MXPA06015127A

MXPA06015127A - Dosificacion optimizada con anticuerpos anti-cd4, para induccion de tolerancia en primates

Info

Publication number: MXPA06015127A
Application number: MXPA/A/2006/015127A
Authority: MX
Inventors: Patricia Rao; Douglas Ringler; Paul Ponath; Dawn Winsorhines
Original assignee: Tolerrx Inc
Priority date: 2004-06-22
Filing date: 2006-12-20
Publication date: 2008-10-03

Abstract

La presente invención se basa al menos en parte, en el hallazgo de que la tolerancia puede inducirse al inhibir células CD4+ (y opcionalmente células CD8+). De acuerdo con esto, los métodos de dosificación optimizados de la invención se utilizan para tratar un primate, por ejemplo un humano, al inhibir células T CD4+ para inducir tolerancia a cuando menos un antígeno, por ejemplo propio o extraño, tal como para inducir tolerancia en un primate contra un antígeno ligado a célula o soluble (por ejemplo un antígeno trasplantado xenógeno o alogénico).

Description

DOSIFICACIÓN OPTIMIZADA CON ANTICUERPOS ANTI-CD4, PARA INDUCCIÓN DE TOLERANCIA EN PRIMATES Solicitudes Relacionadas Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud provisional de patente de los E.U.A. No. de Serie 60/582181 presentada en junio 22, 2004, con título " Optimized Dosing of Anti-CD4 Antibodies for Tolerance Inducing Induction in Primates". Esta solicitud se relaciona con la solicitud provisional de patentes de los E.U.A. No. de Serie 60/431,839, presentada en diciembre 9, 2002, con título "Introducing Tolerance to Proteins in Primates," y la solicitud de patente de los E.U.A. No. de Serie 10/731,984 "Introducing Tolerance in Primates" presentada en diciembre 9, 2003. Todos los contenidos de cada una de estas solicitudes se incorporan aquí por referencia . Antecedentes de la Invención Esta invención se refiere a inducción de tolerancia y más particularmente a inducir tolerancia en un primate contra uno o varios antígenos y en particular un antígeno extraño. Ha habido numerosos intentos para inducir tolerancia contra antígenos extraños y propios en primates. Por ejemplo, en el campo de trasplantes, hay necesidad por inducir tolerancia a antígenos extraños en un trasplante, para evitar su rechazo. En la actualidad, el rechazo solo puede evitarse por el uso de inmunosupresión a largo plazo (crónica) que acarrea riesgos de infección, cáncer y toxicidad de droga. Antecedentes de la Invención Además, en el tratamiento de un paciente con una propiedad terapéutica, en muchos casos, el tratamiento se vuelve menos efectivo o totalmente inefectivo, como resultado de una respuesta inmune a esa proteína extraña. Aunque se ha demostrado éxito utilizando anticuerpos anti-CD4 en roedores, la inducción de tolerancia con anticuerpos anti-CD4 tiene todavía que demostrarse en primates. Como resultado, hay necesidad por un tratamiento que induce tolerancia a uno o varios antígenos, por ejemplo proteínas solubles o ligadas a células que reducen o eliminan la necesidad por drogas inmuno supresoras e inmunosupresión a largo plazo en un primate contra uno o varios antígenos y en particular una o varias proteínas extrañas. Compendio de la Invención La presente invención avanza a la técnica al proporcionar dosis optimizadas de anti-CD4 que son capaces de reducir inmunorespuestas a proteínas extrañas sin inmunosupresión a largo plazo. De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un proceso para hacer tolerante a un primate contra uno o varios antígenos por el uso de anticuerpos CD4 o su fragmento en una cantidad y por un tiempo efectivo para inducir tolerancia contra al menos un antígeno. En una modalidad, el anticuerpo anti-CD4 se administra en combinación con un segundo agente que promueve tolerancia. En una modalidad, el segundo agente es anticuerpo anti-CD8 u otro agente que inhibe la actividad de células CD8+. En un aspecto, la invención se dirige a un método para tratar un primate para inducir tolerancia cuando menos a un antígeno extraño que comprende administrar al primate cuando menos un anticuerpo anti-CD4 o su fragmento de enlace CD , en donde el anticuerpo anti-CD4 como mínimo se administra a una dosis entre aproximadamente 20 mg/kg a 40 mg/kg en al menos tres dosis separadas. En una modalidad, el anti-anticuerpo CD4 como mínimo se administra a una dosis de aproximadamente 20 mg/kg. En otra modalidad, el anti-anticuerpo CD4 como mínimo se administra en al menos cuatro dosis separadas. En otra modalidad, el anti-anticuerpo CD4 se administra en al menos cinco dosis separadas.

En una modalidad, el anti-anticuerpo CD4 como mínimo, se administra en al menos los d£as-l, 3 o 4, 8 y 12 respecto a la administración del antígeno extraño. En una modalidad, en donde el anti -anticuerpo CD4 como mínimo se administra en los días como mínimo -1, 1, y 3, respecto a la administración del antígeno extraño . En una modalidad, el antígeno extraño es un antígeno soluble. En una modalidad, la primera dosis del antianticuerpo CD4 como mínimo se administra antes de administración del antígeno extraño. En una modalidad, el anti -anticuerpo CD4 como mínimo es TRX1. En otro aspecto, la invención se dirige a un método para tratar un primate para inducir tolerancia a cuando menos un antígeno extraño que comprende, administrar al primate al menos un anti -anticuerpo CD4 o su fragmento de enlace CD4 , en donde al menos una dosis del anti-anticuerpo CD4 como mínimo, se administra al menos un día antes de administración del antígeno extraño .

En todavía otro aspecto, la invención se dirige a un método para tratar un primate, para inducir tolerancia al antígeno extraño como mínimo que comprende, administrar al primate al menos un anti -anticuerpo CD4 o su fragmento de enlace CD4 , en donde el anti-anticuerpo CD4 como mínimo se administra a una dosis suficiente para mantener una concentración en suero de anticuerpo anti-CD4 a un nivel de aproximadamente 20 durante la fase de inducción de tolerancia. En una modalidad, al menos una dosis del anti-anticuerpo CD4 como mínimo, se administra un día antes de administración del antígeno extraño. En otra modalidad, el anti -anticuerpo CD4 como mínimo se administra a una dosis de entre aproximadamente 20 mg/kg y 40 mg/kg. En otro aspecto, la invención se dirige a un método para tratar un primate para inducir tolerancia a cuando menos un antígeno extraño que comprende, administrar al primate al menos un anti-anticuerpo CD4 o su fragmento de enlace CD4 , en donde el anti-anticuerpo CD4 se administra a una dosis suficiente para lograr aproximadamente 85% saturación de sitios CD4 en células T del primate durante la fase de inducción de tolerancia.

En una modalidad, el anti-anticuerpo CD4 como mínimo no se administra por más de aproximadamente dos semanas.

En una modalidad, al menos una dosis del antianticuerpo CD4 como mínimo se administra un día antes de administración del antígeno extraño. En otra modalidad, el anti -anticuerpo CD4 como mínimo, se administra a una dosis de entre aproximadamente 20 mg/kg y 40 mg/kg. En una modalidad, el anti -anticuerpo CD4 como mínimo is TRX1. En otro aspecto, la invención se refiere a un método para inducir tolerancia en un primate a un antígeno soluble, que comprende administrar a un primate al menos un antígeno anti-CD4 o su fragmento de enlace CD4 , en donde el anticuerpo anti-CD4 como mínimo se administra a una dosis de entre aproximadamente 20-40 mg/kg en al menos tres dosis separadas de manera tal que se induzca tolerancia al antígeno soluble. En una modalidad, al menos una dosis del anticuerpo anti-CD4 como mínimo se administra un día antes de administración del antígeno soluble. En otra modalidad, el anticuerpo anti-CD4 como mínimo se administra a una dosis de aproximadamente 20 mg/kg. Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1A muestra la secuencia de aminoácidos de la primera modalidad de cadena ligera del anticuerpo TRXl . La Figura IB muestra la secuencia de nucleótidos de la primera modalidad de la cadena ligera del anticuerpo TRXl. La Figura 1C muestra la secuencia de aminoácidos de la primera modalidad de la cadena ligera del anticuerpo TRXl con y sin una secuencia líder. La Figura ID muestra la secuencia de aminoácidos de la primera modalidad de la cadena pesada del anticuerpo TRXl. La Figura 1E es una continuación de la secuencia mostrada mostrada en la Figura ID. La Figura 1F muestra la secuencia de nucleótidos de la primera modalidad de la cadena pesada del anticuerpo TRXl. La Figura 1G muestra la secuencia de aminoácidos de la primera modalidad de cadena pesada del anticuerpo TRXl con y sin una secuencia líder . La Figura 2A muestra la secuencia de aminoácidos de otra modalidad de la cadena ligera del anticuerpo TRXl. La Figura 2B muestra la secuencia de nucleótidos de otra modalidad de la cadena ligera del anticuerpo TRXl . La Figura 2C muestra la secuencia de aminoácidos de otra modalidad de la cadena ligera del anticuerpo TRXl con y sin un líder de secuencia. La Figura 2D muestra la secuencia de aminoácidos de otra modalidad de cadena pesada del anticuerpo TRXl. La Figura 2E es una continuación de la secuencia mostrada en la Figura 2D. La Figura 2F muestra la secuencia de nucleótidos de otra modalidad de la cadena pesada del anticuerpo TRXl. La Figura 2G muestra la secuencia de aminoácidos de otra modalidad de la cadena pesada . del anticuerpo TRXl con y sin una secuencia líder. La Figura 3A muestra la secuencia de aminoácidos de otra modalidad de la cadena ligera del anticuerpo TRXl. La Figura 3B muestra la secuencia de nucleótidos de otra modalidad de la cadena ligera del anticuerpo TRXl. La Figura 3C muestra la secuencia de aminoácidos de otra modalidad de la cadena ligera del anticuerpo TRXl con y sin una secuencia líder. La Figura 3D muestra la secuencia de aminoácidos de otra modalidad de la cadena pesada del anticuerpo TRXl. La Figura 3E es una continuación de la secuencia mostrada en la Figura 3D. La Figura 3F muestra la secuencia de nucleótidos de otra modalidad de la cadena pesada del anticuerpo TRXl. La Figura 3G muestra la secuencia de aminoácidos de otra modalidad de la cadena pesada del anticuerpo TRXl con y sin una secuencia líder. La Figura 4A muestra la secuencia de aminoácidos de otra modalidad de cadena ligera del anticuerpo TRXl. La Figura 4B muestra lia a secuencia de nucleótidos de otra modalidad de cadena ligera del anticuerpo TRXl . La Figura 4C muestra la secuencia de aminoácidos de otra modalidad de la cadena ligera del anticuerpo TRX con y sin una secuencia líder. La Figura 4D muestra la secuencia de aminoácidos de otra modalidad de la cadena pesada del anticuerpo TRX1. La Figura 4E es una continuación de la secuencia mostrada en la Figura 4D. La Figura 4F muestra la secuencia de nucleótidos de otra modalidad de la cadena pesada del anticuerpo TRX1. La Figura 4G muestra la secuencia de aminoácidos de otra modalidad de la cadena pesada del anticuerpo TRX1TRX con y sin una secuencia líder. Las Figuras 5A-5C muestran la secuencia de las cadenas pesadas del anticuerpo CD8 humanizado empleado en el Ejemplo 5. La Figura 6 muestra la secuencia de las cadenas ligeras del anticuerpo CD8 humanizado empleado en el Ejemplo 5. Las Figuras 7A-7C muestran otra modalidad de una cadena pesada TRX1. En esta modalidad, el aminoácido en la posición 236 es un Leu, el aminoácido en la posición 238 es Gly, y el aminoácido en la posición 297 es un Ala. Las Figuras 8A-8B muestran otra modalidad de una cadena ligera TRX1. En esta modalidad, el aminoácido en la posición 117 es un Leu. Las Figuras 9A-9B muestran vista en general esquemática de protocolo de ataque de antígeno e inducción de tolerancia. 9A, el protocolo se divide en 3 fases: inducción, lavado y ataque. Durante la fase de inducción, el anticuerpo TRX1 o salino se somete a infusión los días -1, 3 o 4, 8 y 12. Antígeno (Ig equino o salino) se administra los días 0, 3 y 8. La fase de inducción es seguida por una fase de lavado durante la cual niveles de suero de TRX1 e Ig equino se supervisaron hasta que no fueron más detectables. La fase de ataque se inició el día 68 al dosificar a todos los animales con Ig equino así como un neoantígeno, SRVC . Ataques con Ig equino adicionales se administraron el día 95 y el día 130. 9B, grupos de tratamiento consisten de 4 cohortes de dosificación TRX1 experimentales y 2 grupos de control . Los grupos experimentales recibieron 4 infusiones de TRX1 a 1, 10, 20, o 40 mg/kg y 3 dosis de antígeno. El grupo de control I, antígeno solo, recibió 4 infusiones de salino y 3 dosis de Ig equino. El grupo de control II, TRX1 solo estuvo comprendido por 2 cohortes con animales que reciben 4 infusiones de TRX1 a 20 o 40 mg/kg. Animales en el grupo de control II recibieron 3 dosis de salino en vez de antígeno. Todos los animales se sometieron a ataque o prueba 3 veces con antígeno y recibieron una sola inmunización con SRVC al tiempo del primer ataque Ig equino .

Las Figuras 10A-10C muestran farmacocinética y farmacodinámica de TRX1 durante las fases de inducción y lavado. 10A, representa concentraciones en suero de TRX1 promedio de grupo {µ /ml) . Animales de grupo II de control y experimentales que reciben dosis equivalentes TRX1 (20 y 40 mg/kg) se combinan. La flecha indica dosis con TRX1. Símbolos abiertos representan animales agrupados de acuerdo con la dosis de TRX1 recibida, 1 mg/kg (n=3) ; 10 mg/kg (n=3) ; 20 mg/kg (n=4) ; or 40 mg/kg (n=6) ; 10B, representa saturación de sitios CD4 en células CD3 más arriba en sangre periférica con una función de dosis TRX1 durante fases de inducción de tolerancia y lavado. Tinción de TRXl-biotina de muestra de sangre entera se emplea para detectar sitios CD4 libres. El valor MCF promedio para cada grupo se representa como un por ciento del valor de línea base MCF promedio grupo; grupo de control I; antígeno solo, círculos cerrados (n=3); símbolos abiertos representan animales agrupados de acuerdo con la dosis de TRX1 recibida, grupo 1 mg/kg (n=3) ; 10 mg/kg (n=3) ; 20 mg/kg; y 40 mg/kg (n=6) ; 10C, total de células T CD4+ por mi de sangre. Conteo de linfocitos CD4+ absoluto promedio de grupo se calculan como un porcentaje de valores de línea base promedio de grupo; grupo de control I, antígenos solo, círculos cerrados (n=3) ; símbolos abiertos representan animales agrupados de acuerdo con la dosis de TRX1 recibida, 1 mg/kg (n=3) ; 10 mg/kg (n=3) ; 20 mg/kg (n=4) ; 40 mg/kg (n=6) . Las Figuras 11A-11C muestran respuesta inmune durante inducción y primer ataque. 11A, Título de anticuerpo promedio de grupo generados contra Igl equino durante la fase de inducción. Los animales recibieron 3 dosis de antivenina indicadas por flecha. El título contra tnivenina se defina como la recíproca de la dilución que resulta en un valor OD equivalente a 2 veces el valor OD de una dilución 1:25,000 de una norma de control positiva. Círculos cerrados son grupo de control I, antígeno solo (n=3); símbolos abiertos representan las cohortes de dosis experimentales TRX1, 1 mg/kg de TRX1 (n=3) ; 10 mg/kg de TRX1 (n=3); 20 mg/kg de TRX1 (n=2); and 40 mg/kg de TRX1 (n=3) ; 11B, título de anticuerpo promedio de grupo generados contra Ig equino después del primer ataque dado el día 68 (flecha) . Círculos cerrados son grupos de control I, antígeno solo (n=3) ; símbolos en gris son grupo de control II, cohortes de solo TRX1 , 20 mg/kg de TRX1 (n=2) ; y 40 mg/kg (n=3) ; y símbolos abiertos representan las cohortes de dosificación experimentales TRX1 , lmg/kg (n=3) ; 10 mg/kg (n=3) ; 20mg/kg (n=3) ; and 40mg/kg (n=3) ; 11C, inmuno respuesta al antígeno neo, SRBC, administrado al tiempo del primer ataque el día 68 (flecha) y medido por hemolisis de SRBC. Títulos de anticuerpo promedio de grupo para grupo de control I, círculos cerrados, (n=3); cohortes de grupo II romano de control, símbolos en gris, 20 mg/kg de TRX1 (n=2) ; and 40 mg/kg (n=3) ; y cohortes de dosis experimentales TRX1, símbolos abiertos 1 mg/kg (n=3) ; 10 mg/kg (n=3) ; 20 mg/kg (n=3 ; and 40 mg/kg (n=3) . El título se define como la recíproca de la dilución más alta de suero que no provoca hemolisis obvia. Las Figuras 12A-12B muestran respuesta inmune a Ig equino después de múltiples pruebas. 12A, títulos de anticuerpos promedio de grupo para el grupo de control I, círculos cerrados (n=3); cohortes de grupo de control II, símbolos grises, 20 mg/kg de TRX1 (n=2) y 40 mg/kg (n=3) ; y cortes de grupo experimental TRX1, símbolos abiertos, 20 mg/kg de TRX1 (n=2) y 40 mg/kg de TRX1 (n=3) . 12B, títulos de anticuerpo a Ig equino de animales individuales en el grupo experimental TRX1 20 mg/kg (#16276 y #16096, símbolos abiertos, líneas sólidas) y 40 mg/kg (#16178, #16192, y #16286, símbolos cerrados, líneas sólidas) cortes trazados con los títulos de anticuerpo promedio de grupo a Ig equino para el grupo de control I (círculos grises, línea sólida) y grupo de control II, cohortes 20 mg/kg (triángulo abierto, líneas punteadas n=2) y 40 mg/kg (cuadrado cerrado, líneas punteadas, n=3) . Las Figuras 13A-13B muestran inmuno-respuestas a Ig equino con dosis TRX1 modificada. Círculos cerrados representan grupo de control salino I o antígeno solo (n=3); triángulos abiertos representan el grupo experimental tratado con TRX1 20 mg/kg (n=2) . El título se define como la recíproca de la dilución de suero que resulta en un valor OD equivalente al doble del valor OD de una dilución a 1:25,000 de suero de control positivo. 13A, títulos de anticuerpo promedio de grupo generados contra Ig equino durante la fase de inducción. Los animales recibieron 3 dosis de TRX1 indicado por las flechas en los días -1, 1 y 3. Ig equino se administra los días 0,4 y 8. 13B, títulos de anticuerpo promedio de grupo generados contra Ig equino durante la fase de prueba. Los animales se probaron con 10 mg de antivenina s. c. los días 68 y 97 y con 1 mg/kg de Ig equina s. c. el día 133. Descripción Detallada de la Invención El o los antígenos en cuanto a que tolerancia se induce, pueden ser un auto-antígeno o un antígeno extraño y en particular uno o varios antígenos extraños. Como se emplea aquí, el término "tolerar" o "tolerante" o "tolerancia", incluyen la refractividad a estímulo mediado por receptor de activación. Esta refractividad generalmente es específica de antígeno y persiste después de que la exposición al antígeno tolerante ha cesado. Por ejemplo, la tolerancia se caracteriza por falta de producción de citocina, por ejemplo IL-2 ante exposición subsecuente al antígeno tolerante. La tolerancia puede ocurrir a auto-antígenos o a antígenos extraños. En una modalidad, el primate tolerante no produce una respuesta inmune adversa al antígeno sobre un periodo de tiempo después de tratamiento con un agente tolerante se detiene aún cuando se somete subsecuentemente a prueba con el antígeno y/o cuando el antígeno permanece presente en el primate, pero es capaz de proporcionar una inmunorespuesta contra otros antígenos. En una modalidad, se induce tolerancia en la ausencia de un nivel terapéutico de un inmunosupresor general . Por ejemplo, el antígeno extraño puede ser uno o más de los siguientes tipos de antígeno: (i) uno o varios antígenos extraños presentes en tejido o células trasplantadas, incluyendo tejido o células presentes en un órgano, en donde el trasplante puede ser alogenéico o xenogenéico; (ii) un agente terapéutico (que también incluye agentes terapéuticos empleados para prevención de enfermedad) que produce una inmunorespuesta en un primate, esta inmunorespuesta disminuye la capacidad del agente para funcionar como un agente terapéutico. Estos agentes incluyen pero no están limitados a vehículos de suministro, tales como vectores empleados en terapia de genes; agentes activos tales como proteínas suministradas al primate (por ejemplo proteínas recombinantes tales como anticuerpos monoclonales , enzimas, factores de coagulación) y algunas drogas de moléculas pequeñas o proteínas producidas a partir de un agente suministrado al primate tal como en terapia de genes . Los antígenos extraños contra los cuales se induce tolerancia de acuerdo con la presente invención no son antígenos extraños como están presentes en bacterias, hongos, virus, etc. que causan enfermedad, que infectan a un anfitrión, es decir el término antígeno extraño no incluye un antígeno extraño como parte de un organismo que infecta a un primate y provoca enfermedad o desorden. En una modalidad, el antígeno es un antígeno soluble. El anticuerpo CD4 o anticuerpo CD8 en el caso en el que se emplea un anticuerpo CD8 , de preferencia es un anticuerpo monoclonal (o su fragmento que retiene la capacidad para ligar a CD4 o CD8, respectivamente) . El anticuerpo puede ser un anticuerpo humano o un anticuerpo no-humano, con anticuerpos no humanos que incluyen anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos murinos, etc. El anticuerpo CD4 o su fragmento apropiado se administra a un primate en una cantidad y por un tiempo efectivos, para inducir tolerancia contra un antígeno extraño o auto-antígeno y de preferencia un antígeno extraño. Anticuerpos CD4 anti -primate se conocen en la técnica al igual que métodos para producir estos anticuerpos. En una modalidad, el anticuerpo anti-CD4 se administra antes de exposición (o exposición sistémica) del sujeto al antígeno al cual se desea la tolerancia. En otra modalidad, el anticuerpo anti-CD4 se administra simultáneamente con el antígeno al cual se desea la tolerancia . En ciertas modalidades, en particular cuando se desea tolerancia a un trasplante (por ejemplo un trasplante de célula o tejido), puede ser conveniente el inhibir adicionalmente células CD8+ el compuesto que inhibe células T CD8+ inhibe la actividad de las células T CD8+, por ejemplo al reducir su número o al inhibir su función efectora. En una modalidad, un compuesto que inhibe células T CD8+, específicamente inhibe células T CD8+. En otra modalidad, un compuesto que inhibe células T CD8+, no inhibe significativamente o agota células Treg . Dicho compuesto puede ser un anticuerpo que agota o no células T CD8+. Anticuerpos CD8 anti -primate se conocen en la técnica, al igual que métodos para producir estos anticuerpos. El compuesto que inhibe células T CD8+ puede ser un compuesto (diferente a un anticuerpo) que inhibe estas células T CD8+ (este compuesto diferente a un anticuerpo puede o no agotar células T CD8+. Compuestos no-anticuerpo ejemplares incluyen por ejemplo proteína de enlace beta-galactósido (Blaser et al. 1998. Eur J Immunol . 28:2311) . En una modalidad, el compuesto que inhibe células T CD8+ se administra antes de administración del anticuerpo anti-CD4. En otra modalidad, el compuesto que inhibe células T CD8+ se administra simultáneamente con el anticuerpo anti-CD4. En otra modalidad, el compuesto que inhibe células T CD8+ se administra subsecuente a la administración del anticuerpo anti-CD4. Como se emplea aquí, el término "célula T regulatoria" incluye células T que producen bajos niveles de IL-2, IL-4, IL-5, y IL-12. Células T regulatorias producen TNFo;, TGF ?, IFN- ? , y IL-10, aunque a menores niveles que las células efectoras T. Aunque TGFß es la citocina predominante producida por células T regulatorias, la citocina se produce a niveles menores que o iguales a los producidos por células THl o TH2 , por ejemplo un orden de magnitud menor que en células THl o TH2. Células THl regulatorias pueden encontrarse en la población CD4+ CD25+ de células (ver por ejemplo aldmann and Cobbold. 2001. Immunity. 14: 399). Células T regulatorias suprimen activamente la proliferación y producción de citocina de células THl TH2 o T sin tratamiento previo, que se han estimulado en cultivo con una señal de activación (por ejemplo células de antígeno y células que presentan antígeno o con una señal que imita antígeno en el contexto de MHC, por ejemplo anticuerpo anti-CD3, más anticuerpo anti-CD28) . Ejemplos representativos de compuestos (diferentes a anticuerpos) que inhiben células T CD8+ incluyen: Rapamicina (sirolimus) y micofelonato mofetil (CellCept®) . En una modalidad, de preferencia no se emplea un compuesto tal como ciclosporina, debido a que aunque inhibe las células T CD8+ este compuesto también inhibe células Treg (por ejemplo por agotamiento) . La presente invención tiene aplicabilidad particular para inducir tolerancia en un primate con respecto a un trasplante. De preferencia este primate es un humano. El trasplante puede ser halogenéico o xenogenéico .

De acuerdo con una modalidad preferida, cada uno del anticuerpo CD4 o su fragmento apropiado y el compuesto inhibidor CD8 se administran sobre un periodo de tiempo, a fin de mantener en el primate niveles apropiados de este anticuerpo o fragmento y compuesto sobre un periodo de tiempo que es suficiente para inducir tolerancia . En una modalidad, al menos un anticuerpo anti-CD4 o su fragmento que enlaza CD4 , en donde el anticuerpo anti-CD4 como mínimo se administra a una dosis de aproximadamente 20 mg/kg. En otra modalidad, el anticuerpo anti-CD4 como mínimo se administra a una dosis entre aproximadamente 20 y 40 mg/kg. En otra modalidad, el anticuerpo anti-CD4 como mínimo, se administra a una dosis de aproximadamente 20 mg/kg. En una modalidad, al menos tres dosis del anticuerpo se administran. Cada dosis puede administrarse con el tiempo, por ejemplo, puede diluirse y someterse a infusión sobre un periodo de 24 horas, o porciones de la dosis pueden administrarse en el curso de un periodo de 24 horas, por ejemplo en inoculaciones separadas. En otra modalidad, se administran cuatro dosis separadas del anticuerpo anti-CD4, por ejemplo el anticuerpo anti-CD4 como mínimo se administra en al menos 4 días separados.

En otra modalidad, cinco dosis separadas del anticuerpo anti-CD4 se administran, por ejemplo el anticuerpo ant-CD4 como mínimo se administra en al menos 5 días separados. En otra modalidad, al menos una dosis del anticuerpo anti-CD4 como mínimo se administra al menos aproximadamente 7 días antes de administración del antígeno extraño. En otra modalidad, al menos una dosis del anticuerpo anti-CD4 como mínimo se administra al menos aproximadamente 5 días antes de administración del antígeno extraño. En otra modalidad, al menos una dosis del anticuerpo anti-CD4 como mínimo se administra al menos aproximadamente 4 días antes de administración del antígeno extraño. En otra modalidad, al menos una dosis del anticuerpo anti-CD4 como mínimo se administra al menos aproximadamente 3 días antes de administración del antígeno extraño. En otra modalidad, al menos una dosis del anticuerpo anti-CD4 como mínimo se administra al menos aproximadamente 2 días antes de administración del antígeno extraño. En otra modalidad, al menos una dosis del anticuerpo anti-CD4 como mínimo se administra al menos aproximadamente 1 día antes de administración del antígeno extraño. En una modalidad, la administración de al menos un anticuerpo anti-CD4 continua por aproximadamente una semana después de exposición al antígeno extraño. Todavía en otra modalidad, la administración de al menos un anticuerpo anti-CD4 continua por aproximadamente dos semanas después de exposición al antígeno extraño. En otra modalidad, la administración de al menos un anticuerpo anti-CD4 continua por aproximadamente un mes después de exposición al antígeno extraño. En otra modalidad, el anticuerpo anti-CD4 como mínimo se administra en al menos los días -1, 3 o 4, 8 y 12 respecto a la administración del antígeno extraño. Todavía en otra modalidad, el anticuerpo anti-CD4 como mínimo se administra al menos los días -1, 1 y 3 respecto a la administración del antígeno extraño. En otra modalidad, la invención pertenece a un proceso para tratar a un primate para inducir tolerancia a cuando menos un antígeno extraño que comprende administrar al primate al menos un anticuerpo anti-CD4 o su fragmento de enlace CD4 , en donde el anticuerpo anti-CD4 como mínimo se administra a una dosis suficiente para lograr ligeramente menos que saturación completa de sitio CD4 , por ejemplo, aproximadamente 95%, aproximadamente 90%, aproximadamente 85%, aproximadamente 80%, aproximadamente 75% de saturación de sitio CD4 en células T en el primate durante la fase de inducción de tolerancia. En otra modalidad, al menos un anticuerpo anti-CD4 se administra a una dosis suficiente para lograr ligeramente menos que saturación completa de sitio CD , por ejemplo aproximadamente 95%, aproximadamente 90%, aproximadamente 85%, aproximadamente 80%, aproximadamente 75% de saturación de sitio CD4 de células T en el primate, durante la fase de inducción de tolerancia. En una modalidad, el nivel de saturación de sitio CD4 no excede aproximadamente 85%. Saturación CD4 puede determinarse utilizando métodos conocidos en la especialidad. Por ejemplo, en los ejemplos anexos, la saturación se determina como una función de los sitios CD4 libres en linfocitos en circulación. Por ejemplo, sitios CD4 libres pueden determinarse por tinción con anti-CD4, por ejemplo que comprende una etiqueta detectable. En una modalidad, la administración del anticuerpo anti-CD4 no es necesaria después de la fase de inducción de tolerancia. Todavía en otra modalidad, la invención se refiere a un proceso para inducir tolerancia en un primate a un antígeno trasplantado, que comprende administrar a un primate al menos un anticuerpo anti-CD4, o su fragmento de enlace CD4 y al menos un compuesto que inhibe células T CD8+, cada una en una cantidad y por un tiempo efectivo para inducir tolerancia contra el trasplante, el anticuerpo anti-CD4 o su fragmento están presentes en el primate cuando el antígeno trasplantado está presente en el primate y el anticuerpo anti-CD4 se administra en una dosis inicial de aproximadamente 20 mg/kg, tal que la tolerancia del antígeno trasplantado se induce . En una modalidad, la dosis de anti-CD4 puede variar en cada uno de los tiempos dados durante la . fase de inducción. Por ejemplo, el anticuerpo CD4 (o su fragmento) puede administrarse en una dosis inicial, por ejemplo como se establece aquí, y dosis subsecuentes pueden ser mayores que, iguales a, o menores que la dosis inicial . De preferencia, la dosis del anti-CD4 administrado (ya sea las dosis iniciales o subsecuentes) son de al menos aproximadamente 20 mg/kg. En otra modalidad, menos que o igual a 40 mg/kg se administran en una dosis. En otra modalidad, entre aproximadamente 20 mg/kg y 40 mg/kg se administran en una dosis. Todavía en otra modalidad, entre aproximadamente 10 mg/kg y 40 mg/kg se administran en una dosis. Todavía en otra modalidad, entre aproximadamente 5 y 40 mg/kg se administran en una dosis . En una modalidad, el anticuerpo CD4 (o su fragmento) puede administrase en una dosis menor que o igual a 20 mg/kg. En otra modalidad, el anticuerpo CD4 (o su fragmento) puede administrarse en una dosis de menos de aproximadamente 20 mg/kg. Por ejemplo, en casos cuando el anticuerpo anti-CD4 se administra a humanos, puede ser conveniente el reducir la cantidad de anticuerpo anti-CD4 administrado dada la inmunogenicidad reducida y mejorada farmacocinética del anticuerpo TRX1 en humanos. Por ejemplo, en una modalidad, la dosis de anti-CD4 administrada (ya sea las dosis iniciales o subsecuentes) es de al menos aproximadamente 5 mg/kg. En otra modalidad, la dosis de anti-CD4 administrado (ya sea las dosis iniciales o subsecuentes) es de al menos aproximadamente 7.5 mg/kg. En otra modalidad, la dosis de anti-CD4 administrado (ya sea la dosis inicial o subsecuentes) es de al menos aproximadamente 10 mg/kg. En otra modalidad, la dosis de anti-CD4 administrado (ya sea la dosis inicial o subsecuentes) es al menos aproximadamente 12.5 mg/kg. En otra modalidad, la dosis de anti-CD4 administrado (ya sea la dosis inicial o subsecuentes) es de al menos aproximadamente 15 mg/kg. En otra modalidad, la dosis de anti-CD4 administrado (ya sea la dosis inicial o subsecuentes) es al menos aproximadamente 17.5 mg/kg. La dosis inicial del anticuerpo CD4 puede administrarse en una o más partes sobre un periodo de veinticuatro horas y de preferencia en una dosis sobre veinticuatro horas. Como se emplea aquí, con referencia a una cantidad de dosis, una dosis es la cantidad de anticuerpo CD4 administrada durante un periodo de veinticuatro horas, incluso si se administra más de una vez en 24 horas . Como se emplea aquí, el término "fase de inducción de tolerancia" incluye el tiempo durante el cual el anticuerpo anti-CD4 se administra a un primate para inducir tolerancia. Por ejemplo, anticuerpo anti-CD4 puede administrarse en tres a cuatro dosis sobre un corto periodo de tiempo (por ejemplo, por aproximadamente un mes o menos, tal como aproximadamente 10, aproximadamente 13, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25, o aproximadamente 30 días) en proximidad inmediata al tiempo de exposición al antígeno extraño . En la mayoría de los casos, después de la dosis inicial, el anticuerpo CD4 (o su fragmento apropiado) se administra en una o más dosis de seguimiento durante uno o varios días, con cada dosis de seguimiento que se administra en una o más dosis en un periodo de veinticuatro horas. La o las dosis de seguimiento en general se proporcionan en una cantidad para regresar a niveles de suero del anticuerpo CD4 a aquellos que se lograron por la dosis inicial. En una modalidad preferida, la o las dosis de seguimiento mínimas del anticuerpo CD4 es una cantidad que en general es igual a las cantidades previamente descritas y pueden o no ser idénticas a las dosis dadas como la dosis original o inicial . Si hay más de una dosis de seguimiento del anticuerpo CD4 , cada dosis de seguimiento adicional durante un periodo de 24 horas puede ser igual o diferente que otra dosis de seguimiento. El número de dosis de seguimiento del anticuerpo CD4 variará. En una modalidad, hay al menos una dosis de seguimiento. En una modalidad, el número total de dosis no excede ocho dosis diarias. En una modalidad, dosis subsecuentes de anticuerpo anti-CD4 se administran aproximadamente cada 4 a 5 días. En otra modalidad, dosis subsecuentes de anticuerpo anti-CD4 se administran aproximadamente cada 2 a 3 días. En otra modalidad, dosis subsecuentes de anticuerpo anti-CD4 se administran aproximadamente cada 1 a 2 días . En una modalidad, el periodo total en el cual el anticuerpo CD4 se administra, no excede cuatro semanas y más de preferiblemente no excede tres semanas. En muchos casos, tolerancia puede lograrse al utilizar una dosis inicial y una o más dosis de seguimiento durante un periodo que no excede dos semanas . Aunque, de acuerdo con la presente invención, tolerancia inicial de uno o varios antígenos puede lograrse en un primate en un periodo de inducción de tolerancia de no mayor a aproximadamente cuatro semanas, en algunos casos, tratamientos de seguimiento periódico con el anticuerpo CD4 pueden administrarse en fin de mantener tolerancia. En una modalidad, la invención se refiere a un proceso para tratar a un primate para inducir tolerancia a cuando menos un antígeno e4xtraño que comprende, administra al primate cuando menos un anticuerpo anti-CD4 o su fragmento de enlace CD4 , en donde el anticuerpo anti-CD4 como mínimo se administra a una dosis suficiente para mantener una concentración en suero de anticuerpo anti-CD4 a un nivel de aproximadamente 20 ^g/ml durante la inducción de tolerancia. En otra modalidad, la concentración de suero se mantiene a un nivel de al menos aproximadamente 20 ytg/ml. Como se describió previamente, al menos uno anticuerpo CD4 (o su fragmento apropiado) se suministra en una cantidad que es al menos suficiente para inducir tolerancia en un primate contra uno o varios antígenos en una modalidad preferida contra un antígeno extraño. La cantidad máxima por supuesto se limita por consideraciones de seguridad. En general, las dosis diarias de anticuerpo CD4 será menor a 6000 mg . El número de dosis de seguimiento y su espaciamiento se determinará en parte por la vida media del anticuerpo CD4 como mínimo. Aunque la presente invención no habrá de limitarse, en una modalidad, el anticuerpo CD4 inicialmente se suministrará en una cantidad para lograr niveles en suero de anticuerpo que exceden la cantidad requerida para saturar todo el CD4 del primate que se trata, con dosis de seguimiento que se suministra en tiempos para mantener este exceso sobre un periodo que induce tolerancia en el primate contra el o los antígenos extraños. En una modalidad preferida, el anticuerpo CD4 es un anticuerpo CD4 que tendrá una función efectora reducida (es decir lítica) en comparación con IgGl humano. Ejemplos de anticuerpos que tendrán función efectora reducida, incluyen anticuerpos que tienen una porción Fe que es aglicosilada y/o que tiene enlace reducido al receptor Fe y/o no es lítica. Por ejemplo, en una modalidad, un anticuerpo anti-CD4 comprende cuando menos una mutación en la región constante de la cadena pesada. Mutaciones ejemplares incluyen Leu 236 a Ala (por ejemplo, CTG a GCG) , Gly 238 a Ala (por ejemplo, GGA a GCA) , Asn 297 a Ala (por ejemplo, AAC a GCC) . En una modalidad, una o más de estas mutaciones pueden elaborarse. Por ejemplo, en una modalidad preferida, la mutación en la posición 297 se hace para producir un anticuerpo aglicosil anti-CD4 con función efectora reducida. En otra modalidad, se hacen las mutaciones en las posiciones 236 y 238. Esta forma se glicosila, pero el receptor Fe y enlace complemento se reducen. En una modalidad, un anticuerpo CD4 con una función efectora reducida es un anticuerpo CD4 sin agotamiento. Como se emplea aquí, "un anticuerpo CD4 sin agotamiento" es un anticuerpo CD4 que agota menos de 50% de células CD4 y de preferencia menos de 10% de células CD4. En una modalidad, un cóctel que comprende diferentes anticuerpos anti-CD4 puede emplearse. En otra modalidad, diferentes anticuerpos anti-CD4 puede administrarse al mismo paciente en diferentes días. En una modalidad, un compuesto inhibidor de células CD8 se administra además para mejorar tolerancia en un primate. El compuesto inhibidor CD8 se administra al primate durante el tratamiento inicial con el anticuerpo CD4 en una cantidad efectiva para reducir la acción y/o nivel de células T CD8+ en el primate. Estas cantidades pueden ser menores que las cantidades empleadas para el anticuerpo CD4. El compuesto inhibidor CD8 puede emplearse al mismo tiempo que el anticuerpo CD4 o puede emplearse en diferentes tiempos. El compuesto inhibidor CD8 puede administrarse en diferentes días o en el mismo dia que el anticuerpo CD4. Como se describió previamente, el compuesto inhibidor CD8 puede ser un anticuerpo (o su fragmento) o un compuesto diferente a un anticuerpo. El tratamiento con el compuesto inhibidor CD8 se realiza durante tratamiento inicial (incluyendo dosis de seguimiento inicial) ; sin embargo, si se emplea adicional tratamiento con anticuerpo CD4 después del periodo de tratamiento inicial (incluyendo dosis de seguimiento) , este tratamiento adicional puede realizarse con o sin tratamiento con el compuesto inhibidor CD8. Para tratar un primate y en particular un humano, el anticuerpo CD4 (y opcionalmente el compuesto inhibidor CD8) puede emplearse en combinación con un portador farmaceúticamente aceptable, por ejemplo, formulado para administración separada o conjunta. Una composición que contiene un anticuerpo CD4 y/o compuesto inhibidor CD8, puede incluir otros ingredientes, por ejemplo, estabilizantes y/u otro agentes activos.

El uso de un anticuerpo anti-CD4 para inducir tolerancia contra uno o varios antígenos en un primate de acuerdo con la presente invención proporciona tolerancia contra uno o más antígenos y el primate es capaz de responder inmunológicamente a otros antígenos. De esta manera, en este aspecto, el primate se hace tolerante a uno o más antígenos, y el sistema inmune es capaz de proporcionar una respuesta inmune contra otros antígenos extraños con lo que el primate no esta inmunocomprometido . En la modalidad preferida cuando se induce tolerancia contra un antígeno extraño, cada uno del anticuerpo CD4 (y opcionalmente el compuesto inhibidor CD8 , solos o en combinación entre sí) se administran al primate antes de, en conjunto con o subsecuente al antígeno extraño que se suministra al primate. En una modalidad preferida, el primate se proporciona con el anticuerpo CD4 y el compuesto inhibidor CD8 , a un tiempo tal que ambos están presentes en el primate cuando el o los antígenos contra el cual se induce tolerancia también están presentes en el primate. En una modalidad particularmente preferida, cada uno del anticuerpo CD4 (o su fragmento) y el compuesto inhibidor CD8 se suministra al primate antes que el primate entre en contacto con el o los antígenos extraños a los cuales se hará tolerante el primate o dentro de unas cuantas horas o menos que un día posteriormente. En una modalidad, cada uno del anticuerpo CD4 (y opcionalmente el compuesto inhibidor CD8 se administran al primate al menos aproximadamente 5, al menos aproximadamente 4 , al menos aproximadamente 3 , al menos aproximadamente 2 o al menos aproximadamente 1 día antes de que el primate reciba el antígeno extraño. En una modalidad, el anticuerpo anti-CD4 se administra aproximadamente 5 días antes de que el primate reciba el antígeno extraño. Como se indico previamente, en una modalidad, un primate se hace tolerante contra una proteína terapéutica que se va a utilizar para tratar al primate. Esta proteína terapéutica puede ser un antígeno soluble, por ejemplo, un anticuerpo terapéutico (diferente al anticuerpo CD4) (este anticuerpo terapéutico puede ser un anticuerpo humano, anticuerpo humanizado, anticuerpo quimérico o un anticuerpo no humano) ; una enzima tal como la empleada para terapia de reemplazo; una hormona; factor de coagulación; una proteína producida en terapia de genes; un vehículo de suministro de terapia de genes tal cómo un vector empleado en una terapia de genes (por ejemplo, un vector de adenovirus) ; u otra proteína soluble. Como se emplea aquí, el término "soluble" incluye antígenos que no están ligados a células (tales como proteínas que se secretan naturalmente por células o que se han sometido a ingeniería para ser solubles, por ejemplo, por remoción de dominios transmembrana y citoplásmico y/o por incorporación de diversos dominios, por ejemplo, dominios de región Fe de anticuerpo. El o los antígenos extraños pueden estar presentes en un órgano trasplantado, o en células trasplantadas utilizadas en terapia de células o en otros trasplantes de tejido, tales como piel. En una modalidad, el primate no se ha expuesto al antígeno antes de tratamiento con anticuerpo anti-CD4. En otra modalidad, el primate se ha expuesto al antígeno antes de tratamiento con anticuerpo anti-CD4. El tratamiento de un primate, en particular un humano, a fin de hacer tolerante al primate contra un antígeno extraño por el uso de un anticuerpo CD4 y un compuesto inhibidor CD8 puede lograrse en algunos casos sin terapia auxiliar, tal como trasplante de médula ósea para promover aceptación de un antígeno extraño y/o inmunosupresión . En algunos casos, la terapia auxiliar también puede emplearse. Por ejemplo, como parte de un procedimiento de trasplante, puede emplearse inmunosupresión con un inmunosupresor apropiado pero al emplear la presente invención, no se requiere inmunosupresión crónica. Además, si se utiliza después o durante el procedimiento de hacer tolerante, en algunos casos, el inmunosupresor puede emplearse con menos que la cantidad requerida para proporcionar la inmunosupresión efectiva. En una modalidad no limitante, el anticuerpo CD4 de preferencia es un anticuerpo TRX1 o aquel que liga uno al mismo epítope que TRX1, y este anticuerpo CD4 de preferencia se emplea con el régimen de dosificación como se describió previamente. De acuerdo con un aspecto de la presente invención, este anticuerpo CD4 (de preferencia un anticuerpo humanizado o su fragmento) liga al mismo epítope (o a porción del mismo) en linfocitos humanos como el anticuerpo humanizado selecciona al grupo que consiste de, el anticuerpo humanizado TRX1, por ejemplo, los componentes de los cuales por ejemplo, cadena ligera y cadena pesada, cada uno contiene regiones constantes y regiones variables, se ilustra en las Figuras 1A-1G y corresponden a SEQ ID Nos.: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8; el anticuerpo humanizado TRX1, por ejemplo, los componentes del cual, por ejemplo cadena ligera y cadena pesada, cada uno contiene regiones constantes regiones y regiones variables, se ilustran en la Figuras 2A-2G y corresponden a SEQ ID Nos.: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, y 16; el anticuerpo humanizado TRX1 , por ejemplo, los componentes del cual, por ejemplo cadena ligera y cadena pesada, cada uno contiene regiones constantes y regiones variables, se ilustran en las Figuras 3A-3G y corresponden a SEQ ID Nos. : 17,18, 19, 20, 21, 22, 23, y 24; y el anticuerpo humanizado TRX1, por ejemplo, los componentes del cual, por ejemplo cadena ligera y cadena pesada, cada uno contiene regiones constantes y regiones variables, se ilustran en las Figuras 4A-4G y corresponden a SEQ ID Nos. : 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, y 32. El anticuerpo a continuación se refiere en ocasiones como TRX1. El término "molécula" o "anticuerpo que liga el mismo epítope que TRX1" incluyen TRX1. El término "TRX1" incluye los componentes del anticuerpo humanizado, por ejemplo, cadena ligera y cadena pesada, cada uno que contiene una región constante y una región variable, por ejemplo secuencias de aminoácido mostradas en SEQ ID Nos.: 1, 3, 4, 5, 7 y 8 (Figuras 1A, 1C, ID, 1E, y 1G) , los componentes del anticuerpo humanizado, por ejemplo, cadena ligera y cadena pesada, cada uno que contiene una región constante y una región variable, por ejemplo, secuencias de aminoácido mostradas en SEQ ID Nos.: 9, 11, 12, 13, 15, y 16 (Figures 2A, 2C, 2D, 2E, y 2G) , los componentes del anticuerpo humanizado, por ejemplo, cadena ligera y cadena pesada, cada uno que contiene una región constante y una región variable, por ejemplo, secuencias de aminoácido mostradas en SEQ ID Nos.: 17, 19, 21, 23, y 24 (Figuras 3A, 3C, 3D, 3E, y 3G) , los componentes del anticuerpo humanizado, por ejemplo, cadena ligera y cadena pesada, cada uno que contiene una región constante y una región variable, por ejemplo, secuencias de aminoácido mostradas en SEQ ID Nos.: 25, 27, 28, 29, 31, y 32 (Figures 4A, 4C, 4D, 4E, y 4G) , y aquellos idénticos a estos que pueden producirse, por ejemplo, por tecnología recombinante. Aunque el anticuerpo CD4 preferido es TRXl, de las presentes enseñanzas, otros anticuerpos anti-CD4 también pueden emplearse en los métodos de la invención. Por ejemplo, en una modalidad, una persona con destreza en la técnica puede producir anticuerpos que son equivalentes a TRX 1. Por ejemplo, estos anticuerpos pueden ser: 1) anticuerpos humanizados que ligan a CD4 (por ejemplo, al ligar al mismo epítope que TRXl) ; 2) anticuerpos humanizados que tienen los mismos CDRs que TRXl pero que tienen un marco de lectura humanizado diferente y/o región constante humana diferente ; 3) anticuerpos humanizados que ligan a CD4 (por ejemplo, al ligar al mismo epítope que TRXl) en donde uno o más aminoácidos de uno o más de los CDRs y TRXl se han cambiado (de preferencia pero no necesariamente una substitución de aminoácido conservador) y en donde el marco de lectura puede ser el mismo que TRXl o tener un marco de lectura humanizado diferente o en el cual uno o más de los aminoácidos de la región de marco de lectura de TRXl se han cambiado y/o en donde la región constante puede ser igual o diferente de TRXl; 4) anticuerpos humanizados que ligan a CD4 (por ejemplo al ligar al mismo epítope que TRXl) en donde el anticuerpo no liga a receptores Fe a través de la región Fe del anticuerpo. 5) anticuerpos humanizados que ligan a CD4 (por ejemplo al ligar al mismo epítope que TRXl) en donde sus CDRs no incluyen un sitio de glicosilación . 6) anticuerpos humanizados que ligan a CD4 (por ejemplo al ligar al mismo epítope que TRXl) y no ligan a los receptores Fe a través de la región Fe del anticuerpo y los CDRs no incluyen un sitio de glicosilación. 7) un anticuerpo quimérico que liga a CD4 (por ejemplo al ligar al mismo epítope que TRXl); y 8) un anticuerpo murino que liga a CD4 (por ejemplo al ligar al mismo epítope que TRXl) .

Los anticuerpos que son equivalentes a TRX1 pueden emplearse en la misma forma y para los mismos propósitos que TRX1. En una modalidad preferida, el anticuerpo CD4 empleado en la presente invención, es aquel que liga al mismo epítope (o a una parte de ese epítope) que el anticuerpo humanizado TRX1. El término "liga al mismo epítope que el anticuerpo humanizado TRX1" se pretende que describa no solo el anticuerpo humanizado TRX1 si no también describa otros anticuerpos fragmentos o sus derivados que ligan al mismo epítope que el anticuerpo humanizado TRX1. Anticuerpos que ligan al mismo epítope que el anticuerpo humanizado TRX1 pueden identificarse utilizando técnicas conocidas por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad, por ejemplo ensayos de competencia de anticuerpo o cartografía de epítope. En una modalidad preferida, el anticuerpo CD4 no liga a los receptores Fe a través de la región Fe del anticuerpo y los CDRs no incluyen un sitio de glicosilación . La región constante puede o no incluir un sitio de glicosilación. En una modalidad, la región constante incluye un sitio de glicosilación. Señales de glicosilación son bien conocidas en la especialidad. Un ejemplo de una secuencia de cadena pesada que incluye un sitio de glicosilación se muestra en SEQ ID NO.: 5 (Figuras ID y 1E) , SEQ ID NO . : 7 (Figura 1G) y SEQ ID NO.:8 (Figura 1G) , y SEQ ID NO.:21 (Figuras 3D y 3E) , SEQ ID NO.:23 (Figura 3G) y SEQ ID NO.:24 (Figura 3G) . En otra modalidad la región constante no incluye un sitio de glicosilación debido a un cambio de aminoácido asparagina (N) a alanina (A) . Un ejemplo de una secuencia de cadena pesada que no incluye un sitio de glicosilación se muestra en SEQ ID NO . : 13 (Figuras 2D y 2E) , SEQ ID NO.: 15 (Figura 2G) y SEQ ID NO.: 16 (Figura 2G) , y SEQ ID NO.: 29 (Figuras 4D y 4E) , SEQ ID NO.: 31 (Figura 4G) y SEQ IDNO. :32 (Figura 4G) . Estos otros anticuerpos incluyen, a manera de ejemplo y no a manera de limitación, anticuerpos de rata, murinos, porcinos, bovinos, humanos, quiméricos, humanizados o sus fragmentos o derivados. El término "fragmento" como se emplea aquí, significa una porción de un anticuerpo, a manera de ejemplo, estas porciones de anticuerpo habrán de incluir pero no están limitadas a CDR, Fab, moléculas scFv o aquellas otras porciones que ligan al mismo epítope o cualquier porción de las mismas, como se reconoce por TRX1. El término "anticuerpo" como se emplea aquí, incluye anticuerpos policlonales y monoclonales así como fragmentos de anticuerpo y derivados, así como anticuerpos preparados por técnicas recombinantes , tales como anticuerpos quiméricos o humanizados, anticuerpos de cadena sencilla o biespecífieos que ligan al mismo epítope o una porción del mismo, como se reconoce por el anticuerpo humanizado TRX1. El término "moléculas" incluye a manera de ejemplo y no limitación, péptidos, oligonucleótidos u otro de estos compuestos derivados de cualquier fuente que imita al anticuerpo o liga al mismo epítope o porción del mismo como el fragmento de anticuerpo o su derivado. Otra modalidad de la presente invención proporciona un método para tratar a un paciente que va a recibir o ha recibido un trasplante de injerto con una cantidad efectiva de (i) al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste de anticuerpo TRX1, o un anticuerpo o su derivado o fragmento, que ligan al mismo epítope (o una porción del mismo) que el anticuerpo TRX1 y (ii) un compuesto de inhibición CD8. El tratamiento de preferencia se efectúa con el anticuerpo TRX1 completo o intacto . En una modalidad, el anticuerpo anti-CD4 empleado en los métodos de la invención se humaniza y se modifica para reducir la función efectora, por ejemplo por modificación para reducir el receptor Fe y/o enlace de complemento utilizando métodos conocidos en la técnica . En una modalidad, el anticuerpo es TRXl (SEQ ID Nos.: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, y 8; Figuras 1A, IB, 1C, ID, 1E, 1F, y 1G) . El anticuerpo TRXl, por ejemplo el componentes del anticuerpo TRXl, por ejemplo la cadena ligera y la cadena pesada, cada una que contienen regiones variables y constantes, que se muestran por ejemplo en SEQ ID Nos.: 1 (Figura 1A) , 2, (Figura IB), 3 (Figura 1C, superior) , 4 (Figura 1C, inferior) , 5 (Figuras ID y 1E) , 6 (Figura 1F) , 7 (Figura 1G, superior) , y 8 (Figura 1G, inferior) . SEQ ID No. :1 (Figura 1A) es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera TRXl y la SEQ ID No . : 2 (Figura IB) es la secuencia de nucleótidos de la cadena ligera TRXl. SEQ ID No . : 3 (Figura 1C, superior) es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera TRXl, con una secuencia líder. SEQ ID No . : 4 (Figura 1C, inferior) es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera TRXl, por ejemplo, SEQ ID No.: o SEQ ID No . : 3 , sin una secuencia líder, por ejemplo, residuos aminoácidos 1-20 de SEQ ID No.: 1. La secuencia de aminoácidos de cadena pesada TRXl que contiene un sitio de glicosilación, por ejemplo residuos aminoácidos 317-319, se muestra en SEQ ID No.:5 (Figuras ID y IE) y la secuencia de nucleótidos de la cadena pesada TRX1 se muestra en SEQ ID No.: 6 (Figura 1F) . SEQ ID No.: 7 (Figura 1G, superior) es la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada TRX1 con una secuencia líder. SEQ ID No . : 8 (Figura 1G, inferior) es la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada TRX1, por ejemplo SEQ ID No . : 5 (Figuras ID y 1E) , sin una secuencia líder, por ejemplo los residuos aminoácidos 1-19 de SEQ ID No. :5 (Figuras ID y 1E) , y contienen un sitio de glicosilación, por ejemplo residuos aminoácido 298-300. TRX1 es un anticuerpo humanizado que incluye regiones constantes modificadas de un anticuerpo humano, por ejemplo residuos aminoácidos de cadena ligera 132-238 de SEQ ID No. :1 (Figura 1A) o SEQ ID No . : 3 (Figura 1C, superior), y residuos aminoácidos 112-218 de SEQ ID No. : 4 (Figura 1C, inferior), y residuos aminoácido de cadena pesada 138-467. de SEQ ID No . : 5 (Figuras ID y IE) o SEQ ID No . : 7 (Figura 1G, superior) y residuos aminoácidos 119-448 de SEQ ID No . : 8 (Figura 1 G) , y el marco de cadena ligera y pesada y regiones CDR, en donde las regiones marco de las regiones variables de cadena ligera y pesada, corresponden a las regiones marco de la región variable de cadena ligera, por ejemplo los residuos aminoácidos 21-43, 59-73, 81-112, y 122-131 de SEQ ID No.: 1 (Figura 1A) o SEQ ID No.:3 (Figura 1C, superior) y residuos aminoácidos 1-22, 33-53, 61-92, y 102-111 de SEQ ID No.:4 (Figura 1C) , y regiones marco de la región variable de cadena pesada, por ejemplo residuos aminoácido 20-49,55-68, 86-117, y 127- 137 de SEQ ID No . : 5 o SEQ ID No . : 7 (Figura 1G, superior) y residuos aminoácido 1-30, 36-49, 67-98, y 108-118 de SEQ ID No . : 8 , que se derivan de un anticuerpo humano y CDRs de la cadena ligera, por ejemplo residuos aminoácido 44-58,74-80, y 113-121 de SEQ ID No.: 1 o SEQ ID No . : 3 (Figura 1C, superior) y residuos aminoácidos 24-32, 54-60 y 93-101 de SEQ ID No.: 4, y los CDRs de la cadena pesada, por ejemplo residuos aminoácido 50-54, 69-85, y 118-126 de la SEQ ID No.: 5 o SEQ ID No . : 7 (Figura 1G, superior) , y residuos aminoácidos 31-35, 50-66, y 99-107 de SEQ ID No. : 8, que se derivan de un anticuerpo monoclonal de ratón designado NSM4.7.2.4. En otra modalidad, el anticuerpo es TRX1 (SEQ ID Nos.-. 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 y 24; Figuras 3A, 3B, 3C, 3D, 3E, 3F, y 3G) . El anticuerpo TRX1, por ejemplo , los componentes del anticuerpo TRX1 , por ejemplo la cadena ligera y la cadena pesada, cada una que contienen regiones variables y constantes, que se muestran por ejemplo en SEQ ID Nos.: 17 (Figura 3A) , 18, (Figura 3B) , 19 (Figura 3C, superior) , 20 (Figura 3C, inferior) , 21 (Figuras 3D y 3E) , 22 (Figura 3F) , 23 (Figura 3G, superior), y 24 (Figura 3G, inferior). SEQ ID No.:17 (Figura 3A) es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera TRXl y la SEQ ID No.: 18 (Figura 3B) es la secuencia de nucleotidos de la cadena ligera TRXl. SEQ ID No. :19 (Figura 3C, superior) es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera TRXl, con una secuencia líder. SEQ ID No.:20 (Figura 3C, inferior) es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera TRXl, por ejemplo, SEQ ID No.:17, sin una secuencia líder, por ejemplo, residuos aminoácido 1-20 de SEQ ID No. : 17. La secuencia de aminoácidos de cadena pesada TRXl que contiene un sitio de glicosilacion, por ejemplo residuos aminoácidos 317-319, de SEQ ID No.:21 (Figuras 3D y 3E) y la secuencia de nucleotidos de la cadena pesada TRXl se muestra en SEQ ID No.: 22 (Figura 3F) . SEQ ID No.: 23 (Figura 3G, superior) es la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada TRXl con una secuencia líder. SEQ ID No. :24 (Figura 3G, inferior) es la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada TRXl, por ejemplo SEQ ID No.:21, sin una secuencia líder, por ejemplo los residuos aminoácidos 1-19 de SEQ ID No. :21 y contienen un sitio de glicosilacion, por ejemplo residuos aminoácido 298-300. TRXl es un anticuerpo humanizado que incluye regiones constantes modificadas de un anticuerpo humano, por ejemplo residuos aminoácidos de cadena ligera 132-238 de SEQ ID No.:17 (Figura 3A) o SEQ ID No.:19 (Figura 3C, superior) , y residuos aminoácidos 112-218 de SEQ ID No. : 20 (Figura 3C, inferior) , y residuos aminoácido de cadena pesada 138-467 de SEQ ID No.: 21 (Figuras 3D y 3E) o SEQ ID No.: 23 (Figura 3G, superior) y residuos aminoácidos 119-448 de SEQ ID No.:24 (Figura 3G) , y el marco de cadena ligera y pesada y regiones CDR, en donde las regiones marco de las regiones variables de cadena ligera y pesada, corresponden a las regiones marco de la región variable de cadena ligera, por ejemplo los residuos aminoácidos 21-43, 59-73, 81-112, y 122-131 de SEQ ID No.: 17 (Figura 3A) o SEQ ID No.:19 (Figura 3C, superior) y residuos aminoácidos 1-22, 33-53, 61-92, y 102-111 de SEQ ID No. :20 (Figura 3C) , y regiones marco de la región variable de cadena pesada, por ejemplo residuos aminoácido 20-49, 55-68, 86-117, y 127-137 de SEQ ID No.:21 (Figuras 3D y 3E) , o SEQ ID No.:23 (Figura 3G, superior) y residuos aminoácidos 1-30, 36-49, 67-98, y 108-118 de SEQ ID No. :24 (Figuras 3G, inferior) , que se derivan de un anticuerpo humano y CDRs de la cadena ligera, por ejemplo residuos aminoácido 44-58, 74-80, y 113-121 de SEQ ID No. : 17 (Figura 3A, superior) o SEQ ID No.: 19 (Figura 3C, superior) y residuos aminoácidos 24-32, 54-60 y 93-101 de SEQ ID No.: 20 (Figura 3C, inferior) , y los CDRs de la cadena pesada, por ejemplo residuos aminoácido 50-54, 69-85, y 118-126 de la SEQ ID No. : 21 (Figuras 3D y 3E) o SEQ ID No. : 23 (Figura 3Gf superior), y residuos aminoácidos 31-35, 50-66, y 99-107 de SEQ ID No . : 24 (Figura 3G, inferior) , que se derivan de un anticuerpo monoclonal de ratón designado NSM .7.2.4. En otra modalidad, el anticuerpo es TRX1 (SEQ ID Nos.: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 y 16; Figuras 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, y 2G) . El anticuerpo TRX1, por ejemplo los componentes del anticuerpo TRX1 , por ejemplo la cadena ligera y la cadena pesada, cada una que contienen regiones variables y constantes, que se muestran por ejemplo en SEQ ID Nos.: 9 (Figura 2A) , 10, (Figura 2B) , 11 (Figura 2C, superior), 12 (Figura 2C, inferior), 13 (Figuras 2D y 2E) , 14 (Figura 2F) , 15 (Figura 2G, superior) , y 16 (Figura 2G, inferior) . SEQ ID No. :9 (Figura 2A) es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera TRX1 y la SEQ ID No.: 10 (Figura 2B) es la secuencia de nucleótidos de la cadena ligera TRX1. SEQ ID No. :11 (Figura 2C, superior) es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera TRX1, con una secuencia líder. SEQ ID No.: 12 (Figura 2C, inferior) es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera TRX1 , por ejemplo, SEQ ID No. : 9 (Figura 2A) , sin una secuencia líder, por ejemplo, residuos de aminoácidos 1-20 de SEQ ID No.: 9. La secuencia de aminoácidos de cadena pesada TRX1 que no contiene un sitio de glicosilación, e.g. contiene un cambio de asparagina a alanina en el residuo aminoácido 317, se muestra en SEQ ID No. :13 (Figuras 2D y 2E) y la secuencia de nucleótidos de la cadena pesada TRX1 se muestra en SEQ ID No.: 14 (Figura 2F) . SEQ ID No.:15 (Figura 2G, superior) es la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada TRX1 con una secuencia líder. SEQ ID No.:16 (Figura 2G, inferior) es la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada TRX1, por ejemplo SEQ ID No.:13, sin una secuencia líder, por ejemplo los residuos aminoácidos 1-19 de SEQ ID No.: 13, y no contienen un sitio de glicosilación, por ejemplo contiene un cambio de asparagina a alanina en el residuo aminoácido 298. TRX1 es un anticuerpo humanizado que incluye regiones constantes modificadas de un anticuerpo humano, por ejemplo residuos aminoácidos de cadena ligera 132-238 de SEQ ID No . : 9 (Figura 2A) o SEQ ID No.:ll (Figura 2C, superior), y residuos aminoácidos 112-218 de SEQ ID No.: 12 (Figura 2C, inferior), y residuos aminoácido de cadena pesada 138-467 de SEQ ID No.:13 (Figuras 2D y 2E) o SEQ ID No.: 15 (Figura 2G, superior) y residuos aminoácidos 119-448 de SEQ ID No.:16 (Figura 2G, inferior) , y el marco de cadena ligera y pesada y regiones CDR, en donde las regiones marco de las regiones variables de cadena ligera y pesada, corresponden a las regiones marco de la región variable de cadena ligera, por ejemplo los residuos aminoácidos 21-43, 59-73, 81-112, y 122-131 de SEQ ID No . : 9 (Figura 2A) o SEQ ID No.:ll (Figura 2C, superior) y residuos aminoácidos 1-22, 33-53, 61-92, y 102-111 de SEQ ID No.:12 (Figura 2C, inferior) , y regiones marco de la región variable de cadena pesada, por ejemplo residuos aminoácido 20-49, 55-68, 86-117, y 127-137 de SEQ ID No.:13 ((Figuras 2D y 2E) o SEQ ID No. :15 (Figura 2G, superior) y residuos aminoácido 1-30, 36-49, 67-98, y 108-118 de SEQ ID No.:16 (Figura 2G, inferior) , que se derivan de un anticuerpo humano y CDRs de la cadena ligera, por ejemplo residuos aminoácido 44-58,74-80, y 113-121 de SEQ ID No.: 9 (Figura 2) o SEQ ID No.: 11 (Figura 2C, superior) y residuos aminoácidos 24-32, 54-60 y 93-101 de SEQ ID No. : 12 (Figura 2C, inferior) , y los CDRs de la cadena pesada, por ejemplo residuos aminoácido 50-54, 69-85, y 118-126 de la SEQ ID No.:13 (Figuras 2D y 2E) o SEQ ID No.: 15 (Figura 2G, superior), y residuos aminoácidos 31-35, 50-66, y 99-107 de SEQ ID No.: 16 (Figura 2G, inferior) que se derivan de un anticuerpo monoclonal de ratón designado NS 4.7.2.4. En otra modalidad, el anticuerpo es TRX1 (SEQ ID Nos.: 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 y 32; Figuras 4A, 4B, 4C, 4D, 4E, 4F, y 4G) . El anticuerpo TRX1 , por ejemplo los componentes del anticuerpo TRX1, por ejemplo la cadena ligera y la cadena pesada, cada una que contienen regiones variables y constantes, que se muestran por ejemplo en SEQ ID Nos.: 25 (Figura 4A) , 26, (Figura 4B) , 27 (Figura 4C, superior) , 28 (Figura 4C, inferior) , 29 (Figuras 4D y 4E) , 30 (Figura 4F) , 31 (Figura 4G, superior), y 32 (Figura 4G, inferior). SEQ ID No.:25 (Figura 4A) es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera TRX1 y la SEQ ID No. :26 (Figura 4B) es la secuencia de nucleótidos de la cadena ligera TRX1. SEQ ID No.:27 (Figura 4C, superior) es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera TRX1, con una secuencia líder. SEQ ID No.:28 (Figura 4C, inferior) es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera TRX1 , por ejemplo, SEQ ID No. :25, sin una secuencia líder, por ejemplo, residuos aminoácido 1-20 de SEQ ID No. : 25. La secuencia de aminoácidos de cadena pesada TRX1 que no contiene un sitio de glicosilación, por ejemplo contiene un cambio de asparagina a alanina en el residuo aminoácido 317, se muestra en SEQ ID No. :29 (Figuras 4D y 4E) y la secuencia de nucleótidos de la cadena pesada TRX1 se muestra en SEQ ID No.:30 (Figura 4F) . SEQ ID No.: 31 (Figura 4G, superior) es la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada TRX1 con una secuencia líder. SEQ ID No.: 32 (Figura 4G, inferior) es la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada TRX1, por ejemplo SEQ ID No.:29, sin una secuencia líder, por ejemplo los residuos aminoácidos 1-19 de SEQ ID No.:29, y no contienen un sitio de glicosilación, por ejemplo contiene un cambio asparagina a alanina en el residuo aminoácido 298. TRX1 es un anticuerpo humanizado que incluye regiones constantes modificadas de un anticuerpo humano, por ejemplo residuos aminoácidos de cadena ligera 132-238 de SEQ ID No.:25 (Figura 4A) o SEQ ID No.:27 (Figura 4C, superior), y residuos aminoácidos 112-218 de SEQ ID No.: 28 (Figura 4C, inferior), y residuos aminoácido de cadena pesada 138-467 de SEQ ID No.:29 (Figuras 4D y 4E) o SEQ ID No.: 31 (Figura 4G, superior) y residuos aminoácidos 119-448 de SEQ ID No.:31 (Figura 4G) , y el marco de cadena ligera y pesada y regiones CDR, en donde las regiones marco de las regiones variables de cadena ligera y pesada, corresponden a las regiones marco de la región variable de cadena ligera, por ejemplo los residuos aminoácidos 21-43,59-73, 81-112, y 122-131 de SEQ ID No.:25 (Figura 4A) o SEQ ID No.:27 (Figura 4C, superior) y residuos aminoácidos 1-22, 33-53, 61-92, y 102-111 de SEQ ID No.:28 (Figura 4C, inferior), y regiones marco de la región variable de cadena pesada, por ejemplo residuos aminoácido 20-49, 55-68, 86-117, y 127-137 de SEQ ID No.:29 (Figuras 4D y 4E) o SEQ ID No.:31 (Figura 4G, superior) y residuos aminoácido 1-30, 36-49, 67-98, y 108-118 de SEQ ID No.:32 (Figura 4G) , que se derivan de un anticuerpo humano y CDRs de la cadena ligera, por ejemplo residuos aminoácido 44-58, 74-80, y 113-121 de SEQ ID No.: 25 (Figura 4A) o SEQ ID No.: 27 (Figura 4C, superior) y residuos aminoácidos 24-32, 54-60 y 93-101 de SEQ ID No. : 28 (Figura 4C, inferior) , y los CDRs de la cadena pesada, por ejemplo residuos aminoácido 50-54, 69-85, y 118-126 de la SEQ ID No.: 29 (Figuras 4D y 4E) o SEQ ID No . : 31 (Figura 4G, superior) , y residuos aminoácidos 31-35, 50-66, y 99-107 de SEQ ID No. : 32 (Figura 4G, inferior) , que se derivan de un anticuerpo monoclonal de ratón designado NS 4.7.2.4. En otra modalidad, el anticuerpo TRXl comprende la secuencia de cadena pesada mostrada en las Figuras 7A-7C (SEQ ID NO: 71 y 72) . En otra modalidad, el anticuerpo TRXl comprende la secuencia de cadena pesada mostrada en las Figuras 7A-7C ausente de la secuencia líder. Todavía en otra modalidad, el anticuerpo TRXl comprende la secuencia de cadena ligera mostrada en las Figuras 8A-8B (SEQ ID NO: 73 y 74) . Todavía en otra modalidad, el anticuerpo TRXl comprende la secuencia de cadena ligera mostrada en las Figuras 8A-8B ausentes de la secuencia líder.

En una modalidad, la invención proporciona un anticuerpo anti-CD4 con una región variable de cadena ligera (LCVR) , que tiene al menos un dominio CDR derivado de un anticuerpo monoclonal de ratón, por ejemplo NSM4.7.2.4. En otra modalidad, una región variable de cadena ligera (LCVR) tiene al menos un dominio CDR que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de residuos aminoácido 44-58,74-80, y 113-121 de por ejemplo SEQ ID No.: o SEQ ID No. :3 o residuos aminoácido 24-32, 54-60, y 93-101 de SEQ ID No. :4. En otra modalidad, una región variable de cadena ligera (LCVR) tiene al menos dos dominios CDR que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de residuos aminoácido 44-58,74-80, y 113-121 de por ejemplo SEQ ID No.: o SEQ ID No. :3 o residuos aminoácidos 24-32, 54-60, y 93-101 de SEQ ID No . : 4., Todavía en otra modalidad, una región variable de cadena ligera (LCVR) tiene dominios CDR que comprenden las secuencias de aminoácidos que consisten de los residuos aminoácidos 44-58, 74-80, y 113-121 de por ejemplo SEQ ID No. :1 o SEQ ID No. :3 o residuos aminoácido 24-32, 54-60, y 93-101 de SEQ ID No.:4. En una modalidad de la invención, el anticuerpo anti-CD4 comprende una región de marco humano de una región variable que comprende al menos un CDR derivado de un anticuerpo monoclonal de ratón, por ejemplo NS 4.7.2.4. Por ejemplo, en una modalidad, un anticuerpo anti-CD4 para utilizar en los métodos de la invención, comprende al menos una secuencia CDR de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de residuos aminoácidos 44-58, 74-80, y 113-121 de por ejemplo SEQ ID No.: o SEQ ID No. :3 o residuos aminoácidos 24-32, 54-60, y 93-101 de SEQ ID No. :4. En una modalidad, un anticuerpo para utilizar en los métodos de la invención comprende al menos dos de las secuencias CDR de cadena ligera. Todavía en otra modalidad, un anticuerpo para utilizar en los métodos de la invención comprende al menos tres de las secuencias CDR de cadena ligera. En otra modalidad, un anticuerpo anti-CD4 para utilizar en los métodos de la invención, comprende al menos una secuencia CDR de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de residuos aminoácidos 50-54, 69-85, y 118-126 por ejemplo de SEQ ID No. :5 o SEQ ID No . : 7 o residuos aminoácido 31-35, 50-66, y 99-107 de SEQ ID No.:8. En una modalidad, un anticuerpo para utilizar en los métodos de la invención comprende al menos dos de las secuencias CDR de cadena pesada. Todavía en otra modalidad, un anticuerpo para utilizar en los métodos de la invención comprende al menos tres de las secuencias CDR de cadena pesada.

Métodos apropiados para preparar anticuerpo humanizado TRX1 u otro anticuerpo anti-CD4, adecuados para los propósitos de la presente invención deberán ser aparentes para aquellos con destreza en la especialidad a partir de las presentes enseñanzas. Este anticuerpo puede prepararse por técnicas recombinantes conocidas por aquellos con destreza en la especialidad. Esta invención además se ilustra por los siguientes ejemplos, que no habrán de considerarse como limitantes. Los contenidos de todas las referencias, patentes y solicitudes de patente publicadas citadas a través de esta solicitud así como las figuras, se incorporan aquí por referencia. EJEMPLOS La invención ahora se describirá con respecto a los siguientes ejemplos; sin embargo, el alcance de la presente invención no se pretende limitado de esta manera . Ejemplo 1; Construcción de Anticuerpo TRX1 partiendo de Secuencia de Aminoácidos. Una biblioteca cDNA se construye a partir del hibridoma de ratón NSM 4.7.2.4 utilizando el sistema plásmido Superscript (Gibco/BRL, cat . no. 82485A) de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante . cDNAs de cadena pesada y ligera se clonaron a partir de la biblioteca por hibridización de DNA utilizando como sondas cDNAs de gen de cadenas pesada y ligera de rata del hibridoma de rata YTS 177. Los cDNAs de gen de cadena pesada y ligera de rata de YTS 177 se aislaron del vector de expresión pHA Pr-1 como fragmentos BamHl/Sal 1 y etiquetaron con 32P y utilizaron independientemente para supervisar la biblioteca NSM 4.7.2.4. cDNA utilizando técnicas de biología molecular estándar (Sambrook, et al., Molecular Cloning, A. Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001) ; Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (2001)) . Análisis de secuencia de los cDNAs derivados de la biblioteca NSM 4.7.2 4 cDNA confirmaron que la cadena pesada NSM 4.7.2.4 es la sub-clase gamma- 1 de ratón y la cadena ligera NSM 4.7.2.4 es kappa . Las regiones V pesada y ligera NSM 4.7.2.4 (VH y VL respectivamente) se reconformaron a las regiones VH y VL humanas con "el mejor ajuste" o más alta similaridad de secuencia en las regiones de marco de lectura con la del ratón. Para la cadena ligera, HSIGKA de anticuerpo humano (de EMBL) con una similaridad de secuencia de 79%, se empleó (LA Spatz et al., 1990 J. Immunól. 144: 2821-8) . La secuencia HSIGKAW VL (SEQ ID No. 35) es: MVLQTQVFISLLL ISGAYGDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCK SSQSLLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIY ASTRESGVPDR FSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTPPMFGQGTKV EIKRT D inicio de marco 1 Q cambió a G Para la cadena pesada, el anticuerpo humano A32483 (de GenBank) con una similaridad de secuencia de 74% se empleó (Larrick, et al., Biochem. Biophys . Res. Comm. , Vol . 160, pgs . 1250-1256 (1989)) . La secuencia de A32483 VH (SEQ ID No. 36) es: LLAVAPGAHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNY YMHWVRQAPGQGLE MGIINPSGNSTNYAQKFQGRVTMTRD TSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREKLATTIFGVLI ITGMDY GQGTLVTVSSGSAS Q inicio de marco 1 Para el proceso de humanización de cadena ligera anti-CD4 77.53.1.2 (lkb tamaño de inserto) y clon de cadena pesada anti-CD4 58.59.1 (1.7kb tamaño de inserto) se seleccionaron de la biblioteca de cDNA e insertos aislados del vector pSport como fragmentos I/Not I y clonaron en el vector M13mpl8, para producir DNA de una sola hebra para secuenciado y plantilla para mutagénesis. La humanización de NSM 4.7.2.4 se realizó por mutagénesis dirigida por sitio de cDNA de ratón utilizando un equipo Amersham International (RPN 1523) de acuerdo con el protocolo sugerido del fabricante. Mutagénesis de las regiones de marco de lectura de gen VL se realizó utilizando 5 oligonucleótidos en el rango de longitud 29 a 76. Los oligos empleados fueron: Cebador #1998 (SEQ ID No. 37) 76 bases 5 ' -TGA CAT TGT GAT GAC CCA ATC TCC AGA TTC TTT GGC TGT GTC TCT AGG TGA GAG GGC CAC CAT CAA CTG CAA GGC C Cebador #1999 (SEQ ID No. 38) 29 bases 5' -TGA ACT GGT ATC AAC AGA AAC CAG GAC AG Cebador #2000 (SEQID No. 39) 28 bases 5 ' -AGA GTC TGG GGT CCC AGA CAG GTT TAG T Cebador #2001 (SEQ ID No. 40) 42 bases 5 ' -GTC TTC AGG ACC CTC CGA CGT TCG GTG GAG GTA CCA AGC TGG Cebador #2008 (SEQ ID No.41) 52 bases 5' -CAC CCT CAC CAT CAG TTC TCT GCA GGC GGA GGA TGT TGC AGT CTA TTA GTG T Los oligos se fosforilaron y realizó mutagénesis en tres etapas, utilizando no más de dos oligos por etapa, para introducir cambios de acuerdo con el siguiente procedimiento: (1) alineado de oligos imitantes fosforilados a plantilla ssDNA (2) polimerización (3) filtración para retirar DNA de una sola hebra (4) mella o incisión de hebra no mutante con Nci I (5) digestión de hebra no mutante con Exo III (6) repolimerización de DNA con espacios. (7) transformación de JM101 competente (8) secuenciado de clones Se confirmaron mutaciones por secuenciado de DNA de una sola hebra utilizando cebadores M13-20-40 y también los cebadores mutagénicos # 1999 y # 2000. Un sitio Sal I en el extremo 5 ' de la región variable se cambió a Hind III por oligos enlazadores #2334 y #2335, para permitir clonación de la región variable como un fragmento Hind IIl/Kpn I en la región constante de cadena ligera de CAMPATH-IH. Cebador #2334 (SEQ ID No. 42) 24 bases 5 ' -AGC TTT ACA GTT ACT GAG CAC ACA Cebador #2335 (SEQ ID No. 43) 24 bases 51 -TCG ATG TGT GCT CAG TAA CTG TAA Mutagénesis de las regiones de marco de lectura de gen VH, se realizaron utilizando cinco oligonucleótidos en el intervalo en longitud de 24 a 75 bases. Los oligos empleados fueron: Cebador #2003 (SEQ ID No. 44) 75 bases 5 ' -GGT TCA GCT GGT GCA GTC TGG AGC TGA AGT GAA GAA GCC TGG GGC TTC AGT GAA GGT GTC CTG TAA GGC TTC TGG Cebador # 2004 (SEQ ID No . 45) 52 bases 5 ' -AGC TGG GTG AGG CAG GCA CCT GGA CAG GGC CTT GAG TGG ATG GGA GAG ATT T Cebador #2005 (SEQ ID No. 46) 60 bases 51 -CAA GGG CAG GGT CAC AAT GAC TAG AGA CAC ATC CAC CAG CAC AGT CTA CAT GGA ACT CAG Cebador #2006 (SEQ ID No. 47) 43 bases 5 ' CAG CCT GAG GTC TGA GGA CAC TGC GGT CTA TTA CTG TGC AAG A Cebador #2007 (SEQ ID No. 48) 24 bases 51 -GCC AAG GGA CAC TAG TCA CTG TGT Se llevó a cabo mutagénesis como se describió anteriormente para la cadena ligera de nuevo utilizando no más de dos oligos a la vez para introducir los cambios. Se confirmaron mutaciones por secuenciado DNA de una sola hebra utilizando cebadores M13 -20-40 así como cebadores mutagénicos #2002 y #2004. El cebador #2002 se empleó para corregir un error de marco en el clon de inicio 58.59.1. El cebador #2002 (SEQ ID No. 49) 39 bases 5 ¦ -ACT CTA ACC ATG GAA TGG ATC TGG ATC TTT CTC CTC ATC El cebador #2380 se empleó para corregir mutación extra agregada por #2004 que faltó en el primer secuenciado . Cebador #2380 (SEQ ID No. 50) 39 bases 51 -TCA CTG CCT ATG TTA TAA GCT GGG TGA GGC AGG CAC CTG Como con la cadena ligera, el sitio 5' Sal I de cadena pesada, se cambió a Hind III utilizando los oligos enlazadores #2334 y #2335, para permitir clonación de la región variable de cadena pesada como un fragmento Hind III/ Spe I (sitio introducido por el cebador #2007) en la región constante de cadena pesada de CAMPATH-IH. Construcción de Cadena Pesada Las siguientes muestras de DNA se ampliaron: 1. Plásmido 1990. Gen de región constante de cadena pesada gamma -1 humano clonado en pUC18 (obtenido de Martin Sims, Wellcome Foundation Ltd) . 2. Plásmido 2387: cadena pesada reconformada de NSM 4.7.2.4, que contiene regiones de marco humano y región constante de gamma 1 de ratón. Un sitio Sal I en la cadena pesada CD4 reconformada se altera a un sitio Hind III. El gen de región variable se corta por digestión con Hind III/Spe I y liga con el gen de región constante en el plásmido 1990 para dar una cadena pesada humanizada completa (plásmido 2486) . El gen de cadena pesada se corta de este plásmido con Hind III/EcoR I y liga con el vector de expresión pEE6. Construcción de cadena ligera Las siguientes muestras de DNA se emplearon. 1. Plásmido 2028; gen de cadena ligera CAMPATH-1H clonado en M13mpl8 en el sitio de restricción Sall/BamH I. 2. Plásmido 2197: cadena ligera reconformada de NSM 4.7.2.4 que contiene las regiones de marco humano y región constante kappa de ratón. Un sitio Kpn I ya se ha introducido entre las porciones variable y constante de este gen. Un sitio de restricción Kpn I se introduce en el gen de cadena ligera CAMPATH 1H que corresponde al sitio en el plásmido 2197 y un sitio EcoR I se introduce en el extremo 3' de la región constante. El gen de región constante se corta de este plásmido (2502) por digestión con Hind IIl/Kpn I. Mientras tanto, un sitio Sal I en el plásmido 2197 se cambia a un sitio Hind III (esta etapa tuvo que repetirse debido a que una mutación con cambio de cuadro se introdujo accidentalmente la primera vez) . El nuevo plásmido (2736) se digirió con Hind IIl/Kpn I. El fragmento de región variable DC4 se clonó en un plásmido que contiene el gen de región constante kappa del plásmido 2502 para dar una cadena ligera humanizada completa (plásmido 2548) . El gen de cadena ligera se cortó de este plásmido con Hind IIl/EcoR I y ligó con el vector de expresión pEE12 para dar el plásmido 2798. Ligación de cadenas pesada y ligera y expresión en células NSO. El gen de cadena pesada se cortó del vector pEE6 por digestión con Sal I/Bgl II y clonó en el vector pEE12 de cadena ligera que se digirió con BamH I/Sal I. La construcción de vector final se verificó por digestiones de restricción con Hind III, EcoR I, Sal I, BamH I, Bgl II y Spe I por la presencia de los fragmentos esperados incluyendo cadena ligera de 700 bp, cadena pesada de 1400 bp, fragmento de 2300 bp de pEE6 y fragmento de 7000 bp de pEE12. El vector pEE12 se linearizó por digestión por Sal I y transfirió en células NSO por electroporación, siguiendo un protocolo estándar (Celltech 1991) excepto porque el medio de selección fue ligeramente modificado basado en IMDM en lugar de DMEM. Se seleccionaron transíectados en el medio que carece de glutamina, suplementado con Fe dialisado, ribonucleósidos, ácido glutámico y asparagina como se recomienda.

Las mezclas de transfección se cultivaron en tres placas de 96 pozos, y de 36 pozos de crecimiento que se probaron, 5 fueron fuertemente positivas para producción de cadenas pesada y ligera humanas (los otros 18 fueron positivos para una u otra, o débilmente positivos para ambas) . Un clon, designado SDG/B7B.A.7 se eligió y almacenó congelado pero no se ha realizado mayor caracterización en este anticuerpo de tipo silvestre. Construcción de anticuerpo IgGl muíante diseñada para abolir funciones efectoras. Debido a consideraciones respecto a efectos secundarios de ' otros anticuerpos secundarios CD4 reportados en diversas pruebas clínicas, se considera conveniente el evitar la posibilidad de emplear receptores Fe. IgG4 humano se considera que tiene mínimo enlace Fe o habilidad de activación de complemento. Sin embargo, experimentos han mostrado que involucran receptores Fe en algunos individuos (Greenwood et al . , Eur. J. Immunol . , Vol . 23, pgs . 1098-1104, 1993) , y estudios clínicos con una variante IgG4 humana a C7A PATH-1H han demostrado una habilidad para exterminar células in vivo (Isaacs et al., Clin. Ex . Immunol., Vol. 106, pgs. 427-433 (1996)) . Para eliminar la posibilidad de enlazar receptores Fe, se realizaron construcciones con mutaciones en la región constante de cadena pesada IgGl . TRX1 puede elaborarse para tener mutaciones, por ejemplo Leu236 a Ala y Gly238 a Ala, como se muestra en SEQ ID Nos.:5 y 6, y SEQ ID Nos.:21 y 22. Estos residuos particulares fueron elegidos debido a que se pronostica que rompen enlace máximo a todos los tres tipos de receptores Fe humanos para IgG. Cualquier mutación es suficiente para reducir enlace a Fc/RI (Woof, et al., Mol. Immunol, Vol . 332, pgs . 563-564, 1986; Duncan, et al., Nature, Vol. 332, pgs. 563-564 1988; Lund, et al., J . Immunol , Vol. 147, pgs. 2657-2662 1991) o Fc^RII (Lund et al., 1991; Sarmay et al., Mol . Immunol . , Vol. 29, pgs. 633-639 1992) mientras que Gly238 a Ala tiene el efecto más alto para ligar a Fc^RIII (Sarmay et al., 1992) . Las siguientes muestras de DNA se emplearon. 1. Plásmido 2555 y Plásmido 2555 Mut . ; la región VH humanizada de NSM 4.7.2.4 clonado en el vector de expresión pEE6 en un sitio de restricción Hind Ill/Spe I. El plásmido 2555 después se mutó por mutagénesis dirigida por sitio tal que un residuo aminoácido Asn101 se cambia a Asp101, como se muestra en SEQ ID Nos . : 5 y 6, y SEQ ID Nos.:21 y 22. El plásmido resultante fue el plásmido 2555 Mut. 2. Plásmido 2798: la región VH humanizada de NSM 4.7.2.4 se unió a las regiones constantes kappa humanas, para dar aproximadamente un fragmento de 700 bp clonado en el vector de expresión pEE 12 en un Hind IIl/EcoR I. 3. Plásmido MF4260; la cadena pesada IgGl humana se asoció con la región CD18 VH humanizada que tiene las mutaciones Leu236 a Ala y Gly238 a Ala así como un sitio de restricción Spe I introducido en una región marco 4 clonada en pUC 18. El propósito del sitio de restricción Spe I es permitir separación y recombinación de diferentes regiones variables. El gen de región CD 18 VH se corta del plásmido MF 4260 por digestión con Spe I y Hind III y el vector restante, ahora tiene sólo la región constante de cadena pesada relevante, se purifica utilizando Geneclean. Se liga con el ADN de región VH humanizado de NSM 4.7.2.4 que se ha aislado del plásmido 2555 Mut en la misma forma. El producto se emplea para transformar células "Sure" y se verifican colonias por la presencia del inserto de cadena pesada completo de 1400 bp esperado. El inserto de región constante VH completo se corta del vector pUC por digestión con Hind III y EcoR I. El fragmento de 1400 bp se purifica utilizando QiaexII (Qiagen) y después liga a su vez en el vector pEE6 que se ha cortado previamente con las mismas enzimas. La siguiente etapa fue cortar los genes de cadena pesada CD4 del vector pEE6 y clonarlos en pEE12, que ya contiene el gen de cadena ligera CD4 humanizado (plásmido 2798) . El vector pEE6 se digirió con Sal I y Bgl II y el vector pEE12 se digiere con Sal I y BamH I para crear los sitios apropiados para volver a ligar. La construcción de vector final se verifica por digestiones de restricción con Hind III, EcoR I, Sal I y Spe I por la presencia del fragmento esperado, es decir cadena ligera de 700 bp, cadena pesada de 1400 bp, fragmento de pEE6 de 2300 bp y fragmento de pEE12 de 7000 bp. El vector pEE12 se lineariza por digestión con Sal I y transfecta en células NSO por electroporación como con anterioridad. Las mezclas de transfeccion se cultivaron en seis placas de 96 pozos, y de 90 pozos de desarrollo que se probaron, todos fueron positivos para producción de cadenas ligera y pesada humanas. En esta etapa, una muestra del 7ADN vector pEE12 se digirió con Sal I y precipitó con etanol . Transfeccion y Selección de Transfector Final El vector de expresión de ADN TRX1 "pTX/C4" se transfecta en células CHO/dhfr de crecimiento exponencial que se expandieron del " CHODHFR-MCB 1 padre". El TRX1 DNA se linearizó y (10) µ?> del TRX1 DNA se agregan a 1 mi (3 x 106 células) de células CHO/dhfr de crecimiento exponencial en una cuba de electroporación en hielo. Las células se transíectaron (utilizando un BioRad Gene Pulser II) ajustado a 1000 volts, capacitancia de 25 microfarads, y resistencia de 8 ohms . Después de electroporación, las células se colocaron en hielo por 10 minutos seguido por adición a un matraz de cultivo de tejido T25 e incubaron en un incubador a 37 grados C, C02 al 5%. Se eligieron transformantes para el fenotipo de resistencia a neomicina seguido por selección y amplificación de DHFR + transformantes utilizando un a -MEM suplementado con metotrexato, FBS dializado, irradiado, US sourced al 10% (recolectado en 2001) y neomicina. Células que sobrevivieron en el medio de cultivo que contiene metotrexato y neomicina se supervisaron por productividad y clonaron por dilución limitante en placa de 96 pozos. Estos clones después se supervisaron para altos productores. El subclon "E9/3A2" se encontró que tiene la más alta productividad específica. Este clon se elige y subsecuentemente se expande para preparación de un material pre- sembrado . Purificación del anticuerpo Sobrenadante de cultivo se purifica al utilizar el sistema de cromatografía Biopilot (Pharmacia) en tres etapas como sigue: (1) Cromatografía de afinidad en una columna de proteína A-sefarosa de flujo rápido (2) Cromatografía de intercambio de iones en S-sefarosa de flujo rápido (3) Cromatografía de exclusión de tamaño en Superdex 20. El producto purificado se filtró y reunió en un solo biocontenedor . A través del proceso de purificación, se toman precauciones para asegurar que el sistema permanece aséptico. Todos los amortiguadores y reactivos se pasan a través de un filtro con membrana de 0.2 miera y el producto purificado también se pasa a través de un filtro de 0.2 miera antes de recolectarse. Después de que se ha procesado un lote de anticuerpo, todo el sistema de cromatografía y columnas se desinfectan con NaOH al 0.5M, lavan PBS estéril y almacenan en etanol al 20%. Antes de que se utilice de nuevo, el etanol se lava con PBS estéril y se lleva a cabo una prueba completa. Muestras de amortiguadores y eluatos de columna se verifican para nivel de endotoxina. Ej emplo 2 ; Construcción de anticuerpo TRX1 partiendo de secuencia de nucleótidos Clonación de regiones constantes humanas Región constante de cadena pesada La región constante de cadena pesada gamma 1 humana (IgGl) se amplifica a partir de CDNA de leucocitos humanos (CDNA QUICK-CloneMR Cat . No. 7182-1, Clontech) utilizando el siguiente conjunto cebador y clona en pCR-Script (Stratagene) . El plásmido que contiene la región constante de cadena pesada gamma 1 humana en pCR-Script se designa pHC/-l. cebador hc/-I (SEQ ID No.51) Spe I cebador 5 ' : 51 - ACT AGT CAC AGT CTC CTC AGC cebador he/ -2 (SEQ ID No.52) EcoR I Cebador 31 : 5 ' - GAA TTC ATT TAC CCG GAG ACA G Mutaciones sin enlace a Fe (Leu236Ala, Gly238Ala) se efectúan en la región constante de cadena pesada por mutagénesis dirigida por sitio utilizando el siguiente cebador y equipo de mutagénesis dirigida por sitio TransformerMR de Clontech (Cat. No. K1600-1) . El plásmido que contiene la región constante mutante sin enlace a Fe de cadena pesada gamma 1 humana en pCR-Script, se designa pHC^ -lFcmut . cebador he ? -3 (SEQ ID No.53) Fe raut oligo: 5'- CCG TGC CCA GCA CCT GAA CTC GCG GGG GCA CCG TCA GTC TTC CTC CCC C Región constante de cadena ligera La región constante de cadena ligera kappa humana se amplifica de cDNA de leucocitos humanos (cDNA QUICK-CloneMR Cat . No. 7182-1, Clontech) utilizando el siguiente conjunto cebador y clona en pCR-Script (Stratagene) . El plásmido que contiene la región constante de cadena ligera kappa humana en pCR-Script, se designa pLC/c-l. cebador lc/ -1 (SEQ ID No. 54) Kpn I cebador 5 ' : 5 ' - GGT ACC AAG GTG GAA ATC AAA CGA AC cebador ICK -2 (SEQID No. 55) Hind III Cebador 3 ' : 5 ' - AAG CTT CTA ACA CTC TCC CCT GTT G Síntesis, construcción y clonado de regiones variables TRX1 Las regiones variables de cadena pesada y ligera se construyen a partir de un conjunto de oligonucleótidos sintéticos complementarios y parcialmente superpuestos, que abarcan todas las regiones variables. El conjunto de oligonucleotidos empleado para cada región variable se muestra a continuación. Oligonucleotidos sintéticos de región variable de cadena pesada Cebadores de región variable de cadena pesada con hebra de codificación cebador hv-1 (1-72) + 6 enlazadores nucleótidos (SEQ ID No.56) 5'- aagctt ATG GAA TGG ATC TGG ATC TTT CTC CTC ATC CTG TCA GGA ACT CGA GGT GTC CAG TCC CAG GTT CAG CTG GTG cebador hv-2(120 - 193) (SEQ ID No. 57) 5 ' - C TGT AAG GCT TCT GGA TAC ACA TTC ACT GCC TAT GTT ATA AGC TGG GTG AGG CAG GCA CCT GGA CAG GGC CTT G cebador hv-3 (223 - 292) (SEQ ID No.58) 5 ' - GGT AGT AGT TAT TAT AAT GAG AAG TTC AAG GGC AGG GTC ACA ATG ACT AGA GAC ACA TCC ACC AGC ACA G cebador hv-4 (322 - 399) (SEQ ID No. 59) 5 ' - GAG GAC ACT GCG GTC TAT TAC TGT GCA AGA TCC GGG GAC GGC AGT CGG TTT GTT TAC TGG GGC CAA GGG ACA CTA GT Cebadores de región variable de cadena pesada sin hebra de codificación cebador hv-5 (140 - 51) (SEQ ID No.60) 5 ' - GTG TAT CCA GAA GCC TTA CAG GAC ACC TTC ACT GAA GCC CCA GGC TTC TTC ACT TCA GCT CCA GAC TGC ACC AGC TGA ACC TGG GAC TGG cebador hv-6 (246 - 170) (SEQ ID No.61) 5 ' - CTT CTC ATT ATA ATA ACT ACT ACC GCT TCC AGG ATA AAT CTC TCC CAT CCA CTC AAG GCC CTG TCC AGG TGC CTG CC cebador v-7 (342 - 272) (SEQ ID No.62) 51 - GTA ATA GAC CGC AGT GTC CTC AGA CCT CAG GCT GCT GAG TTC CAT GTA GAC TGT GCT GGT GGA TGT GTC TC Oligonucleótidos sintéticos de región variable de cadena ligera Cebadores de región variable de cadena ligera de hebra de codificación cebador lv-1 (1 - 63) + 6 enlazador nucleótido (SEQ ID No.63) 5 ' - gaattc ATG GAG ACA GAC ACA ATC CTG CTA TGG GTG CTG CTG CTC TGG GTT CCA GGC TCC ACT GGT GAC cebador lv-2 (93 - 158) (SEQ ID No.64) 5 ' - GGC TGT GTC TCT AGG TGA GAG GGC CAC CAT CAA CTG CAA GGC CAG CCA AAG TGT TGA TTA TGA TGG cebador lv-3 (184 -248) (SEQ ID No.65) 5 ' - CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC AAA CTC CTC ATC TAT GTT GCA TCC AAT CTA GAG TCT GGG GTC CC cebador lv-4 (275 -340) (SEQ ID No.66) 5 * - GGA CAG ACT TCA CCC TCA CCA TCA GTT CTC TGC AGG CGG AGG ATG TTG CAG TCT ATT ACT GTC AGC Cebadores de región variable de cadena ligera de hebra sin codificación cebador lv-5 (109-43) (SEQ ID No.67) 5 ' - CAC CTA GAG ACA CAG CCA AAG AAT CTG GAG ATT GGG TCA TCA CAA TGT CAC CAG TGG AGC CTG GAA C cebador lv-6 (203-138) (SEQ ID No.68) 5 ' - GGT GGC TGT CCT GGT TTC TGT TGA TAC CAG TTC ATA TAA CTA TCA CCA TCA TAA TCA ACA CTT TGG cebador lv-7 (294-228) (SEQ ID No. 69) 5 ' - GGT GAG GGT GAA GTC TGT CCC AGA CCC ACT GCC ACT AAA CCT GTC TGG GAC CCC AGA CTC TAG ATT G cebador lv-8 (378-319) (SEQ ID No.70) 5 ' - GGT ACC TCC ACC GAA CGT CGG AGG GTC CTG AAG ACT TTG CTG ACA GTA ATA GAC TGC AAC Después de purificación con HPLC y remoción de solventes orgánicos, los oligonucleótidos se resuspenden en TE pH 8.0 y fosforilan. Un alícuota de cada oligonucleótido en la región variable respectiva se combina en cantidades molares iguales. Las mezclas de oligonucleótidos se calientan a 68 grados C por 10 minutos y deja que enfríen lentamente a temperatura ambiente. Los oligonucleótidos alineados se extienden entonces para producir fragmentos de DNA de región variable con doble hebra. Para la extensión, dNTPs se agregan a una concentración final de 0.25 mM seguido por un volumen apropiado de amortiguador polimerasa 5X T4 DNA [Tris acetato 165 mM, pH 7.9, acetato de sodio 330 mM, acetato de magnesio 50 mM, 500 µg/ml BSA, DTT 2.5mM] y 4 unidades de T4 DNA polimerasa. La mezcla se incuba a 37 grados C por 1 hora seguido por inactivación térmica de la T4 DNA polimerasa a 65 grados C por 5 minutos.- El DNA de doble hebra es etanol precipitado y resuspendido en el mismo volumen de TE pH 8.0. Un volumen apropiado de amortiguador 5X T4 DNA ligasa [Tris-HCl 250mM, pH 7.6, MgCl2 50mM, ATP 5m , DTT 5mM, polietilen glicol-8000 25% p/v] se agrega entonces al DNA de doble hebra seguido por 2 unidades de T4 DNA ligasa y la mezcla se incuba por 1 hora a 37 grados C para ligar los fragmentos extendidos. La T4 DNA ligasa se termo inactiva a 65 grados C por 10 minutos. Los fragmentos de DNA de región variable son extraídos con fenol, precipitan en etanol y resuspenden en TE, pH 8.0 y clonan en pCR-Script (Stratagene) . El plásmido resultante que contiene la región variable de cadena pesada, se designa pHV-1 y el plásmido que contiene la región variable de cadena ligera, se designa pLV-1. Los vectores de expresión de cadena ligera y pesada finales se construyen en pcDNA 3.1 (Invitrogen) . Para el vector de expresión de cadena pesada, la región constante mutada Fe se libera del plásmido pHC-lFcmut por digestión con Spe I y EcoR I y aisla por electroforesis en gel de agarosa. La región variable de cadena pesada se libera del plásmido pHV-1 por digestión con Hind III y Spe I y aisla por electroforesis en gel de agarosa. Los dos fragmentos en cantidades iguales se ligan en los sitios Hind III/EcoR I de pcDNA3.1(+) (Invitrogen) utilizando técnicas de biología molecular estándar. El vector de expresión de cadena pesada TRXl resultante se designa pTRXl/HC. Similarmente , para el vector de expresión de cadena ligera, la región constante de cadena ligera se libera del plásmido pLC-1 por digestión con Kpn I y Hind III seguido por purificación en gel de agarosa. La región variable de cadena ligera se libera de pLV-1 por digestión con EcoR I y Kpn I seguido por purificación con gel de agarosa. Los dos fragmentos de cadena ligera en cantidades iguales se ligan en los sitios EcoR I/Hind III de pcDNA3.1 ( - ) (Invitrogen) utilizando técnicas de biología molecular estándar dando por resultado el vector de expresión de cadena ligera TRXl pTRXl/LC. Para producción del anticuerpo TRXl, los plásmidos de expresión de cadena pesada TRXl y cadena ligera TRXl se co-transfectan en células CHO utilizando técnicas de biología molecular estándar. Ejemplo 3: Construcción de anticuerpo TRXl aglicosilado Un anticuerpo humanizado, por ejemplo los componentes del anticuerpo humanizado, por ejemplo de cadena ligera y cadena pesada, cada uno que contienen regiones constantes y regiones variables, por ejemplo secuencias de aminoácidos, se ilustran en Seq ID Nos.: 9, 11, 12, 13, 15, y 16 (Figuras 2A, 2C, 2D, 2E, y 2G) se produjeron por un procedimiento similar al del Ejemplo 1. El anticuerpo humanizado es un anticuerpo aglicosilado. Ej emplo 4 : Construcción de anticuerpo TRXl aglicosilado Un anticuerpo humanizado, por ejemplo los componentes del anticuerpo humanizado, por ejemplo de cadena ligera y cadena pesada, cada uno que contienen regiones constantes y regiones variables, por ejemplo secuencias de aminoácidos, se ilustran en Seq ID Nos. : 25, 27, 28, 29, 31, y 32 (Figuras 4A, 4C, 4D, 4E, y 4G) , y se producen por un procedimiento similar al del Ejemplo 1. El anticuerpo humanizado es un anticuerpo aglicosilado . Ejemplo 5; Tratamiento de un primate con anticuerpo TRXl Un mandril que tiene un peso de 4.6 kg recibió un trasplante de riñon con apareamiento incorrecto de otro mandril el día 1 y fue tratado tanto con el anticuerpo CD4 , por ejemplo el anticuerpo humanizado, por ejemplo los componentes del anticuerpo humanizado, por ejemplo cadena ligera y cadena pesada, cada uno que contiene una región constante y una región variable, por ejemplo secuencias de aminoácidos mostradas en Seq ID Nos.: 9, 11, 12,13, 15, y 16, y con un anticuerpo CD8 humanizado de agotamiento, las secuencias de aminoácidos de los cuales se ilustran en SEQ ID Nos.: 33 (Figuras 5A-5C) y 34 (Figura 6) secuencias de ácido nucleico se establecen como SEQ ID Nos.: 75 (Figuras 5A-5C) y 76 (Figura 6) de acuerdo con le siguiente protocolo de la Tabla 1. El animal ha sobrevivido por más de 80 días sin recibir un inmunosupresor . Además excepto por un periodo de aproximadamente dos días, los niveles de creatinina fueron inferiores a 2 mg/dL. TABLA 1 Protocolo Estudio 2 DÍAS 0 1 2 3 4 5 ACCIÓN Tratamientos Trasplante X renal Anticuerpo CD4 X X X (iv)2 Anticuerpo (iv)3 (con . ) DÍAS ACCIÓN Tratamientos Trasplante renal Anticuerpo CD4 (iv)2 Anticuerpo CD8 (iv)3 (cont . ) DÍAS ACCIÓN Tratamientos Trasplante renal Anticuerpo CD4 (iv)2 Anticuerpo CD8 (iv)3 2 Anticuerpo CD4 40 mg/kg el día 0 y 20 mg/kg para todas las otras dosis se administraron por infusión iv durante 1 hora . 3 Anticuerpo CD8 6 mg/kg suministrado como un bolo iv después de la infusión de anticuerpo CD4. Estos materiales y métodos se emplearon en los siguientes ejemplos: Inwunoglobulina equina como una fuente de antígeno Antivenina (polivalente Crotalida) se adquiere de Fort Dodge Laboratories (Overland Park, KS) y reconstituye con diluyente que se proporciona por el fabricante y utiliza como nuestra fuente de Ig equina. La solución se pasa a través de un filtro de jeringa de 2 mieras y agrega al diluir a 25 mg/ml en 0.09% de salino e incuba a 64 grados C por 35 minutos seguido por incubación durante la noche en hielo. EL material se almacenó a -80 grados C a utilizar. La cantidad de material agregado en cada lote se determinó por cromatografía de exclusión de tamaño HPLC y estuvo en rango de 21.2% a 29.9% de proteína total. Producción y purificación de TRXl TRX1 se deriva del hibridoma CD4 antihumano ratón, NSM 4.7.2.4. Los cDNA de cadena pesada y ligera padre, se clonaron de una biblioteca NSM 4.7.2.4 cDNA por hibridizacion cruzada con sondas cDNA de gen de cadena ligera y pesada de rata utilizando técnicas de biología molecular estándar. Análisis de secuencia del cDNA derivado de NSM 4.7.2.4 confirmó el isotipo de cadena pesada que es gamma- 1 y la cadena ligera kappa . Las regiones VH y VL de ratón NSM 4.7.2.4 se reconformaron a regiones VH y VL humanas utilizando cuadros humanos o de "mejor ajuste" con la similaridad de secuencia más alta con la de VH y VL de ratón. Para la cadena ligera, el anticuerpo humano HSIGKA (de EMBL) con una similaridad de secuencia de 79%, se empleó como la secuencia diana. Para cadena pesada, anticuerpo humano A32483 (GenBank) con una similaridad de secuencia de 74% fue empleado. La humanización se realizó por mutagénesis dirigida de sitio de los clones cDNA de ratón. Para eliminar enlace de anticuerpo con receptores Fe así como fijación de complemento, una sola sustitución de aminoácidos se introduce en la región Fe en la posición de aminoácido 297 de la región constante de cadena pesada ? 1 por mutagénesis dirigido por sitio, eliminando el sitio de glicosilación N-enlazada.

Anticuerpo TRX1 se produce en Therapeutic Antibody Centre (Oxford, UK) por fermentación de fibras huecas de transíectados de células CHO . El anticuerpo se purificó del sobrenadante de cultivo por cromatografía de afinidad de proteína A, seguido por intercambio de cationes/aniones, nanof iltración y finalmente cromatografía de exclusión de tamaño. El material purificado se formuló en PBS y almacenó a -80 grados C. Inducción de tolerancia y protocolo de prueba Todo el trabajo con mandriles se realizó en Southwest Foundation for Biomedical Research (San Antonio, TX) bajo un protocolo aprobado por el Institutional Animal Care and Use Committee (Comité de Uso y Cuidado de Animales Institucionales) . Siete a veintiún días antes del estudio, se supervisaron animales por examen físico, CBC y químicas de suero. Números de subconjunto de linfocitos y nivel de expresión CD4 en células CD3+ se determinaron por valores d elínea base. Un segundo conjunto de valores de línea base se recolecta el día -1 justo antes de la primera infusión de salino o TRX1. Los animales fueron sedados con una sola dosis de 10 mg/kg de cetamina más 5 mg de diazepam según se requiera para facilitar el manejo. Infusiones de salino y TRX1 se administraron i. v. a una velocidad de 30 ml/hr. Se supervisaron temperatura, presión sanguínea y respiración durante y después de infusiones. Se examinaron animales para salpullidos o irritaciones de la piel y linfadenopatía al tiempo de cada infusión y al tiempo de recolecciones de muestras de suero subsecuentes. Además, se supervisaron animales diariamente por signos de incomodidad, malestar, artralgia y complicaciones gastrointestinales. La primera dosis de antígeno (Ig equino) fue suministrada el Día 0 como un bolo i.v. de 10 mg/kg. Todas las dosis subsecuentes de Ig equino (Días 4,8, 68, 95 y 130) fueron suministradas como bolos s.c. de 10 mg/kg, excepto por la última prueba el Día 130 que fue de un bolo s.c. de 1 mg/kg . Se inmunizaron animales con SRBC (HemoStat Laboratories, Dixon, CA) para demostrar inmunocompetencia a un neo-antígeno después de exposición a TRX1. Todos los animales recibieron una sola inyección i.v. de una solución SRBC al 10% en salino estéril al 0.9% a una dosis de 1.1 ml/kg el día 68 del estudio. Concentración en suero de TRX1 La concentración de TRX1 en suero se determina por ELISA. 50 µ? de una solución de 5 /¿g/ml de CD4 soluble en PBS (suministrado amablemente por Therapeutic Antibody Centre, Oxford, UK) fueron surtidos en placas de 96 pozos e incubaron durante la noche a 2-8 grados C.

Después de tres lavados con PBS que contiene lacas de Tween 20 al 0.05% (amortiguador de lavado) se bloquearon con BSA al 1%, Tween 20 al 0.05% en PBS (amortiguador de bloqueo) por 1 hora a 37 grados C y almacenaron a 2-8 grados C. Inmediatamente antes de uso, las placas se lavaron tres veces con amortiguador de lavado. Muestras de suero de mandril se prepararon a partir de una solución de partida de 1:10 a 1:100 en amortiguador de bloqueo seguido por 1:10 diluciones en serie y transferencia de 50 µ? de muestra diluida a las placas revestidas con CD4 soluble. Una curva estándar incluida en cada placa se prepara a partir de una solución de 1 µg/ml de TRX1 sin conjugar diluido en serie 1:1. Siguiendo una incubación de 2 horas a 37 grados C, se lavaron placas tres veces y 50 µ? de IgG antihumano asno conjugado con peroxidasa (0.08 ¿xg/ml en amortiguador de bloqueo) se agregan a cada pozo. Las placas se incubaron por una hora a temperatura ambiente, lavaron 3 veces y revelaron. Concentraciones en suero de TRX1 se calcularon de todos los valores OD que caen dentro de la porción lineal de la cuerva estándar TRX1. Respuesta inmune a Ig equino Respuestas de antiglobulina de mandril a Ig equino se determinaron por ELISA. Placas de 96 pozos revestidas con 50 µ?/???? de una solución 10 µg/ml de antivenina en amortiguador de carbonato se incubaron durante la noche a 4 grados C. Después se lavaron placas tres veces y bloquearon por 2 horas a 37 grados C. Después de la etapa de bloqueo, se lavaron placas tres veces y muestras de suero de mandril se agregaron a pozos (50 µ?/????) utilizando un esquema de dilución en serie tres veces empezando con una dilución 1:10 e incubaron por 2 horas a temperatura ambiente. Después de tres lavados, se agregó anticuerpo IgG/IgM antihumano conejo conjugado con peroxidasa (diluido 1/10,000) a cada pozo (50 µ?/????) e incubaron por 1 hora a temperatura ambiente. Después se lavaron placas tres veces y 100 µ? de sustrato se agregan a cada pozo seguido por incubación a temperatura ambiente por 8 minutos. El ensayo se estandarizó al incluir en cada placa un suero de control positivo. El suero de control positivo se obtuvo de un animal inmunizado previamente y se empleó como un estándar en todos los ensayos a una dilución de 1:25,000. El título se define como la recíproca de la dilución que resulta en un valor OD equivalente al doble del valor OD de una dilución 1:25,000 de la norma. Análisis de hemolisis SRBC Respuesta inmune a SRBC se estima por hemolisis. Muestras de sueros se termoactivaron a 56 grados C por 30 minutos seguido por preparación de una serie de dilución doble que empieza a partir de una dilución 1:10 en PBS , más BSA al 0.1%. 100 µ? del suero diluido se combinan con un volumen igual de una solución SRBC al 1% seguido por adición de 100 µ? de complemento de conejillo de indias (Sigma-Aldrich) pre-adsorbido con SRBC diluido 1:10 en PBS. Las placas se incubaron a 37 grados C por 30 minutos. Se define título como la recíproca de la dilución más alta de suero que no provoca hemolisis evidente. Anticuerpos y citometría de flujo Suero de asno normal, biotina IgG antihumano asno, biotina IgGF(ab' ) 2 antihumano asno, IgG-peroxidasa antihumano asno, IgG-biotina asno, IgG/lgM antihumano conejo e IgG-biotina humano, se adquirieron de Jackson ImmunoResearch . CD4 antihumano de ratón conjugado con n FITC, clon M-7441 e IgG2b de ratón conjugado con FITC clon BPC 4, se adquirieron de Ancell, Inc. CD2 FITC antihumano ratón, clon SP34, IgG3 de ratón FITC, y CD45RA-PE antihumano ratón se adquirieron de BD Pharmingen. CD8-PerCP antihumano ratón e IgGI-PerCP ratón se adquirieron de BD Biosciences. Streptavidin-Quantum Red se adquirió de Sigma-Aldrich y perlas estándar conjugadas con Cy5 y FITC de Bangs Laboratories (Fishers, IN) .

Saturación CD4 se determina como una función de sitios CD4 libres en linfocitos en circulación. 100 µ? de sangre entera heparinizada se granulan por centrifugación y retira el plasma por aspiración. Las células se re-suspenden en 100 µ? de una solución 1.0 µ9/p?1 de TRX1 biotinilado o IgG humano biotinilado. Después de una incubación por 20 minutos en hielo, se lavaron las células con 1 mi de amortiguador de lavado e incubaron con 50 µ? de Streptavidin Quantum Red (dilución 1:5 de material) por 20 minutos en hielo. RBC después se lisa por la adición de 2 mi de amortiguador de lisis (NHC1 0.15 , KHC03 lOmM, EDTA disódico 100 µ?) . Las muestras se sometieron a torbellino e incubaron a temperatura ambiente hasta quedar claras (aproximadamente 10 minutos) . Desechos de RBc se retiran por centrifugación y lavado con amortiguador de lavado 1 mi . Las células se fijan por la adición de PBS, formalina al 0.1%. Variación de sensibilidad de fluorescencia intra-día se controló al utilizar perlas estándar conjugadas con Cy5 y FITC. Conteo de linfocitos CD4* El número de linfocitos CD4+ en sangre periférica se determina al multiplicar el conteo de linfocitos absoluto obtenido de datos CBC por el por ciento de linfocitos CD4+. El por ciento de linfocitos CD4+ en sangre entera se determina por citometría de flujo como el por ciento de células CD4+ en la tinción de compuerta de linfocitos con M-T441 conjugado con FITC, un dominio de reconocimiento anticuerpo ratón 2 de CD4 , que no compite con enlace TRX1 con CD4. EL anticuerpo TRX1 empleado en estos ejemplos fue un dominio de reconocimiento de anticuerpo IgGl humanizado 1 de CD4 humano modificado adicionalmente al introducir una sola sustitución de aminoácido (Asn a Ala) en la posición 297 en la región constante de cadena pesada, de manera tal que eliminar un sitio de glicosilación mayor necesario para las interacciones de receptor Fe de alta afinidad y enlace de complemento (Bolt, S. , E. et al . 1993. Eur. J. Immunol. 23: 403; Friend, P. J. ( et al. 1997. Trasplantation 68:1632 ; Routledge, E. G., et al. 1995. Trasplantation 60:847) . Diseño de Estudio Para identificar una especie modelo en donde se prueba inducción de tolerancia con TRX1, una cantidad de primates no humanos se supervisaron incluyendo monos verdes del África, macacos y macacos rhesus, mandriles y chimpancés, para reactividad cruzada con TRX1. Mientras que todos mostraron cierto grado de inmunoreactividad, sólo en chimpancés y mandriles la afinidad de enlace fue comparable con los humanos. De esta manera, el mandril se elige como la especie modelo.

Como un antígeno diana para inducción de tolerancia, se buscó un antígeno modelo, simple, sin embargo clínicamente relevante. Esto permite prueba para tolerancia específica de antígeno así como optimización del protocolo de inducción antes de investigar modelos más complejos tales como trasplantes de órganos y enfermedades autoinmunes . Se eligió una antivenina biológica inmunogénica bien caracterizada o anti-veneno, polivalente Crotálido - una preparación comercial de globulinas de suero inmune equino (Ig equino) aisladas de caballos inmunizados con venenos de serpientes de la subfamilia Crotalinae (Jurkovich, G. J., et al . , 1988. J. Trauma 28:1032; Dart , R. C, y J. McNally. 2001. Ann. Emerg . Med. 37: 181) . Para asegurar inmunogenicidad del Ig equino, el material fue termoagregado y la preparación probada en un experimento piloto para determinar dosis y rutas de administración que generen una respuesta inmune robusta, antes de utilizar en el protocolo de inducción de tolerancia. Para investigar la factibilidad de inducción de tolerancia con TRX1 en mandriles, un protocolo experimental dividido en tres fases - inducción, lavado y prueba (Fig. 9?) fue diseñado e implementado al asignar 21 mandriles (Papio cynocephalus anubis) a uno de 7 grupos (3 animales/grupo) incluyendo 4 grupos experimentales y 3 de control (Fig. 9B) . La rama experimental de la fase de inducción consistió de 4 cohortes de dosis de TRX1 de 1 , 10, 20, o 40 mg/kg por dosis con infusión de 4 veces durante 13 días el día -1, día 3 o 4, día 8 y día 12. Un bolo i.v. de 10 mg/kg de antígeno termoagregado (Ig equino) se suministra el día 0 seguido por los días 4 y 8 con un bolo s.c. de la misma dosis. En la rama de control, los animales en el grupo control I (antígeno solo) fueron sometidos en fusión con un volumen equivalente de salino normal en lugar de TRX1 en cada punto en tiempo exactamente como los animales en los grupos experimentales. El grupo de control II, (TRX1 solo) comprendió dos cohortes, 20 mg/kg y 40 mg/kg de TRX1, dosificadas bajo el mismo programa que los grupos experimentales, pero recibiendo salino normal en lugar de Ig equino durante la fase de formación de tolerancia. Concentraciones en suero de TRX1 se determinaron 24 horas después de la primera dosis de anticuerpo e inmediatamente antes de las tres dosis subsecuentes al igual que semanalmente después. Niveles de suero de TRX1 e Ig equino se supervisaron hasta no ser más detectables (fase de lavado) en ese tiempo todos los animales fueron sometidos a prueba por inyección s.c. con Ig equino termoagregado (fase de prueba) .

Exam lo 6. TRX1 suprime la respuesta humoral durante inducción sin agotamiento de células T. Un incremento dependiente de dosis en concentración de suero TRX1 fue evidente 24 horas después de la primera dosis en el rango de un promedio de 15.6 _+ 4.1 µ9/p?1 (n=3) en animales que reciben 1 mg/kg hasta un promedio de 542.5 + 138.1 µ9/?t?1 (n=6) en aquellos que reciben 40 mg/kg (Fig. 10A) . Concentraciones en suero de TRX1 determinadas inmediatamente antes de dosis subsecuentes indicaron una acumulación de dosis de TRX1 en los animales tratados con 20 mg/kg y 40 mg/kg, con concentraciones de nivel pasante promedio que aumentan después de cada dosis. Concentraciones en suero de TRX1 mínimas ocurrirán entre la primera y segunda dosis de anticuerpo y estuvieron en el rango de 39.4 + 18.0 /g/ml (n=6) por 20 mg/kg de animales tratados con TRX1 hasta un promedio de 162 + 63.3 µg/ml (n=6) para aquellos que reciben 40 mg/kg de TRX1. No hubo acumulación de dosis de TRX1 en animales que reciben 1 mg/kg o 10 mg/kg de TRX1 como concentraciones a nivel pasante determinadas inmediatamente antes de las últimas tres dosis de anticuerpo, estuvieron por debajo del límite de detección del ensayo (0.2 g/ml) al igual que aquellas en los animales del grupo de control I, es decir aquellas que reciben sólo antígeno. Una desviación del protocolo al tiempo de la segunda infusión TRXl eliminó un animal (#16250) de mayor estudio en el grupo de control II de sólo 20 mg/kg de TRXl. TRXl se detecta por citometría de flujo en linfocitos CD3+ utilizando IgG antihumano asno F(ab')2 biotinilado. Veinticuatro horas después de la primera infusión, valores MCF estuvieron bien por encima de los valores de línea base y permanecieron así a través del periodo de tratamiento empezando un retorno a nivel de línea base el día veintisiete. TRXl fue indetectable en células al día 48. Para determinar el nivel de saturación CD4 por TRXl, se agregó TRXl biotinilado a muestras de sangre entera y se estimó la tinción de células por citometría de flujo (Figura 10B) . Como se espera de los datos de concentración en suero TRXl, sitios CD4 libres se detectaron fácilmente en el grupo de TRXl 1 mg/kg. Excepto por el punto en tiempo inicial de 24 horas, valores MCF determinados para muestras obtenidas justo antes de dosis de TRXl los días 3, 8 y 12 en el grupo 1 mg/kg, solo estuvieron ligeramente por debajo de los valores de línea base promediando 89.5% de línea base (rango, 86.0% - 92.9%), o 10.5% saturado. Sitios de enlace libre también se detectaron en el grupo TRXl de 10 mg/kg de muestras tomadas justo antes de la dosis de TRXl los días 3, 8 y 12 con un valor MCF promedio de 25.8% de línea base (rango, 19.3% - 33.4%) durante la fase de inducción, indicando que 74.2% de los sitios estaban saturados. El grupo de 20 mg/kg promedió 14.9% de tinción MCF de línea base (rango, 10.2% -18.2%), o 85.1 % saturado, durante la fase de inducción mientras que el grupo de 40 mg/kg promedió valores MCF de 9.5% de línea base (rango 8.1% - 10.7%), o 90.5% saturado. Al día 20, una semana después de la última dosis de TRXl, valores MCF tanto para los grupos de 1 mg/kg y 10 mg/kg de TRXl regresaron a línea base, mientras que la tinción del grupo 20 mg/kg de TRXl indicó el número de sitios CD4 libres a aproximadamente 25% de línea base. El grupo 40 mg/kg de TRXl mantuvo saturación máxima el día 20, pero se detectaron sitios CD4 libres el día 27, con valores MCF promedio a 24.7% de línea base, reflejando 75.3% de saturación. El día 48, valores MCF regresaron a línea base tanto para los grupos de 20 mg/kg y 40 mg/kg de TRXl. La reaparición de sitios CD4 libres correlacionada con la reducción en concentraciones en suero de TRXl durante la fase de lavado con tinción TRXl biotinilado empezando primero para aumentar una vez que niveles en suero TRXl cayeron por debajo de aproximadamente 10 µg/ml. Un animal en el grupo experimental TRXl de 20 mg/kg (#15983) mostró un retorno más rápido a línea base de sitios CD4 libres así como una liberación más rápida de TRXl del suero. Esto se debió a que el desarrollo de una respuesta inmune contra TRXl se confirmó subsecuentemente por ELISA. Se nota que este animal tuvo el nivel pasante de concentración de suero TRXl más bajo de todos los animales en el grupo TRXl de 20 mg/kg, 13.4 µg/ml el día 4, entre la primer y segunda dosis del anticuerpo. Todos los otros animales en el grupo tuvieron concentraciones en suero de TRXl _> 35.0 µg/ l. Datos de este animal no se incluyen en los cálculos promedio del grupo de 20 mg/kg. Todos los cálculos en los grupos experimentales de TRXl 1 mg/kg (3/3) y 10 mg/kg (3/3) hicieron una respuesta inmune a TRXl detectable por ELISA, 7 a 10 días después de la primer dosis de anticuerpo. Solo otro animal (#16313) hizo una respuesta inmunodetectable a TRXl, ocurriendo esto en el grupo de control II TRXl de 40 mg/kg. Sin embargo, esta respuesta no fue detectable hasta el día 27, más de dos semanas después de la última dosis de TRXl. No se observaron eventos adversos relacionados a tratamiento durante infusiones o en cualquier tiempo después de dosis TRXl por la duración del estudio. Conteos de sangre completos y datos de citometría de flujo no mostraron agotamiento aparente de los linfocitos CD4+ en cualquier dosis. Mientras que la variabilidad día-a-día en conteo de linfocitos fue evidente, no se observaron diferencias significantes entre animales tratados con TRX1 de aquellos que reciben salino, ni hubo ninguna diferencia dependiente de dosis evidentes entre los animales tratados con TRX1 (Figura 10C) . Similar a la evaluación in vitro, solo una modulación CD4 modesta de la superficie celular se observó. Administración de TRX1 resulta en una inhibición dependiente de dosis de la respuesta humoral a Ig equino durante las fases de inducción y lavado (Figura 11A) . No se detectó respuesta inmune a Ig equino en ninguno de los animales en el grupo experimental TRX1 de 40 mg/kg a través de este periodo. Sin embargo, una elevación en los títulos promedio contra Ig equino fue evidente para el grupo experimental TRX1 de 20 mg/kg. Dos de tres animales en este grupo, #16276 y #16096, respondieron con títulos pico máximos inferiores a 10 veces sobre la línea base, ocurriendo esto el día 27 después de un retorno a la línea base por el día 48. El animal #15983, el mismo animal en el que se observó una respuesta inmune a TRX1 , montó una respuesta más grande y más substancial a Ig equino durante estas fases de inducción y lavado que alcanzan pico el día 41 a > 25-veces sobre la línea base y que permanecen > 10 sobre la línea base a través de la fase de lavado. Superiores títulos también fueron evidentes tanto en los grupos experimentales TRXl 1 mg/kg como 10 mg/kg así como el grupo de control I (antígeno solo) . Sorprendentemente, títulos promedio para el grupo experimental de TRXl 1 mg/kg fueron de aproximadamente 10 a 15 veces sobre aquellas para el grupo de control I . Una explicación para esta respuesta aparentemente mejorada puede ser el cebar epítopes Ig humanos reactivos cruzados con Ig equino . Ejemplo 7. TRXl induce hipo - respuesta y tolerancia específica de antígeno Una vez que niveles en suero de TRXl cayeron por debajo del límite de detección, se estimó la tolerancia a Ig equino al probar animales con antígeno termo-agregado inmunogénico y medir la respuesta inmune humoral específica resultante. Primero se probaron animales por administración s.c. de 10 mg/kg de Ig equino el día 68. Todos los animales en los grupos de dosis TRXl de 1 mg/kg y 10 mg/kg generaron una inmunorespuesta secundaria robusta de Ig equino, con título de anticuerpo promedio de grupo cercanamente que corresponde al grupo de control I (Fig. 11B) . La respuesta se caracterizó por un aumento rápido en título de anticuerpo así como superiores títulos máximos comparados con la respuesta observada en estos grupos durante la fase de formación de tolerancia. Sin mostrar evidencia de tolerancia a Ig equino, animales de los grupos experimentales TRX1 de 1 mg/kg y 10 mg/kg se liberaron del estudio después de la primera prueba. El grupo de control II, que recibe antígeno por primera vez el día 68, respondió con un título de anticuerpo promedio de grupo a Ig equino que aumenta más lentamente que la respuesta de recuperación en el! grupo de control I (Fig. 11B) , como se esperaría de una respuesta primaria. Títulos promedio de grupo para los grupos experimentales TRX1 de 20 mg/kg a 40 mg/kg también aumentaron en respuesta a prueba, pero con títulos pico significativametne reducidos (50- a 250-veces) en comparación con el grupo de control I (Fig.l IF) . Uno de tres animales en el grupo experimental TRX1 de 20 mg/kg respondió a la prueba con un aumento en el título similar al grupo de control I, ocurriendo esto en el animal #15983, que también generó una respuesta inmune a TRX1 durante las fases de inducción y lavado. Los otros dos animales en este grupo, #16276 y #16096, fueron de hipo-respuesta a la prueba, con respuesta pico promedio máxima de 10 veces menos que el grupo de control I. En el grupo experimental TRX1 de 40 mg/kg TRX1 un animal, #16192, tuvo similar hipo-respuesta a la prueba con los otros dos animales en este grupo #16178 y #16286, que no muestran respuesta a la prueba.

Para demostrar que la falla en montar una respuesta inmune vigorosa sobre la prueba de antígeno en los grupos experimentales TRXl de 20 mg/kg y 40 mg/kg, fueron específicos de antígeno y no la consecuencia de inmuno- supresión relacionada al tratamiento, se estimó inmuno-competencia al inmunizar todos los animales con un antígeno de tercera parte, SRBC, al tiempo de la primera prueba el día 68. Todos los grupos montaron una respuesta hemolítica anti-SRBC esencialmente equivalente a esta prueba (Fig. 11C) , que se confirmó que es predominantemente IgG por ELISA. Los grupos de control I y II así como los grupos experimentales TRXl 20 mg/kg y 40 mg/kg fueron de nuevo sometidos a prueba con Ig equino 10 mg/kg el día 95 y de nuevo el día 130 con 1 mg/kg de Ig equino (Fig. 12A) . Todos los grupos de control, antígeno solo y TRXl solo, mostraron un refuerzo similar en la respuesta humoral a Ig equino demostrando adicionalmente que el tratamiento de TRXl solo no induce inmunosupresión de larga duración. Sin embargo, títulos promedio de grupo para los grupos experimentales de 20 mg/kg y 40 mg/kg fallaron en elevar sobre los títulos pico máximos de la primera prueba, incluso con pruebas repetidas. Para animales en el grupo experimental TRXl de 20 mg/kg, excluyendo el animal #15983, títulos máximos ocurrieron después de la primer prueba con títulos pico de 269 y 145 para los animales #16096 y #16276, respectivamente. Respuestas pico disminuyeron entonces ante prueba repetida a 35 y 92, respectivamente, después de la primer prueba (Fig. 12A) . Títulos promedio de grupo en el grupo experimental TRX1 de 40 mg/kg, fueron consistentemente menores que aquellos del grupo de 20 mg/kg con un solo animal #16192, que representa esencialmente toda la respuesta con un título pico máximo de 313 después de la primer prueba. Como con los animales en el grupo TRX1 de 20 mg/kg, la respuesta pico a cada prueba subsecuente fue menor que para la prueba previa con la respuesta del animal #16192 que declina a un título pico de solo 39 después de la primer prueba con antígeno (Fig. 12B) . Los otros dos animales en el grupo experimental TRX1 de 40 mg/kg, #16178 y #16286, virtualmente no generaron inmuno-respuesta detectable a Ig equino ante prueba repetida (Fig. 12B) . Un segundo estudio (3 animales/grupo) se realizó con la dosis TRX1 de 20 mg/kg reduciendo el número de dosis TRX1 de 4 a 3 pero administrándolas cada día salteado, los días -1, 1 y 3. Un grupo de control (grupo de control I) también se incluyó con animales que reciben infusiones salinas en lugar de TRX1. Dosis Ig equina estuvo sin cambio con los animales que reciben 3 dosis de 10 mg/kg los días 0, 3 y 8. Como en el primer estudio, administración de TRX1 resultó en una supresión de la respuesta humoral a Ig equino durante las fases de inducción y lavado, en comparación con el grupo de control I con un animal, #16224, que representa esencialmente toda la respuesta detectable (Fig. 13A) . El día 68 con niveles de suero de TRX1 por debajo de niveles detectables, los animales se probaron con el grupo de control Ig equino I respondieron como se esperaba con un aumento rápido y robusto en título a una respuesta pico promedio de 7652. En el grupo tratado TRX1 20 mg/kg, el animal #16224 mostró un aumento rápido en el título similar al grupo de control, animales con un título pico máximo de 6139. Sin embargo, otros dos animales en el grupo #12093 y #16130, tuvieron hipo-respuesta a la prueba que genera títulos pico de 37 y 161, respectivamente. Una segunda prueba el día 97 produce sólo un ligero aumento en el título a 20 y 26 para los animales #12093 y #16130, respectivamente, que bajó rápidamente a la línea base. Estos dos animales no mostraron respuesta a una tercera prueba con antígeno. Como en el estudio previo, todos los animales respondieron a inmunización de neoantígeno SRBC al tiempo de la primera prueba el día 68.

Al aumentar la dosis TRX1 a 20 mg/kg, se indujo y por hipo-respuesta en dos de tres animales con el título de respuesta máximo que disminuye después de cada prueba subsecuente. A las dosis de 40 mg/kg dos a tres animales completamente no respondieron a múltiples pruebas de antígeno y la tercer inmuno-respuesta de antígeno con título de respuesta pico de nuevo que disminuye con cada prueba de antígeno. Estudios en ratones han demostrado que tres dosis de 20 a 25 mg/kg de un anticuerpo anti-CD4 sin agotamiento, administrados cada día salteado, fueron suficientes para inducir la tolerancia, aunque el tiempo requerido para que la tolerancia sea evidente fue de aproximadamente un mes después de inicio de la dosis. La dosis TRX1 de 20 mg/kg fue modificada, administrando tres dosis cada día salteado, empezando un día antes de la administración del antígeno. Con esta modificación, dos de tres animales se volvieron completamente sin respuesta a la prueba de antígeno después del período inicial de hipo-respuesta. En humanos la reducida inmunogenicidad y farmacocinética mejorada pueden soportar una dosis eficaz inferior de TRX1. Por ejemplo, mientras que se ha detectado una inmunorespuesta contra TRX1 en todos los mandriles que reciben solo una dosis del anticuerpo (n=9) , no se ha detectado inmunorespuesta a TRX1 después de una sola dosis del anticuerpo en humanos (n=9) . Aún más, un aumento de 2.5 veces en la vida media en suero de TRXl en humanos deberá permitir una cobertura CD4 sostenida con menos anticuerpo comparado con mandril . No se asociaron eventos adversos agudos con cualquier dosis de TRXl, y aquellos regímenes de dosificación que resultaron en hipo-respuesta a intolerancia, mientras que claramente inmunosupresores durante la fase de inducción, no estuvieron asociados con ningunos efectos laterales clínicos o histopatológicos . Animales tratados con TRXl no se alojaron en aislamiento o en condiciones libres de patógeno específicas o libres de gérmenes. A pesar de saturación virtualmente completa de sitios CD4 en linfocitos periféricos por al menos 21 días, no se encontró evidencia por predominancia incrementada de parásitos entéricos o infecciones bacterianas, fúngales o virales oportunistas, o recrudescencia de virus endógenos durante el tratamiento de TRXl en ningún tiempo posterior. Se nota que la falla de TRXl en inducir auto tolerancia en el animal #16313 del grupo de control II puede deberse a infección aguda durante la fase de inducción de tolerancia con el virus SA8 , un virus alfa herpes predominante en la colonia de mandriles de los cuales se obtuvieron todos los animales en el estudio.

El animal #16313 se volvió sero positivo a SA8 durante la fase de inducción, mientras que todos los otros animales ya fueron sero positivos antes del estudio o permanecieron sero negativos a través del estudio. Ejemplo 8. Anticuerpo anti-CD4 tiene efectos en monocitos/macrófagos En este ejemplo, monocitos de sangre periférica humana se incubaron con nada, IgG humano anti-CD4 (TRX1) o anticuerpo CD8 aglicosil por 3, 4, o 5 días. RNA se analizó por PCR cualitativo para niveles de mensaje FcyRIIa y FygRIIB. Incubación de TRX1 se encuentra que aumenta el nivel de mensaje FcyRIIa y FcyRIIb. acrófago/monocito humano tratado con TRX1-también se tiñó para CD14, CD83, CD16, CD32, CD80, CD86, MHCII, CDllb, CD62L, CCR2 , y CXCR4. El fenotipo de las células tratadas se determinó como CD14 ligero con expresión reducida de D86, CDllb, CCR2 y CXCR4. Las células aumentaron la expresión de CC16 (Fc^RIII) , CD32 (Fc/RII) y clase HC II. El efecto máximo en expresión de Fc^RIIb (que conoce inhibe señales inflamatorias suministradas por FcyRIIa y Fc^RIII) se observa después de 4 a 7 días. Macrófagos/monocito murino tratado con CD4 también produjeron cantidades menores de citocinas inflamatorias (por ejemplo IL4, IFNy , GM-CSF) y más citocinas asociadas con el desarrollo de células Treg (por ejemplo IL-10 y TGFß ) . Monocitos humanos se prepararon a partir de sangre entera por aislamiento de PBMC en Ficoll y después separar los monocitos de los linfocitos utilizando un equipo de selección negativa compuesto por perlas magnéticas acopladas con anticuerpos que reconocen todos los tipos de células excepto monocitos y después remoción de las células etiquetadas con una máquina de clasificación de células MACS . Monocitos purificados se incubaron con nada, IgG humano (100 /¿g/ml o 50 µg/ml) , TRX1 (50 ¿¿g/ml o 10 µg/ml) o anticuerpo CD8 anti-humano aglicosilo (50 ^g/ml o 10 µg/ml) por 5 días. En este punto, las células se lavaron 3 veces en medio fresco para retirar cualquier anticuerpo residual y revistieron con células T humanas purificadas alogénicas (también purificadas utilizando perlas magnéticas en un proceso de selección negativa) en una proporción de dos células T: un monocito. Después de 5 días, los cultivos se alimentaron con medio que contiene 3H-timidina, para medir las células de división y cultivo se recolectaron 18 horas después. Se expresaron datos como el por ciento de timidina incorporada en pozos que contienen monocito sin tratar y células T. Mientras que anticuerpo anti-CD8 no tuvo efecto en respuesta MLR (o una respuesta ligeramente incrementada) anti-TRXl tanto en 50 como en 10 yg/ml redujeron la respuesta a niveles por debajo de por ciento del control. El IgG humano a 50 ug/ml de respuesta fue aproximadamente 90 por ciento de control . Numerosas modificaciones y variaciones de la invención son posibles a la luz de las enseñanzas anteriores; por lo tanto, dentro del alcance de las reivindicaciones anexas, la invención puede practicarse de otra forma a como se describe particularmente. Equivalentes Aquellos con destreza en la técnica reconocerán o serán capaces de evaluar utilizando no más que experimentación rutinaria, numerosos equivalentes a los polipéptidos específicos, ácidos nucleicos, métodos, ensayos y reactivos aquí descritos. Estos equivalentes se consideran dentro del alcance de esta invención y se cubren por las siguientes reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un método para tratar un primate para inducir tolerancia a cuando menos un antígeno extraño, que comprende, administrar al primate al menos un anticuerpo anti-CD4 o su fragmento de enlace CD4 , en donde el anticuerpo anti-CD4 como mínimo se administra a una dosis entre aproximadamente 20 mg/kg a 40 mg/kg en cuando menos tres dosis separadas.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque al menos un anticuerpo anti-CD4 se administra a una dosis de aproximadamente 20 mg/kg.
3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque al menos un anticuerpo anti-CD4 se administra en cuando menos cuatro dosis separadas.
4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque al menos un anticuerpo anti-CD4 se administra cuando menos en cinco dosis separadas.
5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque cuando menos un anticuerpo anti-CD4 se administra en al menos los días 1, 3 o 4, 8 y 12 respecto a la administración del antígeno extraño.
6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque cuando menos el anticuerpo anti-CD4 se administra en al menos los días -1, 1, y 3 respecto a la administración del antígeno extraño.
7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el antígeno extraño es un antígeno soluble.
8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la primera dosis de al menos un anticuerpo anti-CD4 se administra antes de administración del antígeno extraño.
9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque cuando menos un anticuerpo anti-CD4 se humaniza y modifica para reducir un receptor Fe y ligar complemento.
10. Un método para tratar un primate para inducir tolerancia a cuando menos un antígeno extraño, que comprende, administrar al primate al menos un anticuerpo anti-CD4 o su fragmento de enlace CD4 , en donde al menos una dosis del anticuerpo anti-CD4 como mínimo se administra al menos un día antes de administración del antígeno extraño.
11. Un método para tratar un primate para inducir tolerancia cuando menos a un antígeno extraño que comprende administrar al primate cuando menos un anticuerpo anti-CD4 o su fragmento de enlace CD4 , en donde al menos un anticuerpo anti-CD4 se administra a una dosis suficiente para mantener una concentración en suero del anticuerpo anti-CD4 a un nivel de aproximadamente 20 ? g/ l durante la fase de inducción de tolerancia.
12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque al menos una dosis del anticuerpo anti-CD4 como mínimo se administra un día, antes de administración del antígeno extraño.
13. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque al menos un anticuerpo anti-CD4 se administra a una dosis entre aproximadamente 20 mg/kg y 40 mg/kg.
14. Un método para tratar a un primate, para inducir tolerancia a cuando menos un antígeno extraño, caracterizado porque comprende administrar al primate cuando menos un anticuerpo anti-CD4 o su fragmento de enlace CD4 en donde al menos el anticuerpo anti-CD4 se administra a una dosis suficiente para lograr aproximadamente 85 por ciento de saturación de los sitios CD4 en células T en el primate durante la fase de inducción de tolerancia.
15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el anticuerpo anti-CD4 cuando menos, no se administra por más de aproximadamente dos semanas.
16. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque al menos una dosis del anticuerpo anti-CD4 como mínimo se administra un día antes de administración del antígeno extraño.
17. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque al menos un anticuerpo anti-CD4 se administra a una dosis entre aproximadamente 20 mg/kg y 40 mg/kg.
18. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque al menos un anticuerpo anti-CD4 es humanizado y modificado para reducir receptor Fe y enlace de complemento.
19. Un método para inducir tolerancia en un primate a un antígeno soluble, caracterizado porque comprende administrar a un primate cuando menos un anticuerpo anti-CD4 o su fragmento de enlace CD4 , en donde el anticuerpo anti-CD4 como mínimo se administra a una dosis entre aproximadamente 20-40 mg/kg en al menos tres dosis separadas, de manera tal que se induzca la tolerancia al antígeno soluble.
20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque al menos una dosis del anticuerpo anti-CD4 como mínimo, se administra un día antes de administración del antígeno soluble.
21. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el anticuerpo anti-CD4 como mínimo se administra a una dosis de aproximadamente 20 mg/kg.