NO20100454A1

NO20100454A1 - Forbindelse og sammensetning for kontroll av bakterier og virus

Info

Publication number: NO20100454A1
Application number: NO20100454A
Authority: NO
Inventors: Adel El-Mowafi; Jose Miguel Troncoso Kirsten; Nestor Javier Gonzalez Foretic; Jorge Eduardo Pino Marambio; Jose L Gonzalez Vecino
Original assignee: Ewos Innovation As
Priority date: 2010-03-26
Filing date: 2010-03-26
Publication date: 2011-09-27
Also published as: WO2011119047A1; CL2012002654A1; CA2794480C; CA2794480A1; NO346522B1; NO20220848A1; EP2552431B1; WO2011119047A8; CL2015000848A1; NO348141B1; DK2552431T3; NO20121253A1; NO20140949A1; EP2552431A1

Abstract

Sammendrag Det beskrives en propyl-metyl-fenol-forbindelse eller sammensetning omfattende en propyl-metyl-fenol-forbindelse for anvendelse i behandling og/eller profylakse av salmonid rickettsial septikemi (SRS) og/eller sykdommer forårsaket av Piscirickettsia 5 salmonis, og/eller for anvendelse i dreping, bekjemping eller regulering av Pisciri-ckettsia salmonis, og for anvendelse i behandling og/eller profylakse av infeksiøs lakseanemi (ISA) og/eller sykdommer forårsaket av infektiøs lakseanemivirus, og/eller for anvendelse i dreping, bekjemping eller regulering av infektiøs lakse-anemivirus.

Description

Område for oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en propyl-metyl-fenol-forbindelse eller sammensetning omfattende en propyl-metyl-fenol-forbindelse for anvendelse i behandling og/eller profylakse av Salmonid rickettsial septikemi (SRS) og/eller sykdommer forårsaket av Piscirickettsia salmonis, og/eller for anvendelse i å drepe, bekjempe eller regulere Piscirickettsia salmonis, og for anvendelse i behandling og/eller profylakse av infektiøs lakseanemi (ISA) og/eller sykdommer forårsaket av infektiøs lakseanemivirus, og/eller for anvendelse i å drepe, bekjempe eller regulere infektiøs lakseanemivirus.

Salmonid rickettsial septicemia ( SRS), patogen agent Piscirickettsia salmonis

Salmonid rickettsial septicemia (SRS), også kjent som piscirickettsiose, er en fatal sykdom i salmonider. Selv om det etologiske agent for SRS ble identifisert på slutten av 1980-årene som Piscirickettsia salmonis, har antibiotika vist seg å ikke være noen suksess i behandling, grunnet, delvis den intracellulære natur til denne bakterie. Som en konsekvens av mangel på en levedyktig behandling, dør millioner av opp-drettetlaks av SRS hvert år kun i Sør-Chile.

Piscirickettsia salmonis er en liten, intracellulær bakterie som forårsaker en fatal septikemisk tilstand i salmonider. Siden innledende isolering i de sene 1980-årene, har P. salmonis vært den primære årsak for mortalitet i industrien i Chile. I løpet av 1995 døde mer enn 10 millioner laks i marin oppdrettsindustri. Mesteparten av tapet skyldes P. salmonis med den økonomiske effekt estimert til $49 millioner USD. På grunn av at P. salmonis er intracellulær (lever på innsiden av cellene av verten), er effektivitet av antibiotisk behandling av infisert laks dårlig. Vaksineutvikling har også vist seg å være vanskelig på grunn av den intracellulære natur til organismen. Bruk av antimikrobielle midler, så som oksolinisk syre, har vært utstrakt i en rekke år i Chile og nådde 127 tonn (aktiv forbindelse) i 2003. Intet antibiotisk eller kjemo-terapeutisk middel har vist seg å være vedvarende effektiv mot P. salmonis, og økende resistens har blitt til oppdaget. Utvikling av en bred antibiotisk resistens vil forårsake signifikante driftsproblemer og en betydelig finansiell effekt på industrien.

Infektiøs lakseanemi, og infektiøs lakseanemivirus ( ISAv)

Infektiøs lakseanemi (ISA) er et dobbelttrådet RNA-virus tilhørende Ortomykso-viridae. Viruset har forårsaket alvorlig økonomisk effekt i mange lakseproduserende regioner, inkluderende Chile, Norge, Skottland, Færøyene, Canada og USA. Sykdommen resulterer i alvorlig anemi i atlantisk laks, påvirker det bloddannende vev inkluderende milt, nyre og likeledes lever og hjerte. Ørret og andre marine orga-nismer kan være asymptomatiske bærere av sykdommen. Nivåer av mortalitet varierer sterkt, men økonomiske tap på opp til 90% har blitt registrert. Toppene på utbrudd forekommer generelt om våren og tidlig sommer med temperaturer rundt 10°C. ISA har forekommet i et temperaturområde av 3°C - 15°C. I 1997 ble ISA listet i European Union Directive 91/67EC og klassifisert som sykdom som en "List I disease".

Smittsom (infektiøs) lakseanemi eller anemi (ISA) er en viral sykdom i atlantisk laks ( Salmo salar) som påvirker fiskeoppdrett i Canada, Norge, Skottland og Chile, og forårsaker alvorlig tap av infiserte farmer.

Som navnet medfører, forårsaker den alvorlig anemi i infisert fisk. I motsetning til pattedyr så har de røde blodceller i fisk DNA, og kan bli infisert med virus. Fisken utvikler bleke gjeller, og svømmer nær vannoverflaten og gisper etter luft. Imidlertid, sykdommen kan også utvikles uten at fisken viser noen ytre tegn på sykdom, og fisken kan opprettholde en normal appetitt, og deretter plutselig dø. Sykdommen kan utvikle seg langsomt gjennom en infisert farm, og i de verste tilfeller kan dødsraten nærme seg 100%. Post-mortem-undersøkelser av fisken har vist et spekter av årsaker til døden. Lever og milt kan være oppsvulmet, blokkert eller delvis allerede død. Sirkulasjonssystemet kan stoppe å fungere, og blodet kan være kontaminert med døde blodceller. Røde blodceller som fremdeles er tilstede sprenges enkelt, og antallet umodne og skadete blodceller øker.

Infektiøs lakseanemi synes å være mest likt influensavirus. Dets overføringsmodus og naturlige reservoarer for infektiøs lakseanemivirus er ikke fullt forstått. I tillegg til atlantisk laks, kan både sea-run brun ørret ( Salmo trutta) og regnbueørret ( Oncorhynchus mykiss) infiseres, men de blir ikke syke, så det er tenkt mulig at disse arter kan virke som viktige bærere og reservoarer av viruset.

Viruset kan overleve i sjøvann og, ikke overraskende, en hovedrisikofaktor for mange infiserte oppdrettsanlegg er nærhet til et allerede infisert anlegg.

I det siste har det blitt vist at sjølus, en liten crustaceanparasitt som angriper den beskyttende mukus, skjell og skinn i laksen viste seg å bære viruset passivt på dets overflate og dets fordøyelseskanal, men overføring av sykdommen med sjølus har ikke blitt påvist ennå.

Det er derfor svært viktig å finne nye forbindelser og nye måter å behandle og hindre Piscirickettsia salmonis og ISAv-forårsakede sykdommer i fisk.

Det objektive tekniske problem ifølge foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe nye effektive midler og fremgangsmåter for å drepe eller regulere Piscirickettsia salmonis og ISAv.

Sammendrag av oppfinnelsen

I samsvar med det første aspekt av foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en propyl-metyl-fenol-forbindelse eller sammensetning omfattende en propyl-metyl-fenol-forbindelse for anvendelse i behandling og/eller profylakse av Salmonid rickettsial septikemi (SRS) og/eller sykdommer forårsaket av Piscirickettsia salmonis, og/eller for anvendelse i å drepe, bekjempe eller regulere Piscirickettsia salmonis.

I samsvar med et andre aspekt vedrører foreliggende oppfinnelse en propyl-metyl-fenol-forbindelse eller sammensetninger omfattende en propyl-metyl-fenol-forbindelse for anvendelse i behandling og/eller profylakse av infektiøs lakseanemi (ISA) og/eller sykdommer forårsaket av infektiøs lakseanemivirus, og/eller for anvendelse i å drepe, bekjempe eller regulere infektiøs lakseanemivirus.

I foretrukne utførelser av disse aspekter, er nevnte forbindelse isopropyl-metyl-fenol, mer fortrinnsvis 2-isopropyl-metyl-fenol, mer fortrinnsvis 2-isopropyl-2-metyl-fenol, dvs. carvacrol eller 2-isopropyl-5-metyl-fenol, dvs. tymol.

Fortrinnsvis, sammensetningen av nevnte første aspekt omfatter en blanding av carvacrol og tymol, og hvor konsentrasjonen er ca. 3,7 mg/l applisert til en vandig lokalisasjon, og ca. 15 mg/kg som en komponent i et for.

Fortrinnsvis, sammensetningen av det andre aspekt omfatter en blanding av carvacrol og tymol, og hvor konsentrasjonen er ca. 100 mg/l applisert til en vandig lokalisasjon, og ca. 120 mg/kg som en komponent i et for.

Fortrinnsvis, forholdet av carvacrol:tymol er i området 1:3 til 3:1, mer fortrinnsvis 1:2 til 2:1, og mest foretrukket ca. 1:1, basert på vekt.

Fortrinnsvis, nevnte fisk er en salmonidae, mer fortrinnsvis en fisk valgt blant gruppen som består av atlantisk laks ( Salmo salar), regnbueørret ( Oncorhynchuss mykiss), sølvlaks ( Oncorhynchus kisutch) og arktisk ørret ( Salvelinus alpinus).

Et tredje aspekt av foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for å drepe, bekjempe eller regulere Piscirickettsia salmonis, hvor fremgangsmåten omfatter å applisere en propyl-metyl-fenol-forbindelse eller en sammensetning omfattende en propyl-metyl-fenol-forbindelse.

Et fjerde aspekt av foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for å drepe, bekjempe eller regulere infektiøs lakseanemivirus, hvor fremgangsmåten omfatter å applisere en propyl-metyl-fenol-forbindelse eller en sammensetning omfattende en propyl-metyl-fenol-forbindelse.

Fortrinnsvis, nevnte propyl-metyl-fenol-forbindelse appliseres til en lokalisasjon som ønskes beskyttet fra nevnte bakterie eller virus.

Fortrinnsvis, nevnte lokalisasjon er et vandig miljø hvor propyl-metyl-fenol-forbindelsen appliseres direkte til den vandige lokalisasjon.

Fortrinnsvis, nevnte lokalisasjon inneholder fisk som er mottakelige til infeksjon forårsaket av Piscirickettsia salmonis eller infektiøs lakseanemi, hvor propyl-metyl-fenol-forbindelsen appliseres direkte til fisken, fortrinnsvis med topikal eller oral applisering.

Fortrinnsvis, propyl-metyl-fenol-forbindelsen appliseres til fisken som en komponent i foret som mates til fisken.

Fortrinnsvis, forbindelsen er isopropyl-metyl-fenol, fortrinnsvis 2-isopropyl-metyl-fenol, mer fortrinnsvis 2-isopropyl-2-metyl-fenol, dvs. carvacrol eller 2-isopropyl-5-metyl-fenol, dvs. tymol.

Fortrinnsvis, sammensetningen omfatter en blanding av carvacrol og tymol, mer fortrinnsvis i området fra 1:3 til 3:1, mer fortrinnsvis 1:2 til 2:1, og mest fortrinnsvis ca. 1:1, basert på vekt.

Fortrinnsvis, nevnte fisk er en salmonidae, fortrinnsvis valgt blant gruppen som består av atlantisk laks ( Salmo salar), regnbueørret ( Oncorhynchuss mykiss), coho-laks ( Oncorhynchus kisutch) og arktisk ørret ( Salvelinus alpinus).

Oppfinnelsen vedrører også anvendelse av en forbindelse eller sammensetning i samsvar med et av kravene 1, og 3 til 10, for fremstilling av et farmasøytisk og/eller en nutrasøytisk sammensetning for hindring og/eller behandling av salmonid rickettsial septikemi (SRS).

Oppfinnelsen vedrører også anvendelse av en forbindelse eller sammensetning i samsvar med et av kravene 2, og 3 til 10, for fremstilling av en farmasøytisk og/eller nutrasøytisk sammensetning for hindring og/eller behandling av infektiøs lakseanemi

(ISA).

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Utførelse av oppfinnelsen vil nå bli beskrevet, ved hjelp av eksempler.

Eksperimentell seksjon

Eksempel 1 - effekt av carvacrol på Piscirickettsia salmonis

Formålet med dette forsøk er å evaluere effektiviteten av carvacrol, og en kombina-sjon av carvacrol og tymol mot Piscirickettsia salmonis ( P. salmonis) med in vitro bestemmelse av Minimum Inhibitorisk Konsentrasjon (MIC).

Materialer og metoder

Fremstilling av testforbindelsene

Fremstilling av arbeidsløsninger av carvacrol og tymol ble utført av Laboratory of Ecological Chemistry, Faculty of Chemistry, Universidad de La Frontera, Temuco, Chile. Carvacrol (Sigma Aldrich 98% standard kvalitet) ble fortynnet i destillert vann/etanol-løsning opp til 200 ppm (benevnt "CAR1"). Carvacrol + tymol (Sigma Aldrich 98% standard kvalitet) 1:1 (volum:volum) ble fortynnet i DMSO/destillert vann ved 200 ppm (benevnt "CAR2"). Alle produkter, forrådsløsninger og arbeidsløsninger ble lagret under avkjøling (4°C) og ble håndtert under et laminært strømnings-kammer for å unngå kontaminering av produktene som skal evalueres.

Antibakteriell effektivitet

Evalueringen av MIC av de forskjellige løsninger av carvacrol og tymol mot P. salmonis ble utført ved ADL Diagnostics, Puerto Montt, Chile. Seks forskjellige isolater av P. salmonis ble oppnådd fra kliniske tilfeller mottatt ved ADL Diagnostics og fikk vokse ved 18°C i agar PSA1, spesifikk for P. salmonis. De forskjellige isolater ble bekreftet med TaqMan® RT-PCR (A. Casanova, J. Obreque C, A.M. Sandino G. og J. Jashés. 2001. tRNA-gener ble funnet i Piscirickettsia salmonis 16S-23S rDNA spacer region (ITS). FEMS Microbiology Letters. Vol. 197: 19-22)

(http://www3.appliedbiosystems.com/). Isolater ble merket som: Ps1: PM-10908; Ps": PM-10877; Ps3: PM10795; Ps4: PM-10766; Ps5: PM-10727 og Ps6: PM-10707.

Minimum inhibitorisk konsentrasjon ( MIC)

MIC for de seks isolater ble bestemt ved anvendelse av en standardisert metode på National Comitee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 2005) basert på standard M49-P (2005), som involverer å utføre serielle fortynninger av produktet (100; 50; 25; 12,5; 6,25; 3,1; 1,5; 0,7; 0,35; 0,18; 0,09 ppm) for å bestemme den minimale konsentrasjon som inhiberer bakteriell vekst.

Inokulum fra rene isolater i agar PSA ble opptatt for å oppnå en konsentrasjon av 0,5 McF, som ble utsådd med de forskjellige fortynninger av testforbindelser for å evaluere antibakteriell effekt i dyrkningsmikroplatene. Mikroplatene ble inkubert ved 18°C i 241. Deretter ble en avskrelling utført med hver fortynning på en agar plate PSA, som deretter ble inkubert i 10 dager for å observere vekst av P. salmonis.

Resultater og diskusjon

MIC for carvacrol (CAR1) nådde en verdi i området 3,7 til 7,4 ppm. For det bestemte tilfellet av CAR2 ble MIC oppnådd på 3,7 ppm i alle isolatene som ble testet, noe som indikerer at tymol ville forsterke den antibakterielle virkning av carvacrol alene (Tabell 1).

Følgende konklusjoner kan trekkes fra dette eksperiment:

1. Carvacrol inhiberer vekst av en populasjon av P. salmonis i et in vitro forsøk.

2. Den estimerte MIC for carvacrol var mellom 3,7 og 7,4 ppm.

3. Den estimerte MIC for carvacrol og tymol var ca. 3,7 ppm, noe som indikerer at tymol forsterker den antibakterielle virkning.

Eksempel 2 ( Bioanalvse # 4)

ISAv er et alvorlig problem for chilensk lakseindustri med en høy registrering av mortaliteter i de siste to år.

Det objektive formål med forliggende forsøk er å undersøke den antivirale effektivitet av carvacrol og tymol mot ISAv.

Materialer og metoder

Fremstilling av produktene

Fremstilling av arbeidsløsninger av carvacrol ble utført av Laboratory of Ecological Chemistry, Faculty of Chemistry, Universidad de La Frontera, Temuco, Chile. Carvacrol (Signa Aldrich 98% standard kvalitet) ble fortynnet i destillert vann/etanol-løsning opp til 200 ppm (benevnt "CAR1"). Alle produkter, forholdsløsning og arbeidsløsninger ble lagret under kjøling (4°C) og ble håndtert under laminær strømningskammerfor å unngå kontaminering av produktene som skal evalueres.

Stamme av ISAv

Det ble anvendt en stamme av ISAv oppnådd fra ADL Diagnostic (ADL-PM3205-ISAV-07), som ble isolert fra en nyre av atlantisk laks (ASK-1) innfestet med ISAv i Isla Lemuy, Chiloé, Chile. Det isolerte virus ble bekreftet, gjennom Indirekte immunfluorescense (IFAT) og RT-PCR.

Utfordring med ISAv

Elleve fortynninger ble fremstilt med carvacrol (100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,1, 1,5, 0,7, 0,35, 0,18, 0,09 mg/l). Hver fortynning ble utfordret med ISAv i en konsentrasjon av 107 25TCID50 (median vevsdyrkningsinfektiv dosering; den mengde av et patogent middel som vil produsere patologisk forandring i 50% av cellekulturene som er inokulert), i løpet av 30, 60, 120 og 360 minutter). Deretter ble hver fortynning av carvacrol med ISAv inokulert i et monosjikt av ASK-1-celler (Atlantic salmon Kidney-1 celler, isolert og opprettholdt i ADL Diagnostic) og inkubert i 10 dager. Nærvær av ISAv i hvert sjikt av celler ble bestemt, gjennom IFAT (indirekte fluorescent antistofftest).

Resultater

Carvacrol viste en effekt mot ISAv i høy fortynning (100 mg/l) testet in vitro, etter virusadsorpsjon (Tabell 2). Etter 60 minutter inhiberte carvacrol replikasjon av ISAv i alle replika.

Følgende konklusjoner oppnås fra dette eksperiment:

1. Carvacrol bevises å elimininere ISAv før adsorpsjon.

2. Den estimerte fortynning hvor carvacrol eliminerer ISAv er 100 ppm, etter 60 minutters utfordring med viruset.

Definisjoner anvendt i søknaden

Propyl-metyl-fenyl er en fenolforbindelse substituert med propyl og metyl på den aromatiske ringstruktur.

Carvacrol er forbindelsen 5-isopropyl-2-metylfenol (C6H3CH3(OH)(C3H7)), og er en monoterpenoidfenol. Den har en karakteristisk skarp, varm lukt av oregano og en pizzalignende smak. Den er tilstede i den essensielle olje av Origanum vulgare, olje fra timian, og olje oppnådd fra karse og vill bergamott.

Tymol er forbindelsen 5-isopropyl-2-metylfenol, og er en monoterpenoidfenolderivat av cymol, isomerisk med carvacrol, funnet i timianolje, og ekstrahert som en hvit krystallinsk substans med en god aromatisk lukt og sterke antiseptiske egenskaper.

Claims

1. Propyl-metyl-fenol-forbindelse eller sammensetning omfattende en propyl-metyl-fenol-forbindelse for anvendelse i behandling og/eller profylakse av Salmonid rickettsial septikemi (SRS) og/eller sykdommer forårsaket av Piscirickettsia salmonis, og/eller for anvendelse i dreping, bekjemping eller regulering av Piscirickettsia salmonis.

2. Propyl-metyl-fenol-forbindelse eller sammensetning omfattende en propyl-metyl-fenol-forbindelse for anvendelse i behandling og/eller profylakse av infektiøs lakseanemi (ISA) og/eller sykdommer forårsaket av infektiøs lakseanemivirus og/eller for anvendelse i dreping, bekjemping eller for regulering av infektiøs lakseanemivirus.

3. Forbindelse i samsvar med krav 1 eller 2, hvor nevnte forbindelse er isopropyl-metyl-fenol.

4. Forbindelse i samsvar med krav 1 eller 2, hvor nevnte forbindelse er 2-isopropyl-metyl-fenol.

5. Forbindelse i samsvar med krav 1 eller 2, hvor nevnte forbindelse er 2-isopropyl-2-metyl-fenol, dvs. carvacrol.

6. Forbindelse i samsvar med krav 1 eller 2, hvor nevnte forbindelse er 2-isopropyl-5-metyl-fenol, dvs. tymol.

7. Sammensetning i samsvar med krav 1, hvor nevnte sammensetning omfatter en blanding av carvacrol og tymol, og hvor konsentrasjonen er ca. 3.7 mg/l applisert til en vandig lokalisasjon, og ca. 15 mg/kg som en komponent i et for.

8. Sammensetning i samsvar med krav 2, hvor sammensetningen omfatter en blanding av carvacrol og tymol, og hvor konsentrasjonen er ca. 100 mg/l applisert til en vandig lokalisasjon, og ca. 120 mg/kg som en komponent i et for.

8. Sammensetning i samsvar med krav 7, hvor forholdet carvacrohtymol er i området 1:3 til 3:1, mer fortrinnsvis 1:2 til 2:1, og mest fortrinnsvis ca. 1:1, basert på vekt.

9. Forbindelse eller sammensetning i samsvar med et av kravene 1-7, hvor nevnte fisk er en salmonidae.

10. Forbindelse eller sammensetning i samsvar med et av kravene 1-9, hvor nevnte fisk er valgt blant gruppen som består av atlantisk laks ( Salmo salar), regnbueørret ( Oncorhynchuss mykiss), sø/vlaks ( Oncorhynchus kisutch) og arktisk ørret ( Salvelinus alpinus).

11. Fremgangsmåte for å drepe, bekjempe eller regulere Piscirickettsia salmonis, hvor fremgangsmåten omfatter å applisere en propyl-metyl-fenol-forbindelse eller en sammensetning omfattende en propyl-metyl-fenol-forbindelse.

12. Fremgangsmåte for å drepe, bekjempe eller regulere infektiøs lakseanemivirus, hvor fremgangsmåten omfatter å applisere en propyl-metyl-fenol-forbindelse eller en sammensetning omfattende en propyl-metyl-fenol-forbindelse.

13. Fremgangsmåte i samsvar med krav 11 eller 12, hvor nevnte propyl-metyl-fenol-forbindelse appliseres til en lokalisasjon som skal beskyttes fra nevnte bakterie eller virus.

14. Fremgangsmåte i samsvar med krav 13, hvor nevnte lokalisasjon er et vandig miljø og hvor nevnte propyl-metyl-fenol-forbindelse appliseres direkte til det vandige miljø.

15. Fremgangsmåte i samsvar med krav 13,karakterisert vedat nevnte lokalisasjon inneholder fisk og hvor disse er mottakelige for infeksjoner forårsaket av Piscirickettsia salmonis eller infektiøs lakseanemivirus, hvor nevnte propyl-metyl-fenol-forbindelse appliseres direkte til fisken, fortrinnsvis med topikal eller oral applisering.

16. Fremgangsmåte i samsvar med krav 15,karakterisert vedat nevnte propyl-metyl-fenol-forbindelse appliseres til fisken som en komponent i foret som mates til fisken.

17. Fremgangsmåte i samsvar med et av kravene 11-16, hvor nevnte forbindelse er isopropyl-metyl-fenol, fortrinnsvis 2-isopropyl-metyl-fenol.

18. Fremgangsmåte i samsvar med et av kravene 11-17,karakterisertved at nevnte forbindelse er 2-isopropyl-2-metyl-fenol, dvs. carvacrol.

19. Fremgangsmåte i samsvar med et av kravene 11-19,karakterisertved at nevnte forbindelse med 2-isopropyl-5-metyl-fenol, dvs. tymol.

20. Fremgangsmåte i samsvar med krav 11 eller 12,karakterisert vedat sammensetningen omfatter en blanding av carvacrol og tymol.

21. Fremgangsmåte i samsvar med krav 20,karakterisert vedat forholdene carvacrol:tymol er i området av ca. 1:3 til 3:1, mer fortrinnsvis 1:2 til 2:1, og mest fortrinnsvis ca. 1:1, basert på vekt.

22. Fremgangsmåte i samsvar med et av de foregående fremgangsmåtekrav,karakterisert vedat nevnte laks er en salmonidae.

23. Fremgangsmåte i samsvar med krav 22,karakterisert vedat nevnte fisk er valgt blant gruppen som består av atlantisk laks ( Salmo salar), regnbueørret ( Oncorhynchuss mykiss), sø/vlaks { Oncorhynchus kisutch) og arktisk ørret ( Salvelinus alpinus).

24 Anvendelse av en forbindelse eller sammensetning i samsvar med et av kravene 1, og 3-10, for fremstilling av en farmasøytisk og/eller nutrasøytisk sammensetning for hindring og/eller behandling av salmonid rickettsial septikemi (SRS).

25. Anvendelse av en forbindelse eller sammensetning i samsvar med et av kravene 2, og 3-10, for fremstilling av en farmasøytisk og/eller nutrasøytisk sammensetning for hindring og/eller behandling av infektiøs lakseanemi (ISA).