NO20121283A1

NO20121283A1 - Fôrsammensetning for fisk

Info

Publication number: NO20121283A1
Application number: NO20121283A
Authority: NO
Inventors: José Luis González Vecino; Simon Wadsworth
Original assignee: Ewos Innovation As
Priority date: 2012-11-01
Filing date: 2012-11-01
Publication date: 2014-05-02
Also published as: WO2014070020A1; CL2015001104A1; CA2889712A1; CA2889712C; NO347765B1; EP2914124A1; EP2914124B1

Abstract

Det beskrives en sammensetning for fisk omfattende konvensjonelle foringredienser så som proteiner, lipider, vitaminer, karbohydrater og mineraler, og anvendelse av forsammensetningen, og likeledes en fremgangsmåte for å fore fisk som er mottagelige for kardiomyopati syndrom (CMS), Hepatisk stenose assosiert med CMS og/eller sykdommer forårsaket av Piscine Myocarditis Virus (PMCV).

Description

Tittel: Forsammensetning.

Område for oppfinnelsen.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en forsammensetning for fisk omfattende konvensjonelle foringredienser så som proteiner, lipider, vitaminer, karbohydrater og mineraler, samt anvendelse av forsammensetningen, og likeledes en fremgangsmåte for å fore en fisk som er mottakelig for kardiomyopatisyndrom (CMS), hepatisk stenose assosiert med CMS og/eller sykdommer forårsaket av Piscine myocarditis virus (PMCV).

Bakgrunn for oppfinnelsen.

Kardiomyopati syndrom (CMS) er en alvorlig hjertesykdom i atlantisk oppdrettslaks ( Salmo salar) nylig assosiert med dobbelttrådet RNA-virus benevnt Piscine Myocarditis virus (PMCV). Sykdommen ble først beskrevet og diagnostisert i Norge i 1985, og har siden også blitt diagnostisert i Skottland, Færøyene, muligens også Canada. Årlige økonomiske tap på grunn av CMS er store, og denne sykdom har påvirket 75 til 85 % av norske lakseoppdrettsanlegg hvert år i løpet av de siste ti år.

Histopatologisk er CMSkarakterisertmed alvorlig inflammasjon og nekrose i det bløte myokardium i atrium og ventrikkel, men lever kan også påvirkes på grunn av sirkulasjonsforstyrrelse assosiert med hjerteskader. Tidlige faser i sykdommen har blitt rapportert i voksne Atlantiske laks rundt 14 til 18 måneder etter overføring til sjøvann. Mortalitet er vanligvis moderat selv om dette er en kronisk sykdom som utvikler seg over en periode på flere måneder så kan kumulativ mortalitet være relevant.

Kliniske tegn på CMS eller infeksjon med PMCV er typisk alvorlig inflammasjon og degenerering av den bløte del av myokardium (ventrikkel) og med tilsvarende forandringer i atrium. Degenerering av myocytt og inflammatoriske forandringer sees ikke hyppig i det kompakte sjikt i hjertet og foregår alltid senere enn forandringer i de bløte deler. Sirkulasjonsforstyrrelser med multifokal leversteatosis og nekrose kan også forekomme.

For tiden, grunnet mangel på kommersielle vaksiner for CMS, er anvendelse av alternative terapier viktige, og det er et formål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe alternative løsninger for å hindre og/eller behandle CMS og sykdommer forårsaket av PMCV.

Videre, det er et formål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe fdrsammen-setninger som kan lindre, inhibere eller behandle CMS og sykdommer forårsaket av

PMCV.

Slike forsammensetninger er normalt benevnt funksjonelle for, og er definert som høykvalitets for som, i tillegg til deres ernæringsmessige sammensetning, formuleres med helsefremmende egenskaper som kan være nyttige i å støtte sykdomsresistens og lindring av kliniske sykdomssymptomer. Således vil den kliniske ernæring mulig-gjøre et skift bort fra kjemoterapeutiske midler og antibiotiske behandlinger, og senke kostnadene for sykdomsbehandling og administrering.

Uten å være bundet av teori så er det antatt at en forbedret fettsyreprofil, det vil si et øket nivå av n-3 fettsyrer i nøkkelvev så som hjerte kan hindre og/eller behandle CMS og sykdommer forårsaket av PMCV.

Videre, vi antar at redusert fordøybar energi og øket mengde fordøybare proteiner vil forsterke effektene som gis av en forbedret fettsyreprofil.

Sammendrag av oppfinnelsen.

Et første aspekt av foreliggende oppfinnelse vedrører en forsammensetning for fisk for å hindre og/eller behandle kardiomyopati syndrom (CMS), lever steatose eller sykdommer forårsaket av piscine myocarditis virus (PMCV) omfattende konvensjonelle foringredienser så som proteiner, lipider, vitaminer, karbohydrater og mineraler, kjennetegnet ved at mindre enn 20 % av de totale fettsyrer er n-3-fettsyrer.

I en foretrukket utførelse er mer enn 25 % av de totale fettsyrer n-3- fettsyrer, og fortrinnsvis mer enn 27 % av de totale fettsyrer er n-3- fettsyrer.

I en foretrukket utførelse er innholdet av eikosapentaenoisk syre 20:5 n-3 (EPA) mer enn ca. 7 % av de totale fettsyrer.

I en foretrukket utførelse er innholdet av eikosapentaenoisk syre 20:5 n-3 (EPA) mer enn ca. 8 % av de totale fettsyrer, mer fortrinnsvis mer enn 9 %, mer fortrinnsvis mer enn 10 %, mer foretrukket mer enn 11 %, mer foretrukket mer enn 12 % og mest foretrukket mer enn 13 %.

I en foretrukket utførelse utgjør proteiner mer enn 50 % (basert på vekt) og lipider mindre enn 20 % (basert på vekt), fortrinnsvis ca. 18 % avfdrsammensetningen.

I en foretrukket utførelse er protein:lipid-forholdet (vekt/vekt) i foret høyere enn 2, fortrinnsvis høyere enn 2,7, mer foretrukket minst 2,8, og mer foretrukket minst 2,9.

I en foretrukket utførelse er innholdet av n-6 fettsyrer mindre enn 8 % av de totale fettsyrer, fortrinnsvis i området 6- 8 %, mer foretrukket ca. 7 %.

I en foretrukket utførelse er en porsjon av nevnte lipider Søramerikansk fiskeolje.

I en foretrukket utførelse omfatter sammensetningen hydrolyserte fosfolipider.

I en foretrukket utførelse omfatter sammensetningen krillmel.

I en foretrukket utførelse er sammensetning i hovedsak som angitt for CMS eller CMS2 i tabell 1 eller 2.

Et andre aspekt av foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av forsammensetningen i samsvar med enhver av de ovenfor angitte egenskaper, det vil si for egenskapene angitt i kravene 1-11 for å fremstille en farmasøytisk sammensetning og/eller en ernæringsmessig sammensetning og/eller funksjonelt for for hindring og/eller behandling av kardiomyopati syndrom (CMS) eller sykdommer forårsaket av piscine myocarditis virus (PMCV).

I en foretrukket utførelse er fisken en laksefisk, flatfisk eller enhver annen fiskeart egnet for akvakultur, fortrinnsvis artene Atlantisk laks ( Salmo salar).

I en foretrukket utførelse fores sammensetningen til en fisk som er mottakelig for kardiomyopati syndrom (CMS) eller sykdommer forårsaket av piscine myocarditis virus (PMCV) i en periode før utfordringen av en infeksjon, under infeksjonen eller etter at fisken har blitt infisert.

I en foretrukket utførelse fores sammensetningen i en periode på minst 8 uker før infeksjon, mer foretrukket 10 til 16 uker, mest foretrukket 16 til 20 uker og 8 til 20 uker etter infeksjon.

En foretrukket utførelse av foreliggende oppfinnelse vedrører en forsammensetning eller et foringsregime for en fisk som tilveiebringer;

- redusert fordøybar energi,

- øket fordøybart protein

- forbedret fettsyreprofil (fortrinnsvis EPA, DHA). Disse fettsyrer blir funksjonelle idet de er i polar form og foreligger i cellemembranene i nøkkelvev så som hjertet.

- økete fosfolipider, reduserte triglyseridformer

- inkludering av funksjonelle ingredienser så som nukleotider.

Det skal anerkjennes at trekkene ifølge foreliggende oppfinnelse beskrevet ovenfor kan kombineres med enhver kombinasjon uten å avvike fra rammen av oppfinnelsen.

Beskrivelse av figurene.

Utførelsene av oppfinnelsen vil videre bli beskrevet, ved hjelp av eksempler med referanse til de følgende diagrammer, hvor: Figur 1 viser forholdene mellom lipidklasser i total lipid av hjertevev fra fisk foret referanse (REF) og funksjonelle (CMS1 og CMS2) for ved forskjellige tider før (PreCh) og etter (6, 8, 10, 12 og 14 uker) infeksjon med PMCV. PC, fosfatidylcholin; PE, fosfatidyletanolamin; Pl, fosfatidylinositol, PS, fosfatidylserin; TAG, triacyl-glyserol. Figur 2 viser fettsyresammensetningene (prosentandel av totale fettsyrer) av totale fosfolipider i hjertevev fra fisk foret referanse (REF) og funksjonelle (CMS1 og CMS2) for ved forskjellige tider før (PreCh) og etter (6, 8, 10, 12 og 14 uker) infeksjon med PMCV. ARA, arakidonsyre; DHA, dokosaheksaenoisk syre (DHA); EPA, eikosapentaenoisk syre; PUFA, polyumettet fettsyre. Figur 3 viser midlete histoscore (± SEM) av atrium og ventrikkel i forskjellige diett-behandlingsgrupper ved 6-, 8-, 10-, 12- og 14- uker etter utfordring. Figur 4 viser statistiske analyser av atrium og ventrikulum histoscore. Estimerte effekter av CMS1- og CMS2-dietter sammenlignet med rest-diett og prøvetakings-uker. Negative estimatgjennomsnitt angir lavere score, og positive eller høyere score enn for rest-diettgruppen. Error bars angir tilnærmet 95 % konfidens grenser. Figur 5 viser statistiske analyser for lever histoscore. Estimert effekt av SMS1- og SMS2-dietter sammenlignet med rest-dietten med prøvetakingsuker. Negative estimater angir at der er lavere score og positive at der er høyere score enn for rest-diettgruppen. Error bars angir tilnærmet 95 % konfidens grenser.

Beskrivelse av utførelser ifølge oppfinnelsen.

Eksperimentell seksjon.

Eksperimentelle for og fisk.

Tre fiskemelbaserte dietter ble formulert og fremstilt av EWOS Innovation (Dirdal, Norway) (Tabell 1). Formuleringene var basert på kommersielle screeningsforsøk i liten skala (ikke publisert). Referansedietten (REF) var i hovedsak en standard, kommersiell formulering med 31 % lipid, hvor tilsatt olje var en blanding av fiskeolje fra den nordlige halvkule (FO) og rapsfrøolje. De to funksjonelle for (benevnt CMS1 og CMS2) inneholdt begge høye nivåer av n-3 fettsyren EPS (nesten 4 %) og et n-3/n-6-PUFA-forhold på ca. 4, sammenlignet med rest-foret (mindre enn 4 % EPA og et n-3/n-6-forhold på 1,4). De to funksjonelle for benevnes CMS1 og CMS2.

De to funksjonelle for inneholdt også et lavere nivå av lipid (18%) som var balansert med økende protein, tilveiebrakt med fiskemel og krillmel.

Den eneste hovedforskjell mellom de funksjonelle for var at CMS1 var tilsatt ytterligere histidin.

Et total på 675 Atlantiske laks ( salmo salar L), SalmonBreed IPN svak stamme (midlet vekt ca. 150 g), ble fordelt inne i tanker (1 m<3>) ved VESO fasiliteten, Vikan, Norge, og foret et av de tre for (3 tanker med 75 fisk per diettbehandling; 225 fisk totalt) for en periode på 8 uker før de overføres til utfordringstankene. Foringsforhold var et maksimum på 2 %. Sjøvann/brakkvann for (ca. 25 %o - 35 %o) avgivelse ble strømmet gjennom, som er tilstrekkelig til å opprettholde oksygenmetning i utslipps-vann på over 70 %. Vanntemperaturen ble opprettholdt til 12 ± 1 °C, og en foto-periode 24:0 t lyst/mørke-regime ble fulgt. Forrådstettheten i tanken var på maksimum 60 kg/m<3>.

Utfordring med PMCV

Etter pre-foringsperioden ble fisken (ikke-vaksinert og HSMI- fri) overført til utfordringstanker (1 m<3>) med de samme oppdrettsbetingelser som beskrevet over. Av de tilgjengelige laks, ble et total på 576 fisk, innledende gjennomsnittlig vekt 141,3 g (± 3,30 g, standard avvik), fordelt i 12 tanker (4 tanker per diettbehandling med 48 fisk/tank). Fisken ble akklimatisert i 2 uker før utfordring, og ble foret med de samme dietter under akklimatiseringsperioden og gjennom utfordringsperioden (14 uker) som de ble foret med før overføring. Ingen tidligere sykdommer var beskrevet.

For utfordring ble fisken bedøvet med anvendelse av Aqui-S i en final konsentrasjon på 5 mg/l isoeugenol, etterfulgt av anestesi i benzocain (20 %, Benzoak<®>) ved anvendelse av en final konsentrasjon på 30 ml/l. To fisk fra hver pre-utfordringstank, 18 i total (n = 6 per diettbehandling) ble samlet før utfordring (0 tidspunkt) og deretter 576 fisk (som beskrevet over) ble utfordret med intramuskulær injeksjon av 0,1 ml PMCV inokulum på hver side av fisken i det laterale muskelvev under den dorsale finne (total, 0,2 ml per fisk).

Produksjon av PMCV-inokulum har blitt beskrevet tidligere. Kort forklart, virus som opprinnelig var isolert fra hjertevevhomogenat ble samlet fra et klinisk utbrudd av CMS, og filtrert gjennom en 0,22 um filter. Utfordring av Atlantisk laks ble utført ved anvendelse av supernatant av GF-1 cellekultur hvor viruset var inokulert.

Prøvetaking

Ti fisk fra hver tank (totalt 40 per diettbehandlig) ble tatt prøver av ved 6, 8, 10, 12 og 14 uker post utfordring. Fisken ble anestetisert som over og drept med en blogging til hodet og lever og hjertevev ble samlet for analyser. Levervev og en porsjon av hvert hjerte ble overført til 10 % bufret formalin for histologiske analyser. Av den resterende porsjon av hjertevevet ble halvparten umiddelbart overført til RNAIater<®>

(ved å følge leverandørens protokoll og lagret ved -20 °C før molekylære analyser (det vil si 5 prøver av hjertevev per tank, 20 per diettbehandling). De resterende prøver av hjertevev ble frosset i væskeformig N2og lagret ved -80 °C før lipidanalyse (fem per tank, 20 per behandling).

Vekst

Vekstegenskaper av fisk som ble foret i tre for ble undersøkt ved anvendelse av repeterte målinger av gjennomsnittsvekt i tanken. Tank-gjennomsnittsvekt ble bestemt ved starten av forsøket (dag 0), ved utfordringsdag (dag 92) og deretter ved 6, 8, 10, 12 og 14 uker post utfordring. En lineær mikset-effektmodell (multinivå modell) ble tilpasset mellom responsen (vekt) og prediktor (diett) ved å følge skjæringspunktene og stigningene av tidsvariabelen (dag) til å variere fra tank til tank for å ta hensyn til tanknivå korrelasjoner og variabilitet i vekstkurver.

Modellen ble estimert med Imer-funksjonen i Ime4-pakken av R language (R Development Core Team, 2008). Alle behandlingseffekter ble basert på posterior stimulering (n = 2,500) med 95 % pålitelighetsintervaller. Nittifem prosent pålitelighetsintervaller ble tolket som statistisk signifikante ved p = 0,05 % nivå idet intervallene ikke overlappet med den aktuelle referanseverdi.

Histologiske undersøkelser

Den histologiske forandring i hjertet ble undersøkt som beskrevet. Kort forklart, inflammatoriske forandringer ble evaluert separat for atrium og ventrikkel, og i den grad det er presentert, ble inflammatoriske score av epikardium også registrert. Histologiske prøver ble samlet til å inkludere atrium og ventrikkel i den samme prøven. Bulbus arteriosus ble også inkludert men ble ikke undersøkt for histopatologiske forandringer. Prøvene ble fiksert i 10 % bufret formalin, innstøpt i parafinvoks og seksjonert i 3-4 mikrometer og farget med hematoksylin og eosin i samsvar med standard metoder. Alle seksjoner ble evaluert vilkårlig og uten kunnskap til hvilken fooringsgruppe de tilhørte (dobbelt- blindet).

Lever steatose score ble rangert i samsvar med en ikke-kontinuerlig scoringsgrad fra 0 til 5 (tabell 3). Kort forklart, et score på 0 indikerte dannelse av vakuola i cytoplasma, som involverer mindre enn 10 % av hepatocyttene og inkluderer mindre enn 25 % av arealet av de individuelle hepatocytter. Et score på 5 indikerte dannelse av vacuola i cytoplasma, som involverer mer enn 90 % av hepatocyttene og inkluderer mer enn 80 % av arealet av de individuelle hepatocytter. De innledende (kontinuerlige) score ble omdannet til et færre antall diskrete score (3-6 klasser) avhengig av responsen. Score var en original respons og multinivå ordinal regresjon ble anvendt for å analysere effektene av forene på scorene. Dette ble oppnådd med ordinal pakke Sweave le med LATEX i R language. Hver av scorene ble anvendt som responsvariabelen i separate analyser som hadde foringstype (REF, CMS1, CMS2) som den faste effekt term. Siden flere fisk ble undersøkt fra hver replikator tank, ble en vilkårlig effekt av tanken tilsatt til modellene.

Lipid analyser

Lipid- og fettsyreanalyser ble utført for forene og hjerteprøver for alle prøvepunktene. Tre pre-utfordrings hjerteprøver per diettbehandling ble vilkårlig valgt for lipid-analyser. Hjertevev fra post-utfordringsprøvene ble samlet per tank slik at hjertevev for fem fisk ble en pol, resulterende i fire poler/behandling/prøvetakingspunkt. Total lipid fra hver pol ble ekstrahert med homogenisering i kloroform/metanol (2:1, basert på volum) i samsvar med fremgangsmåten ifølge Folch et al., og lipidinnhold ble bestemt gravimetrisk. Totale lipidekstrakter ble resuspendert i kloroform/metanol

(2:1, vol/vol) + 0,1 % butylert hydroksytoluen (BHT), i en konsentrasjon på at 10 mg lipid/ml og lagret ved -70 °C inntil de ble analysert.

Fosfolipid (PL) ble fremstilt fra 0,5 mg total lipid med tynnsjiktkromatografi. Prøvene ble applisert til en 20 x 20 cm silica gel 60 TLC plate (VWR, Lutterworth, Leies, UK), og ble utviklet i isoheksan/dietyleter/iseddiksyre (80:20:1, basert på volum). Platene ble sprayet lett med 2, 7, diklorfluorescin (0,1 %, vekt/vol) i 97 % metanol (vol/vol) og PL- båndet ved startpunktet ble skrapet av platen. Fettsyre metylestere (FAME) ble fremstilt med syrekatalysert transesterifisering direkte på silica med inkubering i 2 ml 1 % H2SO4i metanol ved 50 °C natten over (Christie, 2003). Prøvene ble nøytralisert med 2,5 ml 2 % KHCO3og ekstrahert to ganger med 5 ml isoheksan/dietyleter (1:1, vol/vol) + BHT, og de kombinerte ekstrakter ble tørket under en strøm av oksygenfri nitrogen og resuspendert i 0,3 ml isoheksan før fettsyreanalysene.

FAME ble separert og kvantifisert med GLC (Fisons 8160; Carlo Erba, Milan, Italy) ved anvendelse av en 60 m x 0,32 mm x 0,25 um filmtykkelse kappilærkolonne (ZB-WAX; Phenomenex, Macclesfield, Cheshire, UK). Hydrogen ble anvendt som bærergass med en strømningsrate på 4.0 ml/min og temperaturprogrammet var fra 50 til 150 °C ved 40 °C /min deretter til 195 °C ved 2 °C /min og til slutt til 215 °C ved 0,5 °C /min. Individuell FAME ble identifisert med sammenligning med godt karakteriserte in-house standarder og likeledes kommersiell FAME-blandinger (Supelco ™ FAME mix; Sigma-Aldrich Ltd, Gillingham, Dorset, UK).

Vev og diett lipidklasse sammensetninger ble bestemt med én-dimensjon dobbel-utviklet høyytelses tynnsjiktskromatografi (HPTLC) og densitometri som beskrevet tidligere (Bell et al., 1993). Signifikans av forskjeller som skyldes diett og tid ble bestemt med toveis ANOVA (p<0,05) ved anvendelse av SPSS 19,0 statistisk pakke (SPSS Inc., Chicago IL, USA).

Resultater

Vekst

Det var ingen signifikante totale forskjeller mellom diettene ved slutten av forsøket (det vil si etter 192 dager) (data ikke vist).

Lipid- og fettsyresammensetning av hjertevev.

Totalt lipidinnhold i hjertevev var tilsvarende uavhengig av diettbehandling og viste ingen signifikante forandringer over infeksjonsforløpet (tabell 4).

Tabell 4.

Lipid innhold (prosent av våtvekt) av hjertevev av laks foret referanse (REF) og funksjonell (CMS1 og CMS2) for umiddelbart før utfordring med PMCV (PreCh) og ved forskjellige uker post utfordring (wpc).

Nivået av totale fosfolipider (PL) og hoved PL-klassene, fosfatidylkolin (PC) og fosfatidyletanolamin (PE), var signifikant høyere i hjertevev i fisk foret med funksjonelt for (figur 1) sammenlignet med hjertevev i fisk foret med REF-dietten (2-veis ANOVA p-verdi diett, < 0,05). Dette var sannsynligvis en konsekvens av nivåene av triacylglyceroler (TAG) som var signifikant høyere i REF-gruppen, og hvor disse forskjeller er mer åpenbare ved slutten av den innledende foringsfase før infeksjon med PMCV.

Etter PMCV-infeksjon ble PL-nivåene generelt redusert over infeksjonsforløpet og hvor denne effekt var signifikant for fosfatidylinositol (Pl) og fosfatidylserin (PS).

Fettsyresammensetningene av total PL av hjertevev av fisk foret med funksjonelt for blekarakterisertmed lavere andeler av monoener og n-6 PU FA, og høyere andeler

av mettete fettsyrer, n-3 PUFA, LC-PUFA (ARA, EPA og DHA), og EPA/ARA-forhold (figur 2). De to funksjonelle for presenterte tilsvarende nivåer i de relative andeler av viktige LC-PUFA, ARA, EPA og DHA. Således, hjertevev fosfolipider viste andeler av LC-PUFA som er relevant for eikosanoid-reaksjonsveien, og som derfor potensielt kan influere på immunresponsen (Calder 2009b), som reflekterer sammensetningen av diettene. Andelene av EPA, ARA og EPA/ARA- forholdet var signifikant høyere i fisk foret med de funksjonelle for sammenlignet med fisk foret med REF-dietten (P-verdi diett, <0,05). Imidlertid, nivåene av DHA var tilsvarende mellom de forskjellige diettgrupper, som er i samsvar med våre tidligere forsøk som benytter tilsvarende for hvor nivået av DHS var mer konservert til tross for forskjeller i sammensetninger av diettene (Martinez-Rubio et al., 2012b).

Forandringer i forholdstall av immun- og inflammasjonsrelatert LC-PUFA i hjerte total PL under tidsforløpet for infeksjonen var tilsvarende mellom de tre forskjellige grupper (figur 2). Forandringene i ARA post-infeksjon var ikke signifikant, men forholdstallene EPA og DHA var signifikant høyere ved 6-wpc sammenlignet med pre-utfordring. Etter 6-wpc, ble nivåene av DHA progressivt redusert under tidsforløpet av infeksjonen mens forholdstallene for EPA var signifikant høyere ved 10-wpc. Som en konsekvens av det siste, og forandringene i ARA-nivåer, var EPA/ARA-forholdene i hjertet total-PL også høyere i alle diettbehandlinger ved 10-wpc. Der var ingen forskjell i EPA/ARA-forhold i hjertet-PL mellom fisk foret de forskjellige dietter i de siste faser av infeksjonen.

Histopatologi av hjerte- og levervev.

Histologiske forandringer ble først observert i atrium ved 6-wpc (figur 3),karakterisertmed fokal infiltrering av inflammatoriske celler dominert av lymfocytter. En degenerativ prosess assosiert med de inflammatoriske forandringer ble også observert i kardiomyocytter i atrium. Med 8-wpc hadde de gjennomsnittlige score for atrium og ventrikkel øket til 4,1 i fisk foret med rest-dietten, og 3,5 for fisk foret med begge funksjonelle for. Den mest markante økning i histopatologiske forandringer (fra 6 til 8-wpc) ble funnet i ventrikkelen med en 5,6 gangers økning i REF-gruppen, og 5,1- og 9,1 gangers økning for CMS1 og CMS2 diett gruppene, respektivt. Disse forandringer var typiske med multifokal infiltrering av inflammatoriske celler, dominert av lymfocytter og makrofager, og ledsaget av degenerering og nekrose av myocytter. Et annet typisk funn var hyperplasi av endotelceller i betente områder.

Inflammatoriske forandringer var størst i atrium fra 6- til 8-wpc og signifikant (p < 0,01) høyere for alle grupper ved begge tidspunkt. Begge grupper av fisk foret med de funksjonelle dietter viste signifikant lavere histoscore i atrium (figur 4) ved både 6-og 8-wpc. Skader i ventrikkel var også signifikant lavere for gruppen av fisk foret med de funksjonelle for. Ved 10-wpc var de inflammatoriske forandringer og myocytt-nekrose utjevnet seg i alle grupper, og var ikke forskjellig fra 8-wpc. Ved 12-og 14-wpc var der en moderat reduksjon i inflammatoriske score (figur 3). Det var ingen forskjeller mellom diettgrupper ved 10- og 12-wpc i begge deler av hjertet. Ved slutten av forsøket, 14-wpc, var skader i atrium ikke signifikant forskjellig mellom gruppene, selv om fisk foret med CMS2 hadde lavere histoscore sammenlignet med de andre grupper. I ventrikkel, viste fisk foret med begge funksjonelle for lavere histoscore selv om disse ikke var signifikante (figur 4).

Histologiske score for lever, basert på grad av steatose ble avledet som kule-dannelse i hepatocytt cytoplasmakarakterisertmed både mikro- og makro-vesikulære skader. Det var klare forskjeller mellom fisken foret med de funksjonelle for og fisk foret med REF-dietten over alle prøvetakingspunkter post-utfordring, hvor den siste gruppe presentert høyere mikro- og makro-vesikulær steatose. Alvorligheten av lever histopatologi (basert på scorings system i tabell 3) var signifikant høyere ved starten av infeksjonen og større ved slutten av utfordringen (12- og 14-wpc) i laks foret med REF-dietten sammenlignet med fisk foret med de to funksjonelle for (figur 5).

Konklusjoner

Funksjonelle for i samsvar med foreliggende oppfinnelse var klart nyttige for lever-patologi assosiert med CMS. Fisk foret med begge funksjonelle for viste lavere histoscore og hele tidsforløpet for infeksjonen sammenlignet med fisk foret med REF-dietten.

Den potensielle biotilgjengelighet for EPA og ARA, og EPAs forhold relatert til ARA var alltid høyere over tidsforløpet av infeksjonen i fisk foret med de funksjonelle for sammenlignet med fisk foret med REF-dietten.

I tillegg til effektene på fettsyresammensetning var PL-klassesammensetning også påvirket av virusinfeksjonen, hvor hovedforandringen var signifikant reduksjon i andelene av Pl og PS idet infeksjonen fikk utvikle seg.

De funksjonelle for i samsvar med foreliggende oppfinnelse viste en klar forsinkelse i fremkomst av histologiske forandringer assosiert ved utviklingen av CMS hjerte-patologi i fisk.

Idet CMS-sykdommen utviklet seg så økte graden av skader i hjertet i både atrium og ventrikkel, med den forskjell at fisk foret med de funksjonelle for og fisk foret med REF-dietten var mest uttalt ved 8-wpc. Ved dette tidspunkt presenterte fisken som var foret med de funksjonelle for signifikant lavere histoscore i både atrium og ventrikkel sammenlignet med fisk foret med REF-dietten.

Definisjoner av termer og forkortelser

"FA" er forkortelsen som anvendes for "fettsyrer"

"n-3 fettsyrer" er en familie umettete fettsyrer som har felles en final karbon-karbon dobbeltbinding i n-3 posisjon, som er den tredje binding fra metylenden av fettsyren. Disse fettsyrer er også kjent som omega-3 fettsyrer.

"n-6 fettsyrer" er en familie umettete fettsyrer som har felles en final karbon-karbon dobbeltbinding i n-6 posisjon, som er den sjette binding fra metylenden av fettsyren. Disse fettsyrer er også kjent som omega-6 fettsyrer.

EPA er eikosapentaenoisk syre 20:5 n-3.

ARA er arakidonsyre 20:4 n-6.

Termen "n-3/n-6 forhold" angir forholdet mellom fettsyrer som tilhører n-3 familien og de som tilhører n-6 familien i sammensetningen eller dietten.

"Protein/lipid-forhold" angir forholdet mellom proteiner og lipider i sammensetningen eller dietten (hver av dem relatert til vekten av dietten).

"CMS" er forkortelsen som anvendes for "kardiomyopati syndrom".

"PMCV" er forkortelsen for Piscine Myocarditis Virus.

Termen "konvensjonelle foringredienser" angir ingredienser som vanligvis benyttes i fiskefor så som proteiner, lipider, karbohydrater, vitaminer, mineraler, etc. Ingrediensene kan være avledet fra marine, vegetabilske, biprodukter fra dyr og/eller enhver annen relevant kilde og kan anvendes i en egnet kombinasjon.

Claims

1. Forsammensetning for fisk for å hindre og/eller behandle kardiomyopati syndrom (CMS), lever steatose eller sykdommer forårsaket av Piscine Myocarditt Virus (PMCV) omfattende konvensjonelle foringredienser så som proteiner, lipider og vitaminer, karbohydrater og mineraler,karakterisert vedat mer enn 20 % av de totale fettsyrer er n-3 fettsyrer.

2. Forsammensetning i samsvar med krav 1, hvor mer enn 25 % av de totale fettsyrer er n-3 fettsyrer, og fortrinnsvis mer enn 27 % av de totale fettsyrer er n-3 fettsyrer.

3. Forsammensetning i samsvar med ethvert av de foregående krav, hvor innholdet av eikosapentaenoisk syre 20:5 n-3 (EPA) er mer enn ca. 7 % av de totale fettsyrer.

4. Forsammensetning i samsvar med krav 3, hvor innholdet av eikosapentaenoisk syre 20:5 n-3 (EPA) er mer enn ca. 8 % av de totale fettsyrer, og mer foretrukket mer enn 9 %, mer foretrukket mer enn 10 %, mer foretrukket mer enn 11 %, mer foretrukket mer enn 12 % og mest foretrukket mer enn 13 %.

5. Forsammensetning i samsvar med et av de foregående krav, hvor proteinet utgjør mer enn 50 % (basert på vekt), og lipidene utgjør mindre enn 20 % (basert på vekt), fortrinnsvis ca. 18 %) avfdrsammensetningen.

6. Forsammensetning i samsvar med et av de foregående krav, hvor protein:lipid-forholdet (vekt/vekt) i foret er høyere enn 2, fortrinnsvis høyere enn 2,7, fortrinnsvis minst 2,8, og mer foretrukket minst 2,9.

7. Forsammensetning i samsvar med et av de foregående krav, hvor innholdet av n-6 fettsyrer er mindre enn 8 % av de totale fettsyrer, fortrinnsvis i området 6- 8 %, mer foretrukket ca. 7 %.

8. Forsammensetning i samsvar med et av de foregående krav, hvor en andel av nevnte lipider er søramerikansk fiskeolje.

9. Forsammensetning i samsvar med et av de foregående krav, hvor sammensetningen omfatter hydrolyserte fosfolipider.

10. Forsammensetning i samsvar med et av de foregående krav, hvor sammensetningen omfatter krillmel.

11. Forsammensetning i samsvar med et av de foregående krav,karakterisert vedat sammensetningen i hovedsak er som angitt for CMS eller CMS2 i tabell 1 eller 2.

12. Anvendelse av forsammensetningen i samsvar med ethvert av de foregående krav 1-11 for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning og/eller ernæringsmessig sammensetning og/eller funksjonelt forfor profylakse og/eller behandling av kardiomyopati syndrom (CMS) eller sykdommer forårsaket av Piscine Myocarditis Virus (PMCV)

13. Anvendelse i samsvar med krav 12, hvor fisken er en laksefisk, flatfisk eller enhver annen fiskeart egnet for akvakultur, fortrinnsvis arten Atlantisk laks ( Salmo salar).

14. Anvendelse i samsvar med krav 12, hvor en sammensetning i samsvar med et av kravene 1-11 fores til fisk som er mottagelig for kardiomyopati syndrom (CMS) eller sykdommer forårsaket av Piscine Myocarditis Virus (PMCV) i en periode før utfordring av infeksjon, under infeksjon, eller etter at fisken har blitt infisert.

15. Anvendelse i samsvar med krav 14, hvor sammensetningen fores i en periode på minst 8 uker pre infeksjon, mer foretrukket 10-16 uker, mer foretrukket 16-20 uker, og 8-20 uker post infeksjon.