NL1003570C2

NL1003570C2 - Methode voor antigeen- en antistofbepaling in de bloedgroepserologie.

Info

Publication number: NL1003570C2
Application number: NL1003570A
Authority: NL
Inventors: Pieter Johannes Den Boer; Ronald Victor Wilhelmus V Eijk
Original assignee: Stichting Centraal Lab
Priority date: 1996-07-11
Filing date: 1996-07-11
Publication date: 1998-01-15
Also published as: EP1021727A1; US6303390B1; AU3362097A; WO1998002752A1

Description

Titel: methode voor antigeen- en antistofbepaling in de bloedgroepserologie

Gebied van de uitvinding

De uitvinding ligt op het gebied van de bloedgroepserologie, en heeft meer in het bijzonder betrekking op een werkwijze en een testkit voor het bepalen van bloedgroep-5 antigenen of daartegen gerichte antilichamen in een monster.

Achtergrond van de uitvinding

Het doel van bloedgroepbepalingen en antistofonderzoek in klinisch werk is veelal het verkrijgen van compatibele 10 erytrocytenpreparaten voor transfusie. De uitvinding behelst de detectie en identificatie van antistoffen en antigenen en is toepasbaar voor bloedgroepbepaling, antistofscreening en -identificatie en het doen van kruisproeven. De test is niet gebaseerd op hemagglutinatie maar op het vaste-fase 15 principe, waarbij wasstappen achterwege blijven.

Bij een bloedgroep is sprake van specifieke antigene determinanten op de celmembraan. De informatie voor het tot expressie brengen van bloedgroepantigenen is op genniveau vastgelegd en overerfbaar. Bloedgroepantigenen kunnen tot 20 vorming van antistoffen aanleiding geven. Specifieke antistoffen tegen bloedgroepantigenen worden meestal gevormd na immunisatie met het corresponderende antigeen. Een uitzondering hierop wordt gevormd door de zgn. "natuurlijk voorkomende" antistoffen die zonder aanwijsbare immunisatie 25 in het serum aantoonbaar zijn (anti-A en anti-B). Aanwezigheid van antistoffen speelt een belangrijke rol bij bloedtransfusie, zwangerschap en auto-immuniteit.

Antistoffen kunnen op verschillende wijzen worden ingedeeld: 30 1. xeno-antistoffen, allo-antistoffen en auto-antistoffen; 2. regulaire- en irregulaire antistoffen; 3. natuurlijk voorkomende antistoffen; 1003570.

2 4. complete (IgM) antistoffen en incomplete (IgG) anti stoffen .

Bloedtransfusiereacties die door allo-antistoffen tegen erytrocyten worden teweeg gebracht, worden hemolytische 5 transfusiereacties genoemd omdat ze meestal gepaard gaan met een vaak zeer sterk versnelde afbraak van erytrocyten. Het is dus zaak om hemolytische transfusiereacties te voorkomen door zorgvuldig bloedgroeponderzoek.

Bloedgroepantistoffen zijn bijna altijd immunoglobuli-10 nes van het type IgG of IgM. De antigeen-antistofinteractie is onder andere afhankelijk van ionogene binding, waterstof-bruggen en hydrofobe effecten (verdringen van water). De sterkte van een binding tussen een bindingsplaats van een antistof en een epitoop wordt aangeduid met affiniteit.

15 Antistoffen die in staat zijn erytrocyten onder alle omstandigheden te agglutineren, worden agglutininen of complete antistoffen (meestal IgM) genoemd. Antistoffen die wel aan erytrocyten binden, maar geen agglutinatie geven (sensibilisatie) worden incomplete antistoffen genoemd 20 (meestal IgG).

De detectie van erytrocyt-antigenen en corresponderende antistoffen geschiedt veelal door middel van agglutinatie-reacties. Agglutinatiereacties kan men plaats laten vinden in een fysiologische zoutoplossing. Dit is in de praktijk 25 niet altijd optimaal. Een aantal tests kan gevoeliger worden gemaakt door gebruik te maken van een aantal hulpmiddelen, zoals het gebruik van medium met lage ionsterkte (low ionic medium), proteolytische enzymen (bijv. bromeline, papaine of ficine), polykationen (bijv. polybreen), makromoleculen 30 (bijv. albumine) of polymeren (bijv. polyethyleenglycol, PEG) .

Een belangrijke en veel toegepaste test is de antiglobuline- of Coombs test. De antiglobuline test berust op het principe dat erytrocyten, beladen met bijvoorbeeld 35 antistoffen van het IgG type, kunnen worden geagglutineerd door antiglobulineserum. Dit is de belangrijkste test voor het aantonen van incomplete antistoffen. De antiglobuline test is beschreven door Moreschi in 1908 (Zbl. Bakt 46: 49) 1003570.

3 en geherintroduceerd in 1945 door Coombs et al. (Lancet 2: 15, Brit. J. Exp. Path. 26: 255). De test kan onderscheiden worden in 3 fasen. De eerste fase is de sensibilisatiefase. Gedurende deze fase vindt binding van antistoffen plaats aan 5 de corresponderende antigeenstructuren op de erytrocyten (sensibilisatie van erytrocyten). Als de binding optimaal is, vindt de tweede fase, de wasfase, plaats. In deze fase worden alle niet-gebonden antistoffen uit het incubatie-mengsel verwijderd. Een onvoldoende verwijdering van niet-10 gebonden antistoffen kan leiden tot inactivatie van het antiglobuline serum, doordat deze antistoffen aan het anti-globuline binden. De derde fase is de antiglobuline fase. Hierin wordt antiglobuline aan de gewassen gesensibiliseerde cellen toegevoegd waardoor de gesensibiliseerde cellen aan 15 elkaar gekoppeld worden (agglutinatie van de erytrocyten).

Er is een grote verscheidenheid aan serologische tests. De belangrijkste technieken op dit moment zijn de buisjesmethode, de kolomtest en tests in microtiterplaten. Er kan onderscheid worden gemaakt tussen technieken die gebaseerd 20 zijn op hemagglutinatie, en technieken die gebaseerd zijn op het vaste-fase principe.

a. Tests, gebaseerd op agglutinatie:

De buisjestest is een veel gebruikte test waarbij ook langdurige incubaties met antistoffen mogelijk zijn. Men kan 25 de erytrocyten, na de reactie met antistoffen, laten sedi-menteren of ze, ter versnelling van de agglutinatiereactie, centrifugeren.

Bij uitvoering van de Coombs test moet, vóór toevoeging van het antiglobuline serum, zeer goed en veelvuldig worden 30 gewassen. De antigeen-antistofreactie wordt beoordeeld door voorzichtig tegen de buis te tikken en vervolgens de buis rond te draaien (tip and roll) zodat eventueel gevormde agglutinaten los komen van de buis. Het aflezen van de test moet direct plaats vinden door een ervaren persoon en het 35 resultaat van de test kan niet bewaard worden. Doordat het aflezen van de test handmatig gebeurt, is ook de reproduceerbaarheid niet optimaal. Het nadeel van deze methode is, dat ze moeilijk te automatiseren is.

1003570.

4

Zoals aangegeven neemt de wasstap bij de Coombs test veel tijd in beslag. Graham et al. (Transfusion 1982, 22: 408; P.L. Mollison, Blood transfusion in clinical medicine, Blackwell, Oxford, 1983, p.512) onwikkelde een nieuw 5 principe waardoor de wasstap overbodig werd. Dit principe werd door Ortho Diagnostic Systems Inc. in een testsysteem toegepast (Simwash). Volgens dit systeem worden erytrocyten van het serum gescheiden door middel van een centrifugestap. De scheiding berust op het feit dat het soortelijk gewicht 10 van serum (1,03) lager is dan die van erytrocyten (1,09).

Als nu een mengsel van cellen en serum boven op een laagje medium wordt gebracht met een dichtheid, gelegen tussen de dichtheid van de cellen en die van het serum, zullen de erytrocyten door een centrifugatiestap gescheiden worden van 15 het serum (met daarin de niet-gebonden antistoffen). Aldus worden de erytrocyten uit het oorspronkelijke incubatie-mengsel gecentrifugeerd. Een drie- of viervoudige wasstap wordt op deze manier tot een eenmalige centrifugestap gereduceerd. Daarna kunnen de gesensibiliseerde cellen met 20 antiglobulineserum worden geïncubeerd. Het systeem bleek echter niet gevoelig genoeg.

Een verdergaande vereenvoudiging van serologische tests is doorgevoerd door de erytrocyten door een kolommetje van (Sephadex) gel of glasparels te centrifugeren. Het gebruik 25 van transparante, inerte, vaste deeltjes ter onderscheiding van agglutinaten en niet-agglutinaten is reeds beschreven door Dalton et al. in 1970 (Becton, Dickinson & Co. United States Patent 3,492,396). Het systeem waarbij gelmateriaal voor de detectie van erytrocyt-antistofreacties wordt 30 gebruikt, is beschreven door LaPierre et al. (Transfusion 1990; 30: 109-113, European Patents 0 194 212 en 0 305 337). In dit systeem zijn de principes van Simwash en het gebruik van vaste inerte deeltjes voor het maken van een onderscheid tussen agglutinaten en niet-agglutinaten gecombineerd. In 35 dit testsysteem wordt gebruik gemaakt van kleine kolommetjes die met Sephadex gel gevuld zijn. Gebruik kan worden gemaakt van kolommetjes welke geen antistoffen bevatten (bijv. voor reverse ABO typering). Als tweede mogelijkheid kan een gel- 1003570.

5 kolommetje ook antistoffen bevatten welke gericht zijn tegen bepaalde erytrocytenantigenen (bijv. voor typering). Voor de antiglobulinetest wordt gebruik gemaakt van gelkolommetjes welke antiglobuline serum bevatten. Na een incubatie worden 5 de gelkolommetjes gecentrifugeerd. Bij een negatieve reactie zullen alle erytrocyten onderin de buis terechtkomen, indien de test positief is zullen de erytrocytenagglutinaten boven op of in de gel gevangen worden. Bij zwakke reacties zullen erytrocyten ten dele sedimenteren. Een groot voordeel van 10 deze test is dat in geval van de antiglobulinetest geen wasstappen noodzakelijk meer zijn. Tijdens de centrifugatie vindt namelijk scheiding van erytrocyten en serum- of plasmacomponenten plaats. Een tweede voordeel is het feit de resultaten van de test goed vastgelegd kunnen worden. De 15 beschreven test wordt door DiaMed AG (DiaMed-ID Microtyping System) en Diagast Laboratoires (Chromatest) toegepast. Een vergelijkbaar systeem, Ortho Biovue System (Ortho Diagnostic Systems), maakt gebruik van glasparels in plaats van gel-materiaal als inert materiaal om gevormde agglutinaten op te 20 vangen. Nadeel van deze tests is dat een speciale centrifuge vereist is voor het correct uitvoeren van de test. Voor het automatisch aflezen is eveneens speciale afleesapparatuur noodzakelijk.

b. Tests, gebaseerd op het vaste-fase principe: 25 Een andere benadering is het gebruik van het vaste-fase principe als alternatief voor directe en indirecte aggluti-natiereacties voor bloedgroepbepaling, antistofscreening, antistofidentificatie en kruisproeven. Toepassing en voordelen van het gebruik van vaste-fase technieken op genoemde 30 gebieden zijn beschreven door Rosenfield (Abstracts, 15th Cong. Int. Soc. Blood Trans., Paris pp. 27-33, 1976, ÜS Patent 4,275,053, 1981). Hierbij werden onder andere erytrocyten gebruikt die aan het oppervlak van kunststof buizen waren gekoppeld. Meer recent zijn systemen beschreven 35 door Plapp et al. (Am. J. of Clin. Path. 82: 719-721, 1984), Bayer et al. (US Patent 4,608,246, 1986), Rachel et al. (Transfusion 25: 24-26, 1985), Plapp et al. (The Lancet 1003570.

6 1465-1466, 1986) en Uthemann et al. (US Patent 4,925,786, EP 363 510 en Transfusion 30: 114-116, 1990).

Microtiterplaten in combinatie met het vaste-fase principe worden toegepast door onder andere Biotest AG 5 (Solidscreen II voor antistofdiagnostiek), Immucor Ine.

(Immunocapture Capture-R systemen voor antistofscreening en -identificatie) en CLB (Microtype voor het typeren van erytrocytenantigenen). Het Capture-R systeem maakt gebruik van een vaste-fase waaraan membranen van erytrocyten zijn 10 gebonden. Gedurende de incubatie met serum of plasma van donors of patiënten kunnen erytrocyt-specifieke antistoffen aan deze membranen binden. Na de wasfase, waarbij de niet-gebonden antistoffen worden verwijderd, worden indicator-erytrocyten toegevoegd. Indicatorerytrocyten zijn gesensibi-15 liseerde erytrocyten waaraan anti-humaan immunoglobuline is gebonden. In plaats hiervan kunnen ook synthetische deeltjes (bolletjes) gebruikt worden waaraan anti-humaan immunoglobuline is gebonden. Indien in het plasma of serum antistoffen aanwezig waren, zal brugvorming optreden tussen de aan de 20 vaste-fase gebonden antistof en de indicatorerytrocyten. Dit principe is eveneens beschreven door Bayer et al. (US Patent 4,608,246) voor antistofscreening en -identificatie. Naast dit systeem beschrijven Bayer et al. tevens de uitvoering van een kruisproef. Hierbij wordt gebruik gemaakt van aan de 25 vaste-fase gekoppeld anti-IgG. Beide onbekende bloedcompo-nenten (plasma en erytrocyten) worden samen gevoegd in de well zodat sensibilisatie van de erytrocyten plaats kan vinden. Echter, in deze opzet zal inactivatie van het aan de vaste-fase gebonden anti-IgG optreden en zullen gesensibili-30 seerde cellen niet meer aan de vaste-fase kunnen binden, tenzij na de sensibilisatiefase eerst een wasfase wordt uitgevoerd. Recent is door Llopis et al. een variant op de vaste-fase test beschreven met als doel het screenen en identificeren van antistoffen (Vox Sanguinis 1996; 70: 152-35 156). Bij deze methode wordt een monolayer van testerytro- cyten (erytrocyten met een bekende antigeensamenstelling) gemaakt in een U-bodem well van een microtiterplaat, waarna incubatie plaats vindt met serum waarin zich antistoffen 1 00 3 5 7 0 .

7 bevinden. Dit wordt gevolgd door een vijftal, handmatige, wasstappen. De detectie vindt plaats door toevoegen van polyspecifiek anti-humaan globuline (IgG + C3d) en indicatorerytrocyten (dit zijn in dit geval erytrocyten 5 welke gesensibiliseerd zijn met anti-D antistoffen). Tot slot vindt weer een centrifugatiestap plaats. Nadelen van deze test zijn onder andere de beperkte houdbaarheid van de monolayer van testerytrocyten en het meerdere malen handmatig wassen van de monolayer na incubatie met antistoffen. 10 Solidscreen van Biotest AG (antistofscreening en -identificatie) en Microtype van CLB (antigeentypering) maken gebruik van een vaste-fase waaraan (onder meer) humaan IgG gebonden is. In de wells vindt de incubatie van erytrocyten en plasma, serum of antistofbevattend reagens plaats. 15 Indien corresponderende antistoffen aanwezig zijn, vindt sensibilisatie van erytrocyten plaats. De gesensibiliseerde cellen worden vervolgens gewassen om niet-gebonden antistoffen te verwijderen. Detectie vindt plaats door toevoegen van anti-humaan globuline serum en een centrifugatiestap 20 waardoor de gesensibiliseerde cellen via het anti-globuline aan het IgG aan de vaste-fase worden gebonden. Bij deze systemen worden positieve reacties gekenmerkt door een monolayer van erytrocyten op de vaste-fase. Bij negatieve uitslagen wordt geen monolayer gevormd, maar vormen de 25 cellen een zgn. "button" in de U-bodem microtiterplaat well.

Een nadeel van de bekende vaste-fase microtiterplaat-tests is dat veelvuldig gewassen moet worden om de niet-gebonden antistoffen te verwijderen. Dit wassen geschiedt veelal handmatig, waarbij de mogelijkheid blijft bestaan dat 30 patiëntenserum of -plasma (potentieel infectieus materiaal) verspreid wordt tijdens de wasstappen. Een cyclus uit de wasfase omvat achtereenvolgens: centrifugatie, verwijdering supernatant, toevoegen medium en resupenderen van de erytrocyten. Deze tijdrovende cyclus moet een aantal malen 35 herhaald worden teneinde alle niet-gebonden antistoffen te verwijderen. Automatisering van deze wasprocedure is mogelijk. Hierbij vindt één centrifugatiestap plaats waarna bovenstaande medium voorzichtig verwijderd wordt, vervolgens 1003570.

8 wordt op het pellet van erytrocyten een hoeveelheid medium gebracht zodanig dat er geen resuspensie van de erytrocyten plaats mag vinden. Deze stap moet ca. zesmaal herhaald worden. Normale microtiterplaat wasapparaten (zoals ELISA 5 washers) zijn niet geschikt voor deze wasstap. Hiervoor is een speciaal wasapparaat nodig. Na de wasfase wordt alle wasvloeistof verwijderd en wordt antiglobulineserum toegevoegd. Vervolgens worden de erytrocyten geresuspendeerd en wordt de microtiterplaat gecentrifugeerd. De gesensibili-10 seerde erytrocyten zullen dmv het antiglobuline aan het IgG van de vaste-fase worden gebonden. Niet-gesensibiliseerde erytrocyten zullen niet aan de vaste-fase kunnen binden en zullen als button in de U-bodem well worden terug gevonden. Het spreekt voor zich dat het niet volledig wegwassen van 15 antistoffen leidt tot inactivatie van het antiglobuline, waardoor gesensibiliseerde erytrocyten niet meer via het antiglobuline aan de vaste-fase kunnen binden, en zal resulteren in een zgn. vals-negatieve reactie. Het voordeel is dat automatische verwerking van resultaten mogelijk is.

20 Een belangrijk punt hierbij is dat bij de wasfase geen of slechts gering celverlies mag optreden, daar dit problemen op kan leveren bij het (automatisch) aflezen van de test.

De vaste-fase tests zijn niet tot microtiterplaten beperkt. Pernell (Sanofi Pasteur, EP 0 594 506) beschrijft 25 een affiniteitsgeltest waarbij op de gel een immuno- globulinebindende substantie (zoals proteïne A, proteïne G of anti-humaan globuline) is geïmmobiliseerd. Incubatie van erytrocyten en antistoffen vindt plaats boven de gel. Na deze incubatiefase vindt centrifugatie van de gelkolom 30 plaats. Indien aan de erytrocyten antistoffen gebonden zijn, zullen deze gesensibiliseerde erytrocyten aan het immuno-globulinebindende gelmateriaal binden en zullen dus aan het bovenste gedeelte van de gelkolom binden. Cellen waaraan geen antistoffen gebonden zijn, zullen niet gebonden worden 35 en op de bodem van het kolommetje terecht komen. Dit principe van binding van gesensibiliseerde cellen aan een vaste-fase is reeds beschreven door Pharmacia (Cell Affinity Chromatography; Uppsala, Zweden; 1984). Pharmacia beschrijft 1 00 3 5 7 0 .

9 hierin de zuivering van erytrocyten op grond van de aan- dan wel afwezigheid van bepaalde bloedgroepantigenen met behulp van proteïne A-sepharose 6MB. Erytrocyten met het A antigeen op het oppervlak (bloedgroep A erytrocyten) waaraan anti-A 5 antistoffen gebonden zijn, kunnen door binding aan genoemd gelmateriaal (via proteine A) gescheiden worden van erytrocyten welke het A-antigeen niet bezitten. De door Sanofi Pasteur beschreven test is derhalve een combinatie van dit principe en de centrifugestap voor scheiding van al dan 10 niet-gesensibiliseerde erytrocyten en niet-gebonden antistoffen zoals toegepast in Simwash (Ortho) en verschillende kolomsystemen (Diagast, DiaMed en Ortho). Een nadeel van de test zoals beschreven door Sanofi Pasteur, waarbij de beschreven liganden proteine G of een antiglobuline zijn, is 15 dat er geen complementfactoren gebonden worden. Proteine G bindt namelijk alleen IgG antistoffen. In de serologie zijn echter ook erytrocyten, welke met complementfactoren beladen zijn, van belang (bijvoorbeeld bij aantonen van complement-bindende antistoffen zoals anti-Jk antistoffen). Bij de gel-20 test van Sanofi Pasteur zal dus, indien deze antistoffen met hoge gevoeligheid aangetoond moeten worden, ook anti-complement op het gelmateriaal moeten worden geïmmobiliseerd. Het nadeel van gebruik van proteïne A als immunoglobuline-bindend materiaal is dat antistoffen van het type IgG3 niet 25 aangetoond kunnen worden (proteïne A bindt namelijk alleen de IgG subklassen IgGl, IgG2 en IgG4). Deze kunnen echter wel klinisch relevant zijn.

Een andere variant van een vaste-fase test is onlangs beschreven door Den Boer et al. (WO 95/30904). In deze test, 30 welke onder andere geschikt is voor antistofscreening en antistofidentificatie, is de vaste-fase een poreuze membraan waaraan een immunoglobuline-bindende substantie is geïmmobiliseerd. Deze membraan, welke poriën bevat welke voldoend groot zijn om erytrocyten door te laten, is in een buisje of 35 cupje (van bijvoorbeeld een microtiterplaat) geplaatst. De membraan bevindt zich in een medium met hoge dichtheid. Incubatie van bijvoorbeeld erytrocyten en een antistof-bevattend monster vindt boven dit medium plaats, zodanig dat 1 00 3 5 7 0 .

10 er geen contact plaats kan vinden tussen het antistof-bevattende incubatiemengsel en de vaste-fase. Na genoemde incubatiefase vindt een centrifugatiestap plaats. Het antistof-bevattende monster blijft boven het medium staan, 5 erytrocyten zullen naar beneden gecentrifugeerd worden. Zodoende wordt een scheiding van erytrocyten en niet-gebonden antistoffen bereikt. De erytrocyten zullen door de centrifugatiestap naar de vaste-fase bewegen, de gesensibiliseerde erytrocyten zullen hieraan binden terwijl niet-10 gesensibiliseerde door de vaste-fase heen zullen gaan.

Nadeel van deze test is dat op twee verschillende niveaus afgelezen moet worden. De niet-gesensibiliseerde cellen bevinden zich namelijk op de bodem van het testsysteem, de gesensibiliseerde cellen bevinden zich op de vaste-fase 15 welke zich op enige afstand boven de bodem van het testsysteem bevindt.

Korte samenvatting van de uitvinding

De onderhavige uitvinding verschaft een werkwijze voor 20 het bepalen in een monster van een analyt, gekozen uit een op erytrocyten aanwezig bloedgroepantigeen of een aan een dergelijk bloedgroepantigeen bindend antilichaam, omvattende behandeling van het monster in een incubatiezone van een reactievat met een reagens dat een analyt-bindingspartner 25 bevat, welke analyt-bindingspartner, in het geval dat de analyt een op erytrocyten aanwezig bloedgroepantigeen is, een antilichaam is dat aan het bloedgroepantigeen kan binden, en in het geval dat de analyt een aan een bloedgroepantigeen bindend antilichaam is, het op erytrocyten 30 aanwezige bloedgroepantigeen is, waarbij in de incubatiezone een complex van op erytrocyten aanwezig bloedgroepantigeen en daaraan gebonden antilichaam ontstaat indien het monster de analyt bevat, verder omvattende scheiding van erytrocyten, gecomplexeerd of niet, van niet-gebonden antilichamen 35 met behulp van een in het reactievat beneden de incubatiezone gelegen separatiemedium met een dichtheid, hoger dan die van de vloeistof die de antistoffen bevat maar lager dan de dichtheid van erytrocyten, waarbij erytrocyten door het 1003570.

11 separatiemediura passeren en niet-gebonden antilichamen in de incubatiezone blijven, scheiding van gecomplexeerde erytro-cyten van niet-gecomplexeerde erytrocyten door gecomplexeerde erytrocyten in een immobilisatiezone van het 5 reactievat te binden aan een in deze zone geïmmobiliseerde immunoglobuline-bindende substantie en niet-gecomplexeerde erytrocyten af te voeren naar een collectiezone van het reactievat, en detectie van erytrocyten in de immobilisatiezone en/of collectiezone.

10 Tevens verschaft de onderhavige uitvinding een testkit, geschikt voor gebruik in een werkwijze voor het bepalen van een analyt in een monster, waarbij de analyt een op erytrocyten aanwezig bloedgroepantigeen of een aan een dergelijk bloedgroepantigeen bindend antilichaam is, omvattend: 15 (i) een reagens dat een analyt-bindingspartner bevat die, in het geval dat de analyt een op erytrocyten aanwezig bloedgroepantigeen is, een antilichaam is dat aan het bloedgroepantigeen kan binden, en in het geval dat de analyt een aan een bloedgroepantigeen bindend antilichaam is, het 20 op erytrocyten aanwezige bloedgroepantigeen is, (ii) een reactievat, omvattende een incubatiezone, een immobilisatiezone en een collectiezone, waarbij in de immobilisatiezone een immunoglobulinebindende substantie is geïmmobiliseerd, en 25 (iü) een separatiemedium met een dichtheid, lager dan de dichtheid van erytrocyten maar hoger dan de dichtheid van een antilichamen bevattende vloeistof.

Beknopte figuurbeschriiving 30 Figuur 1: deze figuur toont als reactievat een U-bodem well van een microtiterplaat. Als immunoglobuline-bindende immobilisatiezone fungeert de bodem (1), in het bijzonder de hoger gelegen gedeelten daarvan, terwijl het dieper gelegen centrum van de bodem als de collectiezone (2) dienst doet.

35 Boven de immobilisatiezone bevindt zich, in de hier getoonde uitvoeringsvorm, een bolvormig scheidingsvlak (4) met aan de omtrek uitsparingen of doorlaatopeningen (5). In het gebied tussen de immobilisatiezone en dit scheidingsvlak bevindt 1 00 3 5 7 0 .

12 zich een als separatiemedium fungerend medium (3) met hoge dichtheid. Incubatie van erytrocyten en antistoffen vindt plaats boven genoemd scheidingsvlak: de incubatiezone (6).

De aanwezigheid van het scheidingsvlak maakt het gemakkelijk 5 erytrocyten en antistofbevattend monster, of omgekeerd, antistof en erytrocytenbevattend monster, te mengen en te incuberen. Na de incubatieperiode vindt een centrifugatie-stap plaats, zodanig dat erytrocyten zich naar de zijkant van het scheidingsvlak en door de uitsparingen begeven.

10 Niet-gesensibiliseerde erytrocyten zullen zich vervolgens langs de wand van de immobilisatiezone naar het verdiepte gedeelte van het reactievat, dat als collectiezone fungeert, bewegen. Een negatieve reactie wordt zichtbaar door een ophoping van cellen in het centrum van het reactievat.

15 Gesensibiliseerde erytrocyten zullen zich aan de wand in de immobilisatiezone binden. Een positieve reactie wordt zichtbaar door binding van erytrocyten in de immobilisatiezone van het reactievat.

Figuur 2: Hier is gebruik gemaakt van een reactievat 20 met een bodem waarvan het centrum hoger ligt dan de omtrek of periferie. De immunoglobulinebindende immobilisatiezone (1) ligt centraal. Het verdiepte gedeelte van de bodem, dat als collectiezone (2) dienst doet, is in dit geval aan de rand gelegen. In de getoonde uitvoeringsvorm is een hol 25 scheidingsvlak (4) toegepast. Centraal in dit scheidingsvlak is een uitsparing of doorlaatopening (5) aangebracht. Na mengen en incuberen van erytrocyten en antistoffen zullen de erytrocyten door centrifugatie naar het midden van dit vlak worden getransporteerd, door de uitsparing de incubatiezone 30 (6) verlaten en het separatiemedium van hoge dichtheid (3) passeren, waarna de immobilisatiezone bereikt wordt. In geval van een negatieve reactie (niet-gesensibiliseerde erytrocyten) zullen de cellen in het verdiepte gedeelte van het reactievat terecht komen, wat zichtbaar wordt door een 35 ring van cellen, rondom de immobilisatiezone. Een positieve reactie wordt wederom zichtbaar door binding van erytrocyten aan de wand van de immobilisatiezone, dus met name in het centrale gedeelte van de bodem.

1003570.

13

Gedetailleerde beschrijving van de uitvinding

De uitvinding betreft een methode voor het aantonen van antistoffen en antigenen waarvan de toepassing voornamelijk ligt op het gebied van de bloedgroepserologie: bepaling van 5 bloedgroepen, antistofscreening en -identificatie en kruisproeven .

Bij de uitvinding wordt een vaste-fase gebruikt waarop immunoglobuline-bindende substanties zijn geïmmobiliseerd. Als zodanig fungeert een gedeelte van het oppervlak van een 10 reactievat waarin de test wordt uitgevoerd. Het immunoglobuline-bindende gedeelte van het (binnen)oppervlak van het reactievat wordt hierin als de 'immobilisatiezone1 aangeduid. Bij voorkeur wordt gebruik gemaakt van zogenaamde U-bodem wells van microtiterplaten of strips daarvan. De 15 immunoglobuline-bindende substantie kan aan de gehele bodem van het reactievat zijn geïmmobiliseerd, maar hoeft niet in het diepste gedeelte van de bodem aanwezig te zijn, omdat dit gedeelte als de 'collectiezone' voor niet-gecomplexeerde erytrocyten fungeert. De immunoglobuline-bindende substantie 20 kan ook in een gebied boven de bodem van het reactievat aan de binnenwand van het reactievat zijn geïmmobiliseerd.

Volgens de uitvinding kunnen gesensibiliseerde erytrocyten direct aan de vaste-fase (de immobilisatiezone) worden gebonden zonder gebruik te maken van een extra wasstap of 25 cyclus van wasstappen. Boven de immunoglobuline-bindende vaste-fase bevindt zich een hier als het 'separatiemedium' aangeduid vloeistofmedium met een dichtheid gelegen tussen de dichtheid van erytrocyten en de dichtheid van de antistofbevattende vloeistof in. Deze laag is van belang 30 voor de vinding omdat de aanwezigheid van deze laag er voor zorgt dat er geen aparte wasfase nodig is om niet-gebonden antistoffen te scheiden van de al dan niet gesensibiliseerde erytrocyten. Boven deze laag van separatiemedium vindt de incubatie van erytrocyten en antistoffen plaats. Het boven 35 het separatiemedium gelegen gebied wordt hierin als de 'incubatiezone' aangeduid.

Na de incubatiefase vindt een centrifugatiefase plaats, zodanig dat de erytrocyten door het separatiemedium van hoge 1003570.

14 dichtheid gecentrifugeerd worden. De antistofbevattende vloeistof blijft boven dit hoge-dichtheidsmedium staan. Op deze wijze worden de erytrocyten dus gescheiden van niet-gebonden antistoffen, afkomstig uit bijvoorbeeld het serum 5 of plasma. Een cyclus van wasstappen is hiermee dus overbodig geworden en verlies van erytrocyten is onmogelijk.

Mede door de afwezigheid van een afzonderlijke wasprocedure kost de test aanzienlijk minder tijd. De uitvinding betekent een verbetering van het huidige microtiterplaat vaste-fase 10 principe.

De uitvinding verschaft derhalve een werkwijze voor het bepalen in een monster van een analyt, gekozen uit een op erytrocyten aanwezig bloedgroepantigeen of een aan een dergelijk bloedgroepantigeen bindend antilichaam, omvattende 15 behandeling van het monster in een incubatiezone van een reactievat met een reagens dat een analyt-bindingspartner bevat, welke analyt-bindingspartner, in het geval dat de analyt een op erytrocyten aanwezig bloedgroepantigeen is, een antilichaam is dat aan het bloedgroepantigeen kan 20 binden, en in het geval dat de analyt een aan een bloedgroepantigeen bindend antilichaam is, het op erytrocyten aanwezige bloedgroepantigeen is, waarbij in de incubatiezone een complex van op erytrocyten aanwezig bloedgroepantigeen en daaraan gebonden antilichaam ontstaat indien het monster 25 de analyt bevat, verder omvattende scheiding van erytrocyten, gecomplexeerd of niet, van niet-gebonden antilichamen met behulp van een in het reactievat beneden de incubatiezone gelegen separatiemedium met een dichtheid, hoger dan die van de vloeistof die de antistoffen bevat maar lager dan 30 de dichtheid van erytrocyten, waarbij erytrocyten door het separatiemedium passeren en niet-gebonden antilichamen in de incubatiezone blijven, scheiding van gecomplexeerde erytrocyten van niet-gecomplexeerde erytrocyten door gecomplexeerde erytrocyten in een immobilisatiezone van het 35 reactievat te binden aan een in deze zone geïmmobiliseerde immunoglobuline-bindende substantie en niet-gecomplexeerde erytrocyten af te voeren naar een collectiezone van het 1003570.

15 reactievat, en detectie van erytrocyten in de immobilisatie-zone en/of collectiezone.

De uitvinding verschaft voorts een testkit, geschikt voor gebruik in een werkwijze voor het bepalen van een 5 analyt in een monster, waarbij de analyt een op erytrocyten aanwezig bloedgroepantigeen of een aan een dergelijk bloed-groepantigeen bindend antilichaam is, omvattend: (i) een reagens dat een analyt-bindingspartner bevat die, in het geval dat de analyt een op erytrocyten aanwezig 10 bloedgroepantigeen is, een antilichaam is dat aan het bloedgroepantigeen kan binden, en in het geval dat de analyt een aan een bloedgroepantigeen bindend antilichaam is, het op erytrocyten aanwezige bloedgroepantigeen is, (ii) een reactievat, omvattende een incubatiezone, een 15 immobilisatiezone en een collectiezone, waarbij in de immobilisatiezone een immunoglobulinebindende substantie is geïmmobiliseerd, en (iii) een separatiemedium met een dichtheid, lager dan de dichtheid van erytrocyten maar hoger dan de dichtheid van 20 een antilichamen bevattende vloeistof.

De hier beschreven uitvinding heeft ten opzichte van bestaande technieken de volgende voordelen: 1) de gevoeligheid van de test is hoog door het gebruik van immunoglobuline-bindende substanties met hoge affiniteit 25 gecombineerd met de vaste-fase techniek.

2) er is geen wasstap noodzakelijk voor de verwijdering van niet-gebonden immunoglobulines waardoor geen celverlies op kan treden.

3) de test neemt weinig tijd in beslag.

30 4) er is geen apart indicator-erytrocyten systeem nodig voor de detectie van opgetreden antistof-antigeenreacties.

5) de bepaling kan op bestaande apparatuur worden uitgevoerd.

6) de aflezing en interpretatie van de test kunnen 35 eenvoudig visueel worden uitgevoerd, maar kunnen ook gemakkelijk worden geautomatiseerd, mede omdat aflezing op één niveau plaats vindt.

7) het is een gebruiksvriendelijk, uniform systeem.

1003570.

16 8) naast iinmunoglobuline-bindende substanties kunnen ook anti-complement antistoffen worden toegepast. Bepaalde bloedgroepantistoffen veroorzaken namelijk de aanwezigheid van complementfactoren op de membraan van erytrocyten. Anti-5 complement antistoffen kunnen aan deze op de erytrocyten aanwezige complementfactoren (een bepaald type serum-eiwitten) binden. Daarom zou zich in de immobilisatiezone een immunoglobulinebindende substantie kunnen bevinden in combinatie met een of meerdere anti-complement antistoffen.

10 De beschreven uitvinding kan toegepast worden op de gangbare testen binnen de bloedgroepserologie, waaronder screentesten naar antistoffen, identificatie van antistoffen, kruisproeven, antigeenbepaling, bloedgroepbepaling en antistoftitratie. De uitvinding kan bijvoorbeeld worden 15 toegepast voor het bepalen van de volgende bloedgroep- antigenen en antistoffen tegen die antigenen: ABO, Kell (K), cellano (k), Duffy (Fya en Fy*3), Kidd (Jka en Jk*3), Lutheran (Lua en Lu*3) , het Rhesus systeem (D, E, e, C, c), MNS, Lewis (Lea en Le*3) , enz.

20 Bij wijze van voorbeeld kan de uitvinding voor de volgende bepalingen worden toegepast: - Tests waarbij gebruik wordt gemaakt van een antiserum van bekende specificiteit en erytrocyten met onbekende anti-geensamenstelling (bloedgroepbepaling, antigeenbepaling).

25 - Tests waarbij gebruik wordt gemaakt van sera met daarin (een) onbekende antistof(fen) en erytrocyten met een bekende antigeensamenstelling (antistofscreening, antistof-identificatie). Hierbij wordt veelal gebruik gemaakt van een panel van erytrocyten met bekende antigeensamenstelling.

30 Daarnaast kan de test ook gebruikt worden voor de detectie van auto-antistoffen. Aan de erytrocyten zijn in dit geval reeds antistoffen aan de corresponderende antigenen gebonden. De erytrocyten zijn dus al gesensibiliseerd en kunnen direkt aan de vaste-fase binden.

35 - Tests, uitgevoerd volgens de onderhavige uitvinding, berusten alle op hetzelfde principe: erytrocyten waaraan antistoffen zijn gebonden (gesensibiliseerde erytrocyten) 1003570.

17 kunnen aan de vaste-fase binden in tegenstelling tot niet-gesensibiliseerde erytrocyten.

Het monster zal veelal bestaan uit bloed of een daarvan afgeleid materiaal zoals bloedplasma, bloedserum of een 5 bloedfractie, bijv. uit bloed geïsoleerde erytrocyten. Aangezien de uitvinding echter ook voor andere doelen gebruikt kan worden, zoals het selecteren van hybridoma's die monoklonale antilichamen produceren welke aan een bloed-groepantigeen binden, kan het monster ook uit anderssoortige 10 materialen bestaan, bijv. uit een supernatant van een hybridoma.

Essentieel is dat er tijdens de incubatie van antistoffen met erytrocyten en de centrifugatiestap geen contact mag optreden van dit incubatiemengsel met de vaste-fase, 15 daarom is op de vaste-fase een medium met hoge dichtheid gebracht. Scheiding tussen dit medium en het incubatiemengsel kan voor praktische doeleinden gerealiseerd worden door het toepassen van bijvoorbeeld een poreuze membraan, maar ook door middel van een scheidingsvlak, voorzien van 20 uitsparingen. Daarnaast is ook de keuze van immunoglobuline-bindende substanties en de keuze van het materiaal om de dichtheid van het medium te verhogen van belang. Genoemde punten zullen hier kort worden toegelicht.

a. Immunoglobuline-bindende substanties.

25 De keuze uit immunoglobuline-bindende substanties welke aan de vaste-fase geïmmobiliseerd kunnen worden, is groot. Bruikbaar zijn bijvoorbeeld poly- of monoklonale antistoffen die gericht zijn tegen immunoglobuline G (IgG), immunoglobu-line A (IgA) en/of immunoglobuline M (IgM). Teneinde de 30 gevoeligheid te verhogen, dan wel een zo groot mogelijk scala van antistoffen te detecteren, kan ook een combinatie van meerdere immunoglobuline-bindende substanties op de vaste-fase worden geïmmobiliseerd. Tevens kunnen antistoffen tegen het complementsysteem worden toegepast.

35 Ook kunnen immunoglobuline-bindende substanties van een andere oorsprong toegepast worden, bijv. uit bacteriën. Immunoglobulinebindende bacteriële eiwitten worden onder andere in de immunologie, biochemie en biotechnologie 1003570.

18 gebruikt. Een aantal immunoglobuline-bindende eiwitten zijn geïsoleerd en gekarakteriseerd.

De belangrijkste zijn proteïne A (Forsgren et al. J. Immunol. 1966; 97: 822) en proteine G (Björck et al. J.

5 Immunol. 1984,-133: 969; Reis et al. J. Immunol. 132: 3091). Recent zijn een tweetal andere bacteriële eiwitten die immunoglobulinen kunnen binden beschreven, te weten proteine L voor binding aan de lichte keten van IgG, IgA en IgM (Infect. Immun. 58: 1217-1222; 1990, J. Immunol. Methods 10 164: 33-40, 1993 en J. Biol. Chem. 264: 19740-19746; 1989)

en proteine H met een hoge affiniteit voor de zware keten en Fc fragmenten van immunoglobulinen (Akesson et al. Mol. Immunol. 27: 523-531; 1990). Toepassing van deze eiwitten en hiervan afgeleide recombinant produkten zoals proteine A/G 15 (ImmunoPure Immobilized Protein A/G, Pierce) en L/G

(Kihlberg et al. J. Biol Chem. 267: 25583; 1992) en het gebruik van genetisch gewijzigde bactriofagen (A.S. Kang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4363-4366) in de immuno-hematologie en in het bijzonder voor antistof- en antigeen 20 bepalingen in de bloedgroepserologie zijn verder beschreven in WO 95/30904.

Voor de tests waarbij IgG antistoffen betrokken zijn (antistofidentificatie, antistofscreening en kruisproeven) kan gebruik worden gemaakt van een vaste-fase met een IgG-25 bindende substantie met een hoge affiniteit waardoor een optimale binding van gesensibiliseerde cellen aan een vaste-fase is gewaarborgd. Als immunoglobulinebindende substantie kan naast anti-humaan immunogloguline weer proteine-G worden gebruikt. Een vaste-fase waarop immunoglobuline-bindende 30 substanties geïmmobiliseerd zijn die zowel IgA, IgG en IgM binden, is het meest ideaal aangezien dan het grootste scala van antistofspecificiteiten kan worden aangetoond. De immunoglobulinebindende substantie kan zowel door middel van absorptie als door middel van covalente binding aan de 35 vaste-fase woden geïmmobiliseerd. De immunoglobulinebindende vaste-fase kan mbv vriesbeschermende stoffen gevriesdroogd en gestabiliseerd worden en vervolgens droog bewaard worden.

1003570.

19 b. Substanties ter verhoging van de dichtheid van het medium kunnen vele soorten stoffen zijn, waaronder bijv. albumine, dextraan, Ficoll, iodixanol, natrium diatrizoaat, Percoll etc.

5 Voor de uitvoering van de test gaat de voorkeur uit naar een testsysteem op microtiterplaat formaat (met de mogelijkheid om enkelvoudige en meervoudige tests te doen) waarbij de bodem van de test-wells een zgn. U-vorm heeft. Op deze U-vormige bodem is het immunoglobulinebindend complex 10 of een immunoglobulinebindende substantie geïmmobiliseerd. Dit kan bestaan uit bijvoorbeeld 1) mono of polyspecifiek anti-IgG (van het IgG- dan wel het IgM type), 2) humaan immunoglobuline G (IgG) met daaraan gekoppeld anti-humaan IgG ter verkrijgen van een langere arm om gesensibiliseerde 15 erytrocyten beter te binden of 3) bacteriële eiwitten, zoals proteine G.

Op deze vaste-fase bevindt zich een laagje scheidings-medium met een dichtheid, hoger dan die van de antistof-bevattende vloeistof maar lager dan die van erytrocyten.

20 Deze laag is van belang voor de vinding daar de aanwezigheid van deze laag er voor zorgt dat er geen aparte wasfase noodzakelijk is om niet-gebonden antistoffen te scheiden van de (gesensibiliseerde) erytrocyten. De incubatie van erytrocyten en antistoffen kan op verschillende wijzen plaats 25 vinden bijvoorbeeld direct op het scheidingsmedium met hoge dichtheid, of in een compartiment aan de onderzijde voorzien van een membraan (van bijv. polycarbonaat of polyethyleen-tereftalaat) of op een bol (Fig. 1) of hol (Fig. 2) scheidingsvlak aan de zijkanten resp. in het midden voorzien 30 van (een) uitsparing(en). Na de incubatiefase waarin cellen en antistoffen kunnen binden, worden de al dan niet gesensibiliseerde erytrocyten door middel van centrifugatie (via bijv. de uitsparingen) door genoemd scheidingsmedium gescheiden van niet-gebonden antistoffen en naar de vaste-35 fase getransporteerd waarna de gesensibiliseerde cellen aan de vaste-fase zullen hechten, terwijl de niet-gesensibili-seerde cellen naar het verdiepte gedeelte van de vaste-fase worden getransporteerd. Detectie van de gebonden cellen op 1 00 3 5 7 ö .

20 de vaste-fase kan eenvoudig visueel of ook automatisch geschieden.

Voorbeelden 5 De uitvinding zal nu aan de hand van de volgende voorbeelden verder worden toegelicht. Het is echter van belang in te zien dat deze voorbeelden voor illustratieve doeleinden gegeven worden en de nawerkbaarheid van de uitvinding belichten, maar geenszins de definitieve 10 condities van de verschillende bepalingsmethoden inhouden.

Voorbeeld 1

Als vaste-fase werden U-bodem microtiterplaatstrips (Maxisorp, NUNC, Denemarken) gebruikt, waarop humaan intra-15 musculair IgG (CLB, Amsterdam, Nederland) gecoat werd (5 μg/ml IgG in 100 mM natriumcarbonaat buffer, pH 9.0, gedurende 16 uur bij kamertemperatuur). Na coaten werd 5x gewassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7.4) en geblocked met een albumine-oplossing (1% bovine serum 20 albumine in PBS) ter voorkoming van aspecifieke binding. Vervolgens werd 50 μΐ anti-humaan IgG (monospecifiek anti-humaan IgG serum, CLB, Amsterdam, Nederland) gekoppeld. Na 4 uur incubatie werd 4x gewassen met PBS. Op de zo verkregen vaste-fase werd 150 μΐ hogedichtheidsmedium (15% iodixanol 25 in bewaarvloeistof voor erytrocyten (CLB, Amsterdam, Nederland)) gebracht.

Op deze laag medium werden 50 μΐ 1.5% Coombs Controle Cellen (CCC; CLB, Amsterdam, Nederland) gebracht in aanwezigheid van 50 μΐ AB serum of 50 μΐ PBS. De CCC zijn 30 erytrocyten met bloedgroep 0+ (d.i. bloedgroep 0, rhesus D positief) welke met anti-D antistoffen gesensibiliseerd zijn. Als controle werden 0+ cellen gebruikt welke niet met antistoffen zijn beladen. Vervolgens werd 5 min bij 40 g gecentrifugeerd, gevolgd door 5 min bij 200 g. In Tabel 1 35 zijn de resultaten weergegeven.

100 3 5 70 .

21

Tabel 1 incubaties resultaat 5 CCC + PBS +

0+ + PBS

CCC + AB serum + 0+ + AB serum 10 CCC geven na centrifugatie een egale laag van cellen over de vaste-fase (+; positieve reactie), 0+ cellen geven een button van cellen in het centrale, verdiepte gedeelte van de vaste-fase (-; negatieve reactie).

De test van de CCC in aanwezigheid van AB serum geeft 15 aan dat de erytrocyten effectief gescheiden werden van niet-gebonden antistoffen. Als de antistoffen niet boven de scheidingslaag zouden zijn gebleven, zou de vaste-fase geïnactiveerd zijn en zouden de CCC een vals-negatieve reactie hebben gegeven.

20

Voorbeeld 2

Typering van erytrocyten voor Rhesus-antigenen.

Er werd van het vaste-fase systeem zoals beschreven in voorbeeld 1 gebruik gemaakt. Er werd 25 μΐ 3% erytrocyten-25 suspensie (in bewaarvloeistof), geïncubeerd met resp. 25 μΐ anti-C, anti-c, anti-E, anti-e en anti-D reagens (polyklonale reagentia, CLB, Amsterdam, Nederland), op het scheidingsmedium gebracht. Ieder antiserum werd met zowel een positieve als een negatieve cel ingezet. Een positieve 30 cel is een erytrocyt die het corresponderende antigeen bezit, een negatieve cel bezit het corresponderende antigeen niet. Vervolgens werd 20 min bij 37°C in een stoof geïncubeerd. Hierna werd gecentrifugeerd zoals beschreven in voorbeeld 1. De resultaten zijn weergegeven in Tabel 2. Een 35 CCC, geïncubeerd met AB serum, werd meegenomen als positieve controle. In de eerste kolom is de specificiteit van de gebruikte antistof aangegeven, in de tweede kolom is het fenotype van de betreffende erytrocyt aangegeven. In de derde kolom is het resultaat van de bepaling weergegeven, 100 3570 .

22 een positieve reactie was een egaal roze laag van cellen op de vaste-fase, een negatieve reactie een "button" van erytrocyten in het centrum van de well.

5 Tabel 2 antistof fenotype erytrocyt resultaat anti-C RZR1 C+c" pos 10 anti-C ^2R2 C'c+ neg anti-c RZR1 C+c neg anti-c R2R2 C'c+ pos anti-E R2R2 E+e" pos anti-E r'r E"e+ neg 15 anti-e R2R2 E+e neg anti-e r'r E’e+ pos anti-D ^2R2 D pos anti-D r"r d neg 20 AB serum Coombs Controle Cel pos

Voorbeeld 3

Experimenten zoals beschreven in voorbeeld 2 zijn uitgevoerd voor het Kell-bloedgroepsysteem. Er werd 25 μΐ 25 3% erytrocytensuspensie (in bewaarvloeistof) geïncubeerd met resp. 25 μΐ anti-K, anti-k en anti-Kpa (polyklonale IgG antiserum, CLB, Amsterdam, Nederland) op het scheidings-medium gebracht en vervolgens 20 min bij 37°C in een stoof geïncubeerd. Ook hier werden per antistofspecificiteit een 30 positieve cel en een negatieve cel getest. Hierna werd gecentrifugeerd zoals beschreven in voorbeeld 1. De resultaten zijn weergegeven in Tabel 3. Een met AB serum geïncubeerd CCC werd meegenomen als positieve controle. Vermeld zijn achtereenvolgens de specificiteit van de 35 gebruikte antistof, het fenotype van de betreffende erytrocyt en het resultaat van de test. Anti-K en anti-k gesensibiliseerde erytrocyten gaven een egale laag erytrocyten op de vaste-fase te zien. De anti-Kpa gesensibiliseerde cel gaf een gedeeltelijke bedekking van de vaste-fase.

1003570.

Tabel 3 23 antistof fenotype resultaat specificiteit erytrocyt 5 ---------- ------------------------------------- anti-K K~k+ neg anti-K K+k+ pos anti-k K"k+ pos anti-Kpa Kpa" neg 10 anti-Kpa Kpa+ pos

Voorbeeld 4

Er werd gebruik gemaakt van de vaste-fase zoals beschreven in voorbeeld 1. Er werden testerytrocyten genomen 15 met fenotype Fya+b'. Hiervan werd een 0.75% suspensie gemaakt in een LISS-oplossing (3 mM natriumfosfaat, 61 mM natrium-chloride en 240 mM glycine; pH 6.6). Als antistofbevattend monster werd patiëntenserum gebruikt dat anti-Fya antistof bevatte (dit monster gaf in de zgn. PEG test een zwak 20 positieve (2+) reactie). Dit monster werd verdund in AB serum, een aantal verdunningen werd hiervan getest. 75 μΐ erytrocytensuspensie werd geïncubeerd met 75 μΐ (verdund) patiëntenserum gedurende 20 min bij 37°C en vervolgens gecentrifugeerd. In tabel 4 zijn de resultaten weegegeven.

25

Tabel 4 verdunning resultaat 30 onverdund anti-Fya positief cellen over hele vaste-fase verspreid 1:2 in AB serum verdund positief 35 cellen over vrijwel hele vaste- fase verspreid 1:4 in AB serum verdund zwak positief cellen over gedeelte van de 40 vaste-fase verspreid alleen AB serum negatief cellen in centrum van de well 10n}570 .

Claims

1. Werkwijze voor het bepalen in een monster van een analyt, gekozen uit een op erytrocyten aanwezig bloedgroep-antigeen of een aan een dergelijk bloedgroepantigeen bindend antilichaam, omvattende behandeling van het monster in een 5 incubatiezone van een reactievat met een reagens dat een analyt-bindingspartner bevat, welke analyt-bindingspartner, in het geval dat de analyt een op erytrocyten aanwezig bloedgroepantigeen is, een antilichaam is dat aan het bloedgroepantigeen kan binden, en in het geval dat de analyt 10 een aan een bloedgroepantigeen bindend antilichaam is, het op erytrocyten aanwezige bloedgroepantigeen is, waarbij in de incubatiezone een complex van op erytrocyten aanwezig bloedgroepantigeen en daaraan gebonden antilichaam ontstaat indien het monster de analyt bevat, verder omvattende 15 scheiding van erytrocyten, gecomplexeerd of niet, van niet-gebonden antilichamen met behulp van een in het reactievat beneden de incubatiezone gelegen separatiemedium met een dichtheid, hoger dan die van de vloeistof die de antistoffen bevat maar lager dan de dichtheid van erytrocyten, waarbij 20 erytrocyten door het separatiemedium passeren en niet- gebonden antilichamen in de incubatiezone blijven, scheiding van gecomplexeerde erytrocyten van niet-gecomplexeerde erytrocyten door gecomplexeerde erytrocyten in een immobilisatiezone van het reactievat te binden aan een in 25 deze zone geïmmobiliseerde immunoglobuline-bindende substantie en niet-gecomplexeerde erytrocyten af te voeren naar een collectiezone van het reactievat, en detectie van erytrocyten in de immobilisatiezone en/of collectiezone.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat 30 het monster uit bloed, bloedplasma, bloedserum, een bloed- fractie of een supernatant van een hybridoma bestaat.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat als reactievat een microtiterplaat-well wordt toegepast. 1003570.

4. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat een microtiterplaat-well met een holle (concave) bodem, bijv. well met U-vormige bodem, wordt toegepast, waarbij de immunoglobuline-bindende substantie tenminste aan een hoger 5 gelegen gedeelte van deze bodem is geïmmobiliseerd en het lager gelegen gedeelte van deze bodem als de collectiezone fungeert.

5. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat een microtiterplaat-well met een bolle (convexe) bodem wordt 10 toegepast, waarbij de immunoglobuline-bindende substantie tenminste aan een hoger gelegen gedeelte van deze bodem is geïmmobiliseerd en het lager gelegen gedeelte van deze bodem als de collectiezone fungeert.

6. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat 15 als separatiemedium een medium wordt gebruikt dat een dicht- heidverhogende stof bevat, zoals albumine, dextraan, Ficoll, iodixanol, natriumdiatrizoaat, Percoll, bijv. 15% iodixanol-oplossing in erytrocytbewaarvloeistof.

7. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat 20 de incubatie van monster met reagens direkt op het separatiemedium wordt uitgevoerd.

8. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de incubatie van monster met reagens wordt uitgevoerd in een incubatiezone die door een poreus membraan of een van een of 25 meer openingen voorziene bodem van het separatiemedium is gescheiden.

9. Werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat een poreus membraan van kunststof wordt gebruikt, zoals van polycarbonaat of van polyethyleentereftalaat.

10. Werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat een incubatiezone wordt gebruikt met een bodem die aan de periferie van een of meerdere doorlaatopeningen is voorzien.

11. Werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat een incubatiezone wordt gebruikt met een bodem die centraal 35 van een of meerdere doorlaatopeningen is voorzien.

12. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de scheiding van erytrocyten en niet-gebonden antilichamen 1003570. en de scheiding van gecomplexeerde en niet-gecomplexeerde erytrocyten beide door centrifugering worden bewerkstelligd.

13. Werkwijze volgens conclusie 12, met het kenmerk, dat de scheiding van gecomplexeerde en niet-gecomplexeerde 5 erytrocyten wordt uitgevoerd door centrifugering bij hogere centrifugaalkracht dan de scheiding van erytrocyten en niet-gebonden antilichamen.

14. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat als immunoglobulinebindende substantie een immunoglobuline- 10 bindend bacterieel eiwit wordt toegepast.

15. Werkwijze volgens conclusie 14, met het kenmerk, dat als immunoglobulinebindend bacterieel eiwit proteïne A, proteïne G, proteïne L of proteïne H wordt toegepast.

16. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat 15 als immunoglobulinebindende substantie een recombinant eiwit met immunoglobulinebindende eigenschappen, zoals proteïne L/G of proteïne A/G, wordt toegepast.

17. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat als immunoglobulinebindende substantie mono- of polyklonale 20 antistof tegen IgG, IgA en/of IgM wordt gebruikt.

18. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de immunoglobulinebindende substantie door middel van een koppelingsmiddel, dat uit een immunoglobuline kan bestaan, in de immobilisatiezone aan de wand van het reactievat is 25 gebonden.

19. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de analyt een op erytrocyten aanwezig bloedgroepantigeen is.

20. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de analyt een aan een bloedgroepantigeen bindend antilichaam 30 is.

21. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat een kruisproef wordt uitgevoerd doordat erytrocyten met onbekende bloedgroepantigeensamenstelling en antistoffen van onbekende bloedgroepspecificiteit worden toegepast.

22. Testkit, geschikt voor gebruik in een werkwijze voor het bepalen van een analyt in een monster, waarbij de analyt een op erytrocyten aanwezig bloedgroepantigeen of een 1003570. aan een dergelijk bloedgroepantigeen bindend antilichaam is, omvattend: (i) een reagens dat een analyt-bindingspartner bevat die, in het geval dat de analyt een op erytrocyten aanwezig 5 bloedgroepantigeen is, een antilichaam is dat aan het bloedgroepantigeen kan binden, en in het geval dat de analyt een aan een bloedgroepantigeen bindend antilichaam is, het op erytrocyten aanwezige bloedgroepantigeen is, (ii) een reactievat, omvattende een incubatiezone, een 10 immobilisatiezone en een collectiezone, waarbij in de immobilisatiezone een immunoglobulinebindende substantie is geïmmobiliseerd, en (iii) een separatiemedium met een dichtheid, lager dan de dichtheid van erytrocyten maar hoger dan de dichtheid van 15 een antilichamen bevattende vloeistof. 1003570.