NL1020090C2 - Nieuwe coating voor biosensoren. - Google Patents

Description

VO

Titel: Nieuwe coating voor biosensoren

De uitvinding ligt op het gebied van coatings voor biosensoren, in het bijzonder voor toepassing van biosensoren in niet volledig schone oplossingen.

Voor het meten van concentraties van specifieke biologische 5 moleculen in een oplossing die eventueel direct verkregen is uit een organisme worden over het algemeen gevoelige assays ontwikkeld die specifiek een bepaald molecuul kunnen herkennen. Vaak wordt in dit soort metingen gebruik gemaakt van zogenaamde biosensoren die het biologische signaal omzetten in een ander signaal (zoals bijvoorbeeld een elektrisch, 10 optisch of ander soort signaal) waardoor detectie van de aanwezigheid van het biologische molecuul kwalitatief of liever nog kwantitatief meetbaar wordt.

Een specifiek type van biosensoren zijn die sensoren waarbij de detectie van het biologische molecuul wordt gedaan aan de hand van 15 'surface plasmon resonantie' (SPR) wat gebaseerd is op detectie van veranderingen in de optische eigenschappen van een oppervlaktelaag als gevolg van de interactie van een 'receptor' met het te meten medium.

Hiertoe zijn de biosensoren voorzien van een laagje van een metaal, bij voorkeur een inert edelmetaal zoals goud al dan niet afgedekt met een 20 glaslaag, waarop een specifieke coating is aangebracht, waaraan op hun beurt receptor-moleculen worden gehecht zoals antilichamen of enzymen die specifiek een biologische stof kunnen herkennen en binden.

Een coating voor het coaten van een hydrofoob oppervlak zoals glas of metaal omvattende een polysaccharide hydrogel is al bekend uit de 25 literatuur. Bijvoorbeeld US 5,436,161 beschrijft een coating omvattende een hydrogel bestaande uit dextraan of verknoopte dextranen, die na activatie geschikt is voor het binden van de specifieke detectiemoleculen zoals antilichamen of andere eiwitten. Het blijkt echter dat met dit soort coatings 1020090 2 (bestaande uit een zwakke kationwisselaar) in niet volledig schone oplossingen (bijvoorbeeld een verdunde melkoplossing) niet-specifieke signalen worden gemeten, die het effect van het meetsignaal vaak gedeeltelijk of geheel teniet doen. Een ander nadeel van deze methode is dat 5 de polysaccharidelaag niet direct op het metaaloppervlak kan worden aangebracht, maar dat eerst een enkelvoudige laag van een organisch molecuul (bijvoorbeeld een disulfide, diselenide of thiol-bevattende verbinding) op het oppervlak dient te worden aangebracht om te dienen als verankering voor de polysaccharide hydrogel.

10 De huidige uitvinding levert een oplossing voor deze problemen.

Gevonden werd dat een coating voor het coaten van een hydrofoob oppervlak omvattende een polysaccharide hydrogel, waarin tussen het hydrofoob oppervlak en de hydrogel een kristallijne eiwitlaag wordt aangebracht de nadelen van de reeds bekende coatings opheft.

15 Kristallijne eiwitten en de mogelijkheid om deze als een laag op te brengen zijn als zodanig reeds bekend uit de literatuur. Het octrooischrift US 5,028,335 laat zien dat de oppervlaktelaag (surface layer of S-layer) van celenveloppen van sommige prokaryoten of schimmels, zoals bijvoorbeeld de Bacilleae, bestaande uit eiwitten of eiwitbevattende moleculen, kan worden 20 gescheiden van de onderliggende cellagen en als een kristallijn netwerk in een laag op een oppervlakte kan worden aangebracht. Het octrooischrift US 6,296,700 toont dat deze S-laag als 'monolayer' op vlakke hydrofobe oppervlaktes kan worden opgebracht door rekristallisatie. Hierbij is de zijde die origineel in de bacteriën zich aan de buitenkant bevond nu naar het 25 hydrofobe oppervlak gekeerd en is de (meer hydrofiele) zijde die oorspronkelijk de binnenkant van de bacteriële oppervlaktelaag vormde naar buiten gekeerd. Daardoor kan deze S-laag dienstdoen als basis om specifieke detectiemoleculen te immobiliseren en zou dan ook geschikt zijn als coating voor biosensoren.

1020090 3

Verrassenderwijs is nu gevonden dat een S-laag aangebracht op het hydrofobe oppervlakte van de biosensor een polysaccharide hydrogel kan binden om zodoende de aspecifieke interactie van de biosensor in niet volledig schone oplossingen sterk vermindert. Hierdoor is het mogelijk de 5 gunstige eigenschappen van een biosensor met een polysaccharide hydrogel toe te passen in oplossingen van bijvoorbeeld melk.

Bij voorkeur wordt de S-laag verkregen van bacteriën van het genus Lactobacillus plantarum. Het is gebleken dat de oppervlakte-eiwitten van deze bacterie goed uitkristalliseren op een hydrofoob oppervlak en 10 daarbij een enkele ononderbroken laag vormen. Tevens is gebleken dat deze laag kan worden gemodificeerd (voor binding met de polysaccharide hydrogel) zonder dat de kristalliserende eigenschappen verminderen.

Vóór het opbrengen van de S-laag wordt het metalen oppervlak bij voorkeur eerst behandeld met ethanol hierbij zorgend voor een schone en 15 vetvrije oppervlaktelaag waar de eiwitlaag goed aan kan hechten.

Als polysaccharide hydrogel kunnen polysacchariden zoals agarose, carrageenan, cellulose, zetmeel of afgeleiden daarvan zoals polyvinyl acohol, polyacrylzuur, polyacrylamide en polyethyleenglycol worden gebruikt. Bij voorkeur wordt echter dextraan (bijvoorbeeld Dextran T500, Pharmacia) 20 gebruikt aangezien deze al ruime toepassing vindt in het gebruik als matrix voor de binding van biomoleculen in chromatografie en er dus al veel bekend is over de eigenschappen van dextraan en de binding van specifieke receptoren daaraan. Verder kunnen de polysacchariden worden gemodificeerd zodat ze groepen bevatten waar gemakkelijk receptoren aan 25 kunnen worden geïmmobiliseerd, zoals hydroxyl-, carboxyl-, amino-, aldehyde-, carbonyl-, epoxy- of vinyl-groepen. In het geval van dextraan kunnen carboxylgroepen worden geïntroduceerd door middel van bijvoorbeeld een behandeling met broomazijnzuur. Andere werkwijzen om carboxyl- of andere groepen aan te brengen zijn genoegzaam bekend aan de 30 vakman.

1020090 4

Ook kan worden uitgegaan van carboxymethyldextraan (bv. CM-Dextran, Pharmacia) dat al carboxylgroepen bevat.

De dextraanlaag wordt covalent gebonden aan de S-laag. Hiertoe worden de carboxyl-groepen van het dextraan eerst geactiveerd door 5 bijvoorbeeld behandeling met bijvoorbeeld EDC (N-(3,dimethylamino-propyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride) in een lOmM MES-buffer van pH=6.. Het hieruit ontstane carboxymethyl-dextraan wordt in een 50mM boraatbuffer bij pH=8,5 in contact gebracht met de naar buiten gekeerde hydrofiele kant van de op het metaal gekristalliseerde S-laag waardoor het 10 dextraan covalent aan de S-laag wordt gekoppeld.

Specifiek is de coating volgens de uitvinding toepasbaar in biosensoren voor gebruik in niet volledig schone oplossingen, zoals bijvoorbeeld een (verdunde) melkoplossing. Naast melk kunnen ook nog andere niet volledig schone oplossingen in al dan niet verdunde vorm 15 worden genoemd waarin de biosensor volgens de uitvinding bruikbaar is, zoals lichaamsvloeistoffen als bloed, urine, lymfevocht, cerebrospinale vloeistof, en dergelijke en voedingsmiddelen zoals yoghurts, kwark, vruchtensappen, soepen, frisdranken, energiedranken, kookvocht van groenten, bouillons, bier en dergelijke.

20 Het is uiteraard volledig afhankelijk van de te gebruiken specifieke herkenningsmoleculen (receptoren) welke biomoleculen zullen worden herkend en gebonden en als zodanig in staat zijn om een detecteerbare signaalverandering in de biosensor te genereren. Als voorbeeld kan hier detectie van progesteron in koemelk worden genoemd, maar het is duidelijk 25 voor de vakman dat met behulp van de biosensor volgens de uitvinding in principe alle biomoleculen kunnen worden gedetecteerd (mits daar specifieke receptoren voor kunnen worden gebruikt). Voorbeelden van zulke biomoleculen zijn suikers, hormonen, antilichamen, antigenen, antibiotica, (myco)toxines, pesticiden, maar ook milieubelastende stoffen zoals fosfaat-30 en/of nitraat-bevattende verbindingen. De uitvinding is met name goed 1020090 5 toepasbaar voor het testen van voeding en/of voedingsmiddelen op het voorkomen daarin van ongewenste stoffen zoals toxines (aflatoxine, fumonisine, atrazine, Staphylococcus aureus enterotoxin B) en hormonen (progesteron, clenbuterol, hCG, zearalenon).

5 Het meten van concentraties van progesteron in koemelk is van belang om het moment van ovulatie ('tochtigheid') te kunnen detecteren. Dit is van groot belang in de moderne veehouderij waar de beheersing van de reproductie van de melkveestapel zo efficiënt mogelijk dient te gebeuren. Verbetering van de detectie van het ovulatiemoment zal leiden tot een 10 efficiënter meelkveehouderijbedrijf door de verhoging van de duur van melkproductie per koe, vermindering van fokkosten als gevolg van mislukte inseminatiepogingen en vermindering van wegens improductiviteit afgemaakte dieren. Het progesterongehalte in rauwe melk is een goede parameter om het ovulatiemoment bij een koe aan te tonen. Dit 15 progesterongehalte dient tijdens het melken te worden gemeten en een biosensor volgens de uitvinding is hierbij een verbetering ten opzichte van de bestaande methoden.

Als specifiek herkenningsmolecuul voor progesteron worden specifieke antilichamen gebruikt. Deze zijn genoegzaam bekend en 20 makkelijk te verkrijgen voor een vakman. Antilichamen kunnen in elke gewenste vorm worden toegepast: als IgA of IgM polymeren, als monomere gedeeltes van deze polymeren, als IgE of IgG antilichamen of als 'single chain' antilichamen, maar ook de fragmenten van deze antilichamen die specifiek voor herkenning zorgen, bv. de VL-ketens, Fab-fragmenten of de 25 Complementary Determinating Regions (CDR's) kunnen worden gebruikt.

Als alternatief kunnen progesteron receptoren zoals die voorkomen in humane of dierlijke cellen worden gebruikt. Deze receptoren zijn een subklasse van de zogenaamde steroïd-receptoren, eiwitten die volgens een vast stramien zijn opgebouwd en naast het ligand-bindende gedeelte tevens 30 een DNA-bindend domein bevatten. Voor het gebruik van de progesteron 1020090 6 receptor in de biosensor volgens de uitvinding is in principe enkel het ligand-bindend domein noodzakelijk.

Hiernavolgend worden voorbeelden gegeven van een coating volgens de uitvinding en het gebruik van zo'n coating in een biosensor. De 5 uitvinding is echter niet beperkt tot de specifiek genoemde voorbeelden en andere uitvoeringsvormen zullen duidelijk zijn voor een vakman na lezing van de beschrijving.

Voorbeelden 10

Voorbeeld 1 - Bereiding van S-eiwit

Bron S-layer eiwit kan worden geproduceerd door L. acidophilus ATCC 15 4356. Het eiwit dat door dit micro-organisme wordt geproduceerd heeft een molecuulgewicht van 44 kD, heeft een overschot aan positieve lading van 15 (+15) en heeft een pi van 9,40.

Opkweken van de stam ATCC 4356

20 Een monster van L. acidophilus ATCC 4356 (kraal, 70 K) in 5 ml MRS

medium werd onder anaërobe omstandigheden bij 37 °C gedurende 17 - 24 uur geïnoculeerd (incubatiestoof, niet geroerd of geschud).

Het inoculum werd overgezet naar 500 ml MRS (verdunning van 1 : 100) en onder dezelfde omstandigheden verder opgekweekt. De cellen werden 25 geoogst zodra de optische dichtheid van het medium 0,7 had bereikt; OD695 werd gemeten ten opzichte van schoon MRS medium.

1020090 7

Oogsten van L. acidophilus ATCC 4356 en concentreren van het S-layer eiwit

De gekweekte cellen werden gecentrifugeerd (9000 tpm, 20 minuten bij 4 °C), het supernatant werd afgevoerd en de pellet werd gewassen met 100 ml 5 koude milliQ. De gewassen pellet werd geresuspendeerd in 50 ml 1 M LiCl, 30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd en opnieuw gecentrifugeerd (18000 tpm, 15 min., 4 °C). Het supernatant werd geïsoleerd en de pellet werd geresuspenderd in 25 ml 5 M LiCl, waarna 60 minuten bij kamertemperatuur werd geïncubeerd en tenslotte werd de suspensie 10 opnieuw gecentrifugeerd (18000 tpm, 15 min., 4 °C). Verzameld supernatant werd over 0,2 pm gefiltreerd en direct gebruikt in de volgende stap (zie voorbeeld 2) of koud bewaard (4 °C).

Voorbeeld 2 - aanbrengen van een S-laag op een metaaloppervlak 15

Een glazen plaatje met daarop een goudlaag van ca. 50 nm werd gereinigd met achtereenvolgens een vers aangemaakt mengsel van geconcentreerd zwavelzuur en 30 gew.% waterstofperoxide (3:1) en een microgolfondersteunde plasmaetser (zuurstoftargon plasma; 10 vol.% 20 zuurstof). Het glazen plaatje met de goudlaag werd na de etsbehandeling gedurende 1 minuut in de damp van kokende ethanol gehouden en daarna met een stroom van stikstofgas gedroogd.

S-laag eiwit werd geïsoleerd uit een stockoplossing in 5 M LiCl dmv ultrafiltreren over een 10 kD ultrafilter (Omegafilter, Filtron). De isolatie 25 werd uitgevoerd door het concentreren van 10 ml van de LiCl tot 1 ml en vervolgens het residu op te nemen in 10 mM Trisbuffer pH 7,5. Door middel van opnieuw concentreren tot 1 ml en weer opnemen in 10 ml Tris-buffer werd de geïsoleerde S-layer oplossing gespoeld. Dit werd 4 maal herhaald om alle LiCl kwijt te raken. De concentratie aan S-eiwit kon vervolgens 1020090 8 spectrofotometrisch worden bepaald en zonodig werd de oplossing uitverdund tot een S-eiwitconcentratie van 100 pg/ml.

De geïsoleerde S-eiwit oplossing (100 pg/ml) werd in een hoeveelheid van ca. 100 μΐ per cm2 op het goudoppervlak gebracht.

5 Vervolgens werd het oppervlak met daarop het S-eiwit minimaal 3 uur bij RT geïncubeerd in een atmosfeer van hoge luchtvochtigheid. Na het verstrijken van de incubatietijd werd het oppervlak gespoeld met milliQ-water en onder een stikstofstroom gedroogd.

10 Voorbeeld 3 - aanbrengen van dextraanlaag op S-laag

Carboxymethyldextraan 1,5 g (CM-Dextran, natriumzout, Fluka 27560) werd opgelost in 10 ml MES buffer 10 mM, pH 6, met daarin opgelost 400 mM EDC en 100 mM NHS (N-hydroxysuccinimide). Nadat het 15 dextraan volledig was opgelost, werd nog 30 minuten bij RT geroerd.

Vervolgens werd de verkregen oplossing in een hoeveelheid van ca. 100 μΐ per cm2 op het met S-eiwit gemodificeerde goudoppervlak gebracht. Vervolgens werd het oppervlak met daarop het CM-dextraan minimaal 3 uur bij RT geïncubeerd in een atmosfeer van hoge luchtvochtigheid. Na het 20 verstrijken van de incubatietijd werd het oppervlak gespoeld met milliQ-water en onder een stikstofstroom gedroogd.

Voorbeeld 4 - Aanbrengen anti-SEB op gemodificeerd sensoroppervlak 25 Het goud-S-eiwit-CM-dextraan sensoroppervlak werd gedurende 30 minuten bij RT met een oplossing van 400 mM EDC en 100 mM NHS in 10 mM MES pH 6 geïncubeerd. Na verwijdering van de MES buffer werd een oplossing van 50 pg/ml anti-SEB (SEB: Staphilococcus Enterotoxine B) in een buffer van 10 mM natriumacetaat pH 4,8 op het gemodificeerde 1020090 9 sensoroppervlak gebracht en nogmaals 30 minuten geïncubeerd. Nadat de koppeling van het antilichaam aan het sensoroppervlak was voltooid, werd de oplossing van het sensoroppervlak verwijderd en werd een oplossing van 1 M ethanolamine in water gedurende 1 minuut op het oppervlak gebracht 5 om de overmaat aan geactiveerde carboxylgroepen te deactiveren en vervolgens werd het gemodificeerde sensoroppervlak met MilliQ-water gespoeld en tenslotte onder een stroom van stikstofgas gedroogd.

Voorbeeld 4 - Vergelijkingsmetingen nieuwe sensoroppervlak t.o.v. 10 Biacore CM5-chip

Een goud-S-eiwit-CM-dextraan-anti-SEB sensoroppervlak werd in een Biacore 1000 (Biacore, Zweden) gebracht en gespoeld met HBS-buffer (hepes-gebufferde saline, pH 7,2) tot een stabiele basislijn werd bereikt.

15 SEB-concentraties in HBS-buffer in een bereik van 20 —2000 ng/ml werden aangeboden aan het gemodificeerde sensoroppervlak en de respons werd geregistreerd. Na elke meting werden de met SEB bezette antilichamen vrij gemaakt voor de volgende meting dmv het spoelen van het sensoroppervlak met een glycine-HCl buffer (50 mM, pH 1,85). De waargenomen respons bij 20 elke afzonderlijke SEB concentratie werd uitgezet als functie van de logaritme van de betreffende SEB concentratie. Het resultaat wordt getoond in figuur 1.

Ter vergelijking wordt in de figuur tevens een calibratiekromme getoond van identieke metingen uitgevoerd met een commercieel 25 verkrijgbare CM5-chip (Biacore, Zweden). De CM5-chip was overeenkomstig voorbeeld 3 op gelijke wijze voorzien van anti-SEB antilichamen. Uit de figuur kan worden gezien dat de gevoeligheden voor het meten van lage concentraties aan SEB voor beide systemen sterk met elkaar overeen komen, hoewel de sensor overeenkomstig de onderhavige uitvinding licht 1020090 10 gevoeliger lijkt te zijn voor lagere concentraties SEB en deze sensor heeft dientengevolge ook een lagere detectielimiet.

1020090

Claims (12)

1. Coating voor het coaten van een hydrofoob oppervlak omvattende een polysaccharide hydrogel, met het kenmerk dat tussen het hydrofoob oppervlak en de hydrogel een kristallijne eiwitlaag wordt aangebracht.

2. Coating volgens conclusie 1, met het kenmerk dat de kristallijne 5 eiwitlaag bestaat uit bacteriële oppervlakte-eiwitten.

3. Coating volgens conclusie 2, met het kenmerk dat de oppervlakte eiwitten afkomstig zijn van Lactobacillus plantarum,

4. Coating volgens een der voorgaande conclusies, met het kenmerk dat de polysaccharide hydrogel dextraan omvat.

5. Coating volgens een der voorgaande conclusies, met het kenmerk dat aan de polysaccharide hydrogel specifieke detectiemoleculen verknoopt worden.

6. Coating volgens een der voorgaande conclusies, met het kenmerk dat de coating toepasbaar is in een biosensor.

7. Biosensor omvattende een coating volgens een der conclusies 1-5.

8. Biosensor volgens conclusie 7, met het kenmerk dat deze geschikt is voor metingen in niet volledig schone vloeistoffen.

9. Biosensor volgens een der conclusies 7 of 8, met het kenmerk dat de biosensor geschikt is voor metingen in melk.

10. Biosensor volgens een der conclusies 7-9, met het kenmerk dat de biosensor geschikt is voor het meten van progesterongehaltes.

11. Methode voor het meten van concentraties van stoffen in melk, met het kenmerk dat een biosensor volgens een der conclusies 7-9 wordt gebruikt.

12. Methode volgens conclusie 11, met het kenmerk dat de stof progesteron is. 1020090