[go: up one dir, main page]

NO336159B1 - Glukosebiosensor, fremgangsmåte, anvendelse samt blanding omfattende mutert glukose/galaktosebindingsprotein - Google Patents

Glukosebiosensor, fremgangsmåte, anvendelse samt blanding omfattende mutert glukose/galaktosebindingsprotein Download PDF

Info

Publication number
NO336159B1
NO336159B1 NO20043259A NO20043259A NO336159B1 NO 336159 B1 NO336159 B1 NO 336159B1 NO 20043259 A NO20043259 A NO 20043259A NO 20043259 A NO20043259 A NO 20043259A NO 336159 B1 NO336159 B1 NO 336159B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
cysteine
glucose
serine
binding protein
amino acid
Prior art date
Application number
NO20043259A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20043259L (no
Inventor
Bruce J Pitner
Terry J Amiss
Colleen M Nycz
Douglas B Sherman
David J Wright
Original Assignee
Becton Dickinson Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Becton Dickinson Co filed Critical Becton Dickinson Co
Publication of NO20043259L publication Critical patent/NO20043259L/no
Publication of NO336159B1 publication Critical patent/NO336159B1/no

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G01N33/5438—Electrodes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/817—Enzyme or microbe electrode
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]
    • Y10T436/144444—Glucose

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)

Description

Glukosebiosensor, fremgangsmåte, anvendelse samt blanding omfattende mutert glukose/galaktosebindingsprotein
OPPFINNELSENS BAKGRUNN
1. OPPFINNELSENS OMRÅDE
Oppfinnelsen ligger på området bioteknologi. Spesielt er oppfinnelsen rettet mot blandinger inneholdende spesielle muterte glukose/galaktosebindingsproteiner inneholdende rapportørgrupper, analytt-biosensorinnretninger som er avledet derfra, og deres anvendelse som analytiske biosensorer.
2. BESKRIVELSE AV RELEVANT TEKNIKK
Overvåking av glukosekonsentrasjoner for å lette adekvat metabolisk kontroll ved diabetes er et ønskelig mål og vil forbedre livet for mange individer. I dag benytter de fleste diabetikere "fingerstikk"-metoden for å overvåke blodglukosenivået og pasientfordrageligheten er problematisk på grunn av den smerte som forårsakes av hyppig (flere ganger pr. dag) stikk. Som en konsekvens har det vært gjort forsøk på å utvikle ikke-invasive eller minimalt invasive in vivo- og mer effektive in vitro-metoder for hyppig og/eller kontinuerlig overvåking av blodglukose eller andre glukoseholdige, biologiske fluider.
Noen av de mest lovende av disse metoder involverer bruken av en biosensor. Biosensorer er innretninger som er i stand til å gi spesifikke, kvantitative eller semikvantitative, analytiske informasjoner ved bruk av et biologisk gjenkjenningselement som er kombinert med et transduserende (detekterende) element.
Det biologiske gjenkjenningselement i en biosensor bestemmer selektiviteten slik at kun forbindelsen som skal måles, fører til et signal. Valget kan være basert på biokjemisk gjenkjennelse av liganden der den kjemiske struktur av liganden (for eksempel glukose) er uendret eller biokatalyse der elementet katalyserer en biokjemisk reaksjon av analytten.
Transduseren translaterer gjenkjenning til det biologiske gjenkjenningselement til et semi-kvantitativt eller kvantitativt signal. Mulige transduserteknologier er optiske, elektrokjemiske, akustisk/mekaniske eller kolorimetriske. De optiske egenskaper som er eksploatert, inkluderer absorbans, fluorescense/fosforescens, bio/kjemiluminescens, reflektans, lysspredning og refraktiv indeks. Konvensjonelle rapportørgrupper som fluorescente forbindelser, kan benyttes, eller alternativt er det muligheter for direkte optisk detektering uten behov for en merkelapp.
Biosensorer som er spesifikt designert for glukosedetektering som benytter biologiske elementer for signaltransduksjon, benytter typisk elektrokjemisk eller kolorimetrisk detektering av glukoseoksidaseaktiviteten. Denne metode er assosiert med vanskelighet som inkluderer innvirkningen av oksygennivåene, inhibitorer i blodet og problemer med elektrodene. I tillegg resulterer detektering i forbruk av analytt som kan forårsake vanskeligheter når man måler lave glukosekonsentrasjoner.
Et sterkt økende område av biosensorutvikling er bruken av fluorescent merkede, periplasmiske bindingsproteiner (PBP'er). Som rapportert av Cass ( Anal. Chem. 1994, 66, 3847) ble et merket maltosebindingsprotein (MBP) effektivt påvist som en brukbar maltosesensor. I dette arbeidet ble MBP, som ikke har noen native cysteinrester, mutert for å gi et protein med en enkelt cysteinrest i posisjon 337 (S337C). Denne mutasjonsposisjon ligger innenfor bindingskløften der maltosebinding inntrer og erfarer derfor en stor omgivelsesforandring ved maltosebinding. Tallrike fluorofor ble studert, noen enten blokkerte ligandbindinger eller interferert med den konformasjonelle forandring av proteinet. Av de som var studert, resulterte IANBD i en vesentlig økning av fluoressens (160%) intensiteten ved maltosebinding. Dette resultat er konsistent med lokasjonen og av fluoroforforandringen fra en hydrofil eller oppløsningsmiddeleksponert omgivelse til en mer hydrofob omgivelse enn det som teoretisk skulle kunne forutsies fra lukking av hengslet ved maltosebinding. Imidlertid bandt dette mutante protein og den assosierte rapportørgruppen ikke diagnostisk viktige sukkere i pattedyr-kroppsfluider. Cass beskrev også ( Analytical Chemistry 1998,
70(23), 5111-5113) assosiasjonen av dette protein på TiC>2 overflater, imidlertid led det overflatebundne protein fra redusert aktivitet med tiden og krevde konstant hydratering.
Hellinga, et al., (US 6.277.627) rapporterte konstruksjonen av en glukosebiosensor ved innføring av en fluorescent transduser i et Galaktose/Glukose Bindingsprotein (GGBP) som er mutert til å inneholde en cysteinrest og derved trekke fordel av de store konformasjonsforandringer som inntrer ved glukosebindingen. Hellinga et al (US 6.277.627) beskriver at transmisjonen av konformasjon eller forandringer i muterte GGBP'er kan eksploateres til konstruktintegrerte signaltransduksjonsfunksjoner som konverterer et glukosebindingsevenement til en forandring i fluorescens via en allosterisk koblingsmekanisme. De fluorescente transduksjonsfunksjoner er rapportert å interferere minimalt med de iboende bindingsegenskaper for sukkerbindingslommen i
GGBP.
For nøyaktig å bestemme glukosekonsentrasjonen i biologiske oppløsninger som blod, interstitialfluider, okularoppløsninger eller perspirasjon, osv., kan det være ønskelig å justere bindingskonstanten for følermolekyler i biosensor til å passe til det fysiologiske og/eller patologiske arbeidsområdet for den biologiske oppløsning av interesse. Uten egnet bindingskonstant kan et signal være utenfor området for en spesiell fysiologisk og/eller patologisk konsentrasjon. I tillegg kan biosensorer være konfigurert ved bruk av mer enn et protein, hver med en annen bindingskonstant, for å gi nøyaktige målinger over et vidt spektrum av glukosekonsentrasjonen slik det er beskrevet av Lakowicz (US 6.197.534).
Salins et al. (Anal. Biochem., vol. 294, nr. 1, 2001, s. 19 - 26, ISSN 0003-2697) omhandler muterte glukose/galaktose bindingsproteiner som kan fungere som en glukosebiosensor.
På tross av brukbarheten til muterte GGBP'er er kun få av disse proteiner konstruert og undersøkt, verken med eller uten rapportørgrupper. Spesifikke mutasjoner av seter og/eller festing av visse rapportørgrupper kan bevirke modifisering av en bindingskonstant på uforutsigelig måte. I tillegg kan en biosensor som inneholder rapportørgrupper ha en ønskelig bindingskonstant, men ikke resultere i noen lett detekterbar signalforandring ved analyttbinding. Noen av de overstyrende faktorer som bestemmer sensitiviteten for en spesiell rapportørprobe som er festet til et spesielt protein for detektering av en spesifikk analytt er arten av de spesifikke interaksjoner mellom den valgte probe og proteinets aminosyrerester. Det er ikke i dag mulig å forutsi disse interaksjoner innen proteiner ved bruk av eksisterende beregningsmetoder, heller ikke er det mulig å benytte noen fornuftig designmetologi til å optimalisere valget av rapportørprober. Det er i dag ikke mulig å forutsi effekten verken på bindingskonstanten eller på selektiviteten, basert på posisjonen til en rapportørgruppe, eller proteinets aminosyresubstitusjon (eller vice-versa).
For å utvikle reagensfrie, selvforsynte og/eller implanterbare og/eller ombrukbare biosensorer ved bruk av proteiner, må transduksjonselementet være i kommunikasjon med en detekteringsinnretning for å tolke signalet til og fra transduksjonselementet. Med "tolke" menes en prosess med sending av lys til og måling av emittert lys fra en prøve. Typiske metoder inkluderer å plassere proteiner i eller på overflaten av optiske fibere eller plane bølgeføringer ved bruk av immobiliseringsstrategier. Slike immobiliseringsstrategier inkluderer innfanging av protein i semipermeable membraner, organiske polymermatriser eller uorganiske polymermatriser. Immobiliseringsstrategien kan til slutt bestemme ytelsen for den arbeidende biosensor. Tidligere teknikk oppsummerer tallrike problemer i forbindelse med immobiliseringen av biologiske molekyler. For eksempel undergår mange proteiner irreversible konformasjonelle forandringer, denaturering og tap av biokjemisk aktivitet. Immobiliserte proteiner kan eksistere i et stort antall mulige orienteringer på enhver spesiell overflate med for eksempel noen proteiner orientert slik at deres aktive seter er eksponert mens andre kan være orientert slik at de aktive setene ikke er eksponert og således ikke i stand til å undergå noen selektive bindingsreaksjoner med analytten. Immobiliserte proteiner er også offer for tidsavhengig denaturering, denaturering under immobilisering og utlutning av innfangede proteiner etter immobilisering. Derfor oppstår det problemer inkludert en manglende evne til å opprettholde kalibrering av føleinnretningen og signaldriften. Generelt krever bindingsproteiner en orienteringskontroll for å muliggjøre deres bruk og derfor er fysisk absorpsjon og vilkårlig eller massekovalent overflatefesting eller immobiliseringsstrategier som beskrevet i litteraturen, generelt ikke vellykket.
Derfor er det et behov i denne teknikk til å konstruere ytterligere, brukbare, muterte proteiner og muterte GBBP proteiner som genererer detekterbare signalforandringer ved analyttbinding for bruk som biosensorer, og i tillegg er det et behov i teknikkene for å konstruere ytterligere, brukbare, muterte bindingsproteiner - og muterte GGBP'er inneholdende rapportørgrupper som genererer detekterbare og reversible signalforandringer ved analytt- eller glukosebinding for bruk som biosensorer.
OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en glukosebiosensor, kjennetegnet ved at den omfatter: minst ett mutert glukose/galaktose bindingsprotein som har minst en aminosyre substitusjon som er et cystein i posisjon 149, hvori aminosyre nummereringen referer til E.coli glukose/galaktose bindingsprotein som har 309 aminosyrerester, og minst en rapportørgruppe festet dertil, slik at rapportørgruppen gir en detekterbar og reversibel signalforandring når det muterte bindingsprotein er eksponert til varierende glukosekonsentrasjoner, idet den detekterbare og reversible signalforandring er relatert til nevnte varierende konsentrasjoner.
Videre tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for in vitro glukosedetektering, kjennetenet ved at den omfatter: a) å tilveiebringe minst ett mutert glukose/galaktosebindingsprotein og minst en rapportørgruppe festet dertil som definert ved glukose biosensor ifølge ethvert av kravene 1 til 14; b) eksponering av nevnte muterte glukose/galaktosebindingsprotein til varierende glukosekonsentrasjoner; og c) detektering av en detekterbar og reversibel signalforandring fra nevnte rapportørgruppe der nevnte detekterbare og reversible signalforandring tilsvarer
nevnte varierende glukosekonsentrasjoner.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer i tillegg anvendelse av et mutert glukose/galaktosebindingsprotein og minst en rapportørgruppe koblet dertil som definert over for fremstilling av et diagnostisk middel for in-vivo glukose deteksjon.
Videre tilveiebringer oppfinnelsen en blanding, kjennetegnet ved at den omfatter:
et mutert glukose/galaktosebindingsprotein med minst en aminosyresubstitusjon bestående av et cystein i posisjon 149, hvori aminosyre nummereringen referer til E.coli glukose/galaktose bindingsprotein som har 309 aminosyrerester.
Det ovennevnte muterte glukose/gallaktosebindingsprotein anvendt i biosensoren, det diagnostiske midlet, fremgangsmåten eller blandingen kan ha ytterligere substitusjoner valgt fra cystein i posisjon 1, et serin i posisjon 1, et cystein i posisjon 11, et cystein i posisjon 14, et cyistein i posisjon 19, et cystein i posisjon 43, et cystein i posisjon 74, et cystein i posisjon 107, et cystein i posisjon 110, et cystein i posisjon 112, et cystein i posisjon 113, et cystein i posisjon 137, et cystein i posisjon 213, et cystein i posisjon 216, et cystein i posisjon 238, et cystein i posisjon 287, et cystein i posisjon 292, et cystein i posisjon 152, et cystein i posisjon 182, et cystein i posisjon 236 og et cystein i posisjon 296.
Videre tilveiebringes det en biosensor, et diagnostisk middel, fremgangsmåte eller blanding omfattende et mutert glukose/galaktosebindingsprotein med minst to aminosyresubstitusjoner valgt fra gruppen bestående av et cystein i posisjon 112 og et serin i posisjon 238, et cystein i posisjon 149 og et serin i posisjon 238, et cystein i posisjon 152 og et cystein i posisjon 182, et cystein i posisjon 152 og et serin i posisjon 213, et cystein i posisjon 213 og et cystein i posisjon 238, et cystein i posisjon 149 og et arginin i posisjon 213, et cystein i posisjon 149 og et serin i posisjon 213 og et serin i posisjon 238 og et cystein i posisjon 149 og et arginin i posisjon 213 og et serin i posisjon 238. Ytterligere eksempler på muterte glukose/galaktosebindingsproteiner er vist nedenfor i Tabell 1. Aminosyrerestnumrene henviser til den publiserte sekvens av E. coli med 309 rester som detaljert nedenfor, eller den tilsvarende aminosyrerest i en hvilken som helst i det vesentlige homolog sekvens fra en alternativ kilde (for eksempel glukose/galaktose bindingsproteiner fra Citrobacter freundii eller Salmonella typhimurium, sekvensaksessnumre P23925 henholdsvis P23905).
KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE
Figur 1 viser forandringen i fluorescensrespons for et område av glukosekonsentrasjoner for A213C/L238C NBD amid GGBP H6i oppløsning. Figur 2 viser forandringen i fluorescensrespons for et område av glukosekonsentrasjonen for B149C/A213R NBD amid GGBP H6i oppløsning. Figur 3 illustrerer reversibel signaltransduksjon fra et mutert bindingsprotein etter eksponering til oppløsninger av glukose ved de antydede konsentrasjoner.
DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN
Uttrykket biosensor henviser generelt til en innretning som benytter spesifikke, biokjemiske reaksjoner som medieres av isolerte enzymer, immunosystemer, vev, organeller eller hele celler, for å detektere kjemiske forbindelser, vanligvis ved elektriske, termiske eller optiske signaler. Som benyttet her, henviser en "biosensor" til et protein som er i stand til binding til en analytt som kan benyttes for detektere en analytt eller en forandring i analyttkonsentrasjonen ved detektormidler som beskrevet her.
Uttrykket "bindingsproteiner" henviser til proteiner som interagerer med spesifikke analyter på en måte i stand til å tilveiebringe eller transdusere et detekterbart og/eller reversibelt signal som kan differensieres enten fra når analytten ikke er tilstede, analytten er tilstede i varierende konsentrasjoner med tiden, eller på en konsentrasjonsavhengig måte, ved hjelp av de her beskrevne metoder. Transduksjonsevenementet inkluderer kontinuerlige, programmerte eller episodiske midler inkludert engangs- eller ombruksapplikasjoner. Reverserbar signaltransduksjon kan være øyeblikkelig eller være tidsavhengig og tilveiebringe en korrelasjon i nærværet eller konsentrasjonen av en analytt. Bindingsproteiner som er mutert på en slik måte, for å bevirke transduksjon, er foretrukket.
Uttrykket "galaktose/glukosebindingsprotein" eller "GGBP" slik det her benyttes, henviser til en type protein som finnes naturlig i bakterieperiplasmiske rom. Disse proteiner er naturlig involvert i kjemotaksis og transport av små molekyler (for eksempel sukkere, aminosyrer og små peptider) inni cytoplasmaet. GGBP er et enkeltkjedeprotein bestående av to globulære oc/p-domener som er forbundet via tre tråder for å danne et hengsel. Bindingssetet er lokalisert i kløften mellom de to domener. Når glukose trer inn i bindingssetet, undergår GGBP en konformasjonell forandring, sentrert ved hengslen, som bringer de to domener sammen og fanger glukose i bindingssetet. Krystallografiske røntgenstrukturer er bestemt for den lukkede form av GGBP fra E. coli (N.K. Vyas, M. N. Vyas, F. A. Quiocho Science 1988, 242, 1290-1295) og S. Typhimurium (S.L. Mowbray, R.D. Smith, L.B. ColeReceptor 1990, I, 41-54) og er tilgjengelige fra Protein Data Bank ( http:// www. rcsb. org/ pdbA som 2GBP og 3GBP. Villtype E Coli GGBP DNA og aminosyresekvensen kan finnes på www. ncbi. nlm. nih. gov/ entrez/ aksessnummer D90885 (genomisk klon) og aksessnummer 230520 (aminosyresekvens). Den foretrukne GGBP er fra E. coli.
"Mutert bindingsprotein" (for eksempel "mutert GGBP") henviser, slik det her benyttes, til bindingsproteiner fra bakterier inneholdende en eller flere aminosyrer som er kommet i stedet for, deletert fra eller addert til en eller flere aminosyrer som er tilstede i naturlig forekommende protein. Fortrinnsvis involverer slike substitusjoner, delesjoner eller insersjoner færre enn 5 aminosyrerester og helst en eller to rester. Eksempler på mutasjoner av bindingsproteiner inkluderer addisjon eller substitusjon av cysteingrupper, ikke-naturlig forekommende aminosyrer (Turcatti, et al. J Bio, Chem: 1996 271, 33, 19991-19998) og erstatning av i det vesentlige ikke-reaktive aminosyrer med reaktive aminosyrer for å gi den kovalente festing av elektrokjemiske eller fotoresponsive rapportørgrupper. Med "reaktiv" aminosyre menes en aminosyre som kan modifiseres med et merkende middel analogt med merkingen av cystein med et tiolreaktivt fargestoff. Ikke-reaktive aminosyrer inkluderer alanin, leucin, fenylalanin og andre som har sidekjeder som ikke lett kan modifiseres når de først er innarbeidet i et protein (se Greg T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996, San Diego, s. 4-16 for klassifisering av aminosyre-sidekjedereaktivitet).
I tillegg til den minst ene aminosyresubstitusjonen som er et cystein i posisjon 149 inkluderer mutasjonseksempler på GGBP proteinet et cystein i stedet for et lysin i posisjon 11(K11C); et cystein i stedet for aspartinsyre i posisjon 14 (D14C); et cystein i stedet for valin i posisjon 19 (VI9C); et cystein i stedet for asparagin i posisjon 43
(N43C); et cystein i stedet for glycin i posisjon 74 (G74C); et cystein i stedet for tyrosin i posisjon 107 (Y107C); et cystein i stedet for treonin i posisjon 110 (Tl 10C); et cystein i stedet for serin i posisjon 112 (Sl 12C); en dobbelt mutant inkludert en cystein i stedet for serin i posisjon 112 og serin i stedet for leucin i posisjon 238 (S112C/L238S); et cystein i stedet for lysin i posisjon 113 (Kl 13C); et cystein i stedet for lysin i posisjon 137 (K137C); et cystein i stedet for glutaminsyre i posisjon 149 og et serin i stedet for leucin i posisjon 238 (E149C/L238S); en dobbeltmutant omfattende et cystein i stedet for histidin i posisjon 152 og et cystein i stedet for metionin i posisjon 182 (H152C/M182C); en dobbeltmutant omfattende et serin i stedet for alanin i posisjon 213 og et cystein i stedet for histidin i posisjon 152 (H152C/A213S); et cystein i stedet for metionin i posisjon 182 (M182C); et cystein i stedet for alanin i posisjon 213 (A213C); en dobbeltmutant omfattende et cystein i stedet for alanin i posisjon 213 og et cystein i stedet for leucin i posisjon 238 (A213C/L238C); et cystein i stedet for metionin i posisjon 216 (M216C); et cystein i stedet for aspartinsyre i posisjon 236 (D236C); et cystein i stedet for leucin i posisjon 238 (L238C); et cystein i stedet for aspartinsyre i posisjon 287 (D287C); et cystein i stedet for arginin i posisjon 292 (R292C); et cystein i stedset for valin i posisjon 296 (V296C); en trippelmutant omfattende et cystein i stedet for glutaminsyre i posisjon 149, en alanin i stedet for serin i posisjon 213 og et serin i stedet for leucin i posisjon 238 (E149C/A213S/L238S); og en trippelmutant omfattende et cystein i stedet for glutaminsyre i posisjon 149, et arginin i stedet for en alanin i posisjon 213 og et serin i stedet for leucin i posisjon 238 (E149C/A213R/L238S). Kvadruppel (og høyere) mutanter er også inkludert, for eksempel en mutant der serin erstatter alanin i posisjon 1, cystein erstatter glutaminsyre i posisjon 149, arginin erstatter alanin i posisjon 213 og serin erstatter leucin i posisjon 238 (A1S, E149C,A213R,L238S); en mutant der serin erstatter alanin i posisjon 1, cystein erstatter glutaminsyre i posisjon 149, serin erstatter alanin i posisjon 213 og serin erstatter leucin i posisjon 238 (A1S, E149C, A213S, L238S); og en mutant der cystein erstatter glutaminsyre i posisjon 149, cystein erstatter metionin i posisjon 182, cystein erstatter alanin i posisjon 213 og serin erstatter leucin i posisjon 238 (E149C, M182C, A213C, L238S).
Mutasjonen kan tjene ett eller flere forskjellige formål. For eksempel kan et naturlig forekommende protein være mutert for å forandre langtidsstabiliteten for proteinet; for å konjugere, binde, koble eller på annen måte å assosiere protein til en spesiell innkapslingsmatriks eller polymer; for å tilveiebringe bindingsseter for detekterbare rapportørgrupper; for å justere bindingskonstanten med henblikk på en spesiell analytt; eller en hvilken som helst kombinasjon derav.
Ifølge oppfinnelsen virker analytt og muterte proteiner som bindingspartnere. Uttrykkene "assosierer" eller "binder" slik de benyttes her, henviser til bindingspartnere med en relativ bindingskonstant (Kj) som er tilstrekkelig sterk til å tillate detektering av binding til proteinet ved hjelp av en detekteringsinnretning. Ka-verdien kan beregnes som konsentrasjonen av fri analytt ved hvilken halvparten av proteinet er bundet, eller vice versa. Når analytten av interesse er glukose, er Ka-verdien for bindingspartnerne fortrinnsvis mellom rundt 0,0001 mM til rundt 30 mM, og fortrinnsvis ligger Ka-verdiområdet på fra rundt 1 mM til 15 mM ifølge oppfinnelsen.
Ifølge oppfinnelsen har det vært vist at GGBP'er kan benyttes for å detektere glukosebinding ved festing dertil av en rapportørgruppe som trasducerer en detekterbar signalforandring ved glukosebinding. Å "tilveiebringe en detekterbar signalforandring" betyr, slik uttrykket her benyttes, evnen til å gjenkjenne en forandring av en egenskap hos en rapportørgruppe på en måte som muliggjør detektering av ligand-proteinbinding. I en utførelsesform omfatter for eksempel de muterte GGBP'er en detekterbar rapportørgruppe hvis detekterbare karakteristika endrer seg ved en forandring i proteinkonformasjonen som inntrer på glukosebindingen. I en foretrukket utførelsesform er rapportørgruppen en luminescent merkelapp som resulterer i en mutert GGBP med en affinitet for glukose som gir et detekterbart skift i luminiscens egenskapene for glukosebindingen. Forandringen i detekterbare karakteristika kan skyldes en endring i omgivelsene for merkelappen som er bundet til den muterte GGBP.
Den luminescente merkelapp kan være en fluorescentmerkelapp eller en fosforescent merkelapp. Bruken av fluorescente merkelapper som kan eksiteres ved fluorescens ved eksponering til visse bølgelengder av lys, er foretrukket.
I en utførelsesform er rapportørgruppen en fluorofor. Som benyttet her, henviser "fluorofor" til et molekyl som absorberer energi og så emitterer lys. Ikke-begrensende eksempler på fluoroforer som kan benyttes som rapportørgrupper ifølge oppfinnelsen, er fluorescein, kumariner, rhodaminer, 5-TMRIA (tetrametylrhodamin-5-jodacetamid), Quantum Red™, Texas Red ™, Cy3, N-((2-jodacetoksy)etyl)-N-metyl)amino-7-nitrobenzoksadiazol (IANBD); 6-akryloyl-2-dimetylaminonaftalen (akrylodan), pyren, Lucifer Yellow, Cy5, Dapoxyl ® (2-bromacetamidoetyl)sulfonamid, (N-(4,4-difluor-1,3,5,7-tetametyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-2-yl)jodacetamid (Bodipy507/545 IA), N-(4,4-difluor-5,7-difenyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-propionyl)-N'-jodacetyletylendiamin (BODIPY ® 530/550 IA) 5-((((2-jodacetyl)amino)etyl)amino)naftalen-l-sulfonsyre (1,5-IAEDANS) ogkarboksy-X-rhodamin, 5/6-jodacetamid (XRIA 5,6). Fortrinnsvis benyttes IANBD. Mange detekterbare, iboende egenskaper hos en fluorofor rapportørgruppe kan overvåkes for å detektere glukosebinding. Noen egenskaper som kan vise forandringer ved glukosebinding, inkluderer fluorescenslevetiden, fluorescensintensiteten, fluorescensanisotropi eller polarisering, og spektrale skift for fluorescensemisjon. Forandringer av disse fluoroforegenskaper kan induseres fra forandringer i fluorofor-omgivelsene, som de som stammer fra endringer i proteinkonformasjonen. Omgivelsessensitive fargestoffer som IANBD er spesielt brukbare i denne forbindelse. Andre forandringer av fluoroforegenskapene kan stamme fra interaksjoner med selve analytten eller fra interaksjoner med en andre rapportørgruppe, for eksempel når FRET (fluorescensresonansenergitransfer) benyttes for å overvåke forandringene i avstanden mellom to fluoroforer.
Selv om bruken av fluorescente merkelapper er ønskelige, er det tatt sikte på at andre rapportørgrupper kan benyttes. For eksempel kan det benyttes elektrokjemiske rapportørgrupper der en endring i omgivelsene for rapportøren vil gi grunn til en forandring i redox-tilstanden. Slike forandringer kan detekteres ved bruk av en elektrode.
Videre er det tatt sikte på at andre spektroskopisk detekterbare merkelapper, for eksempel merkelapper som kan detekteres ved NMR (kjernemagnetiskresonans) kan benyttes, som velkjent i teknikken.
Rapportergruppen kan være festet til det muterte protein eller GGBP'ene på en hvilken som helst konvensjonell måte, som kjent i teknikken. For eksempel kan rapportørgruppene festes via aminer eller karboksylrester på proteinet. Spesielt foretrukket er imidlertid en kovalent kobling via tiolgrupper på cysteinrester. For muterte GGBP'er er for eksempel cysteiner lokalisert på posisjon 11, posisjon 14, posisjon 19, posisjon 43, posisjon 74, posisjon 107, posisjon 110, posisjon 112, posisjon 113, posisjon 137, posisjon 149, posisjon 152, posisjon 213, posisjon 216, posisjon 238, posisjon 287 og posisjon 292 foretrukket ifølge oppfinnelsen.
Enhver tiolreaktiv gruppe som er kjent i teknikken kan benyttes for festing av rapportørgrupper som fluoroforer til et cystein på et konstruert protein. For eksempel er et jodacetamid, bromacetamid eller maleimid velkjente tiolreaktive deler som kan benyttes for dette formål.
Fluoroforer som arbeider ved lange eksiterings- og emiteringsbølgelengder (for eksempel rundt 600 nm eller høyere eksiterings- eller emitteringsbølgelengder) er foretrukket når den molekylære sensor skal benyttes in vivo, for eksempel innarbeides i en implanterbar biosensorinnretning (huden er opak under 600 nm). I dag finnes det få miljømessig sensitive prober tilgjengelige i dette området av spekteret og sannsynligvis ingen funksjonelle, tiolreaktive grupper. Imidlertid kan tiolreaktive derivater av Cy-5 fremstilles, for eksempel som beskrevet av H. J. Gruber et al.„ Bioconjugate Chem.,
(2000), 11, 161-166. Konjugater inneholdende disse fluoroforer, for eksempel festet til forskjellige cysteinmutanter som er konstruert i muterte GGBP'er, kan screenes for å identifisere de som resulterer i den største forandring i fluorescens ved glukosebinding.
Muterte GGBP'er kan konstrueres til å ha en histidinmerkelapp på protein N-terminus, C-terminus eller begge. Histidinfusjonsproteiner er hyppig benyttet på det molekylærbiologiske området for å understøtte rensing av proteiner. Eksempler på taggesystem gir proteiner med en tag inneholdende ca. seks histidiner og fortrinnsvis påvirker slik tagging ikke bindingsaktiviteten for den muterte GGBP.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en biosensor og en fremgangsmåte for å fremstille et diagnostisk middel for in vivo glukosedeteksjon. I denne forbindelse består biosensoren av en eller flere muterte bindingsproteiner som er innkapslet i en matriks. Den innkapslede biosensor kan også benyttes som en implanterbar innretning eller en del derav.
"Matriksen" kan være i en hvilken som helst ønsket form, inkludert plate, sylinder, pute, mikrosfære, porøs polymer, åpencellet skum eller lignende, forutsatt at den er permeabel for analytten. Matriksen forhindrer i tillegg utlutning av biosensoren. Matriksen tillater at lys fra optiske kilder eller ethvert annet interagerende lys til eller fra rapportørgruppen passerer gjennom biosensorer. Midlene for bestemmelse eller detektering av en forandring i analyttkonsentrasjonen kan i en utførelsesform være
kontinuerlig. Alternativt kan midlene for bestemmelse eller detektering av analyttkonsentrasjonen være programmert eller episodisk.
Den tilsiktede in vivo biosensor ifølge oppfinnelsen består av minst et mutert bindingsprotein i en analyttpermeabel omgivelse eller en innkapslingsmatriks slik at det muterte bindingsprotein gir en detekterbar og reversibel signalforandring når det muterte bindingsprotein eksponerer til varierende analyttkonsentrasjoner, og det detekterbare og reversible signal kan relateres til konsentrasjonen av analytten.
I dette aspekt ved oppfinnelsen kan konfigurasjonen for transduserelementet for eksempel være innarbeidet i den distale ende av en fiber eller en annen liten, minimalt invasiv probe ob innføres i vevet hos en pasient for å muliggjøre metoder for bruk inkludert episodisk, kontinuerlig eller programmert avlesning av pasienten. De implanterbare biosensorer kan, i enkelte utførelsesformer, implanteres i eller under huden hos et pattedyrs epidermal-dermalforbindelse for å interagere med interstitialfluidet, vev- eller andre biologiske fluider.
Et eksempel på en metode som kan benyttes for å detektere nærværet av analytt ved bruk av biosensoren for in vivo anvendelse som beskrevet her, inkluderer en interrogering av implantatet med en fjern lyskilde, detektering av signalet fra proteinrapportørgruppen og bestemme mengden av glukose basert på en sammenheng med det detekterte signal som velkjent i teknikken (se US 5.517.313, US 5.910.661 og US 5.342.789).
Bindingsprotein-biosensorene ifølge oppfinnelsen er i stand til å måle eller detektere mikromolare (IO"<6>molar) til molare analyttkonsentrasjoner uten reagensforbruk. I enkelte utførelsesformer kan deres sensitivitet overfor analytt muliggjøre at biosensorene benyttes for å måle de lave analyttkonsentrasjoner som er kjent for å være tilstede i lavvolumprøver av interstitial- eller okularfluid og perspirasjon. Bindingsprotein-biosensorene ifølge oppfinnelsen tilveiebringer midler for å overvåke analytt kontinuerlig, episodisk eller "etter behov" slik det vil være hensiktsmessig for brukeren eller ved behandling av en tilstand.
I andre utførelsesformer er biosensorenes sensitivitet overfor analytt (for eksempel glukose) slik at de kan benyttes for å teste blodanalyttnivået eller konsentrasjonen av analytt i en biologisk oppløsning, eller en annen oppløsning kan bestemmes. Som benyttet her, inkluderer en "biologisk oppløsning", uten begrensning, blod, svette og/eller okular- eller interstitialfluid inkludert kombinasjoner derav.
De følgende eksempler illustrerer visse foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen, men er ikke ment å være illustrerende for alle utførelsesformer.
Eksempel 1: Metoder for å uttrykke og å rense mutante proteiner uten
histidin tagger.
GGBP kodes av MglB-1 genet i E. coli. Dette proteinet ble endret ved å innføre aminosyrecystein ved forskjellige posisjoner ved seterettet mutagenese av MglB-1 genet. Disse proteiner ble så uttrykt i E. coli og renset.
Kassettmutagenese av MglB-1 ble gjennomført som følger. Villtype MglB-1 genet ble klonet in i en pTZ18R vektor (Dr. Anthony Cass, Imperial College, London, England). Mutante plasmider ble generert fra dette opphavsplasmid ved bruk av kassettmutagenese som ga randomiserte aminosyresekvenser, i det vesentlige som beskrevet av Kunkel (1991) og klonet i E. coli JM109 (Promega Life Science, Madison, WI). Mutante plasmider ble identifisert ved sekvensering. Det mutante protein ble indusert i JM109 og renset som beskrevet nedenfor. En E. coli JM109 koloni som inneholdt det mutante plasmid ble dyrket over natten ved 37°C under rysting ved 220 omdreininger pr. minutt i LB buljong inneholdende 50 ug/mL ampicillin (LB/Amp). Overnatt-veksten ble fortynnet 1:100 i IL friskt LB/Amp og inkubert ved 37°C under rysting inntil OD6oo-verdien for kulturen var 0,3 - 0,5. Ekspresjon av mutanten ble indusert ved tilsetning av 1 mM IPTG (Life Technologies, Gaithersburg, MD) sluttkonsentrasjonen under fortsatt inkubering og rysting ved 37°C i 4 - 6 timer. Cellene ble høstet ved sentrifugering (10,000 x g, 10 min., 4°C).
Det mutante protein ble høstet ved osmotisk sjokk og renset ved kolonnekromatografi. Cellepelleten ble resuspendert i en sukrosebuffer (30 mM Tris-HCL pH 8,0, 20% sukrose 1 mM ED TA), inkubert ved romtemperatur i 10 min. og så sentrifugert (4000 x g, 15 min., 4°C). Supernatanten ble helt av og holdt på is. Cellepelleten ble resuspendert og 10 mL iskald, steril, deionisert H2O ble repetert og suspensjonen ble inkubert på is og sentrifugert. Den gjenværende supernatanten ble slått sammen med andre samlede supernatanter og sentrifugert en gang til (12,000 x g, 10 min., 4°C). Det sammenslåtte "shockate" ble filtrert gjennom et 0,8 um - og så et 0,45 um filter. Streptomycinsulfat (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 5% vekt/volum ble satt til "shockate" og omrørt en gang i 30 min. fulgt av sentrifugering (12.000 x g, 10 min., 4°C). "Shockate" ble så konsentrert ved bruk av Emicon Centriprep 10 (10.000 MWCO) filtre (Charlotte, NC) og dialysert over natten mot 5 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM MgCl2. Det dialyserte "shockate" ble sentrifugert (12.000 x g, 30 min., 4°C). Den resulterende supernatanten ble satt til en preekvilibrert DEAE Fast Flow Sepharose kolonne (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) i en mengde av 0,5 mL/min. Kolonnen ble vasket med 5 til 10 kolonnevolumer. En lineær gradient fra 0 til 0,2 M NaCl ble lagt på kolonnen og fraksjoner ble samlet. Mutantproteinholdige fraksjoner ble identifisert ved SDS-PAGE med Coomassie Brilliant Blue farging (molekylvekt ca. 32 kDa). Fraksjonene ble slått sammen og dialysert over natten ved 4°C mot fosfatbufret saltoppløsning (PBS) eller 10 mM ammoniumbikarbonat (pH 7,4), konsentrert ved bruk av Amicon Centriprep 10 filter og lagret ved 4°C eller -20°C med glycerol. Det ammoniumbikarbonatdialyserte protein ble lyofilisert.
Eksempel 2: Ekspresjon og rensing av mutante GGBP'er inneholdende Histidin
Tags
GGBP mutanter ble konstruert enten ved seterettet mutagenese eller kassettmutagenese. Seterettet mutagenese (QuikChange, Stratagene, La Jolla, CA) ble gjennomført for å endre individuelle aminosyrer i pQE70 vektoren ved å erstatte en aminosyre med en annen, spesifikt valgt aminosyre. Kassettmutagenesemetoden (Kunkel 1991) ble gjennomført for å randomisere aminosyrer i et spesifisert område av GGBP genet. De muterte kassetter ble så subklonet inn i pQE70 ekspresjonsvektoren.
pGGBP-His plasmidet inneholdt GGBP genet klonet inn i pQE70 ekspresjonsvektoren (Qiagen, Valencia, CA). Dette konstrukt plasserer seks histidinrester på C-terminus av GGBP genet. E. coli stamme SG13009 ble benyttet for å overuttrykke mutant GGBP-His ved å følge standard prosedyrer (Qiagen). Etter overekspresjon av en 250 mL kultur ble cellene samlet ved sentrifugering (6000 rpm) og resuspendert i 25 mL bugbuster (Novagen, Madison, WI), Lysozym (25 mg) ble satt til lysatet og blandingen forsiktig blandet ved romtemperatur i 30 minutter. Klart lysat ble fremstilt ved sentrifugering (6000 rpm) og dertil ble det tilsatt 0,5 ml imidizol (1 M) og 3 ml NI-NTA kuler (Qiagen). Etter 30 minutters forsiktig blanding ved romtemperatur ble blandingen sentrifugert (6000 rpm) og lysatet fjernet. Kulene ble vasket med 25 ml oppløsning (1 M NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0) og resentrifugert. Den mutante GGBP-His ble eluert fra kulene ved tilsetning av 5 mL oppløsning (160 mM imidazol, 1 M NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0) og blanding i 15 minutter. Proteinoppløsningen ble umiddelbart filtrert
gjennom et Centriplus YM-100 filter (Amicon, Charlotte, NC) og så konsentrert til 1 - 3 mg/ml ved bruk av et Centriplus YM-10 filter. Proteinet ble dialysert over natten mot 2 L lagringsoppløsning (1 M NaCl, 10 mM Tris, 50 mM NaP04, pH 8,0).
Eksempel 3: Merking av mutante GGBP'er
En alikvot av mutant GGBP inneholdende cystein (4,0 nmol) i PBS ble behandlet med 2 mM ditiotreitol (5 uL, 10 nmol) i 30 min. En forrådsoppløsning av N,N'-dimetyl-N-(jodacetyl)-N'-(7-nitrobenz-2-oksa-l,3-diazol-4-yl)etylendiamin (IANBD amid, 0,5 mg) ble preparert i DMSO (100 uL, 11,9 mM) og 3,36 uL (40 nmol) ble satt til proteinet. Reaksjonen skred frem ved romtemperatur i 4 timer på en Dynal rotamix i mørket. Det merkede protein ble renset ved gelfiltrering på en NAP-5 kolonne (Amersham Pharmacia). Merkingsforholdet ble bestemt ved bruk av en estimert ekstinksjonskoeffisient (50 mM"<1>cm"<1>) for GGBP som ble beregnet i GeneWorks 2,45 (IntelliGenetics),8478(IANBD amid) = 25 mM"<1>cm"<1>), og en måling av O.D. for en standard oppløsning av IANBD amid ved 280 nm og 478 nm. Fargekonsentrasjonen i proteinet ble beregnet som Cdye- A478/s478. Absorbansen for protein ved 280 nm ble beregnet SOm Aprot(280)<=>Atotal(280)Adye(280), der Adye(280)<=>A478X(A28o/A478)dyest. Konsentrasjonen av protein var derved Cprot(280)=Aprot(280)/s28o. Tabell 1 oppsummerer forandringer i fluorescens av forskjellige GGBP mutanter merket med rapportørgrupper, inkludert rapportørgrupper med enten eksiterings- eller emitteringsmaksimum på minst 600 nanometer. Tabell 2 oppsummerer forandringen i fluorescens og bestemte Ka-verdier for mutasjoner av en, to, tre og fire aminosyresubstitusjoner. Disse data viser klart at mutasjoner av GGBP merket med rapportørgrupper kan gi ønskede attributter som glukosebiosensorer. Disse data viser mutasjons- rapportørgruppesammenhengen for de testede prøver. Figur 1 viser forandringen i fluorescensrespons til forskjellige glukosekonsentrasjoner av A213CÆL238C NBD amid GGBP H6som et representativt eksempel, i oppløsning. Figur 2 illustrerer forandringen i fluorescensrespons overfor forskjellige glukosekonsentrasjoner av E149C/A213RNBD amid GGBP H6, som nok et representativt eksempel, i oppløsning.
Eksempel 4: Detekterbar signalforandring som er synlig ved glukosebinding til den muterte GGBP merket med luminescente merkelapper og bestemmelse av Kd.
Forandringen i fluorescens (AF, Tabell 2) ble målt som prosentual forskjell i fluorescens mellom 0 og 1 mM glukose ved 0,5 uM protein ved bruk av et SLM Aminco fluorimeter (Ontario, Canada) med slissinnstillinger på 8 og 4 for eksitering og innstillinger på 5 og 5 på MC250 emisjonsmonokromatoren.
Bindingskonstanter (Tabell 2) ble bestemt ved titrering og økende konsentrasjoner av glukose inn i en 0,1 uM proteinoppløsning (PBS) med blanding etter hver tilsetning av glukose. Slissinnstillingene var de samme som ovenfor. Ka ble bestemt fra følgende sammenheng, tilpasset etter Pisarchick og Thompson (1990):
der F er fluorescensintensiteten, Fj„f er fluoresensen ved uendelig, F0er fluorescensen ved null glukose og x er den frie konsentrasjonen av glukose ([Glc]free) bestemt ved ligningen: der [Glc]tot og [Pro]toter de totale konsentrasjoner av glukose henholdsvis protein.
Eksempel 5: Immobilisering av en biosensor ifølge oppfinnelsen inn i en dialysemembranmatriks og matriksens evne til å gi reversible og kontinuerlige avlesninger.
Det ble benyttet et Varian Eclipse fluorimeter med fiberoptisk festing, GGBP L238C/A213C protein (2 M i PBS buffer) innfanget i en dialysemembran med en molekylterskel på 3500 Dalton festet til den distale ende av fiberen. Oppløsninger ble preparert inneholdende PBS buffer, 2 mM og 20 mM glukose i PBS buffer. Med proben i PBS oppløsning ble avlesninger notert i 0,02 sekunders intervaller av emisjonsbølgelengden 521 nm, fulgt av innføring av fiberen i glukoseoppløsningene. Plassering av fiberen til oppløsning kun med buffer, resulterte i retur til initialsignalet. Figur 3 viser multiple sykler som alternerer mellom buffer og glukoseoppløsninger og som viser reversibiliteten for biosensoren innlagt i en permeabel matriks med fysiologisk område.

Claims (28)

1. Glukosebiosensor,karakterisert vedat den omfatter: minst ett mutert glukose/galaktose bindingsprotein som har minst en aminosyre substitusjon som er et cystein i posisjon 149, hvori aminosyre nummereringen referer til E.coli glukose/galaktose bindingsprotein som har 309 aminosyrerester, og minst en rapportørgruppe festet dertil, slik at rapportørgruppen gir en detekterbar og reversibel signalforandring når det muterte bindingsprotein er eksponert til varierende glukosekonsentrasjoner, idet den detekterbare og reversible signalforandring er relatert til nevnte varierende konsentrasjoner.
2. Biosensor ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte muterte glukose/galaktose bindingspotein omfatter minst en ytterligere aminosyresubstitusjon, minst to ytterligere aminosyresubstitusjoner, eller minst tre ytterligere aminosyresubstitusjoner.
3. Biosensor ifølge krav 1 eller 2,karakterisert vedat det muterte glukose/galaktose bindingsproteinet har ytterligere aminosyresubstitusjoner valgt fra et cystein i posisjon 1, et serin i posisjon 1, et cystein i posisjon 11, et cystein i posisjon 14, et cystein i posisjon 19, et cystein i posisjon 43, et cystein i posisjon 74, et cystein i posisjon 107, et cystein i posisjon 110, et cystein i posisjon 112, et cystein i posisjon 113, et cystein i posisjon 137, et cystein i posisjon 213, et cystein i posisjon 216, et cystein i posisjon 238, et cystein i posisjon 287, og et cystein i posisjon 292, et cystein i posisjon 152, et cystein i posisjon 182, et cystein i posisjon 236, et cystein i posisjon 296.
4. Biosensor ifølge krav 2,karakterisert vedat nevnte muterte glukose/galaktose bindingsprotein omfatter minst to aminosyresubstitusjoner som er valgt fra cystein i posisjon 149 og et serin i posisjon 238, et cystein i posisjon 149 og et arginin i posisjon 213, et cystein i posisjon 149 og et cystein i posisjon 213, et cystein i posisjon 149 og et treonin i posisjon 213, et cystein i posisjon 149 og et leucin i posisjon 213, et cystein i posisjon 149 og et tyrosin i posisjon 213, et cystein i posisjon 149 og et asparagin i posisjon 223, et cystein i posisjon 149 og et cystein i posisjon 238, et cystein i posisjon 149 og et serin i posisjon 256, og et cystein i posisjon 149 og et arginin i posisjon 256.
5. Biosensor ifølge krav 2,karakterisert vedat nevnte muterte glukose/galaktose bindingsprotein omfatter minst tre aminosyresubstitusjoner som er valgt fra et cystein i posisjon 149, et serin i posisjon 213 og et serin i posisjon 238; et cystein i posisjon 149, et arginin i posisjon 213 og et serin i posisjon 238; et cystein i posisjon 149, et cystein i posisjon 213 og et cystein i posisjon 238; et cystein i posisjon 149, et cystein i posisjon 213 og et asparagin i posisjon 223; og et cystein i posisjon 149, et asparagin i posisjon 223 og et arginin i posisjon 256.
6. Biosensor ifølge krav 2,karakterisert vedat nevnte muterte glukose/galaktose bindingsprotein omfatter minst fire aminosyresubstitusjoner som er valgt fra et serin i posisjon 1, et cystein i posisjon 149, et arginin i posisjon 213 og et serin i posisjon 238, et serin i posisjon 1, et cystein i posisjon 149, et serin i posisjon 213 og et serin i posisjon 238, og et cystein i posisjon 149, et cystein i posisjon 182, et cystein i posisjon 213 og et serin i posisjon 238.
7. Biosensor ifølge krav 6,karakterisert vedat nevnte fire aminosyresubstitusjoner er et serin i posisjon 1, et cystein i posisjon 149, et arginin i posisjon 213 og et serin i posisjon 238.
8. Biosensor ifølge ethvert av kravene 1 til 7,karakterisertv e d at det muterte glukose/galaktose bindingspoteinet i tillegg omfatter minst en histidin tag.
9. Biosensor ifølge ethvert av kravene 1 til 8,karakterisertv e d at rapportørgruppen er en luminescent merkelapp.
10. Biosensor ifølge krav 9,karakterisert vedat luminescentmerkelappen har en eksitasjonsbølgelengde på mer enn rundt 600 nanometer.
11. Biosensor ifølge krav 9,karakterisert vedat den luminescente merkelapp har en emisjonsbølgelengde på mer enn rundt 600 nanometer.
12. Biosensor ifølge krav 9,karakterisert vedat den luminescente merkelapp kovalent er koblet til nevnte minst ene glukose/galaktosebindingsprotein.
13. Biosensor ifølge krav 12,karakterisert vedat den luminescente merkelapp kovalent er koblet til nevnte glukose/galaktosebindingsprotein ved reaksjon med et medlem valgt fra gruppen bestående av fluorescein, kumariner, rhodaminer, 5-TMRIA (tetrametylrhodamin-5-jodacetamid), Quantum Red™, Texas Red ™, Cy3, N-((2-jodacetoksy)etyl)-N-metyl)amino-7-nitrobenzoksadiazol (IANBD); 6-akryloyl-2-dimetylaminonaftalen (akrylodan), pyren, Lucifer Yellow, Cy5, Dapoxyl ® (2-bromacetamidoetyl)sulfonamid, (N-(4,4-difluor-l,3,5,7-tetametyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-2-yl)jodacetamid (Bodipy507/545 IA), N-(4,4-difluor-5,7-difenyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-propionyl)-N'-jodacetyletylendiamin (BODIPY ® 530/550 IA) 5-((((2-jodacetyl)amino)etyl)amino)naftalen-l-sulfonsyre (1,5-IAEDANS) og karboksy-X-rhodamin, 5/6-jodacetamid (XRIA 5,6).
14. Biosensor ifølge ethvert av kravene 1 til 9,karakterisertv e d at rapportørgruppen emitterer nevnte signal som respons på eksponering til en energikilde.
15. Fremgangsmåte for in vitro glukosedetektering,karakterisert vedat den omfatter: a) å tilveiebringe minst ett mutert glukose/galaktosebindingsprotein og minst en rapportørgruppe festet dertil som definert ved glukose biosensor ifølge ethvert av kravene 1 til 14; b) eksponering av nevnte muterte glukose/galaktosebindingsprotein til varierende glukosekonsentrasjoner; og c) detektering av en detekterbar og reversibel signalforandring fra nevnte rapportørgruppe der nevnte detekterbare og reversible signalforandring tilsvarer nevnte varierende glukosekonsentrasjoner.
16. Fremgangsmåte ifølge krav 15,karakterisert vedat detekteringen skjer kontinuerlig, programmert, episodisk eller ved kombinasjoner derav.
17. Fremgangsmåte ifølge krav 15,karakterisert vedat de muterte glukose/galaktosebindingsproteiner er valgt blant bakterieperiplasmiske bindingsproteiner.
18. Fremgangsmåte ifølge krav 15,karakterisert vedat den ytterligere omfatter et trinn med eksponering av nevnte rapportørgruppe til en energikilde i stand til å eksitere rapportørgruppen for å emittere nevnte signal.
19. Anvendelse av et mutert glukose/galaktosebindingsprotein og minst en rapportørgruppe koblet dertil som definert i ethvert av kravene 1-14 for fremstilling av et diagnostisk middel for in-vivo glukose deteksjon.
20. Blanding,karakterisert vedat den omfatter: et mutert glukose/galaktosebindingsprotein med minst en aminosyresubstitusjon bestående av et cystein i posisjon 149, hvori aminosyre nummereringen referer til E.coli glukose/galaktose bindingsprotein som har 309 aminosyrerester.
21. Blanding ifølge krav 20,karakterisert vedat det muterte glukose/galaktosebindingsprotein har ytterligere aminosyresubstitusjon valgt fra et cystein i posisjon 1, et serin i posisjon 1, et cystein i posisjon 11, et cystein i posisjon 14, et cystein i posisjon 19, et cystein i posisjon 43, et cystein i posisjon 74, et cystein i posisjon 107, et cystein i posisjon 110, et cystein i posisjon 112, et cystein i posisjon 113, et cystein i posisjon 137, et cystein i posisjon 149, et cystein i posisjon 213, og et cystein i posisjon 216, et cystein i posisjon 238, et cystein i posisjon 287, et cystein i posisjon 292, et cystein i posisjon 236 og et cystein i posisjon 296.
22. Blanding ifølge krav 21,karakterisert vedat det muterte glukose/galaktosebindingsproteinet har (i) minst to aminosyresubstitusjoner valgt fra gruppen bestående av et cystein i posisjon 149 og et serin i posisjon 238, et cystein i posisjon 149 og et arginin i posisjon 213, et cystein i posisjon 149 og et cystein i posisjon 213, et cystein i posisjon 149 og et threonin i posisjon 213, et cystein i posisjon 149 og et leucin i posisjon 213, et cystein i posisjon 149 og et tyrosin i posisjon 213, et cystein i posisjon 149 og et asparagin i posisjon 223, et cystein i posisjon 149 og et cystein i posisjon 238, et cystein i posisjon 149 og et serin i posisjon 256, et cystein i posisjon 149 og et arginin i posisjon 256, eller (ii) minst tre aminosyresubstitusjoner valgt fra gruppen omfattende et cystein i posisjon 149, et serin i posisjon 213 og et serin i posisjon 238; et cystein i posisjon 149, et arginin i posisjon 213 og et serin i posisjon 238; et cystein i posisjon 149, et cystein i posisjon 213 og et cystein i posisjon 238 ; og et cystein i posisjon 149, et serin i posisjon 213 og et asparagin i posisjon 223; et cystein i posisjon 149, et asparagin i posisjon 223 og et arginin i posisjon 256; eller (iii) minst fire aminosyresubstitusjoner valgt fra et serin i posisjon 1, et cystein i posisjon 149, et arginin i posisjon 213 og et serin i posisjon 238; et serin i posisjon 1, et cystein i posisjon 149, et serin i posisjon 213 og et serin i posisjon 238; og et cystein i posisjon 149, et cystein i posisjon 182, et cystein i posisjon 213 og et serin i posisjon 238.
23. Blanding ifølge ethvert av kravene 20 til 22,karakterisertv e d at nevnte muterte glukose/galaktosebindingsprotein i tillegg omfatter minst en histidin tag.
24. Blanding ifølge ethvert av kravene 20 til 22,karakterisertv e d at nevnte muterte glukose/galaktosebindingsprotein i tillegg omfatter minst en rapportørgruppe.
25. Blanding ifølge krav 24,karakterisert vedat nevnte rapportørgruppe er en luminescent merkelapp.
25. Blanding ifølge krav 25,karakterisert vedat nevnte luminescente merkelapp har en eksiteringsbølgelengde på mer enn rundt 600 nanometer.
27. Blanding ifølge krav 25,karakterisert vedat nevnte luminescente merkelapp har en emitteringsbølgelengde på mer enn 600 nanometer.
28. Blanding ifølge krav 25,karakterisert vedat nevnte luminescente merkelapp kovalent er koblet til nevnte mutterte glukose/galaktosebindingsprotein ved omsetning av nevnte bindingsprotein og et medlem valgt fra gruppen bestående av fluorescein, kumariner, rhodaminer, 5-TMRIA (tetrametylrhodamin-5-jodacetamid), Quantum Red , Texas Red , Cy3, N-((2-jodacetoksy)etyl)-N-metyl)amino-7-nitrobenzoksadiazol (IANBD); 6-akryloyl-2-dimetylaminonaftalen (akrylodan), pyren, Lucifer Yellow, Cy5, Dapoxyl ® (2-bromacetamidoetyl)sulfonamid, (N-(4,4-difluor-l,3,5,7-tetametyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-2-yl)jodacetamid (Bodipy507/545 IA), N-(4,4-difluor-5,7-difenyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-propionyl)-N'-jodacetyletylendiamin (BODIPYS ® 530/550 IA) 5-((((2-jodacetyl)amino)etyl)amino)naftalen-l-sulfonsyre (1,5-IAEDANS) og karboksy-X-rhodamin, 5/6-jodacetamid (XRIA 5,6).
NO20043259A 2002-01-04 2004-08-03 Glukosebiosensor, fremgangsmåte, anvendelse samt blanding omfattende mutert glukose/galaktosebindingsprotein NO336159B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10/040,077 US6855556B2 (en) 2002-01-04 2002-01-04 Binding protein as biosensors
PCT/US2003/000203 WO2003057851A2 (en) 2002-01-04 2003-01-06 Binding proteins as biosensors

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO20043259L NO20043259L (no) 2004-09-16
NO336159B1 true NO336159B1 (no) 2015-05-26

Family

ID=21908968

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20043259A NO336159B1 (no) 2002-01-04 2004-08-03 Glukosebiosensor, fremgangsmåte, anvendelse samt blanding omfattende mutert glukose/galaktosebindingsprotein

Country Status (11)

Country Link
US (1) US6855556B2 (no)
EP (1) EP1468023B1 (no)
JP (1) JP4326958B2 (no)
AT (1) ATE402188T1 (no)
AU (1) AU2003201822B2 (no)
CA (1) CA2472108A1 (no)
DE (1) DE60322339D1 (no)
ES (1) ES2310647T3 (no)
NO (1) NO336159B1 (no)
WO (1) WO2003057851A2 (no)
ZA (1) ZA200405388B (no)

Families Citing this family (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6535753B1 (en) 1998-08-20 2003-03-18 Microsense International, Llc Micro-invasive method for painless detection of analytes in extra-cellular space
US7851593B2 (en) * 2002-01-04 2010-12-14 Becton, Dickinson And Company Binding proteins as biosensors
AU2003277377B2 (en) * 2002-10-16 2009-05-21 Duke University Biosensor
US7473548B2 (en) * 2003-04-25 2009-01-06 Medtronic, Inc. Optical detector for enzyme activation
US20040234962A1 (en) * 2003-05-02 2004-11-25 Javier Alarcon Multicoated or multilayer entrapment matrix for protein biosensor
US7496392B2 (en) * 2003-11-26 2009-02-24 Becton, Dickinson And Company Fiber optic device for sensing analytes
US20050112685A1 (en) * 2003-11-26 2005-05-26 Amiss Terry J. Compositions and methods for measuring analyte concentrations
US20050148003A1 (en) * 2003-11-26 2005-07-07 Steven Keith Methods of correcting a luminescence value, and methods of determining a corrected analyte concentration
US7787923B2 (en) * 2003-11-26 2010-08-31 Becton, Dickinson And Company Fiber optic device for sensing analytes and method of making same
US7563891B2 (en) * 2004-05-21 2009-07-21 Becton, Dickinson & Company Long wavelength thiol-reactive fluorophores
DK1759536T3 (da) 2004-06-01 2011-09-05 Kwalata Trading Ltd In vitro-teknikker til anvendelse med stamceller
WO2006006166A2 (en) 2004-07-14 2006-01-19 Glusense, Ltd. Implantable power sources and sensors
USD550378S1 (en) 2004-09-10 2007-09-04 S.C. Johnson & Sons, Inc. Melting plate with rose petal cut-outs
CA2584108A1 (en) * 2004-10-14 2006-04-27 Carnegie Institution Of Washington Development of sensitive fret sensors and methods of using the same
CA2584116A1 (en) 2004-10-14 2006-04-27 Carnegie Institution Of Washington Neurotransmitter sensors and methods of using the same
WO2006096213A1 (en) * 2005-03-03 2006-09-14 Carnegie Institution Of Washington Polyamine sensors and methods of using the same
CA2599852A1 (en) * 2005-03-04 2006-09-14 Carnegie Institution Of Washington Environmentally stable sensors and methods of using the same
WO2007022485A2 (en) * 2005-08-19 2007-02-22 Becton, Dickinson And Company Sterilization of biosensors
AU2005337168B2 (en) * 2005-10-14 2012-07-05 Carnegie Institution Of Washington Phosphate biosensors and methods of using the same
DE602005025043D1 (de) * 2005-10-14 2011-01-05 Carnegie Inst Of Washington Saccharose-biosensoren und verwendungsverfahren dafür
US20080311047A1 (en) * 2005-11-16 2008-12-18 Thijs Kaper Multimetric Biosensors and Methods of Using Same
TW200734462A (en) 2006-03-08 2007-09-16 In Motion Invest Ltd Regulating stem cells
US8083926B2 (en) * 2006-04-19 2011-12-27 Chen Ellen T Nanopore structured electrochemical biosensors
AU2012216832B2 (en) * 2006-04-20 2014-11-06 Becton, Dickinson And Company Thermostable proteins and methods of making and using thereof
CA2649535A1 (en) 2006-04-20 2007-11-01 Becton, Dickinson And Company Thermostable proteins and methods of making and using thereof
US7809441B2 (en) * 2006-05-17 2010-10-05 Cardiac Pacemakers, Inc. Implantable medical device with chemical sensor and related methods
US8088097B2 (en) 2007-11-21 2012-01-03 Glumetrics, Inc. Use of an equilibrium intravascular sensor to achieve tight glycemic control
JP5517919B2 (ja) 2007-05-10 2014-06-11 グルメトリクス、 インク． 即時血管内グルコース測定のための平衡非消費蛍光センサー
US8772047B2 (en) * 2007-05-22 2014-07-08 Becton, Dickinson And Company Dyes having ratiometric fluorescence response for detecting metabolites
WO2009021052A1 (en) * 2007-08-06 2009-02-12 University Of Kentucky Research Foundation Polypeptides, systems, and methods useful for detecting glucose
US9023661B2 (en) 2007-10-18 2015-05-05 Becton, Dickinson And Company Visual glucose sensor and methods of use thereof
US20100160749A1 (en) * 2008-12-24 2010-06-24 Glusense Ltd. Implantable optical glucose sensing
EP2483679A4 (en) * 2009-09-30 2013-04-24 Glumetrics Inc SENSORS WITH THROMORETIC COATINGS
US8741591B2 (en) 2009-10-09 2014-06-03 The Research Foundation For The State University Of New York pH-insensitive glucose indicator protein
US8467843B2 (en) 2009-11-04 2013-06-18 Glumetrics, Inc. Optical sensor configuration for ratiometric correction of blood glucose measurement
GB0920013D0 (en) * 2009-11-13 2009-12-30 King S College London Glucose sensor
CN102081088A (zh) * 2009-11-30 2011-06-01 苏州艾杰生物科技有限公司 半乳糖的测定方法与半乳糖诊断/测定试剂盒
CN102087269A (zh) * 2009-12-04 2011-06-08 苏州艾杰生物科技有限公司 半乳糖的测定方法与半乳糖诊断/测定试剂盒
WO2011113020A1 (en) * 2010-03-11 2011-09-15 Glumetrics, Inc. Measurement devices and methods for measuring analyte concentration incorporating temperature and ph correction
US9037205B2 (en) 2011-06-30 2015-05-19 Glusense, Ltd Implantable optical glucose sensing
EP2831583B1 (en) 2012-03-28 2019-12-18 Becton, Dickinson and Company Hydrogel adhesion to molded polymers
US10466247B2 (en) 2012-11-20 2019-11-05 Becton, Dickinson And Company System and method for diagnosing sensor performance using analyte-independent ratiometric signals
US8834401B2 (en) 2012-11-26 2014-09-16 Becton, Dickinson And Company Glucose management and dialysis method and apparatus
US10379125B2 (en) 2013-12-27 2019-08-13 Becton, Dickinson And Company System and method for dynamically calibrating and measuring analyte concentration in diabetes management monitors
US10252002B2 (en) 2014-08-01 2019-04-09 Becton, Dickinson And Company Continuous glucose monitoring injection device
WO2016059635A1 (en) 2014-10-13 2016-04-21 Glusense Ltd. Analyte-sensing device
JP6488147B2 (ja) * 2015-02-24 2019-03-20 株式会社サカエ 基質結合力調整剤及びこれを用いた分子センサ並びにその使用方法
US10716500B2 (en) 2015-06-29 2020-07-21 Cardiac Pacemakers, Inc. Systems and methods for normalization of chemical sensor data based on fluid state changes
CN108474021A (zh) * 2015-11-20 2018-08-31 杜克大学 葡萄糖生物传感器及其用途
US10871487B2 (en) 2016-04-20 2020-12-22 Glusense Ltd. FRET-based glucose-detection molecules
WO2018071579A1 (en) 2016-10-12 2018-04-19 Becton, Dickinson And Company Integrated disease management system
CN108968976B (zh) 2017-05-31 2022-09-13 心脏起搏器股份公司 具有化学传感器的植入式医疗设备
US12004853B2 (en) 2017-07-26 2024-06-11 Cardiac Pacemakers, Inc. Systems and methods for disambiguation of posture
CN109381195B (zh) 2017-08-10 2023-01-10 心脏起搏器股份公司 包括电解质传感器融合的系统和方法
CN109419515B (zh) 2017-08-23 2023-03-24 心脏起搏器股份公司 具有分级激活的可植入化学传感器
CN109864746B (zh) 2017-12-01 2023-09-29 心脏起搏器股份公司 用于医学装置的多模式分析物传感器
CN109864747B (zh) 2017-12-05 2023-08-25 心脏起搏器股份公司 多模式分析物传感器光电子接口
CN111189783B (zh) * 2020-01-07 2022-07-19 湖北大学 一种d-葡萄糖的检测方法和应用
WO2025101914A1 (en) 2023-11-10 2025-05-15 Mekanistic Therapeutics Llc Substituted aminobenzyl heteroaryl compounds as egfr and/or pi3k inhibitors having improved therapeutic index against solid tumors

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4704029A (en) 1985-12-26 1987-11-03 Research Corporation Blood glucose monitor
US4703756A (en) 1986-05-06 1987-11-03 The Regents Of The University Of California Complete glucose monitoring system with an implantable, telemetered sensor module
US5001054A (en) 1986-06-26 1991-03-19 Becton, Dickinson And Company Method for monitoring glucose
US5342789A (en) 1989-12-14 1994-08-30 Sensor Technologies, Inc. Method and device for detecting and quantifying glucose in body fluids
IL93134A (en) 1990-01-23 1997-11-20 Yissum Res Dev Co Doped sol-gel glasses for obtaining chemical interactions
US5165407A (en) 1990-04-19 1992-11-24 The University Of Kansas Implantable glucose sensor
US5200334A (en) 1991-08-13 1993-04-06 The Regents Of The University Of California Sol-gel encapsulated enzyme
JPH0816669B2 (ja) 1993-02-18 1996-02-21 日本電気株式会社 グルコースセンサの製造方法
DE4408152A1 (de) 1994-03-11 1995-09-14 Studiengesellschaft Kohle Mbh Immobilisierte Lipasen in hydrophoben Sol-Gel-Materialien
US5501836A (en) 1994-07-11 1996-03-26 Hewlett Packard Company Entrapped non-enzymatic macromolecules for chemical sensing
US5517313A (en) 1995-02-21 1996-05-14 Colvin, Jr.; Arthur E. Fluorescent optical sensor
US5577137A (en) 1995-02-22 1996-11-19 American Research Corporation Of Virginia Optical chemical sensor and method using same employing a multiplicity of fluorophores contained in the free volume of a polymeric optical waveguide or in pores of a ceramic waveguide
EP0775669B1 (en) 1995-11-16 2001-05-02 Texas Instruments Incorporated Low volatility solvent-based precursors for nanoporous aerogels
US6403337B1 (en) 1996-01-05 2002-06-11 Human Genome Sciences, Inc. Staphylococcus aureus genes and polypeptides
DK0950068T3 (da) 1996-05-16 2006-02-13 Texas A & M Univ Sys Kollagen-bindende proteinsammensatninger og fremgangsmade til anvendelse
US6016689A (en) 1996-11-18 2000-01-25 The Research Foundation Of Suny At Buffalo Aerosol-generated sol-gel derived thin films and applications thereof
US5910661A (en) 1997-05-13 1999-06-08 Colvin, Jr.; Arthur E. Flourescence sensing device
US5894351A (en) 1997-05-13 1999-04-13 Colvin, Jr.; Arthur E. Fluorescence sensing device
DK1044374T3 (da) * 1997-12-31 2009-02-16 Univ Duke Glucosebiosensor
ES2329850T3 (es) * 1998-07-17 2009-12-01 University Of Maryland, Baltimore Proteinas manipuladas para la deteccion de analitos.
US6432723B1 (en) 1999-01-22 2002-08-13 Clinical Micro Sensors, Inc. Biosensors utilizing ligand induced conformation changes
GB9907815D0 (en) 1999-04-06 1999-06-02 Univ Cambridge Tech Implantable sensor
EP1332216B1 (en) * 2000-10-27 2011-08-17 Roche Diagnostics GmbH Variants of soluble pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase
US7064103B2 (en) * 2002-01-04 2006-06-20 Becton, Dickinson And Company Binding protein as biosensors
US20030153026A1 (en) * 2002-01-04 2003-08-14 Javier Alarcon Entrapped binding protein as biosensors

Also Published As

Publication number Publication date
ATE402188T1 (de) 2008-08-15
EP1468023B1 (en) 2008-07-23
DE60322339D1 (de) 2008-09-04
AU2003201822A1 (en) 2003-07-24
NO20043259L (no) 2004-09-16
JP4326958B2 (ja) 2009-09-09
WO2003057851A3 (en) 2003-09-18
WO2003057851A2 (en) 2003-07-17
CA2472108A1 (en) 2003-07-17
ZA200405388B (en) 2005-05-25
EP1468023A2 (en) 2004-10-20
ES2310647T3 (es) 2009-01-16
EP1468023A4 (en) 2006-11-29
AU2003201822B2 (en) 2008-08-14
JP2005539206A (ja) 2005-12-22
US20030134346A1 (en) 2003-07-17
US6855556B2 (en) 2005-02-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1468023B1 (en) Binding proteins as biosensors
US20070281368A1 (en) Binding proteins as biosensors
EP1458760B1 (en) Entrapped binding proteins as biosensors
AU2003201819B2 (en) Binding proteins as biosensors
AU759888B2 (en) Engineered proteins for analyte sensing
WO2005054855A1 (en) Compositions and methods for measuring analyte concentrations
US20120232251A1 (en) Glucose sensor

Legal Events

Date Code Title Description
MM1K Lapsed by not paying the annual fees