was stopped by the addition of iodoacetamide (final concentration 8 mM) and after 10 minutes at room temperature the solutions were dialyzed against 50 mM NaCl pH 8.0. After previous analysis on 5 - 16% polyacrylamide gels in the presence of SDS and visualization of the proteins with the silver color method of Wray, the three solutions were mixed to produce a reagent with approximately equal amounts of all possible combinations of light and heavy chains.
Kanin IgG ble isolert fra serum ved hjelp av protein A sepharose og delt opp i tre delmengder. En delmengde ble innstilt Rabbit IgG was isolated from serum using protein A sepharose and divided into three aliquots. A subset was set
til 16 mM i forhold til ditiotreitolog inkubert ved romtemperatur i 30 minutter. alylering ble gjennomført ved å innstille oppløsningen til 32 mM med hensyn til jodacetamid og henstand ved romtemperatur i 10 minutter. Oppløsningen ble så dialysert mot 50 mM Tris/HCl, 50 mM NaCl pH 8,0. Den annen delmengde ble inkubert med papain (Worthington 28^um/mg) i nærvær av 10 mM cystein ved 37°C i 1 1/2 time. Reaksjonen ble stanset ved tilsetning av jodacetamid og oppløsningen dialysert mot 50 mM Tris/HCl, 50 mM NaCl pH 8,0. Fc fragmeutene av det oppsluttede IgG ble isolert på protein A sepharose og produktet dialysert mot 50 mM fosfat 145 mM NaCl pH 7,0. to 16 mM relative to dithiothreitol incubated at room temperature for 30 minutes. allylation was carried out by adjusting the solution to 32 mM with respect to iodoacetamide and standing at room temperature for 10 minutes. The solution was then dialyzed against 50 mM Tris/HCl, 50 mM NaCl pH 8.0. The other aliquot was incubated with papain (Worthington 28 µm/mg) in the presence of 10 mM cysteine at 37°C for 1 1/2 hours. The reaction was stopped by the addition of iodoacetamide and the solution dialyzed against 50 mM Tris/HCl, 50 mM NaCl pH 8.0. The Fc fragments of the captured IgG were isolated on protein A sepharose and the product dialyzed against 50 mM phosphate 145 mM NaCl pH 7.0.
Dette material ble redusert ved å innstille oppløsningen til 14 mM med hensyn til ditriotreitol og inkubasjon ved romtemperatur i 30 minutter. Alkylering ble gjennomført ved å innstille oppløsningen til 30 mM i forhold til jodacetamid etter-fulgt av dialyse mot pH 8,0 tris buffer. Den tredje delmengde ble ikke behandlet. Alle tre delmengder ble undersøkt ved hjelp av SDS-PAGE og sølvfarget i likhet med human- og muse-IgG. Fra disse data, ble det fremstilt en blanding for å fremstille en blanding inneholdende nativt og fragmentert IgG. This material was reduced by adjusting the solution to 14 mM with respect to dithiothreitol and incubating at room temperature for 30 minutes. Alkylation was carried out by adjusting the solution to 30 mM in relation to iodoacetamide followed by dialysis against pH 8.0 tris buffer. The third subset was not processed. All three aliquots were examined by SDS-PAGE and silver-stained like human and mouse IgG. From this data, a mixture was prepared to prepare a mixture containing native and fragmented IgG.
Delmengder av blandingene av komponentene fra de tre species, fremstilt som beskrevet i det foregående, ble kjørt på en 5 - 15% polyakrylamidgel, parallelt med kommersielle høy- og lav-molekylvektstandarder (Pharmacia). Proteinene ble visualisert ved hjelp av sølvfarging og resultatene er illustrert i fig. 1 En kalibreringskurve ble satt opp med R mot log molekylvekter av standardene og fra denne kurve ble det funnet at IgG-fragmentene hadde følgende molekylvekter. Aliquots of the mixtures of the components from the three species, prepared as described above, were run on a 5-15% polyacrylamide gel, in parallel with commercial high and low molecular weight standards (Pharmacia). The proteins were visualized using silver staining and the results are illustrated in fig. 1 A calibration curve was set up with R against log molecular weights of the standards and from this curve it was found that the IgG fragments had the following molecular weights.
EKSEMPEL 4 EXAMPLE 4
To 5 - 16% polyakrylamidgeler ble fremstilt med spalter for å romme enkle prøver på hver side og med resten av gelen avsatt til en enkel prøve. 5^,ug av muse immunostandard (beskrevet i eksempel 3) i SDS buffer ble tilsatt til de to enkle side-baner på en gel og 5^,ug av human-immunostandard ble tilsatt til disse baner på den annen gel. 80^ug (i 200^1) av en ekstrakt av B.Pertussis (kikhoste) bakterier ble fylt inn på den midtre brede bane av hver gel. Gelene ble kjørt med 36m.amp. konstant størmstyrke i omtrent 2 1/2 time. De separerte proteiner ble så overført til nitrocellulosemembraner med konstant spenning på 70 volt i 16 timer. Nitrocellulose-membranene ble kuttet opp i strimler og overført til BioRad inkubasjonsskåler. Strimlene inneholdende B. Pertussis antigener ble undersøkt med forskjellige muse- og human-antistoffer. Alle strimler (inklusive immunostandarder) ble endelig prøvet med enten pepperrot-peroksydase (HRP) - konjugert geite-antimuse IgG eller med HRP-konjugert geite anti-human IgG, i avhengighet av de species hvorfra det primære antistoff og immunostandardene var blitt avledet. Two 5 - 16% polyacrylamide gels were prepared with slits to accommodate single samples on each side and with the rest of the gel set aside for a single sample. 5 µg of mouse immunostandard (described in Example 3) in SDS buffer was added to the two single side lanes on one gel and 5 µg of human immunostandard was added to these lanes on the other gel. 80 µg (in 200 µl) of an extract of B. Pertussis (whooping cough) bacteria was loaded onto the middle wide lane of each gel. The gels were run with 36m.amp. constant gust strength for about 2 1/2 hours. The separated proteins were then transferred to nitrocellulose membranes at a constant voltage of 70 volts for 16 hours. The nitrocellulose membranes were cut into strips and transferred to BioRad incubation dishes. The strips containing B. Pertussis antigens were probed with different mouse and human antibodies. All strips (including immunostandards) were finally probed with either horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG or HRP-conjugated goat anti-human IgG, depending on the species from which the primary antibody and immunostandards were derived.
Fig. 2 visr de oppnådde resultater. Banene 1-4 tilsvarer B. Pertussis ekstrakt prøvet med (1) muse-hperimmunt (vaksine) serum (2) muse-polyklonalt serum dyrket mot et preparat av filamentaktig hemagglutin (FHA) renset fra B. Pertussis ekstrakt (3) muse-klonalt anti-FHA og (4) muse-polyklonalt anti-pertussigen (vesentilig B. Pertussis toksin). De to brobaner tilsvarer muse-immunostandarden. Banene 5 7 tilsvarer B. Pertussis ekstrakt prøvd med tre forskjellige humansera ved 1/100 fortunning; fra (5), en pasient som var antatt å ha kikhoste (6) et sundt vaksinert individ og (7) en sammenslåing av sera fra pasienter som er kjent å ha lav anti-FHA og antper- tussigene bestemmelser ved ELISA-tester. Disse er forbundet over den humane immunostandard. Fig. 2 shows the results obtained. Lanes 1-4 correspond to B. Pertussis extract probed with (1) mouse hyperimmune (vaccine) serum (2) mouse polyclonal serum cultured against a preparation of filamentous hemagglutinin (FHA) purified from B. Pertussis extract (3) mouse clonal anti-FHA and (4) mouse polyclonal anti-pertussis (essentially B. Pertussis toxin). The two bridge lanes correspond to the mouse immunostandard. Lanes 5 7 correspond to B. Pertussis extract tested with three different human sera at 1/100 dilution; from (5), a patient suspected of having pertussis (6) a healthy vaccinated individual and (7) a pool of sera from patients known to have low anti-FHA and anti-pertussis determinations by ELISA tests. These are connected over the human immunostandard.
Det kan fra musepanelet sees at IgG molekylvekt (immuno) standarder tilveiebringer et nyttig områder for molekylvekt-specier for å bestemme molekylvektene av antigenet som gjen-kjennes av de forskjellige sera. Fra humanpanelet er det klart av den samlede immunodeteksjon er ganske svak, idet dette illustrerer brukbarheten av standardene ved kontroll av effektiviteten av trinnene med elektroforese, overføring og immunodeteksjon. It can be seen from the mouse panel that IgG molecular weight (immuno) standards provide a useful range of molecular weight species to determine the molecular weights of the antigen recognized by the different sera. From the human panel it is clear that the overall immunodetection is quite weak, illustrating the utility of the standards in checking the efficiency of the electrophoresis, transfer and immunodetection steps.
Claims (12)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AUPH038185 | 1985-05-01 | ||
| PCT/AU1986/000118 WO1986006383A1 (en) | 1985-05-01 | 1986-04-30 | Molecular weight determination of proteins |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO865333L true NO865333L (en) | 1986-12-30 |
Family
ID=3771078
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO865333A NO865333L (en) | 1985-05-01 | 1986-12-30 | PROCEDURE AND MIXING FOR MOLECULE WEIGHT DETERMINATION OF PROTEINS. |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0221116A4 (en) |
| JP (1) | JPS63500207A (en) |
| CA (1) | CA1272938A (en) |
| DK (1) | DK634486A (en) |
| NO (1) | NO865333L (en) |
| NZ (1) | NZ215967A (en) |
| WO (1) | WO1986006383A1 (en) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19729248C1 (en) * | 1997-07-09 | 1998-07-09 | Jochen Uhlenkueken | Protein for use as electrophoretic standard |
| JP3432158B2 (en) * | 1998-12-04 | 2003-08-04 | 日立ソフトウエアエンジニアリング株式会社 | Electrophoresis method, electrophoresis apparatus and marker sample used therefor |
| AU6608500A (en) * | 1999-07-27 | 2001-02-13 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Automated landmarking for two-dimensional electrophoresis |
| DE10244502B4 (en) * | 2002-09-25 | 2006-06-01 | Universität Gesamthochschule Kassel | Molecular weight markers for proteins and process for its preparation |
| EP3892989A1 (en) * | 2020-04-07 | 2021-10-13 | Ares Trading S.A. | Capillary gel electrophoresis and its use with complex biological molecules |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5292590A (en) * | 1976-01-30 | 1977-08-04 | Oriental Yeast Co Ltd | Isoelectric point marker for separation of isoelectric points of gel |
| JPS55153724A (en) * | 1979-05-17 | 1980-11-29 | Teijin Ltd | Preparation of immunoglobulin derivative |
| DE2953674C2 (en) * | 1979-05-23 | 1986-04-24 | Teijin Ltd., Osaka | Process for the preparation of human immunogammaglobulin derivatives |
| US4681848A (en) * | 1982-09-22 | 1987-07-21 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Novel peptide and use thereof |
| CA1260828A (en) * | 1983-07-04 | 1989-09-26 | Masakazu Iwai | Therapeutic and prophylactic agent for gastrointestinal ulcers |
-
1986
- 1986-04-28 NZ NZ21596786A patent/NZ215967A/en unknown
- 1986-04-30 CA CA000508010A patent/CA1272938A/en not_active Expired
- 1986-04-30 EP EP19860902779 patent/EP0221116A4/en not_active Ceased
- 1986-04-30 JP JP61502591A patent/JPS63500207A/en active Pending
- 1986-04-30 WO PCT/AU1986/000118 patent/WO1986006383A1/en not_active Ceased
- 1986-12-30 NO NO865333A patent/NO865333L/en unknown
- 1986-12-30 DK DK634486A patent/DK634486A/en not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NZ215967A (en) | 1988-05-30 |
| WO1986006383A1 (en) | 1986-11-06 |
| DK634486A (en) | 1987-03-02 |
| EP0221116A4 (en) | 1987-09-15 |
| DK634486D0 (en) | 1986-12-30 |
| EP0221116A1 (en) | 1987-05-13 |
| CA1272938A (en) | 1990-08-21 |
| JPS63500207A (en) | 1988-01-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Edelman et al. | Immunological studies of human γ-globulin: Relation of the precipitin lines of whole γ-globulin to those of the fragments produced by papain | |
| Stollar et al. | Rabbit antibodies to histone fractions as specific reagents for preparative and comparative studies | |
| Ahle et al. | Purification and properties of a new clathrin assembly protein. | |
| Köhler et al. | Immunoglobulin production by lymphocyte hybridomas | |
| Sheetz et al. | Relations of the spectrin complex of human erythrocyte membranes to the actomyosins of muscle cell | |
| US6692930B2 (en) | Monoclonal antibodies specific to cooked meats | |
| Marchalonis | Isolation and partial characterization of immunoglobulins of goldfish (Carassius auratus) and carp (Cyprinus carpio) | |
| Langeland | A Clinical and Immunological Study of Allergy to Hen's Egg White: II, Antigens in Hen's Egg White Studied by Crossed Immunoelectrophoresis (CIE) | |
| Edelman et al. | Structure and specificity of guinea pig 7S antibodies | |
| Bjerrum et al. | Some recent developments of the electroimmunochemical analysis of menbrane proteins. Application of Zwittergent, Triton X-114 and Western blotting technique | |
| Alexander et al. | Characterization of membrane and cytoplasmic antigens of Mycoplasma arginini by two-dimensional (crossed) immunoelectrophoresis | |
| US6608172B1 (en) | Isolation of IgY (ΔFc) antibodies | |
| DK169571B1 (en) | Monoclonal antibody, method for its preparation, hybridoma cell line producing the antibody, methods for quantitative immunological determination of procollagen peptide (type III) with the antibody, and diagnostic composition containing the monoclonal antibody | |
| Milthorp et al. | Immunochemical characterization of apolipoprotein AI from normal human plasma. In vitro modification of apo AI antigens. | |
| NO865333L (en) | PROCEDURE AND MIXING FOR MOLECULE WEIGHT DETERMINATION OF PROTEINS. | |
| EP0585960A2 (en) | Diagnostic method for autoimmune diseases | |
| US6288215B1 (en) | Monoclonal antibodies specific to cooked meats | |
| WO1998008371A9 (en) | Monoclonal antibodies specific to cooked meats | |
| Mather et al. | Detection of xanthine oxidase and immunologically related proteins in fractions from bovine mammary tissue and milk after electrophoresis in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulphate | |
| Schiefer et al. | Immunological studies on the localization of phosphatidylglycerol in the membranes of Mycoplasma hominis | |
| Stylos et al. | Splitting of human thyroglobulin. II. Enzymatic digestion | |
| Morrison-Plummer et al. | An ELISA to detect monoclonal antibodies specific for lipid determinants of Mycoplasma pneumoniae | |
| Billett et al. | The use of a poultry‐specific murine monoclonal antibody directed to the insoluble muscle protein desmin in meat speciation | |
| Watanabe et al. | Serologic and immunochemical characterization of an immunosuppressive soluble factor from mastocytoma-bearing mice | |
| Bassett et al. | STUDIES ON HUMAN ANTIBODIES: III. Amino Acid Composition of Four Antibodies from One Individual |