NL2001101C2 - Werkwijze voor het vormen van informatie over een driedimensionale moleculaire structuur van een molecuul. - Google Patents

Description

t

Werkwijze voor het vormen van informatie over een driedimensionale moleculaire structuur van een molecuul

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het verschaffen van informatie over een driedimensionale moleculaire structuur van een molecuul zoals genoemd in de aanhef van conclusie 1. De uitvinding heeft te-5 vens betrekking op een rekeninrichting en een computerprogramma zoals beschreven in de onafhankelijke conclusies 6 en 7.

Een werkwijze zoals hiervoor aangeduid, is bekend uit de Europese octrooiaanvrage met publicatienummer 10 EP 1 226 528. Deze werkwijze is sinds vele jaren algemeen bekend in de techniek (de zogenoemde “Faster" methode) . De publicatie heeft betrekking op een werkwijze voor het verschaffen van informatie met betrekking tot de moleculaire structuur van een biomolecuul, waarbij de werkwijze kan worden 15 uitgevoerd door een computer, onder aansturing van een programma dat is opgeslagen in de computer en dat de stappen omvat van: (a) het ontvangen van een driedimensionale weergave van een moleculaire structuur van het biomolecuul, waarbij de weergave een eerste set van residuen en een sjabloon omvat; 20 (b) het modificeren van de weergave volgens stap (a) door ten minste één optimalisatiecyclus; waarbij elke optimalisatiecy-clus de stappen omvat van: (bl) het verstoren van een eerste weergave van de moleculaire structuur door het modificeren van de structuur van één of meer van de eerste set residuen 25 door middel van een supplementair krachtveld dat inwerkt op ten minste de eerste set residuen; (b2) het laten ontspannen (relaxeren) van de verstoorde weergave door het supplementaire krachtveld uit te schakelen; (b3) het beoordelen van de verstoorde en gerelaxeerde weergave van de moleculaire struc-30 tuur door gebruik te maken van een energetische kostenfunctie en de eerste weergave te vervangen door de verstoorde en gerelaxeerde weergave wanneer de algemene energie van die laatste optimaler is dan die van de eerste weergave; en (c) het beëindigen van het optimalisatieproces volgens stap (b) wan-35 neer een vooraf te bepalen beêindigingscriterium is be- 2001101 2 reikt; en (d) het uitvoeren naar een opslagmedium of naar een opvolgende methode van een gegevensstructuur omvattende informatie die is verkregen bij stap (b) . De inhoud van de Europese octrooiaanvrage met publicatienummer EP 1 226 528 is 5 hierbij door middel van referentie is zijn geheel opgenomen.

Deze bekende werkwijze heeft verscheidene nadelen. Bijvoorbeeld worden slechts de hoofdketen (het sjabloon) en de zijketens meegenomen voor het berekenen van de energie-waarde van verschillende conformationele structuren. Bij het 10 buigen van de moleculaire structuur worden slechts de ener-giewaarden van deze hoofdketen en zijketens berekend.

De onderhavige uitvinding heeft nu tot doel om een verbeterde werkwijze te verschaffen.

De uitvinding heeft tevens tot doel een nauwkeuriger 15 en betrouwbaardere werkwijze te verschaffen.

Tenslotte heeft de uitvinding tot doel een snellere werkwijze te verschaffen voor het verschaffen van informatie met betrekking tot een driedimensionale moleculaire structuur van een molecuul.

20 Om ten minste één van de hiervoor genoemde doelen te verkrijgen, verschaft de uitvinding een werkwijze die de stappen omvat zoals die zijn aangeduid in conclusie 1. Hierbij is gebleken dat het gebruik van de waterstofbrugenergie voor het berekenen van de energiewaarde van de structuur van 25 een molecuul een verbeterde werkwijze verschaft. Het is tevens gebleken dat de werkwijze het vooraf te bepalen criterium sneller en nauwkeuriger bereikt.

De werkwijze is betrouwbaarder geworden met de stappen volgens de onderhavige uitvinding.

30 Bovendien wordt gemeld dat de waterstofatomen die waterstofbruggen zullen vormen, die zijn, welke zijn bevestigd aan zuurstof- of stikstofatomen.

In overeenstemming met de uitvinding wordt een waterstof bindingspotentiaal Vm, geïntroduceerd als een supple-35 mentaire kracht in aanvulling op het standaardkrachtveld (bijvoorbeeld uit de werkwijze volgens EP 1 226 528), die inwerkt op de atomen die betrokken zijn bij de water stof binding om de eiwitvouwing in MD-simulaties te versnellen (MD = Mole- 3 cular Dynamics) . Dit wordt geïmplementeerd als een stapvormig MD-protocol, waarbij in overeenstemming met de onderhavige uitvinding drie stadia worden onderscheiden: het afstotende stadium (repulsief, *R"), het aantrekkende stadium (attracti-5 ve, "A") en het relaxerende stadium (relaxation, "E"). Deze drie stadia behandelen de waterstof bindingen alle verschillend. Tijdens "R" zal een potentiaal de breuk van een waterstof binding stimuleren, tijdens ”A" zal een potentiaal de vorming van een waterstof binding mogelijk maken, en tijdens 10 UE" zal het systeem de gelegenheid krijgen om te relaxeren. Tijdens de onderhavige simulaties is elk stadium actief gedurende bijvoorbeeld 0,5 ps in de volgorde —(—R - E - A - E —)—n.

Wanneer een stadium actief is, worden gedurende alle tijdframes (bijvoorbeeld 0,1 ps) alle intramoleculaire donor-15 acceptorparen van een eiwit beoordeeld. De relevante paren worden gekozen en potentialen worden geïntroduceerd die zullen leiden tot een kracht die inwerkt op de atomen. Een paar wordt uitgesloten van selectie wanneer het (a) een sterke water stof binding is (gekenmerkt door een donor-acceptorafstand 20 van minder dan bijvoorbeeld 0,35 nm en een donor-waterstof-acceptorhoek die groter is dan bijvoorbeeld 120°), (b) de atomen van het paar zijn betrokken bij een andere sterke water stof binding en (c) de atomen in het paar zijn reeds toegewezen aan een andere waterstofbindingspotentiaal (bijvoor-25 beeld uit een eerdere beoordeling). Voor de overige donor- acceptorparen worden die met de grootste waterstofbindingspo-tentiaalenergie (vergelijking 1) gekozen, met als algemene regel dat de atomen in een paar slechts eenmaal mogen worden gekozen.

30 Met betrekking tot de gebruikte potentiaal wordt het volgende opgemerkt: de waterstofbindingspotentiaal Vhb(q,t) wordt beschreven volgens (vergelijking 1).

35 = Ed(q(t„)yE0(q(tJ) (vergelijking 1)

Deze vergelijking is een functie van de tijd t en bestaat uit een afstandspotentiaal Edqftev)), een hoekpotentiaal 4 EMU*)), e©n tijdsafhankelijke krachtconstante fc(q,t) en de posities van de atomen in de waterstofbindingen q.

Tijdens het repulsieve stadium wordt de afstandspo-tentiaal EMt**)) bepaald door de afstand d (nm) tussen de do-5 nor en de acceptor (zie fig. 1) op de beoordelingstijd tev. De afsnijafstanden d^en dvan (bijvoorbeeld) 0,35 en 0,40 nm worden respectievelijk gebruikt. Voor het aantrekkende stadium ("attractive") wordt een waterstof en acceptor (zie fig.

1) beschouwd en de afsnijaf standen dmn en aU» zijn (bijvoor-10 beeld) respectievelijk 0,23 en 0,40 nm. De waarden van de afsnijaf standen zorgen ervoor dat slechts zwakke tot zeer zwakke waterstofbindingen worden betrokken.

«· ) . .. .

„ . , .. , dt, . (vergelijking 2) EMO) = \ 15 n o max ' ev'

De hoekpotentiaal E,(q(t„)) hangt af van de hoek Θ (in graden) van de donor-waterstof-acceptor (zie fig. 1) op het activeringstijdstip U,. De afsnijhoek Ommi in het repulsieve 20 stadium is in dit geval ingesteld op 120°, waardoor alle zwakke waterstofbindingen worden meegenomen en tijdens het attractieve stadium op 60° (hoewel andere waarden evengoed kunnen worden gekozen), waardoor de vorming van veel water-stofbindingen mogelijk wordt.

25 2.<ï(0) = { ! (vergelijking 3) L W 9bound>e(‘ct>

Een belangrijk concept van de onderhavige uitvinding is dat de krachten in het systeem geleidelijk kunnen toenemen 30 tijdens een cyclus, totdat een overschrijding van een barrière wordt verkregen. In dat geval zullen de krachten (potentialen) verdwijnen en zij zullen worden ingesteld op een waarde (nul) aan het eind van die cyclus.

De tijdsafhankelijke krachtconstante zorgt voor een 35 geleidelijke introductie van de krachten in het systeem. Deze is een functie van de maximale krachtconstante fc(kJ mol'1 nm'1) en de geleidelijke krachtsintroductietijd t9^ (ps) . heeft initieel de waarde van nul. Deze neemt toe met elke 5 tijdstap zolang de waterstofbinding waar deze op inwerkt, is gelegen binnen de afsnijafstand van de potentiaal, dat wil zeggen cU» Sd, <<W. Wanneer deze buiten het traject ligt, wordt deze afgetrokken. Wanneer de som kleiner wordt dan 0, wordt 5 tgrad ingesteld op 0. zorgt ervoor dat wanneer de waterstofbinding is gelegen binnen de grenswaarden van de afstandpo-tentiaal, de kracht wordt geïntroduceerd binnen 50 tijdstap-pen (verdelingsfactor in vergelijking 4) tot aan de maximale waarde ervan en wanneer deze is gelegen buiten deze grenzen, 10 wordt deze langzaamaan verminderd tot nul. De verdelingsfac-tor wordt willekeurig gekozen, op basis van het idee van het geleidelijk invoeren van krachten in het systeem tot een maximum. Om de maximale krachtconstante te verkrijgen, zijn verscheidene waarden onderzocht en degene die een goede res-15 pons verschaffen, dat wil zeggen veel gevallen van uitvouwen en vouwen, werden gebruikt.

=(vergelijking 4) 20 De waterstofbindingspotentiaal leidt tot de intro ductie van de volgende kracht die inwerkt op het acceptor-atoom (zie fig. 1).

(vergelijking 5) 25 [ 0 rest

De vereffenende kracht is FX=-FA. In deze vergelijkingen verwijst X naar het donoratoom in het repulsieve stadium en naar het waterstofatoom in het aantrekkende stadium 30 (zie fig. 1) .

Uitvoeringsvormen die de voorkeur hebben, worden specifiek aangeduid in de afhankelijke conclusies. De voordelen van die uitvoeringsvormen zullen duidelijk worden na de uitgebreide beschrijving van de uitvinding die hierna volgt.

35 Overigens wordt vermeld dat EP 1 226 528 het gebruik noemt van een bijdrage van waterstofbindingen in het molecuul. Dit is echter slechts voor het bepalen van de energie-waarden tussen de atomen in de hoofdketen en de zijketens, 6 omdat de aanwezigheid van een waterstofatoom op een zijketen of een hoofdketen invloed heeft op de energiewaarde tussen atomen in de hoofdketen en zijketens. De energiebijdrage van waterstofbruggen wordt in het algemeen niet in beschouwing 5 genomen. In overeenstemming met de hiervoor aangeduide Europese octrooiaanvrage met publicatienummer EP 1 226 528 wordt de conformatie van de hoofdketen niet bijgesteld wanneer veranderingen in de waterstofbindingen of waterstofbruggen worden verkregen. Voorts, wanneer de werkwijze volgens dit Euro-10 pese octrooi voortduurt, worden enkele residuen verwijderd van de optimalisatiecyclus terwijl delen (clusters van residuen) slechts worden gebruikt voor het berekenen van de algehele energie van het molecuul.

In algemene termen versnelt de onderhavige uitvin-15 ding het vouwen van eiwit in MD-simulaties van alle atomen door introductie van alternerende waterstofbindingspotentia-len als aanvulling op het krachtveld. De alternerende water-stofbindingspotentialen leiden tot een versnelde herordening van de waterstofbinding, wat weer leidt tot een snelle vor-20 ming van secondaire structuurelementen. De methode vereist geen kennis van de natieve toestand, maar levert de potentialen, gebaseerd op de ontwikkeling van de tertiaire structuur in de simulatie. Bij het vouwen van eiwit is de vorming van secundaire structuurelementen, in het bijzonder a-helix en β-25 sheet, zeer belangrijk en hier wordt aangetekend dat de onderhavige methode zowel efficiënt als met grote snelheid de vouwbewerking kan uitvoeren.

Het vouwen van een eiwit in de natieve toestand kan niet worden beschreven door een willekeurige zoektocht door 30 alle vrijheidsgraden, maar wordt geacht een geleid proces te zijn.

De werkwijze in overeenstemming met deze uitvinding is toepasbaar op niet alleen interacties binnen hetzelfde biomolecuul, maar ook op interacties met één of meer ver-35 schillende moleculen, eventueel als een complex van dat biomolecuul met een ander molecuul.

Hier wordt een nieuwe berekeningsmethode voorgesteld, gebaseerd op het idee dat het incidenteel (gedeelte- 7 lijk) ontvouwen van een eiwit de frequentie van het overkruisen van de barrières en de vouwsnelheid van eiwitten verbetert. Wij hebben MD-simulaties uitgevoerd waarbij wij periodiek tijdelijke supplementele (additionele) krachten intro-5 duceren die het ontvouwen en vouwen alternerend stimuleren. Deze krachten werken in op de intramoleculaire waterstofbin-dingen. De eerste reden hiervoor is vanwege het feit dat onderscheidende waterstofbindingen in een overeenkomstige context op gelijke wijze bijdragen aan een vrije energie, maar 10 een vrije energiebarrière alle mogelijke waterstofbindingen van elkaar scheidt. Met andere woorden: waterstofbindingen verschaffen een kinetische stabiliteit aan zowel het globale minimum als aan locale minima, en wel meer dan thermodynarai-sche stabiliteit. Dit heeft belangrijke implicaties: het ont-15 vouwen en vouwen kan worden gestimuleerd door het vereffenen van de activeringsenergie die wordt opgelegd door de kinetische barrière van een waterstofbinding. In aanvulling hierop verschaffen de waterstofbindingen een specificiteit in plaats van stabiliteit voor wat betreft de tertiaire structuur van 20 een eiwit, wat betekent dat de interacties die thermodynami-sche stabiliteit verschaffen, niet veranderd worden en nog steeds een gids vormen voor het vouwproces van het eiwit in de natieve toestand ervan, terwijl de tijd in de vrije ener-gieminima wordt verminderd. Een tweede, meer technische re-25 den, voor het beïnvloeden van de intramoleculaire waterstofbindingen is dat het aantal noodzakelijke additionele krachten minimaal is. Dit is vanwege het feit dat het aantal do-nor-acceptorpaarcombinaties in een eiwit beperkt is en de waterstofbindingen oriêntatie-afhankelijk zijn, waardoor 30 slechts een gering aantal relevante waterstofbindingspotenti-alen moet worden ingevoerd.

De manipulatie van de waterstofbindingen wordt uit-gevoerd binnen een enkele MD-simulatie, terwijl alternerende aantrekkende (attractieve) of repulsieve waterstofbindingspo-35 tentialen worden ingevoerd in aanvulling op de standaard krachtveldpotentialen. De repulsieve potentiaal destabiliseert de waterstofbindingen en brengt het eiwit naar een hoger vrij energieniveau. De attractieve potentiaal zorgt op 8 zijn beurt voor een waterstofbindingsvorming zodat een snelle identificatie van de conformationele gebieden van de vrije energieminima mogelijk wordt. Dergelijke locale mechanismen van ontvouwen/vouwen zijn vergelijkbaar met het barrièreover-5 stekende effect van een chaperoneiwit. In de onderhavige werkwijze is geen a priori informatie over de natieve toestand nodig; in plaats daarvan wordt hier gebruik gemaakt van de structuur van het eiwit zoals het zich ontwikkelt tijdens de simulatie om te bepalen welke potentialen worden geintro-10 duceerd.

Wij tonen aan dat manipulatie van water stof bindingen tijdens een MD-simulatie het vouwen van een eiwit kan versnellen. De twee secundaire structuurelementen die het meest voorkomen, a-helix en β-sheet, kunnen efficiënt worden gevou-15 wen. Dit wordt aangetoond door het vouwen van een polyalanine met 16 residuen naar de α-helische natieve toestand en het 16-residuen grote C-eindstandige deel van het 1GB1 eiwit naar de β-hairpin natieve toestand.

De werkwijze die hiervoor is weergegeven, beoogt de 20 in silico eiwitvouwbewerking te versnellen. Dit wordt verkregen door het manipuleren van de intramoleculaire waterstof-bindingen, wat leidt tot een toename in het aantal barrière-overgangen. Om aan te tonen dat dit inderdaad het geval is, werd het tijdsgedrag van een 16-residuen grote polyalanine 25 beoordeeld met standaard MD (4 simulaties van 30 ns) en met AHBP-MD (5 simulaties van 10 ns) . De simulaties werden gestart vanuit een in elkaar geklapte spiraal ("collapsed coil"), die een structuur voorstelt in een locaal minimum waarbij veel waterstofbindingen aanwezig zijn. De maximale 30 krachtconstante die wordt gebruikt in de MD-simulatie met AHBP bedroeg -600 kJ mol'1 nm'1 voor de attractieve potentiaal en 450 kJ mol"1 nm"1 voor de repulsieve potentiaal.

Om na te gaan of een snellere en bredere verzameling van de conformationele ruimte van een eiwit door de AHBP-MD-35 simulaties leidt tot snelle vorming van secundaire structuurelementen, werden twee systemen getest. De polyalanine-simulaties die werden gebruikt om de verbeterde barrièreover-schrijding in AHBP-MD aan te tonen, werden ook gebruikt voor 9 het testen van de geschiktheid van de AHBP-methode om a-helische secundaire structuur te vormen. Om de β-sheet secundaire structuurvorming te testen, hebben wij het vouwen onderzocht van een 16-residuen grote C-eindstandige groep van 5 het eiwit G (PDB-code 1GB1) , die in een waterige omgeving een β-hairpin conformatie aanneemt. Wij hebben 10 standaard MD-simulaties van 50 ns en 10 AHBP-MD-simulaties van 30 ns uitgevoerd, die alle begonnen bij een geëxtendeerde conformatie. In deze AHBP-MD-simulaties van de β-hairpin hebben wij een 10 maximale krachtconstante van -300 kJ mol'1 nm'1 voor de attractieve potentiaal en 900 kJ mol"1 nm'1 voor de repulsieve potentiaal gebruikt.

Voor de polyalanine simulaties is het gemiddelde aantal residuen in een α-helische conformatie bepaald. De N-15 en C-terminus worden niet beschouwd omdat zij te mobiel zijn. Hierdoor is het duidelijk dat binnen de zeer korte tijd van de AHBP-simulatie een snelle vorming van a-helix secundaire structuur plaatsvindt. De snelste vorming van een volledige helix wordt reeds gezien binnen 6 ns en alle simulaties tonen 20 een vorming van de α-helische structuurelementen. In onze vier standaard MD-simulaties hebben wij slechts één kort optreden van een a-helix vorming gezien, wat bevestigt dat a-helix vorming veel sneller is en veel vaker voorkomt wanneer AHBP wordt aangezet.

25 Om de β-sheet vorming te testen in de simulatie van het vouwen van 1GB1 β-hairpin, hebben wij het gemiddeld aantal residuen in een β-sheet conformatie versus de simulatie-tijd bepaald. In de AHBP-MD-simulaties wordt een snelle toename van een aantal residuen in een β-sheet conformatie ge-30 zien, terwijl in de standaard MD-simulaties dit aantal niet zo hoog is en niet zo consistent is. In aanvulling op a-helix vorming kunnen AHBP-MD-simulaties derhalve ook leiden tot een snelle vorming van β-sheet secundaire structuur.

2001101

Claims (8)

1. Werkwijze voor het verschaffen van informatie over een 3-dimensionale moleculaire structuur van een molecuul , waarbij de methode kan worden uitgevoerd door een computer onder aansturing van een programma dat in de computer 5 is opgeslagen, waarbij de werkwijze de stappen omvat van: (a) het ontvangen van een 3-dimensionale weergave van de moleculaire structuur van het molecuul, omvattende een eerste set residuen en een sjabloon; (b) het herhalen van een optimalisatiecyclus, waar-10 bij een set wordt herhaald bestaande uit: (bl) het modificeren van de moleculaire structuur van één of meer van de eerste set van residuen, (b2) het relaxeren van de gemodificeerde structuur, (b3) het berekenen van een energiewaarde van de 15 structuur; (c) totdat aan een vooraf te bepalen criterium is voldaan; en (d) het uitvoeren van een gegevensstructuur omvattende informatie die is geëxtraheerd uit één van de genoemde 20 stappen naar een opslagmedium of naar een volgende methode, met het kenmerk, dat de 3-dimensionale weergave van het molecuul een set van zuurstofgebonden of stikstofgebonden waterstof residuen omvat en stap (b3) de stap omvat van het berekenen van de energiewaarde van de water stof bruggen in de struc-25 tuur.

2. Methode in overeenstemming met conclusie 1, met het kenmerk, dat de waterstofresiduen deel uitmaken van de eerste set van residuen.

3. Methode in overeenstemming met conclusie 1 of 2, 30 met het kenmerk, dat de energiewaarde van de waterstof bruggen wordt berekend en wordt toegevoegd aan de energiewaarde van de structuur.

4. Methode in overeenstemming met één der conclusies 1-3, met het kenmerk, dat het molecuul een biomolecuul is.

5. Methode in overeenstemming met één der voorgaande 2001101 » conclusies 1-4, met het kenmerk, dat het biomolecuul bestaat uit een polypeptide, een polynucleotide, een polysaccharide, en een complex omvattende ten minste één biologisch actie£ (macro)molecuul.

6. Methode in overeenstemming met één der conclusies 1-5, met het kenmerk, dat het biomolecuul interactie vertoont met één of meerdere verschillende moleculen en waarbij de methode de stappen omvat van (a2) het ontvangen van een 3-dimensionale weergave van de moleculaire structuur van het 10 biomolecuul met het ene of met meerdere verschillende moleculen, eventueel met het ontvangen van een 3-dimensionale weergave van de moleculaire structuur van het biomolecuul in complex met het ene molecuul of met meerdere verschillende moleculen.

7. Rekeninginrichting voor het vormen van informatie over een 3-dimensionale moleculaire structuur van een molecuul, waarbij de rekeninrichting omvat: (a) middelen voor het ontvangen van een 3-dimensionale weergave van de moleculaire structuur van het 20 molecuul, omvattende een eerste set van de residuen en een sjabloon; (b) middelen voor het herhalen van een optimalisa-tiecyclus, omvattende: (bl) het modificeren van de moleculaire structuur 25 van één of meer van de eerste set van residuen, (b2) het relaxeren van de gemodificeerde structuur, (b3) het berekenen van een energiewaarde van de structuur; (c) middelen voor het beëindigen van de optimalisa-30 tiecyclus wanneer aan een vooraf te bepalen criterium is voldaan; en (d) middelen voor het uitvoeren van een gegevensstructuur omvattende informatie die is geëxtraheerd uit één van deze stappen naar een opslagmedium of naar een opvolgende 35 methode, met het kenmerk, dat de middelen voor het ontvangen van een 3-dimensionale weergave van de moleculaire structuur van het molecuul, middelen omvatten voor het ontvangen van een set waterstofresiduen en waarbij de middelen van stap (b) middelen omvatten voor het berekenen van de energiewaarde van waterstofbruggen in de structuur in stap (b3).

8. Softwareproduct, ingericht om te worden uitgevoerd op een rekeninrichting, waarbij het product software 5 omvat voor: (a) het ontvangen van een 3-dimensionale weergave van de moleculaire structuur van het molecuul, omvattende een eerste set residuen en een sjabloon; (b) het herhalen van een optimalisatiecyclus, omvat- 10 tende: (bl) het modificeren van de moleculaire structuur van één of meer van de eerste set van residuen, (b2) het relaxeren van de gemodificeerde structuur, (b3) het berekenen van een energiewaarde van de 15 structuur; (c) totdat aan een vooraf te bepalen criterium is voldaan; en (d) het uitvoeren van een gegevensstructuur omvattende informatie die is geëxtraheerd uit één van de genoemde 20 stappen naar een opslagmedium of naar een volgende methode, net het kenmerk, dat het product is ingericht voor het berekenen van de energiewaarde van de waterstofbruggen en het toevoegen van de waarde aan de energiewaarde van de structuur. 2001101