NO803552L - Diagnostisk proevemiddel for urinstoff. - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører generellt området for diagnostiske midler, spesielt diagnostiske prøver som egner seg til kvalitative og kvantitative bestemmelse av urinstoff i kroppsvæsker, spesielt i blod.

Urinstoff er det hovedsakelige sluttprodukt av eggehvite stoffskiftet hos mennesker og ved andre pattedyr. Dette produkt dannes i leveren, kommer i blodet, og ut-skilles gjennom nyrene i urinen, hvor det utgjør den stør-ste del av de organiske stoffer. En økning av blodurinstof-fet betegent som azotemie eller uremie, er omtrent alltid et tegn på en innvirkning på nyrefunksjonen. Prøven til bestemmelse av blodurinstoff (i USA vanligvis betegnet som urin-nitrogen) er en av de i den rutinemessige klini-

ske kjemi hyppigst gjénnomførte prøver. Urinstoffkonsen-trasjonen i urinen måles videre også under tiden for å bestemme urin stoff-næringersom er et mål for den glo-merulare filtrasjonsgrad.

Metodene som anvendes i den rutinemessige kliniske kjemi til bestemmelse av urinstoff i biologiske væsker, kan innplasseres som direkte (kondensasjon av urinstoff med egnede reagenser som formår å danne et målbart kromogen) og inndirekte (bestemmelse av ammoniakk som produkt av innviskning av urease på urinstoff).

Av de direkte metoder, anvendes den med diacetylmonoxim gjennomførte og av R.J. Henry et al "Clinical Chemistry - Principles and Technics", Harper & Row, 2. opplag 1 974-» omtalt i den rutinemessige kliniske kjemi, såvel på manuell som også automatisk arbeidsmåte. Denne;metode er imidlertid beheftet med mange ulemper, f. eks. 1. Relativ ikke-spesifitet, da den fører til posi-tive reaksjoner med citrullin, allantoin og andre komponenter av kroppsvæsker, 2. En standard-kurve ( eller minst et to-punkts-justering) må fremstilles hver dag,

3. Farven forsvinner hurtig og er lysfølsom,

4.. Reaksjonen må gjennomføres ved forholdsvis høy

temperatur og

5. På grunn av reagensenes uheldige lukt og irriterende damper, er det hensiktsmessig å arbeide under et avtrekk.

Av disse grunner foretrekkes generellt enzymatiske (indirekte) metoder fremfor diacetylmonoxim-metoden.

Til grunn for de indirekte metoder ligger den enzymatiske omdannelse av urinstoff til ammoniakk ved hjelp av urease (urinstoff-amidohydrolase) ifølge reaksjonen

og den etterfølgende bestemmelse av frigjort ammoniakk med egnede reagens-systemer (R^Richterich "Clinical Chemistry - Theory and Practice", oversatt fra 2. tyske opplag, S. Karger, Basel 1969»og H.U. Bergmeyer " Methods of Enzymatic Analysis", 2. engelske opplag, bind U, Verlag Chemie - Academic Press, New York 1974). Hovedtrekket ved de enzymatiske metoder er spesifiteten, da bare urinstoff hydro-lyseres ved hjelp av urease.

Av metodene til bestemmelse av det enzymatiske frigjorte ammoniakk som er proporsjonal med urinstoffkon-sentrasjonen i prøven, ligger den metode til grunn som har fått den største anvendelse i laboratoriumspraksis, Bertelot-reaksjonen, hvor ammoniumioner i alkalisk medium reagerer med fenol og hypoklorit under dannelse av det blå farve-stoff indofenol. Urinstoff- bestemmelsene etter denne metode krever to trinn: I første trinn inkuberes prøven (vanligvis 10 til 20 minutter) ved 37°C med urease ved den for den enzymatiske reaksjon mest egnede pH-verdi (d.v.s.

ca. 6,5). I annet trinn tilséttes alkaliske oppløsninger av fenol og hypoklorit, hvorpå inkubasjonen gjennomføres til farvefremkalling 10 til 30 minutter vanligvis ved 37°C.

En ytterligere to-trinnsmetode omtales av Bermeyer (se ovenfor). Denne metode muliggjør bestemmelsen av de fra den enzymatiske reaksjonen' med urease stammende ammonium-ioner ved hjelp av enzyme glutamatde-hydrogenase (G1DH) ifølge reaksjonen

og måling av nedgang av NADH-ekstinks j on ved 34-0 (eller 334- eller 366) nm. Forskjellige endringer ble foretett på denne metode for å gjennomføre den i bare ett trinn med bare ett reagenspreparat og under utnyttelse av den kinetiske analysetype. På tross av forbedringen anvendes denne metode bare i begrenset omfang i den rutinemessige kliniske kjemi, betinget på grunn, av dei høye reagensomkostninger, og den umulige anvendbarhet på automatiserte analysatorer med kontinuerlig gjennomstrømning.

På et annet undersøkelsesområde danner en "Han-tzche dihydropyridinsyntesen" et som 3-diacetyl-1 , 4--dihydro - lutidin (DDL) kjent produkt. De fremstilles som følger:

Den anvendes ifølge Nash i " Biochem, J." 55

(1953) 416-421 til analytisk bestemmelse av formaldehyd (ammoniakk og acetylaceton som reagenser). Anvendelser i den kliniske kjemi ble likeledes publisert idet bestemmelsene av formaldihyd ved denne reakson er slutt-trinnet av komplekset reaksjoner til bestemmelser av kolestrol ( P. Roeschlau et al. Z.Klin. Chem. Klin. Biochem. 12 (9) (1974) 403, 407), urinsyre (N. Kageyaraa, Klin.Chem. Acta 31 (1971) 421-426) og triglycerider (G.Kessler et al. 2. Technicon Symposium, N. I., London 1965 (1966) 341-344). En fluori-nretrisk metode til bestemmelse av ammoniakk under anvendelse av acetylaceton og formaldehyd ble omtalt av S. Belman i analen Chim. Acta (1963) 120-126.

Til grunn for oppfinnelsen ligger den oppgave

å tilveiebringe en forbedret prøve til bestemmelse av urinstoff. Den er rettet mot en urinstoffprøve under anvendelse av urease og en reagenskombinasjon av acetylaceton og et Cj-C^-alkylaldehyd, samt en prøve til bestemmelse av urinstoffet under anvendelse av urease og 3,5-diacetyl-2,6-heptandion.

Dagens laboratoriemetoder til bestemmelse av urinstoff-nitrogen i biologiske væsker, har tallrike ulemper, som det allerede er kommet inn på. Motsetning her-til er metoden ifølge oppfinnelsen den eneste metode som for-ener følgende fordelaktige trekk i seg: Anvendbarhet på automatiserte analysatorer, innbefattende slike med kon-timuerlig gjennomstrømning (spesielt med enzymourease i immobilisert form), mottagbare omkostninger av reagenser, bestemmelse i bare ett trinn, kinetiske analyser som enpunkt- såvel også topunkt- (eller flereganger-punkt-)-be - stemmelse, mindre antall av reagenspreparater og spesifitet-er.

Det samtidige nærvær av alle disse trekk ved denne metode, gjør den bemerkelsesverdig verdifull for laboratoriumspraksis, såvel ved manuelle metoder som også automatiserte og halvautomatiserte instrumenter.

Oppfinnelsens gjenstand er prøvemidler som preparater, en prøveinnretning, en prøvepakning .eller et prøvesett, en metode til fremstilling av en prøveinnretning og en fremgangsmåte til bestemmelse av urinstoff. I detalj hører de egnede prøvemidler til den type som omfatter urease og en reagenskombinasjon som inneholder acetylaceton og en C<->|-C^-alkylaldehyd eller reaksjonsprodukt av acetylaceton

og formaldehyd (3,5-diacetyl-2,6-heptan-dion ).

For dannelse av en prøveinnretning kan kombinasjonen innarbeides i en bærer, f. eks. et grunnstoff eller eit tablett. Kombinasjonen eller middelet kan også kombineres med en prøvepakning eller et prøvesett til bestemmelse av urinstoffet, som innpakket kombinasjon inneholder en beholder med urease, en beholder med regenskombinasjon ifølge oppfinnelsen, og eventuelt en beholder med en puffer.

Av klarhetsgrunner anvendes bestemte uttrykk, imidlertid refererer disse uttrykk seg bare til den til an-skueliggjørelse valgte bestemte utførelsesformer, og skål ikke begrense oppfinnelsens omfang.

Ifølge en utførelsesform omfatter prøvemiddel-et til bestemmelse av urinstoffet i en prøve urease, og en indikator- reagenskombinasjon, som inneholder acettulacetin og en C| -C^-alkyladehyd. Som alkylaldehyd kan det fortrinnvis anvendes formaldehyd eller acetaldehyd. Ved en annen ut-førelsesform kan reaksjonsproduktet som fåes fra omsetning av acetylaceton og formaldehyd, d.v.s 3»5-diacetyl-2,6-heptan-dion, likeledes anvendes som indikator-reagens for bestemmelsen. Syntesen av 3»5-diacetyl-2,6-heptandion fra acetylaceton og formaldehyd ble omtalt av B.D.Wilson et al i britisk patent 618 14-0 og av B,D. Wilson i J.Org-Chem. 28 (1 963) 314--320, imidlertid ble denne forbindelse ikke syn-tetisert for analyseformål.

Reagenskombinasjonen kan anvendes i oppløsning eller i forskjellige vanlige tørre former. Enten som opp-løsning eller i tørr form anvendes reagenskombinasjonen i følge oppfinnelsen til påvisning av urinstoff idet den bringes i berøring med en prøve av en kroppsvæske, f. eks. urin, blod, plasma eller serum. Når det i prøven som skal undersøkes er tilstede urinstoff, forårsakes herved en farveendring. Da det i:, avhengighet av konsentrasjonen av urinstoffet som skal påvises finner sted en karakteristisk ' f arver eaks jon i, er de.t mulig med en kvantitativ bestemmelse av uristoffet.

Oppfinnelsen omfatter videre en prøveinnretning som inneholder midler ifølge oppfinnelsen, og' en med:'.en.: gangs dypping gjennomført metode, til fremstilling av en slik reagensprøveinnretning ideteen bærer, f. eks. en tablett eller grunnmasse bringes i berøring med en oppløsning av sammensetningen ifølge oppfinnelsen. Når denne berøring foregår ved impregnering med en oppløsning av middelet, ifølge oppfinnelsen, blir den på denne måte behandlede bærer deretter tørket. Som oppløsningsmiddel som anvendes til fremstilling av impregneringsoppløsning, egner det seg vann, fysiologiske oppløsgninger, organgiske oppløsningsmidler eller blandinger av disse forbindelser.

Prøveinnretningen anvendes fortrinnsvis idet

den i kort tid dyppes i en prøve-prøve, eller på annen måte innføres en prøve-prøve i bærereren hvorved det inntrer en fastslåbar farveendring når urinstoff er tilstede. Prøveinnretningen kan anvendes på samme måte når det under-søkes prøver av plasma, :;'ser.um eller andre kroppsvæsker.

Hvis ønsket kan prøveinnretningen ifølge oppfinnelsen an-bringes i en langstrakt holder.

Uttrykket "bærer" betegner grunnstoffer eller innleiringsmasser, som er uoppløselige i den.fysiologiske "eller andre væske, og forblir uberørt strukturelt under deres innvirkning. Som bærere egner det seg eksempelvis papir, cellulose, tre, tekstile stoffer, gelatin, forskjellige organniske polymerisater, f. eks. polypropylen og andre organiske materialer, som for fagfolk er kjent som film-dannere. Av enkelthetsgrunner kan grunnstoffet eller mar-triksen kombineres med en uoppløselig bærer som består av polystyr.en. Uttrykket "bærer" omfatter også vanlige tablett-ter ing s stoff er som presses eller formes til en passende og bekvem fysikalsk form.

Oppfinnelsen omfatter videre en prøvepakke eller et prøvesett som tjener til bestemmelse av urinstoff i en prøve, og i forpakket kombinasjon inneholder en beholder med urease, en beholder for en indikator-reagenssammen-setning av acetylaceton, og et Cj-C^-alkylaldehyd og even? tuelt en beholder med en puffer. Som alkylaldehyd anvendes fortrinnsvis formaldeJiyd eller acetaldehyd. Ved en annen utførelsesform inneholder prøvesettet til bestemmelse av urease i forpakket kombinasjon en beholder med urease, en beholder med 3»5-diacetyl-2,6-heptandion og eventuelt en beholder med en puffer. Ved disse to utførelsesformer kan prøvesettet dessuten inneholde den beholder med urinstoff-standard til sammenligning med prøven etter omsetning med sammensetningen eller prøveinnretningen. I tillegg kan prøvesettet være beskaffet således at minst ett av beholder - ene er en kuvette;f ortrinnsvis en optisk klar kuvette, kan anvendes for den spektrofotometriske anvisning av reaksjonen som inntrer ved berøring av sammensetningen med en prøve.

For oppløsninger som inneholder sammensetningen ifølge oppfinnelsen, foretrekkes visse områder. Når bestemmelsen med sammensetningen gjennomføres i oppløsning,

er konsentrasj onsområdet i den endelige vandige oppløsning, for bestemmelsen som følger: Urease kan anvendes i konsentrasjoner som gir en aktivitet på ca. 5 til 60 U/ml (U er enheten av enzymaktiviteten, definert som den aktivitets-størrelse som 1 umol urinstoff omdanner pr. minutt ved 25°C og pH på 8.0 etter bestemmelsesmetoden av Schlegel og Kaltwasser i H.U. Bergmeyer, Methods og Enzymatic Analysis, 2. engelseke opplag, bind 2, Verlag-Chemie-Academic Press, New York 1 974-, i avhengighet av volumforholdet mellom prøve og reagens. Når dette forhold er lavt (ca. 1/125), utgjør ureasekonsentrasjonen fortrinnsvis 18 til 30 U/ml. Når dette forholdet er høyt (ca. 1/20), ligger den foretrukkede ureasekonsentrasjonen ved 30 til 50 U/ml.

Som indikatorreagens kan det tjene acetylaceton og et Cj -C^-alkylaldehyd eller også 3,5-diacetyl-2,6-heptan-dion (DHD). I begge tilfeller er konsentrasjonen innen grensene for oppløselighet,<!>fortrinnsvis høyest mulig.

Når acetylaceton og et C..I -C 4,-alkylhaldehyd anvendes som indikatorreagens er forholdet mellom acetylaceton og aldehyd fortrinnsvis støkiometrisk ( 2mol acetylaceton/1 mol aldehyd). I prøvemiddelet kan det innbefattes e.t pufferstoff. Puffer-stoffet kan anvendes i konsentrasjoner på ca. 0,01 til 1,0 mol/l, fortrinnvis 0,25 mol/l, og dannes fortrinnsvis med fosfatsalter. Fortrinnvis tilsettes dinatriumedetat (dinatriumsalt av EDTA) i konsentrasjoner på ca. 0,002 til 0,008 mol/l. Oppløsningen pH-verdi kan utgjøre ca. 5,0 til 9,0, og utgjør fortrinnvis 6,5 til 7,5.

Bestemmelsen kan også gjennomføres med kombi-nasjoner ifølge oppfinnelsen i tørr form. Når bæreren bringes i berøring med sammensetningen ved impregnering med en oppløsning av sammensetningen, ligger konsentrasjonen i den vandige oppløsning for impregneringen som følger: Aktiviteten (U/ml) av urease er innen oppløselighetsgren-sene fortrinnsvis høyest mulig. Indikatorreagenset, puffer-stoffet og dinatriumedetat anvendes i samme konsentrasjons-områder som benevnt, for den med sammensetningen i oppløsning gjennomførte bestemmelser. Et vannoppløselig, ,' lavtkokende oppløsnignsmiddel, f. eks. metanol, tilsettes fortrinnsvis i konsentrasjoner på ca. 20 til 30 ml/dl.

Typen av gjennomføring av bestemmelsen av urinstoff med sammensetningen ifølge oppfinnelsen i oppløsning, kan variere i avhengig av om bestemmelsen foregår manuelt eller automatisk, og hvilke type av instrumentasjon som er disponibelt. Den grunnleggende forskjell ligger mellom (A) analysens likevektsmetoder og (B) analysens kinetiske metoder.

Ved likevektsmetoden gjennomføres reaksjonen

ved ca. 37°C,etter en egnet tid avleses ekstinksjonen av oppløsningen med et spektrofotometer ved den egnede bølge-lengde. Da den tid inntil reaksjonen oppnår likevekt (slutt-punktet), er meget lang, gjennomføres bestemmelsen fortrinnsvis i konsentrert oppløsning, for at reaksjonshastigheten er tilstrekkelig stor, og avlesningen forestås på et quasi-likevektspunkt. Når reaksjonen nærmer seg slutten, og hastigheten er tilstrekkelig lav, fortynnes;oppløsningen ved værelsestemperatur med den vannmengde som er nødvendig for at ekstinksjonen kommer i instrumentskalaen, og reaksjonen fullstendig opphører. Deretter avleses ekstinksjonen av oppløsning ved værelsestemperatur mot et blind-

reagens. Beregningen foregår på vanlig måte, ved hjelp av en standard. :■

Ved den kinetiske sluttpunktmetode gjennomføres reaksjonen ved ca.37°C, og etter en på forhånd bestemt faststående tid (før likevekten) avleses oppløsningens ekstinksjon med spektrofotometer ved samme temperatur ved den egnede bølgelengde mot et blindreagens. Når den tid, hvor ekstinksjonen avleses som ved automatiske analyseapparater er fullstendig reproduserbar, er ekstinksjonen lineær med analytens konsentrasjon. Denne lineæritet gjelder til ethvert tidspunkt under reaksjonen. Derfor kan avlesningen foregå til ethvert tidspunkt, alt etter den nød-vendige følsomhet. Beregningen foregår ved hjelp av eh standard. Ved denne metode er det hensiktsmessig, spesielt når det anvendes serum eller plasma som prøve, å arbeide med et ikke forjhøyt volumforhold -.mellom prøve og reagens for å unngå forstyrrelser fra prøven. Derfor kan det være nødvendig med lang avlesningstid for å oppnå den nødvendige følsomhet. I dette tilfelle er det hensiktsmessig å an-vende automatiske analyseapparater, som avleser prøvens ekstinksjoner enkeltvis etter hverandre uten å avvente in-kubasjonstiden mellom de enkelte prøver (eksempelvis analysatorer med kontinuerlig gjennomstrømning).

Ved topunkts- (eller flerepunkt) - metoden, gjennomføres reaksjonen fortrinnsvis ved ca. 37°C, og oppløsningens ekstinksjonsendring over et på forhånd bes stemt faststående tidsrom (før likevekten) måles med spektr-fotometer ved samme temperatur ved den egnede bølgelengde mot et blindreagens. Når tidsintervalét, og i hvilken r ekstinksjonsendringen er målt, er fullstendig reproduser-

bar som det er tilfelle ved automatiske analy.sat-brer, er ekstinksjonsendring lineær med analytens konsentrasjon.

Denne lineæritet gjelder over hvert tidsinterval under reaksjonen. Derfor kan målingen etter den nødvendige føl-somhet foregå over ethvert ønskelig tidsinterval. Beregningen foregår ved hjelp av en standard. Ved denne metode utkobles interferenser fra i prøven tilstedeværende stoffer som absorberes ved avlesningsbølgelengden, også når det arbeides med et høyt volumforhold mellom prøve og reagens. Derfor kan den nødvendige følsomhet oppnås med meget korte måletider, og hver ønskelig type av automatiske analysatorer, som arbeider etter to punkt- (eller flerepunkt) - metoden kan anvendes.

Ved ovenfor omtalte analysemetoder, måles en oppløsningsekstinksjon og denne stemmer overens med en bestemmelse hvor sammensetningen ifølge oppfinnelsen er i oppløsning. Når bestemmelsen med denne sammensetning gjennomføres i tørr form, og farven utvikler seg på en ugjennomsiktig overflate, kan overnevnte metoder ."-allikevel anvendes forutsatt at et egnet instrument måler reflek.-sjonen av denne overflate istedenfor oppløsningens ekstinksjon. Som alternativ kan det foretas en kvalitativ eller halvkvantitativ avlesning, fortrinnvis ved hjelp av en egnet farve skala.

Foretrukkede utførelsesformer ifølge oppfinnelsen omtales i de følgende eksempler.

Eksempel 1

Bestemmelse av urin-nitogen i kroppsvæsker med 3, 5-diacetyl-2,6-heptandion (DHD) -.

Det for denne bestemmelse anvendte DHD, ble ført fremstilt som følger:- 136 ml acetylaceton og 52 ml 35%-ig formaldehyd (begge reagenser analyserene) ble opp-løst i destillert vann. Oppløsningen ble oppfylt til 1,0 1 og hensatt 6 dager ved værelsetemperatur (utbytte i DHD ca. 92%). Innholdet av DHD ble bestemt ved UV-analyse ved hjelp av en standardoppløsning av DHD. Den lille mengde av ikke omsatt formaldehyd ble fjernet ved anlegg av svakt vakuum. Den dannede oppløsning viser seg egnet for anvendelse som analysereagens uten ytterligere rensing.

De følgende reagenspreparater ble anvendt for urinstoffbe stemmel ser:

Reagens 1: Puffer KH2P0^/K2HP0^, 0,28 M i destillert vann,

pH 7, inneholder 0,2 g/dl dinatriumedetatdi-

hydrat (analyserene reagenser).

Reagens 2: Urease, frysetørket pulver, 50 U/mg (besørget

av Miles Laboratories, Inc., Kode 36-615).

Reagens 3: Den på overnevnte måte fremstilte DHD-oppløs-

ning.

En arbeidsoppløsning ble fremstilt som følger: Reagens 1+2:150 mg reagens 2 ble oppløst i 100 ml reagens

1 (stabilitet: 3 måneder ved 2-8°C).

Bestemmelsen ble gjennomført etter følgende

metoder:

A. Kinetisk topunktsmetode.

Følgende mengder i mikroliter (ul) (volumene

kunne, hvis nødvendig, endres proporsjonalt) anvendt ved bestemmelsen:

Bare ett blindforsøk og ett standardforsøk ble gjennomført i hver prøverekke.

Reaksjonen ble gjennomført ved 37°C, og ekstinksjonen avlest ved 4-10 nm med en automatisk analysator (1. avlesning etter 30 sek. 2. avlesning etter 120 sek. fra begynnelsen.). Beregning for serum- eller plasmaprøve foregikk, etter følgende formel:'

heri var A eøkningen av ekstinksjonen i det gitte tidsinterval. En vandig standard ble anvendt, da plasmarpro-triner ikke forstyrres vesentlig. Ved urinprøver ble re-sultatene multiplisert med 100.

Metoden var. lineær inntil minst 120 mg/dl urin-nitrogen i prøven. Tilbakevinningsprøver, som ble gjennom-ført under tilsetning av kjente mengder urinstoff til sammenhelte menneskelige plasma,viste en gjennomsnittlig prosentual gjenvinning på 99»0 i området av lineæriteten. Bestemmelser av menneskelig srea eller plasma, som gjennom-føres sammenlignet til urease/Berthelotmetiden, ga en korre-lasjonskoeffisient r på 0,997 i området for lineæriteten.

B. Kinetisk enpunkt-metode.

Følgende mengder (iul ) ble anvendt for bestemmelsen (volumina kunne hvis nødvendig, modifiseres.proppr-sj onalt):

Bare ett blinforsøk og ett standardforsøk ble gjennomført ved hver prøverekke.

Reaksjonen ble gjennomført ved 37°C, og ekstinksjonen ved410 nm ble avlest med en automatisk analysator etter 10 minutter, beregnet fra begynnelsen. Beregningen for serum- eller plasmaprøver foregikk ved hjelp av følgen-de formel:

Heri var E ekstinksjonen ved den gitte avlesningstid. En vandig standard ble anvendt da plasmaproteiner ikke for-styrrer vesentlig. Ved urinprøver ble resultatet multiplisert med 100.

Metoden var lineær til minst 120 mg/dl urin-nitrogen i prøven. Gjenvinningsforsøk som ble gjennomført ved tilsetning av kjente mengder urinstoff til sammenhelt menneskelig plasma, viser en gjennomsnittlig prosentuell gjenvinning på 99»3i området av lineæriteten. Bestemmelse for menneskelig sera eller plasma som ble gjennomført sammenlignet til urease/Berthelot-metoden, ga en korrelasjons-koeffisient r på 0,995 i området for lineæriteten.

C. Likevektsmetoden.

I bestemmelsen av anvendtevolummengde, var samme som ved foregående metode. Reaksjonen ble gjennom-ført ved 37 C. Etter 1,5 ti mer ble oppløsningen tatt ut av inkubatoren og fortynnet med vann til 10 ml, hvorpå ekstinksjonen ved 4IO nm ble avlest med spektrofotometer. Beregningen var det samme som ved foregående metode.

Metoden var lineær til minst 120 mg/dl urin-nitrogen i prøven. Gjenvinningsfor søk som ble gjennomført med tilsetning av kjente mengder urinstoff til sammenhelt menneskelig plasma, ga en gjennomsnittlig prosentual gjenvinning på 98,4i området av lineæriteten. Til sammen ligning med urease-Berthelot-metoden gejnnomførte bestemmelser på menneskelig sera og plasmaer, ga en korrelasjons-koeffisient r på 0,986 i området for linæritet.

Således påvist at DHD gir tilforlatelige resultater ved bestemmelse av urin-nitrogen, såvel ved en-trinn som også ved to-trinnskinetisk bestemmelse, samt ved likevekt smetoden. Resulatatet stemmer meget godt overens med de ved anvendelse av Standard-Berthelot-metode oppnådde resultater, og viste ikke de ved de kjente urinstoffbes stemmelsesmetoder opptredende ulemper.

Eksempel 2

Bestemmelse av urin-nitrogen i kroppsvæske med acetylaceton og formaldehyd.

Følgende reagenspreparater ble anvendt for be stemmelsen:

Reagens 1 : som i eksempel 1

Reagens 2 : som i eksempel 1

Reagens 3 : acetylaceton (analyseren)

Reagens4'• 35%- i- g formaldehyd (analyseren)

Arbeidsoppløsningen ble fremstilt som følger: Reagens 1+2: som eksempel 1

Reagens 3 + A'13t& ml reagens 3 og 5,2 ml reagens4ble blandet og oppfylt med destillert vann til 100 ml.

Bestemmelsen ble gjennomført etter samme metoder som ble omtalt i eksempel 1, med samme forøsksan-ordning, idet det ble oppnådd samme ytelser. Lineæriteten var den samme' og den prosentuelle gjenvinning og korrela-sjonskoeffisienten lå meget nær ved de i eksempel 1 oppnådde verdier.

Eksempel 3

Prøveinnretning for bestemmelse av urin-nitrogen i kroppsvæsker med DHD.

DHD ble først fremstilt som følger:

100 ml acetylaceton og 39 ml 35'%- ±g formal dehyd ble oppløst i 50 ml etanol, og hensatt 3 dager ved værelsestemperatur. Oppløsningsmlddelet ble fjernet under

nedsatt trykk. Ved destillering (kokepunkt 120-125°C/0,067 mbar (0,05 mm Hg) ble det dannet 63 g DHD i form av en olje. Elementæranalyse,/beregnet for C^H^O^, hadde følgende re-sultat: C 62,26, H 7,55. Det ble funnet C 61,21, H 7,70.

Filtrerpapirblad "Eaton-Dikeman nr. 204." ble impregnert med en oppløsning av følgende sammensetning:

Destillert vann til oppfylling til 100 ml oppløsning.

Disse impregner be blad ble deretter tørket, og deretter puttet til dannelse av innretninger til kvadrater på 5 mm x 5 mm. Innretningen ble deretter underlagt med dobbeltsidig klebestrimler, og herved fastgjort på kunst-stoff håndtak.

De på denne måte oppnådde prøvepapir, ble dyppet

i menneskeserum eller plasma, og etter 12 minutter ved værelsestemperatur ble den dannede gule farve sammenlignet visuelt med en egnet farveskala: Normalverdier av urinstoff-nitrogen ga ingen tydlig farvereaksjon, men dette var tilfelle ved verdier som lå over normalen. De samme prøve-papir ble dyppet i menneskelig urin. Etter 2 minutter ved værelsestemperatur ble den gulaktig dannede farve sammenlignet visuelt med en egnet farveskala. Normalverdier av urinstoffnitrogen ga ingen tydlig farvereaksjon, mens dette var tilfelle ved verdier som lå over normalen. Hverken plasmaproteiner eller stoffer som foruten urinstoff var tilstede i urinen, ble forstyrret.

Eksempel4

Bestemmelse av urinstoffnitrogen i kroppsvæsker med acetylaceton og acetaldehyd.

De følgende reagenspreparater ble anvendt for bestemmelsen:

Reagens 1 : som_i eksempel 1

Reagens 2 : som i eksempel 1

Reagens 3 : 13,6 ml acetylaceton + 3,7 ml acetaldehyd (begge analyserene reagenser), fylt med destillert vann til 100 ml.

En arbeidsoppløsning ble fremstilt som følger: Reagens 1+2: som i eksempel 1.

Bestemmelsen ble gjennomført etter den kinetiske topunkt-metoden. De ved bestemmelsen anvendte volum-mengder, var de samme som ved-eksempel 1. Reaksjonen ble gjen-nomført ved 37°C og ekstinksjonen ved 390 nm, avlest med en automatisk! analysator (første avlesning etter 30 sek, 2 avlesning etter-10 minutter fra begynnelsen). Beregningen var den samme som ved eksempel 1. Metoden var lineær; til minst 120 mg/dl urinstoffnitrogen i prøven.

Gjenvinningsprøve som ble gjennomført ved tilsetning av kjente mengder urinstoff til sammenhelt menneskelig plasma, ga en gjennomsnittlig prosentuell gjenvinning på 98,8 i området av lineæriteten. Av menneskelig sera og plasma sammenlignet med urease/Berthelot-metoden gjennom-førte bestemmelser, ga en kbrrelasjonskoffesient r på 0,992 i området for lineæriteten.

Claims (10)

1. Prøvemiddel til bestemmelse av urinstoff i en prøve, inneholder urease og en indikator-reagens-sammensetning av acetylaceton og et■Cj-C^-alkyladehyd.

2. Prøvemiddel ifølge krav 1, karakterisert v ^e d at -C^ -alkylaldehyd er formaldehyd.

3- Prøvemiddel ifølge krav 1, karakterisert ved at C^ rC^ -ålkylaldehyd er acetaldehyd.

4- Prøvemiddel til bestemmelse av urinstoff i en prøve inneholder urease og en indikator-reagens-sammensetning, som inneholder 3»5 -diacetyl-2,6-heptandion.

5. Innretning til bestemmelse av urinstoff i en prøve, karakterisert ved en bærer, hvori det er innarbeidet et prøvemiddel ifølge krav 1 til 4.

6. Fremgangsmåte til bestemmelse av urinstoff i en prøve, karakterisert ved at man bringer prøven i berøring med prø vemiddelset ifølge krav 1 til 4, og herved iakttar en eventuell inntredende farvedannelse.

7. Prøvepakning for bestemmelse av urinstoff i en prøve, inneholdende i pakket kombinasjon en beholder med urease, og en beholder med indikator-reagens-sammensetning som inneholder acetylaceton og et -C^ .alkylaldehyd.

8. Prøvepakning ifølge krav 7, k a r a k t e:i r i-sert ved at C^ -C^ -alkylaldehyd er formaldehyd.

9. Prøvepakning ifølge krav 7, karakterisert ved at C| -C^ -alkylaldehyd er acetaldehyd.

10. Prøvepakning til bestemmelse av urinstoff i en prøve, inneholdende i pakket kombinasjon en beholder med urease og en beholder med 3»5 -diacetyl-2,6-heptandion.