NO326099B1 - In vitro og fremgangsmate for innforing av nukleinsyrer i en celle, og forbindelse for anvendelse ved slik innforing - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en in vitro fremgangsmåte for innføring av forbindelser, spesielt nukleinsyre, i celler. Foreliggende oppfinnelse vedrører videre sammensetninger for anvendelse i denne forbindelser.

Det er et antall situasjoner hvor det er ønskelig å levere spesifikke forbindelser inn i celler. En av disse situasjonene er transfeksjon av eukaryote celler med DNA. Dette blir for tiden utført ved anvendelse av forskjellige kommersielle lipofekterende midler så som "Transfectam" (Promega) and "Lipofectin" (BRL) ved anvendelse av kalsiumfosfat formidlet transfeksjon eller ved elektroporering av cellene.

Evnen til å levere nukleinsyrebaserte forbindelser til celler kan også anvendes ved medikamentlevering. Levering av medikamenter til celler eller vev i assosiasjon med forbindelsen med formelen beskrevet nedenfor vil føre til forandring av parametere så som varighet av medikamentvirkningen (for eksempel sakte frigjøring eller vedvarende virkning), mengden av medikament som er nødvendig eller leveringsmåten. Levering av medikamentene ved anvendelse av forbindelsesvarianter innenfor paramterene beskrevet nedenfor vil også muliggjøre en mer spesifikk målsøking av medikamentlevering både i celler og i hele organismer.

Som beskrevet i foreliggende søkers inngitte internasjonale patentsøknad nr. PCT/AU95/00505 (beskrivelsen er inkorporert heri som kryss-referanse), kan nukleinsyre bli innført i en celle ved eksponering av cellen for en forbindelse med formel:

hvor:

w er en nukleinsyre

x er en aminosyre eller et peptid

y er en spacer som har en kjedelengde som tilsvarer 1-20 karbonatomer eller er fraværende,

Pm er H eller CH2O-R3, og Ri, R2 og R3 er like eller forskjellige og er enten hydrogen, metyl, etyl, hydroksyl eller acylgrupper avledet fra en fettsyre som har en karbonkjede med 3-24 karbonatomer mettede eller umettede, med den forutsetningen at minst en av Ri, R2 og R3 er en acylgruppe avledet fra en fettsyre.

Foreliggende oppfinnere har nå vist at det er mulig å innføre nukleinsyrer inn i en celle ved anvendelse av lignende forbindelser, med hvor egenskapen til "x" blir variert.

Det første aspektet av foreliggende oppfinnelse består følgelig av

in vitro-fremgangsmåte for innføring av nukleinsyre i en celle, karakterisert ved at cellen eksponeres for en forbindelse med formelen:

hvor:

w er en nukleinsyre

x er en ikke-aminosyre eller ikke-peptid nukleinsyrebindende gruppe

y er en spacer som har en kjedelengde som tilsvarer 1-30 karbon-karbon kovalente enkeltbindinger eller er fraværende,

R4 er H eller halogen eller CH2O-R3; og Ri, R2 og R3 er like eller forskjellige og er enten hydrogen, metyl, etyl, alkyl, alkenyl, hydroksylert alkyl, hydroksylerte alkenylgrupper eller eterinneholdende alkyl, alkenyl, hydroksylert alkyl eller hydroksylerte alkenylgrupper, eventuelt en acylgruppe avledet fra en fettsyre som har en karbonkjedelengde som tilsvarer 3-24 karbonatomer som er mettede eller umettede, forutsatt at minst én av Ri, R2 eller R3 innbefatter en gruppe som har en karbonkjede med 3-24 karbonatomer som er mettede eller umettede.

I et andre aspekt består foreliggende oppfinnelse av en forbindelse for

forbindelse for anvendelse ved innføring av nukleinsyre inn i en celle, karakterisert ved at forbindelsen har formelen

hvor:

w er en nukleinsyre

x er en ikke-aminosyre eller ikke-peptid nukleinsyre bindende gruppe

y er en spacer som har en kjedelengde som er ekvivalent med 1-30 karbon-karbon kovalente enkeltbindinger eller er fraværende,

Pm er H eller halogen eller CH2O-R3; og Ri, R2 og R3 er like eller forskjellige og er enten hydrogen, metyl, etyl, alkyl, alkenyl, hydroksylert alkyl, hydroksylerte alkenylgrupper eller eterinneholdende alkyl, alkenyl, hydroksylert alkyl eller hydroksylerte alkenylgrupper, er eventuelt en acylgruppe avledet fra en fettsyre som har en karbonkjedelengde ekvivalent med 3-24 karbonatomer som er mettede eller umettede, forutsatt at minst én av Ri, R2 eller R3 innbefatter en gruppe som har en karbonkjede med 3-24 karbonatomer som er mettede eller umettede.

Som anvendt heri blir betegnelsen "nukleinsyre" anvendt i bredeste forstand og innbefatter DNA, RNA eller oligonukleotider av enten DNA eller RNA, modifiserte oligonukleotider og kombinasjoner av disse. I tillegg skal betegnelsen omfatte modifiserte oligonukleotider. Disse modifikasjonene innbefatter, men er ikke begrenset til, sukkermodiifkasjoner, så som 2'-deoksy-2'-fluor nukleotider (Kawasaki, A. M. et al.

(1993) J. Med. Chem 36: 831-834), 2'-0-allyl-uridin, -cytosin, -adenosin og -guanosin (Beijer, B. et al. (1994) Nucelos. Nucleot. 13: 1905-1927), 2'-deoksy-2'-C-allyl-ribonukeotider, 2-O-metylribonukleotider (Sproat, B.S. andLamond, A. I. (1991) i "Oligonucleotides and analogues; a practical approach" s. 49-86, F. Eckstein (ed.). Oxford University Press, Oxford) og andre 2'-0-alkylribonukleotider (Sproat, B.S. et al.

(1991) Nucleic Acids Symp. Ser., 24: 59-62), fosfatmodiifkasjoner, så som fosforotioater (Stec, W. J. et al. (1991) Nucl. Acids Res., 19: 5883-5388), fosforditioater (Beaton G. et al. i "Oligonucleotides and analogues; a practical approach", s. 109-136 F. Eckstein (ed.). Oxford University Press, Oxford), fosforamidater (Froehler, B., Ng, O. og Matteucci, M.D. (1998) Nucl. Acids Res. 16: 4831-4839), metylfosfonater (Miller, P. S. et al. (1986) Biochemistry 25: 5092-5097) og andre alkyl-fosfonater (Fathi, R. et al.

(1994) Nucl. Acids Res. 22: 5416-5424), og andre skjelettmodifikasjoner så som amider (inkludert, men ikke begrenset til PNA) (De Mesmaeker, A. et al. (1994) Agnew Chem. Int. Ed. 33: 226-229; Egholm, M. et al. (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:1895-1897), karbamat (Habus, I. Temsamani, J. og Agrawi, S. (1994) Bioorg. Med. Chem. Lett.

4:1065-1070), Ureas (Waldner, A. et al. (1994) Synlett. 57-61), aminer (Caufield, T.J. et al. (1994) Bioorg. Med. Chem. Lett. 3: 2771-2776), allyleter (Cao, X. og Matteucci, M-D. (1994) Tet. Lett. 35: 2325-2328), allyl (Cao, X. og Matteucci, M.D. (1994) Tet. Lett. 35: 2325-2328). Alkan (De Mesmaeker, A. et al. (1994) Bioorg. Med. Chem. lett.

4:395-398), morfolino (Stirchak, E.P., Summerton, J. E. and Weller, D.D. (1989) Nucl. acids Res. 17: 6129-6141) og guanidinium (Dempcy, R. O., Almarsson and Bruice, T.C.

(1994) Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) 91: 7864-7868) (produserer et polykationisk oligonukleotid). I tillegg kan oligonukleotidene inneholde basemodiflkasjoner, terminale og indre modifikasjoner som tilfører funksjonelle grupper så som psoralen, biotin eller kolesterol grupper og ikke-nukleotidregioner.

Nukleinsyren "w" kan bli assosiert med ikke-aminosyre eller ikke-peptid nukleinsyre bindende gruppe på en hvilke som helst måte så som kovalent binding, ionisk interaksjon, hydrogenbinding, baseparing osv. Som det vil fremgå for fagfolk innenfor dette området vil den spesielle naturen til ikke-aminosyre eller ikke-peptid nukleinsyrebindende gruppe "x" som blir anvendt avhenge av den bestemte naturen til nukleinsyren "w" som skal bli levert. Når assosiasjonen mellom "w" og "x" er en ione interaksjon når nukleinsyren har en total positiv ladning vil bindingsgruppen "x" ha en total negativ ladning.

Det er for tiden foretrukket at assosiasjonen mellom "w" og "x" er ionisk interaksjon eller hydrogenbinding eller tripleksdannelse.

Når nukleinsyren "w" er negativt ladet kan nukleinsyrebindende gruppe "x" være et kation eller polykation med en hvilken som helst lengde. I denne utførelsesformen vil nukleinsyrebindende gruppe vanligvis inneha en total positiv ladning for å tiltrekke og holde nukleinsyren ved ionisk interaksjon. For eksempel kan nukleinsyrebindende gruppe være et polyamin så som spermin, et polyimin eller en dendrimer.

Nukleinsyrebindende gruppe "x" eller spacer "y" kan også innbefatte funksjonelle domener som letter cellulær målsøking eller subcellulær lokalisasjon for eksempel sukkere, reseptorligander, polysakkarider eller peptider (så som nukleære lokalisasjonssignaler, antistoffer eller derivater derav for eksempel FAB eller SCFV). Slike funksjonelle domener kan bli innbefattet i tandem eller på en todelt struktur, som homo- eller heterodimerer.

I en annen utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse er nukleinsyrebindende gruppe "x" i seg selv et oligonukleotid av enten DNA eller RNA, et modifisert oligonukleotid eller en kombinasjon av disse eller et molekyl av PNA som har evne til å binde nukleinsyre "w" gjennom baseparing, trippelheliksdannelse eller lignende interaksjoner.

Nukleotidene er byggestenene til nukleinsyrene. I de mest forekommende naturlige formene består de av en pentose sukker (ribose eller 2-deoksyribose) med en hydrofob nitrogenholdig base (en purin, adenin eller guanin, eller en pyrimidin, thymin (Uracil i ribonukleotider) eller cytosin) kovalentlig koblet til en 1' karbon og fosforsyre forestret til fri hydroksylgruppe på 5' karbonet til pentosesukkeret. Nukleinsyre er polymerer av sukssesive nukleotidenheter hvor et nukleotid er koblet til det neste med en fosfodiesterbro mellom 3'- hydroksylgruppe av pentosedelen til et nukleotid og 5'-hydroksyl av pentose delen til den neste. Fordi det er to hovedsukkere tilstede i nukleinsyrene vil en bestemt nukleinsyre i naturen ikke inneholde begge disse på samme tid. Det er følgelig to typer av nukleinsyre, ribonukleinsyre (RNA) og deoksyribonukleinsyre (DNA). Et kovalent skjelett av en nukleinsyre består av alternerende pentose og fosforsyregrupper og tilveiebringer en molekylær plattform med en definert polaritet hvorfra side-kjedepurin og pyrimidinbasene er vist. Det er sekvensene av basene som de oppstår langs denne polariserte polymeren som gir nukleinsyrene deres spesielle egenskaper.

Egenskapene ved nukleinsyrene (eller mer spesifikt individuelle baser) som er avgjørende for denne utførelsesformen ifølge foreliggende oppfinnelse er at basene kan bli paret med hverandre gjennom hydrogenbinding. I generelle adenin basepar med thymin (uracil i RNA) og guanin med cytosin (komplementær baseparing). Hvor baseparingen oppstår mellom baser på forskjellige nukleinsyremolekyler oppstår hensiktsmessige interaksjoner mellom basene dersom polariteten av sukker/fosfat skjelettene hvorfra basene er utvist er i motsatt orientering i de to trådene. Hydrogenbindingen som oppstar i disse baseinteraksjonene tilveiebringer en kraft som kan potensiere og stabilisere assosiasjoner mellom forskjellige nukleinsyremolekyler. Styrken på disse assosiasjonene avhenger av komplementairtetsgraden til basesekvensene til reagerende tråder når de er oppstilt med motsatt polaritet. I et vandig oppløsningsmiddel assosieres komplementære tråder av nukleinsyren for å danne en dobbel heliks eller en dupleks med sukker fosfatskjelett i kontakt med oppløsningsmiddelet og hydrofobe baser oppstablet i midten av heliksen. I tillegg til kraften til hydrogenbindingen mellom alle komposittbaseparene virker London dispersjonskreftene og de hydrofobe effektene forårsaket av interaksjoner mellom stablede baser videre slik at de stabiliserer assosiasjonen mellom komplementære tråder av nukleinsyren. (Saenger, W. (1984) Principles of nucleic acid structure. Springer-Verlag (New York). I det adenin-thymin (uracil) og guanin-cytosin baseparene er de mest vanlige i naturen kan andre basepar oppstå og kan fortsatt i betraktelig grad bidra til stabilisering av en dupleks (Saenger (1984) ibid).

Utvikling av kjemiske metoder for syntese av nukleinsyrer har gjort det mulig å produsere schimeriske DNA/RNA molekyler. I tillegg er det blitt tilveiebrakt midler for syntetisering av nukleinsyrer med endrede baser og sukkere og fosfatgrupper som ofte fører til forbedret stabilitet av disse molekylene i biologiske fluider (se "Oligonucleotides and analogues, a practical approach" (1991) IRL Press at Oxford University Press, Oxford, Eckstein F. ed). I tillegg kan modifiserte aminosyrer, hvor aminosyresidekj edene er erstattet av purin og pyrimidin baser tilstede i nukleinsyrer, også bli syntetisert (Egholm, M., Buchardt, O., Nielsen, P.E. and Berg, R. H. (1992). J. Am. Chem. Soc. 114 1895-1897; Egholm, M., P. E. Nielsen, O- Buchardt and R.H. Berg (1992). J. Am. Chem. Soc. 114, 9677-9678). Disse protein-nukleinsyremolekylene eller PNA kan også assosiere med en nukleinsyre av komplementær sekvens gjennom baseparing (Nielsen, P. E. Egholm, M., Berg, R.H. and Buchardt, O, (1993). Anticancer Drug Des. 8, 53-63; Hanvey, J. C, Peffer, N. J., Bisi, J. E. Thomson, S.A., Cadilla, R., Josey, J. A. Ricca, D. J., Hassman, C.F., Bonham, M. A., Au, K. G. et al. (1992). Science 258,1481-5; Egholm, M., Buchardt, O., Christensen, L., Behrens, C, Freier, S. M. Driver, D.A., Berg, R.H., Kim, S.K., Norden, B og Nielsen, P.E. (1993). Nature 365 566-8; Nielsen, P. E. Egholm, M., Berg, R.H. and Buchardt, O. (1993). Nucleic Acids Res. 21,197-200).

I det interaksjonene mellom nukleinsyren, modifisert nukleinsyre og PNA-forbindelsene beskrevet ovenfor alle involverer interaksjoner mellom de to molekylene kan nukleinsyrer som består av homopyrimidin kanaler assosiere med dobbelt trådet nukleinsyre som bærer en dupleksregion omfattende komplementære sekvenser av homopurin og samme homopyrimidin kanal. I et slikt ternært kompleks forblir homopurin homopyrimidin kanalene til opprinnelig dupleks anti parallell og Watson-Crick baseparet på normal måte, mens invaderende homopyrimidintråden passer inn i den dype hovedkløften til denne dobbel heliksen og er involvert i Hoogsteen-type baseparing med basene til polypurin inneholdende tråd. I slike trippelhelisk strukturer er polariteten til invaderende polypyrimidintråd den samme som den til polypurin tråden (In Saenger, W. (1984) Principles of nucleic acid structure. Springer-Verlag (New York). Nukleinsyrer som bidrar til tripleksen kan være RNA eller DNA til tross for at det er enkelte antydninger som foreslår at en RNA tredje tråd kan bli mer sterkt bundet til en DNA/DNA dupleks enn korresponderende DNA tredje tråd (Roberts, R. W. and Crothers, D.M. (1992) Science 258: 1463-1466). Modifiserte oligonukleotider kan også bli anvendt som tredje tråd for eksempel 4'-tio-RNA (Leydier C, Bellon, L. Barascut, J. L. Morvan, F., Rayner, B. and Imbach, J-L- (1995) Antisense Res. and Dev. 5: 167-174). Triplekser er også blitt dannet hvor den tredje tråden er en polypurin-inneholdende nukleinsyre (Porumb, H., Dagneaux, C, Letellier, R. Malvy, C. og Taillandier, E.

(1994) Gene 1494: 101-107). I dette eksempelet var komplekset basert på revers Hoogsteen G(GC) og A(AT) tripletter (parene i parentesen indikerer Watson-Crick basepar tilstede i opprinnelig dupleks) med anti orienteringer av baser og alle trådene har S-type sukker konformasjoner.

Fra den foregående diskusjonen vil det være innlysende at baseparing i forskjellige former kan lette assosiasjon av to molekyler av nukleinsyre eller et molekyl av en nukleinsyre og en annen PNA eller, i spesielle tilfeller, en enkelttrådet nukleinsyre med en nukleinsyre dupleks for å danne en trippel helisk struktur. I alle tilfellene er det velkjent at bindingsaffiniteter er avhengig av homologilengde, komplementaritetsnivå, basesammensetning til med hver andre reagerende sekvenser og pH og ionestyrken til oppløsningen (for dobbelttrådede interaksjoner se Britten, RJ. and Davidson, E.H.

(1985) i "Nucleic Acid Hybridisation" a Practical Approach", IRL Press Oxford, Washington D.C., Hames, B.D. and Higgins, S.J. eds; Sambrook, J. Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989) "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nolan, C. ed, for triplekser se Rougee, M., Faucon, B. Mergny, J.L. Barcelo, F., Giovannangeli, C, Garestier, T. and Helene, C. (1992) Biochemistry 31: 9269-9278; Singleton, S.F. and Dervan, P.B. (1992) Biochemistry 31: 10995-11003; Singleton, S.F. and Dervan, P.B. (1992) J. Am. Chem. Soc. 114: 6957-6965: for nukleinsyre/PNA se Egholm, M., Buchardt, O., Christensen, L., Behrens, C, Freier, S.M., Driver, D.A., Berg, R.H., Kim, S. K., Norden, B. and Nielsen, P.E. (1993). Nature 365: 566-8; Egholm, M., Buchardt, O. Nielsen, P.E. and Berg, R.H. (1992). J.Am. Chem. Soc. 114:1895-1897). Ved foreliggende oppfinnelse kan en enkelttrådet nukleinsyre eller PNA "x" gruppe med definerte sekvensegenskaper virke som en nukleinsyrebindende domene i forbindelsen enten ved baseparing til en komplementær enkelttrådet region på eller ved dannelse av en tripleks med en egnet dobbelttrådet sekvens i nukleinsyren som skal bli levert. Det er innlysende for fagfolk innenfor dette området at transfeksjonsreagenser som binder molekylet som skal bli levert gjennom baseparing vil ha betydelige fordeler i forhold til reagenser hvor binding oppstår via ladningsinteraksjoner for å lette levering av nukleinsyre målsøkte terapeutiske midler med uladede skjelett (så som PNA og uladede oligonukleotidanaloger) inn i cellene.

I en alternativ utførelsesform for eksempel hvor nukleinsyren (w) som skal bli levert er et oligonukleotid vil den bli kovalentlig koblet til x gruppen, spesielt hvor x-linker-lipofilt kompleks er et fosforamidit.

Et annet eksempel på nukleinsyre bindende grupper er polyamider som eksemplifisert ved antibiotikaene distamycin og netropsin. De gjentatt amidene i distamycin blir dannet fra en aromatisk karboksylsyre og et aromatisk amin kombinert for å danne et halvmåneformet tripeptid. Dette tripeptidet blir bundet i de mindre hulrommene til dobbelttrådet DNA ved seter til 5 påfølgende AT basepar, men viser ingen særlig binding til enkelt-trådet DNA eller RNA. Binding av antibiotika til dobbelttrådet DNA antas å bli stabilisert gjennom en kombinasjon av hydrogenbinding til basepar, van der Waals bindinger og elektrostatiske krefter (Coll, M., Frederick, C.A., Wang A. H. and Rich, A (1987) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 84: 8385-8389). Til tross for at både netropsin og distamycin bindes som monomerer i det mindre hulrommet kan en høy konsentrasjon av distamycin bli bundet som en dimer (Pelton, J.G. and Wemmer, D.E.

(1989) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 86: 5723-4727). Basert på disse observasjonene er strukturelt relaterte polyamider inneholdende N-metylimidazol og N-metylpyrrol aminosyrer blitt syntetisert og vist å bli kombinert som antiparallelle side-til-side dimeriske komplekser med det mindre DNA hulrommet (Mrksich, M., Wade, W.S., Dwyer, T.J., Geierstranger, B.H., Wemmer, D.E. and Dervan P.B. (1992) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89: 7586-7590). Kovalentlig kobling av slike polyamid heterodimerer og homodimerer har ført til konstruksjon av ligander med både øket affinitet og spesifisitet (mrksich, M., Parks, M.E. and Dervan, P.B. (1994) J. Am. Chem. Soc. 116:7983). Slike hårnålskoblede polyamider kan nå bli syntetisert effektivt og i stor skala ved anvendelse av fast fase syntese (Baird, E.E and Dervan, P.B. (1996) J. Am. Chem. Soc. 118:6141-6146) og bærer reaktive terminalgrupper som lett kan bli koblet enten direkte eller via en spacergruppe til et lipofil domene.

Andre potensielle "x" grupper som har evne til å bli kompleksbundet med nukleinsyrer ved dannelsen av hydrogenbindinger forskjellig fra de som oppstår i baseparing er eksemplifisert ved polyvinylderivater så som polyvinylalkohol (PVA) og polyvinylpyrrolidon (PVP). PV A og PVP har begge evne til å danne hydrogenbindinger, virke som hydrogen-bindingsdonorer og -akseptorer (Galaev, Y. Garg, N. and Marriasson, (1994) J. Chromatogr. A 684: 45-64; Buhler, V., (1993) Kollidon: Polyvinyl pyrrolidone for the pharmaceutical industry. BASF Aktiengesellschaft Feinchemie, Ludwigshafen). Spesielt PVP er blitt vist å reagere med DNA og beskytte det fra nukleaseangrep, mens både PVP og PVA er blitt vist å forsterke DNA opptaket til rotteskjelettmuskel (Mumper, R.J., Duguid, J.G. Anwer, K., Barron, M.K. Nitta, H. and Rolland, A.P. (1996) Pharma. Res. 13:701-709). Kortere oligomerer av vinylalkohol og vinylpyrrolidon, er koblet til via en spacer del til en lipofil domene, vil binde nukleinsyre og lette det opptak til cellene. PVA blir ofte produsert ved hydrolyse av polyvinylacetat med alkali. Fordi alkoholgruppene til PVA eller oligo VA er relativt ureaktive kan binding bli oppnådd gjennom reaktive acetatgrupper på delvis hydrolysert oligo VA. Ved anvendelse av tilsvarende dersom PVP (eller oligo VP) blir produsert ved omsetning av en forbindelse så som polyvinylklorid (eller oligovinylklorid) med pyrrolidon, kan kobling til en spacergruppe bli oppnådd gjennom gjenværende kloridgruppe på ufullstendig derivatisert PVP (eller oligo VP) produkt.

Spaceren "y" som kobler nukleinsyrebindende gruppe "x" til aminogruppen til linkeren, for eksempel, kan være hvilke som helst av et antall molekyler som er velkjent innenfor fagområdet. Egenskapen til spaceren vil avhenge av reaktive grupper som er tilgjengelige på nukleinsyrebindende del "x". Eksempler på spacer "y" er:

1. Mellom en " x" med en aminogruppe og aminogruppen til linkeren

a) en spacer med en karboksylgruppe til "x" delen og en karboksylgruppe til aminogruppen, så som dikarboksylsyrer via anhydridet, for eksempel ravsyreanhydrid,

maleinsyreanhydrid osv.

b) En spacer med en karboksylgruppe til "x" delen og en aldehydgruppe til aminogruppen så som glyoksylsyre (i nærvær av reduksjonsmiddel, for eksempel Na

BH4) eller vice versa.

c) En spacer med en karboksylgruppe til "x" delen og et halid til aminogruppen så som kloreddiksyre eller vice versa. d) En spacer med en halid gruppe til "x" og en sulfonsyregruppe til aminogruppen så som 2-brometansulfonsyre eller vice versa. e) En spacer med en klorformatgruppe til "x" og en halidgruppe til aminogruppen så som brommetylklorformat eller vice versa. f) En spacer med en halidgruppe til "x" og en halidgruppe til aminogruppen så som 1,2 dibrometan. g) Andre eksempler på potensielt egnede spacere mellom en "x" gruppe med en amidgruppe og aminogruppen innbefatter forbindelsesfamilier eksemplifisert ved

akrylsyre.

2. Mellom en " x" gruppe med en h<y>droks<y>l<g>ruppe og amino<g>ruppen til linkeren a) En spacer med en karboksylgruppe til "x" gruppen og en karboksylgruppe til aminogruppen, så som dikarboksylsyrer via anhydridet, for eksempel ravsyreanhydrid,

maleinsyreanhydrid osv.

b) En spacer med en karboksylgruppe til "x" delen og en aldehydgruppe til aminogruppen så som glyoksylsyre (i nærvær av reduksjonsmiddel, for eksempel

NaBH4).

c) En spacer med en karboksylgruppe til "x" delen og et halid til aminogruppen så som kloreddiksyre. d) En spacer med en karboksylgruppe til "x" delen og en N=C=0 gruppe til aminogruppen så som etylisocyanatoacetat.

3. Mellom en " x" gruppe med en tiol<g>ruppe og amino<g>ruppen til linkeren.

a) En spacer med en karboksylgruppe til "x" gruppen og en karboksylgruppe til aminogruppen, så som dikarboksylsyrer via anhydridet, for eksempel ravsyreanhydrid,

maleinsyreanhydrid osv.

b) En spacer med en karboksylgruppe til "x" delen og en aldehydgruppe til aminogruppen så som glyoksylsyre (i nærvær av reduksjonsmiddel, for eksempel

NaBH4).

c) En spacer med en karboksylgruppe til "x" delen og et halid til aminogruppen så som kloreddiksyre. d) En spacer med en karboksylgruppe til "x" delen og en N=C=0 gruppe til aminogruppen så som etylisocyanatoacetat. 4. Mellom en " x" gruppe med en trikarboksvlgruppe og amino<g>ruppen til linkeren. a) En spacer med en aminogruppe til "x" delen og en karboksylgruppe til aminogruppen, for eksempel en aminosyree eller et antibiotika. b) En spacer med en amino til "x" delen og en sulfonsyregruppe til aminogruppen for eksempel to aminoetansulfonsyre (taurin). c) En spacer med en hydroksyl til "x" delen og en karboksylgruppe til aminogruppen for eksempel glykolsyre, melkesyre osv. d) En spacer med en hydroksylgruppe til "x" og en sulfonsyregruppe til aminogruppen for eksempel 2-hydroksyetansulfonsyre. e) En spacer med en hydroksylgruppe til "x" delen og et reaktivt halid til aminogruppen for eksempel 2-kloretanol. f) Andre eksempler på potensielt egnede spacere mellom en forbindelse med en reaktiv karboksyl og aminogruppe innbefatter forbindelsesfamilier eksemplifisert ved p-hydroksybenzaldehyd, 2-kloreddiksyre, 1,2-dibrommetan og etylenoksid.

Som det fremgår av ovennevnte beskrivelse kan spaceren "y" være fraværende, men det er foretrukket at molekylet innbefatter spaceren "y". Som angitt ovenfor kan spaceren være hvilke som helst av et antall molekyler som er velkjent innenfor fagområdet. Det er derimot for tiden foretrukket at spaceren har en kjedelengde som tilsvarer 3 til 17 karbonatomer. I det henseendet er det spesielt foretrukket at spaceren er aminosmørsyre, aminokaproinsyre, aminokaprylsyre, aminoundekansyre eller et dipeptid av aminokaproisk syre og aminoundekanonisk syre.

I en foretrukket utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse er Ri, R2 og R3 alkyl, hydroksyalkyl eller alkenylgrupper. Foretrukne alkylgrupper er avledet fra 1-brom-utvidet sonikering av MLV for derved å produsere en homogen populasjon av unilamellære leveringspartikler. Vanlige anvendte fremgangsmåter for å fremstille lipidleveringspartikler innbefatter eterinjeksjon (Deamer, D. and Bangham, A. Biochim, Biophys, Acta (1976) 443:629; Ostro, et al., Biochem Biophys. Res. Commun. (1977) 76: 836; Fraley, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA (1979) 76: 3348); Ca<2+->EDTA chelatering (Papahadjopoulos, ete al., Biochim. Biophys. Acta (1975) 394; 483; Wilson, et al., Cell (1979) 17; 77) detergentdialysering (Enoch, FL, and Strittmatter, P., Proe. Nati. Acad. Sei. USA (1979) 76: 145 og revers fase evaporasjon (REV) (Fraley, et al., J. Biol. Chem. (1980) 225: 10431; Szoka, F. and Papahadjopoulos, D., Proe. Nati. Acad. Sei, USA (1978) 75:145; Schaeffer-Ridder, et al., Science (1982) 215: 166). Andre fremgangsmåter for fremstilling av vesikulære strukturer dannet fra kationisk peptid/fettacylkonjugater og som er egnede for transfeksjon er også beskrevet i PCT/AU95/00505 som er innkorporert heri som referanse.

For å muliggjøre dannelsen av kationiske liposomer under hensiktsmessige betingelser kan det være nødvendig å innbefatte tilsetning av nøytrale lipider. Det antas at formuleringen til liposomer ifølge standermetoder med et nøytralt lipid så som fosfatidylcholin, fosfatidyletanolamin, dioleoylfosfatidyletanolamin (DOPE), DOPC (DOP cholin) eller kolesterol vil øke kapasiteten for å lette levering av forbindelser ifølge oppfinnelsen inn i cellene. Dette er spesielt sannsynlig når antall lipofile grupper er 2. Fremgangsmåte for formulering av liposomer er for eksempel beskrevet i Felgner, P.L. et al. (1987) Proe. Nati. Acad. Sei (USA) 84: 7413-7417; Yago, K. et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Comm. 196: 1042-1048 and Campbell, M. J. (1995) Biotechniques 18:1027.

En hovedanvendelse av in vitro fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ville være som et genterapi leveringsmiddel hvor det vil være ventet å lette nukleinsyreopptaket til cellene. Ytterligere informasjon vedrørende genterapi kan finnes i nabel et al., (1993) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 90: 11307-11311, i det beskrivelsen er innkorporert heri som referanse. Oppfinnelsen vil også finne anvendelse i produksjon av transgene dyr og planter, genetisk immunisering (letter forbedret opptak og ekspresjon av nukleinsyrer kodende for ønsket antigen ved cellene til vevet hvortil nukleinsyre/leveringsforbindelseskomplekser påføres, med en påfølgende immunrespons blir dannet for å uttrykke antigen) og generstatning via homolog rekombinasjon.

Ved anvendelse av denne in vitro fremgangsmåten kan en mengde mulige amfiflle konjugater med 1-3 lipofile grupper bli dannet. For at foreliggende oppfinnelse skal forstås nærmere vil eksempelvis syntese av blyforbindelser bli beskrevet i tillegg til fremgangsmåte for å vurdere deres transfekterende aktivitet og innbefatte et eksempeleksperiment som vurderer aktiviteten til en blyforbindelse.

Beskrivelse av figurer:

Figur 1

Denne figuren oppsummerer syntese av BOC beskyttet spermin mellomprodukt som ble anvendt for å tilveiebringe DNA bindende domene til blyforbindelsen SpSucTL3. Denne syntesen er beskrevet i detalj i teksten.

Figur 2

Denne figuren oppsummerer syntese av OSU-Suc-TL3 byggestenen som beskrevet i detalj i teksten. Denne forbindelsen, når koblet til beskyttet spermin forbindelse (figur 1) produserte blyforbindelsen SpSucTB.

Figur 3

Denne figuren oppsummerer kobling av di-BOC-spermin forbindelse produsert som beskrevet i figur 1 til aktivert ester av Suc-TL3 produsert som beskrevet i figur 2 som resulterte i produksjon av blyforbindelsen SpSucTL3. Denne koblingen er beskrevet i detalj i teksten.

Figur 4

Denne figuren oppsummerer syntese av Suc-TL3 fosforamidit som kan bli anvendt i oligonukleotidsyntese innretning for å produsere et transfeksjonsreagens hvor nukleinsyrebindende domene i seg selv var en nukleinsyre. Denne syntesen er beskrevet i detalj i teksten.

Figur 5

Denne figuren angir hovedtrekkene ved pCJJ3-Gal plasmid som ble anvendt som reportergen konstruksjon i transfeksjonseksperimentet beskrevet i eksemplene. CMVIE er øyeblikkelig tidlig promoter fra humant cytomegalovirus, fi-Gal er E. coli 13-galaktosidase genet, SVPA er polyadenyleringsinnholdet fra SV40, Amp<R> angir genet kodende for resistens overfor antibiotika ampicillin. Toppstrukturen representerer sete for kompositt intron innbefattet i PCI vektoren for å forsterke transgen ekspresjonen. De omtrentlige posisjonene til et antall restriksjonsenzymseter er angitt. Posisjonene til Xhol og Xbal setene anvendt for å klone 6-galaktosidase genet i pCl vektoren er indikert uthevet og understreket. Figur 1 er ikke tegnet i riktig skala.

Figur 6

Denne figuren viser topptransfeksjonsnivå oppnådd med vår blyforbindelse SpSucTL3 og sammenligner denne med topptransfeksjonsnivået oppnådd med kommersielt reagens liopfektamin (panel B). Den relative evnen som celler behandlet under disse samme betingelsene er vist i panel A. pClfl-Gal ble transfektert inn i celler ved anvendelse av begge reagensene i jnikrotiterskål analyse som beskrevet i delen for fremgangsmåter og materialer og vurdering av transfeksjonsegenskaper, transfeksjon, eksempel 4. Dataene i hvert panel representerer gjennomsnittsverdiene oppnådd fra to uavhengige eksperimenter. Feilkolonnene utviser i alle tilfellene standardfeil til gjennomsnittet.

Kjemisk syntese

Forkortelser anvendt:

BOC =tert-butyloksykarbonyl

DCCD=dicykloheksylkarbodiimid

DCM=diklormetan

DIEA= diisopropyletylamin

DMAP=dimetylaminopyridin

DMF=dimetylformamid

HOSU=N-hydroksysuksinimid

HPLC=høy ytelse væskekromatografi

Suc= ravsyre

TFA= trifluoreddiksyre

THF = tetrahydrofuran

Tris = 2-amino-2-hydroksy-metyl-l,3 propandiol

Z = benzyloksykarbonyl

Fremgangsmåter anvendt:

Tynnsiiktskromatografi ( TLQ

Tynnsjiktskromatografi ble utført på Alufolien Silica gel 60 F254 skåler (Merck) i følgende oppløsningsmiddelsystemer: DCM/MeOH=97/3 (Rf<1>), kloroform/MeOH=65/35 (Rf<2>), DCM/MeOH/DIEA=98/2/l (Rf<3>).

Høv ytelse væskekromatografi ( HPLC)

Analytisk HPLC ble utført på et Millipore Waters HPLC utstyr (Waters Chromatography Division of Millipore, Milford, MA), og omfattet et 6000A serieoppløsningsmiddel leveringssystem med en automatisert gradient kontrolleringsinnretning og modell 746 datamodul. Kromatografi ble utført med en NO V AP AK™ Ci 8 revers fase kolonne (100x8 mm). Peptidene og peptid-Tris konjugatene ble analysert på en lineær gradient eluerende fra 24 til 80% acetonitril med 0,1% (TFA iløpet av 5 min. ved en strømningsrate på 2 ml/min. (system A). Deteksjon ble utført ved 260 nm ved anvendelse av en Waters Lambda Max 480; (Rt<A>).

Lipopeptidkonjugatene ble analysert på en Ci8 kolonne med en lineær gradient fra 40% vann, 50% acetonitril og 10% THF til 50% acetonitril, 50% THF med 0,1% TFA iløpet av 5 min. ved en strømningsratee på 2 ml/min. (system B); (Rt<B>).

Preparativ HPLC

Separeringen ble utført på en Millipore Waters DeltaPrep 4000 HPLC ved anvendelse av en PrePakCis revers fase kolonne (100x40 mm) eluert med en lineær gradient med samme elueringsbuffersystemer som nevnt ovenfor for analytisk HPLC ved en strømningsrate på 20 ml/min.

Nukleær magnetisk resonans ( NMR)

NMR spekteret ble registrert ved et 200 MHz Brucker spektrofotometer.

Eksempel 1

FREMGANGSMÅTE FOR FREMSTILLING AV SPERMIN-SUC-TRIS-TRTLAURAT

Fremstilling av N^N^di-BOC-spermin

Denne forbindelsen ble syntetisert i 3 trinn som beskrevet av Goodnow et al. (1990) Tetrahedron 46: 463267-3286 med noen modifikasjoner som vist i figur 1 og beskrevet nedenfor.

Trinn 1: Fremstilling av N. N'( diaminobutvl)- dietylnitril( l)

Akrylinitril (3,9 g, 73,5 mmol) ble tilsatt til diaminobutan (4,3 g, 48,8 g) i 5 ml MeOH ved 0°C og reaksjonsblandingen ble omrørt i 5 timer. Oppløsningsmiddelet ble avdampet til tørrhet og den oljeholdige resten ble renset ved silikagel flammekromatografi eluerende med kloroform/MeOH med et øket forhold av MeOH for å oppnå 2,1 g av tittelforbindelsen (Rf<2>=0,4). Strukturen til denne forbindelsen ble bekreftet ved 'HNMR.

Trinn 2: Fremstilling av N. N- di- BOC- fdiaminobutvlVdietvlnitril ( 2 )

Forbindelse 1 (2 g, 10,3 mmol) løst opp i 15 ml DCM. BOC-anhydrid (4,5 g, 20,6 mmol) ble tilsatt og reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 3 timer. Reaksjonsblandingen ble deretter vasket med natriumbikarbonat og vann og den organiske fasen ble tørket over MgS04 og deretter avdampet til tørrhet for å oppnå 4,2 g av tittelforbindelsen ((Rf1 =0,84). Strukturen til denne forbindelsen ble bekreftet ved

'HNMR.

Trinn 3: Fremstilling av N4. N9- di- BOC- spermin ( 3)

Til 560 mg forbindelse 2 (1,4 mmol) i 10 ml dietyleter ble det tilsatt Li Al H4 (0,19 g, 5 ml 1 M oppløsning i dietyleter) ved 0°C og reaksjonsblandingen ble omrørt ved 0°C i 1 time. Overskudd LiAlH4 ble stoppet ved tilsetning av 3 ml 1 N NaOH ved 0°C. Presipitatet ble filtrert og filtratet ble vasket med vann. Det organiske laget ble tørket over MgS04 og avdampet til tørrhet for å oppnå 270 mg av tittelforbindelsen. Strukturen til denne forbindelsen ble bekreftet ved <]>HNMR.

Fremstilling av OSU-Suc-Tris-trilaurat

Denne 5 trinns syntesen er beskrevet i figur 2.

Trinn 1: Fremstilling av Z- Tris ( 4)

Til en oppløsning av Z-OSU (4,98 g, 20 mmol) i 30 ml acetonitril, Tris (6,6 g, 60 mmol) i 20 ml vann ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 1 time for å oppnå 82% Z-Tris bekreftet ved HPLC (Rt<A>:4,24). Oppløsningsmidlene ble avdampet til tørrhet, resten ble på ny oppløst i etylacetat og overskudd Tris ble vasket bort med vann. Det organiske laget ble tørket over natriumsulfat og avdampet til tørrhet for å tilveiebringe 3,2 g ren Z-Tris bekreftet ved 'HNMR.

Trinn 2: Fremstilling av Z- Tris trilaurat ( 5)

Z-Tris (2,8 g, 10,9 mmol) ble løst opp i 6 ml DMF og 30 ml DCM. DCCD (6,67 g, 3,27 mmol) laurinsyre (6,56 g, 32,7 mmol) og en katalytisk mengde DMAP ble tilsatt til reaksjonsblandingen og den ble omrørt over natt. HPLC etter 16 timers reaksjon viste dannelse av tittelforbindelsen i 49% utbytte sammen med 41% dilaurat og 10% monolaurat. Oppløsningsmidlene ble avdampet til tørrhet og resten ble igjen oppløst i DCM. Presipitatet av dicykloheksylurea (DCU) ble filtrert og filtratet ble vasket med natriumbikarbonat (5%) og vann. Preparativ HPLC av blandingen ga høy renhet av tittelforbindelsen (3,5 g, Rt<B>: 9,26).

Trinn 3: Fremstilling av Tris- trilaurat ( 6)

Z-tris-trilaurat (3,4 mmol) ble løst opp i DCM/metanol (50/50, 60 ml) og hydrogenert i 3 t. ved 40 psi i en par hydrogenator ved anvendelse av 10% palladium/karbon for å fjerne Z gruppen. Palladium/karbon ble filtrert og filtratet ble avdampet til tørrhet for oppnåelse av 2,2 g tittelforbindelse. Fjerning av Z gruppen ble bekreftet ved HPLC og

'HNMR spektroskopi.

Trinn 4: Fremstilling av Suc- Tris- trilaurat ( 7 )

Tris-trilaurat (1,5 g, 2,24 mmol) ble løst opp i 20 ml DCM. Ravsyreanhydrid (0,45 g, 4,49 mmol) og DIEA (382 ml, 2,24 mmol) ble tilsatt til reaksjonsblandingen som deretter ble omrørt over natt ved romtemperatur. Reaksjonen ble fulgt ved TLC (Rf1 =0,42). Overskudd ravsyreanhydrid ble vasket bort med vann. DCM ble avdampet til tørrhet for oppnåelse av 1,9 g av tittelforbindelsen bekreftet ved 'HNMR.

Trinn 5: Fremstillin av OSU- Suc- Tris- trilaurat ( 8)

Suc-tris-trilaurat (lg, 1,3 mmol) ble løst opp i 8 ml DCM. DCCD (0m268,1,30 mmol) og HOSU (0,224,1,95 mmol) ble tilsatt og reaksjonsblandingen ble omrørt i 16 timer. TLC til reaksjonsblandingen viste kvantitativ dannelse av tittelforbindelsen (Rf<1>=0,50). DCU ble filtrert og filtratet ble avdampet til tørrhet og anvendt i neste kobling uten ytterligere rensning. Fremstilling av N'-(N<12->Z, N^N<9->di-BOC-spermin)Suc-tris-trilaurat(lO).

Til en oppløsning av forbindelse 3 (67 mg, 0,168 mmol) i 5 ml DCM, ble forbindelse

8 (0,168 mmol) i 8 ml DCM tilsatt og pH til reaksjonsblandingen ble justert til 8 ved tilsetning av DUE A. Reaksjonsblandingen ble omrørt over natt for oppnåelse av forbindelse 9. Z-OSU (80 mg, 0,32 mmol) ble tilsatt til ovennevnte reaksjonsblanding og den ble omrørt i ytterligere 2 timer for å oppnå tittelforbindelse 10. Preparativ HPLC av ovennevnte blanding ga 12 mg ren forbindelse 10 og resten av fraksjonene var blandingen av tittelproduktet med forbindelse 7 og forbindelse 9. Strukturen til tittelforbindelsen ble bekreftet ved 'HNMR.

Fremstilling av N^spermin-Suc-Tris-trilaurat (11)

Forbindelse 10 ble løst opp i 3 ml (DCM/MeOH=50/50) og hydrogenert i 2 timer ved 40 psi i en par hydrogenator ved anvendelse av 10% palladium/karbon for å fjerne Z gruppen. Fjerning av Z gruppen ble bekreftet ved HPLC. Palladium/karbon ble deretter filtrert og filtratet ble avdampet til tørrhet. Fjerning av Z ble bekreftet ved 'HNMR spektrorskopi. Resten ble igjen løst opp i 0,5 ml DCM og avkjølt til 0°C. TFA (0,5 ml) ble tilsatt og reaksjonsblandingen ble omrørt i 10 min. ved 0°C og 30 min. ved romtemperatur. TFA og DCM ble avdampet til tørrhet og resten ble lyofilisert for oppnåelse av tittelforbindelsen.

Andre analoger med forskjellige lengder av polyamin, forskjellige typer av spacer og forskjellige typer av fettacylgrupper kan bli syntetisert ifølge fremgangsmåten beskrevet ovenfor med en viss modifikasjon etter behov.

Eksempel 2

Fremgangsmåte for fremstilling av DNA-TRIS-TRILAURAT KONJUGATER MED

EN FOSFORAMIDITLINKER15' TERMINUSEN TIL DNA.

Denne syntesen er oppsummert i figur 4.

Fremstilling av OSU-Suc-tris-trilaurat

Denne forbindelsen ble syntetisert som vist i eksempel 1.

Fremstilling av Hex-Suc-Tris-trilaurat (12)

Denne syntesen er oppsummert i figur 3.

Til en oppløsning av 1,3 mmol OSU-Suc-Tris-trilaurat i 20 ml DCM, ble det tilsatt 6-amino-heksanol (152 mg, 1,3 mmol) og reaksjonsblandingen ble omrørt over natt. Oppløsningsmidlene ble avdampet til tørrhet og resten ble igjen oppløst i DCM og renset med en silika gelflamme kromatograifkolonne, eluerende med DCM/MeOH ved anvendelse av en økende andel MeOH. 400 mg av tittelforbindelsen (Rf<3>: 0,28) ble oppnådd og strukturen ble bekreftet ved 'HNMR.

Fremstilling av fosforamidit-Hex-Suc-Tris-trilaurat (13)

Forbindelse 12 (160 mg, 0,189 mmol) ble løst opp i 3 ml tørr THF og klordiisopropylcyanoetoksyfosfin (89 mg, 0,380 mmol) og DJEA (96 ul) ble begge tilsatt til reaksjonsblandingen. Blandingen ble omrørt i 2 timer under nitrogen. Oppløsningsmiddelet ble deretter avdampet til tørrhet og resten ble renset ved silikagelflammekromatografi eluerende med DCM/MeOH/DIEA med et økende forhold av MeOH. 98 mg av tittelforbindelsen (Rf<3>:0,3) ble oppnådd og strukturen til denne forbindelsen ble bekreftet ved <1>HNMR.

Fremstilling av DNA-Tirs-laurat konjugater

Fosforamidit-Hex-Suc-TRis-trilaurat ble løst opp i DCM og anvendt som et fosforamidit nukleosid og koblet til 5' hydroksylterminusen av støttebundet DNA i den endelige koblingssyklusen. Ammoniakkspaltning og avspaltning kan tilveiebringe fettsyre-DNA konjugat i oppløsning.

Eksempel 3

FREMGANGSMÅTE FOR FREMSTILLING AV DNA-TRIS-MONI, DI OG TRILAURAT KONJUGATER MED AMINOLINKER ENTEN 13' ELLER 5' TERMINUSEN

Fremstilling av tioglycolat-mono, di og trilaurat

Tioglykolsyre kan bli aktivert med HOSU i nærvær av DCC. Aktivert ester kan deretter bli koblet til tris i en DMF oppløsning. Den kan bli renset ved ekstrahering med etylacetat. Dette produktet kan bli acylert med laurinsyre i nærvær av DCC for å tilveiebringe en blanding av tittelproduktene. De tre forbindelsene kan deretter bli separert ved silika gelkromatografi ved eluering med organiske oppløsningsmidler.

Fremstilling av DNA-iod-acetyl

Iodeddiksyre kan bli aktivert med HOSU i nærvær av DCC. Denne aktiverte esteren kan deretter bli koblet til aminolinkeren i 3' og 5' terminusen av DNA; og en aminolinkergruppe kan deretter bli koblet til DNA enten i 3' eller 5' enden av kommersielt tilgjengelige aminolink reagens. Produktet kan deretter bli renset på en anion-bytte kolonne.

Fremstilling av DNA-acetyl-glykolat-tris-laurat

DNA-iod-acetyl kan bli koblet spesifikt til tiolgruppen av tioglykolay-laurat rett etter fremstilling av DNA iodacetyl. Produktet kan deretter bli renset ved revers fase HPLC.

Vurdering av transfeksjonsegenskaper

Forkortelser anvendt:

fi-Gal = 6-galaktosidase (fra E. coli)

CAT = klormafenikol acetyltransferase

CHO kinesisk hamsterovarie celler

Cosi = afrikansk grønn ape nyreceller som bærer det store T antigenet fra SV40 virus.

DME Dulbeccos modifiserte Eagles medium

DMSO = dimetylsulfoksid

DPBS = Dulbeccos fosfat buffret saltvann

EMEM = Earl's modifiserte Eagles medium

FCS = føtalt kalveserum

h = timer

lac Z = gen kodende for E. coli B-galaktosidase

min = minutter

MTS = 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-5-(3-karboksymetoksyfenyl)-2-(4-sul^ tetrazolium inner salt

PBS = fosfatbuffret saltvann

PMS = phenazin metosulfat

PGK = fosfoglycerat kinase

X-Gal = 5-brom-4-klor-3-indolyl-B-D-glaktopyranosid

Eksempel 4

TRANSFEKSJON AV DYRKEDE CELLER TIL BLYFORBINDELSEN

SpSucTL3.

Fremgangsmåter og materialer anvendt:

Forbindelser og nukleinsyrer

En blyforbindelse SpSucTL3 (spermin-ravsyre spacer-tris-laurat), ble syntetisert som beskrevet ovenfor. Forbindelsen ble oppløst i 20 mM i etanol og fortynnet med et likt volum sterilt vann for å tilveiebringe en 10 mM stamoppløsning i 50% etanol. Denne 10 mM stamoppløsningen ble ytterligere fortynnet i sterilt vann ved vortex behandling for å produsere en 2 mM arbeids stam oppløsning. Kommersielt tilgjengelig kationisk lipidtransfeksjonsreagens lipofektamin (GIBCO/BRL) ble anvendt som en positiv kontroll.

For å teste transfeksjonsegenskapene til blyforbindelsen SpSucTL3, ble helt uspaltet pCIB-Gal plasmid som bærer E. coli B-galaktosidase reportergen under kontroll av cytomegalovirus øyeblikkelig tidlig promoter anvendt. For å danne denne reporter genekspresjonskassetten ble E. coli B-galaktosidase genet fra pSVGAL (Sleigh, M.J-and Lockett, T.J. (1985). EMBO J. 4: 3831-3837) først klonet som et Hind IH-BamHI fragment inn i Bluescript SK+ (Clontech) for å produsere Bst B-Gal. Reportergenet ble deretter spaltet fra Bst B-Gal som et Xho I-Xba I fragment og klonet inn i Xho I-Xba I cut pCI (Clontech) for å produsere ekspresjonsplasmidet vist i figur 5.

Transfeksi onsprotokoll

Transfeksjonseffektiviteten ble bestemt ved måling av nivået av reportergen produkt (fl-Gal aktivitet) tilstede i cellene 48 timer etter introdusering av reportergen kassetten inn i cellene. For å oppnå dette ble hver brønn i en 8 x 9 oppstilling av brønner i en mikrotiterskål utsådd med 1 x IO<4> CHO celler i EMEM, 10% FCS og adherert over natt. Neste dag ble det i et nytt mikrotiter brett satt opp en DNA fortynningsplate ved plassering av 250 ul EMEM inneholdende 4,0 ug pCIB-Gal plasmid i hver av de øverste 9 brønnene til skålen. EMEM (125 ul) ble tilsatt til 7 rader av 9 brønner rett under DNA inneholdende brønner. DNA ble deretter fortynnet i serie i 2 trinn gjennom 7 rader med medium-inneholdende brønner som resulterer i en skål med 8 brønnrader hvor alle brønnene til en hvilke som helst gitt rad inneholdt en identisk mengde DNA. På en analog måte ble en transfeksjonsmiddelfortynningsskål også dannet. Til 8 brønner av den venstre kolonnen til en 9 mikrotiterskål ble det tilsatt 120 ul EMEM inneholdende transfeksjonsreagens (SpSucTO) eller lipofektamin) med 168 um. Til 8 brønner av ved siden av liggende 8 kolonner av brønner ble det tilsatt 60 ul DME. Transfeksjonsreagenset ble deretter seriefortynnet i 2-ganger trinn gjennom 7 av kolonnene til medium-inneholdende brønner som resulterer i 8 kolonner av brønner hvor alle brønnene til en gitt kolonne inneholdt identiske konsentrasjoner av transfeksjonsreagens som skal bli testet og en endelig kolonne som ikke inneholder reagens. DNA og transfeksjonsreagensfortynningsmatriser ble deretter lagt oppå hverandre ved overføring av 60 ul DNA inneholdende medium fra brønnene til hver brønn av DNA fortynningsskålen til tilsvarende rad av transfeksjonsreagensfortynningsskål. Denne skålen ble eventuelt ristet i 1 min. Etter blanding av skålen inneholdende kombinert reagens og DNA ble dette latt stå ved romtemperatur i 10 min. for å lette dannelsen av transfeksjonskompleks applikasjon til cellene. Cellene ble vasket en gang med EMEM og deretter ble transfeksjonsmatrisen overført til celleskålen, 100 ul av hensiktsmessig DNA/reagensblanding pr brønn. Skålene ble inkubert i 4 timer ved 37°C, 95% fuktighet i 5% C02. EMEM, 10% FCS (100 ul) ble deretter tilsatt til hver brønn og skålene ble inkubert over natt. Neste morgen ble mediet erstattet med frisk EMEM, 10% FCS og skålene ble returnert til inkubatoren i gjenværende 48 timer ekspresjonstid.

Analyser av toksisitet

Som en del av hver transfeksjonsstudie ble toksisiteten til testforbindelsen i kombinasjon med nukleinsyre testet ved anvendelse av MTS analysen før analysering for reportergen ekspresjon. MTS (Promega) (2 mg/ml i DPBS) og PMS (Promega) (0,92 mg/ml i DPBS) ble blandet friskt i et forhold på 20:1 og 20 ul av denne blandingen pr 100 ul kulturmedium ble tilsatt til hver test og kontrollbrønnen til hver mikrotiterskål. Kulturer ble deretter inkubert i ytterligere 0,5-2 timer under normale betingelser (37°C, 95% fuktighet med 5% CO2). Cellelevedyktigheten ble deretter bestemt ved bereining av forskjellen mellom A490 (test) og A655 (referanse) avlesninger for alle prøver og kontroller ved anvendelse av en skålavleser ved å kjenne forholdet mellom antall levedyktige celler og størrelsen på denne differansen.

Målin<g>er av transfeksionsaktivitet via reporter genekspresion

MTS-inneholdende medium ble først fjernet og cellene vasket 1 x med PBS. For B-Gal analysering ble de vaskede cellene i hver brønn lysert ved tilsetning av 50 ul lyseringsbuffer (0,1% Triton X-100,250 mM pH 8,0). Skålene ble forseglet, frosset ved -70°C, tint og 50 ul PBS, 0,5% BSA ble tilsatt til hver brønn. For å kvatifisere B-Gal aktiviteten ble 150 ul substrat i buffer (1 mg/ml klorfenolrød galaktopyranosid (Boehringer Mannheim) i 60 mM natriumfosfatbuffer pH 8,0,1 mM MgSC>4, 10 mM KC1, 50 MM 2-merkaptoetanol) tilsatt til hver brønn og farven ble utviklet ved romtemperatur i 1 min. til 24 timer. Aktiviteten ble bestemt ved avlesning av A570 for hver brønn og sammenlignet med de som ble produsert ifølge kjente sett av B-Gal standarder.

Oppnådde resultater er vist i figur 6. Figur 6A viser at både SpSucTL3 og lipofektamin viser lignende nivåer av toksisitet i de brønnene hvor de viser maksimal transfeksjonsaktivitet (21 um lipid, 0,25 ug plasmid for lipofektamin; 21 um lipid, 0,5 Hg plasmid for SpSucTL3). Figur 6B viser at SpSucTL3 kan effektivt introdusere reportergen konstruksjoner inn i dyrkede celler. I det denne aktiviteten er noe lavere enn den som blir observert med lipofektamin vil det være innlysende for fagfolk innenfor dette området at SpSucTL3 representerer en ledende forbindelse for en ny familie av beslektede forbindelser. Ved å utføre systematiske endringer på lengde, antall og kjemisk natur til de hydrofobe domenene vil lengden og naturen til spacer regionen og størrelse, ladning, natur og binding av nukleinsyrebindende domene og/eller ved formulering med nøytrale lipider være mulig å syntetisere reagenser med svært forbedrede nukleinsyreleveringsegenskaper uten å avvike fra de vesentlige trekkene til de molekylære konstruksjonene som beskrevet i denne søknaden. Det kan være mulig og ytterligere forsterke transfeksjonsegenskapene til disse reagensene ved å inkludere polykationer med nukleinsyre og reagenset ved tidspunktet for dannelse av transfeksjonskomplekser som tidligere beskrevet i et antall kationiske liposomer (Gao, X. and Huang, L. (1996) Biochemistry 35: 1027-1036).

I det den nøyaktige mekanismen hvorved SpSucTL3 forsterker transfeksjonen av cellene ikke er kjent, på grunn av at det er et kationisk lipid, antar vi at den reagerer med anioniske nukleinsyrer gjennom en ladningsinteraksjon som tilveiebringer et lipidbelegg som vil lette deres cellulære opptak som beskrevet av Gershon et al. (Gershon, H. et al.

(1993) Biochemistry 32: 7143).

I tillegg til levering av nukleinsyrer inneholdende genekspresjonskassetter kan transfeksjonsreagensene ifølge oppfinnelsen også bli anvendt for å levere nukleotider

(dersom de består av RNA, DNA, beskyttede nukleotider eller kombinasjoner av disse)

inn i cellene. Effektiviteten hvorved transfeksjonsreagensene kan levere slike nukleinsyrer til cellene kan bli bestemt ved merking av oligonukleotidene ifølge hvilke som helst av et antall fremgangsmåter kjent innenfor fagområdet inkludert, men ikke begrenset til, ved anvendelse av radioaktivitet, fluorescens tagger, biotin og digoksigenin. Som et eksempel, når andelen av celler transfektert med oligonukleotid ved anvendelse av et bestemt reagens skal bli målt ved anvendelse av fluoreskeinerte oligonukleotider, kan følgende tilnærming bli anvendt. Kort sagt vil 8 x IO<4> Cosi celler (5 x IO<4> CHO celler) bli sådd ut på objektglass i brønnene til en 24 brønn skål i DME (for Cosi celler) eller EMEM (for CHO celler), 10% FCS og inkubert ved 37°C i 5% C02/luft for å muliggjøre cellekobling. Et fluoreskeinert oligonukleotid (1-20 um i 250 Hl medium) vil bli blandet med transfeksjonsreagens (SpSucTL3 eller lipofektamin, 0,25,0,5 eller 1 ul av en 2 mM stamoppløsning i 250 ul medium) og latt stå ved romtemperatur i 15 min. Cellene kan deretter bli vasket lx med serumfritt medium og 500 ul av de forskjellige transfeksjonsblandingene kan bli tilsatt til brønnene. Skålene kan deretter bli inkubert ved 37°C, 95% luftfuktighet i 5% C02 i 4 timer. Etter inkubasjon kan mediet bli fjernet og cellene vasket lx med PBS. Objektglass kan deretter bli fjernet fra brønnene, plassert i PBS og undersøkt ved konfokal scanning laser mikroskopi for å registrere andeler av celler som inneholder fluorescensmarkør.

Claims (1)

1. In vitro-fremgangsmåte for innføring av nukleinsyre i en celle, k a r a k - 3o terisert ved at cellen eksponeres for en forbindelse med formelen:

   hvor: w er en nukleinsyre x er en ikke-aminosyre eller ikke-peptid nukleinsyrebindende gruppe y er en spacer som har en kjedelengde som tilsvarer 1-30 karbon-karbon kovalente enkeltbindinger eller er fraværende, R4 er H eller halogen eller CH2O-R3; og Ri, R2 og R3 er like eller forskjellige og er enten hydrogen, metyl, etyl, alkyl, alkenyl, hydroksylert alkyl, hydroksylerte alkenylgrupper eller eterinneholdende alkyl, alkenyl, hydroksylert alkyl eller hydroksylerte alkenylgrupper, eventuelt en acylgruppe avledet fra en fettsyre som har en karbonkjedelengde som tilsvarer 3-24 karbonatomer som er mettede eller umettede, forutsatt at minst én av Ri, R2 eller R3 innbefatter en gruppe som har en karbonkjede med 3-24 karbonatomer som er mettede eller umettede. 2.

   In vitro-fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert v e d at y er tilstede. 3.

   In vitro-fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert v e d at nukleinsyren er DNA, RNA eller oligonukleotider av enten DNA eller RNA, modifiserte oligonukleotider eller en kombinasjon derav. 4.

   In vitro-fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at Ri, R2 og R3 er like. 5.

   In vitro-fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at Ri, R2 og/eller R3 er kolesterol eller acylderivater av fettsyrer valgt fra gruppen bestående av palmitat, myristat, laurat, kaprat og oleat. 6.

   In vitro-fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at Ri, R2 og/eller R3 er acylderivater av myristat eller laurat. 7.

   In vitro-fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert v e d at cellene er dyreceller. 8.

   In vitro-fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert v e d at cellene er planteceller. 9.

   In vitro-fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert v e d at forbindelsen er tilstede i et liposom eller blandet med et annet lipid. 10.

   In vitro-fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at forbindelsen inneholder en spacergruppe "y" som har en kjedelengde tilsvarende 3 til 17 karbonatomer. 11.

   In vitro-fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert v e d at "y" er aminosmørsyre, aminokapronsyre, aminokaprylsyre eller aminoundekansyre eller et dipeptid av aminokapronsyre og aminoundekansyre. 12.

   In vitro fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert v e d at "x" har en total positiv ladning og nukleinsyren er assoisert elektrostatisk. 13.

   In vitro fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert v e d at "x" er et oligonukleotid og nukleinsyre "w" er assosiert med "x" ved baseparing eller trippel heliks dannelse. 14.

   In vitro fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at "w" er kovalentlig koblet til "x". 15.

   In vitro fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert v e d at "w" er assosiert til "x" ved hydrogenbinding. 16.

   Forbindelse for anvendelse ved innføring av nukleinsyre inn i en celle, karakterisert ved at forbindelsen har formelen

   hvor: w er en nukleinsyre x er en ikke-aminosyre eller ikke-peptid nukleinsyre bindende gruppe y er en spacer som har en kjedelengde som er ekvivalent med 1-30 karbon-karbon kovalente enkeltbindinger eller er fraværende, Pm er H eller halogen eller CH2O-R3; og Ri, R2 og R3 er like eller forskjellige og er enten hydrogen, metyl, etyl, alkyl, alkenyl, hydroksylert alkyl, hydroksylerte alkenylgrupper eller eterinneholdende alkyl, alkenyl, hydroksylert alkyl eller hydroksylerte alkenylgrupper, er eventuelt en acylgruppe avledet fra en fettsyre som har en karbonkjedelengde ekvivalent med 3-24 karbonatomer som er mettede eller umettede, forutsatt at minst én av Ri, R2 eller R3 innbefatter en gruppe som har en karbonkjede med 3-24 karbonatomer som er mettede eller umettede. 17.

   Forbindelse ifølge krav 16, karakterisert ved at "y" er tilstede. 18.

   Forbindelse ifølge krav 16, karakterisert ved at "w" er DNA, RNA eller oligonukleotider av enten DNA eller RNA, modifiserte oligonukleotider eller en kombinasjon derav. 19.

   Forbindelse ifølge krav 16, karakterisert ved at Ri, R2 og R3 er like. 20.

   Forbindelse ifølge krav 16, karakterisert ved at Ri, R2 og/eller R3 er kolesterol eller acylderivater av fettsyrer valgt fra gruppen bestående av palmitat, myristat, laurat, kaprat og oleat. 21.

   Forbindelse ifølge krav 20, karakterisert ved at Ri, R2 og/eller R3 er acylderivater av myristat eller laurat. 22.

   Forbindelse ifølge krav 16, karakterisert ved at forbindelsen er tilstede i et liposom eller blandet med et annet lipid. 23.

   Forbindelse ifølge krav 16, karakterisert ved at forbindelsen inneholder en spacergruppe "y" som er en kjedelengde ekvivalent med 3 til 17 karbonatomer. 24.

   Forbindelse ifølge krav 22, karakterisert ved at "y" er aminosmørsyre, aminokapronsyre, aminokaprylsyre eller aminoundekansyre eller et dipeptid av aminokapronsyre og aminoundekansyre. 25.

   Forbindelse ifølge krav 16, karakterisert ved at "x" har en total positiv ladning. 26.

   Forbindelse ifølge krav 16, karakterisert ved at "x" er et oligonukleotid og nukleinsyren "w" er assosiert med "x" med baseparring eller trippel heliks dannelse. 27.

   Forbindelse ifølge krav 16, karakterisert ved at "w" er kovalentlig koblet til "x". 28.

   Forbindelse ifølge krav 16, karakterisert ved at "w" er assosiert til "x" ved hydrogenbinding.