NL1034267C2

NL1034267C2 - Werkwijze voor het meten van zaadkwaliteit.

Info

Publication number: NL1034267C2
Application number: NL1034267A
Authority: NL
Inventors: Hendrikus Wilhelmus Maria Hilhorst; Jan Willem Ligterink; Jan Kodde; Michiel Lammers
Original assignee: Stichting Tech Wetenschapp
Priority date: 2007-08-17
Filing date: 2007-08-17
Publication date: 2009-02-18
Also published as: WO2009025550A1

Description

Titel: Werkwijze voor het meten van zaadkwaliteit

GEBIED VAN DE UITVINDING

De uitvinding betreft een werkwijze voor het meten van de zaadkwaliteit van een monster van zaad van een plant. De uitvinding heeft voorts betrekking op de toepassing van ten minste één gen dat differentieel 5 tot expressie komt tussen priming en kieming van zaad van een plant als een indicator van zaadkwaliteit, en op een werkwijze voor het selecteren van een plant in een zaadveredelingsprogramma op basis van zaadkwaliteit.

ACHTERGROND VAN DE UITVINDING 10 De kwaliteit van plantenzaad wordt bepaald door een samenstel van eigenschappen en factoren. Behalve intrinsieke eigenschappen als kiemkracht, stressbestendigheid en de bruikbaarheid van de uiteindelijk uit het zaad voortkomende plant, zijn bijvoorbeeld ook factoren als de hoeveelheid aanwezig ongewenst materiaal, zoals schadelijk onkruidzaad, 15 zaad van ongewenste gewassen of inerte materialen, en de aanwezigheid van zaad-gedragen ziekten van belang. Immers, ook deze factoren kunnen de kwaliteit en opbrengst van het gewas wezenlijk beïnvloeden en bepalen daarom mede de uiteindelijke waarde van een hoeveelheid zaad.

Desondanks zijn de intrinsieke eigenschappen van het zaad zeer wezenlijk 20 voor de zaadkwaliteit.

Een van de belangrijkste eigenschappen van het zaad die bijdragen aan de zaadkwaliteit is de kiemkracht van het zaad. Met de term kiemkracht wordt verwezen naar het vermogen van het zaad om onder gunstige of optimale groeiomstandigheden uit te groeien tot een gezonde 25 plant. De kiemkracht wordt doorgaans getest onder gecontroleerde en optimale condities van vocht, temperatuur en licht. Dergelijke optimale omstandigheden worden in het veld echter zelden aangetroffen, en een 1 0342 67 2 kiemtest geeft daarom vaak een overschatting van de werkelijke kiemkracht die onder veldomstandigheden zal worden ervaren, en dus van de reële zaadkwaliteit. Onder veldomstandigheden zal van het zaad worden verwacht dat het tevens onder minder gunstige omstandigheden zal 5 ontkiemen en zal uitgroeien tot een gezonde plant. Dit vermogen komt tot uiting in de vigour en in de stressbestendigheid van het zaad. De meting van de bovenstaande parameters van zaadkwaliteit omvatten doorgaans een uitgebreide testprocedure waarbij de snelheid en de kwaliteit van het gehele ontwikkelingsproces van zaad tot gewas wordt gevolgd en beoordeeld. Een 10 resultaat daarvan is dat het geteste zaad niet meer als zaad beschikbaar is omdat het is ontkiemd.

Terwijl de bovenstaande eigenschappen voor ieder zaadje individueel bepaald kunnen worden en bijgevolg intrinsiek voor het individuele zaadje zijn, voor een goede agronomische prestatie is het ook 15 van belang dat een uitgezaaide partij zaad als geheel (‘overall’) goed presteert. Een andere belangrijke eigenschap van zaad die met kieming samenhangt, is dan ook het moment van ontkieming van het zaad. Bij voorkeur ontkiemen alle zaden ongeveer op hetzelfde moment, zodat alle zaailingen zich in hetzelfde groeistadium bevinden. Dit laatste kan worden 20 bewerkstelligd door een proces dat bekend staat als “priming”. Priming omvat een gedeeltelijke hydratatie van het zaad waarbij wordt toegestaan dat een aantal metabole processen betrokken bij kieming in gang wordt gezet, echter, zonder de wortelpunt door de zaadhuid te laten breken. De behandeling van zaden op deze wijze resulteert na droging en eventuele 25 bewaring over het algemeen in een uniformere en snellere kieming. Priming wordt algemeen door zaadbedrijven toegepast om de zaadkwaliteit - zowel intrinsiek als overall - te verbeteren.

Priming procedures worden ontwikkeld op basis van ‘trial and error’, waarbij de uiteindelijke uniformiteit en snelheid van ontkieming en 30 de groeikracht voor iedere afzonderlijke partij zaad wordt bepaald. Dit is 3 een tijdrovende activiteit. Er bestaan op dit moment geen werkwijzen om de doelmatigheid van de primingprocedure gedurende het primingsproces te bepalen of te controleren. Belangrijker nog, er bestaat op dit moment weinig inzicht in de invloeden die het primingsproces op het zaad zelf uitoefent, en 5 met name de invloed van priming op de verschillende intrinsieke parameters van zaadkwaliteit.

De onderhavige uitvinding heeft ten doel om te voorzien in een werkwijze om de zaadkwaliteit te meten zonder het zaad te laten ontkiemen.

10 De onderhavige uitvinding heeft tevens ten doel om te voorzien in een werkwijze waarbij de zaadkwaliteit gedurende het primingsproces kan worden gecontroleerd en zonodig aangepast.

De onderhavige uitvinding heeft tevens ten doel om te voorzien in een werkwijze voor het selecteren van planten in een veredelingsproces op 15 basis van de kwaliteit van het zaad dat dergelijke planten (kunnen) voortbrengen.

SAMENVATTING VAN DE UITVINDING

De onderhavige uitvinders hebben nu gevonden dat de kwaliteit 20 van plantenzaad zeer geschikt met behulp van moleculair biologische meettechnieken kan worden vastgesteld. In het bijzonder is nu gevonden dat het expressieniveau van een aantal specifieke genen voorspellend is voor afzonderlijke en veelal zeer uiteenlopende parameters van zaadkwaliteit. Metingen aan het genexpressiepatroon in zaden tijdens priming en kieming 25 hebben aangetoond dat de expressie van specifieke genen tijdens priming voorspellend is voor de uniformiteit en de snelheid van kieming. Dit is des te verrassender omdat deze specifieke genen differentieel tot expressie komen tussen priming en kieming, d.w.z. genen vertegenwoordigen op basis waarvan kieming en priming als verschillende processen moeten worden 30 aangemerkt.

4

Er is nu dus gevonden dat genen die differentieel tot expressie komen tussen kieming en priming kunnen worden toegepast om het primingsproces met betrekking tot kiemsnelheid en uniformiteit te controleren en te optimaliseren, en dat het expressieniveau in zaad van deze 5 genen een merker is voor de zaadkwaliteit.

Verrassenderwijs is tevens gevonden dat ook stressbestendigheid van geprimede zaden kan worden voorspeld aan de hand van een specifiek genexpressiepatroon of genexpressieniveau van een specifiek gen.

In een eerste aspect verschaft de onderhavige uitvinding een 10 werkwijze voor het meten van de zaadkwaliteit van (of in) een monster van zaad van een plant, welke werkwijze de volgende stappen omvat: - het verschaffen van een ijklijn voor zaad van genoemde plant waarin het genormaliseerd expressieniveau van ten minste één gen dat differentieel tot expressie komt tussen priming en kieming van zaad van 15 genoemde plant is uitgezet tegen de zaadkwaliteit van zaad van genoemde plant - het meten van het genormaliseerd expressieniveau van genoemd ten minste één gen in genoemd monster, en - het aflezen van de zaadkwaliteit van genoemd monster uit 20 genoemde ijklijn.

In een voorkeursuitvoeringsvorm van een werkwijze volgens de uitvinding omvat de genoemde zaadkwaliteit ten minste twee parameters van zaadkwaliteit gekozen uit de groep bestaande uit de vitaliteit, kiemsnelheid, kiemenergie, en kiemkracht, onder optimale en onder 25 suboptimale (stress) condities.

In een andere voorkeursuitvoeringsvorm van een werkwijze volgens de uitvinding omvat de genoemde zaadkwaliteit ten minste twee parameters gekozen uit vitaliteit, stressbestendigheid en vigour.

De onderhavige uitvinding verschaft dus werkwijzen voor de 30 gelijktijdige bepaling van het samenstel van diverse parameters die alleen 5 of in combinatie de zaadkwaliteit bepalen onder toepassing van een moleculair biologische meettechniek.

Een dergelijke werkwijze heft o.a. het probleem op dat kiemtests geen goede weergave zijn van het kiemvermogen onder 5 veldomstandigheden. Immers, de uitvinding maakt het mogelijk om het kiemvermogen onder veldomstandigheden (stressbestendigheid, vigour en vitaliteit onder stress) direct te bepalen.

In een ander aspect verschaft de onderhavige uitvinding de toepassing van ten minste één gen dat differentieel tot expressie komt 10 tussen priming en kieming van zaad van een plant als een indicator van zaadkwaliteit of als een marker voor de (verbetering van) zaadkwaliteit in een zaadveredelingsprogramma.

De onderhavige uitvinding verschaft dan ook tevens een werkwijze voor het selecteren van een plant in een zaadveredelingsprogramma, 15 omvattende het meten van de zaadkwaliteit van een monster van zaad van genoemde plant met een werkwijze volgens de onderhavige uitvinding, en het selecteren van genoemde plant als een kandidaat ouderplant binnen het zaadveredelingsprogramma ingeval het resultaat van de meting uitwijst dat de zaadkwaliteit een gewenst niveau heeft.

20

BESCHRIJVING VAN DE FIGUREN

Figuur 1 toont een gecombineerde blok-lijn grafiek van de relatieve expressie (blok, linker y-as) van het betreffende gen (FBA) in zaad geprimed volgens één van 8 verschillende (niet-publieke) procedures ten 25 opzichte van de controles (Cl en C2) en de relatie met de geteste fysiologische parameter, in dit geval de kiemkracht bij 35 °C uitgedrukt als een percentage (lijn, rechter y-as). De Pearson correlatie is -0.88 (zie Tabel 2; FBA / KK 35).

Figuur 2 toont een gecombineerde blok-lijn grafiek van de 30 relatieve expressie van FBA in zaad geprimed volgens één van 8 6 verschillende (niet-publieke) procedures ten opzichte van de controles (Cl en C2) en het percentage abnormale planten bij 15°C. De Pearson correlatie is 0.85 (zie Tabel 2; FBA / AB 15).

Figuur 3 toont een gecombineerde blok-lijn grafiek van de 5 relatieve expressie van FBA in zaad geprimed volgens één van 8 verschillende (niet-publieke) procedures ten opzichte van de controles (Cl en C2) en de kiemkracht bij 25°C. De Pearson correlatie is -0.42 (zie Tabel 2; FBA / KK 25).

Figuren 4-11 tonen de Unigene sequenties van genen die 10 differentieel tot expressie komen tussen priming en kieming van tomatenzaad.

GEDETAILLEERDE BESCHRIJVING VAN DE UITVINDING

De term “kiem” zoals hierin gebruikt kan verwijzen naar het 15 embryo in het rijpe zaad.

De term “kiemplant” verwijst naar de jonge zaailing.

De termen “kiemen”, “kieming” en “ontkiemen” zoals hierin gebruikt zijn onderling uitwisselbaar en verwijzen naar het eerste stadium in de ontwikkeling van een plant uit zaad, met name het moment waarop 20 het kiemworteltje door de zaadhuid en/of pericarp breekt.

De term “priming” verwijst naar het proces van osmoconditionering van zaad, waarbij het zaad voorafgaand aan het zaaien een (gedeeltelijke) hydratatie ondergaat waarbij wordt toegestaan dat een aantal metabole processen dat betrokken is bij de ontwikkeling van zaad tot 25 plant in gang wordt gezet, maar waarbij het proces wordt gestopt voordat de wortelpunt door de zaadhuid breekt. Het proces wordt doorgaans gestopt door droging.

De term “geprimed” verwijst naar zaad dat een primingsprocedure heeft ondergaan.

7

De term “kiemkracht” zoals hierin gebruikt, verwijst naar het percentage zaden dat na een bepaalde periode (bijv. 7 dagen) onder optimale omstandigheden een volwaardige kiemplant geeft. Voor het bepalen van de kiemkracht is een representatief monster nodig. De monstername en de 5 bepalingsmethode voor de kiemkracht wordt in het handboek voor monstername van de International Seed Testing Association (ISTA) beschreven. De optimale temperatuur voor ontkieming van tomatenzaad is 23° C. Een hoge kiemkracht van het zaad betekent niet per definitie een hoge veldopkomst. Een betere maat daarvoor is de vigour. Onderzoek naar 10 de kiemkracht bij ongunstige omgevingscondities (bijv. een verhoogde of verlaagde temperatuur) kan informatie opleveren over de vigour van het zaad.

De “kiemenergie” is een maat voor de snelheid van kiemen en de vitaliteit van het zaad. De kiemenergie wordt doorgaans op dezelfde manier 15 bepaald als de kiemkracht, maar dan in een kortere periode (bijv. 3 dagen). Zaad heeft een hoge kiemenergie als uit een hoog percentage van de zaden een kiemworteltje voortkomt. Kiemenergie betreft dus louter het vermogen van het zaad om te ontkiemen terwijl kiemkracht verwijst naar het vermogen van het zaad om na ontkieming goed door te groeien tot een klein 20 kiemplantje. Onderzoek naar de kiemenergie bij ongunstige of sub-optimale omgevingsomstandigheden (bijv. een verhoogde of verlaagde temperatuur) kan informatie opleveren over de stressbestendigheid van het zaad.

De term “stressbestendigheid" of “stresstolerantie” zoals hierin gebruikt, verwijst naar het vermogen van zaad om tot ontkieming te komen 25 onder sub-optimale omstandigheden of na kortere of langere periodes van ongunstige omstandigheden. Meting van de stressbestendigheid van zaad kan plaatsvinden door de kiemenergie te bepalen onder sub-optimale omstandigheden.

De term “kiemsnelheid” verwijst naar de periode (in dagen of 30 uren) waarbinnen tot 50% van de zaden tot ontkieming komt.

8

De term ‘vigour’ wordt doorgaans gebruikt om te verwijzen naar zowel het vermogen van het zaad om te ontkiemen onder sub-optimale (stress) omstandigheden, als ook naar het vermogen van het zaad om te ontkiemen en uit te groeien tot een autotrofe zaailing onder sub-optimale 5 omstandigheden. Als zodanig omvat de term dus zowel de kiemenergie als kiemkracht onder sub-optimale omstandigheden. Er wordt met nadruk op gewezen dat de term “vigour” zoals hierin gebruikt, verwijst naar het vermogen van zaad om onder sub-optimale omstandigheden toch een goede kieming te vertonen en uit te groeien tot een autotrofe zaailing en gewas, 10 d.w.z. kiemkracht onder sub-optimale omstandigheden. Zoals hierin gebruikt verhoudt de term zich tot kiemkracht, zoals stressbestendigheid zich verhoudt tot kiemenergie.

De term “bruikbare plant” verwijst naar een plant die geen abnormale plant is en om die reden bruikbaar is voor de commerciële teelt. 15 Een abnormale (tomaten)plant kenmerkt zich door een zaailing die zeer klein (<50% in lengte) is ten opzichte van de gemiddelde grootte, met zware schade aan enig plantendeel of zonder een zichtbaar apicaal groeipunt of enig ander kenmerk zoals vermeld in ISTA Handbook on Seedling Evaluation, Section 15, Seedling Type E - Seedling Group A-2-1-1-1.

20 De term “priming” zoals hierin gebruikt verwijst naar het proces van voorkieming, en omvat een gedeeltelijke hydratatie van het zaad waarbij wordt toegestaan dat een aantal cellulaire processen betrokken bij kieming wordt gestart, echter, zonder het kiemworteltje door de zaadhuid te laten breken. Deze waterbehandeling van zaden resulteert over het 25 algemeen in een uniformere en snellere kieming. Priming kan bijvoorbeeld plaatsvinden door osmopriming, trommel-priming of matrix-priming. Osmopriming is een vorm van zaadpriming waarbij zaden worden geweekt in een beluchte oplossing met een lage waterpotentiaal. Gewoonlijk wordt een polyethyleenglycol- (PEG) of een zoutoplossing gebruikt om de 30 waterpotentiaal te verlagen en de wateropname te controleren. Hierdoor 9 kan worteldoorbraak (kieming) worden voorkomen. Trommel-priming is een methode waarbij de zaden in een draaiende trommel in beweging worden gehouden waarbij zij in contact worden gebracht met water in de vloeibare vorm of in de vorm van waterdamp. Zie bijvoorbeeld US5,119,589 en 5 US6,421,956. Doorgaans wordt na of als onderdeel van het primingsproces het zaad teruggedroogd. Matrix-priming is een methode waarbij het zaad wordt geprimed terwijl het is vermengd met een vast materiaal dat het vermogen heeft om veel water vast te houden (bijv. een slurrie van PEG en vermiculiet). Voorbeelden van deze methode worden o.a. beschreven in US 10 4,912,874 en US 5,974,734.

“Genexpressie” is hierin gedefinieerd als het proces waarbij de genetische informatie die is gecodeerd in het DNA wordt omgezet in een uiteindelijk genproduct (d.w.z., een eiwit of een van verschillende vormen van RNA).

15 Een “expressiepatroon” is een weergave van het niveau van de expressie van één of meer genen, meestal een pluraliteit van genen, doorgaans verkregen met behulp van PCR en/of microarray-gebaseerde detectiemethoden. Het expressieniveau van één of meer genen weerspiegelt de constitutie en het functioneren van de cel onder bepaalde 20 omstandigheden en verandert wanneer de cel structurele veranderingen moet ondergaan om ander cellulaire processen te kunnen ondersteunen waarbij de producten van deze genen in potentie betrokken zijn.

In principe kan ieder willekeurig plantenzaad worden toegepast in een werkwijze volgens de uitvinding. Zeer geschikt zijn gewas en 25 groentezaden, waaronder zaden van tarwe, haver, gerst, maïs, rogge, gierst, rijst, soja, raapzaad, lijnzaad (vlas), koolzaad, zonnebloem, wortel, schorseneer, pronkboon, stamboon, stokboon, sperzieboon, slaboon, tuinboon, (dop)erwt, lupine, tomaat, paprika, peper, (water)meloen, pompoen, komkommer, aubergine, courgette, ui, prei, sla, andijvie, spinazie, 30 veldsla, augurk, witte kool, rode kool, savooie kool, spitskool, Chinese kool, 10 paksoi, sluitkool, bloemkool, spruitkool, suikerbiet, biet, kohlrabi, cichorei, witlof, artisjok, asperge, broccoli, knolselderij, bleekselderij, radijs, gras en kruiden. Een plantenzaad is bij voorkeur een zaad van tomaat (Solarium lycopersicum) of paprika (Capsicum spp.).

5 Een werkwijze volgens de uitvinding omvat de meting aan een monster zaad van een gen dat differentieel tot expressie komt tussen priming en kieming. Een dergelijk gen kan geschikt worden gevonden door het expressieprofiel tijdens priming (bijv. aan zaden die priming ondergaan of aan geprimede zaden) en het genexpressieprofiel tijdens kieming (bijv.

10 aan ontkiem(en)de zaden) te meten. Genen die wel tijdens kieming en niet tijdens priming, of vice versa, tot expressie komen, worden differentieel tot expressie gebracht volgens de definities van de onderhavige uitvinding.

In tomaat zijn diverse genen gevonden die differentieel tot expressie komen tussen priming en kieming van zaad. Een groot aantal 15 hiervan is zeer goed toepasbaar in een werkwijze volgens de uitvinding omdat zij een bewezen correlatie vertonen met één of meer parameters van zaadkwaliteit. Bij voorkeur omvat een gen waarvan de expressie wordt bepaald een sequentie gekozen uit één van SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 en 15, of een homoloog daarvan. Een homoloog heeft een identiteit met de 20 gensequentie van meer dan 80%, bij voorkeur meer dan 85%, met grotere voorkeur meer dan 90%, met de sequentie van één van SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 en 15.

De sequenties van SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 en 15 zijn ieder afzonderlijk zogenaamde Unigene sequenties, hetgeen inhoudt dat deze 25 afzonderlijke sequenties in een pluraliteit van gensequenties van verschillende origine (bij voorkeur wel hetzelfde soort organisme, bijv. tomaat) voorkomen, welke gensequenties gemeenschappelijk hebben dat zij coderen voor een specifiek genproduct. Unigene sequenties zijn cDNA sequenties afkomstig van mRNA, hetgeen betekent dat hierin slechts een 30 deel van het gen wordt weerspiegeld.

11 SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 en 15 staan voor de volgende eiwitten: histone Hl.41 (HIST; vertegenwoordigd door SEQ ID NO. 1); metallothionein-like protein (MTLP; vertegenwoordigd door SEQ ID NO. 3); fructose-bisphosphate aldolase (FBA; vertegenwoordigd door SEQ ID 5 NO. 5); Acidic 26 kDa endochitinase precursor (AEP; vertegenwoordigd door SEQ ID NO. 7); putative glutathione S-transferase (PGST; vertegenwoordigd door SEQ ID NO. 9); late-embryogenesis protein homolog (LEA; vertegenwoordigd door SEQ ID NO. 11); Protein NP24 precursor (Pathogenesis-related protein PR P23) (NP24; vertegenwoordigd door SEQ 10 ID NO. 13) en unknown protein (UP; vertegenwoordigd door SEQ ID NO.

15) (een onbekend eiwit dat sterke homologie vertoont met oxidase-like-protein).

Het gen waar van de expressie wordt gemeten in een werkwijze volgens de onderhavige uitvinding is bij voorkeur het gen coderend voor 15 fructose-bisphosphate aldolase (FBA); putative glutathione S-transferase (PGST); late-embryogenesis protein homolog (LEA); Protein NP24 precursor (Pathogenesis-related protein PR P23) (NP24) en/of unknown protein (UP).

In een werkwijze volgens de onderhavige uitvinding kan het expressieniveau in principe met iedere beschikbare methodiek worden 20 gemeten. Bij voorkeur wordt het expressieniveau gemeten met behulp van kwantitatieve RT-PCR, een gene-chip array, of met een in situ kleuringstechniek, met grote voorkeur met behulp van een gene-chip array. Op deze wijze kan een volledig genexpressieprofiel voor het zaad worden verkregen.

25 Een meting met een gene-chip array omvat zeer geschikt een meting aan cDNA verkregen van mRNA geïsoleerd uit een monster van het te onderzoeken zaad.

De werkwijze volgens de uitvinding omvat het produceren van een ijklijn. De ijklijn wordt geproduceerd door het expressieprofïel van een groot 30 aantal partijen zaad van uiteenlopende zaadkwaliteit aan een 12 expressieanalyse te onderwerpen. Bij voorkeur wordt uiteraard ingezoomd op de differentieel tot expressie gebrachte genen tussen priming en kieming, en behoeft dus geen volledig (genoom-omvattend) genexpressieprofiel te worden bepaald.

5 In principe kan op ieder willekeurige wijze een verscheidenheid aan zaad van uiteenlopende zaadkwaliteit worden verkregen. Zeer geschikt is de zaden (uiteraard van overeenkomstige plantensoorten, bij voorkeur nog van overeenkomstige plantenvariëteiten) te onderwerpen aan een groot aantal verschillende procedures van priming. Hierdoor wordt bewerkstelligd 10 dat diverse parameters van de zaadkwaliteit (bijv. kiemenergie, stressbestendigheid, etc.) in verschillende mate in het behandelde zaad tot uiting komen.

Zeer geschikt is het genormaliseerd expressieniveau zoals gebruikt in een werkwijze volgens de uitvinding het verschil in 15 expressieniveau ten opzichte van onbehandeld en niet ontkiemd zaad. Om het opstellen en het aflezen van de ijklijn te vergemakkelijken is een normalisering ten opzichte van onbehandeld (bijv. niet-geprimed) zaad zeer geschikt omdat hierdoor het effect van de behandeling als gevolg waarvan de verscheidenheid aan zaad van uiteenlopende zaadkwaliteit werd 20 verkregen (bijv. verschillen in primingsmethodes) beter kan worden bestudeerd.

Een ijklijn voor toepassing in een werkwijze volgens de onderhavige uitvinding, wordt bij voorkeur vooraf geproduceerd, zodat de bepaling van de zaadkwaliteit aan een monster slechts het meten van het 25 expressieniveau van ten minste één gen als boven gedefinieerd in een monster van te onderzoeken zaad omvat. In principe is ieder zaad geschikt om onderworpen te worden aan een werkwijze voor bepaling van de zaadkwaliteit volgens de uitvinding. Bij voorkeur heeft een monster van zaad waarvan de kwaliteit wordt bepaald een primingsbehandeling 13 ondergaan of ondergaat het op het moment van meting een primingsbehandeling.

De werkwijze volgens de uitvinding kan zeer geschikt worden toegepast als onderdeel van een werkwijze voor het selecteren van zaad.

5 Een dergelijke werkwijze omvat zeer geschikt de stappen van het optioneel primen van zaad, het meten van de zaadkwaliteit van een monster van het optioneel geprimede zaad met een werkwijze volgens de onderhavige uitvinding, en het selecteren van zaad met de gewenste zaadkwaliteit.

Een gewenste zaadkwaliteit kan bijvoorbeeld een hoge 10 stressbestendigheid inhouden, dit betekent dat het zaad ook een goede ontkieming vertoont in geografische gebieden met een overheersende temperatuur buiten het bereik van 20-25 °C. Dit kan voor bepaalde plantenvariëteiten, die bijvoorbeeld in mediterrane of (sub)tropische, of juist in koelere (e.g. boreale) gebieden verbouwd gaan worden van voordeel zijn. 15 Andersom kan een gewenste zaadkwaliteit inhouden dat de opbrengst aan bruikbare planten hoog is, zelf zo hoog dat vrijwel ieder uitgezaaid zaadje in een bruikbare plant resulteert. Dit kan ten koste gaan van de kiemenergie, maar zal de monetaire waarde per zaadje significant verhogen.

De onderhavige uitvinding voorziet voorts in de toepassing van ten 20 minste één gen dat differentieel tot expressie komt tussen priming en kieming van zaad van een plant, zoals hierin gedefinieerd, als een indicator van zaadkwaliteit. Met de term “indicator” wordt hierin de voorspellende waarde op de zaadkwaliteit bedoeld die het expressieniveau van geselecteerde genen kan hebben.

25 Zo kan een gen dat differentieel tot expressie komt tussen priming en kieming zelfs worden toegepast als een marker voor de verbetering van zaadkwaliteit in een zaadveredelingsprogramma.

De genen en hun expressieprofielen kunnen worden gebruikt om de primingsprocedure te controleren en te optimaliseren voor bijvoorbeeld 30 verbeterde stress tolerantie. De werkwijze volgens de uitvinding kan dus 14 zeer geschikt worden toegepast als onderdeel van een werkwijze voor het optimaliseren van een primingsproces, waarbij de zaadkwaliteit van zaadmonsters onderworpen aan verschillende primingsprocessen wordt bepaald en het proces dat de gewenste zaadkwaliteit oplevert als optimaal 5 wordt aangewezen. Het optimale primingsregime kan vervolgens worden toegepast in een werkwijze voor het primen van zaad.

Tevens kunnen optimale resultaten van priming gedurende het proces worden voorspeld. De genen die kunnen worden gevonden zoals hierin beschreven en die vervolgens volgens de onderhavige uitvinding met 10 dat doel worden toegepast maken het mogelijk om de groeikracht van zaailingen te voorspellen. Het testen van de doelmatigheid van priming gedurende de primingsprocedure zal ook de mogelijkheid van over-priming (priming voor een te lange periode, waardoor de zaadkwaliteit kan teruglopen) verminderen.

15 De vakman zal onderkennen dat bijvoorbeeld het selecteren op tomaat met zaden met een laag niveau van fructose bisfosfaat aldolase deze zaden met een hoge kiemenergie, een hoge kiemkracht, en een hoge vitaliteit onder suboptimale (stress) condities verschaft.

Deze en andere varianten op uitvoeringsvormen als hierin 20 beschreven zijn onderdeel van de onderhavige uitvinding.

VOORBEELDEN

Voorbeeld. Bepaling van de kwaliteit van tomatenzaad.

Introductie 25 Met behulp van differentiële genexpressie studies met DNA arrays, hieronder in meer detail beschreven, werd gevonden dat de processen van priming en kieming van tomatenzaad een verschil in 15 genen opleverde. Om de expressiepatronen van deze 15 genen te koppelen aan de zaadkwaliteit, werd zaad van 2 verschillende tomaten cultivars met in 30 totaal 8 verschillende primingmethodes behandeld. Dit zaad werd 15 vervolgens getest op verschillende parameters van zaadkwaliteit. Vergelijking van de expressieniveaus van deze 15 genen in geprimed en niet geprimed zaad met behulp van kwantitatieve RT-PCR resulteerde in 8 genen die een significante correlatie vertoonden met een of meer parameters 5 van zaadkwaliteit.

Materialen en Methoden IJklijn

Voor de ijklijn van tomatenzaad werden zaden van 2 verschillende 10 rassen Solanum lycopersicum toegepast (Velocity en Rally) en de variëteit Moneyberg.

Monstername

Monstername van zaad voor het testen van de zaadkwaliteit werd 15 uitgevoerd zoals beschreven in het handboek voor monstername van de International Seed Testing Association (ISTA).

Verschillende primingscondities

Een zestal organisaties met zaad-priming faciliteiten werd 20 gevraagd de tomatenzaden te behandelen volgens interne (niet-publieke) primingsprocedures. In totaal werden één of meer van in totaal 8 verschillende primingsprocedures toegepast door de zes organisatie op 2 verschillende cultivars, hetgeen resulteerde in een totaal van 15 partijen zaad die op verschillende wijze waren geprimed. De 8 primingsprocedures 25 staan in figuren 1-3 vermeld als P1-P8. Hieronder bevonden zich zowel osmopriming- als trommelpriming-methodes. De geprimede zaden werden, als onderdeel van het primingsproces of daarop volgend, gedroogd, en de gedroogde zaden werden aan genexpressieanalyse onderworpen.

Als controle zaden werden zaden toegepast die niet aan priming werden 30 onderworpen.

16

Bepaling genexpressieprofiel

Voor het bepalen van genexpressie werd van alle partijen zaad (geprimed niet gekiemd en onbehandeld) een genexpressieprofiel opgesteld.

5 Hiertoe werden 50 zaden gehomogeniseerd in 2 ml eppendorf tubes met 2 kwart inch metalen kogeltjes m.b.v. een dismembrator en het mRNA werd als volgt geëxtraheerd: Het homogenaat werd verdund met extractie buffer (0,18 M Tris (pH 8,2), 0,09 M LiCl, 4,5 mM EDTA, 1% SDS) en na centrifugeren (2 min. bij 10.000 x g) werd het supernatant geëxtraheerd met 10 2 ml fenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1) en opnieuw gecentrifugeerd.

Na hernieuwde extractie met chloroform werd het RNA in het supernatant geprecipiteerd met 1/3 volume 8M LiCl. Na centrifugeren (10.000 xg gedurende 2 min) werd het pellet gewassen met 80% ethanol, opnieuw gecentrifugeerd, gedroogd en opgelost in water.

15 Na DNAse behandeling van het RNA door DNAse I (Biorad

Laboratories) volgens de voorschriften van de producent werd cDNA geproduceerd met een commerciële kit (iScript cDNA Synthesis Kit, Bio-Rad Laboratories) volgens de voorschriften van de producent en onderworpen aan expressieanalyse.

20 Het cDNA werd gebruikt voor het bepalen van genexpressieprofielen met behulp van een DNA chip (Toml microarray, CGEP, Boyce Thompson Institute, Cornell University, USA) en voor het bepalen van genexpressieniveaus met behulp van kwantitatieve RT-PCR (zie hieronder) 25

Selectie van differentieel tot expressie gebrachte genen Protocol DNA microarray: Verkrijgen van gelabeld cDNA.

cDNA werd verkregen uit het mRNA, verkregen zoals hier boven beschreven, door binding met oligo-dT na denaturatie, en omgekeerde 30 transcriptie gedurende 2 uur bij 37 °C in een AA-dNTP mix (met daarin 17 aminoallyl-dUTP) en Superscript II Reverse Transcriptase. Na denaturatie en enkele precipitatiestappen werd het cDNA opgenomen in 0.1M Natriumcarbonaatbuffer, pH 9.3. Het cDNA werd gemengd met een oplossing van de Cy3 en Cy5 fluorescente kleurstoffen in DMSO en 30 5 minuten geïncubeerd bij kamertemperatuur. Het gelabelde cDNA werd geprecipiteerd in 2.5M natriumacetaat en 100% ethanol bij -20 °C gedurende minimaal 2 uur. Na centrifugering in een microcentrifuge gedurende 20 minuten bij 4 °C werd het pellet gewassen in 80% ethanol en opgelost in water. Dit werd één maal herhaald.

10

Hybridisatie met de Toml microarray

Prehybridisatie van de microarrays werd uitgevoerd in een mix van 50% formamide, 5x Denhardt’s reagens, 5x SSC, 0.2% SDS en 0.1 mg/ml gedenatureerd zalmsperma DNA gedurende 16 uur bij 42 °C. De 15 glasplaatjes werden vervolgens gewassen in water en isopropanol, en gedroogd middels centrifugatie (5 min bij 200-300 x g). Plaats de glasplaatjes in de frames van de hybridisatietank. Voor hybridisatie werd de Ambion SlideHyb buffer voorverwarmd tot 68 °C en de benodigde waterbaden voor hybridisatie tot 50 °C. De met Cy3 en Cy5 gelabelde cDNA 20 monsters werden gemengd, gedenatureerd gedurende 10 minuten bij 95 °C en gekoeld op ijs. De warme Ambion SlideHyb buffer werd toegevoegd aan het cDNA, gecentrifugeerd (1 min bij 14000 x g) en bij 68 °C geplaatst.

Nadat de cDNA monsters waren opgebracht vond hybridisatie plaats gedurende 18 uur bij 50 °C. Na wassing in achtereenvolgens lx SSC/0.1% 25 SDS, O.lx SSC/0.1% SDS en O.lx SSC werden de arrays gedroogd door middel van centrifugatie (5 min bij 200-300 x g).

Analyse van de microarrays

Na aftrek van achtergrondsignalen warden de microarray data 30 genormaliseerd en gecorrigeerd voor pin effecten, positie op de array en 18 signaalintensiteitseffecten. Alle microarrayexperimenten werden vier maal uitgevoerd waarbij 2 van de 4 herhalingen gewisselde labels (‘swapped dyes’) bevatten om te kunnen corrigeren voor mogelijke kleurstofeffecten. Experimenten werden uitgevoerd in een blokopzet. Hierdoor werd ieder 5 experiment verdeeld in twee identieke blokken met daarin de combinatie van alle proefcondities en de gewisselde labels in één enkel blok. Elk blok werd onderverdeeld in twee sub-blokken, met het label als discriminator, die elk alle proefcondities bevatten. De dataset werd verder geanalyseerd met behulp van ANOVA. Microarray analyse met daarin achtergrondcorrecties, 10 normalisatie en ANOVA werd uitgevoerd met het Genstat Release 9.2 software pakket (VSN International Ltd, Hemel Hemstead, UK) met kleine modificaties om ANOVA analyse van dubbel gelabelde microarray experimenten mogelijk te maken.

De genen die wel tijdens priming maar niet tijdens kieming tot 15 expressie kwamen werden aangemerkt als differentieel tot expressie gebrachte genen.

Differentieel tot expressie gebrachte genen en zaadkwaliteit

Een selectie van differentieel tot expressie gebrachte genen werd 20 verkregen door genexpressieprofielen tijdens priming te vergelijken met genexpressieprofielen tijdens kieming als bovenbeschreven. Om de expressie van deze genen te koppelen aan zaadkwaliteit werden expressie-verschillen tussen geprimed en onbehandeld zaad bestudeerd. Hierbij werd het expressieniveau van de geselecteerde genen van geprimed (niet ontkiemd) 25 zaad bepaald met behulp van kwantitatieve RT-PCR (dus op mRNA niveau) en vergeleken met het expressieniveau in onbehandeld zaad.

De kwantitatieve RT-PCR werd uitgevoerd met behulp van gen-specifieke primers (Tabel 1) onder gebruikmaking van een commercieel verkrijgbare kit (iQ SYBR Green Supermix, Biorad Laboratories) en een 19 real time- PCR machine (MyiQ Single-Color Real-Time PCR Detection System, Biorad Laboratories) volgens de voorschriften van de producent.

Tabel 1. Gen-specifieke primers (Forward [Fw] en Reverse [Rv]) als 5 toegepast in de kwantitatieve RT-PCR procedure.

Gene__Sequence, 5'-3'_

histone Hl.41__Fw ATGGTGTCTGCTACTGCATCTGCG

__Rv CAAAAGCTTCCTGAAGTTTGGAGGC

metallothionein-like protein__Fw__TGTTTCAGACCAATCAATCAT _

__Rv CACCCCAAGCACCAAAGTCTC

Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase__Fw__GGAAACGGGACCGGAGGAGAG__

__Rv CTTAGCGGTACAGATGAAAAACT

fructose-bisphosphate aldolase__Fw__CCTGGAAAGGGTATCCTTGCTGC

__Rv TCTCCTCAAACAAGATCACACCGC

expressed protein [Arabidopsis p

thalianal____GTGATGGCAGAAGTAATAGGAGCGC

__Rv TTCACCACTAACCATTGTCGATCCC

heat shock cognate protein 80__Fw__AGATCCGCTTTGAGAGTTTA_ __Rv ATTGTACCCAGGTTATTCAC_

Acidic 26 kDa endochitinase precursor Fw__CAGGTACTTTAGCACAAAATGCCGG

__Rv AACCTGGAAACGAATTGGCTGC

glutathione S-transferase_ Fw__ATTCTACTTCCGAATCGCCAGCC

__Rv CAGGCCTGTTCTGAAGATCAATTGG

nam-like protein 10__Fw GCGGTGAGTGAAGGTGATGTAAAGC

__Rv TGGAATCGGCGTGAAGTTTCG

putative glutathione S-transferase__Fw__CCAGTGCTAATTCACAATGGCAAGC

__Rv GCTTTCCCCATTACTGGCATGC

late-embryogenesis protein homolog__Fw__CTCTCTGCTTTCGTCTCCGACTCC

__Rv ACCCATGAAGTCTTCACCGATTCC

Protein NP24 precursor (Pathogenesis- P

related protein PR P23) (Osmotin)__*__GTACGCAACAACTGTCCATACACCG

__Rv TTAAAGTTGCAACCAGTACGACCCC

cytochrome b6/f complex subunit VIII Fw__CACCTAGGAAGAGGCCATTGATTGG

__Rv TTGAAATTCCATTGGACTCGACTGG

Unknown (oxidase like protein)__Fw__TGGAACATAGCTGCAATCTTGATGG

__Rv TCAAAGAACCCTGCCTCCAAACC

36.4 kD proline-rich protein Fw___TGAAACCACCCTCTACACAACCTCC

Rv GTTTTTGTGGGGGGTGTTTAGGG

Het expressieniveau van deze genen tijdens priming werd genormaliseerd door de waarde van het expressieniveau in niet behandelde zaden hierin te verdisconteren. De genormaliseerde waarden werden daarna 10 gerelateerd aan de verschillende fysiologische parameters van zaadkwaliteit 20 (kiemenergie, kiemkracht, vitaliteit, stresstolerantie, vigour en vitaliteit onder stress)

Meting van zaadkwaliteit parameters 5 Kiemkracht

De zaden werden gezaaid in kiembakken onder standaard condities, bij een temperatuur van 25 °C, een licht/donker regime van 16 uur licht / 8 uur donker, waarbij het percentage zaden dat na een periode van 7 dagen een volwaardige kiemplant gaf werd bepaald.

10 Kiemenergie

Werd op dezelfde wijze bepaald als hierboven beschreven voor de kiemkracht (bij 25°C, een licht/donker regime van 16 uur licht/8 uur donker), maar evaluatie van het percentage van de zaden met een kiemworteltje werd uitgevoerd na aan periode van 3 dagen.

15 Vitaliteit

De zaden werden gezaaid in grond en de kwaliteit van de zaailingen werd geëvalueerd gebaseerd op hun vermogen om uit te groeien tot planten die bruikbaar zijn voor commerciële tomatenkwekers. De zaailingen zonder beschadigde plantendelen en met een grootte gelijk aan of 20 groter dan de gemiddelde grootte werden geclassificeerd als "goede planten".

De zaailingen die enigszins kleiner waren dan gemiddeld of met lichte beschadigingen aan de zaadlobben werden geclassificeerd als "licht beschadigde" planten. De zaailingen die zeer klein zijn waren, met zware schade aan enig plantendeel of zonder een zichtbaar apicaal groeipunt 25 werden geclassificeerd als "abnormale planten". De goede planten en de licht beschadigde planten werden beschouwd als bruikbare planten voor tomatenkwekers, terwijl de abnormale planten als niet bruikbaar werden bestempeld. Groeiomstandigheden tijdens deze test waren: substraat: cocos turf; 23 °C; 20 uur licht / 4 uur donker.

30 Stresstolerantie 21

De stresstolerantie werd bepaald op dezelfde wijze als beschreven voor de kiemenergie behalve dat het zaad werd gehouden bij een testtemperatuur van 15 °C of 35 °C in plaats van 25 °C.

Vigour 5 De vigour van het zaad werd bepaald op dezelfde wijze als beschreven voor de kiemkracht behalve dat het zaad werd gehouden bij een testtemperatuur van 15 °C of 35 °C in plaats van 25 °C.

Vitaliteit onder stress

De vitaliteit onder stress van het zaad werd bepaald op dezelfde 10 wijze als beschreven voor de vitaliteit, maar nu bij een temperatuur van 15 °C of 35 °C in plaats van 23 °C.

Resultaten

Een 15-tal genen werd geïdentificeerd na vergelijking van 15 expressieprofielen gemeten aan zaden tijdens of na priming en gemeten aan zaden tijdens kieming. Het verschil in fysiologische toestand (zaadkwaliteit) van het zaad gedurende priming en kieming komt dus tot uiting in de expressie van deze 15 genen. Tabel 2 toont de lijst van genen die een priming-specifiek expressiepatroon laten zien in tomaat.

20 22

Tabel 2: SGN-gegevensbestandidentificatoren en genbeschrijvingen van genen met priming-specifiek expressiepatroon (de SGN nummers corresponderen met Unigene nummers van het gegevensbestand van SOL Genomics Network, build 2 (SGN; http://sgn.cornell.edu)) SGN nummer Gen Aantal Correlaties1 SGN-U146045 histone Hl.41 ï SGN-U143485 metallothionein-like protein 1

SGN-U143291 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase O

SGN-U 143932 fructose-bisphosphate aldolase 6 SGN-U 144750 expressed protein [Arabidopsis thaliana] 0 SGN-U143132 Heat Shock Cognate Protein 80 0 SGN-U 144297 Acidic 26 kDa endochitinase precursor 1 SGN-U145298 glutathione S-transferase nd SGN-U 144944 nam-like protein 10 nd SCN-U143283 putative glutathione S-transferase 5 SGN-U 143432 late-embryogenesis protein homolog 4

Protein NP24 precursor (Pathogenesis-related SGN-U212928 protein PR P23) 3 SGN-U147907 cytochrome b6/f complex subunit VIII nd SGN-U143658 Unknown (oxidase like protein ?) 5 SGN-U 143835 36.4 kD proline-rich protein nd 5 ', Aantal correlaties verwijst naar significante Pearson correlaties als vermeld in tabel 3.

Bij nadere analyse van de expressie van deze 15 genen onder ongunstige kiemomstandigheden (d.w.z. 35 en 15°C: een stress situatie voor het zaad) bleek dat voor 8 van de 11 aldus onderzochte genen een zeer 10 sterke correlaties kon worden aangetoond met parameters als vitaliteit (zowel onder optimale als suboptimale [stress] omstandigheden), stresstolerantie (KE onder sub-optimale condities), en vigour (KK onder sub-optimale condities) (Zie Tabel 3).

23

Tabel 3: Pearson correlatiecoëfficiënten voor specifieke parameters van zaadkwaliteit en genexpressieprofielen van een 11 van de 15 gevonden genen die differentieel tot expressie werden gebracht als boven omschreven. Een correlatie >0.65 of <-0.65 werd als significant aangemerkt 5 (geschaduwde cellen).

Vitaliteit Stresstolerantie Vigour VT onder stress KE 25 KK 25 VT + |VT +/- |VT - KE 15 tKE 35 KK 15 IKK 35 AB 15 IaB 35 FBA -0.64 0 42 -0.76 0.47 0.59 -0.83 -0.84 -0.67 049 PPI 1 -0 14 -0.33 0.03 0.44 -0.28 -0.21 0.39 -0.21 -0.39 0.22 048 LËA |^^~^Ö22~||^^pÖ67~ -0.70 043 042 052 056 -0.58 -0.03 HSC802 0.08 0.16 0.20 -0.05 -0.27 013 Ö04 ÖÖ6 0.07 -0.02 -0.06 MTLP 0.44 0.27 0.55 -0.71 -0.39 053 036 030 024 -0.38 -0.15

Expl3 -0.08 0.10 -0.09 0.37 -0.24 -0.21 -0.26 -0.01 -0.09 0.14 ÖÖ9 PGST -0.63 -0.50 -0.66 0.23 051 -0.73 -0.76 -0.64 ~Ό~85Γ^^·· 048 NP24 ~^Ö67 035 Ö33 046 0.53 | -0.48 -0.03 ÖLP ' 0.65 >067 0.53 0.54~Ι····Π070~ -0.26 HIST -0,09 0.10 -0.17 ÖÖ2 0.05 -0.12 -0.07 0.16 -0.23 AËP -0 31 -0.15 -033 0.16 -0.14 -0.53 -0.71 -0.33 -0.56 0.45 044

Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase;2, Heat-shock cognate protein 80;3, expressed protein [Arabidopsis thaliana]; KE, Kiemenergie; KK, Kiemkracht; VT, Vitaliteit (bruikbare planten); AB, abnormale of zeer kleine zaailingen; 15, 25, 35, = 15eC, 25°C en 35"C, reap.; +, goede; +/- goede/kleinere; - abnormale of zeer kleine zaailingen; VT is omgekeerd evenredig 10 met AB, d.w.z hoge vitaliteit komt overeen met laag aantal abnormale planten. Positieve scores verwijzen naar een positieve correlatie, en vice versa voor negatieve scores.

Dus de bovenbeschreven experimenten resulteerden in duidelijke correlaties tussen enkele expressiegegevens en elk van 11 geteste 15 fysiologische parameters. Tabel 3 geeft een overzicht van het aantal fysiologische parameters dat correleert met de expressiepatronen van de betreffende genen. Deze gegevens tonen aan dat er een duidelijke correlatie bestaat tussen de genexpressie van 8 geselecteerde genen en verbeterde stress tolerantie.

1034267

Claims

1. Werkwijze voor het meten van de zaadkwaliteit van een monster van zaad van een plant, welke werkwijze de volgende stappen omvat: - het verschaffen van een ijklijn voor zaad van genoemde plant waarin het genormaliseerd expressieniveau van ten minste één gen dat 5 differentieel tot expressie komt tussen priming en kieming van zaad van genoemde plant is uitgezet tegen de zaadkwaliteit van zaad van genoemde plant, - het meten van het genormaliseerd expressieniveau van genoemd ten minste één gen in genoemd monster, en 10. het aflezen van de zaadkwaliteit van genoemd monster uit genoemde ijklijn.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarin genoemde zaadkwaliteit ten minste twee parameters van zaadkwaliteit gekozen uit de groep bestaande 15 uit de vitaliteit, kiemsnelheid, kiemenergie, en kiemkracht, onder optimale en onder suboptimale (stress) condities omvat.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, waarin genoemde zaadkwaliteit ten minste twee parameters gekozen uit vitaliteit, stressbestendigheid en 20 vigour omvat.

4. Werkwijze volgens één van de voorgaande conclusies, waarin genoemd genormaliseerd expressieniveau het verschil in expressieniveau ten opzichte van onbehandeld en niet ontkiemd zaad is. 25

5. Werkwijze volgens één van de voorgaande conclusies, waarin genoemde plant tomaat (Solatium lycopersicum) is. 10342 67.

6. Werkwijze volgens één van de voorgaande conclusies, waarin genoemd ten minste één gen een sequentie gekozen uit één van SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, en 15 omvat. 5

7. Werkwijze volgens één van de voorgaande conclusies, waarin genoemd ten minste één gen het gen voor fructose-bisphosphate aldolase (FBA); putative glutathione S-transferase (PGST); late-embryogenesis protein homolog (LEA) en/of Protein NP24 precursor (Pathogenesis-related 10 protein PR P23) (NP24) is.

8. Werkwijze volgens één van de voorgaande conclusies, waarin het expressieniveau wordt gemeten met behulp van kwantitatieve RT-PCR, een gene-chip array, of met een in situ kleuringstechniek. 15

9. Werkwijze volgens één van de voorgaande conclusies, waarin de meting met een gene-chip array een meting aan cDNA verkregen van uit genoemd monster geïsoleerd mRNA omvat.

10. Werkwijze volgens één van de voorgaande conclusies, waarin genoemd monster op het moment van de meting priming ondergaat of heeft ondergaan.

11. Toepassing van ten minste één gen dat differentieel tot expressie 25 komt tussen priming en kieming van zaad van een plant als een indicator van zaadkwaliteit.

12. Toepassing van ten minste één gen dat differentieel tot expressie komt tussen priming en kieming van zaad van een plant als een marker 30 voor de verbetering van zaadkwaliteit in een zaadveredelingsprogramma.

13. Toepassing volgens conclusie 11 of 12, waarin genoemde plant tomaat is en waarin genoemd gen ten minste één gen een sequentie gekozen uit één van SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, en 15 omvat. 5

14. Toepassing volgens conclusie 13, waarin genoemd ten minste één gen het gen voor fructose-bisphosphate aldolase (FBA); putative glutathione S-transferase (PGST); late-embryogenesis protein homolog (LEA) en/of Protein NP24 precursor (Pathogenesis-related protein PR P23) (NP24) is. 10

15. Een werkwijze voor het selecteren van een plant in een zaadveredelingsprogramma, omvattende het meten van de zaadkwaliteit van een monster van zaad van genoemde plant met een werkwijze volgens één van de conclusies 1-10, en het selecteren van genoemde plant als een 15 kandidaat ouderplant binnen het zaadveredelingsprogramma ingeval genoemde zaadkwaliteit een gewenst niveau heeft. 1 0342 67