NO163699B

NO163699B - PROCEDURE AND REAGENT COMBINATION FOR DIAGNOSIS OF MICROORGANISMS.

Info

Publication number: NO163699B
Application number: NO83832061A
Authority: NO
Inventors: Tuula Marjut Ranki; Hans Erik Soederlund
Original assignee: Orion Yhtymae Oy
Priority date: 1981-10-16
Filing date: 1983-06-07
Publication date: 1990-03-26
Also published as: NO832061L; NO163699C

Abstract

Mikrobiell diagnostisk metode basert på en sandwlch-hybridisering av nukleinsyrer på en fast bærer, samt en reagenskombinasjon for anvendelse ved metoden. Den metode som er beskrevet kan anvendes for å identifisere, ut fra en enkelt prøve som inneholder nukleinsyrer i de mikroorganismer eller mikrobielle grupper som skal diagnostiseres, etter først A gjøre nevnte nukleinsyrer enkelt-strenget, alle mikroorganismene eller de mikrobielle grupper ved å sette til prøven to nukleinsyrereagenser for hver mikroorganisme eller mikrobiell gruppe som skal diagnostiseres, hvorav ett nukleinsyrereagens er festet til en fast bærer i den enkelt-strengede form og det annet inneholder et helt annerledes nukleinsyrefragment fra den samme mikroorganisme eller mikrobielle gruppe, som er merket med en etablert markør. Det gjenkjennende nukleinsyrefragment hybridiserer til en komplementær enkelt-strenget nukleinsyre fra prøven, og det hybrid som således dannes på den partikkelformige bærer blir merket når det komplementære, merkede nukleinsyrefragment fester seg til den enkelt-strengede nukleinsyre som stammer fra prøven. Fordi de merkede nukleinsyrereagenser ikke alene hybridiserer med den faste bærer, blir bare de bærere som inneholder nukleinsyrereagenser som tilsvarer nukleinsyrer i prøven, merket. Merkingen måles ved etablerte metoder.Microbial diagnostic method based on a sandwich hybridization of nucleic acids on a solid support, as well as a reagent combination for use in the method. The method described can be used to identify, on the basis of a single sample containing nucleic acids in the microorganisms or microbial groups to be diagnosed, after first A making said nucleic acids single-stranded, all the microorganisms or the microbial groups by adding to the sample two nucleic acid reagents for each microorganism or microbial group to be diagnosed, one of which nucleic acid reagent is attached to a solid support in the single-stranded form and the other contains a completely different nucleic acid fragment from the same microorganism or microbial group, which is labeled with an established marker . The recognizing nucleic acid fragment hybridizes to a complementary single-stranded nucleic acid from the sample, and the hybrid thus formed on the particulate carrier is labeled when the complementary, labeled nucleic acid fragment attaches to the single-stranded nucleic acid derived from the sample. Because the labeled nucleic acid reagents do not hybridize alone with the solid support, only those carriers that contain nucleic acid reagents that correspond to nucleic acids in the sample are labeled. The marking is measured by established methods.

Description

Oppfinnelsen vedrører en mikrobiell diagnostisk metode for samtidig identifisering av en eller flere mikroorganismer og/eller mikrobielle grupper. Metoden er basert på "sandwich"-hybridisering av nukleinsyrer på en fast bærer. Oppfinnelsen vedrorer også en serie av reagenskombinasjoner for anvendelse ved denne metode. The invention relates to a microbial diagnostic method for the simultaneous identification of one or more microorganisms and/or microbial groups. The method is based on "sandwich" hybridization of nucleic acids on a solid support. The invention also relates to a series of reagent combinations for use in this method.

I tradisjonelle mikrobielle diagnoser demonstreres nærvær In traditional microbial diagnoses, presence is demonstrated

av en mikroorganisme i en gitt prøve ved isolering av den aktuelle mikroorganisme. Etter anrikningsdyrkning identifiseres mikroorganismen enten på basis av sine biokjemiske egenskaper eller ved anvendelse av immunologiske metoder. Denne type diagnose krever at mikroorganismen i prøven er levedyktig. Identifisering ved isolering er videre en arbeidskrevende metode, som i tilfellet med virus kan kreve 4-6 uker. of a microorganism in a given sample by isolating the relevant microorganism. After enrichment cultivation, the microorganism is identified either on the basis of its biochemical properties or by using immunological methods. This type of diagnosis requires that the microorganism in the sample is viable. Identification by isolation is also a labour-intensive method, which in the case of viruses can require 4-6 weeks.

Formålet med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe The purpose of the present invention is to provide

en diagnostisk metode hvor nærvær av en mikroorganisme i en prøve demonstreres ved identifisering av dens genetiske materiale, nukleinsyren, ved hjelp av den sensitive og spesifikke nukleinsyre-hybridiseringsteknik-k. I seg selv er nukleinsyre-hybridisering en gammel og velkjent metode for undersøkelse av identi-teten til nukleinsyrer. Komplementære nukleinsyretråder har evne til å danne en tett dobbelttrådet struktur i henhold til reglene med pardannelse av baser, og den resulterende hybrid kan separeres fra den residuelle enkelt-trådede nukleinsyre. a diagnostic method where the presence of a microorganism in a sample is demonstrated by identifying its genetic material, the nucleic acid, by means of the sensitive and specific nucleic acid hybridization technique-k. In itself, nucleic acid hybridization is an old and well-known method for investigating the identity of nucleic acids. Complementary nucleic acid strands have the ability to form a tight double-stranded structure according to the rules of base pairing, and the resulting hybrid can be separated from the residual single-stranded nucleic acid.

Noen metoder som er basert på identifisering av nukleinsyre (r) er allerede blitt anvendt på mikrobielle diagnoser. Enterotoksigen Escherichia coli er identifisert fra faekal-prøver ved kolonihybridisering under anvendelse av genet for toksinproduksjon som en sonde. Positiv hybridisering er demon-strert ved autoradiografi (Moseley, S.L. et al., J. Infect. Dis. Some methods that are based on the identification of nucleic acid(s) have already been applied to microbial diagnoses. Enterotoxigenic Escherichia coli has been identified from faecal samples by colony hybridization using the gene for toxin production as a probe. Positive hybridization has been demonstrated by autoradiography (Moseley, S.L. et al., J. Infect. Dis.

(1980) 142, 892-898). Kolonihybridisering er basert på den (1980) 142, 892-898). Colony hybridization is based on it

metode som opprinnelig ble utviklet av Griinstein og Hogness (Proe. Nati. Acad. Sei. USA (1975) 72, 3961-3965). Hybridisering er også anvendt som en metode for å skjelne mellom Herpes simplex virus type 1 og type 2 (Brautigam, A.R. et al., J. Clin.Microbiol method originally developed by Griinstein and Hogness (Proe. Nati. Acad. Sei. USA (1975) 72, 3961-3965). Hybridization has also been used as a method to distinguish between Herpes simplex virus type 1 and type 2 (Brautigam, A.R. et al., J. Clin.Microbiol

(1980) 12, 226-234), imidlerid ikke i hurtig diagnostikk, men (1980) 12, 226-234), however not in rapid diagnostics, but

ved typifisering av viruset etter anrikningsdyrkning. I denne metode separeres den dobbelt-trådede hybrid fra fraksjonen av nukleinsyrer gjenværende enkelt-strenget i løsningen ved affinitets-kromatografi. by typing the virus after enrichment culture. In this method, the double-stranded hybrid is separated from the fraction of nucleic acids remaining single-stranded in the solution by affinity chromatography.

Det ble nylig publisert at DNA fra celler infisert med Epstein-Barr-virus (prøven) etter egnet forhåndsbehandling ble fiksert direkte på filterne. Den aktuelle nukleinsyre identifiseres ved hybridisering av filterne med den radioaktive sonde, It was recently published that DNA from cells infected with Epstein-Barr virus (the sample) after suitable pretreatment was fixed directly on the filters. The relevant nucleic acid is identified by hybridization of the filters with the radioactive probe,

og positiv hybridisering påvises ved autoradiografi (Brandsma, and positive hybridization is demonstrated by autoradiography (Brandsma,

I. og Miller, K. (1980) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77, 6851-6855). I. and Miller, K. (1980) Proe. Nati. Acad. Pollock. USA 77, 6851-6855).

En lignende metode som angitt ovenfor er beskrevet i BRD-off.skrift nr. 2.950.295 og i Lancet av 10.okt. 1982, A similar method as indicated above is described in BRD official publication no. 2,950,295 and in the Lancet of 10 Oct. 1982,

s. 765-767. I det nevnte off.skrift er det beskrevet en frem-gangsmåte for fremstilling av en radioaktivt merket DNA-sonde ved hjelp av rekombinante DNA-teknikker. Denne DNA-sonde lages av hepatitis B virus. I Lancet er anvendelse av denne sonde ved en metode for påvisning av hepatitis B virus beskrevet. Ved denne metode overføres DNA fra prøven til et nitrocellulosefilter, og den fikserte hepatitis DNA fra prøven påvises ved anvendelse av sonden som reagens. pp. 765-767. In the aforementioned publication, a procedure for producing a radioactively labeled DNA probe using recombinant DNA techniques is described. This DNA probe is made by the hepatitis B virus. In the Lancet, the use of this probe in a method for detecting the hepatitis B virus is described. In this method, DNA from the sample is transferred to a nitrocellulose filter, and the fixed hepatitis DNA from the sample is detected using the probe as a reagent.

Fordi to. reagenser anvendes, er vår metode meget mer spesifikk enn den metode som er beskrevet ovenfor og gjør det mulig å konstruere forskjellige sett ved hjelp av hvilke ulike mikrober eller mikrobielle grupper kan påvises fra den samme prøve uten å forstyrre spesifisiteten til testen for hver mikrobe eller mikrobiell gruppe som kommer på tale. Ved frem-gangsmåten i henhold til oppfinnelsen anvendes to forskjellige nukleinsyrefragmentreagenser - det ene festet til en fast bærer, det annet merket på egnet måte - og DNA-prøven er i flytende tilstand. Det henvises forøvrig til krav 1 og 2. Because two. reagents are used, our method is much more specific than the method described above and makes it possible to construct different kits by means of which different microbes or microbial groups can be detected from the same sample without disturbing the specificity of the test for each microbe or microbial group in question. In the method according to the invention, two different nucleic acid fragment reagents are used - one attached to a solid support, the other labeled in a suitable way - and the DNA sample is in a liquid state. Reference is also made to requirements 1 and 2.

Den oppfinnelse som her er beskrevet er basert på sandwich-hybridiseringsteknikken (Dunn, A.R. og Hassel, J.A. (1977) The invention described here is based on the sandwich hybridization technique (Dunn, A.R. and Hassel, J.A. (1977)

Cell 12, 23-36), som forenkler håndtering av prøven og påvisningen av hybriden. Av denne grunn er teknikken spesielt egnet for diagnostisk anvendelse. Cell 12, 23-36), which simplifies the handling of the sample and the detection of the hybrid. For this reason, the technique is particularly suitable for diagnostic use.

I den metode som er beskrevet her, kan alle de ønskede mikroorganismer eller mikrobielle grupper identifiseres fra én og samme prøve som inneholder denaturerte enkelt-trådede nukleinsyrestrenger av de mikroorganismer eller mikrobielle grupper som skal identifiseres, uten oppdeling av prøve. Metoden krever to nukleinsyrereagenser for hver mikroorganisme eller gruppe av mikroorganismer som skal identifiseres. Reagensene er to separate nukleinsyrefragmenter som stammer fra genomet til den mikroorganisme som skal identifiseres, som ikke har noen sekvens felles, men som fortrinnsvis er beliggende nær hverandre i genomet. Reagensene kan fremstilles direkte fra de mikrobielle genomer eller ved å anvende de etablerte rekombinant-DNA-teknikker. Av de to nukleinsyrefragmenter fikseres ett til en fast bærer, fortrinnsvis et nitrocellulosefilter, etter at det er denaturert, og det annet, også i enkelt-trådet form, merkes på egnet måte radioaktivt. Når disse nukleinsyrereagenser, to ulike reagenser for hver mikroorganisme eller mikrobiell gruppe som skal identifiseres, anbringes i kontakt med de enkelt-trådede nukleinsyrer som skal identifiseres i prøven, In the method described here, all the desired microorganisms or microbial groups can be identified from one and the same sample containing denatured single-stranded nucleic acid strands of the microorganisms or microbial groups to be identified, without splitting the sample. The method requires two nucleic acid reagents for each microorganism or group of microorganisms to be identified. The reagents are two separate nucleic acid fragments originating from the genome of the microorganism to be identified, which have no sequence in common, but which are preferably located close to each other in the genome. The reagents can be prepared directly from the microbial genomes or by using the established recombinant DNA techniques. Of the two nucleic acid fragments, one is fixed to a solid support, preferably a nitrocellulose filter, after it has been denatured, and the other, also in single-stranded form, is labeled radioactively in a suitable manner. When these nucleic acid reagents, two different reagents for each microorganism or microbial group to be identified, are placed in contact with the single-stranded nucleic acids to be identified in the sample,

kobles nukleinsyrene til de komplementære nukleinsyrefragmenter på den faste bærer. De hybrider,som således dannes på bæreren blir merket etter hybridiseringen med de merkede komplementære nukleinsyrefragmenter. De merkede nukleinsyrefragmenter hybridiserer ikke alene til de nukleinsyrefragmenter som er knyttet til bæreren, men bare til de tilsvarende enkelt-trådede. nukleinsyrer som stammer fra prøven. Således kan bare de bærere til hvilke de komplementære nukleinsyrer fra prøven har hybridisert, bli merket. Disse bærere kan lett vaskes og merkingen måles ved etablerte metoder. the nucleic acids are linked to the complementary nucleic acid fragments on the solid support. The hybrids thus formed on the carrier are labeled after the hybridization with the labeled complementary nucleic acid fragments. The labeled nucleic acid fragments do not hybridize alone to the nucleic acid fragments that are attached to the carrier, but only to the corresponding single-stranded ones. nucleic acids originating from the sample. Thus, only the carriers to which the complementary nucleic acids from the sample have hybridized can be labeled. These carriers can be easily washed and the marking measured using established methods.

Metoden i henhold til oppfinnelsen kan i prinsippet anvendes for identifisering av alle organismer som enten inneholder DNA eller RNA, f.eks. virus, bakterier, fungus og The method according to the invention can in principle be used for the identification of all organisms that either contain DNA or RNA, e.g. viruses, bacteria, fungus and

gjær. Metoden har den spesifikke fordel at den tillater identifisering av alle bakterier og viruser som det er mulig kan komme på tale på samme tid og fra samme prøve, uten hensyntagen til om mikroorganismene inneholder DNA eller RNA. Ved egnet kombinasjon av reagenser er det mulig å utvikle "sett", slik at hver mikroorganisme som skal identifiseres har sin egen faste bærer utstyrt med en merkelapp og et merket nukleinsyrereagens. Alle de filtre som er inkludert i reagenskombinasjonen kan settes til prøven samtidig, sammen med de merkede nukleinsyrereagenser. Når hybridiseringen har funnet sted, vaskes de faste bærere og merkingen måles. Den eneste bærer som skal merkes er den ene som inneholder sekvenser komplementært til den mikrobielle genom i den undersøkte prøve. yeast. The method has the specific advantage that it allows the identification of all possible bacteria and viruses at the same time and from the same sample, regardless of whether the microorganisms contain DNA or RNA. With a suitable combination of reagents, it is possible to develop "kits", so that each microorganism to be identified has its own solid carrier equipped with a label and a labeled nucleic acid reagent. All the filters included in the reagent combination can be added to the sample at the same time, together with the labeled nucleic acid reagents. When the hybridization has taken place, the solid supports are washed and the labeling is measured. The only carrier to be labeled is the one that contains sequences complementary to the microbial genome in the examined sample.

Kombinasjonen av metode og reagenser kan anvendes f.eks. The combination of method and reagents can be used e.g.

i medisinsk mikrobiologi, veterinær-mikrobiologi, matvarehygiene-undersøkelser og mikrobiell diagnostikk av plantesykdommer. Egnede prøvematerialer er f.eks. alle dyre- og plante-vev-homogenater, slike pasientsekresjoner som blod, faeces og nasal og uretral slimhinne. Det kan vurderes at metoden er til-strekkelig sensitiv til å oppdage de mikrobenivåer som normalt er til stede i kliniske prøver. Foreløpig anrikning av den mikroorganisme som er til stede i prøven, ved dyrkning, er naturligvis mulig før identifikasjonstesten og ville i noen tilfeller være essensielt. Metoden er også egnet for under-søkelse av prøver fra hvilke mikroorganismen ikke lenger kan dyrkes, men som inneholder betydelige mengder av mikrobielt debris (f.eks. etter at antibiotisk behandling har begynt), eller hvis dyrkning av mikroorganismen er særlig arbeidskrevende og vanskelig (f.eks. anaerobe bakterier, som er til stede i stort antall i suppurative prøver når det gjelder infeksjoner for-årsaket av anaerober. in medical microbiology, veterinary microbiology, food hygiene investigations and microbial diagnostics of plant diseases. Suitable sample materials are e.g. all animal and plant tissue homogenates, such patient secretions as blood, faeces and nasal and urethral mucosa. It can be considered that the method is sufficiently sensitive to detect the microbe levels that are normally present in clinical samples. Preliminary enrichment of the microorganism present in the sample, by cultivation, is of course possible before the identification test and would in some cases be essential. The method is also suitable for examining samples from which the microorganism can no longer be cultivated, but which contain significant amounts of microbial debris (e.g. after antibiotic treatment has begun), or if cultivation of the microorganism is particularly labor-intensive and difficult ( eg anaerobic bacteria, which are present in large numbers in suppurative specimens in the case of infections caused by anaerobes.

Metodenvkunne tilpasses i form av følgende reagenskombinasjoner<*>, "sett", idet deler av disse naturligvis kunne anvendes separat: ;Åndedrettsinfeksjoner: ;a) Bakterier: B-hemolytiske streptokokker (A-gruppe), Haemophilus influenzae, Pneumococci, Mycoplasma ;pneumoniae, mycobacteria ;b) Vira: Influenza A, Influenza B, Parainfluenza 1-3 Åndedretts-syncytial virus, adenoviruses, corona- ;viruses, rhinoviruses ;Diareer ;a) Bakterier: salmonellae, shigellae, Yersinia entero-colitica, enterotoxigenic E. coli, Clostridium ;difficile, eampylobacteria ;b) Vira: rotawiruses, parvoviruses, adenoviruses, enteroviruses ;Veneriske sykdommer: ;a) Bakterier: Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum, Chlamydia trachomatis ;b) Vira: Herpex simplex-virus ;c) Gjærsopper: Candida albicans ;d) Protozoa: Trichomonas vaginalis ;Sepsis: ;a) Bakterier: 3-hemolytiske streptokokker (A-gruppe), pneumococci, enterobakterier som en enkelt gruppe ;Matvarehygiene: ;a) Bakterier: Salmonella og Clostridium perfringens ;Avhengig av valget av reagenser kan spesifisiteten ved ;testen begrenses til en definert mikrobiell slekt (f.eks. salmonella) eller til en hel mikrobiell gruppe, f.eks. entero-bacteriaceae, ved å velge identifiserende reagenser fra området av et felles gen. ;De nukleinsyrereagenser som kreves i sandwich-hybridi-seringsteknikken som er beskrevet her-, produseres ved rekombinant-DNA-teknologi. I det følgende beskrives reagensproduksjon og testmetode for eksempel 1. ;Reagenser ;Adenovirus type 2 (stamme deponert ved KTL, dvs. National Public Health Institute, Helsingfors) ble dyrket og renset, og DNA ble isolert (Petterson, U. og Sambrook, J. (1973) J. Mol. Biol. 73 , 125-130) (i det følgende referert til som Ad.,-DNA) . DNA ble digerert med BamHI-restriksjonsjonsenzym (BRL, d.e. Bethesda Research Laboratories) som kutter DMA opp i fire ;reproduserbare fragmenter. Av disse fire fragmenter ble to inn-lemmet på BamHI-setet i vektor-plasmidet pBR 322 (BRL) ved hjelp av T4-ligase (BRL). (Fragmentene ble ikke separert før ligering, men tilføyelsen som ble gjort til plasmidet ble i hvert tilfelle bare identifisert etter kloning). Deretter ble bakterieverten ;(É. coli HB101 (K12) gal-, pro-, leu-, hrs-, hrm-, recA, str<r>, F-) ;(oppnådd fra KTL) transformert med plasmid-DNA sammensatt av ;rekombinantplasmider, dvs. molekyler som hadde mottatt fragmenter av adenovirus-DNA (Cohen, S.N. et al., (1972) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 69, 2110-2114). Blant de transformerte bakteriekloner ble det valgt slike som mest sannsynlig inneholdt rekombinant-plasmidet. Ampicillin- og tetracyklin-resistansgener overføres til bakteriet ved. pBR322-plasmidet (Bolivar F. et al., (1977) ;gen 2, 95-113). Bakterier som inneholder rekombinantplasmidet er imidlertid sensitive overfor tetracyklin, fordi BamHI-restriksjonssetet er i tetracyklingenet og det fremmede DNA som innlemmes i dette område ødelegger genet. Innlemmelsen av plasmidet ble karakterisert etter plasmidanrikning ved bestemmelse av størrelsen på restriksjonsfragmentene etter BamHI-oppslutning med agarosegel-elektroforese. De tilstøtende BamHI D- og C-fragmenter av Ad2-DNA (cf. genkart) ble valgt som reagenser (Soderlund H. et al., (1976) Cell 7, 585-593). De ønskede rekombinantplasmider, Ad2C-pBR322, KTL nr. E231 og Ad2D-pBR322, KTL nr. EH230, ble dyrket og renset som beskrevet i litteraturen (Clewell D.B. og Helinski D.R. (1969) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 62, 1159-1166). ;Rekombinantplasmidet Ad2D-pBR322 ble anvendt som filter-reagens. Det er ikke nødvendig for foreliggende søknad å fjerne plasmidsekvensene, da prøven ikke inneholder pBR322-sekvenser. Imidlertid ble nukleinsyren-, for radioaktiv merking, separert fra pBR322-DNA etter BamHI-oppslutning ved hjelp av agarosegel-elektroforese. C-fragmentet ble isolert fra LGT-agarose (Marine Colloids, Inc.) ved fenol-ekstraksjon eller elektro-eluering (Wieslander L. (1979) Anal. Biochem. 98, 305-309) og konsentrert ved utfelling med etanol. ;Det er spesielt bekvemt å subklone nukleinsyrefragmentet som velges for merking i en separat vektor", slik at man kan unngå hybridiseringsbakgrunnen som resulterer fra den direkte hybridisering med filteret i de residuelle plasmidsekvenser, som kont-aminerer det merkede nukleinsyrereagens. Den enkelt-trådede DNA-fag Ml3 mp7 (BRL), som DNA-fragmentene oppnådd ved BamHI-oppslutning lett kan overføres til, kunne anvendes som en optimal vektor (Messing J:. et al., (1981) Nucleic Acids Res. 9, 309-323). ;Festing av DNA til filteret ;Rekombinantplasmidet Ad2D-pBR322 ble denaturert til en enkelt- trådet form og knekket vilkårlig på forskjellige punkter ved behandling med 0,2N NaOH (5 min., 100°C), hvoretter DNA ble nedkjølt og, umiddelbart før overføring til- filteret, nøytralisert og pipettert til overføringsløsningen, 4 x SSC-medium på is (SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M natriumcitrat). Filterne (Schleicher og Schull BA85 nitrocellulose) ble grundig fuktet i 4 x SSC løsning (ca. 2 h) før påføring av DNA. DNA festes til filteret i fortynnet løsning (0,5-1,0 yg/ml) ved suging av løsningen gjennom filteret i svakt vakuum. Filteret har evne til å absorbere DNA opp til ca. 180 ug/cm 2 (Kafatos F.C. et al., (1979) Nucleic Acids Res. 7, 1541-1552). Vi har anvendt DNA-konsentrasjoner på mellom 0,5 yg DNA/2,5 cm diameter av filter og 1,0 yg DNA/0,7 cm diameter av filter. Etter DNA-filtrering vaskes filterne i 4 x SSC, tørkes ved romtemperatur og innbakes til slutt i vakuumovn ved 80°C i 2 h, hvoretter DNA på filterne forblir stabilt og filterne kan lagres i lange perioder ved romtemperatur (Southern E.M. (1975) J. Mol. Biol. 98, 503-517) . ;Merking av det radioaktive nukleinsyrefragment ;12 5 ;Den radioaktive merking som ble benyttet var I-isotopen. Denne isotop kan påvises med y-tellere, som er tilgjengelige ;i de fleste store laboratorie-enheter. Halveringstiden til isotopen er 60 dager, og av denne grunn er anvendelsesperioden for 12 5I-merkede reagenser ca. 4 måneder. ;" Knekk- translaterings"- merking ;Prinsippet ved denne metode er å forskyve ett av nukleotidene i nukleinsyren med et radioaktivt sådant, hvoretter hele DNA-molekylet blir merket. Dette utføres i henhold til den metode som er publisert av Rigby P.W.J, et al., (J. Mol. Biol. (1977) 113, 237-251). I reaksjonen blir DNA radioaktivt merket når ;12 5 ;løsningen inneholder I-merket deoksynukleosid-trifosfat som ;125 ;substrat, i dette tilfelle I-dCTP (Radiochemical Centre, Amersham: >1500 Ci/mmol). Under optimale betingelser kan det oppnås en spesifikk aktivitet på 10^ c<p>m/yg DNA. Det merkede ;DNA renses for nukleotider som er igjen i reaksjonsblandingen ved enkel gelfiltrering, f.eks. med BioGel P30 (BioRad). ;Andre merkemetoder ;Det enkelt- trådede nukleinsyrereagens som ble produsert ;i M13 mp7-fag merkes ved kjemisk jodering hvorved det ;125 ;reaktive I tilsettes kovalent til nukleinsyren (Commenford S.L. (1971) Biochemistry 10, 1993-2000, Orosz J.M. og Wetmur J.G. ;(1974) Biochemistry 13, 5467-5473). Alternativt kan nukleinsyren gjøres radioaktiv ved. sluttmerking med radioaktive nukleotider ved hjelp av den terminale transferase (Roychoudhury R. og Wu R. (1980) Meth. Enzymol. 65, 43-62). ;Reagensfremstillingen som er beskrevet ovenfor vedrører mikroorganismer hvor det genetiske materiale er i form av DNA. Når det gjelder RNA-vira finner kloningen av genom-fragmenter■ sted på en slik måte at først er det laget en DNA-kopi (cDNA) av virus RNA ved hjelp av revers transkriptase, fulgt av DNA-polymerase for kopiering av den annen DNA-tråd, og deretter klones DNA som beskrevet ovenfor (Salser W. (1979) i Genetic Engineering, Ed. A.M. Chakrabarty, CRC Press, s. 53-81). ;Den mest egnede klonemetode velges i avhengighet av den mikroorganisme som anvendes. Vertene så vel som vektorene kan variere. Muligheter inkluderer A-fagen som vektor, andre plasmider, kosmider, kloning, f.eks. i Bacillus subtilis bakterier osv. (Rekombinant DNA, Benchmarck Papers in Micro-biology, vol. 15, Eds. K.J. Denniston og L.W. Enqvist, Dowden, Hutchinson og Ross, Inc. (1981); Ish-Horowicz D. og Burke J.F. ;(1981) Nucleic Acids Res. 9, 2989-2998). ;Utførelse av testen ;Prøvebehandling ;Den mikrobielle nukleinsyre som skal undersøkes må først frigjøres fra selve mikroben og også fra de infiserte celler, hvoretter den må denatureres til den enkelt- trådede form. Virus-genomer kan frigjøres ved behandling av prøventaterialet med 1% natriumdodecylsulfat (SDS) og ødelegge de proteiner som beskytter genomet ved hjelp av proteinase K-behandling (1 mg/ml, 37°C, 60 min.).. Bakterieprøver må i tillegg brytes ned ved lysozym- og EDTArbehandling. ;Hvis prøven inneholder store mengder av viskøs.cellulær-DNA med høy molekylvekt, må denne skjæres ved få punkter for reduksjon av viskositeten, f.eks. ved sonar behandling eller ved å føre prøven noen få ganger gjennom en fin nål. ;Hybridisering ;Hybridisering finner sted f.eks. i 50% formamid (avionisert, lagret ved -20°C), i 4 x SSC Denhardt-løsning (Denhardt D.T. ;(1966) Biochem. Biophys. Res. Commun. 23, 641-646) som inneholder 1% SDS og 0,5 mg/ml DNA (laksespermier eller kalve-thymus) ved 37°C og vanligvis natten over i 16-20 timer. De filtere som velges for testen inkuberes i et egnet kar som hybridiseringsblandingen tilsettes, og hybridiseringen starter. Hybridiseringsblandingen inneholder (a) den forhåndsbehandlede prøve som er tilsatt den eller de radioaktive nukleinsyrereagenser som er blitt denaturert sammen ved koking i 5 minutter, fulgt av hurtig avkjøling ved 0°C; (b) konsentrerte formamid-, SSC- og Denhardt-løsninger som pipetteres til den denaturerte og avkjølte nukleinsyreblanding (a). Etter blanding pipetteres hybridiseringsblandingen til filterne i hybridiseringskaret. Etter hybridisering vaskes filterne omhyggelig og telles individuelt i y-telleren. ;Oppfinnelsen skal klargjøres i det følgende ved hjelp av noen utførelseseksempler. ;Eksempel 1 ;Påvisning av adenovirus ved sandwich- hybridiseringsroetoden ;(Tabell 1) ;Detaljene ved testen er klargjort i teksten til tabell 1. Sandwich-hybridiseringsmetoden kan påvise virus-DNA fra en løsning, men det virale genom kan like godt påvises fra infiserte celler. ;Hybridiseringsbakgrunnen måles i et rør som bare inneholder filteret og det merkede nukleinsyrereagens, uten prøven. Bakgrunnen forårsakes av pBR322-sekvensene som opptrer i det merkede nukleinsyrereagens. Disse sekvenser hybridiserer direkte med filteret uten at prøven medvirker til det. Filterne som inneholder kalve-thymus og intet DNA anvendes i testen som kontrollprøver, hvilket på den ene side indikerer spesifisiteten ved hybridiseringen og på den annen side nivået av den ikke-spesifikke bakgrunn som opptrer f.eks. på grunn av utilstrekkelig vasking. ;I de følgende tabeller er bakgrunnen som skyldes reagensene subtrahert fra cpm-verdiene hybridisert til filterne. ;Merket nukleinsyrereagens: ;Ad2-BamHI C-fragment, renset, spesifikk aktivitet ;90 x IO<6> cpm/ug (200 000 cpm <1>25I/reaksjon) ;Hybridisering: ;50% formamid, 4 x SSC ;Denhardt-løsning, inneholdende 0,5 mg/ml laksesperma DNA og ;1% SDS, 37°C, 16 h ;Vasking: ;0,1% SSC, romtemperatur, 40 min. ;Prøver: ;Adenovirus type 2. DNA (BRL) ;Infeksjon med type' 2 adenovirus fant sted i HeLa-celler. Cellene ble så oppbrutt ved behandling med 1% SDS, fulgt av oppslutning med 1 mg/ml proteinase-K-enzym (Sigma) i 30 min. ved 37°C. Før denaturering ble prøven ført gjennom en fin nål. De verdier som fremstår i tabellen er korrigert ved subtraksjon av reagensbakgrunnen, oppnådd ved utførelse av en lignende hybridisering, men uten prøve. ;Eksempel 2 ;Påvisning av et RNA- virus ved hjelp av sandwich- hybridisering ;(Tabell 2) ;RNA-virusmodellen som ble anvendt var Semliki Forest-virus (prototyp stamme, oppnådd fra London School of Hygiene and Tropical Medicine), av hvilket genomet er enkelt-strenget RNA. Ved å anvende virus-genomet som sjablong (eller mal) ble cDNA produsert, som ble klonet inn i Pstl-setet i pBR322-plasmidet som beskrevet av Garoff et al. (Proe.Nati. Acad.Sei. (1980) USA 77, 6376-6380). Det således oppnådde rekombinant-plasmid er pKTH312 KTL nr. EH 232. Innlemmelsen av dette plasmid som stammer fra virus-genomet er ca. 1400 nukleotider lang og er fra det strukturelle proteinområde, tilnærmet fra nukleotid 200 til nukleotid 1600 når nummereringen starter fra begynnelsen av de strukturelle gener (Garoff H. et al., 1980). For produksjon av reagens ble hele rekombinant-plasmidet pKTH312 linearisert med EcoRI restriksjonsenzym (BRL) (den sekvens som stammer fra Semliki Forest-virus inneholder ikke gjenkjennelsespunkter for EcoRI-enzymet), og det lineariserte plasmid ble kuttet opp i ;to fragmenter ved anvendelse av Xhol-enzym (BRL). Restriksjons-punktet for sistnevnte ble lokalisert med Semliki Forest-virus-sekvensen. Det største EcoRI-XhoI-fragment A (ca. 3900 basepar) ble knyttet til filteret, og det minste fragment B (ca. 1850 ;125 ;basepar) ble merket med I ved anvendelse av knekk-trans-lateringsteknikken. Både fritt Semliki Forest-virus og virus-infiserte celler ble anvendt som prøver i denne test. I begge tilfeller var de virus-spesifikke nukleinsyrer i prøven sammensatt utelukkende av RNA. ;;Filtere: ;1) EcoRI-XhoI-fragment A (1,2 ug) av pKTH312-plasmidet ;2) Kalve-thymus DNA 1 yg ;3) Blindprøve (intet DNA) ;Merkede nukleinsyrereagenser: ;EcoRI-XhoI-fragment B i plasmidet pKTH312, spesifikk aktivitet 90 x 106 cpm/yg DNA (200 000 cpm <125>I/reaksjon). ;Hybridisering: ;Som beskrevet i tabell 1 ;Vasking: ;Som beskrevet i tabell 1 ;Prøver: ;Semliki Forest-virus (30 yg) ble oppbrutt med SDS før testen. ;De infiserte celler ble behandlet som beskrevet i tabell 1. Infeksjonen med Semliki Forest-virus ble utført i BHK-21-celler. ;De verdier som er angitt i tabellen er korrigert med hensyn på reagensbakgrunn, oppnådd fra en lignende hybridisering uten prøve. ;Eks empel 3 ;En virusprøve hvor den virale budbringer RNA påvises ved ;hjelp av sandwich- hybridiseringsmetoden (Tabell 3) ;Sandwich-hybridiseringsreagensene ble produsert av SV40-virus DNA (BRL) ved oppkutting av DNA i to deler med Pstl-enzym (Boehringer Mannheim) som beskrevet av Lebowitz og Weissman (Curr. Topics i Microbiol. Immunol. 87, 43-172), og fragmentene ble isolert og renset ved agarose-gel-elektroforese. Fragment ;125 ;A (4000 base-par) ble radioaktivt merket med I ved knekk-translatering, og fragment B (1200 base-par) ble festet til filteret. ;DNA-fragmentene ble valgt slik at hvert inneholdt områder som kodet for både tidlige og sene budbringere. Således inneholder fragment B ca. 700 baser fra det strukturelle protein-gen VPl og over 600 baser fra genet for tidligere budbringere. Fordi DNA i SV40-virus i seg selv er en kovalent lukket ring, kan den ikke påvises ved testen før linearisering. Derfor er det, når infiserte celler anvendes som prøve, mulig å teste hvor godt metoden lar seg tilpasse påvisning av RNA-kopier av viral-genomet. Som det kan sees av resultatene i tabell 3, er testen utmerket egnet for undersøkelse av infiserte celler. Tabellen viser også at de samme reagenser kan anvendes for å undersøke både viral-DNA og mRNA laget derav. ;Filtere: ;1) Det korteste fragment Pstl B (0,2 yg) av den sirkulære ;SV40-virus-DNA oppsluttet med Pstl-restriksjonsenzym ;2) Kalve-thymus DNA 1 yg ;3) Blindprøve (intet DNA) ;Merket nukleinsyrereagens: ;Det lengste Pstl A-fragment i SV40-virus DNA, spesifikk aktivitet 28 x IO<6> cpm/yg DNA (200 000 cpm <125>I/reaksjon) ;Hybridisering: ;Som beskrevet i tabell 1 ;Hybridiseringstiden er 40 h ;Vasking: ;Som beskrevet i tabell 1 ;Prøver: ;SV40-virus DNA (BRL) ble linearisert med EcoRI-restriksjonsenzym (BRL). CVl-celler (Biomedical Centre, Uppsala University) ble infisert med SV40-virus (fra Janice Y. Chou og Robert G. Martini, NIH, Bethesda), og cellene ble innhøstet 40 h etter infeksjon. Behandling av prøven var som beskrevet i tabell 1. ;De verdier som er presentert i tabellen er korrigert for reagensbakgrunn, oppnådd fra en lignende hybridisering utført uten prøve. ;Eksempel 4 ;Påvisning av Bacillus amyloliquefaciens ved sandwich-hybridisering (Tabell 4) ;Reagensene var fragmenter av a-amylase-genet i B. amyloliquefaciens E 18 (Technical Research Centre of Finland, VTT), som ble isolert for formålet med denne test ut fra rekombinant-plasmidet pKTHlO (Palva I et al., (1981) Gene, 15, 43-51) ved behandling med restriksjonsenzym og påfølgende agarose-gel-elektroforese. Fragmentene som ble anvendt for denne test var Clal-EcoRI-fragment-området i a-amylasegenet (460 base-par) ;(Clal Boehringer Mannheim) og EcoRI-BamHI-fragmentet (1500 base-par) . EcoRI-BamHI-fragmentet ble festet til filteret, og Clal-125 ;EcoRI-fragmentet ble radioaktivt merket med I ved knekk-translatering. ;Som det kan sees av tabell 4, var B. amyloliquefaciens i en prøve identifiserbar ved sandwich-hybridisering på basis av enkelt-a-amylase-genet. E. coli ga negativt resultat i denne test (ikke til å skjelne fra bakgrunnen). ;Tabell 4 ;Bakteriell diagnostikk ved sandwich- hybridisering ;Prøve Filtere ( cmp) ;g- amylase 1) Kalve- thymus 2) Blindprøve 3) pKTHlO-plasmid-DNA ;(linearisert) 1 ug 5773 47 ;Ingen prøve - ;E. coli HB101 (IO<9>) - - - ;Bacillus amylolique- ;faciens (3 x IO<9>) 3377 ;Bacillus amylolique- ;faciens (IO<9>) 2871 ;Filtere: ;1) EcoRI-BamHI-fragmentet av a-amylase-genet fra plasmid pKTHIO, 0,35 yg ;2) Kalve-thymus DNA, 1 <y>g ;3) Blindprøve (intet DNA) ;Merket nukleinsyrereagens: ;Clal-EcoRI-fragmentet av a-amylase-genet fra plasmid pKTHIO, spesifikk aktivitet 35 x IO<6> cpm/yg (200 000 cpm <125>I/reaksjon) ;Hybridisering: ;Som beskrevet i tabell 1 ;Vasking: ;Som beskrevet i tabell 1 ;Prøver: ;Bakterieprøver ble behandlet med lysozym (67 yg/ml) i 30 min. ved 37°C; 5 mM EDTA ble satt til prøver av E. coli også. Etter behandlingen ble SDS satt til alle prøvene (endelig konsentrasjon 2%), som så ble ført to ganger gjennom en fin nål for reduksjon av deres viskositet før de ble denaturert ved koking som beskrevet i den tekst som vedrører håndtering av prøvene. ;De verdier som fremgår av tabellen er korrigert for reagensbakgrunn, oppnådd fra en lignende hybridisering uten prøve. ;Eksempel 5 ;Et eksempel på et reagenskombinasjonssett basert på sandwich- hybridiseringsmetoden (tabell 5) ;De prøver som ble undersøkt i denne test var celler som ;var infisert av tre vira (adenovirus, SV40-virus og Herpes sim<p>lex-virus) og en prøve som inneholdt Bacillus amyloliquefaciens-bakterier. Følgende reagenser ble alle satt samtidig til hver prøve, 5 filtere, hvert inneholdende én type DNA fra SV40-virus, adenovirus, Bacillus amyloliquefaciens-a-amylase-' ;gen og kalve-thymus, så vel som et filter som ikke inneholdt noe DNA i det hele tatt; i tillegg 200*000 cpm av hvert av de følgende merkede nukleinsyrereagenser: SV40-virus-, adenovirus-og a-amylase-gen-DNA-reagens. The method could be adapted in the form of the following reagent combinations<*>, "sets", as parts of these could of course be used separately: ;Respiratory infections: ;a) Bacteria: B-haemolytic streptococci (group A), Haemophilus influenzae, Pneumococci, Mycoplasma ;pneumoniae , mycobacteria ;b) Viruses: Influenza A, Influenza B, Parainfluenza 1-3 Respiratory syncytial virus, adenoviruses, corona- ;viruses, rhinoviruses ;Diarrhea ;a) Bacteria: salmonellae, shigellae, Yersinia entero-colitica, enterotoxigenic E. coli , Clostridium ;difficile, eampylobacteria ;b) Viruses: rotaviruses, parvoviruses, adenoviruses, enteroviruses ;Venereal diseases: ;a) Bacteria: Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum, Chlamydia trachomatis ;b) Viruses: Herpex simplex virus ;c) Yeast fungi: Candida albicans ;d) Protozoa: Trichomonas vaginalis ;Sepsis: ;a) Bacteria: 3-hemolytic streptococci (group A), pneumococci, enterobacteria as a single group ;Food hygiene: ;a) Bacteria: Salmonella and Clostridium perfringen s ;Depending on the choice of reagents, the specificity of the ;test can be limited to a defined microbial genus (e.g. salmonella) or to an entire microbial group, e.g. entero-bacteriaceae, by selecting identifying reagents from the region of a common gene. The nucleic acid reagents required in the sandwich hybridization technique described here are produced by recombinant DNA technology. In the following, reagent production and test method are described for example 1. ;Reagents ;Adenovirus type 2 (strain deposited at KTL, i.e. National Public Health Institute, Helsinki) was cultured and purified, and DNA was isolated (Petterson, U. and Sambrook, J (1973) J. Mol. Biol. 73, 125-130) (hereinafter referred to as Ad.,-DNA). DNA was digested with BamHI restriction enzyme (BRL, i.e. Bethesda Research Laboratories) which cuts DMA into four reproducible fragments. Of these four fragments, two were incorporated into the BamHI site in the vector plasmid pBR 322 (BRL) using T4 ligase (BRL). (The fragments were not separated before ligation, but the addition made to the plasmid was in each case only identified after cloning). Then the bacterial host ;(É. coli HB101 (K12) gal-, pro-, leu-, hrs-, hrm-, recA, str<r>, F-) ;(obtained from KTL) was transformed with plasmid DNA composed of ;recombinant plasmids, ie molecules that had received fragments of adenovirus DNA (Cohen, S.N. et al., (1972) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 69, 2110-2114). Among the transformed bacterial clones, those most likely to contain the recombinant plasmid were selected. Ampicillin and tetracycline resistance genes are transferred to the bacterium by. the pBR322 plasmid (Bolivar F. et al., (1977) ; gene 2, 95-113). However, bacteria containing the recombinant plasmid are sensitive to tetracycline, because the BamHI restriction site is in the tetracycline gene and the foreign DNA incorporated into this region destroys the gene. The incorporation of the plasmid was characterized after plasmid enrichment by determining the size of the restriction fragments after BamHI digestion with agarose gel electrophoresis. The adjacent BamHI D and C fragments of Ad2 DNA (cf. gene map) were chosen as reagents (Soderlund H. et al., (1976) Cell 7, 585-593). The desired recombinant plasmids, Ad2C-pBR322, KTL No. E231 and Ad2D-pBR322, KTL No. EH230, were grown and purified as described in the literature (Clewell D.B. and Helinski D.R. (1969) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 62, 1159-1166). The recombinant plasmid Ad2D-pBR322 was used as filter reagent. It is not necessary for the present application to remove the plasmid sequences, as the sample does not contain pBR322 sequences. However, the nucleic acid for radiolabeling was separated from pBR322 DNA after BamHI digestion by agarose gel electrophoresis. The C fragment was isolated from LGT agarose (Marine Colloids, Inc.) by phenol extraction or electroelution (Wieslander L. (1979) Anal. Biochem. 98, 305-309) and concentrated by ethanol precipitation. "It is particularly convenient to subclone the nucleic acid fragment selected for labeling in a separate vector", so that the hybridization background resulting from the direct hybridization with the filter in the residual plasmid sequences, which contaminates the labeled nucleic acid reagent, can be avoided. The single-stranded DNA -phage Ml3 mp7 (BRL), to which the DNA fragments obtained by BamHI digestion can be easily transferred, could be used as an optimal vector (Messing J:. et al., (1981) Nucleic Acids Res. 9, 309-323) .;Attachment of DNA to the filter ;The recombinant plasmid Ad2D-pBR322 was denatured to a single-stranded form and randomly broken at various points by treatment with 0.2N NaOH (5 min., 100°C), after which the DNA was cooled and, immediately before transfer to the filter, neutralized and pipetted into the transfer solution, 4 x SSC medium on ice (SSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M sodium citrate). The filters (Schleicher and Schull BA85 nitrocellulose) were thoroughly wetted in 4 x SSC solution ( approx. 2 h) before application ng of DNA. DNA is attached to the filter in diluted solution (0.5-1.0 yg/ml) by suction of the solution through the filter in a weak vacuum. The filter has the ability to absorb DNA up to approx. 180 µg/cm 2 (Kafatos F.C. et al., (1979) Nucleic Acids Res. 7, 1541-1552). We have used DNA concentrations of between 0.5 yg DNA/2.5 cm diameter of filter and 1.0 yg DNA/0.7 cm diameter of filter. After DNA filtration, the filters are washed in 4 x SSC, dried at room temperature and finally baked in a vacuum oven at 80°C for 2 h, after which the DNA on the filters remains stable and the filters can be stored for long periods at room temperature (Southern E.M. (1975) J . Mol. Biol. 98, 503-517). ;Labeling of the radioactive nucleic acid fragment ;12 5 ;The radioactive label that was used was the I isotope. This isotope can be detected with y-counters, which are available in most large laboratory units. The half-life of the isotope is 60 days, and for this reason the period of use for 12 5I-labelled reagents is approx. 4 months. "Knekk- translationerings" labeling The principle of this method is to displace one of the nucleotides in the nucleic acid with a radioactive one, after which the entire DNA molecule is labeled. This is carried out according to the method published by Rigby P.W.J, et al., (J. Mol. Biol. (1977) 113, 237-251). In the reaction, DNA is radioactively labeled when the ;12 5 ;solution contains I-labelled deoxynucleoside triphosphate as ;125 ;substrate, in this case I-dCTP (Radiochemical Centre, Amersham: >1500 Ci/mmol). Under optimal conditions, a specific activity of 10^ c<p>m/ug DNA can be achieved. The labeled DNA is purified from nucleotides remaining in the reaction mixture by simple gel filtration, e.g. with BioGel P30 (BioRad). ;Other labeling methods ;The single-stranded nucleic acid reagent that was produced ;in M13 mp7 phage is labeled by chemical iodination whereby the ;125 ;reactive I is covalently added to the nucleic acid (Commenford S.L. (1971) Biochemistry 10, 1993-2000, Orosz J.M. and Wetmur J. G. (1974) Biochemistry 13, 5467-5473). Alternatively, the nucleic acid can be made radioactive by end labeling with radioactive nucleotides using the terminal transferase (Roychoudhury R. and Wu R. (1980) Meth. Enzymol. 65, 43-62). The reagent preparation described above relates to microorganisms where the genetic material is in the form of DNA. In the case of RNA viruses, the cloning of genome fragments takes place in such a way that first a DNA copy (cDNA) of the viral RNA is made using reverse transcriptase, followed by DNA polymerase to copy the other DNA strand, and then the DNA is cloned as described above (Salser W. (1979) in Genetic Engineering, Ed. A.M. Chakrabarty, CRC Press, pp. 53-81). ;The most suitable cloning method is chosen depending on the microorganism used. The hosts as well as the vectors may vary. Possibilities include the A phage as a vector, other plasmids, cosmids, cloning, e.g. in Bacillus subtilis bacteria, etc. (Recombinant DNA, Benchmarck Papers in Micro-biology, vol. 15, Eds. K.J. Denniston and L.W. Enqvist, Dowden, Hutchinson and Ross, Inc. (1981); Ish-Horowicz D. and Burke J.F. ; (1981) Nucleic Acids Res. 9, 2989-2998). ;Performance of the test ;Sample processing ;The microbial nucleic acid to be examined must first be released from the microbe itself and also from the infected cells, after which it must be denatured to the single-stranded form. Virus genomes can be released by treating the sample material with 1% sodium dodecyl sulfate (SDS) and destroy the proteins that protect the genome by means of proteinase K treatment (1 mg/ml, 37°C, 60 min).. Bacterial samples must also broken down by lysozyme and EDTA treatment. If the sample contains large amounts of viscous cellular DNA with a high molecular weight, this must be cut at a few points to reduce the viscosity, e.g. by sonar treatment or by passing the sample a few times through a fine needle. ;Hybridization ;Hybridization takes place e.g. in 50% formamide (aionized, stored at -20°C), in 4 x SSC Denhardt solution (Denhardt D.T.; (1966) Biochem. Biophys. Res. Commun. 23, 641-646) containing 1% SDS and 0 .5 mg/ml DNA (salmon sperm or calf thymus) at 37°C and usually overnight for 16-20 hours. The filters selected for the test are incubated in a suitable vessel to which the hybridization mixture is added, and the hybridization begins. The hybridization mixture contains (a) the pretreated sample to which has been added the radioactive nucleic acid reagent(s) which have been denatured together by boiling for 5 minutes, followed by rapid cooling at 0°C; (b) concentrated formamide, SSC and Denhardt solutions are pipetted into the denatured and cooled nucleic acid mixture (a). After mixing, the hybridization mixture is pipetted onto the filters in the hybridization vessel. After hybridization, the filters are carefully washed and counted individually in the y-counter. ;The invention shall be clarified in the following with the help of some design examples. ;Example 1 ;Detection of adenovirus by the sandwich hybridization method ;(Table 1) ;The details of the test are clarified in the text of Table 1. The sandwich hybridization method can detect viral DNA from a solution, but the viral genome can just as easily be detected from infected cells. ;The hybridization background is measured in a tube containing only the filter and the labeled nucleic acid reagent, without the sample. The background is caused by the pBR322 sequences appearing in the labeled nucleic acid reagent. These sequences hybridize directly with the filter without the sample contributing to it. The filters containing calf thymus and no DNA are used in the test as control samples, which on the one hand indicates the specificity of the hybridization and on the other hand the level of the non-specific background that occurs e.g. due to insufficient washing. ;In the following tables, the background due to the reagents is subtracted from the cpm values hybridized to the filters. ;Labeled nucleic acid reagent: ;Ad2-BamHI C fragment, purified, specific activity ;90 x 10<6> cpm/ug (200,000 cpm <1>25I/reaction) ;Hybridization: ;50% formamide, 4 x SSC ;Denhardt solution, containing 0.5 mg/ml salmon sperm DNA and ;1% SDS, 37°C, 16 h ;Washing: ;0.1% SSC, room temperature, 40 min. ;Samples: ;Adenovirus type 2. DNA (BRL) ;Infection with type' 2 adenovirus took place in HeLa cells. The cells were then disrupted by treatment with 1% SDS, followed by digestion with 1 mg/ml proteinase K enzyme (Sigma) for 30 min. at 37°C. Before denaturation, the sample was passed through a fine needle. The values that appear in the table have been corrected by subtracting the reagent background, obtained by performing a similar hybridization, but without a sample. ;Example 2 ;Detection of an RNA virus by means of sandwich hybridization ;(Table 2) ;The RNA virus model used was Semliki Forest virus (prototype strain, obtained from the London School of Hygiene and Tropical Medicine), of which the genome is single-stranded RNA. Using the viral genome as a template, cDNA was produced, which was cloned into the Pstl site of the pBR322 plasmid as described by Garoff et al. (Proe.Nati. Acad.Sei. (1980) USA 77, 6376-6380). The recombinant plasmid thus obtained is pKTH312 KTL No. EH 232. The incorporation of this plasmid originating from the virus genome is approx. 1400 nucleotides long and is from the structural protein region, approximately from nucleotide 200 to nucleotide 1600 when the numbering starts from the beginning of the structural genes (Garoff H. et al., 1980). For reagent production, the entire recombinant plasmid pKTH312 was linearized with EcoRI restriction enzyme (BRL) (the sequence derived from Semliki Forest virus does not contain recognition points for the EcoRI enzyme), and the linearized plasmid was cut into two fragments using Xhol enzyme (BRL). The restriction point for the latter was located with the Semliki Forest virus sequence. The largest EcoRI-XhoI fragment A (about 3900 base pairs) was ligated to the filter, and the smallest fragment B (about 1850 ;125 ;base pairs) was labeled with I using the kink translation technique. Both free Semliki Forest virus and virus-infected cells were used as samples in this test. In both cases, the virus-specific nucleic acids in the sample were composed entirely of RNA. ;;Filters: ;1) EcoRI-XhoI fragment A (1.2 µg) of the pKTH312 plasmid ;2) Calf thymus DNA 1 µg ;3) Blank sample (no DNA) ;Labeled nucleic acid reagents: ;EcoRI-XhoI fragment B in the plasmid pKTH312, specific activity 90 x 106 cpm/µg DNA (200,000 cpm <125>I/reaction). ;Hybridization: ;As described in Table 1 ;Washing: ;As described in Table 1 ;Samples: ;Semliki Forest virus (30 µg) was digested with SDS before the test. ;The infected cells were treated as described in Table 1. The infection with Semliki Forest virus was carried out in BHK-21 cells. ;The values given in the table are corrected for reagent background, obtained from a similar hybridization without sample. ;Example 3 ;A virus sample where the viral messenger RNA is detected by ;using the sandwich hybridization method (Table 3) ;The sandwich hybridization reagents were produced from SV40 virus DNA (BRL) by cutting the DNA into two parts with Pstl enzyme ( Boehringer Mannheim) as described by Lebowitz and Weissman (Curr. Topics in Microbiol. Immunol. 87, 43-172), and the fragments were isolated and purified by agarose gel electrophoresis. Fragment ;125 ;A (4000 base pairs) was radiolabeled with I by kink translation, and fragment B (1200 base pairs) was attached to the filter. ;The DNA fragments were chosen so that each contained regions that coded for both early and late messengers. Thus, fragment B contains approx. 700 bases from the structural protein gene VP1 and over 600 bases from the early messenger gene. Because the DNA in SV40 virus is itself a covalently closed ring, it cannot be detected by the test before linearization. Therefore, when infected cells are used as a sample, it is possible to test how well the method can be adapted to the detection of RNA copies of the viral genome. As can be seen from the results in Table 3, the test is excellently suited for the examination of infected cells. The table also shows that the same reagents can be used to examine both viral DNA and mRNA made from it. ;Filters: ;1) The shortest fragment Pstl B (0.2 yg) of the circular ;SV40 virus DNA digested with Pstl restriction enzyme ;2) Calf thymus DNA 1 yg ;3) Blank sample (no DNA) ;Labeled Nucleic acid reagent: ;The longest Pstl A fragment in SV40 virus DNA, specific activity 28 x IO<6> cpm/µg DNA (200,000 cpm <125>I/reaction) ;Hybridization: ;As described in table 1 ;Hybridization time is 40 h ;Washing: ;As described in Table 1 ;Samples: ;SV40 virus DNA (BRL) was linearized with EcoRI restriction enzyme (BRL). CV1 cells (Biomedical Centre, Uppsala University) were infected with SV40 virus (from Janice Y. Chou and Robert G. Martini, NIH, Bethesda), and the cells were harvested 40 h after infection. Processing of the sample was as described in Table 1. The values presented in the table are corrected for reagent background, obtained from a similar hybridization performed without sample. ;Example 4 ;Detection of Bacillus amyloliquefaciens by sandwich hybridization (Table 4) ;The reagents were fragments of the α-amylase gene of B. amyloliquefaciens E 18 (Technical Research Center of Finland, VTT), which was isolated for the purpose of this test from the recombinant plasmid pKTH10 (Palva I et al., (1981) Gene, 15, 43-51) by treatment with restriction enzyme and subsequent agarose gel electrophoresis. The fragments used for this test were the Clal-EcoRI fragment region in the α-amylase gene (460 base pairs) (Clal Boehringer Mannheim) and the EcoRI-BamHI fragment (1500 base pairs). The EcoRI-BamHI fragment was attached to the filter, and the ClaI-125;EcoRI fragment was radioactively labeled with I by kink translation. As can be seen from Table 4, B. amyloliquefaciens in one sample was identifiable by sandwich hybridization on the basis of the single α-amylase gene. E. coli gave a negative result in this test (indistinguishable from the background). ;Table 4 ;Bacterial diagnostics by sandwich hybridization ;Sample Filters ( cmp) ;g- amylase 1) Calf thymus 2) Blank sample 3) pKTHlO plasmid DNA ;(linearized) 1 ug 5773 47 ;No sample - ;E. coli HB101 (IO<9>) - - - ;Bacillus amylolique- ;faciens (3 x IO<9>) 3377 ;Bacillus amylolique- ;faciens (IO<9>) 2871 ;Filters: ;1) The EcoRI-BamHI fragment of the α-amylase gene from plasmid pKTHIO, 0.35 µg ;2) Calf thymus DNA, 1 µg ;3) Blank (no DNA) ;Labeled nucleic acid reagent: ;Clal-EcoRI fragment of α-amylase- the gene from plasmid pKTHIO, specific activity 35 x 10<6> cpm/yg (200,000 cpm <125>I/reaction) ;Hybridization: ;As described in table 1 ;Washing: ;As described in table 1 ;Samples: ;Bacterial samples were treated with lysozyme (67 µg/ml) for 30 min. at 37°C; 5 mM EDTA was added to samples of E. coli as well. After treatment, SDS was added to all samples (final concentration 2%), which were then passed twice through a fine needle to reduce their viscosity before being denatured by boiling as described in the text relating to sample handling. ;The values shown in the table are corrected for reagent background, obtained from a similar hybridization without sample. ;Example 5 ;An example of a reagent combination kit based on the sandwich hybridization method (Table 5) ;The samples examined in this test were cells infected by three viruses (adenovirus, SV40 virus and Herpes sim<p>lex- virus) and a sample containing Bacillus amyloliquefaciens bacteria. The following reagents were all added simultaneously to each sample, 5 filters, each containing one type of DNA from SV40 virus, adenovirus, Bacillus amyloliquefaciens α-amylase gene and calf thymus, as well as a filter that contained no DNA at all; in addition, 200*000 cpm of each of the following labeled nucleic acid reagents: SV40 virus, adenovirus, and α-amylase gene DNA reagent.

Vart'eksempel viser at det er mulig, uten oppdeling eller fortynning av prøven, samtidig å undersøke en passende serie av mikroorganismer ved tilsetning av reagenskombinasjonen til prøven. Prøven kan inneholde både viral og bakteriell nukleinsyre. Filterne kan gjenkjennes ved hjelp av et tegn (merke, merkelapper), som identifiserer sekvensen det inneholder og som angir hvilken mikroorganisme som ble knyttet/hybridisert til det. Tegnene kan være tall eller bokstaver, f.eks. 1 eller SV40 2 eller Ad etc. eller andre tegn slik som x for SV40 Vart's example shows that it is possible, without dividing or diluting the sample, to simultaneously examine a suitable series of microorganisms by adding the reagent combination to the sample. The sample may contain both viral and bacterial nucleic acid. The filters can be recognized by means of a sign (mark, labels), which identifies the sequence it contains and which indicates which microorganism was linked/hybridized to it. The characters can be numbers or letters, e.g. 1 or SV40 2 or Ad etc. or other characters such as x for SV40

eller A for AD eller 0 for Bacillus. or A for AD or 0 for Bacillus.

Merkede nukleinsyrereagenser: SV40-virus som i tabell 3 Adenovirus som i tabell 1 a-amylase-gen som i tabell 4 Labeled nucleic acid reagents: SV40 virus as in Table 3 Adenovirus as in Table 1 α-amylase gene as in Table 4

Hybridisering: Hybridization:

Som i tabell 1 As in Table 1

Vasking: Washing:

Som i tabell 1 As in Table 1

Prøver: Samples:

Celleprøver infisert med SV40-virus og adenovirus er beskrevet henholdsvis i tabellene 3 og 1. Cell samples infected with SV40 virus and adenovirus are described respectively in Tables 3 and 1.

10 Vero-celler ble infisert med Herpes simplex-virus 10 Vero cells were infected with Herpes simplex virus

type 1. Cellene ble innhøstet 20 h etter infeksjon da cyto-patisk effekt kunne observeres. Prøven ble behandlet som beskrevet for adenovirus-infiserte celler (tabell 1). type 1. The cells were harvested 20 h after infection when a cytopathic effect could be observed. The sample was processed as described for adenovirus-infected cells (Table 1).

Bacillus amyloliquefaciens- prøve: Bacillus amyloliquefaciens sample:

Som i tabell 4. As in Table 4.

Verdiene i tabellen er korrigert med hensyn på reagensbakgrunn, oppnådd ved utførelse av en lignende hybridisering uten prøve. The values in the table are corrected for reagent background, obtained by performing a similar hybridization without a sample.

Eksempel 6 Example 6

Påvisning av Escherichia coli ved sandwich- hybridisering Detection of Escherichia coli by sandwich hybridization

(Tabell 6) (Table 6)

Reagensene ble fremstilt ut fra ompA-genet (ytre membran-protein A -gen) i Escherichia coli. The reagents were prepared from the ompA gene (outer membrane protein A gene) in Escherichia coli.

Hybridplasmidene pKTH40 og pKTH45, anvendt som utgangs-materiale, ble fremstilt ut fra det pTUlOO-plasmid som er beskrevet av Henning et al., (1979) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 76, 4360-4364. The hybrid plasmids pKTH40 and pKTH45, used as starting material, were prepared from the pTU100 plasmid described by Henning et al., (1979) Proe. Nati. Acad. Pollock. USA 76, 4360-4364.

Plasmidet pKTH45 (deponert ved KTL, dvs. National Public Health Institute, Helsingfors nrEH254), anvendt som filter-reagens, var sammensatt av 740 base-par fra 5' -terminalenden i ompA-genet innsatt i pBR322-plasmidet. The plasmid pKTH45 (deposited at KTL, i.e. National Public Health Institute, Helsinki nrEH254), used as filter reagent, was composed of 740 base pairs from the 5'-terminal end of the ompA gene inserted into the pBR322 plasmid.

Plasmidet pKTH40 inneholder 300 base-par fra 3' -terminalenden i ompA-genet og de umiddelbart følgende 1700 base-par fra genomet i E. coli. pKTH40-plasmidet ble spaltet med BamHI-restriksjonsenzymet for mottagelse av DNA-fragmentet i E. coli, som inneholder de 1700 base-par som er nevnt ovenfor. Dette fragment ble overført til den enkelt-strengede bakteriofag M13mp7 ved de metoder som er beskrevet av Messing et al. (1981), Nucl. Acids Res. 9, 309-321, Heidecker et al. (1980), Gene 10, 69-73, Gardner et al. (1981), Nucl. Acids Res. 9, 2871-2888. Rekombinasjonsfagen mKTHl207 (deponert ved KTL nrEH256) ble merket med 12 5I-isotop som beskrevet på side 8 under over-skriften "Andre merkemetoder " og ble anvendt som sonde i sandwich-hybridiseringsmetoden. The plasmid pKTH40 contains 300 base pairs from the 3'-terminal end of the ompA gene and the immediately following 1700 base pairs from the E. coli genome. The pKTH40 plasmid was digested with the BamHI restriction enzyme to obtain the DNA fragment in E. coli containing the 1700 base pairs mentioned above. This fragment was transferred to the single-stranded bacteriophage M13mp7 by the methods described by Messing et al. (1981), Nucl. Acids Res. 9, 309-321, Heidecker et al. (1980), Gene 10, 69-73, Gardner et al. (1981), Nucl. Acids Res. 9, 2871-2888. The recombinant phage mKTH1207 (deposited at KTL nrEH256) was labeled with 12 5I isotope as described on page 8 under the heading "Other labeling methods" and was used as a probe in the sandwich hybridization method.

DNA fra oppbrutte E. coli-celler, såvel som isolert, renset DNA fra E. coli, kan påvises ved sandwich-hybridisering som vist i tabell 6. DNA from disrupted E. coli cells, as well as isolated, purified DNA from E. coli, can be detected by sandwich hybridization as shown in Table 6.

Merket nukleinsyrereagens: Labeled Nucleic Acid Reagent:

mKTHl207, spesifikk aktivitet 8 x IO<7> cpm/ug DNA mKTHl207, specific activity 8 x 10<7> cpm/ug DNA

(200 000 cpm/reaksjon) (200,000 cpm/reaction)

Hybridisering: Hybridization:

4 x SCC, 1 x Denhardt-løsning uten BSA (okseserum-albumin), 0,25% SDS, 200 yg/ml sildesperma DNA, 17,5 h, +65°C 4 x SCC, 1 x Denhardt's solution without BSA (bovine serum albumin), 0.25% SDS, 200 ug/ml herring sperm DNA, 17.5 h, +65°C

Vasking: Washing:

Som beskrevet i tabell 1 As described in Table 1

Claims

Samples of E. coli K12 HB101 DNA were isolated according to the Marmur method described by Marmur (1961) J. Mol. Biol. 3, 208-218. DNA was denatured at 7mM NaOH, +100°C, 5 min.

The cells were treated with lysozyme (500 µg/ml), EDTA (70 mM +37°C, 30 min.), SDS (0.25%, +65°C), and the free DNA was denatured by boiling at 14 mM NaOH, +100°C, 5 min.

The values presented in the table are corrected for reagent background obtained from a similar hybridization without a sample. 1. Microbial diagnostic method for the simultaneous identification of one or more microorganisms and/or microbial groups, where the method is based on sandwich hybridization of nucleic acids on a solid support, whereby two different nucleic acid reagents are used, one of which consists of a single-stranded nucleic acid fragment, bound to the solid support, and the other consists of a single-stranded nucleic acid fragment labeled with a suitable substance. characterized in that a series consisting of at least two nucleic acid reagents for each microorganism and/or microbial group to be detected, where one of the reagents is bound to the solid support and the other is labeled with a substance known in and of itself, is brought into contact with a single, undivided sample containing nucleic acids from the microorganisms and/or microbial groups to be detected, these nucleic acids being made simple -threaded by methods known per se, whereby only those of the nucleic acids in the nucleic acid mixture from the sample that a corresponding nucleic acid reagents are used, are hybridized with the corresponding identifying nucleic acid fragments that are bound to the solid support, and the hybrids that are thereby formed and are bound to the solid support are labeled using the corresponding, labeled nucleic acids when these bind to the nucleic acids that originate from the sample and are attached to the solid support, and the solid support's labeling is measured by methods known per se.

2. Series of reagent combinations for use in the method according to claim 1,

characterized in that at least two nucleic acid reagents belong to the series for each microorganism and/or microbial group to be identified, since two different nucleic acid fragments originating from microorganisms and/or microbial groups and necessary for the production of the aforementioned reagents are prepared from the different parts of the microbial genome, but fragments which are presumably located close to each other, either directly from the microbial genome or by undergoing per se known recombination DNA techniques and these nucleic acid fragments which are group or species specific and specific for each microorganism, is made single-stranded and one fragment is attached to a solid support and the other is labeled with a substance.

3. Series of reagent combinations as stated in claim 2, characterized in that for the identification of adenovirus as nucleic acid reagent bound to the solid carrier it comprises adenovirus recombinant plasmid Ad2DpBR322 and as labeled nucleic acid reagent, adenovirus Ad2BamHI C-fragment.

4. Series of reagent combinations as stated in claim 2, characterized in that for the identification of Semliki Forest virus as a nucleic acid reagent bound to the solid carrier it comprises the EcoRI-XhoI fragment A of the pKTH312 plasmid and as a labeled nucleic acid reagent the EcoRI-xhoI fragment of the pKTH312 plasmid .

5. Series of reagent combinations as stated in claim 2, characterized in that for the identification of SV40 virus as nucleic acid reagent bound to the solid carrier it comprises SV40 virus Pstl B fragment and as labeled nucleic acid reagent SV40 virus Pstl A fragment.

6. Series of reagent combinations as stated in claim 2, characterized in that for the identification of Bacillus amyloloquefaciens as a nucleic acid reagent bound to the solid bars it comprises the α-amylase gene's EcoRI-BamHI fragment in the Bacillus amyloloquefaciens pKTHIO plasmid and such. labeled nucleic acid reagent oc-amylase gene's ClaI-EcoRI fragment in the Bacillus amyloliquefaciens pKTHIO plasmid.

7. Series of reagent combinations as stated in claim 2, characterized in that for the identification of Escherichia coli as nucleic acid reagent bound to the solid carrier it comprises the plasmid pKTH45 and as labeled nucleic acid reagent the recombinant phage mKTH1207.

8. Series of reagent combinations as stated in claims 2, 3, 5 and 6, characterized in that for the identification and detection of adenovirus, SV40 virus and Bacillus amyloli-quef aciens from the same sample, which sample contains nucleic acids originating from different microorganisms , as nucleic acid reagents bound to solid support comprise adenovirus Ad2DpBR322 recombinant plasmid, SV40 virus Pstl B fragment and the α-amylase gene's EcoRI-BamHI fragment in Bacillus amyloloquefaciens pKTHIO plasmid and as labeled nucleic acid reagents comprise adenovirus Ad2BamHI C fragment, SV40 virus Pstl A fragment and the α-amylase gene's ClaI-EcoRI fragment in the Bacillus amyloliquefaciens pKTHIO plasmid.