NO20110169A1 - Probiotiske produkter for barn - Google Patents

Abstract

Brystmelkerstatning for spedbarn eller næringsmiddelprodukt for barn som omfatteren proteinkilde, en fettkilde, en karbohydratkilde og B. longum AH1205.

Description

TEKNISK OMRÅDE

[0001]Den foreliggende oppfinnelse vedrører generelt probiotiske brystmelkerstatninger for spedbarn og næringsmiddelprodukter for barn.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

[0002]Kort vedrører den foreliggende oppfinnelse, i en utførelsesform, en brystmelkerstatning for spedbarn eller et næringsmiddelprodukt for barn som omfatteren proteinkilde, en fettkilde, en karbohydratkilde og B. longum AH 1205.

[0003]I en annen utførelsesform vedrører den foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å redusere inflammasjon i et spedbarn eller barn som omfatter å administrere B. longum AH1205 til spedbarnet eller barnet.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

[0004]For en mere fullstendig forståelse av den foreliggende oppfinnelse, skal det nå vises til den etterfølgende beskrivelse sett i sammenheng med de vedlagte tegninger.

[0005]Figur 1 er en BOX polymerasekjedereaksjon (BOX PCR) (bioanalysator) strekkodeprofil for B. longum AH1205. Basepar størrelser ble bestemt ved å anvende Agilent 2100 programvaren;

[0006]Figur 2 er en kurve som illustrerer fekal uvinning av B. longum AH 1205 over en 8 døgns tilførselsperiode og viser at AH 1205 kan overleve den murine gastrointestinalkanalen;

[0007]Figur 3 er et stolpediagram som viser effekten av B. longum AH1205 på interleukin (IL)-10 cytokinproduksjon ved humane mononukleære celler fra perifert blod (PBMCer). Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± standard feil av måling (SEM) (n=6);

[0008]Figur 4 A og B er diagrammer som viser effekten av (A) B. longum AH 1205 og (B) placebo på det totale celletall i bronkoalveolær lavage (BAL) fluid etter ovalbumin (OVA) eksponering i sensibiliserte dyr (n=10/gruppe,<*>= p<0,05 sammenlignet med OVA eksponering alene);

[0009]Figur 5 A og B er diagrammer som viser effekten av (A) B. longum AH 1205 behandling og (B) placebo på luftveis-respondering på metacholin, som bestemt ved forandringer i økt pause (Penh) i OVA-sensibiliserte mus 24 timer etter intranasal utfordring med OVA eller saltvann. Hvert datapunkt representerer gjennomsnittet ± SEM (n=1 O/grupper<*>p = <0,05 sammenlignet med OVA alene);

[0010]Figurer 6 A til og med E er diagrammer som viser (A) IL-10, (B) interferon (IFN)-y, (C) tumornekrosefaktor (TNF)-a, (D) IL-6 og (E) kjemokin (C-C motiv) ligand 2 (CCL2) nivåer i BAL fluid fra OVA-sensibiliserte mus. Hver kolonne representerer gjennomsnittet ± SEM (n=10,<*>p<0,05 sammenlignet med OVA-utfordring, saltvannsbehandlet kontroll);

[0011]Figur 7 er et diagram som illustrerer at CD4+CD25+celler fra AH1205-tilførte mus signifikant reduserte responder CD4<+>T celle proliferasjon (n=7);

[0012]Figur 8 er et diagram som viser prosentandelen av Payers patch celler i CD4<+>populasjonen som også er CD25<+>, som bestemt ved flowcytometri;

[0013]Figurer 9 A og B er diagrammer som viser prosentandelen av CD4<+>/CD25<+>celler som uttrykker transkripsjonsfaktoren FoxP3. Figuren viser at FoxP3 var signifikant oppregulert i bakterie-frie mus som konsumerer B. longum AH1205. (A) = miltceller, (B) = mesenteriske lymfeknuteceller (MLNC) (n = 4/gruppe for milt-analyse n=2/3 for MLNC analyse);

[0014]Figur 10 er et diagram som viser at nivået av cytokiner IL-6, monocytt-kjemotiltrekkende protein (MCP)-1 og IFN-y utskilt ved CD3/CD28 stimulerte MLNC kulturer ble redusert når bakteriefrie mus konsumerte B. longum AH 1205. Resultater er uttrykt som gjennomsnittet per gruppe ± SEM (n=4/gruppe);

[0015]Figur 11 er et diagram som viser at nivået av cytokiner IL-6 og TNF-a utskilt ved CD3/CD28 stimulerte splenocyttkulturer ble redusert når bakteriefrie mus konsumerte B. longum AH 1205. Resultater er uttrykt som gjennomsnittet per gruppe ± SEM (n=4/gruppe); og

[0016]Figur 12 er et diagram som illustrerer stabiliteten til B. longum AH 1205 over 3 måneder sammenlignet med Lactobacillus rhamnosus GG (LGG).

SÆRLIG UTFØRELSE AV OPPFINNELSEN

[0017]Det skal nå detaljert henvises til utførelsesformene av oppfinnelsen, og det er gitt ett eller flere eksempler derpå i det etterfølgende. Hvert eksempel tilveie-bringes gjennom forklaring av oppfinnelsen, og skal ikke være en begrensning av oppfinnelsen. Det vil i realiteten forstås av en fagkyndig på området at forskjellige modifikasjoner og variasjoner kan gjennomføres i den foreliggende oppfinnelse uten at man avviker fra oppfinnelsesrammen. Trekk som illustrert eller beskrevet som deler av en utførelsesform kan for eksempel anvendes i en annen utførelses-form til å gi en ytterligere utførelsesform.

[0018]Således skal den foreliggende oppfinnelse dekke slike modifikasjoner og variasjoner som er innenfor rammen for de vedlagte kravene og deres ekviva-lenter. Andre objekter, trekk og aspekter av den foreliggende oppfinnelse er omtalt i eller fremgår klart fra den etterfølgende detaljerte beskrivelse. En fagkyndig på området skal forstå at den foreliggende omtale er en beskrivelse av kun typiske utførelsesformer, og skal ikke være begrensende for de bredere aspekter av den foreliggende oppfinnelse.

[0019]Som angitt ovenfor vedrører den foreliggende oppfinnelse generelt pre-biotiske brystmelkerstatninger for spedbarn og næringsmiddelprodukter for barn. Referanser relatert til probiotiske brystmelkerstatninger for spedbarn og næringsmiddelprodukter for barn kan inkludere U.S. patent nr. 7 179 460 av Dennen, et. al. og 5 922 375 av Luchansky, et. al.

[0020]Det tekniske problem som skal løses ved den foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe brystmelkerstatninger for spedbarn og næringsmiddelprodukter for barn som inneholder nye probiotika. Således, i en utførelsesform, vedrører den foreliggende oppfinnelse en brystmelkerstatning for spedbarn eller næringsmiddelprodukt for barn som inneholder Bifidobacterium longum stamme AH 1205. En deponering av B. longum stamme AH 1205 ble gjort ved the National Collections of Industrial, Marine, and Food Bacteria (NCIMB), Scotland, UK, 11. mai 2006 og ble registrert med deponeringsnummer NCIMB 41387. NCIMB er en internasjonal deponeringsinstitusjon som er godkjent under Budapest konvensjonen. Stammen er syretolerant og galletolerant og passerer gastrointestinal kanalen. I en særlig ut-førelsesform av oppfinnelsen, isoleres B. longum AH1205 fra spedbarn feces.

[0021]I en annen utførelsesform inneholder brystmelkerstatningen for spedbarn eller næringsmiddelproduktet for barn B. longum stamme AH 1205 eller en mutant eller variant derav. Mutanten kan være en genetisk modifisert mutant. Varianten kan være en naturlig forekommende variant av Bifidobacterium. I enkelte utførel-sesformer kan stammen være et probiotika. I andre utførelsesformer kan stammen være i form av en biologisk ren kultur. I ytterligere utførelsesformer er stammen en isolert stamme.

[0022]Som anvendt heri inkluderer betegnelsene "mutant", "variant" og "genetisk modifisert mutant" en stamme av bifidobakterier hvis genetiske og/eller fenotyp-iske egenskaper er endret sammenlignet med moderstammen. Naturlig forekommende varianter av Bifidobacterium longum inkluderer de spontane endringene av målrettede egenskaper som er selektivt isolert. Tilsiktet endring av egenskapene for moderstammen gjennomføres ved konvensjonelle (in vitro) genetiske mani-pulasjonsteknikker, slik som genspalting og konjugativ overføring.

[0023]Genetisk modifikasjon inkluderer introduksjon av eksogene og/eller endo-gene DNA sekvenser inn i genomet til en bifidobakteriestamme, for eksempel ved insersjon inn i genomet til bakteriestammen ved hjelp av vektorer, som inkluderer plasmid DNA, eller bakteriofager. Naturlige og induserte mutasjoner inkluderer minst enkeltbaseendringer slik som delesjon, insersjon, transversjon eller andre DNA modifikasjoner som kan resultere i endring av aminosyresekvensen kodet for DNA sekvensen.

[0024]Betegnelsen "mutant", "variant" og "genetisk modifisert mutant" inkluderer også en stamme av bifidobakterier som har gjennomgått genetiske forandringer som akkumulerer i et genom i en takt som er konsistent i naturen for alle mikroorganismer og/eller genetiske endringer som forekommer gjennom spontan mutasjon og/eller tilvekst av gener og/eller tap av gener som ikke er oppnådd ved tilsiktet (in vitro) manipulasjon av genomet men er oppnådd gjennom den naturlige seleksjon av varianter og/eller mutanter som tilveiebringer en selektiv fordel for å understøtte overlevelsen av bakterien når eksponert for trykk utenfra slik som antibiotika. En mutant kan dannes ved den tilsiktede (in vitro) insersjon av spesi-fikke gener i genomet som ikke fundamentalt endrer den biokjemiske funksjonali-teten til organismen, men hvis produkter kan anvendes for identifikasjon eller seleksjon av bakterien, for eksempel antibiotisk resistens.

[0025]En fagkyndig på området vil forstå at mutant- eller variant-stammer av bifidobakterier kan identifiseres ved DNA sekvens homologianalyser med moderstammen. Stammer av bifidobakterier som har en nær sekvensidentitet med moderstammen betraktes til å være mutant- eller variant-stammer. En bifidobakteriestamme med en sekvensidentitet (homologi) på 96% eller mere, slik som 97% eller mere, eller 98% eller mere, eller 99% eller mere med moder DNA sekvensen kan betraktes til å være en mutant eller variant. Sekvenshomologi kan bestemmes ved å anvende on-line homologialgoritme "BLAST" programmet, som er offentlig tilgjengelig på http://www.ncbi.nim.nih.gov/BLAST/.

[0026]Mutanter av moderstammen inkluderer også avledede bifidobakterie-stammer som har minst 85% sekvenshomologi, slik som minst 90% sekvenshomologi, eller minst 95% sekvenshomologi med 16s-23s intergenisk spacer polynukleotidsekvensen av moderstammen. Disse mutantene kan videre omfatte DNA mutasjoner i andre DNA sekvenser i bakteriegenomet.

[0027]I en utførelsesform av oppfinnelsen er bifidobakteriestammen i form av

levedyktige celler. Alternativt kan bifidobakteriestammen være i form av inaktiverte celler. Betegnelsen "inaktivert" betyr at den metabolske aktiviteten eller reproduk-sjonsevnen til stammen er blitt redusert eller ødelagt. Inaktivering kan forekomme ved en hvilken som helst metode som nå er kjent innenfor området eller som ennå ikke er utviklet. Inaktiveringen kan f.eks. gjennomføres via varmebehandling, frysetørking, ultrafiolett lys, gammastråling, trykk, kjemisk nedbrytning, mekanisk nedbrytning eller endring av pH. Probiotikumet kan for eksempel inaktiveres ved varmebehandling via lagring i området 80°C til 100°C i 10 minutter. Probiotikumet kan også inaktiveres med ultrafiolett lys via stråling i 5 minutter i en avstand av 5 cm fra en 30 watt UVC lampe. Alternativt kan probiotikumet inaktiveres med gammastråling via stråling med 2 kg-Gray (kGy) ved anvendelse av en Cobalt-60 kilde i en avstand av 20 cm. Som anvendt heri, er betegnelsen "inaktivert" synonym med "ikke-levedyktig".

[0028]I en utførelsesform kan B. longum stamme AH1205 være supplert i en formulering for barn eller spedbarn. Betegnelsen "spedbarn" betyr et postnatalt menneske som er mindre enn omtrent 1 år gammel. Betegnelsen "barn" betyr et menneske i alderen som strekker seg omtrent 1 til 12 år gammel. I visse utførel-sesformer, er et barn i aldersområdet fra omtrent 1 til 6 år gammel. I andre ut-førelsesformer er et barn i aldersområdet fra omtrent 7 til 12 års gammel.

[0029]Mengden av B. longum AH 1205 som er supplert i formuleringen ifølge oppfinnelsen kan tilsvare området fra omtrent 1x10<4>til omtrent 1x10<12>koloni-dannende enheter (cfu) per gram formulering. I en annen utførelsesform, kan mengden som er supplert i formuleringen ifølge oppfinnelsen tilsvare området fra omtrent 1x10<6>til omtrent 1x10<9>cfu per gram formulering. I en annen utførelses-form kan mengden som supplert i formuleringen ifølge oppfinnelsen tilsvare om rådet fra omtrent 1x10<9>og til omtrent 1x10<12>cfu per gram formulering. I en annen utførelsesform kan mengden som er supplert i formuleringen ifølge oppfinnelsen tilsvare minst omtrent 1x10<6>cfu per gram formulering.

[0030]Administreringsformen for B. longum AH 1205 i den foreliggende oppfinnelse er ikke kritisk, så lenge en effektiv mengde administreres til et barn eller spedbarn. I noen utførelsesformer administreres B. longum AH1205 til et barn eller spedbarn via tabletter, piller, innkapslinger, dragéer, gel-hetter, kapsler, olje-dråper, posjonsposer, væsker, væskekonsentrater, pulvere, eliksirer, oppløs-ninger, suspensjoner, emulsjoner, pastiller, kuler og kombinasjoner derav. I en annen utførelsesform er B. longum AH1205 innkapslet i et sukker, fett eller poly-sakkarid. I en ytterligere utførelsesform er B. longum AH1205 tilsatt til et matvare-produkt eller drikkeprodukt og konsumert. Matvareproduktet eller drikkeproduktet kan være et kosttilskudd eller et næringsmiddelprodukt for barn slik som en opp-følgings-brystmelkerstatning, melk for oppvekst, drikkevarer, melk, yoghurt, frukt-juice, fruktbasert drikk, tyggbar tablett, småkaker, kjeks eller et melkepulver.

[0031]I andre utførelsesformer kan produktet være et næringsmiddelprodukt for spedbarn, slik som en brystmelkerstatning eller et tilskudd for å berike human melk. Som anvendt heri, betyr betegnelsen "brystmelkerstatning" en sammensetning som tilfredsstiller næringsmiddelkrav for et spedbarn ved at den kan være en substitutt for human melk. Betegnelsen "et tilskudd for å berike human melk" betyr en sammensetning som kan tilsettes til human melk for å øke nærings-verdien til den humane melk. I enkelte utførelsesformer er sammensetningen et surgjort produkt (som påkrevd ved bestemte medisinske næringsmiddelregule-ringer).

[0032]Næringsmiddelproduktet kan være et produkt for et normalfødt spedbarn, et for tidlig født spedbarn, et spedbarn med lav fødselsvekt, eller et spedbarn med svært lav fødselsvekt. Som anvendt heri kan betegnelsen "for tidlig født" eller "for tidlig født spedbarn" inkludere spedbarn med lav fødselsvekt eller svært lav fødselsvekt. Spedbarn med lav fødselsvekt er dem som er født fra omtrent 32 til 37 uker ut i svangerskapet eller som veier fra omtrent 1,5 kg til omtrent 2,5 kg ved fødselen. Spedbarn ved svært lav fødselsvekt er dem som er født før 32 uke i svangerskapet eller som veier mindre enn omtrent 1,5 kg ved fødselen. Således kan for tidlig fødte spedbarn inkludere spedbarn som er født før omtrent 37 ukers svangerskap og/eller dem som veier mindre enn omtrent 2,5 kg ved fødselen.

[0033]I bestemte utførelsesformer kan formuleringene administreres enteralt eller parenteralt. Som anvendt heri betyr "enteral" gjennom eller i gastrointestinalkanalen eller fordøyelseskanalen, og "enteral administrering" inkluderer oral til-førsel, intragastrisk tilførsel, transpylorisk administrering eller en hvilken som helst annen introduksjon inn i fordøyelseskanalen. Betegnelsen "parenteral" betyr inntatt i kroppen eller administrert på en måte som er annet enn gjennom fordøyelses-kanalen, slik som intravenøs eller intramuskulær injeksjon.

[0034]Formuleringene ifølge oppfinnelsen kan tilveiebringe minimalt, delvis eller totalt næringstilskudd. Sammensetningene kan være nærings-supplementer eller måltidserstatninger. I enkelte utførelsesformer kan sammensetningene administreres sammen med en matvare eller næringsmiddelsammensetning. I denne utførelsesformen, kan sammensetningene enten være iblandet matvaren eller næringsmiddelsammensetningen før inntak ved individet eller kan administreres til individet enten før eller etter inntak av en matvare eller næringsmiddelsammensetning. Sammensetningen kan administreres til for tidlig fødte spedbarn som mottar brystmelkerstatning for spedbarn, brystmelk, tilskudd for å berike human melk eller kombinasjoner derav. Sammensetningene kan, men behøver ikke, være næringsmessig sett fullstendige. Med betegnelsen "næringsmessig sett fullstendig" menes at sammensetningen inneholder adekvate næringsmidler for å opprettholde sunn helse i forlengede perioder.

[0035]I enkelte utførelsesformer kan oppfinnelsen omfatte et prenatalt kosttilskudd som skal konsumeres av en gravid kvinne, for derved å tilveiebringe B. longum AH 1205 til fosteret i livmoren. I andre utførelsesformer kan oppfinnelsen omfatte et postnatalt kosttilskudd som skal forbrukes av en ammende mor for derved å tilveiebringe B. longum AH1205 til det postnatale spedbarn via morens melk.

[0036]Dersom B. longum AH 1205 administreres via en spedbarns-brystmelkerstatning eller næringsmiddelprodukt for barn, kan formuleringen være nærings-middelmessig fullstendig eller inneholde passende typer av mengder av lipid, karbohydrat, protein, vitaminer og mineraler. Mengden av lipid eller fett kan typisk variere fra omtrent 3 til omtrent 7 g/100 kcal. Lipidkilder kan være en hvilken som helst kilde som er kjent eller anvendt innen teknikken, for eksempel melkefett, eggeplomme, lipid, fiskeolje, vegetabilske oljer slik som palmeolje, soyabønneolje, palmolein, palmekjerneolje, kokosnøttolje, triglyceridolje med medium kjede-lengde, solsikkeolje med høyt oleinsyreinnhold, olivenolje, saflorolje med høyt oleinsyreinnhold og estere av fettsyrer.

[0037]Mengden av protein kan typisk variere fra omtrent 1 til omtrent 5 g/100 kcal. Proteinkilder kan være en hvilken som helst som kjent eller anvendt innen teknikken, for eksempel melkeprotein, ikke-fettholdige melkefaststoffer, ikke-fettholdig melk, valle protein, kasein, soyaprotein, animalsk protein, kornprotein, vegetabilsk protein eller kombinasjoner derav. Formuleringen kan inneholde proteiner og/eller peptider som er rike på glutamin/glutamat. Proteinkilden kan være intakt, delvis hydrolysert eller omfattende hydrolysert. Proteinkilden kan i noen utførelsesformer være en kombinasjon av intakt protein og hydrolysert protein. Proteinkilden kan være et isolat eller et konsentrat.

[0038]I bestemte utførelsesformer kan sammensetningen ifølge oppfinnelsen inneholde en nitrogenkilde (dvs. aminosyrer og/eller protein) slik at den totale mengden av aminosyrer eller protein kan være fra omtrent 1 g/100 kilokalorier (kcal) til omtrent 10 g/100 kcal av den totale sammensetning. I enkelte utførel-sesformer omtrent 2 g/100 kcal til omtrent 6 g/100 kcal. Mengden av lipidkilde per 100 kcal av den totale sammensetning kan være større enn 0 g opp til omtrent 6 g, i noen utførelsesformer fra omtrent 0,5 g til omtrent 5,5, g, og i andre utførelses-former fra omtrent 2 g til omtrent 5,5 g, og mengden av ikke-fiber karbohydratkilde per 100 kcal av den totale sammensetning kan være omtrent 5 g til omtrent 20 g, og i enkelte utførelsesformer fra omtrent 7,5 g til omtrent 15 g. Mengden av vitaminer og mineraler i den næringsmessige fullstendige sammensetning kan være tilstrekkelig til å oppfylle 100% av U.S. rekommandert daglig inntak (RDI) på omtrent 500 til omtrent 3000 kcal, i enkelte utførelsesformer fra omtrent 1000 til omtrent 3000 kcal. I en spesiell utførelsesform kan sammensetningen være proteinfri. I en slik utførelsesform kan sammensetningen inneholde en protein-ekvivalent kilde som omfatter 100% frie aminosyrer.

[0039]Mengden av karbohydrat kan typisk variere fra omtrent 8 til omtrent 12 g/100 kcal. Karbohydratkilder kan være en hvilken som helst som er kjent eller anvendt innen teknikken, for eksempel laktose, fruktose, glukose, maissirup, maissirup-faststoffer, maltodekstriner, sukrose, stivelse, rissirup-faststoffer, risstivelse, modifisert maisstivelse, modifisert tapiokastivelse, rismel, soyamel og kombinasjoner derav. Formuleringen kan inkludere hvilken som helst eller flere av et tilsetningsstoff, en bakteriekomponent, en legemiddelentitet eller en biologisk forbindelse.

[0040]Passende kan kommersielt tilgjengelige brystmelkserstatninger for spedbarn og andre formuleringer anvendes i praksis ifølge oppfinnelsen. Enfamil, Enfamil Premature Formula, Enfamil med jern, Laktofri, Nutramigen, Pregestimil og ProSobee (tilgjengelig fra Mead Johnson & Company, Evansville, IN. U.S.A.) kan for eksempel suppleres med passende nivåer av B. longum AH 1205 og i praksis anvendes ifølge oppfinnelsen.

[0041]Formuleringen ifølge oppfinnelsen kan eventuelt inkludere ett eller flere av de etterfølgende vitaminer eller derivater derav som inkluderer, men som ikke er begrenset til, biotin, vitamin B-i, tiamin, tiaminpyrofosfat, vitamin B2, riboflavin, flavin-mononukleotid, flavin-adenin-dinukleotid, pyridoksinhydroklorid, tiamin-mononitrat, folinsyre, vitamin B3, niacin, nikotinsyre, nikotinamid, niacinamid, nikotinamidadenindinukleotid, tryptofan, biotin, pantotensyre, vitamin B6, vitamin B12, kobalamin, metylkobalamin, deoksyadenosylkobalamin, cyanokobalamin, kalsiumpantotenat, vitamin C, askorbinsyre, vitamin A, retinol, retinal, retinoinsyre, beta-karoten, vitamin D, vitamin D3, kalciferol, cholekalciferol, dihydroksy vitamin D, 1,25 dihydroksycholekalciferol, 7-dehydrokolesterol, cholin, vitamin E, vitamin E acetat, vitamin K, menadion, menakinon, fyllokinon, naftokinon og blandinger derav.

[0042]Formuleringen ifølge oppfinnelsen kan eventuelt inkludere ett eller flere av de etterfølgende mineraler eller derivater derav som inkluderer, men som ikke er begrenset til, fosfor, kalium, svovel, natrium, docusatnatrium, klorid, mangan, magnesium, magnesiumstearat, magnesiumkarbonat, magnesiumoksid, magnesiumhydroksid, magnesiumsulfat, kopper, kuprisulfat, jodid, bor, sink, sinkoksid, krom, molybden, jern, karbonyl-jern, ferri-jern, ferrofumerat, poly-sakkarid-jern, fluorid, selen, molybden, kalsiumfosfat eller acetat, kaliumfosfat, magnesiumsulfat eller-oksid, natriumklorid, kaliumklorid eller-acetat, ferriorto-fosfat, alfa-tokoferylacetat, sinksulfat eller-oksid, kopperglukonat, kromklorid eller

-pikolonat, kaliumjodid, natriumselenat, natriummolybdat, fyllokinon, cyanokobalamin, natriumselenitt, koppersulfat, inositol, kaliumjodid, kobolt og blandinger

derav. Ikke-begrensende eksempler på derivater av mineralforbindelser inkluderer salter, alkalisalter, estere og chelater av en hvilken som helst mineralforbindelse.

[0043]Sammensetningen ifølge oppfinnelsen kan også inneholde emulgerings-midler og stabilisatorer slik som soyalecitin, karragenan og kombinasjoner derav. Sammensetningen ifølge oppfinnelsen kan eventuelt inneholde andre substanser som kan ha en fordelaktig effekt slik som laktoferrin, nukleotider, nukleosider, immunoglobuliner og kombinasjoner derav.

[0044]I en utførelsesform av oppfinnelsen kan B. longum AH 1205 administreres i kombinasjon med ett eller flere probiotika. Betegnelsen "probiotika" betyr en mikro-organisme som utviser fordelaktige effekter på vertens helse. Et hvilket som helst probiotika som er kjent innen teknikken kan aksepteres i denne utførelsesform med den betingelse at det gir det tilsiktede resultat. I en spesiell utførelsesform kan probiotikaet velges fra LGG, Bifidobacterium longum arter og Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12.1 en utførelsesform kan den eller de ytterligere probiotika være levedyktige eller ikke-levedyktige.

[0045]I en annen utførelsesform av oppfinnelsen kan B. longum AH1205 kombineres med ett eller flere prebiotika. Betegnelsen "prebiotika" betyr en ikke-fordøybar næringsbestanddel som stimulerer vekst og/eller aktivitet av probiotika. Et hvilket som helst prebiotika som er kjent innen teknikken vil være aksepterbart i denne utførelsesform med den betingelse at det gir det ønskede resultatet. Prebiotika som er anvendbare i forbindelse med den foreliggende oppfinnelse kan inkludere oligosakkarider, polysakkarider og andre prebiotika som inneholder fruktose, xylose, soya, galaktose, glukose og mannose. Mere spesifikt kan prebiotika som er anvendbare i den foreliggende oppfinnelse inkludere laktulose, glukoligosakkarid, inulin, polydekstrose, galakto-oligosakkarid, frukto-oligosakkarid, isomalto-oligosakkarid, soyabønne-oligosakkarider, laktosukrose, xylo-oligosakkarid og gentio-oligosakkarider.

[0046]I en ytterligere utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse kan formuleringen inneholde andre aktive midler slik som langkjede poly-umettede fettsyrer (LCPUFA'er). Passende LCPUFA'er inkluderer, men er ikke begrenset til, a-linoleinsyre, y-linoleinsyre, linoleinsyre, linolensyre, eicosapentensyre (EPA), arakidonsyre (ARA) og/eller docosaheksaensyre (DHA). I en utførelsesform administreres B. longum AH1205 i kombinasjon med DHA. I en annen utførelses- form administreres B. longum AH1205 i kombinasjon med ARA. I en ytterligere utførelsesform administreres B. longum AH1205 i kombinasjon med både DHA og ARA. Kommersielt tilgjengelig brystmelkerstatning for spedbarn som inneholder DHA, ARA eller en kombinasjon derav kan være supplert med B. longum AH1205 og anvendes i den foreliggende oppfinnelse. For eksempel Enfamil LI PIL, som inneholder effektive nivåer av DHA og ARA, er kommersielt tilgjengelige og kan være supplert med B. longum AH 1205 og anvendes i den foreliggende oppfinnelse.

[0047]I en utførelsesform administreres både DHA og ARA i kombinasjon med B. longum AH1205.1 denne utførelsesform kan vektforholdet ARA:DHA være fra omtrent 1:3 til omtrent 9:1.1 en utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse er dette forholdet fra omtrent 1:2 til omtrent 4:1.1 en ytterligere utførelsesform, er forholdet fra omtrent 2:3 til omtrent 2:1.1 en spesiell utførelsesform er forholdet omtrent 2:1.1 en annen spesiell utførelsesform av oppfinnelsen er forholdet omtrent 1:1,5.1 andre utførelsesformer, er forholdet omtrent 1:1,3.1 ytterligere utførelses-former, er forholdet omtrent 1:1,9.1 en særlig utførelsesform er forholdet omtrent 1,5:1.1 en ytterligere utførelsesform er forholdet omtrent 1,47:1.

[0048]I bestemte utførelsesformer av oppfinnelsen, er nivået av DHA i området fra omtrent 0,0% til 1,00% av fettsyrer, uttrykt i vekt. Nivået av DHA er omtrent 0,32 vekt%. I noen utførelsesformer kan nivået av DHA være omtrent 0,33 vekt%. I en annen utførelsesform kan nivået av DHA være omtrent 0,64 vekt%. I en annen utførelsesform kan nivået av DHA være omtrent 0,67 vekt%. I en ytterligere ut-førelsesform kan nivået av DHA være omtrent 0,96 vekt%. I en ytterligere ut-førelsesform kan nivået av DHA være omtrent 1,00 vekt%.

[0049]I utførelsesformer av den foreliggende oppfinnelse er nivået av ARA i området fra 0,0% til 0,67% av fettsyrer, uttrykt i vekt. I en annen utførelsesform kan nivået av ARA være omtrent 0,67 vekt%. I en annen utførelsesform kan nivået av ARA være omtrent 0,5 vekt%. I en ytterligere utførelsesform kan nivået av DHA være i området fra omtrent 0,47 vekt% til 0,48 vekt%.

[0050]Dersom inkludert, er den effektive mengde DHA i en utførelsesform av oppfinnelsen typisk fra omtrent 3 mg per kg kroppsvekt per døgn til omtrent 150 mg per kg kroppsvekt per døgn. I en utførelsesform av oppfinnelsen, er mengden fra omtrent 6 mg per kg kroppsvekt per døgn til omtrent 100 mg per kg kroppsvekt per døgn. I en annen utførelsesform, er mengden fra omtrent 10 mg per kg kroppsvekt per døgn til omtrent 60 mg per kg kroppsvekt per døgn. I en ytterligere utførelsesform er mengden fra omtrent 15 mg per kg kroppsvekt per døgn til omtrent 30 mg per kg kroppsvekt per døgn.

[0051]Dersom inkludert, er den effektive mengden av ARA i en utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse typisk fra omtrent 5 mg per kg kroppsvekt per døgn til omtrent 150 mg per kg kroppsvekt per døgn. I en utførelsesform av oppfinnelsen, varier mengden fra omtrent 10 mg per kg kroppsvekt per døgn til omtrent 120 mg per kg kroppsvekt per døgn. I en ytterligere utførelsesform, varier mengden fra omtrent 15 mg per kg kroppsvekt per døgn til omtrent 90 mg per kg kroppsvekt per døgn. I en ytterligere utførelsesform, varierer mengden fra omtrent 20 mg per kg kroppsvekt per døgn til omtrent 60 mg per kg kroppsvekt per døgn.

[0052]Dersom en brystmelkerstatning for spedbarn benyttes, kan mengden av DHA i brystmelkerstatningen for spedbarn variere fra omtrent 5 mg/100 kcal til omtrent 80 mg/100 kcal. I en utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse, varierer DHA fra omtrent 10 mg/100 kcal til omtrent 50 mg/100 kcal; og i en annen utførelsesform fra omtrent 15 mg/100 kcal til omtrent 20 mg/100kcal. I en særlig utførelsesform av foreliggende oppfinnelse, er mengden DHA omtrent 17 mg/100 kcal.

[0053]Dersom en brystmelkerstatning for spedbarn benyttes, kan mengden av ARA i brystmelkerstatningen for spedbarn variere fra omtrent 10 mg/100 kcal til omtrent 100 mg/100 kcal. I en utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse, varierer mengden av ARA fra omtrent 15 mg/100 kcal til omtrent 70 mg/100 kcal. I en annen utførelsesform, varierer mengden av ARA fra omtrent 20 mg/100 kcal til omtrent 40 mg/100 kcal. I en særlig utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse, er mengden ARA omtrent 34 mg/100 kcal.

[0054]Dersom en brystmelkerstatning for spedbarn anvendes, kan brystmelkerstatningen for spedbarn være supplert med oljer som inneholder DHA og ARA ved å anvende standard teknikker som er kjent innen teknikkens stand. DHA og ARA kan for eksempel tilsettes til brystmelkerstatningen ved å erstatte en ekvivalent mengde av en olje, slik som solsikkeolje med høyt oleinsyreinnhold, som normalt er tilstede i brystmelkerstatningen. Som et annet eksempel, kan oljene som inneholder DHA og ARA tilsettes til brystmelkerstatningen ved å erstatte en ekvivalent mengde av resten av den totale fettblandingen som normal er tilstede i brystmelkerstatningen uten DHA og ARA.

[0055]Ved anvendelse, kan kilden for DHA og ARA være en hvilken som helst kilde som er kjent innen teknikken slik som marin olje, fiskeolje, encelle-olje, egge-plommelipid og jernlipid. I enkelte utførelsesformer er kilden for DHA og ARA encelle Martek olje, DHASCO eller variasjoner derav. DHA og ARA kan være i naturlig form, med den betingelse at resten av det LCPUFA kilden ikke resulterer i noen vesentlig ødeleggende effekt på spedbarnet. Alternativt kan DHA og ARA anvendes i raffinert form.

[0056]i en utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse er DHA og ARA kilder encelle-oljer som omtalt i U.S. patenter nr. 5 374 567; 5 550 156 og 5 397591, som er innlemmet i sin helhet heri som referanse. Den foreliggende oppfinnelse er imidlertid ikke begrenset til bare slike oljer.

[0057]I en utførelsesform anvendes en LCPUFA kilde som inneholder EPA i kombinasjon med B. longum AH 1205.1 en annen utførelsesform, anvendes en LCPUFA kilde som er i alt vesentlig fri for EPA i kombinasjon med B. longum AH1205.1 en utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse, blir for eksempel en brystmelkerstatning for spedbarn som inneholder mindre enn omtrent 16 mg EPA/100 kcal supplert med B. longum AH1205 og anvendt i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. I en annen utførelsesform, blir en brystmelkerstatning for spedbarn som inneholder mindre enn omtrent 10 mg EPA/100 kcal supplert med B. longum AH1205 og anvendt i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. I en ytterligere utførelsesform, blir en brystmelkerstatning for spedbarn som inneholder mindre enn omtrent 5 mg EPA/100 kcal supplert med B. longum AH1205 og anvendt i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. En annen utførelsesform av oppfinnelsen inkluderer en brystmelkerstatning for spedbarn supplert med B. longum AH 1205 som er fri for selv spormengder av EPA.

[0058]Det vil forstås at kombinasjonen av B. longum AH 1205 og probiotika, prebiotika, LCPUFA'er eller andre aktive bestanddeler kan administreres i en enkelt formulering eller som separate formuleringer som administreres samtidig eller på forskjellige tidspunkter og med anvendelse av den samme eller forskjellige administreringsruter.

[0059]I en utførelsesform av oppfinnelsen kan formuleringen anvendes ved immu-niseringsprotokoller og vaksinasjonsprotokoller. Oral immunisering ved å anvende probiotiske bakterier som vektorer vil ikke bare beskytte verten mot infeksjon, men også erstatte de immunologiske stimuli som patogenet normalt ville utløse, noe som således bidrar til vertens immunologiske utvikling.

[0060]I en utførelsesform av oppfinnelsen er formuleringen anvendbar for å behandle, redusere og/eller forebygge inflammasjon. Som anvendt heri betyr betegnelsen "behandle" å bli bedre av en sykdom, komme seg etter sykdom eller helbrede en sykdom, lidelse eller et symptom på en sykdom eller tilstand. Betegnelsen "redusere" betyr å svekke i omfang, mengde eller grad. Betegnelsen "forebygge" betyr å stanse eller hindre en sykdom, lidelse eller et symptom på en sykdom eller tilstand gjennom en eventuell handling.

[0061]I en spesiell utførelsesform omfatter oppfinnelsen anvendelsen av B. longum AH 1205 for fremstilling av en sammensetning for å redusere eller forebygge inflammasjon i et spedbarn eller et barn. Eksempler 2-5 indikerer hver at administrering av B. longum AH 1205 kan redusere eller forebygge inflammasjon i et spedbarn eller et barn. Inflammasjonen kan være redusert i mage-tarm-kanalen, luftveiene, eller kan være redusert systemisk. Reduksjonen eller forebyggingen av inflammasjon kan forbedre allergier eller astma.

[0062]I denne utførelsesformen kan inflammasjonen være respiratorisk inflammasjon slik som astma, allergisk rhinitt, sinusitt, luftveisinflammasjon, infeksjon i øvre deler av luftveiene, influensa, krupp, respiratorisk syncytialvirus, bronkitt, bronkiolitt, pneumoni eller luftveis-lumen inflammasjon. Likeledes kan inflammasjonen være gastrointestinal inflammasjon, slik som diaré, inflammatorisk tarm-sykdom, Crohns sykdom, enterokolitt, ulcerøs kolitt, allergisk kolitt, irritabel tarm, pouchitt, post-infeksjon kolitt, Clostridium difficile- assos\ ert diaré, Rotavirus-assosiert diaré, eller post-infektiv diaré, eller diarésykdom som skyldes et infek-sjonsmiddel, slik som E. coli. I andre utførelsesformer kan inflammasjonen være systemisk, slik som revmatoid artritt. Betegnelsen "systemisk" som anvendt heri, betyr som vedrører eller som rammer hele kroppen.

[0063]I enkelte utførelsesformer kan reduksjonen eller forebyggingen av inflammasjon forbedre eller forhindre atopiske tilstander eller sykdommer. Reduksjon eller forebygging av inflammasjon kan for eksempel forbedre eller forhindre atopisk dermatitt. I en spesiell utførelsesform kan reduksjon eller forebygging av inflammasjon forbedre eller forebygge vanlig sykdommer hos spedbarn eller barnesykdommer. Reduksjon eller forebygging av inflammasjon kan for eksempel forbedre eller forhindre diaré eller akutt otitis media. I en annen utførelsesform kan reduksjon eller forebygging av inflammasjon forbedre eller forhindre matallergier.

[0064]Man mener at B. longum AH1205 virker ved å antagonisere og ekskludere pro-inflammatoriske mikroorganismer fra mage/tarmkanalen eller fra inflamma-sjonsstedet. Man mener også at B. longum AH 1205 virker ved å redusere nivåene av pro-inflammatoriske cytokiner.

[0065]I en særlig utførelsesform kan stammen modifisere nivåene av IL-10 i et individ. IL-10 produseres ved T-celler, B-celler, monocytter og makrofager. Dette cytokinet øker proliferasjon og differensiering av B-celler til antistoff-utskillende celler. IL-10 utviser for det meste anti-inflammatoriske aktiviteter. Det oppregulerer IL-1RA ekspresjon ved monocytter og undertrykker majoriteten av monocytt-inflammatorisk aktivitet. IL-10 inhiberer monocyttproduksjon av cytokiner, reaktive oksygen- og nitrogen-mellomprodukter, "major histocompatibility complex" (MHC) klasse II ekspresjon, parasitt dreping og IL-10 produksjon via en feed-back mekanisme. Dette cytokinet har også blitt vist til å blokkere monocyttproduksjon av intestinal kollagenase og type IV kollagenase ved å interferere med et prostaglan-din E2-cyklisk adenosin monofosfat (PGE2-cAMP) avhengig spor og kan derfor være en viktig regulator av bindevevsdestruksjonen som man ser ved kroniske inflammatoriske sykdommer. Således, i en utførelsesform, kan stammen oppregu-lere eller indusere sekresjon av IL-10 nivåer i spedbarn eller barn som konsumerer stammen.

[0066]I andre utførelsesformer, vil B. longum AH 1205 nedregulere eller nedsette sekresjon av TNF-a, IL-6, MCP-1 og/eller IFN-y eller andre pro-inflammatoriske cytokiner eller kjemokiner. TNF-a, et pro-inflammatorisk cytokin, initierer en kaskade av cytokiner og biologiske effekter resulterende i en inflammatorisk tilstand.

[0067]I noen utførelsesformer er formuleringen ifølge oppfinnelsen anvendbar for å opprettholde homeostasen i immunsystemet. I andre utførelsesformer er formuleringen ifølge oppfinnelsen anvendbar for å forbedre eller øke immuniteten i et individ.

[0068]I noen utførelsesformer kan den økte immunitet eller suppresjon av inflammasjon inkludere stimulering av intestinal integritet; reduksjon av intestinal permeabilitet, forbedring av mucin syntese, sekresjon og/eller kvalitet; forbedring av maturasjon og differensiering av intestinalt epitel; forbedring av næringsabsorp-sjon; økning i produksjon av oppløselige faktorer som overfører antimikrobiell aktivitet; stimulering av, forbedring av eller understøttelse av resistens mot infeksjon; understøttelse av cellulære eller humorale responser mot virusinfeksjon eller bakterieinfeksjon; økt cytotoksisitet (både anti-viral og anti-tumor); understøttelse av systemiske og/eller mukosale vaksinasjonsresponser; økning eller understøt-telse av cellulær og/eller humoral immunitet; økning eller understøttelse av naturlig immunitet (inkluderende neutrofiler, fagocytter, makrofager og naturlig drepercelle aktivitet); økning eller understøttelse av adaptiv T og B celle immunitet; stimulering av en hjelper T celle 1 (Th1) cytokin spor (økt IL-1, IL-2, IFN-y, IL-12, TNF-a; human leukocytt antigen-Dr (HLA-Dr) ekspresjon); suppresjon av inflammasjon eller produksjon av systemiske og mukosale inflammatoriske mediatorer (som inkluderer cytokiner og/eller kjemokiner); reduksjon av følsomhet ved å redusere total og/eller allergen-spesifikk IgE; reduksjon av produksjon av allergiske cytokiner; reduksjon av en Th2 understøttende immunoglobulin profil; og kombinasjoner derav.

[0069] Produksjonen av multifunksjonelle cytokiner over et vidt spekter av tumor-typer foreslått at signifikante inflammatoriske responser pågår i pasienter med cancer. Således, i en utførelsesform av oppfinnelsen, kan B. longum AH1205 anvendes for å behandle symptomene på cancer. På grunn av de anti-inflammatoriske egenskapene til B. longum AH 1205, kan denne bakteriestammen redusere grad av malign celletransformasjon. Videre kan intestinalbakterier produsere, fra kost-forbindelser, substanser med genotoksis, karcinogen og tumor-fremmende aktivitet og tarmbakterier kan aktivere pro-karcinogener mot DNA reaktive midler. Generelt har Bifidobacterium arter lave aktiviteter av xenobiotiske metaboliserende enzymer sammenlignet med andre populasjoner i tarmen slik som bacteroider, eubacteria og clostridia. Derfor vil økning av antallet Bifidobacterium bakterier i tarmen fordelaktig kunne modifisere nivåene av disse enzymene.

[0070]I spesielle utførelsesformer kan B. longum AH1205 administreres i kombinasjon med anti-inflammatoriske terapier slik som ikke-steroide anti-inflammatoriske legemidler (NSAID'er) eller infliximab.

[0071]Tarm-mikrofloraen hos spedbarn etableres raskt i de første få ukene etter fødselen. Naturen til denne intestinal-kolonisering bestemmes initialt ved tidlig eksponering for miljømessige mikrobekilder så vel som spedbarnets helsetilstand. Spedbarn som er født med keisersnitt, for tidlig fødte eller andre spedbarn som til-bringer deres første del av livet i en steril inkubator, og/eller spedbarn som for tilført antibiotika tidlig i livet vil sannsynligvis ha signifikante utsettelser av utvikling av en frisk tarmflora. Fordi disse spedbarna ikke har muligheten til å erverve en frisk tarmflora fra deres mødre eller fra omgivelsene, kan konsumering av B. longum AH 1205 fordelaktig bidra til en rett utvikling og funksjon av mage/tarm-immunsystemet.

[0072]I noen utførelsesformer ifølge oppfinnelsen, har spedbarnet eller barnet behov for behandling, reduksjon eller forebygging av inflammasjon. Individet kan ha en risiko for inflammasjon som skyldes genetisk predisposisjon, diett, livsstil, sykdom eller lidelser. Et for tidlig født spedbarn eller et spedbarn med immun-supresjon kan for eksempel ha en risiko for inflammasjon og kan derfor ha behov foren slik behandling, reduksjon eller forebygging.

[0073]Sammensetningen ifølge oppfinnelsen kan emballeres i en hvilken som helst type beholder som er kjent innen teknikken for anvendelse når det gjelder

lagring av næringsmiddelprodukter slik som glass, belagt kartong, plast og belagte metallbokser. I enkelte utførelsesformer er sammensetningen emballert via blåse-fylle-forsegle emballeringsteknikker. I andre utførelsesformer er sammensetningen tilveiebrakt som en enkelt-dose beholder. Emballeringen av sammensetningen kan gjennomføres under aseptiske forhold. I noen utførelsesformer fremstilles sammensetningen slik at den er aksepterbar for direkte avlevering til et for tidlig født spedbarn via nasogastriske sonder, nasoduodenalsonder eller nasojejunalsonder.

[0074]Sammensetningen ifølge oppfinnelsen kan være lagringsstabil. Med "lagringsstabil" er det ment at sammensetningen, i en form som er lett å forbruke, forblir i en enkelt homogen fase (dvs. separerer ikke til mer enn en fase ved visuell inspeksjon), og/eller som ikke bunnfeller ved visuell inspeksjon etter lagring over natten i et kjøleskap.

[0075]De etterfølgende eksempler beskriver forskjellige utførelsesformer av den foreliggende oppfinnelse. Andre utførelsesformer innenfor rammen av de her angitte krav vil fremkomme klart for en fagkyndig på området ut fra beskrivelsen eller utførelsen av oppfinnelsen som omtalt heri. Beskrivelsen skal, sammen med eksemplene, betraktes til kun å være eksempelvise, hvor rammen for oppfinnelsen er indikert ved kravene som etterfølger eksemplene. I eksemplene er alle prosent-andelene gitt på vektbasis dersom annet ikke er indikert.

Eksempel 1

[0076]Dette eksempel illustrerer karakteriseringen av bakterier isolert fra sped-barnsavføring.

Isolering av probiotiske bakterier

[0077]Frisk avføring ble oppnådd fra et 3-dager gammelt ammet guttespedbarn og seriefortynninger ble utplatet på TPY (trypticase, pepton og gjærekstrakt) og MRS (deMann, Rogosa and Sharpe) medier supplert med 0,05% cystein og mupirocin. Plater ble inkubert i anaerobe glasskrukker, (BBL, oksoid) ved å anvende CO2genererende kit (Anaerocult A, Merck) i 2-5 døgn ved 37°C. Gram-positive, katalase-negative stav-formede eller bifurkerte/pleomorfe bakterieisolater ble strøket ut for renhet på komplekse ikke-selektive medier (MRS og TPY). Isolater ble rutinemessig kultivert i MRS eller TPY medium dersom annet ikke er angitt ved 37°C under anaerobe forhold. Presumptive Bifidobacterium ble anbrakt i 40% glyserol og lagret ved -20°C og -80°C.

[0078]Etter isolering av en ren bifidobakteriestamme, tildelt betegnelsen AH1205, ble mikrobiologiske egenskaper bestemt og oppsummert i tabell 1 nedenfor. AH 1205 er en gram-positiv, katalase-negativ pleomorfisk formet bakterie som er fruktose-6-fosfat-fosfoketolase positiv som bekrefter dens identitet som en bifidobakterie. Ved å anvende minimalt medium hvori en enkelt karbonkilde var innført, var AH 1205 i stand til å vokse på alle karbonkildene som ble testet (glukose, laktose, ribose, arabinose, galaktose, raffinose, fruktose, maltekstrakt, mannose, maltose, sukrose).

Identifikasjon av arter

[0079]16 s intergenisk spacer (IGS) sekvensering ble gjennomført for å identi-fisere bifidobakterieartene som er isolert. Kort ble DNA isolert fra AH1205 ved å anvende 100 ul ekstraksjonsoppløsning og 25 ul vevspreparatoppløsning (Sigma, XNAT2 Kit). Prøvene ble inkubert i 5 minutter ved 95°C og deretter ble 100 ul nøy-traliseringsoppløsning (XNAT2 kit) tilsatt. Genomisk DNA oppløsning ble kvantifisert ved å anvende et Nanodrop spektrofotometer og lagret ved 4°C. PCR ble gjennomført ved å anvende IGS primere, IGS L: 5-GCTGGATCACCTCCTTTC-3'

(SEQ ID NO 3) som er basert på SEQ ID NO 1 og IGS R: 5'-CTGGTGCCAAGGCATCCA-3' (SEQ ID NO 4) som er basert på SEQ ID NO 2. Cykliseringsbetingelsene var 94°C i 3 minutter (1 syklus), 94°C i 30 sekunder, 53°C i 30 sekunder, 72°C i 30 sekunder (28 sykluser). PCR reaksjonen inneholdt 4 Ml (50 ng) DNA, PCR blanding (XNAT2 kit), 0,4 uM IGS L og R primer (MWG Biotech, Tyskland). PCR reaksjonene ble gjennomført på en Eppendorf termo-cykliseringsanordning. PCR produktene (10 ul) ble kjørt sammen med en molekylvekt markør (100 bp stige, Roche) på en 2% agarose EtBr farget gel i tris-acetat-buffer (TAE), for å bestemme IGS profilen. PCR produkter av bifidobakterium (enkeltbånd) ble renset ved å anvende Promega Wizard PCR rensekit. De rensede PCR produktene ble sekvensert ved å anvende primer sekvensene (ovenfor) for den intergeniske spacer regionen. Sekvensdata ble deretter søkt mot the National Center for Biotechnology Information (NCBI) nukleotid databasen for å bestemme identiteten til stammen ved nukleotidhomologi. De oppnådde DNA sekvensdataene ble underkastet NCBI standard nukleotid-til-nukleotid homologi BLAST søkemotoren (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BI_AST/). Den nærmeste match med sekvensen ble identifisert, og deretter ble sekvensene sammenstilt for sammenligning ved å anvende DNASTAR MegAlign programvare. De oppnådde sekvensene (SEQ ID NO 1 er [IGS fremover sekvens] og SEQ ID NO 2 [IGS revers sekvens] kan man se i sekvenslisten. Søk i NCIMB databasen viste at AH1205 har en unik IGS (SEQ ID NO 1 [fremoversekvens] og SEQ ID NO 2 [revers sekvens] sekvens med sin nærmeste sekvenshomologi med en Bifidobacterium longum. En papirkopi og et datamaskin-lesbart format av sekvenslisten for tabell 3 innsendes hermed og er herved innlemmet ved referanse i sin helhet. Den datamaskinlesbare filen på disketten er identifisert som AH1205_ST25.txt, størrelse: 3 KB, dannet 12. september 2008.

[0080]For å utvikle en strekkode PCR profil for AH1205, ble PCR gjennomført ved anvendelse av BOX primere. Cykliseringsbetingelsene var 94°C i 7 minutter (1 syklus): 94°C i 1 minutt, 65°C i 8 minutter (30 sykluser) og 65°C i 16 minutter. PCR reaksjonen inneholdt 50 ng DNA, PCR blanding (XNAT2 kit) og 0,3 uM BOXA1R primer (5-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3') (SEQ ID NO 5) (MWG Biotech, Tyskland). PCR reaksjonene ble utført på en Eppendorf termocykliseringsanord-ning. PCR produktene (1 ul) ble kjørt sammen med en molekylvekt markør (DNA 7500 stige, Agilent, Tyskland) ved å anvende DNA 7500 LabChip på Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, Tyskland). Strekkoden (PCR produkt profil) ble bestemt ved å anvende Agilent Bioanalyzer programvaren hvor topptall (PCR produkter) og størrelse ble identifisert (figur 1).

Antibiotiske sensitivitetsprofiler

[0081]Antibiotiske sensitivitetsprofiler av B. longum stammen ble bestemt ved å anvende "dise susceptibility" analysen. Kulturer ble dyrket i et passende buljong-medium i 24-48 timer, utplatet (100 ul) på agarmedier og skiver som inneholdt kjente konsentrasjoner av antibiotikaene ble anbrakt på agaren. Stammer ble undersøkt for antibiotikasensitivitet 1-2 døgn etter inkubasjon ved 37°C under anaerobe betingelser. Stammer ble betraktet til å være sensitive dersom inhiberingssoner på 1 mm eller større ble sett. Den minste inhiberende konsentrasjonen (MIC) for hvert antibiotika ble bestemt uavhengig. MIC for clindamycin, vancomycin og metronidazol var henholdsvis 0,032, 0,75 og >256.

Mage/ tarmgjennomgang

[0082]For å bestemme om Bifidobacterium longum kunne overleve ved lave pH verdier som er ekvivalente med dem som man finner i magen, ble bakterieceller høstet fra nylagede kulturer som var dyrket over natten, vasket to ganger i fosfatbuffer (pH 6,5) og resuspendert i TPY buljong justert til pH 2,5 (med 1M HCI). Celler ble inkubert ved 37°C og overlevelse ble målt ved intervaller på 5, 30, 60 og 120 minutter ved å anvende platetellemetoden. AH1205 overlevde godt i 5 minutter ved pH 2,5, mens ingen levedyktige celler ble oppdaget etter 30 minutter.

[0083]På vei ut fra magen, ble putative probiotika eksponert for gallesalter i tynn-tarmen. For å bestemme den evnen som B. longum har til å overleve eksponering for galle, ble kulturer strøket ut på TPY agarplater supplert med 0,3% (vekt/volum), 0,5%, 1%, 2%, 5%, 7,5% eller 10% porcine galle. B. longum AH1205 vekst ble observert på plater som inneholdt opp til 0,5% galle.

[0084]I en murin modell ble evnen hos B. longum AH 1205 til å passere mage/ tarmkanalen bestemt. Mus konsumerte 1x10<9>AH1205 daglig, og feces pelleter ble undersøkt for tilstedeværelsen av den tilførte mikroorganismen. Deteksjon av AH 1205 ble forenklet ved å isolere en spontan rifampicin-resistent variant av bifidobakeriene-innlemmelse av rifampicin i TPY platene anvendt for å bestemme passering forsikret at kun tilførte rifampicin-resistente bifidobakteriene ble dyrket. Feces prøver ble samlet daglig og B. longum passering gjennom mage/ tarm-kanalen ble bekreftet (figur 2).

Anti- mikrobiell aktivitet

[0085]De indikator-patogene mikroorganismene som anvendes i dette studium ble propagert i det etterfølgende medium under de etterfølgende vekstbetingelser: Salmonella typhimurium (37°C, aerob) i Tryptone Soya buljong/agar supplert med 0,6% gjærekstrakt (TSAYE, oksoid), Campylobacter jejuni (37°C, anaerob) og E. coli 0157:H7 (37°C, anaerob) på blodagarmedium, og Clostridium difficile (37°C, anaerob) i forsterket klostridiummedium (RCM, oksoid). Alle stammer ble inokulert i nylaget vekstmedium og dyrket over natten før de anvendes i forsøkene.

[0086]Antimikrobiell aktivitet ble detektert ved å anvende den utsatte metoden. Kort, ble B. longum AH 1205 inkubert i 36-48 timer. Ti-ganger seriefortynninger ble utplatet (100 ul) på TPY agar medium. Etter inkubasjon over natten, ble platene med distinkte kolonier dekket med indikatorbakterien. Indikatorplenen ble fremstilt ved å inokulere et smeltebelegg med 2% (volum/volum) av en over natten indikatorkultur som ble helt over overflaten av de inokulerte TPY platene. Platene ble re-inkubert over natten under betingelser som er egnet for vekst av indikatorbakterien. Indikatorkulturer med inhiberingssoner som er større enn 1 mm i radius ble betraktet til å være sensitive for testbakterien. B. longum AH1205 inhiberte veksten av alle de testede patogene organismene, med klare soner som målte 8,67, >80, 4,33 og 11,67 mm for henholdsvis Salmonella typhimurium, Campylobacter jejuni, E. coli 0157: H7 og Clostridium difficile.

Eksempel 2

[0087]Dette eksempel illustrerer cytokinproduksjon ved PBMCer som respons på B. longum. PBMCer ble isolert fra friske donorer ved densitetsgradientsentrifuge- ring. PBMCer ble stimulert med den probiotiske bakteriestammen i en 72 timers periode ved 37°C. På dette tidspunktet ble kultursupernatanter samlet, sentrifu-gert, delt i like deler og lagret ved -70°C inntil de ble målt for IL-10 nivåer ved å anvende cytometriske kuleanalyser (CBA) (BD BioSciences). AH 1205 induserte signifikant sekresjon av IL-10 ved humane PBMCer, som forslår at denne probiotiske stammen vil kunne indusere en anti-inflammatorisk respons in vivo (figur 3). Som et anti-inflammatorisk middel, kan den anvendes for å redusere og forebygge inflammasjon i mennesker.

Eksempel 3

[0088] Dette studium undersøkte om den probiotiske bakterien B. longum AH1205 svekker respiratorisk sykdom i en murin astmamodell. Mere spesifikt ble B. longum AH 1205 undersøkt for å bestemme om den vil kunne undertrykke allergiske responser i en OVA-sensibilisert musemodell med allergisk luftveisinflammasjon. Kort ble voksne BALB/c hannmus sensibilisert ved intra-peritoneal (IP) injeksjon av OVA på dag 0 og dag 6. På dager 12 og 14 ble mus eksponert intranasalt med OVA. Tjuefire timer etter den siste eksponering (dag 15), ble mus underkastet målinger av luftveisrespondering etterfulgt av BAL prosedyre. OVA/alum-sensibiliserte, saltvannseksponerte mus tjente som kontroller. Mus mottok probiotika eller placebo gjennom hele forsøket. Luftveisinflammasjon (cytokintall og celletall) ble bestemt ved antall inflammatoriske celler i BAL fluid. Luftveisrespondering ble også målt med å anvende Buxco plethysmografen for hele kroppen. Splenocytter ble også isolert fra OVA-sensibiliserte mus og ble inkubert i nærvær av anti-CD3 og anti-DC28 antistoffer hvoretter cytokinnivåer ble målt i supernatanten ved flow-cytometri.

[0089]B. longum AH 1205 bevirket ingen signifikant reduksjon i celler utvunnet fra BAL fluid etter OVA eksponering, sammenlignet med dyr som var tilført buljong (figur 4). Luftveisresponderbarhet ble målt og en eksponering av sensibiliserte mus med OVA resulterte i en økning i AHR overfor metacholin og sammenlignet med saltvannseksponerte mus. AH 1205 modulerer ikke denne økte luftveisresponderbarhet for metacholin, som bestemte forandringer i økt pause (figur 5).

[0090]BAL cytokinnivåer ble målt ved CBA og viste at dyr som var tilført AH1205 hadde signifikant reduserte TNF-a nivåer sammenlignet med OVA kontroll (figur 6C). Denne reduksjon av TNF-a nivåer foreslår at B. longum AH1205 kan svekke eller forhindre respiratorisk sykdom og undertrykke eller forhindre allergiske responser. Ingen signifikante forskjeller ble registrert for IL-10, IFN-y, IL-6 og CCL2 nivåer (figur 6).

Eksempel 4

[0091]Dette studium undersøkte effekten av probiotisk konsumering på regulerende T celle antall og aktivitet i friske mus. BALB/c mus (1 O/gruppe) fikk tilført B. longum AH 1205 eller placebo i tre uker. Etter konsumering av probiotika/ placebo, ble CD4<+>CD25<+>T-regulerende celler isolert og deres in vitro under-trykkende aktivitet ble bestemt ved å måle proliferasjon av anti-CD3/CD28 stimulerte CFSE-merkede CD4<+>responder T celler ved å anvende flow-cytometri. CD4<+>responder T-celler ble ko-inkubert med CD4+CD25~ T-celler som en kontroll. Prosentandelen CD4<+>CD25<+>celler (regulerende T-celler) i murine splenocytter som også var FoxP3 positive ble bestemt i milten til mus som var tilført probiotika eller placebo.

[0092]Prosentandelen CD4<+>celler som prolifererte når ko-inkubert med CD4<+>CD25<+>celler fra mus tilført probiotika/placebo ble sammenlignet med prosentandelen CD4<+>celler som prolifererte når ko-inkubert med CD4<+>CD25" celler fra det samme museforsøket. I hvert tilfelle var T-celleproliferasjon mindre i kulturer som inneholdt CD4<+>CD25<+>celler sammenlignet med kulturer som inneholdt CD4<+>celler alene og uten CD25<+>cellene (figur 7).

[0093]Prosentandelen celler i CD4<+>populasjonen som også var CD25<+>ble bestemt (figur 8). Gruppen som hadde fått tilført B. longum AH1205 hadde signifikant mere CD4<+>T-celler som var CD25<+>(dvs. T-regulerende celler) enn deres motstykker som hadde fått tilført placebo. Dette foreslår at prosentandelen T-regulerende celler i CD4<+>populasjonen økte signifikant når AH1205 ble tilført. Dette resultatet indikerer at AH 1205 administrering kan redusere eller forhindre inflammasjon i et menneske.

[0094]Antallet CD4<+>CD25<+>FoxP3<+>celler i hele splenocyttpopulasjonen av mus som hadde fått tilført probiotika eller placebo ble også bestemt. Antallet CD4<+>CD25<+>T-regulerende celler som uttrykker FoxP3 var uforandret i milten til mus som hadde fått tilført probiotika i forhold til mus som hadde fått tilført placebo eller mus uten tilførsel.

Eksempel 5

[0095]Bakteriefrire mus ble innkjøpt i 6 ukers alderen og ble holdt i den bakterie-frie enheten ved den biologiske serviceenheten i UCC. Dyr konsumerte den probiotiske stammen B. longum AH 1205 i 9 døgn eller forble bakteriefrie (kontroll). Induksjon av T-regulatoriske celler ble bestemt ved flow-cytometri og cytokinnivåer ble kvantifisert ved CBA.

[0096]AH 1205 passering ble bestemt ved å måle bifidobakterie-antallet på selektiv agar i løpet av studiet. AH 1205 passerte ikke tarmen i bakteriefrie mus i et målbart antall skjønt omtrent 1x10<9>organsimer ble administrert daglig. Dette resultat foreslår at ytterligere mikrobielle faktorer eller vertsfaktorer kreves for overlevelse av bifidobakterien i tarmen.

[0097]Mens AH 1205 ikke passerte tarmen i et detekterbart antall, interagerte bakteriene med vertens immunsystem. Antallet CD4<+>CD25<+>FoxP3<+>celler i den mesenteriske lymfeknuten og milt til AH1205-f6rede bakteriefrie dyr var signifikant økt etter 9 døgns foring (figur 9). Totale CD3/CD4 eller CD3/CD8 tellinger forble uendret.

[0098]Isolerte MLNC og splenocytter ble stimulert in vitro med anti-CD3/CD28 antistoffer eller LPS eller forble ustimulerte som negative kontroller. MLNC sekresjon av IL-6 og IFN-y, etter CD3/CD28 stimulering, var i alt vesentlig nedsatt i kultursupernatanter mens MCP-1 nivåer var signifikant undertrykket når mus ble pre-foret med AH1205 (figur 10). IL-10 nivåer ble tilsvarende mellom gruppene. Splenocytt-frigivelse av IL-6 og TNF-a var vesentlig, men ikke signifikant, nedsatt når pre-foret med AH 1205 (figur 11). Ingen signifikante forskjeller ble registrert for de ustimulerte eller LPS stimulerte kulturene men totalt ble mindre pro-inflammatorisk cytokinproduksjon observert fra B. longum AH1205-f6rede dyr. Igjen indikerer dette resultat at AH 1205 administrering kan redusere eller forhindre inflammasjon i et menneske.

Eksempel 6

[0099]Dette eksempel illustrerer stabiliteten av B. longum AH 1205. Stabiliteten av AH 1205 varierte over 3 måneder ved 30° C (figur 12). LGG var en dårlig utøver over testperioden med et 2 log fall over 3 måneders perioden mens stamme AH 1205 avtok i levedyktighet med opp til omtrent 1 logg over den samme testperioden.

[00100] Alle referanser som angitt i denne beskrivelsen som inkluderer, uten begrensning, alle vitenskapelige artikler, publikasjoner, patenter, patentsøknader, presentasjoner, tekster, rapporter, manuskripter, brosjyrer, bøker, internett-oppslag, tidsskrifter, artikler og periodiske artikler er herved innlemmet i sin helhet ved referanse. Omtalen av referansene heri en kun ment for å oppsummere for-fatternes påstander og ingen innrømmelse er gjort om at eventuelle referanser utgjør den kjente teknikk. Søkerne reserverer retten til å utfordre nøyaktigheten og relevansen til de angitte referanser.

[00101]Disse og andre modifikasjoner og variasjoner av den foreliggende oppfinnelse kan gjennomføres av en fagkyndig på området uten at man avviker fra oppfinnelsesrammen, som mere spesielt er angitt i de vedlagte kravene. I tillegg skal det forstås at aspekter av de forskjellige utførelsesformer kan byttes ut, både i sin helhet eller delvis. Videre vil en fagkyndig på området forstå at den foregående beskrivelse kun er eksempelvis og skal ikke begrense oppfinnelsen slik den er videre beskrevet i de vedlagte kravene. Rammen for de vedlagte kravene bør derfor ikke begrenses til beskrivelsen av versjonene som er inneholdt deri.

Claims (15)

1. Brystmelkerstatning for spedbarn, karakterisert vedat den omfatter en proteinkilde, en fettkilde, en karbohydratkilde og B. longum AH 1205.

2. Brystmelkerstatning for spedbarn som angitt i krav 1, hvori brystmelkerstatningen for spedbarn omfatter B. longum AH 1205 i området fra omtrent 1x10<4>cfu til omtrent 1x10<10>cfu per gram brystmelkerstatning for spedbarn.

3. Brystmelkerstatning for spedbarn som angitt i krav 1, hvori B. longum AH1205 er levedyktig.

3. Brystmelkerstatning for spedbarn som angitt i krav 1, hvori B. longum AH1205 er ikke-levedyktig.

5. Brystmelkerstatning for spedbarn som angitt i krav 1, som videre omfatter et ytterligere probiotika.

6. Brystmelkerstatning for spedbarn som angitt i krav 5, hvori det ytterligere probiotika omfatter LGG.

7. Brystmelkerstatning for spedbarn som angitt i krav 1, som ytterligere omfatter et prebiotika.

8. Brystmelkerstatning for spedbarn som angitt i krav 7, hvori prebiotikaet er valgt fra gruppen som består av laktulose, gluko-oligosakkarid, inulin, polydekstrose, galakto-oligosakkarid, frukto-oligosakkarid, isomalto-oligosakkarid, soyabønne oligosakkarider, laktosukrose, xylo-oligosakkarid og gentio-oligosakkarider.

9. Brystmelkerstatning for spedbarn som angitt i krav 1, som videre omfatter minst en LCPUFA.

10 Brystmelkerstatning for spedbarn som angitt i krav 1, som videre omfatter ARA og DHA.

11. Næringsmiddelprodukt for barn, karakterisert vedat det omfatter en proteinkilde, en fettkilde, karbohydratkilde og B. longum AH1205.

12. Fremgangsmåte for å redusere eller forhindre inflammasjon i et spedbarn eller et barn, karakterisert vedat den omfatter administrering av B. longum AH1205 til spedbarnet eller barnet.

13. Fremgangsmåte som angitt i krav 12, hvori reduksjonen eller forebyggingen av inflammasjon forbedrer allergier.

14. Fremgangsmåte som angitt i krav 12, hvori reduksjonen eller forebyggingen av inflammasjon forbedrer astma.

15. Fremgangsmåte som angitt i krav 12, hvori reduksjonen eller forebyggingen av inflammasjon forbedrer en sykdom som er valgt fra gruppen som består av diaré, respiratoiske infeksjoner og otitis media.