[go: up one dir, main page]

NL1008745C2 - Therapeutisch werkzame verbinding voor behandeling van gist- en/of schimmelinfecties in de mondholte. - Google Patents

Therapeutisch werkzame verbinding voor behandeling van gist- en/of schimmelinfecties in de mondholte. Download PDF

Info

Publication number
NL1008745C2
NL1008745C2 NL1008745A NL1008745A NL1008745C2 NL 1008745 C2 NL1008745 C2 NL 1008745C2 NL 1008745 A NL1008745 A NL 1008745A NL 1008745 A NL1008745 A NL 1008745A NL 1008745 C2 NL1008745 C2 NL 1008745C2
Authority
NL
Netherlands
Prior art keywords
peptide
therapeutically active
active compound
amino acids
compound according
Prior art date
Application number
NL1008745A
Other languages
English (en)
Inventor
Arie Van Nieuw Amerongen
Engelmundus Cornelis I Veerman
Willem Van T Hof
Willy Alexander Van De Reijden
Annetje Lena Adriana Ruissen
Original Assignee
Stichting Tech Wetenschapp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Stichting Tech Wetenschapp filed Critical Stichting Tech Wetenschapp
Priority to NL1008745A priority Critical patent/NL1008745C2/nl
Application granted granted Critical
Publication of NL1008745C2 publication Critical patent/NL1008745C2/nl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4723—Cationic antimicrobial peptides, e.g. defensins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/58—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. poly[meth]acrylate, polyacrylamide, polystyrene, polyvinylpyrrolidone, polyvinylalcohol or polystyrene sulfonic acid resin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

J
THERAPEUTISCH WERKZAME VERBINDING VOOR BEHANDELING VAN GIST- EN/OP SCHIMMELINFECTIES IN DE MONDHOLTE
De uitvinding betreft een therapeutisch werkzame verbinding voor behandeling van gist- en/of schimmel-en/of bacteriële infecties in de mondholte, in het maag-darmkanaal, op de huid en in de vagina.
5 Candida species zijn orale commensalen, maar kunnen onder bepaalde omstandigheden infecties veroorzaken. Dit wordt candidiasis genoemd. Mensen, die in het bijzonder vatbaar zijn voor orale candidiasis zijn bijvoorbeeld personen, die een kunstgebit dragen, immuun-10 gecompromiteerde patiënten en patiënten met een verminderde speekselproductie (xerostomia), bijvoorbeeld als gevolg van het syndroom van Sjögren of stralingstherapie. Candida kan verder leiden tot vaginale candidiasis en laesies op de huid.
15 Voor de behandeling van orale candidiasis zijn momenteel drie hoofdcategorieën van antifungale middelen beschikbaar: polygenen, zoals amphotericine B, azolen, zoals fluconazol en desinfectantia, zoals chloorhexidine. Een nadeel van deze klassieke antibiotica is het ontstaan 20 van resistentie. Voor Candida zijn reeds resistenties tegen amphotericine B en fluconazol gemeld. Ook van de bacterie Staphylococcus aureusf die huidinfecties kan veroorzaken zijn zeer resistente stammen bekend.
Een bijkomend probleem, dat zich met name 25 voordoet bij de behandeling van de mondholte, is dat de beschikbare hoeveelheid van het antifungale of antibacte-riële middel tot onder de effectieve concentratie daalt door slikken en verdunning door speeksel. Ook bij de andere vormen van Candida- of bacteriële infectie kunnen 30 zich soortgelijke beschikbaarheidsproblemen voordoen, bijvoorbeeld door proteolytische afbraak door micro-organismen uit de orale flora.
Het is het doel van de uitvinding beide problemen tegelijkertijd op te lossen.
35 Dit wordt door de uitvinding bereikt door een therapeutisch werkzame verbinding voor behandeling van gist- en/of schimmelinfecties van mondholte, maag-darmka- 10087 4 5¾ 2 naai, huid en vagina, omvattende een peptide met antifun-gale activiteit, bestaande uit een aminozuurketen, welke een domein van 10 tot 25 aminozuren bevat, waarbij de meerderheid van de aminozuren van de ene helft van het 5 domein positief geladen aminozuren zijn en de meerderheid van de aminozuren van de andere helft van het domein ongeladen aminozuren zijn, gekoppeld aan een mucoadhesief (co)polymeer. De aanwezigheid van het mucoadhesieve (co)polymeer zorgt voor een langere verblijftijd in de 10 mond. Het mucoadhesieve (co)polymeer is bij voorkeur gekozen is uit xanthaangom, polyacrylzuur, cellulosederi-vaten, carragenen en derivaten daarvan, chitine en derivaten daarvan, zoals chitosan, scleroglucan en gommen, zoals guargom, locust bean gom enz. Ook synthetische 15 polymeren met carboxylgroepen of amine-groepen komen hiervoor in aanmerking. Dergelijke mucoadhesieve (co)polymeren hebben als voordelen dat zij de biobeschik-baarheid van het geneesmiddel verhogen en verbeteren, dat het middel door de langere verblijftijd minder vaak 20 aangebracht behoeft te worden en dat er een optimaal contact is met het (co)polymeer adsorberende oppervlak.
In de verbinding volgens de uitvinding hebben de peptiden, die kationisch zijn, een Candida albicans-dodende werking en werken tevens remmend op pathogene 25 micro-organismen als Streptococcus mutans en een methyci-line-resistente Staphylococcus aureus (MRSA). Gevonden is dat de kationische peptiden geen resistente mutanten veroorzaken na 20 passages op een concentratie nabij de MIC-waarde. Verder werken zij synergistisch met klassieke 30 antibiotica.
De werking van de peptiden is waarschijnlijk gebaseerd op het feit dat de kationische peptiden in de negatief geladen celwand amfipathische α-helices vormen, die dienst doen als poriën waardoor onder andere K+-ionen 35 uit de cel lekken.
De opbouw van de peptiden, die onderdeel uitmaken van de therapeutische verbindingen volgens de uitvinding kent een aantal variaties. Ten eerste kan het domein ; 100 874 δ * 3 een α-helix vormen, waarvan tenminste een meerderheid van de posities 1, 2, 5, 6, 9 (12, 13, 16, 19, 20, 23 en 24) een positief geladen aminozuur bevat, positie 8 een positief of een ongeladen aminozuur is en tenminste een 5 meerderheid van de posities 3, 4, 7, 10, (11, 14, 15, 17, 18, 21, 22, 25) een ongeladen aminozuur bevat. Deze peptiden hebben een laterale amfipathiciteit, dat wil zeggen een maximaal hydrofoob moment bij 100°. Eenvoudig gezegd, zijn deze peptiden aan de linkerzijde hydrofoob 10 en aan de rechterzijde hydrofiel of omgekeerd. Deze peptiden worden hierin "type I" genoemd.
Verder kan het domein een α-helix vormen, waarvan tenminste een meerderheid van de posities 1, 2, 5, 6, 9 (12, 13, 16, 19, 20, 23 en 24) een ongeladen aminozuur 15 bevat, positie 8 een positief of een ongeladen aminozuur is en tenminste een meerderheid van de posities 3, 4, 7, 10, (11, 14, 15, 17, 18, 21, 22, 25) een positief geladen aminozuur bevat. Deze peptiden hebben een laterale amfipathiciteit, dat wil zeggen een maximaal hydrofoob moment 20 bij 100°. Eenvoudig gezegd, zijn deze peptiden aan de rechterzijde hydrofoob en aan de linkerzijde hydrofiel of omgekeerd. Deze peptiden worden hierin "type II" genoemd en zijn in principe de spiegelbeelden van type I peptiden.
25 Daarnaast kan het domein een α-helix vormen, waarbij tenminste een meerderheid van de posities 1 tot en met 6 (of 7 of 8 of 9 of 10 of 11 of 12) een ongeladen aminozuur bevat, en op positie 7 (of 8 of 9 of 10 of 11 of 12 of 13) tot en met 25 een positief geladen aminozuur 30 voorkomt. Deze peptiden hebben een langsgerichte amfipathiciteit, dat wil zeggen een minimaal hydrofoob moment bij 100®. Deze peptiden zijn aan hun "bovenkant" hydrofoob en aan hun "onderkant" hydrofiel. Dergelijke peptiden worden met "type III" aangeduid.
35 Omgekeerd kan het domein een e-helix vormen, waarbij tenminste een meerderheid van de posities 1 tot en met 6 (of 7 of 8 of 9 of 10 of 11 of 12) een positief geladen aminozuur bevat, en op positie 7 (of 8 of 9 of 10 10 0874 5·« 4 of 11 of 12 of 13) tot en met 25 een ongeladen aminozuur voorkomt. Deze peptiden hebben eveneens een langsgerichte amfipathiciteit, en dus een minimaal hydrofoob moment bij 100°. Deze peptiden zijn aan hun "onderkant" hydrofoob en 5 aan hun "bovenkant" hydrofiel. Dergelijke peptiden worden met "type IV" aangeduid.
Tenslotte kan het domein een zogeheten β-strand vormen en op tenminste een meerderheid van de posities 1, 3, 5, 7, 9 (11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 en 25) een posi-10 tief geladen aminozuur bevatten, en op tenminste een meerderheid van de posities 2, 4, 6, 8, 10, (12, 14, 16, 18, 20, 22, 24) een ongeladen aminozuur. Een dergelijke β-strand is lateraal amfipathisch en heeft een maximaal hydrofoob moment bij 180°. De β-strand structuur is 15 vlakker dan de α-helix en is eenvoudig gezegd links hydrofoob en rechts hydrofiel of omgekeerd. Dit zijn "type V"-peptiden.
De positief geladen aminozuren worden bij voorkeur gekozen uit de groep, die bestaat uit ornithine 20 (O), lysine (K), arginine (R) en histidine (H), terwijl de ongeladen aminozuren bij voorkeur worden gekozen uit de groep, die bestaat uit de alifatische aminozuren glycine (G), alanine (A), valine (V), leucine (L), isoleucine (I), de aminozuren met een dipolaire zijketen 25 methionine (M), asparagine (N), glutamine (Q), serine (S), threonine (T), de aminozuren met een aromatische zijketen phenylalanine (F), tyrosine (Y), tryptofaan (W). Aminozuren op de grens tussen hydrofiel en hydrofoob kunnen uit beide groepen of uit de overige aminozuren 30 gekozen worden.
In principe is er nauwelijks verschil in activiteit waar te nemen wanneer een van de positieve aminozuren en/of een van de ongeladen aminozuren is vervangen door een willekeurig aminozuur. De meerderheid van de 35 positief geladen aminozuren is derhalve bij voorkeur het totale aantal positief geladen aminozuren minus 1 en de meerderheid van de ongeladen aminozuren is bij voorkeur het totale aantal ongeladen aminozuren minus l.
1003745^ 5
Het domein kan een onderdeel zijn van een groter peptide, maar kan ook zelf het gehele peptide uitmaken. Wanneer het domein onderdeel uitmaakt van een groter peptide kunnen de C-terminale en/of N-terminale 5 aminozuren, die dan extra aanwezig zijn willekeurige aminozuren zijn.
De bijzondere voorkeur gaat uit naar de volgende peptiden van het type I: KRLFKELKFSLRKY (peptide 3) 10 KRLFKELLFSLRKY (peptide 4) KRLFKELKKSLRKY (peptide 5) KRLFKELLKSLRKY (peptide 6 OOLFOELOOSLOOY (peptide 7) OOLFOELLOSLOOY (peptide 8) 15 KRLFKKLKFSLRKY (peptide 9) KRLFKKLLFSLRKY (peptide 10)
Een voorkeurspeptide van het type III heeft de volgende aminozuurvolgorde: LLLFLLKKRKKRKY (peptide 11) 20 De peptiden, die onderdeel uitmaken van de verbindingen volgens de uitvinding kunnen verder nog modificaties bevatten. Deze modificaties zijn bijvoorbeeld een N-terminale amidering, bijvoorbeeld met azijn-zuuranhydride, of een alternatieve afsplitsing van de 25 synthesehars, waardoor de C-terminus gemodificeerd wordt. Voor dit laatste kan gedacht worden aan een vervanging van de C-terminale carbonzuurgroep door een amide-, ester-, keton-, aldehyde- of alcoholgroep. De mogelijkheid van modificatie hangt af van het uiteinde waaraan 30 het (co)polymeer gekoppeld is. Dit zal meestal het N-terminale uiteinde zijn. Deze is dan niet meer vrij voor modificatie. Peptiden met een dergelijke modificatie zijn bijvoorbeeld: KRLFKELKFSLRKY-amide (peptide 12) 35 KRLFKELLFSLRKY -amide (peptide 13)
Naast enkelvoudige peptiden kunnen ook oligome-ren worden gebruikt. Dit zijn bij voorkeur lineaire oligomeren van de peptiden volgens de uitvinding. De 100874 5¾ 6 koppeling kan zowel kop-kop als staart-staart als staart-kop zijn, hetzij door directe synthese in vitro of in vivo en via translatie uit een transgene cDNA-bank, hetzij door postsynthetische enzymatische koppeling. Voor 5 de vorming van een transmembraan porie is een minimale peptidenlengte vereist. Oligomeren van de peptiden volgens de uitvinding zijn dubbel lang en daardoor in principe beter in staat de gehele fosfolipide dubbellaag van de bacteriële of eukaryotische celmembraan in een keer te 10 overspannen. Hierdoor zou de werking van het peptide nog verder kunnen verbeteren. Daarnaast geeft verlenging van de peptiden een stabilisatie van de helixconformatie. Meestal dient een spacer te worden ingevoegd. Bij directe synthese van kop-staart gekoppelde oligomeren kan een 15 spacer op maat worden ingebouwd door het gebruik van een keten van onnatuurlijke aminozuren van de juiste lengte, bijvoorbeeld B-alanine, γ-aminoboterzuur, e-aminocapron-zuur, etc. Ook kunnen heterodifunctionele koppelingsrea-gentia, zoals die commercieel verkrijgbaar zijn om pepti-20 de-antigenen aan dragereiwitten te koppelen (bijvoorbeeld l-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide (EDC), ifl-maleimidobenzoyl)-Ji- hydroxysuccinimide ester (MBS), N-succinimidyl 3-[pyridyldithio]propionaat (SPDD) etc. gebruikt worden om lineaire oligomeren met een tussenge-25 voegde spacer te maken. Voor kop-kop en staart-staart-koppelingen kunnen driewaardige aminozuren worden gebruikt, zoals asparaginezuur (D), glutaminezuur (E), ornithine (O), lysine (K), serine (S), cysteïne. Dergelijke oligomeren zijn bijvoorbeeld: 30 KRKFHEKHHSHRGYC-CY GRH SHHKEHFKRK (peptide 14) YGRHSHHKEHFKRKC-CKRKFHEKHHSHRGY (peptide 15) ®N, *N- (KRKFHEKHHSHRGY) 2K-amide (peptide 16) ®N, *N- (KRLFKELKFSLRKY) 2K-amide (peptide 17) eN, *N- (KRLFKKLKFSLRKY) 2K-amide (peptide 18) 35 Peptiden 14 en 15 zijn verkregen door synthese van peptide 2 met een additionele C-terminale, respectievelijk N-terminale cysteïne, waarna het oligomeer verkregen is door luchtoxidatie. Peptiden 16, 17 en 18 zijn verkregen 1Q0GV4C, 7 door gebruikmaking van de Multi-Antigen Peptide (MAP) strategie, waarbij als eerste aminozuur een lysine met zowel op de a- als op de e-aminogroep een Fmoc bescherming als eerste aminozuur aan de synthesehars werd ge-5 bruikt, waardoor gelijktijdig twee identieke aminozuurke-tens (peptiden 2, 3 en 9) op één lysinemolecuul werden gesynthetiseerd.
De hierin beschreven peptiden hebben geen of nauwelijks hemolytische activiteit in fysiologische 10 buffers, zoals PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing). Een lage activiteit tegen erytrocyten van humane oorsprong is een indicatie voor lage toxiciteit. Deze selectiviteit is essentieel voor het gebruik van deze peptiden als antibiotica.
15 Alle hierboven beschreven peptiden kunnen covalent gekoppeld aan een mucoadhesief (co)polymeer gebruikt worden voor de behandeling van gist- en/of schim-melinfecties van mondholte, maag-darmkanaal, huid en vagina. De bijzondere voorkeur gaat echter uit naar een 20 peptide met de aminozuursequentie KRLFKELKFSLRKY met xanthaangom daar covalent aan gekoppeld. Een voorbeeld van een werkwijze om xanthaangom covalent aan de peptiden te koppelen wordt gegeven in Voorbeeld 2.
De verbindingen volgens de uitvinding kunnen 25 worden gebruikt in of als een antifungaal middel en in of als een middel tegen infectie door gisten. Hun activiteit zal in de begeleidende voorbeelden verder worden geïllustreerd .
De uitvinding betreft derhalve verder de ver-30 bindingen voor gebruik in de behandeling van gist- en/of schimmelinfecties.
Tevens onderdeel van de uitvinding is het gebruik van de verbindingen voor de vervaardiging van een geneesmiddel voor de behandeling van schimmelinfecties 35 en/of infectie door gisten.
De verbindingen volgens de uitvinding kunnen toegepast worden in verschillende farmaceutische toedie- 1008745·* 8 ningsvormen. De bijzondere voorkeur gaat uit naar spray, zalf, gel en zuigtabletten.
De uitvinding wordt verder geïllustreerd in de begeleidende voorbeelden, die slechts gegeven zijn ter 5 illustratie en niet om de uitvinding op enigerlei wijze te beperken.
VOORBEELDEN VOORBEELD 1 10 Peptidensvnthese
Peptiden, die onderdeel uitmaken van de verbindingen volgens de uitvinding werden chemisch gesynthetiseerd zoals beschreven door Van 't Hof et al. (1991) en Helmerhorst et al. (1997). Peptiden werden gesyntheti-15 seerd met behulp van de T-bag-methode, die werd aangepast voor 9-fluorenylmethoxycarbonyl ((Fmoc)-chemie). p-Ben-zyloxybenzyl-alcoholharsen waaraan de eerste N-Fmoc-beschermde aminozuren reeds gekoppeld zijn, werden opgenomen in de T-bags. De koppelingsreacties werden uitge-20 voerd in N.N-dimethvlformamide. Na voltooiing van de aminozuurketen werd deze afgesplitst van de hars en werden tegelijkertijd de zijketen-beschermingsgroepen verwijderd met een mengsel van 5% thioanisol, 5% fenol, 5% water en 85% trifluorazijnzuur. Zuiverheidsanalyses 25 werden uitgevoerd door omgekeerde fase HPLC en toonden één enkele piek met slechts weinig verontreinigingen (minder dan 5%).
Alle peptiden werden opgelost in 10 mM kalium-fosfaatbuffer (PPB), pH 7,0, tot een concentratie van 30 2 mg/ml en bewaard bij -80°C. De eind-pH van de stock-oplossing was 6,0. De exacte peptidenconcentraties die gebruikt werden in de antibacteriële bepalingen werden bepaald door aminozuuranalyse.
Tabel 1 geeft een overzicht van de peptiden 2 35 tot 13 die op deze wijze gemaakt werden. Peptiden 1 en 2 uit deze tabel geven respectievelijk het histatine 5 en het C-terminale deel daarvan weer. Vetgedrukte aminozuren zijn veranderingen ten opzichte van peptide 2.
1008745a 9
Tabel 1
PePtide sequentie
1 DSHAKRHHGYKRKFHEKHHSHRGY
2 KRKFHEKHHSHRGY
5 3 KRLFKELKFSLRKY
4 KRLFKELLFSLRKY
5 KRLFKELKKSLRKY
6 KRLFKELLFSLRKY
7 OOLFOELOOSLOOY
10 8 OOLFOELLOSLOOY
9 KRLFKKLKFSLRKY
10 KRLFKKLLFSLRKY
11 LLLFLLKKRKKRKY
12 KRLFKELKFSLRKY-amide 15 13 KRLFKELLFSLRRY-amide
14 KRKFHEKHHSHRGYC-CYGRHSHHKEHFKRK
15 YGRHSHHKEHFKRKC-CKRKFHEKHHSHRGY
16 eN,fN-(KRKFHEKHHSHRGY) 2K-amide 17 ®N, ‘N- (KRLFKELKFSLRKY) 2K-amide 20 18 “Ν,'Ν-(KRLFKKLKFSLRKY) 2K-amide VOORBEELD 2
Vervaardiging van xanthaangom-peotide coniuqaten 25 Peptide 3 uit tabel 1 werd covalent gekoppeld aan xanthaangom (Keltrol™, Keko Inc., London) roet behulp van l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) (Sigma, St. Louis, MO, VS), zoals beschreven door Hattori et al., J. Food Sci. 61: 1171-1176 (1996).
1000745ë 10
Xanthaangom en peptide 3 werden gemengd en opgelost in water. De pH werd ingesteld op 4,75. Over een periode van 30 minuten werd EDC toegevoegd, waarna het geheel onder licht roeren gedurende 5 uur bij kamertempe-5 ratuur geïncubeerd werd. Hierbij werd de pH op 4,75 gehouden. De reactie werd gestopt door toevoeging van glycine, terwijl de pH op 4,75 gehouden werd. Voor het instellen van de pH werd 10 mM HC1 gebruikt. De eindcon-centratie van xanthaangom was 21,4 mM, van peptide 3 10 0,539 mM of 0,0539 mM en van EDC 52,1 mM, 21,4, 3,77 mM, 0,539 mM of 5,21 mM. De eindconcentratie glycine was steeds 53,3 mM.
VOORBEELD 3 15 Analyse van de gevormde coniuqaten
De viscositeit en elasticiteit van xanthaangom en het gevormde conjugaat werd bepaald met behulp van een oscillerende capillaire rheometer, Vilastic 3 Viscoelas-- ticity Analyzer (Vilastic Scientific Inc. Austin TX, VS), 20 zoals beschreven door Van der Reijden et al., Arthritis & Rheumatism 39, 57-63 (1996).
De laagste concentraties EDC (0,539 mM en 3,77 mM) leidden tot een elasticiteit en viscositeit, die vergelijkbaar was met die van xanthaangom alleen. Hogere 25 concentraties verminderden de elasticiteit en viscositeit.
Op SDS-PAGE werd de koppelingsefficiëntie bepaald. Deze bleek hoger naarmate de EDC concentratie hoger was.
30 Het is voor de deskundige op basis van het bovenstaande vrij eenvoudig om de optimale EDC concentratie te bepalen.
" 100874 5·* i 11 VOORBEELD 4
Fungicide activiteit
De antifungale activiteit van het conjugaat werd bepaald, zoals beschreven door Helmerhorst et al., 5 Biochem. J. 326, 39-45 (1997). 25 μΐ van de te testen oplossingen werd 8 keer tweemaal verdund en vervolgens werd 25 jliI Candida albicans ATCC 10231 toegevoegd. C.albicans was bij 30eC gegroeid op Sabouraud dextrose agar (SDA, Oxoid, Hants, UK) en in 20 mM PPB, pH 7,0 verdund 10 tot een hoeveelheid van 107 kolonievormende eenheden (cfu) per ml.
Na 1 uur incuberen bij 37°C werd het aantal overlevende cellen bepaald door 100 maal verdunnen in PBS en werd 25 μΐ uitgeplaat op Sabourad dextrose agar. Het 15 percentage levensvatbaarheid werd berekend door: aantal levensvatbare cellen _ * 100% aantal levensvatbare cellen bij de laagste peptide concentratie
Uit de grafiek van het percentage levensvatbaarheid tegen 20 concentratie werden de IC50-waarden bepaald.
Tabel 2 geeft een overzicht van de geteste oplossingen en hun antifungale activiteit.
Tabel 2 25 oplossing IC50-waarde (^g/ml) 0.539 mM peptide 3 5 21.4 mM xanthaangom + 37,5 0.539 mM peptide 3 + 53.3 mM glycine 30 conjugaat volgens de uit- 50 vinding uit: 21.4 mM xanthaangom + 0.539 mM peptide 3 + 52,1 mM EDO + 35 53,3 mM glycine 1008745* 12
Uit het bovenstaande blijkt dat het conjugaat minder actief is dan het vrije peptide, maar nog ruim voldoende activiteit vertoont voor een praktische toepassing. Daarnaast compenseert de werking van de xanthaangom 5 mogelijk de verminderde werking door het verschaffen van een langere biobeschikbaarheid.
|
100874 5J

Claims (39)

1. J
1. Therapeutisch werkzame verbinding voor behandeling van gist- en/of schimmel- en/of bacteriële infecties van mondholte, huid en vagina, omvattende een peptide met antifungale activiteit, bestaande uit een 5 aminozuurketen, welke een domein van 10 tot 25 aminozuren bevat, waarbij de meerderheid van de aminozuren van de ene helft van het domein positief geladen aminozuren zijn en de meerderheid van de aminozuren van de andere helft van het domein ongeladen aminozuren zijn, gekoppeld aan 10 een mucoadhesief (co)polymeer.
2. Therapeutisch werkzame verbinding volgens conclusie l, met het kenmerk, dat het mucoadhesieve (co)polymeer gekozen is uit xanthaangom, polyacrylzuur, cellulosederivaten, carragenen en derivaten daarvan, 15 chitine en derivaten daarvan, zoals chitosan, scleroglu-can en gommen, zoals guargom, locust bean gom enz. Ook synthetische polymeren met carboxylgroepen of amine-groepen komen hiervoor in aanmerking.
3. Therapeutisch werkzame verbinding volgens 20 conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat de het domein van het peptide een a-helix vormt en tenminste een meerderheid van de posities 1, 2, 5, 6, 9 (12, 13, 16, 19, 20, 23 en 24) een positief geladen aminozuur, op positie 8 een positief of een ongeladen aminozuur en op tenminste 25 een meerderheid van de posities 3, 4, 7, 10, (11, 14, 15, 17, 18, 21, 22, 25) een ongeladen aminozuur bevat.
4. Therapeutisch werkzame verbinding volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat de positief geladen aminozuren van het domein van het peptide zijn gekozen 30 uit de groep, die bestaat uit ornithine (O), lysine (K), arginine (R) en histidine (H).
5. Therapeutisch werkzame verbinding volgens conclusies 2-4, met het kenmerk, dat de ongeladen aminozuren van het domein van het peptide zijn gekozen uit de groep, 35 die bestaat uit de alifatische aminozuren glycine (G), alanine (A), valine (V), leucine (L), isoleucine (I), de 1G 0 87 4 6*1 aminozuren met een dipolaire zijketen methionine (M), asparagine (N), glutamine (Q), serine (S), threonine (T), de aminozuren met een aromatische zijketen phenylalanine (F), tyrosine (Y), tryptofaan (W).
6. Therapeutisch werkzame verbinding volgens conclusies 2-5, met het kenmerk, dat de meerderheid van de positief geladen aminozuren van het domein van het peptide het totale aantal positief geladen aminozuren minus 1 is.
7. Therapeutisch werkzame verbinding volgens conclusies 2-6, met het kenmerk, dat de meerderheid van de ongeladen aminozuren van het domein van het peptide het totale aantal ongeladen aminozuren minus 1 is.
8. Therapeutisch werkzame verbinding volgens conclu-15 sies 2-7, met het kenmerk, dat het domein het gehele peptide uitmaakt.
9. Therapeutisch werkzame verbinding volgens conclusies 2-8, met het kenmerk, dat het domein van het peptide de volgende aminozuurvolgorde heeft:
10. Therapeutisch werkzame verbinding volgens conclusies 2-8, met het kenmerk, dat het domein van het peptide de volgende aminozuurvolgorde heeft: KRLFKELLFSLRKY (peptide 4).
11. Therapeutisch werkzame verbinding volgens con clusies 2-8, met het kenmerk, dat het domein van het peptide de volgende aminozuurvolgorde heeft: KRLFKELKKSLRKY (peptide 5).
12. Therapeutisch werkzame verbinding volgens con-30 clusies 2-8, met het kenmerk, dat het domein van het peptide de volgende aminozuurvolgorde heeft: KRLFKELLKSLRKY (peptide 6).
13. Therapeutisch werkzame verbinding volgens conclusies 2-8, met het kenmerk, dat het domein van het 35 peptide de volgende aminozuurvolgorde heeft: OOLFOELOOSLOOY (peptide 7).
14. Therapeutisch werkzame verbinding volgens conclusies 2-8, met het kenmerk, dat het domein van het peptide de volgende aminozuurvolgorde heeft: OOLFOELLOSLOOY (peptide 8).
15. Therapeutisch werkzame verbinding volgens conclusies 2-8, met het kenmerk, dat het domein van het peptide de volgende aminozuurvolgorde heeft: KRLFKKLKFSLRKY (peptide 9).
16. Therapeutisch werkzame verbinding volgens 10 conclusies 2-8, met het kenmerk, dat het domein van het peptide de volgende aminozuurvolgorde heeft: KRLFKKLLFSLRKY (peptide 10).
17. Therapeutisch werkzame verbinding volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat het domein van het 15 peptide een a-helix vormt en tenminste een meerderheid van de posities l tot en met 6 (of 7 of 8 of 9 of 10 of 11 of 12) een ongeladen aminozuur bevat, en op positie 7 (of 8 of 9 of 10 of 11 of 12 of 13) tot en met 25 een positief geladen aminozuur.
18. Therapeutisch werkzame verbinding volgens con clusie 1 of 2, met het kenmerk, dat het domein van het peptide een α-helix vormt en tenminste een meerderheid van de posities 1 tot en met 6 (of 7 of 8 of 9 of 10 of 11 of 12) een positief geladen aminozuur bevat, en op 25 positie 7 (of 8 of 9 of 10 of 11 of 12 of 13) tot en met 25 een ongeladen aminozuur.
19. Therapeutisch werkzame verbinding volgens conclusie 17 of 18, met het kenmerk, dat de positief geladen aminozuren van het domein van het peptide zijn gekozen 30 uit de groep, die bestaat uit ornithine (0), lysine (K), arginine (R) en histidine (Η).
20. Therapeutisch werkzame verbinding volgens conclusie 17, 18 of 19, met het kenmerk, dat de ongeladen aminozuren van het domein van het peptide zijn gekozen 35 uit de groep, die bestaat uit de alifatische aminozuren glycine (G), alanine (A), valine (V), leucine (L), isoleucine (I), de aminozuren met een dipolaire zijketen methionine (M), asparagine (N), glutamine (Q), serine 100874 5* (S), threonine (T), de aminozuren met een aromatische zijketen phenylalanine (F), tyrosine (Y), tryptofaan (W).
20 KRLFKELKFSLRKY (peptide 3).
21. Therapeutisch werkzame verbinding volgens conclusies 17-20, met het kenmerk, dat de meerderheid van 5 de positief geladen aminozuren van het domein van het peptide het totale aantal positief geladen aminozuren minus 1 is.
22. Therapeutisch werkzame verbinding volgens conclusies 17-21, met het kenmerk, dat de meerderheid van 10 de ongeladen aminozuren van het domein van het peptide het totale aantal ongeladen aminozuren minus 1 is.
23. Therapeutisch werkzame verbinding volgens conclusies 17-22, met het kenmerk, dat het domein het gehele peptide uitmaakt.
24. Therapeutisch werkzame verbinding volgens conclusies 17 en 19-23, met het kenmerk, dat het domein van het peptide de volgende aminozuurvolgorde heeft: LLLFLLKKRKKRKY (peptide 11).
25. Therapeutisch werkzame verbinding volgens con-20 clusie 1, met het kenmerk, dat het domein van het peptide een zogeheten β-strand vormt en op tenminste een meerderheid van de posities 1, 3, 5, 7, 9 (11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 en 25) een positief geladen aminozuur bevat, en op tenminste een meerderheid van de posities 2, 4, 6, 8, 10, 25 (12, 14, 16, 18, 20, 22, 24) een ongeladen aminozuur.
26. Therapeutisch werkzame verbinding volgens conclusie 25, met het kenmerk, dat de positief geladen aminozuren van het domein van het peptide zijn gekozen uit de groep, die bestaat uit ornithine (O), lysine (K), 30 arginine (R) en histidine (H).
27. Therapeutisch werkzame verbinding volgens conclusie 25, met het kenmerk, dat de ongeladen aminozuren van het domein van het peptide zijn gekozen uit de groep, die bestaat uit de alifatische aminozuren glycine (G), 35 alanine (A), valine (V), leucine (L), isoleucine (I), de aminozuren met een dipolaire zijketen methionine (M), asparagine (N), glutamine (Q), serine (S), threonine (T), 100874 5 « de aminozuren met een aromatische zijketen phenylalanine (F), tyrosine (Y), tryptofaan (W).
28. Therapeutisch werkzame verbinding volgens conclusies 25-27, met het kenmerk, dat de meerderheid van 5 de positief geladen aminozuren van het domein van het peptide het totale aantal positief geladen aminozuren minus 1 is.
29. Therapeutisch werkzame verbinding volgens conclusies 25-28, met het kenmerk, dat de meerderheid van io de ongeladen aminozuren van het domein van het peptide het totale aantal ongeladen aminozuren minus 1 is.
30. Therapeutisch werkzame verbinding volgens conclusies 25-29, met het kenmerk, dat het domein het gehele peptide uitmaakt.
31. Therapeutisch werkzame verbinding volgens conclusies 1-30, waarbij de C-terminale carbonzuurgroep is vervangen door een amide-, ester-, keton-, aldehyde-of alcoholgroep.
32. Therapeutisch werkzame verbinding volgens 20 conclusie 1 of 2, welke verbinding bestaat uit een peptide met de aminozuurseguentie KRLFKELKFSLRKY met xanthaan-gom covalent daaraan gekoppeld.
33. Therapeutisch werkzame verbinding volgens een der conclusies 1-32 voor gebruik in de behandeling 25 van gist- en/of schimmel- en/of bacteriële infecties van mondholte, huid en vagina.
34. Gebruik van de therapeutisch werkzame verbinding volgens conclusies 1-32 voor de vervaardiging van een geneesmiddel voor de behandeling van gist- en/of 30 schimmel- en/of bacteriële infecties van mondholte, huid en vagina.
35. Gebruik van de therapeutisch werkzame verbindingen volgens conclusies 1-32 voor de vervaardiging van een geneesmiddel voor de behandeling van 35 tumoren.
36. Farmaceutische samenstelling omvattende een of meer therapeutisch werkzame verbindingen volgens conclusies 1-32 en een of meer geschikte excipientia. 1008745¾ 4
37. Farmaceutische samenstelling volgens conclusie 36 in de vorm van een spray, zalf, gel of zuigta-blet.
38. Therapeutisch werkzame verbinding volgens 5 een der conclusies 1-33, gebruik volgens conclusie 34 of 35 of farmaceutische samenstelling volgens conclusies 36 en 37, met het kenmerk, dat de gistinfecties worden veroorzaakt door Candida species, met name Candida albicans.
39. Therapeutisch werkzame verbinding volgens een der conclusies 1-33, gebruik volgens conclusie 34 of 35 of farmaceutische samenstelling volgens conclusies 36 en 37, met het kenmerk, dat de bacteriële infecties worden veroorzaakt door Staphylococcus aureus, in het 15 bijzonder methycilline resistente Staphylococcus aureus (MRSA). 100874 5*4 SAMENWERKINGSVERDRAG (PCT) RAPPORT BETREFFENDE NIEUWHEIDS0NDER20EK VAN INTERNATIONAAL TYPE IOENTIRKATIE VAN OE NATIONALE AANVRAGE KenmerK van 0· aanvrager of van de gemachtigde L PS/eki/7 Nederlandse aanvrage nr. indieongsdaum 1008745 30 maart 1998 in ge roe oen voorrangsdaum Aanvrager (Naam) STICTHTING VOORE DE TECHNISCHE WETENSCHAPPEN Oasjm van net verzoek voor een onderzoen van intemaionaai type Door oe insanse voor Intematiortaai Onderzoen (ISA) aan net verzoen voor een onderzoen van intema&onaaJ type toegenend nr. SN 31154 NL I. CLASSIFICATIE VAN HET ONDERWERP (bij toepassing van verschillen oe classificaties. aJie dassificaoesymboien opgaven) Volgens de Internationale classificatie (IPC) Int.Cl.6: A 61 K 47/48, C 07 K 14/47 II. ONDERZOCHTE GEBIEDEN VAN DE TECHNIEK _Onoerzochte minimum documentatie __ Classificatiesysteem _Classtficatiesvmoolen _1 Int.Cl.6: A 61 K, C 07 K Onaofzocfite anoere documentatie o an ca minimum documentatie voor zover dergeiijka documenten in de onderzochte gebeden zijn | opgenomen ! i i | Hl-i ’ GEEN ONDERZOEK MCGEL1JK VOOR BEPAALDE CONCLUSIES (opmerkingen oo aanvullingsolad) i _ j IV.:_; GEBREK AAN EENHEID VAN UITVINDING (opmerkingen op aanvullingsolad) "crn PCT.IS<V23'la i CS '95c
NL1008745A 1998-03-30 1998-03-30 Therapeutisch werkzame verbinding voor behandeling van gist- en/of schimmelinfecties in de mondholte. NL1008745C2 (nl)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NL1008745A NL1008745C2 (nl) 1998-03-30 1998-03-30 Therapeutisch werkzame verbinding voor behandeling van gist- en/of schimmelinfecties in de mondholte.

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NL1008745A NL1008745C2 (nl) 1998-03-30 1998-03-30 Therapeutisch werkzame verbinding voor behandeling van gist- en/of schimmelinfecties in de mondholte.
NL1008745 1998-03-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
NL1008745C2 true NL1008745C2 (nl) 1999-10-01

Family

ID=19766851

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NL1008745A NL1008745C2 (nl) 1998-03-30 1998-03-30 Therapeutisch werkzame verbinding voor behandeling van gist- en/of schimmelinfecties in de mondholte.

Country Status (1)

Country Link
NL (1) NL1008745C2 (nl)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992010998A1 (en) * 1990-12-21 1992-07-09 Felice Bombart Aqueous vaginal douche and related methods
WO1995019370A1 (en) * 1994-01-18 1995-07-20 Magainin Pharmaceuticals Inc. Ion-channel forming amphiphilic peptides having n-terminal modifications
EP0721774A2 (en) * 1994-12-12 1996-07-17 Unilever N.V. Anti-microbial compositions
WO1996040768A2 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Periodontix, Inc. Anti-fungal and anti-bacterial histatin-based peptides
US5696078A (en) * 1991-11-01 1997-12-09 The Trustees Of Boston University Methods of treating fungal infections using histatin-based peptides
WO1998005303A1 (en) * 1996-08-02 1998-02-12 Farmigea S.P.A. Bioadhesive complexes of polycarbophil and azole antifungal or antiprotozoal drugs

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992010998A1 (en) * 1990-12-21 1992-07-09 Felice Bombart Aqueous vaginal douche and related methods
US5696078A (en) * 1991-11-01 1997-12-09 The Trustees Of Boston University Methods of treating fungal infections using histatin-based peptides
WO1995019370A1 (en) * 1994-01-18 1995-07-20 Magainin Pharmaceuticals Inc. Ion-channel forming amphiphilic peptides having n-terminal modifications
EP0721774A2 (en) * 1994-12-12 1996-07-17 Unilever N.V. Anti-microbial compositions
WO1996040768A2 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Periodontix, Inc. Anti-fungal and anti-bacterial histatin-based peptides
WO1998005303A1 (en) * 1996-08-02 1998-02-12 Farmigea S.P.A. Bioadhesive complexes of polycarbophil and azole antifungal or antiprotozoal drugs

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HATTORI E.A.: "Functional improvement of alginic acid by conjugating with ß-lactoglobulin", J.FOOD.SCIENCE, vol. 61, no. 6, 1996, pages 1171 - 1176, XP002087343 *
HELMERHORST E.A.: "Synthetic histatin analogues with broad-spectrum antimicrobial activity", BIOCHEM JOURNAL, vol. 326, no. 1, 15 August 1997 (1997-08-15), pages 39 - 45, XP002087342 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2016203767B2 (en) Compositions and uses of materials with high antimicrobial activity and low toxicity
NL1008139C2 (nl) Antimicrobiële peptiden.
CN105555290B (zh) 抗微生物肽
CN114341160B (zh) 包含赖氨酸替换的romo1来源抗微生物肽及其变体
CN1925866B (zh) 细菌感染的治疗
US12441773B2 (en) Peptides, hydrogel compositions and methods of use thereof
CN102827288B (zh) 一种酸激活csp靶向抗菌肽及其制备和应用
US20230052825A1 (en) Antimicrobial and anticancer peptides &amp; conjugates and compositions, methods, articles &amp; kits relating thereto
NL1008745C2 (nl) Therapeutisch werkzame verbinding voor behandeling van gist- en/of schimmelinfecties in de mondholte.
CN106540339B (zh) 一种脂肽自组装凝胶及其制备方法和应用
US11266712B2 (en) Antimicrobial peptides and methods of using the same
EP1519951B1 (fr) Peptides lineaires cationiques ayant des proprietes antifongiques
WO2015099535A1 (en) Thrombocidin-derived antimicrobial peptides
EP3866826B1 (en) Antimicrobial peptides and methods of using the same
KR100849162B1 (ko) 세포 용혈활성이 감소된 항균 펩타이드
HK1114777B (en) Novel antimicrobial peptides
HK1114777A1 (en) Novel antimicrobial peptides

Legal Events

Date Code Title Description
PD2B A search report has been drawn up
VD1 Lapsed due to non-payment of the annual fee

Effective date: 20031001