NO324871B1 - Rensede proteiner, rekombinante DNA-sekvenser og fremgangsmater til fremstilling av koffeinfrie drikker. - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en hovedsakelig ren xantosin-N^-metyltransferase som bruker S-adenosylmetionin som substrat, samt en genetisk endret kaffeplante.og genetisk endret kaffeplantefrukt eller bønne avledet fra denne plante. Oppfinnelsen vedrører også en hovedsakelig ren DNA-sekvens som koder for uttrykking av xantonsin-N^-metyltransferase, samt fremgangsmåte for produksjon av koffeinfrie kaffebønner.

Foreliggende oppfinnelse fremstiller stabile linjer av koffeinfrie kaffeplanter hvis frukt, etter brenning og maling, kan anvendes for fremstilling av koffeinfri kaffe. Det forventes at foreliggende oppfinnelse kan anvendes for å undertrykke koffeinsyntese i te ( Camellia sinensis) og cola (Co/a acuminata), og likeledes beslektede alkaloider i sjokolade ( Theobroma cacao).

Kaffe fremstilles fra brente jordbønner av planten av genus Coffea, generelt fra species C. arabica. Kaffeplanter produserer alkaloid koffein, som foreligger i deres tørkede frukter, kaffebønner. På grunn av at mange som drikker kaffe foretrekker kaffe uten koffein, har det blitt utviklet et antall fremgangsmåter for å fjerne koffein fra kaffebønnene. Alle disse fremgangsmåter resulterer i fjerning av substanser utover koffein fra bønnene, noe som dermed påvirker smaken av kaffe som tillages fra de behandlede bønner. Selv om noen få naturlig forekommende koffeinfri kaffe og relaterte generar er kjent ( Mascarocoffea ssp. og Coffea bengalensis), så har de ingen kommersiell verdi. (Charrier og Berthaud, "Variation Of Coffeine Content In The Coffea Gensus", Cafe' Cacao The', 14:251-264 (1975). Det er derfor et behov for en fremgangsmåte for fremstilling av dekoffeinerte kaffebønner som ikke resulterer i fjerning av andre substanser enn koffein fra bønnene.

Kato, M., Kanehara, T., Shimizu, H., Suzuki, T., Gillies, F. M., Crozier, A. og Ashihara, H., Physiologia Plantarium 98: 629-636(1996) studerer og karakteriserer in v/fro-aktiviteten av N-metyltransferase fra unge blad av teplanten Camellia sinensis. Enzymet er assosiert med tre metyleringstrinn i koffeinbiosyntesen i te, hvor hovedsynteseruten tar utgangspunkt i substratet xantosin, som omdannes via mellomproduktene 7-metylxantosin, 7-metylxantin og teobromin til koffein.

US patent 5,334,529 omhandler stabilt transformerte Coffea arabica planteceller, som stammer fra protoplaster og som har evnen til regenerering. DNA for den genetiske modifiseringen av protoplasten blir introdusert gjennom elektroporering.

Koffein er et naturlig forekommende purin-alkaloid som produseres av kaffe- og teplanter, blant andre. Det antas at koffeinsyntese beskytter plantene mot insekter. Kaffeplanter syntetiserer koffein fra nukleosidet xantosin i en firetrinns reaksjon som vist i fig. 1. For en oversikt over metabolismen av purinnukleotider og -alkaloider i te- og kaffeplanter se Suzuki, T., Ashihara, H og Waller, G.R., Phytochemistry 31:2575-2584 (1992). Første trinn i reaksjonsveien er metyler-ingen av nukleosidet xantosin av S-adenosylmetionin, som katalyseres av enzymet xantosin N^ metyl transferase (XMT). Produktet, 7-metylxantosin hydrolyseres (en ribose fjernes) til 7-metylxantin, og undergår ytterligere metyleringer til teobromin og koffein. Det forventes at avbrytelse av denne sekvens av syntetiske reaksjoner vil blokkere syntese av koffein.

I samsvar med dette er en strategi for selektivt å eliminere koffein fra kaffeplanter å hindre syntese av spesifikke enzymer i reaksjonsveien for koffein-biosyntesen.

Et første aspekt av foreliggende oppfinnelse vedrører således en hovedsakelig ren xantosin- -metyltransferase som bruker S-adenosylmetionin som substrat, som er kjennetegnet ved tryptiske fragmenter A, B eller C i samsvar med den følgende formel: Fragment A: -Ile Asn Tyr Ala Ser Gly Ala Ser Gly Ile Leu Asp Gin - Gly Fragment B: -Ile Asn Tyr Ala Ser Gly Ala Ser Gly Ile Leu Asp Gin Thr Fragment C: -Gin Tyr Val Pro Cys Tyr Phe Thr/Asp Phe Ile Asp (Asp)

(Gin) Asp

En foretrukket utførelse av transferasen består av aminsyresekvensen ifølge figur 6.

Et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse vedrører en genetisk endret kaffeplante, som er kjennetegnet ved at endringen er basert på transformering med en DNA-sekvens som undertrykker syntese av xantosin-<7>N-metyltransferase gitt over.

Et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse vedrører genetisk endret kaffeplantefrukt eller bønne avledet fra en plante som angitt over, kjennetegnet ved at den inneholder et DNA-molekyl som undertrykker syntese av nevnte xantonsin-<7>N-metyltransferase.

I et ytterligere aspekt omfatter oppfinnelsen en genetisk endret kaffeplante, kaffeplantefrukt eller kaffeplantebønne, kjennetegnet ved at nevnte inneholder et DNA-molekyl som koder for transkripsjon av mRNA som er antisense til mRNA som koder for uttrykking av xantonsin-N<7->metyltransferase i samsvar med det første aspekt angitt over.

I et ytterligere aspekt omfatter oppfinnelsen en hovedsakelig ren DNA-sekvens som koder for uttrykking av xantonsin-N<7->metyltransferase, kjennetegnet ved at den er valgt fra gruppen som består av a) en sekvens i samsvar med figur 5; b) DNA-sekvenser som hybridiserer med sekvensen i samsvar med figur

5, hvor nevnte hybridiserende sekvens hovedsakelig består av sekvenser som

er komplementære med sekvensen i samsvar med figur 5; og

c) DNA-sekvenser som er degenerative i forhold til sekvensen i samsvar med figur 5.

En foretrukket utførelse av dette aspekt er en kloningsvehikkel.

I et siste aspekt vedrører foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for produksjon av koffeinfrie kaffebønner, kjennetegnet ved at fremgangsmåten omfatter: a) transformering av kaffeplanter med en DNA-sekvens som er enten antisense til en andre DNA-sekvens, eller som koder ved

transkripsjon for et mRNA som er antisense til den andre DNA-sekvensen, hvori nevnte andre DNA sekvens er enten DNA-

sekvensen i samsvar med figur 5, eller en DNA-sekvens som koder for uttrykking av en proteinsekvens i samsvar med figur 6; og valgfritt

b) innhøsting av frukten fra de transformerte kaffeplantene.

Det beskrives derfor således genetisk forandring av kaffeplanter for å eliminere

syntese av XMT.

Kort beskrivelse av figurene.

Fig. 1 er en skjematisk oversikt over reaksjonsveien for koffeinsyntese i Coffea arabica. Fig. 2 er et bilde av en sølvfarget SDS PAGE gel av renset xantosin N<7> metyl transferase. Fig. 3 er et densitometrisk plot som viser eluering av tryptiske fragmenter av renset xantosin N<7> metyl transferase etter HPLC-separering. Fig. 4 er en beskrivelse av oligonukleotidprimerene anvendt for å screene cDNA-biblioteket cDNA-kodende xantosin N<7> metyl transferase. Fig. 5 er basesekvensen for cDNA som koder for xantosin N<7> metyl transferase. Fig. 6 er den predikerte aminosyresekvens for xantosin N<7> metyl transferase.

For å forbedre forståelsen av foreliggende oppfinnelse, er den følgende detaljerte beskrivelse angitt. I beskrivelsen som følger benyttes følgende termer: Nukleotid: En monomerisk enhet av DNA eller RNA som består av en sukker-enhet (pentose), et fosfat og en nitrogen-heterosyklisk base. Basen er koplet til sukkerenheten via det glykosidiske karbon (1'-karbon av pentose) og den kombinasjon av base og sukker kalles et nukleosid. Basen karakteriserer nukleotidet. De fire DNA-baser er adenin ("A"), guanin ("G"), cytosin ("C", og thymin ("T"). De fire RNA-baser er A, G, C og uracil ("U").

DNA-sekvens: Et lineært arrangement av nukleotider som er koplet til hverandre med fosfodiesterbindinger mellom 3'- og 5'-karboner av tilgrensende pentoser.

Kodon: En DNA-sekvens på tre nukleotider (en triplet) som koder via mRNA for en aminosyre, et translasjonsstartsignal eller et translasjonstermineringssignal. F.eks. koder nukleotidtripletene TTA, TTG, CTT, CTC, CTA og CTG for aminosyren leucin ("Leu"), TAG, TAA og TGA er translasjonsstoppsignaler og ATG er et translasjonsstartsignal, som også koder for aminosyren metionin

("MET").

Polypeptid: Et lineært arrangement av aminosyrer som er koplet til hverandre ved peptidbindinger mellom amino- og karboksygrupper på tilgrensende aminosyrer.

Genom: Det fullstendige DNA i en celle eller et virus. Det inkluderer inter alia det strukturelle gen som koder for de substansielle polypeptider, og likeledes promoter, transkripsjon- og translasjoninitiering og termineringsseter.

Gen: En DNA-sekvens som koder gjennom dets templat eller messenger RNA ("mRNA") en sekvens av aminosyrer som er karakteristisk for et spesifikt polypeptid.

Transkripsjon: Prosessen for produksjon av mRNA fra et gen eller en DNA-sekvens.

Translasjon: Prosessen for produksjon av et polypeptid fra mRNA.

Ekspresjon: Prosessen som foregår fra et gen eller en DNA-sekvens til fremstilling av polypeptid. Dette er en kombinasjon av transkripsjon og translasjon.

Plasmid: En ikke-kromosomalt dobbelt-trådet DNA-sekvens omfattende et intakt "replikon" slik at plasmidet replikeres i en vert-celle. Idet plasmidet plasseres inne i en unicellulær organisme, kan karakteristika for denne organisme bli forandret eller transformert som et resultat av plasmidets DNA. F.eks. transformerer et plasmid som bærer genet for tetrasyklinmotstand (TETR) en celle som tidligere er sensitiv til tetrasyklin til å bli en celle som er resistent mot tetrasyklin. En celle som er transformert av et plasmid kalles for en "transformant".

Fag eller bakteriofag: Bakterielle virus, hvor mange av disse består av DNA-sekvenser innkapslet i en protein-envelope eller kappe ("capsid").

Kloningsvehikkel: Et plasmid, fag-DNA, kosmid eller annen DNA-sekvens som er i stand til å replikere i en vert-celle, karakterisert ved en eller et lite antall endonukleasegjenkjennelsesseter ved hvilke slike DNA-sekvenser kan oppkuttes på en måte som lar seg bestemme, uten ledsagende tap av en essensiell biologisk funksjon av DNAet, f.eks. replikasjon, produksjon av kappeproteiner eller tap av promotor eller bindingsseter, og som inneholder en markør som er egnet for anvendelse i identifikasjonen av de transformerte celler, f.eks. tetrasyklinresistens eller ampicillinresistens. En kloningsvehikkel kalles ofte for en vektor.

Kloning: Prosessen for å oppnå en populasjon av organismer eller DNA-sekvenser som er avledet fra en slik organisme eller sekvens ved ukjønnet formering.

Rekombinant DNA-molekyl eller hybrid-DNA: Et molekyl som består av segmenter av DNA fra forskjellige genomer som har blitt koplet ende-til-ende på utsiden av levende celler og som er i stand til å opprettholdes i levende celler.

cDNA: En DNA-tråd som er komplementær til en mRNA som koder for et bestemt polypeptid.

Selv om strategien for å produsere koffeinfri kaffe kan generaliseres til andre enzymer i reaksjonsveien for koffeinsyntese i kaffe, og andre koffeinproduser-ende planter, er et nåværende foretrukket utførelseseksempel ifølge foreliggende oppfinnelse undertrykkelse av utrykkingen av det første unike enzym i reaksjonsveien, xantosin N<7> metyl transferase (XMT). Selv om rollen til XMT i koffeinsyntese har blitt undersøkt ved radiomerking av forløperne, har ingen til dags dato renset enzymene, eller bestemt dets aminosyresekvens.

cDNA-prober basert på deler av aminosyresekvensen oppnådd fra prøver av det rensede enzym ble syntetisert, og en andel av genet ble mangfoldiggjort ved å anvende PCR. PCR-produktene ble anvendt for å screene et cDNA-

bibliotek syntetisert fra mRNA fra unge blad for å identifisere transkripter som koder for XMT. De positive transkripter ble sekvensert, og ca. 90% av den gen-kodende XMT ble opptatt.

DNA som koder ved ekspresjon for XMT inkorporeres inn i en pBI-121-trans-formasjonsvektor som inkluderer et kanamycin-resistent gen. Suksessfull inkorporering av vektorene i planteceller monitoreres ved måling av antibiotisk resistens. Konstruktene anvendes for å transformere somatiske embryoer fra kaffe i vevskultur. De transformerte embryoer vokser deretter til nye kaffeplanter som ikke produserer koffein. Naturlig dekoffeinert kaffe fremstilles av brente jordfrukter fra disse nye planter.

Mer bestemt, ble ferskt løvvev fra unge løv av C. arabica bløtet, og protein ekstrahert derfra. Kolonnerensede ekstrakter ble analysert for enzymatisk aktivitet, ved å monitorere metylering av xantosin ved anvendelse av C^<4->merket S-adenosylmetionin som substrat. Reaksjonsproduktet ble bekreftet som 7-metylxantosin ved å sammenligne migreringen av det merkede reaksjonsprodukt med migrering av 3-metylxantin, 7-metylxantin, 8-metylxantin, 7-metylxantosin, xantin og xantosin i hver av fire forskjellige kromatografisystemer.

Renheten av proteinisolatene ble bestemt ved anvendelse av SDS PAGE elektroforese, og todimensjonal gelelektroforese. Sølvfarging av en-dimensjonale SDS PAGE geler indikerte nærvær av en dublett med den enzymatiske aktivitet av XMT, med en molekylvekt på 36-37 kg Daltons (kD) som vist i fig. 2. Hvert protein ble ytterligere bestemt ved isoelektrisk fokusering. Dataene indikerer nærvær av isozymer av XMT som kan være et resultat av post-translational modifisering av proteinet, alternativt, kan der være en genfamilie som koder for XMT-enzymer.

Dubletten som var synlig på SDS PAGE geler ble anvendt for proteinsekvensering. Renset XMT ble underlagt delvis tryptisk oppkutting for å etablere fragmenter for ytterligere analyse; tre topper ble bestemt ved anvendelse av HPLC. Sekvensering ble utført av Protein Structure Laboratory, ved University of California, Davis, ved å anvende automatisert Edman-degradering. (Edman, P. og Begg, G., Eur. J. Biochem, 1:80). To unike sekvenser ble oppløst, og anvendt for å konstruere primere for probesyntese. RNA ble ekstrahert fra kaffeblad. mRNA-inneholdende poly (A<+>)-sekvenser ble renset derfra. Et cDNA-bibliotek ble fremstilt fra poly(A<+>)mRNA ved anvendelse av revers transkriptase. Dobbeltrådet DNA ble fremstilt ved anvendelse av DNA-polymerase I, og gjenvunnet ved presipitering. cDNA ble fraksjonert og satt inn i fag for mangfoldiggjøring. cDNA-biblioteket ble screenet med en PCR-syntetisert probe produsert ved anvendelse av primere basert på DNA-sekvensen forventet ut fra aminosyresekvensen for det rensede XMT. En klon som produserte et cDNA inneholdende alle sekvensene som koder for XMT har blitt identifisert.

Den cDNA som korresponderer til genet som koder for XMT anvendes for å transformere embryoniske kaffeplanter. Plasmidet pBI-121 anvendes som en transformeringsvektor. Sekvensene som korresponderer til DNA som koder ved ekspresjon for XMT innsettes i plasmidet i en invertert orientering tilgrensende til en cauliflower mosaikk virus 35S promoter. RNA som transkriberes derfra vil være komplementær til mRNA som koder for aminosyresekvensen til XMT. Fullstendige konstrukter mangfoldiggjøres i bakterielle verter. Vertene øde-legges, og den mangfoldiggjorte vektor festes til kolloidale gullpartikler. Gull-partiklene med adherte vektorer innsettes i kaffeplanteprotoplaster ved propellering av partiklene med høy hastighet mot cellene, som beskrevet i US-patent 5.107.065. Unge planter som med suksess er transformert identifiseres ved antibiotisk resistens. De transformerte planter produserer ikke koffein.

Eksempler.

A. Rensing av xantosin-N<7->metyltransferase fra C. arabica L. cv kaffeblad fra Guatemala.

Ungt bladvev, mindre enn 5 mm i lengde (tilsvarende til B3-trinnet Frischknecht.P.M., Ulmer-Dufek, J. og Baumann, T.W. (1986) Phytochemistry 25:613) ble innsamlet fra trær som vokste ved University of Hawaii Waimanalo Research Station, Oahu, Hawaii. Bladene ble umiddelbart neddykket i flytende nitrogen (væskeformig N2) og lagret ved -70°C inntil anvendelse. Alle påfølgende prosedyrer ble utført ved 4°C, dersom ikke annet er angitt. Bladvev (150 g) ble bløtet i en mørtel og støter under N2 i væskeform og, mens det fremdeles var frossent, overført til en på forhånd avkjølt huskaffekvern og malt med et lite stykke tørris i ca. 30 sekunder. Det pulverformede vev ble tilsatt til et beger inneholdende 1,5 I iskald 80% aceton, 5 mM tiourea og 12,5 mM li-merkaptoetanol. Etter blanding med en magnetisk omrører i 45 minutter, ble vevet gjenvunnet ved filtrering under vakuum i en trakt av typen Buchner, inneholdende filterpapir av typen Whatman Nr. 1. Vevet ble vasket med 2,5 I 80% iskald aceton inneholdende tiourea og B-merkaptoetanol som ovenfor, lufttørket i 20 minutter og deretter frysetørret i 48 timer.

Det resulterende aceton-pulver ble homogenisert i en blander med 400 ml ekstraheringsbuffer (EB)(0,1 M PIPES[pH 7,0], 0,5 mM Na2EDTA, 0,5 mM Na2EGTA, 5% askorbinsyre, 5 mM ditiotreitol [DTT], 5 mM tiourea, 12 mM L-cystein HCI, 1% polyetylenglykol (PEG) 20.000, 0,1 mM fenylmetylsulfonyl-fluorid [PMSF], og 20 g polyvinyl-polypyrrolidon [PVPP]). Blandingen ble homogenisert i 10 minutter ved middels hastighet, og deretter overført til 250 ml sentrifugerør og sentrifugert ved 23.000 g i 30 minutter i en GSA-rotor (Dupont-Sorvall).

Rå-supernatanten på 350 ml som ble oppnådd, ble brakt til 40% ammonium-sulfat-(AS)-metning i løpet av 30 minutter ved langsom tilsetning av 79,86 g AS-pulver idet den ble omrørt i et beger omgitt av et isbad. Blandingen ble enda en gang overført til 250 ml sentrifugerør og sentrifugert ved 23.000 g i 30 minutter, som ovenfor. 350 ml-supernatanten som ble oppnådd ble overført til en 40 ml Macro-Prep (Bio-Rad) metyl-hydrofobisk interaksjonskromatografikolonne (HIC) med en gjennomstrømningshastighet på 2,5 ml/min. Alle kolonnefraksjoner ble monitorert for protein ved å anvende absorbans ved 280 nm. HIC-kolonnen ble vasket to ganger med preekvileringsbuffer inneholdende 1,7 M AS, 20 mM bis-tris-propan (pH 6,8), og 5 mM DTT inntil det ble etablert en baselinje nær null. Kolonnen ble deretter "tømt" med en buffer inneholdende 10 mM tris (pH 7,0), 5 mM DTT, 1 mM MgCI2. De første 15 ml som kom ut av kolonnen ble kastet, og det gjenværende eluat (200 ml) ble lastet under gravitet til en 100 ml Affi-Gel blue affinity gel (100-200 mesh, Bio-Rad) kolonne som hadde en farge Cibacron blue F3GA kovalent koplet til matriksen. Gelen ble pre-ekvilibrert med 10 mM tris (pH 7,0), 5 mM DTT, 1 mM MgCI2 påføringsbuffer. Kolonnen ble vasket utførlig med påføringsbufferen inntil baselinjen stabiliserte seg nær null, og de bundne proteiner ble eluert med en buffer inneholdende 10 mM tris (pH 7,0), 5 mM DTT og 1,5 M natriumklorid (NaCI).

Affi-Gel Blue Gel kolonneeluatet på 142 ml ble justert til 1,7 M AS ved langsom tilsetning av 31,8 g AS-pulver under omrøring i 30 minutter i et beger omgitt av et isbad. Blandingen ble sentrifugert i 250 ml sentrifugerør ved 23.000 g i 30 minutter som ovenfor, og supernatanten ble overført til FPLC fenylsefarose-kolonne XK 26/20 (Pharmacia) ved 23°C. Kolonnen ble pre-ekvilibrert med en buffer inneholdende 20 mM bis-tris-propan (pH 6,8), 5 mM DTT og 1,7 M AS. Når baselinjen var etablert nær null ble proteinene eluert ut fra kolonnen med en 40 minutters revers gradient på fra 1,7 M AS til 0 M AS med en gjennom-strømningshastighet på 5 ml/min., og det ble oppsamlet fraksjoner pr. minutt. 0 M AS-elueringsbufferen inneholdt 10 mM tris (pH 7,0), 5 mM DTT og 1 mM MgCI2.

Aktivitetsanalyser i fraksjonene innsamlet indikerte at hoveddelen av enzym-aktiviteten for xantosin-N<7->metyltransferase var konsentrert i fraksjoner 49 til 54. Disse fraksjoner ble samlet til et finalt volum på 30 ml, og deretter lastet på en 6 ml ATP-agarosekolonne (Sigma Chemicals, A2767) med tyngdekraft ved 4°C. Kolonnen ble pre-ekvilibrert med 10 mM tris (pH 7,0), 5 mM DTT og 1 mM MgCI2. Etter stabilisering av baselinjen ble kolonnen tømt med 20 ml pre-ekvilibreringsbuffer inneholdende 100 pM xantosin, og vasket med ytterligere 40 ml pre-ekvilibreringsbuffer. Begge kolonneeluater ble samlet og applisert på en Mono-P HR 5/20 FPLC-kolonne (Pharmacia) pre-ekvilibrert med 25 mM bis-tris (pH 6,0) og 9% betain ved 23°C. Etter at baselinjen var stabilisert ble kolonnen eluert med 100 ml polybuffer 74 (10 ml:90 ml H20, volum:volum) (pH 4,0) (Pharmacia) og 9% betain med en gjennomstrømningshastighet på 1 ml/min. Innsamlingsrørene inneholdt 100 pl 0,5 M tricinbuffer (pH 7.0) og 50 mM DTT som ga en final konsentrasjon på 1 ml av 50 mM tricin (pH 7,0), og 5 mM DTT i fraksjoner på 1 minutt. Dette stabiliserte de finale pH-betingelser for proteinene eluert under svakt sur pH fra mono-P-kolonnen. Hovedaktiviteten av xantosin-N<7->metyltransferase i innsamlingsrørene uten tricin ble funnet i fraksjoner 15 og 16 av gradientelueringen fra kolonnen med en pH på 5,42 og 5,35, respektivt. Det var viktig å ikke fryse proteinprøvene i noe trinn under rensingen, idet dette hadde en betydelig negativ effekt på aktivitetsformen for xantin- -metyltransferase.

B. Analyse av enzymaktivitet.

En standard analyseblanding på 100 pl inneholdt 50 mM tricin (pH 7.0), 1200 pM xantosin, 5 mM DTT, 7,5 pM S-adenosyl-L-[metyl-<14>C]metionin (SAM) (60 mCi/mmol, DuPont NEN), og 1 mM Na2EDTA. Reaksjonsblandingen (50 pl uten enzym) ble preinkubert i 10 min. ved 25°C, og reaksjonen ble startet ved tilsetning av 50 pl enzymblanding og fikk fortsette ved 25°C i 1 time. Ved slutten av inkuberingsperioden ble tre 30 pl alikvoter av reaksjonen fjernet og terminert ved tilsetning av 8 pl 0,6 M perklorsyre (HCIO4). Det samme ble gjort for nulltidskontroller for å detektere riktig enzymaktivitet. Blandingen ble sentrifugert i en mikrosentrifuge i 5 min., og 10 pl av supernatanten ble blandet med 1,0 pl 33 mM 7-metyl-xantosin. Disse blandinger ble applisert på Whatman Nr. 1 kromatografipapir og utviklet med n-butanol-eddiksyre-H20 (n-BuOH-HOAc-H20) (4:1:1). Posisjonen for 7-metylxantosin ble bestemt av dets blå fluorescens ved eksponering til kortbølgelengde UV-lys. Denne region ble skjært ut av kromatogrammene og radioaktivitet ble bestemt ved scintillasjons-tellling ved anvendelse av 3 ml scinti-verse scintillasjonsfluid (Fisher Scientific). Tellingseffektivitet var 74,7%. Bakgrunn og ikke-spesifikk utstråling detektert i 7-metylxantosin-regionen av nulltidsprøvene ble trukket fra.

C. Identifisering av reaksjonsproduktet.

Metyleringssetet på xantinringen ble identifisert med hydrolyse av sukkeret fra det metylerte xantosin-reaksjonsprodukt, og separering i 4 forskjellige kromatografisystemer. Produktet fra 200 pl reaksjoner utført som beskrevet ovenfor og inneholdende 6 pl 33 mM 7-metylxantosin som bærer, ble påført som et bånd ved nullpunktet i et Whatman Nr. 1 papirkromatogram. Kromatogrammet ble utviklet i n-BuOH-HOAc-H20 (4:1:1). Regionen på kromatogrammet som korre-sponderte til metylert xantosin ble detektert som ovenfor, skjært ut i små styk-ker, plassert i et sterilt rør, og inkubert med 35 ml deionisert vann ved 37°C, med risting over natten. Ekstraktet ble filtrert gjennom 2 sjikt av miracloth etterfulgt av 0,22 pm filter, og deretter frysetørket. Det tørre ekstrakt ble resuspendert i 1,0 ml deionisert vann, plassert i glass-digestionflaske, og frysetørket. Prøven ble resuspendert i 400 pl 1,0 M HCI, og inkubert i 1 time ved 100°C. Digestet ble frysetørret, resuspendert i 400 pl 3 mM 7-metyl-xantin, og fryse-tørret igjen. Digestet ble resuspendert i 40 pl deionisert vann, og 10 pl ble kromatografert i hver av fire forskjellige systemer. 1-metylxantin, 3-metylxantin, 7-metylxantin, 8-metylxantin, 7-metylxantosin, xantin og xantosin ble inkludert på hvert kromatogram for sammenligning. De følgende kromatografisystemer ble anvendt: Whatman Nr. 1 papir utviklet i n-BuOH-HOAc-H20 (4:1:1) og C8 tynnsjiktsplater (Whatman KC18F) utviklet i enten isoamyl alkohol-H20-acetonitril (41:4:5), etanol-H20 (4:1) eller tert-BuOH-HOAc-H20 (4:1:1). Etter tørking ble kromatogrammene sprayet med En^Hance (Dupont NEN), tørket på nytt og eksponert i 30 dager til pre-flashed Fuji RXqqj X-ray filmer ved -70°C.

D. Identifisering av proteiner med gel-elektroforese.

Ekstrakter oppnådd som beskrevet ovenfor ble anvendt i en-dimensjonale (1D) SDS-PAGE minigeler (hovedgel:12,5% akrylamid, 0,8% metylenbisakrylamid, stacking gel:7,5% akrylamid, 0,21% metylenbisakrylamid) ved å blande med Laemmli-prøvebuffer (Laemmli, U.K., Nature 227:680 (1970)), og i to-dimensjonal (2D) mini JEF/SDS-PAGE av den modifiserte fremgangsmåte beskrevet i 0'Farrell et al. (0'Farrell, P.Z., Goodman, H.M., 0'Farrell P.H., Cell 12:1133

(1977)). To-dimensjonal elektroforese ble mulig ved at proteinene ble presipitert med 50 volum 100% etanol i 1 time, og ved oppløsning på nytt av proteinene i isoelektrisk fokuseringsprøvebuffer (IEF) inneholdende 5% amfoliner (1:1, volum:volum, pH 3-10:pH 5-7, LKB-Pharmacia). Forholdet av det opprinnelige proteinekstrakt til lEF-prøvebuffer ble opprettholdt på minst 1:2 for å sikre at enhver gjenværende bufferbestanddel fra kromatograferingstrinnet ikke inn-virket på IEF. Like totale proteinprøver (<20 yg) ble påført til den basiske ende av prefokuserte rørgeler (8,8% akrylamin, 1,6% metylenbisakrylamid) inneholdende 5% amfoliner som ovenfor. Gelene ble fokusert med 10.000 V-time pluss ytterligere 2 timer ved 1.000 V. Blanke fokuserte geler ble kuttet i seksjoner på 5 mm, og inkubert i 0,5 ml 100 mM CaCI2 i 24 timer, og pH i segmentene ble bestemt. For denne analyse ble pH-gradienten i IEF-gelen estimert til å være i området fra 4,4 til 6,0.

Rørgelene ble fremstilt for SDS-PAGE med en kort H20-vasking etterfulgt av tre vaskinger (10 min. hver) i varm Laemmli-prøvebuffer. Rørgelene ble plassert på toppen av SDS-PAGE gelene (hovedgel:12,5% akrylamid, 0,8% metylenbisakrylamid, stacking gel:7,5% akrylamid, 0,21% metylenbisakrylamid) og ble holdt på plass med 3% agarose i Laemmli-prøvebuffer. Proteinene ble visualisert med sølvfarging. 11D-geler indikerte mono-P-fraksjonen 16 som hadde den høyeste enzymaktivitet kun nærvær av en dublett ved sølvfarging (fig. 2). Molekylvekten for disse proteiner (kD) var ca. 37,6 og 36,1 kD. I 2D-gelene separerte hvert protein til to flekker. Det isoelektriske punkt (IP) av det sureste hadde en gjennomsnittsverdi over flere geler på 5,2, og det mest basiske på 5,3. Deres molekylvekter var nå i gjennomsnitt 43,5 kD, og hvor de øvre og nedre peptider fusjonerte inn i hverandre. Det er derfor en distinkt forskjell i kD mellom 1D- og 2D-geler. Den like migrering av alle disse fire peptider i mono-P-kolonner, 1D- og 2D-geler indikerte at de alle er isoenzymer som kan være post-translationalt modifisert. Alternativt kan de være produktet av en genfamilie som har små forskjeller i struktur, resulterende i de forskjellige isoenzymer som ble observert.

E. Prbteinsekvensering

Totalt proteinestimering ifølge prosedyren til Lowry (Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L og Randall, R.J., J. Biol. Chem. 193:265 (1951)) for fraksjon 16 av mono-P indikerte at der var totalt 100 pg protein i 1 ml fraksjonen. Det er vår erfaring at ved disse lave konsentrasjoner av protein er Lowry-verdier en over-estimering av den aktuelle totale mengde som foreligger. Vi bestemte å over-kompensere for dette ved å anvende en vesentlig del av denne fraksjon for proteinsekvensering. En 900 pl andel av mono-P fraksjon 16 representerende 90 pg ble plassert i et sterilt 1,5 ml mikrosentrifugerør, og 216 pl 100% triklor-eddiksyre (TCA) ble tilsatt til denne. Etter blanding ble røret inkubert på is over natten, og ble deretter sentrifugert ved 14.000 rmp i en mikrosentrifuge i 30 min. ved 4°C. Supernatanten ble fjernet ved aspirasjon, og pelleten vasket to ganger med 1 ml 75% etanol, hvor hver vasking ble etterfulgt av et sentri-fugeringstrinn. Pelleten ble tørket ved å plassere røret i en "speedvac", og det ble sentrifugert i 1 min. under vakuum. 20 pl 2 x Laemmli-prøvebuffer ble tilsatt til presipitatet. Det ble deretter kokt i et vannbad i 5 min., og deretter "mikro-fugert" i 1 min. Når temperaturen i røret var kjølt ned til 23°C ble hele mengden applisert på et enkelt spor i en 12,5% 1D-gel. Ved terminering av elektroforesen ble proteinene visualisert ved farging med 0,1% Coomassie R-250 i vandig 50% metanol og 10% eddiksyre, (vekt:volum:volum), og deretter avfarget. De samme dubletter på 37,6 og 36,1 kD observert i sølvfargede geler var også synlig i Coomassie-fargete geler. Regionen i gelen som omfattet denne dublett ble skjært ut, og anvendt for proteinsekvensering ved automatisert Edman-deg radering.

Proteinsekvensering ble utført ved University of California, Davis, Protein Structure Laboratory standard protocol. Gelstykket som inneholdt dubletten ble vasket 4 ganger med 15 ml H2O ved forsiktig risting i 15 min. for å fjerne gjenværende eddiksyre og SDS fra de foregående trinn. Gelstykket ble kuttet med et barberblad til firkanter på 2 mm, og overført til et 1,5 ml mikrosentrifuge-rør. Gelstykkene ble dehydrert i en Speed-Vac i 2 timer inntil de ikke adherte til røret. Deretter ble 30 pl gel-rehydreringsbuffer (0,1 M tris-HCI, pH 9,0, 0,05% SDS) tilsatt, og pH bekreftet til 8,0 ved å avsette 0,5 pl på pH-papir. Oppkut-tingsenzymet Lys-C (0,2 pg) fra Achromobacter lyticus (Wako) ble tilsatt, sammen med ytterligere rehydreringsbuffer for å fullstendig hydrere gelstykkene, samt å ha litt ekstra buffer. Blandingen ble inkubert over natten ved 30°C. Etter inkubasjonsperioden ble supernatanten overført til et ferskt, sterilt mikrosentri-fugerør, og lagret. Tilstrekkelig vann ble tilsatt til å dekke gelstykkene, og de ble inkubert i en ytterligere 2 timer ved 30°C. Supernatanten ble fjernet og lagret i den samme mikrosentrifuge som tidligere. Vasketrinnene ble gjentatt en gang til, og supernatantene kombinert med de tidligere to vasker. Gelstykkene ble deretter dekket med en løsning omfattende 0,1% trifluoreddiksyre (TFA) i 80% acetonitril, og inkubert i 1 time ved 30°C. Supernatanten ble oppsamlet og tilsatt til røret inneholdende alle de tidligere supernatanter. Den siste vask ble gjentatt en gang til, og de samlede supernatanter ble tørket i en speed-vac.

De tørkede tryptiske oppkuttingsprodukter ble oppløst i 25 pl 6 M guanidin-HCI, 0,4 M tris (pH 8,2), og pH ble verifisert ved applisering av 0,5 pl på pH-papir. 1 pl 450 mM DTT ble tilsatt, og digestet ble inkubert i 45 min. ved 50°C. Etter kjøling til romtemperatur ble 2 pl 500 mM jodacetamid tilsatt, og inkubert i ytterligere 15 min. ved 23°C. Ved slutten av denne inkubasjon ble 72 pl vann tilsatt for å gi en final konsentrasjon på 1,5 M guanidin, og 0,1 M tris. Prøven ble deretter sentrifugert i 5 min. ved 14.000 rpm i en mikrosentrifuge, og supernatanten ble forsiktig overført til et nytt mikrosentrifugerør. Til den presipiterte pellet ble det tilsatt 25 pl 0,1% TFA, og virvlet. Røret ble deretter resentrifugert som før, og supernatanten tilsatt til det fra det tidligere trinn.

Oppkuttingsfragmentene fra den tryptiske oppkutting ble separert med kapillær høytrykksvæskekromatografi (HPLC) i en C18 1 mm x 10 cm kolonne, ved anvendelse av en lineær gradient i 90 min., fra 5% løsning A (0,1% TFA) til 70% løsning B (0,075% acetonitril) med en gjennomstrømningshastighet på 100 pl pr. minutt. UV-deteksjonen ble innstilt til 210 nm, med en skala i området fra 0 til 0,1 A. Gjenvinnelse av individuelle topper indikerte nærvær av flere forskjellige peptider som vist i fig. 3. Som en kontroll ble en andel av den opprinnelige BDS-PAGE gel som ikke inneholdt protein ført gjennom opp-kuttingsprosessen. De fylte topper som vist i fig. 3 var felles mellom denne kontroll og prøven. De 3 topper som er merket A, B og C ble underlagt automatisk Edman-degradering. To av toppene (A og B) ga overlappende unike sekvenser representerende det samme proteinfragment (fig. 2, fragmenter A og B). Den tredje topp (C) ga en forskjellig unik sekvens (fig. 2, fragment C).

F. Syntese av oligonukleotid DNA-primere for xantosin-N<7->metyltransferase.

Kjemisk syntese av 20-mer-primere for de to aminosyresekvenser oppnådd ved oppkuttingsfragmentene av xantosin-N<7->metyltransferase ble utført ved The Midland Certified Reagent Company. Regioner av de utvalgte fragmenter hadde minimal nukleinsyre-degeneritet, og hvor mulige aminosyrer som hadde utstrakt genetisk kodeoverflødighet ble unngått. Der dette ikke var mulig ble mer enn én primer syntetisert for det samme segment for å inkludere alle de mulige alternative kodon-kombinasjoner. Det ble videre også syntetisert primere slik at de var komplementære til kodetråden av DNA-sekvensene som koder for aminosyresekvensen. Tredje posisjon nukleotid-degeneresitet på tre eller flere ble unngått ved å anvende inosin i disse posisjoner. Det hvor degeneresiteten av nukleotidet var to-fold, ble begge nukleotider inkludert i primersyntesen (fig. 3).

G. Ekstrahering av RNA fra B3-trinn av unge kaffeblad.

Alle artikler som ble anvendt under ekstraheringen var sterile, og tilberedt med behandling med 0,1% DEPC-vann. Alle sentrifugetrinn ble utført ved 4°C, dersom ikke annet er oppgitt.

Unge kaffeblad i B3-trinn ble innsamlet og lagret som tidligere beskrevet. Total RNA ble isolert fra 100 g av dette unge bladvev ved oppmaling under nitrogen i væskefase, og umiddelbar overføring til en på forhånd avkjølt huskaffekvern. Vevet ble malt til pulver sammen med et lite stykke tørris. Vevet ble deretter tilsatt til 200 ml homogeniseringsbuffer tillaget av 100 mM tris-HCI (pH 9,0), 200 mM NaCI, 15 mM Na2EDTA, 0,5% sarkosyl, og ferskt tilsatt 100 mM 13-merkaptometanol. Til dette ble det tilsatt 200 ml buffer-ekvilibrert fenol, og 40 ml av en blanding av kloroform:isoamyl-alkohol (24:1, volum:volum). Vevet ble deretter homogenisert i et glasskår i et isbad i 2 min. ved høy hastighet i en homogenisator av typen Polytron. Umiddelbart etter homogenisering ble 14 ml 3 M natriumacetat (pH 4,0) tilsatt og blandet ved å operere homogenisatoren i ytterligere ett minutt. Homogenatet ble deretter lagret på is i 15 min., og deretter overført til to 250 ml polypropylen sentrifugerør. Sentrifugering ble utført i en GSA-rotor (DuPont Sorvall) ved 16.000 g i 10 min. Den vandige fase (topp-sjiktet) ble overført til et nytt 250 ml polypropylen sentrifugerør, og et tilsvarende volum av isopropanal ble tilsatt til dette.

Blandingen ble inkubert over natten ved -20°C, og deretter sentrifugert ved 10.000 g i 10 min. for å oppsamle det presipiterte RNA,

RNA-pelleten ble vasket med 70% etanol, og resentrifugert ved 10.000 g i 5 min. Etanolen ble dekantert, og pelleten tørket under vakuum i 5 min. Pelleten ble deretter resuspendert i 15 ml DEPC-behandlet vann. RNA-suspensjonen ble overført til et sterilt 40 ml skrukork-sentrifugerør, og det uløselige materiale fjernet ved sentrifugering ved 10.000 g i 5 min. Supernatanten ble overført til et nytt 40 ml skrukork-sentrifugerør, og 5 ml 8 M LiCI ble tilsatt for å gi en final konsentrasjon på 2 M LiCI. Røret ble inkubert over natten ved 4°C og RNA ble gjenvunnet ved sentrifugering ved 14.000 g i 10 min. RNA-pelleten ble deretter vasket med 70% etanol, sentrifugert ved 10.000 g i 5 min., og hurtig tørket under vakuum. Pellet ble resuspendert i 5 ml DEPC-behandlet vann, og sentrifugert ved 10.000 g i 5 min. for å fjerne uløselig materiale. Supernatanten ble overført til fire sterile 1,5 ml mikrosentrifugerør, og lagret på is. Kvantifisering av 10 pl total RNA-løsning i et spektrofotometer av typen Shimadzu UV 160U i et spektrum fra 230 til 330 nm indikerte 42,8 mg RNA. Rørene inneholdende RNA ble lagret i -70°C.

H. Rensing av poly(A<+>)mRNA fra total RNA.

Total RNA-preparatet ble anriket for poly(A<+>)RNA (mRNA) ved anvendelse av PolyATract II mRNA-isoleringssystemkitt (Promega Corporation). En 600 pl prøve av det totale RNA tilsvarende 5,1 mg ble tilsatt til et rør av det ovenfor nevnte kitt, og justert til 2,43 ml finalt volum med RNase-fritt vann. Etter varming ved 65°C i 10 min., ble 10 pl 50 pmol/ml biotinylert oligo(dT) og 60 pl 20x SSC (175,3 g/l NaCI, 88,2 g/l natriumcitrat, pH 7,0) tilsatt, og blandingen ble langsomt avkjølt til romtemperatur over en periode på ca. 30 min. En alikvot av streptavidin-paramagnetiske partikler ble vasket 3 ganger i 0,5x SSC (1,5 pl pr. vask) og resuspendert i 0,5 ml 0,5x SSC. RNA-løsningen inneholdende den biotinylerte oligo(dT) ble tilsatt til de vaskede streptavidin-paramagnetiske partikler. Etter en inkubering på 10 min. ved romtemperatur, ble de paramagnetiske partikler sammen med det opptatte mRNA samlet til en side av røret ved anvendelse av en magnet. Supernatanten ble fjernet og partiklene ble vasket fire ganger med 0,1 X SSC (1,5 ml/vask). mRNA ble gjenvunnet ved suspendering av partiklene i 1,0 ml RNase-fritt vann, og hvor vannet ble fjernet idet partiklene ble holdt på den ene side av røret. Vannet ble overført, 500 pl hver gang, til to 1,5 ml sterile mikrosentrifugerør. Etter tilsetning av 1/10 volum av 3 M natriumacetat (50 pl pr. rør), ble mRNA gjenvunnet ved presipitering med et tilsvarende volum av isopropanol (500 pl pr. rør). Rørene ble lagret ved -20°C over natten, og deretter sentrifugert ved 14.000 rpm i 30 min. ved 4°C. Pellet ble vasket med 500 pl 75% iskald etanol, og sentrifugert på nytt. Etanolen ble dekantert av, og pelleten tørket hurtig under vakuum. mRNA ble oppløst i 60 pl DEPC-behandlet nuklease-fritt sterilt vann. Kvantifisering ble utført på 15 pl av det oppløste mRNA som beskrevet for totalt RNA. Ca. 9,6 pg av mRNA ble gjenvunnet fra 5 mg totalt RNA.

I. Konstruksjon av cDNA-bibliotek.

Første og andre tråd cDNA ble syntetisert ved anvendelse av ZAP-cDNA-syntesekitt (Stratagene). 4 pg mRNA i 25 pl vann ble inkubert ved 65°C i 5 min. 3 pl 100 mM metylkvikksølv ble tilsatt og inkubert ved romtemperatur i 10 min. 4 pl 700 mM li-merkaptoetanol ble tilsatt, og inkuberingen fikk fortsette i ytterligere 5 min. Til den denaturerte mRNA ble 5 pl 10x "første tråd buffer", 5 pl 100 mM DTT, 3 pl nukleotid-blanding (10 mM hver av dATP, dGTP, TTP og 5-metyl-dCTP), 2pl av 1,4 pg/ml linker-primer, (5'GAGAGAGAGAGAGAGAG-AGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT3'), 1 pl RNase-blokk og 5 pl vann tilsatt. Reaksjonen ble inkubert ved romtemperatur i 10 min. for å kople primeren til mRNAen, og 2,5 pl 20 u/pl M-MuLV revers transkriptase ble tilsatt. 4 pl av denne reaksjonsblanding ble overført til et rør inneholdende 0,5 pl 800 Ci/mmol [a-<32>P]dCTP (DuPont NEN). Begge reaksjoner ble inkubert ved 37°C i 1 time. Den radioaktivt merkede reaksjon ble frosset ved -20°C for senere gelanalyse.

Til hovedreaksjonen på 45 pl ble 40 pl "andre trådbuffer", 15 pl 100 mM DTT, 6 pl nukleotidblanding (10 mM dATP, dGTP, TTP og 26 mM dCTP), 268,3 pl vann og 2 pl 800 Ci/mmol [a-<32>P]dCTP tilsatt. Etter blanding ble 4,5 pl 1 u/pl RNase H og 19,2 pl 5,2 u/pl E. co//' DNA-plymerase I tilsatt, og reaksjonen ble inkubert ved 16°C i 2,5 time. Reaksjonen ble ekstrahert med 400 pl fenohkloroform (1:1), og fasene ble separert ved sentrifugering. Den vandige fase ble overført til et nytt rør, og ekstrahert på nytt med kloroform. Den vandige fase ble gjenvunnet som beskrevet ovenfor. Dobbelttrådet cDNA ble gjenvunnet ved presipitering over natten ved -20°C, etter tilsetning av 33,3 pl 3 M natriumacetat og 867 pl 100% etanol. Presipitatet ble gjenvunnet ved sentrifugering i en mikrosentrifuge ved 4°C i 60 min. Presipitatet ble vasket med 1 pl 80% etanol, og gjenvunnet ved sentrifugering ved romtemperatur ved full hastighet i en mikrosentrifuge. Supernatanten ble fjernet, presipitatet ble tørket under vakuum og oppløst i 45 pl vann. 3 pl av den resuspenderte dobbelttrådete cDNA ble fjernet, og frosset ved -20°C inntil den ble analysert ved gelelektroforese.

Til de resterende 42 yl av dobbelttrådet cDNA ble 5 yl 10 x Klenow-buffer (buffer nr. 3), 2,5 yl 2,5 mM nukleotider (dCTP, dGTP, dATP og TTP), og 0,5 pl 5 u/pl Klenow-fragment tilsatt. Etter 30 min. ved 37°C ble 5 pl vann tilsatt, og reaksjonen ble ekstrahert med et tilsvarende volum av fenol:kloroform (1:1), og deretter kloroform som beskrevet ovenfor. Etter tilsettingen av 7 pl 3 M natriumacetat og 226 pl 100% etanol, ble dobbelttrådet DNA med butte ender gjenvunnet ved presipitering ved å inkubere på is i 30 min., og deretter mikrosentri-fugering med full hastighet ved 4°C i 60 min. Pelleten ble vasket med 300 pl 80% etanol, sentrifugert og tørket som før beskrevet. 7 pl 0,4 pg/pl EcoRI-linkere ble tilsatt til det tørkede cDNA. Strukturene av EcoRI-linkerne:

5' AATTCGGCACGAG 3'

- 3' GCCGTGGCTC 5'

Etter risting (vortex) for å resuspendere cDNAen, ble 1 pl 10 x ligeringsbuffer, 1 pl 10 mM ATP og 1 pl 4 Weiss u/pl T4 DNA-ligase tilsatt, og reaksjonen ble inkubert over natten ved 8°C. Ligasen ble inaktivert ved varming ved 70°C i 30 min. 5-endene av EcoRI-linkerne koplet til cDNAen ble fosforylert ved anvendelse av polynukleotidkinase. 1 pl 10x buffer nr. 3, 2 pl 10 mM ATP, 6 ml vann og 1 ml 10 u/ml T4 polynukleotidkinase ble tilsatt til ligeringsreaksjonen. Etter 30 min. ved 37°C ble kinasereaksjonen varmeinaktivert ved 70°C i 30 min.

Xhol "sticky ends" ble generert ved den ende av cDNAen som korresponderer til 3-enden av mRNAen ved oppkutting av Xhol-setet i linker-primeren (se ovenfor). 28 pl Xhol-buffer og 3 pl 40 u/ml Xhol ble tilsatt til cDNAen, og reaksjonen ble inkubert ved 37°C i 1,5 time. cDNAen med EcoRI sticky ends ved 5' enden og Xhol sticky ends ved 3-enden (i forhold til den opprinnelige mRNA) ble størrelse fraksjonert ved passering igjennom en Sepharcryl S-400 spinn-kolonne som følger. 5 pl 10x STE (100 mM tris (pH 7,0), 5 mM EDTA og 100 mM NaCI) ble tilsatt, og cDNAen ble applisert til toppen av en 1 pl sprøyte inneholdende Sephacryl S-400. Et 500 ml mikrosentrifugerør ble plassert i bunnen av sprøyten, og kolonnen ble plassert i et sentrifugerør og sentrifugert ved ca. 400 g i 2 min. 60 pl 10x STE ble tilsatt til toppen av sprøyten, et nytt mikro-sentrifugerør ble plassert på bunnen, og kolonnen ble igjen sentrifugert som nevnt ovenfor. Denne prosess ble gjentatt inntil seks fraksjoner hadde blitt oppsamlet.

Ca. 10% av hver fraksjon ble elektroforisert på en 1 % agarosegel for å bestemme størrelsesfordelingen av cDNAen i hver fraksjon. Det resterende av hver fraksjon ble ekstrahert med et tilsvarende volum av fenohkloroform, og deretter kloroform som beskrevet ovenfor, og deretter presipitert med tilsetning av 2 volum 100% etanol. Etter inkubering ved -20°C over natten ble cDNA gjenvunnet med sentrifugering ved 14.000 rpm ved 4°C i 60 min. i en mikrosentrifuge. cDNAen ble vasket med 200 yl 80% etanol som beskrevet ovenfor, og tørket. cDNAen ble oppløst i 5 pl vann, og 5 pl ble overført for å bestemme cDNA-konsentrasjonen ved fluorografi ved anvendelse av et fluorometer av typen HoeferTKO 100 DNA. Det resterende 4,5 ml av fraksjon 1, inneholdende de største cDNA-molekyler, inneholdt ca. 304 ng cDNA.

100 ng cDNA fra fraksjon 1 ble ligert inn i 1 pg Uni-Zap, en bakteriofag lambda ZAP-vektor som var oppkuttet med EcoRI og Xhol (Stratagne). Fraksjon 1 cDNA (2,9 M1) ble tilsatt til 0,54 pl 10x ligeringsbuffer, 0,5 pl 10 mM ATP, 1 pl 1 pg/pl Uni-Zap XR-vektor og 0,5 pl 4 Weiss u/pl T4 DNA ligase. Reaksjonen ble inkubert ved 8°C i ca. 44 timer. 1 pl alikvot av ligeringsreaksjonen ble tilsatt til en alikvot av "fryse-tine"-ekstraktet fra Gigapack II Gold packaging kitt (Stratagene). 15 pl av sonisk ekstrakt ble tilsatt, og innholdet ble forsiktig blandet. "Packaging" ble utført ved romtemperatur. Etter 2 timer ble 500 pl SM-buffer (0,01 M tris-HCL pH 7,0, 0,01 M MgCI2 og 0,1 mM Na2EDTA) og 20 pl kloroform tilsatt til packaging-reaksjonen, debris ble fjernet ved en hurtig sentrifugering i en mikrosentrifuge, og de pakkede fag ble lagret ved 4°C inntil anvendelse.

J. Titrering av primærbibliotek.

1 pl 500 pl primærbibliotek ble blandet med 9 pl SM-buffertil en 1/10-fortynning. 1 pl av denne fortynning ble anvendt for å infisere 200 pl E. coli XL1-Blue MRF-celler som hadde vokst til en tetthet tilsvarende en O.D.gøo=0,5. Cellene ble inkubert ved 37°C i 15 min. under forsiktig risting. De infiserte celler ble

deretter blandet med 2,5 ml 48°C topp-agar inneholdende 15 pl 0,5 M IPTG, og 50 pl 250 mg/ml X-gal, og utsådd på 100 x 15 mm NZY-plater (5 g/l NaCI, 2 g/l MgS04.7H20, 5 g/l gjærekstrakt, 10 g/l NZ-amin [pH 7,5], og 15 g/l Difco agar). Platene ble inkubert over natten ved 37°C. Bakgrunsplakk var blå, mens de

rekombinante plakk var hvite. Et gjennomsnitt over tre slike plater indikerte at 1 pl primærbibliotek produserte 1.930 hvite rekombinante plakk, og 65 blå plakk.

Det totale 500 pl primærbibliotek ble beregnet til å representere 965.000 rekombinante plakk.

K. Mangfoldiggjøring av primærbibliotek.

Til 20 sterile rør ble 300 pl E. coli XL1-Blue MRF'-celler som hadde vokst til en O.D.gøo=0,5 tilsatt. Til hvert rør ble 12,5 pl av primærbibliotek-forråd, og 90 pl SM-buffer tilsatt, og rørene ble inkubert ved 37°C i 15 min. 2,5 ml 48°C topp-agar ble tilsatt til hvert rør, og cellene ble utsådd på 100 x 15 mm NZY-plater. Platene ble inkubert over natten ved 37°C. 5 ml SM-buffer ble tilsatt til hver plate, og platene ble inkubert for en ytterligere 8 timers periode ved 4°C. SM-buffer ble oppsamlet med en steril pipette, og lagret i et sterilt 250 ml sentri-fugerør. Hver plate ble vasket med ca. 4 ml fersk SM-buffer som ble tilsatt til det tidligere innsamlede materiale. Kloroform, til et finalt volum på 5%, ble tilsatt til det mangfoldiggjorte bibliotek. Biblioteket ble deretter inkubert ved romtemperatur i 15 min., og deretter sentrifugert ved 2.000 x g i 10 min. for å fjerne celle-debris. Supernatanten (114,5 ml) ble gjenvunnet og deretter overført til en sterill polypropylenflaske. Kloroform ble tilsatt til et finalt volum på 0.3%, og det mangfoldiggjorte bibliotek ble lagret ved 4°C.

L. Titrering av mangfoldiggjort bibliotek.

1 pl av en 10"^-fortynning av det mangfoldiggjorte bibliotek i SM-buffer inneholdt 192 rekombinante plakk ved utsåing som beskrevet ovenfor. For å oppnå 50.000 rekombinante plakk ble 25 pl av en 10~<7->fortynning anvendt for å infisere 600 pl av E. coli EL1-Blue MRF-celler som hadde vokst til en ODgøo=0,5, som deretter ble inkubert ved 37°C i 15 min. Til disse celler ble 6,5 ml av 48°C topp-agar tilsatt, og biblioteket ble utsådd på 150x15 mm NZY-plater. Fire slike plater representerende 200.000 rekombinante plakk, ble fremstilt og inkubert ved 37°C over natten. Platene ble deretter avkjølt i 4 timer ved 4°C, og deretter anvendt for DNA-screening av biblioteket. M. Polymerase kjedereaksjon (PCR) mangfoldiggjøring av xantosin-N<7->metyltransferase cDNA.

Syntesen av første tråd cDNA ble utført som beskrevet i Stratagene-protokoll, angitt ovenfor. De to unike peptidsekvensene oppnådd ved tryptisk oppkutting muliggjorde syntese av de degenererte primere avbildet i fig. 4. En polymerase kjedereaksjon (PCR) (Saki, R.K., Gelfand, D.H., Stoffel, S., Scharf, S.J., Higuchi, R.,Horn, G.T., Mullis, K.B. and Erlich, HA, Science 239:487 (1988) mellom par av disse primere (1-6, 2-6, 3-5 eller 4-5) ved anvendelse av 4 ng cDNA, 1 pl 20 pM primere, 0,5 pl av hver av 1 mM deoksyribonukleotidtrifosfat, 1,5 mM MgCI2, 0,3 pl Taq DNA-polymerase [5.000 u/ml], 2,5 pl 10x PCR-buffer [10 mM tris-HCI (pH9,0), 0,1% Triton X. 100] og sterilt H20 til et finalt volum på 25 pl ble utført. PCR-betingelsene var 94°C i 4 min [1 syklus]; 94°C i 1 min., 43°C i 1 min., 72°C i 1 min. [35 sykluser]; 72°C i 5 min. [1 syklus]. Reaksjonene ble utført i 500 pl sterile mikrosentrifugerør ved anvendelse av Perkin Eimer DNA thermal cycler 480. Kun primer-kombinasjonen 1 og 6 resulterte i et enkelt produkt ved en koplingstemperatur på 43°C. Produktet ble målt ved agarose gelelektroforese ved anvendelse av SeaPlaque agarose (FMC) til å være ca. 750 base par. En kommersielt tilgjengelig 100 bp ladder ble anvendt som en størrelsesmarkør (Promega Corporation). M. Kloning av koffein-spesifikt xantosin-N<7->metyl-transferase PCR-genprodukt.

Til det 750 bp fragment oppnådd ved anvendelse av primere 1 og 6 (fig. 4) i en 50 pl PCR-reaksjon ble 50 pl kloroform, og 100 pl sterilt vann tilsatt. Blandingen ble omrørt og deretter sentrifugert i en mikrosentrifuge ved 14.000 rpm i 2 min. Det øvre vandige sjikt inneholdende DNA ble fjernet og overført til et sterilt rør. Etidium-bromid-platekvantifisering indikerte nærvær av ca. 5 ng av PCR-mangfoldiggjort DNA/pl. PCR-produktet ble deretter ligert inn i TA kloningskitt PCR II vektor (Invitrogen Corporation) i en 10 pl ligeringsreaksjon inneholdende 1 pl 10 x ligeringsbuffer, 2 pl PCR II vektor (25 ng/pl), 3 pl ferskt PCR-produkt (5 ng/pl), 1 pl T4 DNA-ligase, og 3 pl sterilt vann. Ligeringsreaksjonen ble inkubert ved 14°C over natten. Ligeringsreaksjonene ble sentrifugert ved 14.000 rpm i 2 min. og plassert på is. Til en fersk opptint flaske E. coli XL1-Blue kompetente celler ble 2 pl 0,5 M å-merkaptoetanol tilsatt og blandet forsiktig med pipettespissen. 2 pl av ligeringsreaksjonen ble pipettert til cellene, og de ble forsiktig omrørt med pipettespissen. Flaskene ble deretter inkubert på is i 30 min., og gitt et temperatursjokk på eksakt 30 sek. i en 42°C varmeblokk. Flaskene ble plassert på is. Etter 2 min. ble 450 pl sterilt SOC-medium (20 g/l trypton, 5 g/l gjærekstrakt, 0,5 g/l NaCI, 10 ml/l 250 mM KCI, 10 ml/l MgCI2, 20 ml/l 1 M glukose, [pH 7,0] tilsatt. Flaskene ble deretter ristet ved 225 rpm i en rotasjonsrister i 1 time, og deretter plassert på is.

De transformerte celler ble utsådd ved pipettering av 50 yl og/eller 200 pl av cellesuspensjonen til en av to LB-plater (10 g/l trypton, 5 g/l gjærekstrakt, 10 g/l NaCI, 15 g/l Difco-agar, pH7,5) inneholdende 50 pg/ml ampicillin og 40 pg/ml X-Gal. Platene ble inkubert ved 37°C i 20 timer, og deretter overført til 4°C i 3 timer for å muliggjøre utvikling av farge. Seks hvite transformantkolonier ble analysert for nærvær og orientering av PCR-fragmentet.

N. Koking av plasmid mini-prep.

Hver av de transformerte kolonier fikk vokse i 5 ml sterilt "terrific broth" (12 g/l trypton, 24 g/l gjærekstrakt, 4 ml/l glyserol, 100 ml/l 10 x TB-fosfat [0,17 M KH2P04, 0,72 M K2HPO4]) tilsatt 50 pg/ml ampicillin. Rørene ble inkubert over natten i en rotasjonsrister ved 37°C. 3 ml av hver koloni ble overført til et 1,5 ml mikrosentrifugerør, 1 ml om gangen, og cellene ble konsentrert ved sentrifugering ved 14.000 rpm i 2 min. Supernatanten ble kastet hver gang, og cellepelleten ble oppbevart så tørr som mulig. Cellene ble vasket en gang med 1 ml sterilt H20, og sentrifugert som angitt ovenfor. Supernatanten ble kastet og cellepelleten resuspendert i 320 pl STET-buffer (8% sukrose, 0,5% Triton X-100, 50 mM EDTA, 10 mM tris-HCI, pH 8,0). Til disse celler ble 32 pl 10 mg/ml lysozym i TE-buffer (10 ml/l 1 M tris-HCI pH 8,0, 2 ml/l 0,5 M EDTA pH 8,0) tilsatt og blandet ved å snu rørende flere ganger. Rørene ble plassert i et kokende vannbad i 5 min., og deretter plassert umiddelbart på is. Straks de var avkjølt ble de sentrifugert i 30 min. ved 14.000 rpm ved 4°C. Pelleten ble fjernet fra hvert rør med en steril tannpirker. Supernatanten fikk tilsatt 170 pl 7,5 M NH4OAC og 550 pl iskald isopropanol, og DNA ble presipitert over natten ved -20°C. Rørende ble sentrifugert ved 14.000 rpm ved 4°C i 30 min., og pelleten vasket med 75% etanol, og tørket i 1 min. i en speed-vac. DNA ble resuspendert i 50 pl sterilt H2O inneholdende 1 pl 5 mg/ml RNase A.

O. Restriksjonsoppkutting for å fjerne innskudd fra pCR II plasmid.

En reaksjonsblanding på 25 pl ble fremstilt ved tilsetning av 15 pl av plasmid mini-prep DNA som oppnådd ovenfor, 2,5 pl buffer H (90 mM tris-HCI [pH 7,5], 10 mM MgCI2, 50 mM NaCI), 1 pl EcoRI (8-12 u/pl) og 6,5 pl sterilt H20. Blandingen ble inkubert i et ristende vannbad ved 37°C i 1 time, og deretter kokt i et vannbad i 1 min. Rørende ble sentrifugert ved 14.000 rpm i 15 sek., og fikk deretter kjøles ned til romtemperatur. Til 10 pl av hver blanding ble 2 pl lastefargestoff tilsatt, og oppkuttingsproduktene ble analysert ved 1,5% agarose-gelelektroforese ved anvendelse av ultraren agarose (GibcoBRL) og en 100 bp "ladder" som en størrelsesmarkør (Promega Corporation).

Kun én av de seks reaksjoner indikerte nærvær av et oppkuttingsinnskudd på avrundet 750 bp. Den opprinnelige bakteriekoloni korresponderende til plasmidet med 750 bp xantosin-N<7>~metyltransferase PCR-produkt ble inokulert i en 250 ml Erlenmayerflaske inneholdende 50 ml sterilt LB-medium (10 g/l trypton, 5 g/l gjærekstrakt, 10 g/l NaCI, pH 7,5) tilsatt 50 pg/ml ampicillin. Flasken ble inkubert i en rotasjonsrister ved 30°C over natten. I et 1,5 ml mikro-sentrifugerør ble 18 ml av det resulterende cellemedium konsentrert ved sentrifugering som ovenfor.

Plasmid-DNA ble renset ved anvendelse av QIAGEN-plasmid minikitt fremgangsmåte (Qiagen Inc.). Den vaskede bakterielle pellet ble resuspendert i 0,3 ml buffer P1 som inneholder det tilsatte RNase. Til dette ble det tilsatt 0,3 ml alkalisk lyseringsbuffer P2, blandet forsiktig ved å snu på røret, og inkubert i ikke mer enn 5 min. ved romtemperatur. Deretter ble 0,3 ml av avkjølt buffer P3 tilsatt, og blandet ved å snu rørende seks ganger. Etter 10 min. på is ble ekstraktet sentrifugert ved 14.000 rpm i 15 min. i en mikrosentrifuge. Supernatanten ble fjernet og applisert til en QIAGEN-spiss 20 som tidligere var ekvilibrert ved applisering av 1 ml QBT-buffer ved tyngdekraftstrøm. Den påførte celle-ekstraktsupernatant fikk også entre harpiksen av kolonnen ved tyngdekraftstrøm. Straks strømmen gjennom kolonnen hadde stoppet, ble QIAGEN-spiss 20 vasket fire ganger med 1 ml buffer QC. DNA ble eluert med vasking med QIAGEN-spiss 20 med 0,8 ml buffer QF, og presipitert ved tilsetning av 0,7 volumer (560 pl) isopropanol av romtemperatur. Røret ble umiddelbart sentrifugert ved 14.000 rpm i 30 min., og supernatanten ble forsiktig fjernet. Det presipiterte DNA ble vasket med 1 ml iskald 70% etanol, sentrifugert som ovenfor, og lufttørket i 5 min. DNA ble resuspendert i 100 pl sterilt H20. UV-spektrofotometri, som beskrevet ovenfor, på 1 pl av DNA-resuspensjon indikerte at der var 55 pg renset rekombinant pCRII plasmid-DNA pr. 100 pl.

Automatisert DNA-sekvensering av innskuddet i pCRII-plasmidet fra dets 5'-ende ble utført ved å anvende M13-revers-primer som binder til referanse i pCRII like tilgrensende til det sted hvor PCR-produktet ble innsatt. Sekvensering ble utført med utstyr på University of Hawaii Biotechnology. Sekvenseringsreaksjonen inneholdt 1 pg plasmidtemplat og 3,2 pmol M13-primer. Sekvensen som ble oppnådd indikerte at PCR-produktet kodet for DNA-sekvensen av de første 6 aminosyrer av peptidfragmenter A og B (fig. 4) fra hvilken sekvens de degenererte DNA-primere 1 og 2 (fig. 4) ble fremstilt. I tillegg kodet sekvensen også for de følgende 7 aminosyrer av peptidfragmentet, hvilken DNA-sekvens ikke ble anvendt ved konstruksjon av primer. Dvs., DNA-sekvensen for det korrekte protein ble klonet.

P. Fremstilling av vilkårlig primerprobe for cDNA-screening ved anvendelse av PCR-produktet.

To 25 pl restriksjonsoppkuttinger med EcpRI ble utført på to 17,5 pl alikvoter av renset pCRII plasmid som beskrevet ovenfor. Produktene ble separert på en I % agarose gel som forklart ovenfor, og det 750 bp innskudd ble utskjært aseptisk fra to spor på gelen. Gelstykkene som har en masse på 0,65 g ble overført til et sterilt 40 ml polypropylenrør og underlagt rensing med Geneclean II kitt (BIO 101, Inc.) Fire og en halv volumer av Nal (2,93 ml) for-rådsløsning ble tilsatt til genstykkene. En halvdel av volumet av gel-TBE-modifiserer (325 pl) ble tilsatt, og røret inkubert ved 45°C i 5 min. Til dette ble 15 pl glassmelk-suspensjon tilsatt og inkubert for ytterligere 5 min. Glassmelk/DNA-komplekset ble pelletert ved sentrifugering i 10 sek. ved 1.000 rpm, og supernatanten ble fjernet. Glassmelk-pelleten ble vasket tre ganger med 1 ml "New Wash"-løsning, og DNA ble eluert med 50 pl sterilt H2O. Etidiumbromid-plater indikerte at DNA-konsentrasjonen var 10 ng/pl.

En vilkårlig primet probe ble syntetisert fra 30 ng (3 pl) av det rensede DNA. 3 pl av DNAen ble tilsatt til 25 pl sterilt vann, og DNAen ble denaturert ved opp-varming i et kokende vannbad. Til dette ble Promega Corporation Prime-a-Gen-kitt-bestanddeler (10 pl 5x merkebuffer, 2 pl ikke-merket dNRP'er [20 pM hver dCTP, dGTP, TTP], 2pl 1 mg/ml acetylert BSA, 1 pl 5u/ml Klenow-enzym) og 5 pl [a-<32>P]dATP (50 pCi, 3.000 Ci/mmol; DuPont NEN) tilsatt til et finalt volum på 50 pl, og dette fikk inkubere ved romtemperatur i 1 time. Reaksjonen ble avsluttet ved tilsetning av 2 pl 0,5 M Na2EDTA (20 mM final konsentrasjon) og oppvarmet i 2 min. i et kokende vannbad.

Q. Screening av mangfoldiggjort bibliotek med vilkårlig primet probe.

De fire 150x15 mm NZY-plater som hadde omtrent 50.000 rekombinante kloner pr. plate ble avkjølt til 4°C (se ovenfor for utsåing og vekstbetingelser), og de rekombinante plakk ble overført ved først å neddykke 132 mm Magna nylon overføringsmembraner (MSI Corporation) på kromatografipapir mettet 5x SSC-buffer i 10 sek. Membranene ble plassert på platene inneholdende de rekombinante plakk i 5 min., og deretter løftet og plassert, med den fag-inneholdende side opp, i 2 min. på kromatografipapir mettet med 0,5 M NaOH og 1,5 M NaCI. Membranene ble nøytralisert ved overføring til kromatografipapir mettet med 0,5 M tri-HCI(pH 8,0) og 1,5 M NaCI i 5 min. De ble deretter plassert i 20 sek. på kromatografipapir mettet med 2x SCC-buffer og 0,2 M tris-HCL (pH 7,5), og deretter blottet i tørr tilstand. Etter 1 time med lufttørking, ble DNA som var kryssbundet til membranene eksponert til 12.000 pJoule UV ved anvendelse av UV Stratalinker 1800 (Stratagene Corporation). De fire mem-braner ble prehybridisert ved 665°C i 2 timer i 100 ml 6x SSPE (52,2 g/l NaCI, 8,3 g/l NaH2P04.H20, 2,2 g/l Na2EDTA, [pH 7,4]), 5x Denhardfs løsning (1 g/l Ficoll, 1 g/l polyvinylpyrrolidon, 1 g/l BSA [pentax fraksjon V]), 0,5% SDS og 100 pg/ml denaturert sildesperm-DNA i en hybridiseringsovn av typen Hybrid Mark II.

Hybridisering ble uført ved 65°C i 12 timer i 10 ml 6x SSPE, 0,5% SDS, 100 pg/ml pulverformet/denaturert sildesperm-DNA, og 52 pl 15 X 10^ dpms/ml av den vilkårlig primete probe som beskrevet ovenfor. Ved slutten av hybridi-seringsperioden ble proben fjernet, og membranen hurtig vasket i 30 sek. med 100 ml av 2x SSC av 65°C inneholdende 0,5% SDS. Membranene ble deretter vasket i ytterligere 30 min. med den samme mengde og konsentrasjon av fersk buffer. Membranene ble underlagt ytterligere to 100 ml vasker i 30 min. ved 65°C, 0,2x SSC, 0,5% SDS, og deretter pakket inn i et cellufanomslag og eksponert til pre-flashet Fuji RXqqj X-ray film ved -70°C i 24 timer. Femten positive kloner ble observert. Disse plakk ble plukket og plassert i 1 ml SM-buffer inneholdende 20 pl kloroform (fagforråd). Av disse ble 11 bearbeidet til sekundær eller tertiær screening inntil enkle individuelle plakk ble oppnådd.

R. Karakterisering av xantosin-N<7->metyltransferase cDNA-kloner.

Størrelsen av de putative xantosin-N<7->metyltransferase cDNA-kloner ble bestemt med polymerase kjedereaksjon ved anvendelse av primere som er homologe til T3- og 17- promoterer og som foreligger i kloningsvektoren og som flankerer cDNA-innskuddssetet. Betingelser for polymerase kjedereaksjon var som beskrevet ovenfor med unntak av at syklusen var 35 sykluser av 95°C i 1 min., 50°C i 1 min. og 72°C i 2 min. Analyse ble utført med agarose gel-elektroforese som tidligere. De tre største kloner som ble oppnådd ble underlagt in vivo eksisjon ved blanding i et sterilt rør 200 yl av den ene plakk-fag-løsning med 200 yl av ferskt XL1-Blue MRF-celler som hadde vokst til O.D.goo=1.0. Til denne blanding ble 1 yl ExAssist (Stratagene Corporation) hjelpefag (>1x10<®> pfu/yl) tilsatt, og rørende ble inkubert ved 37°C i 15 min. 3 ml steril LB-løsning ble tilsatt og inkuberingen fikk fortsette i 3 timer ved 37°C med risting. Kulturene ble oppvarmet i et 70°C vannbad i 20 min., og deretter ble rørende sentrifugert ved 1.000 g i 15 min. 1 ml av supernatanten inneholdende det eksiserte pBluesript fagmid pakket som en filamentøs fagpartikkel ble overført til et sterilt 1,5 ml mikrosentrifugerør og lagret ved 4°C som forrådsløsning. 25 yl av forrådsløsningen ble tilsatt til 200 yl E. col; Solar-celler som hadde vokst til O.D.ggo=1 i et mikrosentrifugerør. Etter inkubering ved 37°C i 15 min. ble 200 yl celler utsådd på 100x15 mm NZY-agarplater, inneholdende 50 yg/ml ampicillin. Platene ble inkubert over natten ved 37°C til fremkomst av kolonier. En enkel koloni ble inokulert i 10 ml steril LB-løsning inneholdende 50 yg/ml ampicillin, og fikk vokse over natten ved 37°C med risting. 10 ml av cellekulturen ble konsentrert i et 1,5 ml sterilt mikrosentrifuge-rør, og de pelleterte celler ble underlagt QIAGEN-plasmidrensing som beskrevet ovenfor. Det rensede plasmid-DNA ble resuspendert i 50 yl sterilt H20. DNA automatisert sekvenseringsreaksjon ble utført ved å blande 8 yl av denne DNA-prøve (0,8 yg) med 4 yl av enten T3- eller T7-sekvenserings-primere 0,8 pmol/yl). Det resterende av prosessen var som beskrevet ovenfor. Hver sekvenseringsreaksjon ga ca. 350 baser av sekvensen. Sekvensen er vist i fig. 5. Aminosyresekvensen for xantosin-N<7->metyltransferase som predikert fra basesekvensen av cDNA er vist i fig. 6.

De ovenfor angitte eksempler er ment å være illustrerende, og skal ikke ansees som begrensende for rammen av oppfinnelsen, som er angitt i de medfølgende krav.

Claims (8)

1. Hovedsakelig ren xantosin-N<7->metyltransferase som bruker S-adenosylmetionin som substrat, karakterisert ved tryptiske fragmenter A, B eller C i samsvar med den følgende formel:

2. Transferase i samsvar med krav 1, karakterisert ved at den hovedsakelig består av aminsyresekvensen ifølge figur 6.

3. Genetisk endret kaffeplante, karakterisert ved at endringen er basert på transformering med en DNA-sekvens som undertrykker syntese av xantosin-<7>N-metyltransferase ifølge krav 1 eller 2.

4. Genetisk endret kaffeplantefrukt eller bønne avledet fra en plante i samsvar med krav 3, karakterisert ved at nevnte inneholder et DNA-molekyl som undertrykker syntese av xantonsin-<7>N-metyltransferase i samsvar med krav 1 eller 2.

5. Genetisk endret kaffeplante, kaffeplantefrukt eller kaffeplantebønne, karakterisert ved at nevnte inneholder et DNA-molekyl som koder for transkripsjon av mRNA som er antisense til mRNA som koder for uttrykking av xantonsin-N<7->metyltransferase i samsvar med krav 1 eller 2.

6. En hovedsakelig ren DNA-sekvens som koder for uttrykking av xantonsin-N<7->metyltransferase, karakterisert ved at den er valgt fra gruppen som består av a) en sekvens i samsvar med figur 5; b) DNA-sekvenser som hybridiserer med sekvensen i samsvar med figur 5, hvor nevnte hybridiserende sekvens hovedsakelig består av sekvenser som er komplementære med sekvensen i samsvar med figur 5; og c) DNA-sekvenser som er degenerative i forhold til sekvensen i samsvar med figur 5.

7. DNA i samsvar med krav 6, karakterisert ved at det er et kloningsvehikkel.

8. Fremgangsmåte for produksjon av koffeinfrie kaffebønner, karakter i s e r t ved at fremgangsmåten omfatter: c) transformering av kaffeplanter med en DNA-sekvens som er enten antisense til en andre DNA-sekvens, eller som koder ved transkripsjon for et mRNA som er antisense til den andre DNA-sekvensen, hvori nevnte andre DNA sekvens er enten DNA-sekvensen i samsvar med figur 5, eller en DNA-sekvens som koder for uttrykking av en proteinsekvens i samsvar med figur 6; og valgfritt d) innhøsting av frukten fra de transformerte kaffeplantene.