NL1018571C2 - Inrichting met een groot aantal monsterkamers voor de behandeling van cellen en voor analyse door middel van lichtproducerende werkwijzen, alsmede filtersamenstel. - Google Patents

Description

- ι - 5

INRICHTING MET EEN GROOT AANTAL MONSTERKAMERS VOOR DE ‘R’RTTRNDRT.TNG VAN CELLEN EN VOOR ANALYSE DOOR MIDDEL· VAN LICHTPRODPCERENDE WERKWIJZEN. ALSMEDE FILTERSAMENSTEL

10

De uitvinding heeft betrekking op een inrichting met een groot aantal monsterkamers voor de behandeling van cellen, alsook op een filtersamenstel.

In de milieumicrobiologie is fluorescentiekleuring 15 een gangbare werkwijze om het aantal cellen en de fylogenetische indeling van bacteriën uit milieumonsters te bepalen. Er is een voortdurend groeiend aantal fluorescentie-kleurstoffen op de markt met een groot aantal eigenschappen. Zo binden enkele daarvan specifiek aan vrije functio-20 nele groepen van eiwitten, andere intercaleren met of binden aan nucleïnezuren, weer andere dienen als substraatana-loga voor bepaalde enzymen, of geven de concentratie van bepaalde ionen aan. In het bijzonder de binding van genpro-bes aan celeigen nucleïnezuren (hybridisatie) vormt een in-25 teressant gebied. Deze binding wordt tot nog toe op filters of speciale diagnostische objectglaasjes uitgevoerd.

Bij het onderzoek van cellen met fluorescerend gemerkte genprobes moeten de volgende stappen uitgevoerd worden. Eerst worden de cellen geïmmobiliseerd, respectieve-30 lijk gefixeerd. Bij de immobilisatie, respectievelijk fixatie gaat het om een proces waarbij de eiwitten van de cellen door degeneratie zover in hun activiteit worden beperkt dat ze nucleïnezuren niet af breken. Voor dit doel wordt een fixeermiddel toegevoegd. Volgens een werkwijze van F.O. 35 Glöckner, M.F. Fuchs en R. Amann, 1999, "Bacterioplankton Compositions of Lakes and Oceans: A First Comparison Based on Fluorescence In Situ Hybridization", Appl. Environ.

1018571 - 2 -

Microbiol. 65: 3721-3726 worden de cellen met een fixeermiddel gemengd, geincubeerd en later op een filter afgefiltreerd. Voor de filtratie worden standaardfilters met een doorsnede van 25 of 47 mm gebruikt. In een alternatieve 5 werkwijze van Amann worden de cellen gemengd met het fixeermiddel, geincubeerd, gecentrifugeerd, geresuspendeerd en op een speciaal objectglaasje met putjes opgebracht en aan de lucht gedroogd. De werkwijze is gepubliceerd in R.I. Amann, L. Krumholz en D.A. Stahl, 1990, "Fluorescent- 10 oligonucleotide probing of whole cells for determinative, phylogenetic and environmental studies in microbiology", J. Bacteriol. 172: 762-770. De werkwijze van Amann heeft als nadeel dat bij het drogen de oplossingen niet altijd homogeen verdampen en dat zich ringvormige ophopingen van 15 objecten kunnen vormen. Hierbij komt dat meerdere handelingen zoals centrifugeren, resuspenderen en verdunnen de cellen kunnen schaden en zelfs kunnen vernietigen. Het drogen van de objectglaasjes neemt veel tijd in beslag, zodat de monsters niet direct verder kunnen worden verwerkt. 20 Om deze redenen wordt doorgaans de voorkeur gegeven aan de filterwerkwijze volgens Glöckner.

Na de fixatie van de cellen volgt als tweede stap de hybridisatie. Volgens de werkwijze van H.M. Christensen, H.M. Hansen en J. Sorensen, 1999, "Counting and size clas-25 sification of active soil bacteria by fluorescence in situ hybridization with RNA oligonicleotide probe", Appl. Environ. Microbiol. 65: 1753-1761, vindt de hybridisatie plaats in een reactievat. Bij de hybridisatie worden aan de cel-suspensie de fluorescerend gemerkte genprobes toegevoegd. 30 De hybridisatie vereist afhankelijk van het type gebruikte genprobe een tijd van 30 tot 90 minuten bij een temperatuur van 40 tot 50°C. De temperatuur is eveneens afhankelijk van de gekozen genprobe. Wanneer de gesuspendeerde cellen volgens de werkwijze van Christensen in de reactievaatjes zijn 35 gehybridiseerd, dan wordt een centrifugatie uitgevoerd, die echter zoals vermeld de kwaliteit van het celmateriaal vermindert. Na de centrifugatie worden de cellen gewassen.

1018571 - 3 -

Voor microscopische waarneming worden de cellen dan afge-filtreerd en wordt het filter overgebracht op een object-glaasje. Volgens de werkwijze van Glöckner wordt het filter dat zich op het objectglaasje bevindt, met hybridisatieop-5 lossing bedekt en in een vochtige hybridisatiekamer geplaatst. Voor het wassen wordt het filter overgebracht in een glazen flesje met wasbuffer, vervolgens gedroogd en bevestigd op een objectglaasje voor microscopische opname. Bij deze werkwijze gaat onder optimale omstandigheden ten 10 minste 10% van de cellen verloren. Het verlies aan cellen is echter bij milieumonsters ongecontroleerd. De werkwijze is beschreven in de publicatie F.0. Glöckner, R. Amann, A. Alfreider, J. Pernthaler, R. Psenner, K. Trebesius en K.H. Schleifer, 1996, "An in Situ Hybridization Protocol 15 for Detection and Identification of Planktonic Bacteria System", Appl. Microbiol. 19: 403-406.

De volgens de stand der techniek bekende werkwijzen voor fluorescentiekleuring hebben als nadeel dat meerdere stappen onder gebruik van verschillende instrumenten 20 nodig zijn, waarbij celmateriaal verloren kan gaan of waarbij de cellen door mechanische belasting, zoals bijvoorbeeld door centrifugatie of resuspendering, kunnen worden beschadigd. Uit DE 199 54 713.0-41 is een inrichting voor de hybridisatie van cellen bekend waarbij in een thermosta-25 tiseerbare hybridisatieruimte een afzuiginrichting in de vorm van een frit is aangebracht, om de reactieoplossing desgewenst te kunnen afzuigen. Bij deze inrichting worden de te onderzoeken cellen met de hybridisatieoplossing in de hybridisatieruimte gebracht, geïncubeerd en na de gewenste 30 incubatietijd kan de vloeibare fase met behulp van een va-cuümpomp worden afgezogen. De cellen worden tegengehouden door een filter dat zich op de bodem van de hybridisatieruimte bevindt. Het filter kan vervolgens voor verdere microscopisch analyse uit de inrichting worden gehaald. Deze 35 werkwijze heeft als nadeel dat er een grote materiaalinvestering voor de noodzakelijke apparatuur nodig is wanneer meerdere monsters gelijktijdig moeten worden behandeld en 1018571 - 4 - onderzocht. Bovendien is een relatief groot volume monsteren reagensoplossing nodig (ongeveer 2 ml).

In de toegepaste milieumicrobiologie worden de laatste jaren in toenemende mate zogenoemde microtiterpla-5 ten gebruikt. Deze hebben een grootte van ongeveer 125 x 81 mm en zijn voorzien van 32, 96 of 396 putjes, die bijvoorbeeld een volume van 60 tot 300 μΐ kunnen opnemen. Deze putjes worden afzonderlijk gevuld met behulp van daartoe dienende apparatuur; daarvoor wordt gebruik gemaakt van 10 pipetten met één kanaal of met 8, 48 of 96 kanalen. Het voordeel van microtiterplaten is dat een groot aantal gelijke of verschillende monsters, inclusief referentieoplos-singen, parallel kunnen worden behandeld en geanalyseerd. Er is een groot aantal specifieke microtiterplaten op de 15 markt, bijvoorbeeld voor DNA-zuivering of voor immunoassays alsook overeenkomstig aangepaste apparatuur zoals bijvoorbeeld fotometers of thermoblokken. Ook tot de stand der techniek behoren filtratiesystemen die in samenhang met microtiterplaten worden gebruikt. Hierbij worden filters 20 gebruikt die vast in de putjes van de microtiterplaten worden gelast of worden complete filtermatten gebruikt die op de gehele microtiterplaat worden gelegd. Een nadeel van het gebruik van vastgelaste filters in de microtiterplaten is dat een directe microscopische analyse van de filters 25 niet mogelijk is, omdat als gevolg van de dikte van de microtiterplaat een nauwkeurige scherpstelling van de microscoop op de monsters onmogelijk is. Een volgend nadeel van deze microtiterplaten is dat ze slechts eenmaal kunnen worden gebruikt en dat de monsterbehandeling daardoor 30 relatief duur wordt (ongeveer 30 DM/plaat). De gebruikelijke uitvoering van microtiterplaten in hard plastic belemmert bovendien een gerichte thermostatisering wegens de mindere warmtegeleiding vergeleken met metaal. Een nadeel van het gebruik van complete filtermatten is het optreden 35 van kruislingse verontreiniging met reagentia van aangrenzende monsters en optische interferentie van aangrenzende monsters, omdat zonder afbakening van de afzonderlijke mon- 101 8571' - 5 - stergebieden van elkaar een diffusie over de gehele filter-mat gemakkelijk mogelijk is. Ook een microscopische analyse van de complete f iltermatten is niet goed uitvoerbaar, omdat ze door hun grootte niet in hun geheel op een in de 5 handel verkrijgbare microscooptafel kunnen worden gelegd.

Doel van de uitvinding is daarom te voorzien in een inrichting waarmee een groot aantal monsters onder gebruik van kleine hoeveelheden reagensoplossing onder gelijke omstandigheden kan worden behandeld, alsook een di- 10 recte optische analyse mogelijk te maken. Verder is een doel van de uitvinding te voorzien in een inrichting met voor een groot deel herbruikbare elementen, om de toepassing van deze inrichting economischer te maken.

Uitgaande van de aanhef van conclusie 1 wordt het 15 doel volgens de uitvinding bereikt met de in het kenmerk van conclusie 1 aangegeven maatregelen. Het doel wordt verder uitgaande van de aanhef van conclusie 17 volgens de uitvinding bereikt met de in het kenmerk van conclusie 17 aangegeven maatregel.

20 Met de inrichting en het filtersamenstel volgens de uitvinding is het nu mogelijk een groot aantal monsters (bijvoorbeeld 96) onder gelijke omstandigheden, in het bijzonder ondèr gelijke thermische omstandigheden, te onderzoeken. De uitvinding maakt het gebruik van kleine 25 monsterhoeveelheden mogelijk en daardoor ook een geringer verbruik aan genprobes en celmateriaal, alsmede een directe microscopische analyse van de monsters door het afnemen van de mobiele filters. Verder is het mogelijk de inrichting na het verwijderen van de filters opnieuw te gebruiken.

30 Gunstige uitvoeringsvormen zijn aangegeven in de volgconclusies.

De figuren tonen een voorbeelduitvoeringsvorm van de inrichting volgens de uitvinding alsook van het filter-samenstel.

35 Getoond wordt:

In figuur 1: bovenaanzicht van bovenste plaat In figuur 2: bovenaanzicht van onderste plaat 1018571 - 6 -

In figuur 3: zijaanzicht van bovenste en onderste plaat

In figuur 4: filtersamenstel

In figuur 5: bovenaanzicht grondplaat 5 In figuur 6: zijaanzicht grondplaat

De in figuur 1 weergegeven bovenste plaat 1 toont een plaat met 96 putjes. Deze putjes vormen buisvormige uitsteeksels 2, waarvan de openingen in figuur 1 van bovenaf te zien zijn. De putjes zijn in een gelijkmatig patroon 10 gerangschikt.

In het bovenaanzicht van de onderste plaat 3 in figuur 2 zijn de op de uitsparingen 4 van de onderste plaat 3 liggende filters 5 te zien, die met elkaar zijn verbonden via een verbindingsstuk 6 en die elk door een ring 7 worden 15 begrensd.

In het zijaanzicht in figuur 3 is zowel de plaat 1 met de buisvormige uitsteeksels 2 als de onderste plaat 3 met de uitsparingen 4 te zien. De buisvormige uitsteeksels 2 van de bovenste plaat 1 worden bij gebruik van de inrich-20 ting in de uitsparingen 4 van de onderste plaat 3 gestoken.

Figuur 4 toont een f iltersamenstel van acht filters 5, die via verbindingsstukken 6 met elkaar verbonden zijn en die elk worden omgeven door een ring 7.

Figuur 5 toont een bovenaanzicht op grondplaat 8 25 met binnenruimte 11. Deze grondplaat bevat een afdichtring 9 die de binnenruimte 11 afdicht, en een afzuigbuis 10.

In het zijaanzicht van de grondplaat in figuur 6 is de afzuigbuis 10 te zien die in de binnenruimte 11 van de grondplaat 8 uitmondt. De afdichtring 9 begrenst de bin-30 nenruimte 11 van grondplaat 8.

De inrichting volgens de uitvinding volgens conclusie 1 met een bovenste plaat 1 met buisvormige uitsteeksels 2 alsook een onderste plaat 3 met uitsparingen 4 waarin mobiele filters 5 kunnen worden gelegd, alsook middelen 35 voor het afzuigen van vloeistof, maakt het mogelijk een groot aantal monsters onder gelijke omstandigheden te behandelen en te onderzoeken. De uitsparingen 4 van onder- 1018571 - 7 - ste plaat 3 kunnen de vorm hebben van ronde boorgaten die onder andere conisch toelopen, alsook hoekig uitgestanste vormen hebben. In deze uitsparingen 4 worden filters 5 gelegd, die het materiaal dat moet worden onderzocht, 5 tegenhouden en alleen doorlaatbaar zijn voor de vloeistof waarmee de monsters moeten worden behandeld of waarin de monsters opgelost zijn. Met behulp van de middelen voor het afzuigen van vloeistof kunnen deze vloeistoffen door de filters 5 uit de inrichting worden verwijderd.

10 Doordat de filters 5 via verbindingsstukken 6 met elkaar zijn verbonden, wordt het mogelijk meerdere filters 5 gelijktijdig uit de inrichting te verwijderen. Het aantal filters 5 die moeten worden verwijderd, wordt vastgelegd door de verbinding van de afzonderlijke filters 5 door 15 middel van de verbindingsstukken 6, en kan naar behoefte gevarieerd worden.

Doordat de filters 5 elk door een ring 7 omgeven zijn, is een dichte afsluiting van de filters 5 met de uitsparingen 4 van onderste plaat 3 mogelijk. Tegelijker-20 tijd maken de ringen de fixatie van de filters 5 op de uitsparingen 4 en een stabilisatie van de overigens breekbare filters 5 mogelijk.

Doordat de ring 7 een dikte heeft van niet meer dan 0,2 mm, is het mogelijk de filters 5 direct na kleuring 25 of een andere chemische of biologische behandeling uit de inrichting te nemen en onder een microscoop te leggen. Door de geringe dikte van de filters 5 met ring 7 is het mogelijk het objectief van de microscoop dicht genoeg bij de filters 5 te brengen om een goede scherpstelling te berei-3 0 ken.

De gunstige uitvoeringsvorm van de uitvinding volgens conclusie 2 met de bijbehorende thermostatiseerbare kamer maakt een behandeling van celmateriaal onder constante temperatuursomstandigheden mogelijk. Zo kan bijvoorbeeld 35 een hybridisatie van cellen uitgevoerd worden zonder dat de cellen voor filtratie of verdere toevoeging van reagentia uit de inrichting behoeven te worden verwijderd. De inrich- 1018571 - 8 - ting kan bijvoorbeeld in een thermoblok worden gezet. Hierbij is het bijzonder gunstig dat een temperatuurgra-diënt kan worden toegepast om de telkens optimale temperatuur vast te stellen.

5 Met behulp van de uitvoeringsvorm van de inrich ting volgens conclusie 3, die een pomp voor het af zuigen van vloeistof omvat, is het mogelijk scheidingswerkwijzen direct met de inrichting uit te voeren. De pomp kan bijvoorbeeld een vacuümpomp, een waterstraalpomp of een mem-10 braanpomp zijn. Het af zuigen van de vloeistof kan hier ofwel compleet over de gehele onderste plaat 3 plaatsvinden, door de pomp aan te sluiten op een grondplaat 8 die alle uitsparingen 4 afdicht, ofwel kan de pomp naar behoefte op de afzonderlijke uitsparingen 4 aangesloten worden, zodat 15 elk afzonderlijk monster kan worden afgezogen (conclusie 4). Dit heeft het voordeel dat onder overigens gelijkblijvende omstandigheden verschillende incubatietijden kunnen worden toegepast.

De uitvoeringsvorm van de inrichting volgens con-20 clusie 5, waarbij de filterdoorsnede overeenkomt met de doorsnede van de uitsparingen 4, dient om de uitsparingen 4 van de onderste plaat 3 af te dichten en zo de bodem voor de reactieruimte van de inrichting te vormen.

De gunstige uitvoeringsvorm van de inrichting 25 volgens conclusie 6, waarbij de afstand tussen de filters 5 overeenkomt met de afstand tussen de uitsparingen 4 van de onderste plaat 3, maakt het mogelijk de filters 5 door de verbindingsstukken 6 zo te rangschikken dat bijvoorbeeld een aantal van 8 of 16 filters in één handeling in de uit-30 sparingen 4 kan worden gelegd, zonder dat de filters 5 afzonderlijk behoeven te worden ingelegd.

In de uitvoeringsvorm van de inrichting volgens conclusie 7, waarbij de doorsnede van de ring 7 groter is dan de doorsnede van de uitsparingen 4 van onderste plaat 35 3, wordt bereikt dat de ring 7 rond de filters 5 zich als een kraag rond de uitsparingen 4 legt en deze afdicht.

1018571 - 9 -

De uitvoeringsvorm van de inrichting volgens conclusie 8, waarbij de filters 5 een poriegrootte van 0,20 tot 0,45 μπι hebben, zorgt ervoor dat met de filters 5 meer verschillende micro-organismen door de filters 5 kunnen 5 worden tegengehouden en zo behandelingen zoals bijvoorbeeld een hybridisatie met micro-organismen van verschillende grootte kunnen worden uitgevoerd.

Met de uitvoeringsvorm van de inrichting volgens conclusie 9, waarbij de filters 5 bestaan uit polycarbo-10 naat, aluminiumoxide of cellulosenitraat, wordt het mogelijk rekening te houden met de verschillende eisen die worden gesteld door gebruik van verschillende oplosmiddelen en zuren en die verder worden gesteld door verschillend eiwitbindingsgedrag alsook de eigen fluorescentie en 15 achtergrondfluorescentie van de desbetreffende filtereigen-schappen.

In de gunstige uitvoeringsvorm van de inrichting volgens conclusie 10, waarbij de doorsnede van de buisvormige uitsteeksels 2 van de bovenste plaat 1 overeenkomt met 20 de doorsnede van de uitsparingen 4 van de onderste plaat 3, wordt een nauwkeurige aansluiting van de buisvormige uitsteeksels 2 van bovenste plaat 1 met de uitsparingen 4 van onderste plaat 3 bereikt zonder dat vloeistof naar buiten kan treden of dat zich dode ruimten vormen.

25 Door de uitvoeringsvorm van de inrichting volgens conclusie 11, waarbij de buisvormige uitsteeksels 2 na het opzetten op de onderste plaat 3 een volume tot 300 μΐ vormen, wordt het mogelijk te werken met een klein monster-volume en ook met een klein volume reagensoplossing, waar-30 door kostenbesparingen worden bereikt. Vergeleken met de stand der techniek wordt een ongeveer tienvoudige reductie van het noodzakelijke hybridisatiereagens bereikt.

De uitvoeringsvorm van de inrichting volgens conclusie 12, waarbij de inrichting bestaat uit warmtegelei-35 dend materiaal, zorgt ervoor dat bij thermostatisering van de inrichting, bijvoorbeeld door bevestiging in een ther-moblok, een snelle instelling van de gewenste temperatuur 1018571 - 10 - wordt bereikt. Bij instelling van een temperatuurgradiënt wordt de temperatuurverandering snel door het thermoblok op de inrichting overgedragen. Met bijzondere voorkeur is hiervoor een inrichting geschikt die VA-staal omvat (con-5 clusie 14).

Met de gunstige uitvoeringsvorm van de inrichting volgens conclusie 13, die bestaat uit voor licht ondoor-laatbaar materiaal, wordt een aantasting van lichtgevoelige reagentia of micro-organismen verhinderd.

10 Door het gebruik van chemisch inert materiaal vol gens de uitvoeringsvorm volgens conclusie 15, waarbij het VA-staal bekleed is met teflon, glas, kunststof, goud of keramiek, is het mogelijk ook chemisch reactievere reagentia zoals bijvoorbeeld oplosmiddelen en zuren te gebruiken. 15 De gunstige uitvoeringsvorm van de inrichting vol gens conclusie 16, waarbij de inrichting kan worden gesteriliseerd, maakt het mogelijk de inrichting vele malen te gebruiken. Er kan onder steriele omstandigheden gewerkt worden door de inrichting bijvoorbeeld volledig te autocla-20 veren. Het enige wegwerpmateriaal bestaat uit de gebruikte filters 5.

Het filtersamenstel volgens conclusie 17, waarbij de afzonderlijke filters via verbindingsstukken 6 met elkaar gekoppeld zijn, maakt het mogelijk dat een willekeurig 25 variabel aantal filters 5 met elkaar kan worden gekoppeld en zo naar behoefte kan worden gebruikt. Er kunnen bijvoorbeeld ketens van acht filters 5 gekoppeld worden, die in een in de handel verkrijgbare microtiterplaat met 8 x 12 putjes precies in een rij van deze plaat kunnen worden 30 gezet. In principe is een rooster van gekoppelde filters 5 denkbaar, dat afhankelijk van de eis bij de verbindingsstukken 6 tussen de filters 5 willekeurig weer kan worden gescheiden, om bijvoorbeeld een keten van 4 of een vierkante rangschikking te verkrijgen. Door de koppeling van de 35 filters 5 via alleen verbindingsstuk 6 is het uitwisse-lingsoppervlak tussen de afzonderlijke filters 5 zeer klein, zodat kruislingse verontreiniging met aangrenzende 1018571 - 11 - filters 5 wordt voorkomen. De relatief kleine filters 5 kunnen door de koppeling van de filters 5 met elkaar beter uit filterhouders worden genomen, omdat het gehele samenstel van filters uit de houders uitgenomen kan worden.

5 De gunstige uitvoeringsvorm van het filtersamen- stel volgens conclusie 18, waarbij de verbindingsstukken 6 uit kunststofmateriaal bestaan, zorgt enerzijds voor een mechanisch stabiele koppeling tussen de filters 5 en anderzijds voor een chemisch inerte koppeling. Gelijktijdig 10 wordt een diffusie-uitwisseling tussen aangrenzende filters 5 bemoeilijkt.

De uitvoeringsvorm van het f iltersamenstel volgens conclusie 19, waarbij de afzonderlijke filters worden omgeven door een ring 7, bewerkstelligt een dichte afsluiting 15 van de filters 5 met de filterhouder waarin het filter-samenstel wordt gelegd. Gelijktijdig maken de ringen de fixatie van de filters 5 in de houder en een stabilisatie van de eventueel breekbare filters 5 mogelijk.

De uitvoeringsvorm van het filtersamenstel volgens 20 conclusie 20, waarbij ring 7 uit kunststofmateriaal bestaat, zorgt enerzijds voor een mechanisch stabiele koppeling tussen de filters 5 en anderzijds voor een chemisch inerte stabilisatie van de filters. Gelijktijdig wordt een diffusie-uitwisseling tussen aangrenzende filters 5 bemoei-25 lijkt.

Met de uitvoeringsvorm van het f iltersamenstel volgens conclusie 21, waarbij de ring een dikte heeft van niet meer dan 0,2 mm, wordt het mogelijk de filters 5 direct na de kleuring of een andere chemische of biologi-30 sche behandeling uit de filterhouder te nemen en onder een microscoop te leggen. Door de geringe dikte van de filters 5 met ring 7 is het mogelijk het objectief van de microscoop voldoende dicht bij de filters 5 te brengen om een goede scherpstelling te bereiken.

35 De uitvoeringsvorm van het f iltersamenstel volgens conclusie 22, waarbij de doorsnede van ring 7 rond filter 5 groter is dan de doorsnede van de uitsparingen 4 in onder- 10 1 8671 - 12 - ste plaat 3 van een inrichting volgens één der conclusies 1 tot 16, zorgt ervoor dat ring 7 rond de filters 5 zich als een kraag rond de uitsparingen 4 legt en deze afdicht.

In een gunstige uitvoeringsvorm van het filter-5 samenstel volgens conclusie 23, waarbij de filters lineair met elkaar gekoppeld zijn, wordt het mogelijk naar behoefte een filterketen met de noodzakelijke filters te gebruiken en deze filterketen aan te passen aan het aanwezige aantal filterhouders. De filterketens kunnen zo goed worden 10 aangepast aan de matrixachtig gerangschikte boorgaten van een microtiterplaat.

Door de uitvoeringsvorm van het filtersamenstel volgens conclusie 24, waarbij acht filters 5 lineair aan elkaar gekoppeld worden, kunnen deze filterketens in hun 15 geheel in een passende houder worden gelegd zoals bijvoorbeeld een rij van een microtiterplaat, en na afloop van de behandeling daar ook weer worden uitgenomen.

De uitvoeringsvorm van het filtersamenstel volgens conclusie 25, waarbij de doorsnede van de filters 5 over-20 eenkomt met de doorsnede van de uitsparingen 4 in de onderste plaat 3 van een inrichting volgens één der conclusies 1 tot 16, zorgt ervoor dat de uitsparingen 4 van de onderste plaat 3 worden afgedicht en dat zo de bodem voor de reactieruimte van de inrichting wordt gevormd.

25 De uitvoeringsvorm van het filtersamenstel volgens conclusie 26, waarbij de filters 5 bestaan uit polycarbo-naat, aluminiumoxide of cellulosenitraat, maakt het mogelijk rekening te houden met de verschillende eisen die worden gesteld door het gebruik van verschillende oplosmidde-30 len en zuren en die worden gesteld door verschillend eiwit-bindingsgedrag van de desbetreffende filtereigenschappen.

De uitvoeringsvorm van het filtersamenstel volgens conclusie 27, waarbij de filters 5 een poriegrootte hebben van 0,2 tot 0,45 μπι, zorgt ervoor dat met de filters 5 meer 35 verschillende micro-organismen door de filters 5 kunnen worden tegengehouden en dat zo behandelingen zoals bijvoor- 1018571 - 13 - beeld hybridisaties met micro-organismen van verschillende grootte kunnen worden uitgevoerd.

Uitvoeringsvoorbeeld 5 De bovenste plaat 1 met 96 buisvormige uitsteek sels 2 in een rangschikking van 12 x 8, wordt vloeistofdicht bevestigd aan de onderste plaat 3, die ook 96 uitsparingen heeft in een rangschikking van 12 x 8 en die is uitgerust met 12 filtersamenstellen van elk acht filters 5 10 per rij. De bovenste plaat 1 wordt volledig afgesloten met een deksel. De onderste plaat 3 wordt vloeistofdicht afgedicht met een grondplaat 8, versterkt door een afdichting 9. Op de gehele inrichting kan via grondplaat 8, die via een afzuigbuis 10 is aangesloten op een vacuümpomp, een 15 vacuüm aangelegd worden. Voor een zekere afdichting van de aan elkaar bevestigde platen kan nog een klem rond de gehele inrichting gespannen worden. Voor thermostatisering wordt de gehele inrichting in een thermoblok gezet.

200 μΐ voorverwarmde hybridisatiebuffer met een 20 passend gehalte genprobes wordt gebracht in de reactieruim-te die wordt gevormd door de buisvormige uitsteeksels 2 van de bovenste plaat 1 samen met de filters in de uitsparingen 4 van onderste plaat 3. Vervolgens wordt daaraan 100 μΐ gefixeerde cellen toegevoegd. Na een hybridisatietijd van één 25 uur wordt de vloeistof afgezogen, wordt de temperatuur van de inrichting op de gewenste wastemperatuur gereguleerd en er wordt 200 μΐ wasbuffer toegevoegd. Na één uur wordt de wasbuffer afgezogen met behulp van de vacuümpomp die via afzuigbuis 10 is aangesloten op grondplaat 8. Er wordt op-30 nieuw 200 μΐ wasbuffer toegevoegd en weer afgezogen. De filters worden nu uit de inrichting verwijderd door het gehele filtersamenstel van acht filters per rij uit de onderste plaat te nemen. Dit filtersamenstel kan direct microscopisch onderzocht worden. Desgewenst kan ook een tegen-35 kleuring in de inrichting uitgevoerd worden. De filters blijven gedurende de gehele werkwijze in de uitsparingen 4 van onderste plaat 3. Dit heeft het voordeel dat eventueel f 0 18 5 71 - 14 - van het filter losgelaten cellen door afzuiging weer kunnen worden opgevangen.

1018571

Claims (27)

1. Inrichting met een groot aantal monsterkamers 10 voor de behandeling van cellen en voor analyse door middel van lichtproducerende werkwijzen, met het kenmerk, dat zij een bovenste plaat (1) met buisvormige uitsteeksels (2) alsmede een onderste plaat (3) met uitsparingen (4) waarin mobiele filters (5) kunnen worden gelegd, die via verbin-15 dingstukken (6) met elkaar verbonden zijn en die elk omgeven zijn door een ring (7) die een dikte heeft van niet meer dan 0,2 mm, alsmede middelen voor het af zuigen van vloeistof omvat.

2. Inrichting volgens conclusie 1, met het ken-20 merk, dat bij de inrichting een thermostatiseerbare kamer hoort.

3. Werkwijze volgens één der conclusies 1 en 2, met het kenmerk, dat de middelen voor het afzuigen van vloeistof een pomp omvatten.

4. Inrichting volgens conclusie 3, met het ken merk, dat de pomp direct wordt aangesloten op de afzonderlijke uitsparingen (4) van de onderste plaat (3) , of op een grondplaat (8) die alle uitsparingen afdicht.

5. Inrichting volgens één der conclusies 1-4, met 3 0 het kenmerk, dat de filterdoorsnede overeenkomt met de doorsnede van de uitsparingen (4),

6. Inrichting volgens één der conclusies 1-5, met het kenmerk, dat de afstand tussen de filters (5) overeenkomt met de afstand tussen de uitsparingen (4) van de on- 35 derste plaat (3) .

7. Inrichting volgens één der conclusies 1-6, met het kenmerk, dat de doorsnede van de ring (7) groter is dan 10 18571: - 16 - de doorsnede van de uitsparingen (4) van de onderste plaat (3) .

8. Inrichting volgens één der conclusies 1-7, met het kenmerk, dat de filters (5) een poriegrootte van 0,2 5 tot 0,45 μπι hebben.

9. Inrichting volgens één der conclusies 1-8, met het kenmerk, dat de filters (5) bestaan uit polycarbonaat, aluminiumoxide of cellulosenitraat.

10. Inrichting volgens één der conclusies 1-9, met 10 het kenmerk, dat de doorsnede van de buisvormige uitsteeksels (2) van de bovenste plaat (1) overeenkomt met de doorsnede van de uitsparingen (4) van de onderste plaat (3) .

11. Inrichting volgens één der conclusies 1-10, 15 met het kenmerk, dat de buisvormige uitsteeksels (2) na het opzetten op de onderste plaat (3) een volume tot 300 μΐ vormen.

12. Inrichting volgens één der conclusies 1-11, met het kenmerk, dat zij bestaat uit warmtegeleidend 20 materiaal.

13. Inrichting volgens één der conclusies 1-12, met het kenmerk, dat zij bestaat uit voor licht ondoorlaat-baar materiaal.

14. Inrichting volgens één der conclusies 1-13, 25 met het kenmerk, dat zij VA-staal omvat.

15. Inrichting volgens conclusie 14, met het kenmerk, dat het VA-staal bekleed is met teflon, glas, kunststof, goud of keramiek.

16. Inrichting volgens één der conclusies 1-15, 30 met het kenmerk, dat zij steriliseerbaar is.

17. Filtersamenstel, met het kenmerk, dat afzonderlijke filters (5) met elkaar verbonden worden via verbindingsstukken (6) .

18. Filtersamenstel volgens conclusie 17, met het 35 kenmerk, dat de verbindingsstukken (6) bestaan uit kunst- stofmateriaal. 1018571 - 17 -

19. Filtersamenstel volgens één der conclusies 17-18, met het kenmerk, dat de afzonderlijke filters (5) omgeven worden door een ring (7).

20. Filtersamenstel volgens conclusie 19, met het 5 kenmerk, dat de ring (7) bestaat uit kunststofmateriaal.

21. Filtersamenstel volgens één der conclusies 19-20, met het kenmerk, dat de ring (7) een dikte heeft van niet meer dan 0,2 mm.

22. Filtersamenstel volgens één der conclusies 10 15-21, met het kenmerk, dat de doorsnede van de ring (7) rond de filters (5) groter is dan de doorsnede van de uitsparingen (4) in de onderste plaat (3) van een inrichting volgens één der conclusies 1-16.

23. Filtersamenstel volgens één der conclusies 15 17-22, met het kenmerk, dat de filters (5) lineair met el kaar verbonden zijn.

24. Filtersamenstel volgens één der conclusies 17-23, met het kenmerk, dat acht filters (5) lineair met elkaar verbonden zijn.

25. Filtersamenstel volgens één der conclusies 17-24, met het kenmerk, dat de doorsnede van de filters (5) overeenkomt met de doorsnede van de uitsparingen (4) in de onderste plaat (3) van een inrichting volgens één der conclusies 1-16.

26. Filtersamenstel volgens één der conclusies 17-25, met het kenmerk, dat de filters (5) bestaan uit po-lycarbonaat, aluminiumoxide of cellulosenitraat.

27. Filtersamenstel volgens één der conclusies 17-26, met het kenmerk, dat de filters (5) een poriegrootte 30 van 0,2 tot 0,45 μπ\ hebben. ***** 10 18571