MXPA06011824A

MXPA06011824A - Ensayo para anticuerpos.

Info

Publication number: MXPA06011824A
Application number: MXPA06011824A
Authority: MX
Inventors: Anan Chuntharapai; Yu-Ju G Meng; Kyu Hee Hong
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2004-04-16
Filing date: 2005-04-15
Publication date: 2006-12-15
Also published as: US20070015228A1; IL178509A0; US20080176257A9; AU2005241431A1; CA2563334A1; RU2006145450A; ZA200608572B; WO2005108989A3; KR20070012826A; EP1745288A2; US20060099662A1; BRPI0509419A; WO2005108989A2; CN1997893A

Abstract

La presencia y cantidad de un anticuerpo de interes en la corriente sanguinea del paciente u otra muestra biologica puede servir como una herramienta clinica importante u otra analitica o de diagnostico. Los metodos ELISA y equipos para tales ensayos, asi como anticuerpos anti-idiotipicos e hibridomas que los producen, se desarrollan para detectar niveles del anticuerpo en muestras biologicas, que son de, por ejemplo, modelos animales y pacientes humanos.

Description

de residuos de aminoácidos con cadenas laterales no polares. La gran mayoría de proteínas de transmembrana se glicosilan. Las cadenas oligosacáridas están usualmente presentes en el dominio extracelular . Además, el ambiente reductor del citosol evita la formación de enlaces de disulfuro (S-S) de intracadena (e intercadena) entre residuos de cisterna en las membranas laterales citosólicas. Estos enlaces de disulfuro se forman en el lado extracelular, por ejemplo, entre el dominio de terminal N y un dominio extracelular. Las proteínas de transmembrana son notoriamente difíciles de cristalizar para estudios estructurales de rayos X. Las estructuras tridimensionales dobladas son bastante inciertas para las formas aisladas de estas proteínas. De esta manera, estas características presentan un problema en el intento de utilizar la proteína de transmembrana completa como un objetivo para aislar moléculas que se unirían a ella in vitro. Los receptores acoplados a la proteína G (GPCR) son una superfamilia de proteínas de transmembrana que juegan papeles importantes en el proceso de transducción de señal de una célula. GPCR median las respuestas celulares a una enorme diversidad de moléculas de señalización, incluyendo hormonas, neurotransmisores, y mediadores locales. Las moléculas de señal varían en su estructura y función, incluyendo proteínas y péptidos pequeños, así como también derivados de ácido graso y aminoácido. Ver revisiones por Watson and Arkinstall, The G-Protein Linked Receptor Facts Book (Academic Press, Harcourt Brace & Company, Publishers, London, San Diego, New York: 1994); Proudfoot et al., Nature Review Immunology, _2:106-115 (2002); y Ji et al., J. Biol. Chem. , 273:17299-17302 (1998)). Por ejemplo, se ha encontrado recientemente que los receptores para la relaxin de hormona (LGR7 y LGR8) son receptores acoplados a la proteina G (Hsu et al., Science, 295 : 671-674 (2002)). Relaxin es una hormona importante para el crecimiento y remodelado de tejidos reproductivos y otros durante el embarazo. Hsu et al. demostraron que dos receptores de proteina (proteina G) de unión de nucleótido guanina heterotrimérica huérfanos, LGR7 y LGR8, son capaces de mediar la acción de relaxin a través de una trayectoria dependiente de 3 ' , 5 ' -monofosfato de adenosina (cAMP) distinta de aquella de la insulina estructuralmente relacionada y factor de crecimiento similar a insulina. Estos receptores para relaxin se implican para jugar papeles en funciones reproductivas, cerebrales, renales, cardiovasculares y otras. A pesar de la diversidad funcional y química de las moléculas de señalización que se unen a ellos, todos los GPCRs comparten una similitud estructural en que la cadena polipeptídica se rosca de atrás hacia delante a través de la bicapa de lipido varias veces, por ejemplo, siete veces para formar siete dominios de transmembrana que se conectan por tres ciclos extracelulares y tres ciclos intracelulares . Tanto CCR5 como CXCR4 son receptores de quimoquina que son miembros de la superfamilia GPCR. CCR5 es un receptor para varias quimoquinas CC tales como MlP-la (también nombrada G0S19, LD78, producto genético pAT464, TY5 (murino) y SISOÍ (murino) ) , MIP-?ß (también nombrada Act-2, G- 26, producto genético pAT744, H-400 (murino) y hSISy (murino) ) , y RANTES (célula T normal, regulada en activación, expresada y secretada, o CCL5) (Cocchi et al., Science, 270 : 1811-1815 (1995) y Mellado et al., Annu . Rev. Immunol . , 19:397-421 (2001)). CXCR4 (también nombrada LESTR o fusin antes) es un receptor de quimoquina humana con el motivo C-X-C, y se expresa altamente en leucocitos (Loetscher et al., J. Biol. Chem., 269:232- 237 (1994)). El factor 1 derivado de la célula estromal quimioatrayente de linfocito (o SDF- 1) o CXCL12 es un ligando para CXCR4 (Bleul et al., ature, 382 : 829- 833 (1996)). CXCR4 actúa como un co-receptor de VIH-1 (Feng, Science, 272:872- 877 (1996)). Su expresión también se correlaciona con cáncer, incluyendo cáncer de próstata (Taichman et al., Cáncer Res., _62: 1832-1837 (2002)) y metástasis de cáncer de mama (Muller et al . , Nature, 410:50- 56 (2001) y Moore, Bioessays, 23:674-676 (2001)). Los anticuerpos generados de estos receptores de quimoquina pueden entonces utilizarse para la prevención y/o tratamiento de infección por VIH, cáncer y otras enfermedades asociadas con actividades de quimoquina anormales. Los anticuerpos de cadena única monoclonal de humano contra CCR5 y CXCR4 pueden utilizarse para inhibir infección por VIH de células mononucleares de sangre periférica y quimiotaxis e células de cáncer de mama, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de CCR5 humano tiene siete dominios de transmembrana que se conectan por los ciclos 2, 4, y 6, que son ciclos extracelulares, y por los ciclos 1, 3, y 5, que son ciclos intracelulares . Un modelo para la estructura secundaria de CCR5 humano se proporciona en Blanpain et al., J. Biol. Chem. , 274 : 34719-34727 (1999). Diferentes a CCR5 y CXCR4, ejemplos de un receptor de quimoquina o un receptor huérfano similar al receptor de quimoquina también incluyen, pero no se limitan a, CCR1, CCR2b, CCR3, CCR4, CCR8, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CX 3CR1, STRL33/BONZO, y GPR15/B0B (Berger et al., AIDS, 11, Suppl . a: S3-S16 (1997) y Dimitrov, Cell, 91: 721-730 (1997)). Cada uno o un conjunto de estos co-receptores de VIH pueden mediar la entrada de diferentes cepas del virus de VIH en la célula huésped. La superfamilia de quimoquina comprende dos ramificaciones principales, las a-quimoquinas (o quimoquinas CXC) y las ß-quimoquinas (quimoquinas CC) . La ramificación de a-quimoquina incluye proteínas tales como IL-8, péptido-2 de activación de neutrófilo (NAP-2), actividad estimuladora de crecimiento de melanoma (MGSA/gro o GROA) , y ENA-78, cada uno de los cuales tienen efectos atrayentes y activadores predominantemente en neutrófilos. Los miembros de la ramificación de la ß-quimoquina afectan otros tipos celulares tales como monocitos, linfocitos, basófilos, y eosinófilos (Oppenheim et al., Annu . Re . Immunol . / 9:611- 648 (1991); Baggiolini et al., Adv. Imunol . , 55:97-179 (1994); Miller and Krangel, Crit . Rev. Immunol . , 12:17-46 (1992); José et al., J. Exp. Med., 179:881-118 (1994); Ponath et al., J. Clin. Invest . r 9^7:604-612 (1996)), e incluyen proteínas tales como proteínas quimiotácticas de monocito 1-4 (MCP-1, MCP-2, MCP-3, y MCP-4) , RANTES, y proteínas inflamatorias de macrófago (MIP-la, MIP-?ß) . Recientemente, una nueva clase de quimoquinas unidas a membrana designadas quimoquinas CX3C se ha identificado (Bazan et al., Nature, 385 : 640-644 (1997)). Quimoquinas pueden mediar un rango de efectos pro-inflamatorios en leucocitos, tal como activación de quimiotaxis, degranulación, síntesis de mediadores de lípido, y activación de integrin (Oppenheim et al., Annu . Re . Immunol . , 9:617-648 (1991); Baggiolini et al., Adv. Imunol . , 55:97-179 (1994); Miller and Krangel, Crit. Rev. Immunol., 12^:17-46 (1992)). Por último, ciertas ß-quimoquinas han mostrado suprimir infección por VIH-1 de las estirpes de célula T in vitro (Cocchi et al., Science, 270:1811-1815 (1995) ) . Quimoquinas se unen a siete receptores acoplados a proteina G de expansión sobre la transmembrana (7TMS) (Murphy, Annu. Rev. Immunol . , 12:593-633 (1994)). Algunos de los receptores conocidos para las quimoquinas CC o ß incluyen CCR1, que une ???-?a y RANTES (Neote et al., Cell, 72 : 415-425 (1993); Gao, J . Exp . Med . , 177:1421-1427 (1993)); CCR2, que une quimoquinas incluyendo MCP-1, MCP-2, MCP-3 y MCP-4 (Charo et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 91:2752-2756 (1994); Myers et al., J. Biol. Chem. , 270 : 5786-5792 (1995); Gong et al., J. Biol. Chem., 272:11682-11685 (1997); Garcia-Zepeda et al., J . Immunol . , 157 : 5613-5626 (1996)); CCR3, que une quimoquinas incluyendo eotaxin, RANTES y MCP-3 (Ponath et al., J. Exp. Med., 183:2437-2448 (1996)); CCR4, que se ha encontrado que señala en respuesta a MCP-1, MIP-la, y RANTES (Power et al., J. Biol. Chem. , 270:19495-19500 (1995)); y CCR5, que se ha mostrado que señala en respuesta a MIP-la, ???-?ß, y RANTES (Boring et al., J. Biol. Chem. r 271 (13) .-7551-7558 (1996); Raport, J. Biol. Chem. , 271:17161-17166 (1996); y Samson et al., Biochemistry, 35:3362-3367 (1996) ) . CCR2 se expresa en la superficie de varios subconjuntos de leucocitos, y parece expresarse en dos formas ligeramente diferentes (CCR2a y CCR2b) debido a separación alternativa del mARN codificando la región de terminal carboxi (Charo et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 91:2752- 2756 (1994)). MCP-1 actúa en monocitos, linfocitos y basófilos, incluyendo quimiotaxis, liberación de gránulo, rotura respiratoria, y liberación de citoquina e histamina. Los estudios han sugerido que MCP-1 se implica en la patología de enfermedades tales como artritis reumatoide, ateroesclerosis , enfermedades granulomatosas, y esclerosis múltiple (Koch, J. Clin. Invest., 90:772-79 (1992); Hosaka et al., Clin. Exp. Immunol . , 97:451-457 (1994); Schwartz et al., Am. J. Cardiol., 71 ( 6) : 9B-14B (1993); Schimmer et al., J. Immunol . , 160: 1466-1471 (1998); Flory et al., Lab. Invest., 69:396-404 (1993); Gong et al., J. Exp. Med., 186: 131- 137 (1997)). Adicionalmente, CCR2 puede actuar como un co-receptor para VIH (Connor et al., J. Exp. Med., 185 : 621-628 (1997)). De esta manera, los antagonistas receptores CCR2 pueden representar una nueva clase de agentes terapéuticos importantes . CD20 es una proteína de membrana no glicosilada de 33-36 kDa que existe como variantes de separación alternas diferentes en células B malignas y nórmales. Tiene cuatro regiones hidrofóbicas de separación de membrana con términos intracelulares y un ciclo extracelular de intervención corto de aproximadamente 42 aminoácidos (Tedder et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 85: 208-212 (1988); Einfeld et al., EMBO, 7: 711-717 (1988)). Un anticuerpo anti-CD20 quimérico, rituximab (RITUXAN®) , se ha utilizado para eliminar las células B en pacientes con linfoma no Hodgkin como parte de la terapia estándar. También ha sido eficaz en tratar algunas enfermedades autoinmunes (Boye et al., Annals of Oncology, 14 : 520-535 (2003); Von Schilling et al., Seminars in Cáncer Biology, 13: 211-222 (2003); Kneitz et al., Immunobiology, 206: 519-527 (2002)}. Un anticuerpo humanizado se prefiere para tratamiento a largo plazo de desórdenes asociados con célula B ya que es menos probable que cause respuesta inmune (Boye et al., supra; Maeda et al., International Journal of Hematology, 74 : 70-75 (2001) ) . Sin embargo, el ciclo extracelular pequeño de CD20, que está entre dos regiones de expansión sobre membrana, es difícil de expresar en su conformación nativa, como lo son muchos de los receptores de quimoquina CC y quimoquina CXC. Típicamente, los inmunoensayos para analitos de alto peso molecular, alta concentración en el lugar de venta se predicen en la multivalencia del analito. Por último, el analito se detecta por alguna clase de degradación, ya sea por aglutinación (en ensayos nefelométrico o turbidimétrico) , precipitación (inmunodifusión radial) , o inmunoensayos de intercalación tales como ELISAS. La Pub. de EE.UU. No. US 20020142356 proporciona un método para obtener poblaciones de anticuerpo monoclonal anti-idiotípico dirigidas a un anticuerpo que es específico para un antígeno objetivo de alto peso molecular, alta concentración en donde dichas poblaciones de anticuerpo anti- idiotipico tienen un amplio rango de afinidades de unión para el anticuerpo seleccionado especifico para dicho antigeno objetivo y en donde un subconjunto de dichas poblaciones de anticuerpo anti-idiotipico puede seleccionarse teniendo la afinidad requerida para una aplicación particular. La Pub. de EE.UU. No. US 20020142356 incluye un inmunoensayo competitivo de un antigeno utilizando un anticuerpo como revestimiento y un anticuerpo anti-idiotipico como detección o viceversa. Otras referencias describiendo el uso de un anticuerpo anti-idiotipico como un antigeno subrogado incluyen Losman, Cáncer Research, 55 (23 suppl S) : S5978-S5982 (1995) ; Becker, J. of Immunol. Methods, 192 (1-2): 73-85 (1996) ; Baral, International J of Cáncer, 92(1) 88-95 (2001); y Kohen, Food and Agriculture Immunology, _L2(3> 193-201 (2000) . Los ensayos inmunoabsorbentes enlazados a enzima (ELISAs ) para varios antigenos incluyen aquellos basados en colorimetria, quimiluminescencia y fluorometria . ELISAs se han aplicado exitosamente en la determinación de bajas cantidades de fármacos y otros componentes antigénicos en muestras de orina y plasma, incluyen etapas de no extracción, y son simples de llevar a cabo. ELISAs para la detección de anticuerpos para antigenos de proteina con frecuencia utilizan unión directa de cortos péptidos sintéticos a la superficie de plástico de una placa de microtitulación . Los péptidos son, en general, muy puros debido a su naturaleza sintética y métodos de purificación eficiente utilizando cromatografía de líquido de alto desempeño. Una desventaja de péptidos cortos es que usualmente representan epítopos lineales, pero no conformacionales o discontinuos. Para los presentes epítopos conformacionales , cualquiera de los péptidos largos o la proteína nativa completa se utiliza. La unión directa de los antígenos de proteína al soporte de poliestireno hidrofóbico de la placa puede resultar en desnaturalización parcial o total de la proteína unida y pérdida de epítopos conformacionales . El revestimiento de la placa con un anticuerpo, que media la inmovilización (ELISA de captura) de los antígenos, puede evitar este efecto. Sin embargo, frecuentemente, las proteínas recombinantes sobreexpresadas son insolubles y requieren purificación bajo condiciones desnaturalizantes y renaturalización, cuando los anticuerpos a epítopos conformacionales están por analizarse. Ver, por ejemplo, Pub. de EE.UU. No. 20030044870 para un ELISA genérico utilizando proteínas de fusión recombinantes como proteínas de revestimiento. Previamente, los métodos ELISA a base de célula utilizando células de suspensión vivas para seleccionar hibridomas o para detectar anticuerpos contra antígenos de superficie celular se reportan (Posner et al., J. Immunol . Methods, 48: 23 (1982); Morris et al., Hum¦ Immunol . , 5: 1 (1982); Gruno et al., J. Immunol. Meth., 171: 93 (1994)). La centrifugación se utiliza para las etapas de lavado. Los métodos ELISA celulares simples (CELISA) también se describen (Sedgwick and Czerkinsky, J. Immunol. Meth., 150: 159 (1992)) utilizando suspensión fija a glutaraldehído o formaldehído (Walker et al., J. Immunol. Meth., 154 : 121 (1992); Smith et al., BioTechniques, 22: 952 (1997); Yang et al., J. Immunol. Meth. , 277 : 87 (2003)) o células adherentes (Smith et al., supra) asi como también células secas no fijas (Arunachalam et al., J. Immunol. Meth., 135 : 181 (1990); Schlosser et al. J. Immunol. Meth., 140: 101 (1991)) para detección de anticuerpos contra antigenos de superficie celular o caracterización de moléculas de superficie de célula. Sin el uso de células vivas, existe una alteración potencial del ep topo e CD20 causada por fijación o secado (Barón et al., Scand. J. Immunol., 6_: 385 (1977), Schlosser et al., supra; Sedgwick and Czerkinsky, supra) . Además, Meng et al., "Measuring CD20 binding for humanization of anti-CD20 antibody", FASEB Journal, volumen 18, No. 4, A59, programa no. 85.8 (2004) describe que un anticuerpo anti-idiotipico especifico para un anticuerpo humanizado puede utilizarse en un formato ELISA para medir las concentraciones de suero del anticuerpo para estudios clínicos, pero no contiene detalles. Hong et al., J. Immunol. Meth., 294: 189-197 (2004) describe la célula viva cuantitativa y ELISA a base de anticuerpo anti-idiotípico para anticuerpo humanizado para CD20. Ya que un dominio extracelular soluble de muchos antígenos tal como CD20 y los receptores de quimoquina con la conformación nativa no está disponible como un reactivo de captura para medir en las muestras la concentración de anticuerpo que se une a tal dominio, existe una necesidad de medir concentraciones de anticuerpos que se unen a tales proteínas. También existe una necesidad de detectar anticuerpos humanizados para tales proteínas de superficie celular en muestras biológicas sin también detectar ciertos otros anticuerpos dirigidos o no dirigidos a tales proteínas de superficie de célula, particularmente en muestras clínicas . BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN De acuerdo con lo anterior, la invención es como se reivindica. En una modalidad, un método de ensayo inmunoabsorbente enlazado a enzimas (ELISA) se proporciona para detectar específicamente, en una muestra biológica, un anticuerpo de interés que se une a una proteína multi-transmembrana, superficie celular que comprende un dominio extracelular de intervención de menos de aproximadamente 75 aminoácidos, tal método comprende (a) poner en contacto e incubar la muestra biológica con un reactivo de captura, en donde el reactivo de captura es un anticuerpo anti-idiotipico que se une al idiotipo del anticuerpo de interés pero no al idiotipo de al menos otro anticuerpo en la muestra que se une a la proteina, para unir cualquiera del anticuerpo de interés presente en la muestra, y (b) poner en contacto la muestra, y por lo tanto cualquier anticuerpo unido de interés, con un anticuerpo detectable que se une al anticuerpo de interés, y medir el nivel de cualquiera del anticuerpo de interés unido al reactivo de captura utilizando un medio de detección para el anticuerpo detectable. El reactivo de captura no se une al idiotipo de al menos otro anticuerpo en la muestra que se une a la proteina de manera que el anticuerpo de interés puede distinguirse de tal anticuerpo o anticuerpos presentes en la muestra. Preferentemente, el ensayo es a base de célula . Preferentemente, el anticuerpo de interés es un anticuerpo monoclonal, más preferentemente un anticuerpo humanizado o anticuerpo murino. En otra modalidad preferida, el anticuerpo detectable es un anticuerpo anti-idiotipico detectable que se une al idiotipo del anticuerpo de interés pero no al idiotipo de al menos otro anticuerpo en la muestra que se une a la proteina. El reactivo de captura y anticuerpo detectable puede ser el mismo o diferente.

En otro aspecto preferido, la muestra biológica se aisla de un sujeto humano o sujeto ratón. La muestra biológica es preferentemente, plasma, suero u orina, y más preferentemente suero. Se prefiere además el método en donde la etapa de medición comprende además utilizar una curva estándar para determinar el nivel del anticuerpo de interés comparado con un nivel conocido. En otro aspecto preferido, la proteína es CD20 y el anticuerpo de interés es un anticuerpo 2H7 humanizado. Tal anticuerpo humanizado de interés es preferentemente un anticuerpo intacto o fragmento de anticuerpo que comprende la secuencia de cadena ligera variable: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR (SEQ ID N0:1); y la secuencia de cadena pesada variable: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYN QKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID N0:2) . Donde el anticuerpo 2H7 humanizado es un anticuerpo intacto, preferentemente comprende la secuencia de aminoácidos de cadena ligera: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPG AP PLIYAPSNLASGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID N0:3); y la secuencia de aminoácidos de cadena pesada: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYN QKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSY YFDVWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH PSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKP DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLV GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 4) o la secuencia de aminoácidos de cadena pesada: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYN QKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSY YFDVWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS NSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQ-PREPQVYTLPPSREE TKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:5). En otro aspecto preferido, el reactivo de captura es un anticuerpo monoclonal, preferentemente un anticuerpo murino, y más preferentemente anticuerpo 8A3 o anticuerpo 8C5. Estos anticuerpos tienen el isotipo IgG29. En tal aspecto preferido, el anticuerpo 8A3 puede utilizarse como reactivo d-e captura y anticuerpo detectable, o anticuerpo 8C5 se utiliza como reactivo de captura y anticuerpo 8A3 se utiliza como anticuerpo detectable. En una modalidad aún preferida, el método de ensayo comprende las etapas de: (a) poner en contacto e incubar la muestra biológica con el reactivo de captura inmovilizado a un soporte sólido para unir cualquiera del anticuerpo de interés presente en la muestra con el reactivo de captura; (b) separar la muestra biológica del reactivo de captura inmovilizado unido a cualquiera del anticuerpo de interés presente; (c) poner en contacto el reactivo de captura inmovilizado unido a cualquiera del anticuerpo de interés presente con un anticuerpo anti-idiotipico detectable contra el anticuerpo de interés, dicho anticuerpo detectable que se une al idiotipo del anticuerpo de interés pero no al idiotipo de al menos otro anticuerpo en la muestra que se une a la proteína; y (d) medir el nivel de cualquiera del anticuerpo de interés unido al reactivo de captura utilizando un medio de detección para el anticuerpo detectable. En tal método, preferentemente el reactivo de captura inmovilizado se recubre sobre una placa de microtitulación . También se prefiere en donde el anticuerpo detectable es directamente detectable, y/o en donde el anticuerpo detectable se amplifica por un reactivo colorimétrico o fluorimétrico. En otra modalidad preferida, el anticuerpo detectable se biotinila y el medio de detección es peroxidasa de rábano picante (HRP)de estreptavidina o avidina . En aún un aspecto adicional, la invención proporciona un anticuerpo 8A3 que comprende SEQ ID NOS : 7 y 9 para las cadenas, pesada y ligera, respectivamente, y obtenible de o producido por hibridoma 8A3.10 depositado bajo número ATCC PTA-5914. En todavía otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo 8C5 obtenible o producido por hibridoma 8C5.1 depositado bajo número ATCC PTA-5915. Ambos anticuerpos pueden conjugarse para una marca detectable . En otro aspecto, la invención proporciona un hibridoma 8C5.1 o 8A3.1Q depositado bajo número de depósito ATCC PTA-5915 o PTA-5914, respectivamente. En aún una modalidad adicional, la invención proporciona un equipo de inmunoensayo para detectar específicamente en una muestra biológica un anticuerpo de interés que se une a una proteína multi-transmembrana, de superficie celular que comprende un dominio extracelular de intervención de menos de aproximadamente 75 aminoácidos, el equipo comprendiendo: (a) un recipiente que contiene, como un reactivo de captura, un anticuerpo anti-idiotípico que se une al idiotipo del anticuerpo de interés pero no al idiotipo de al menos otro anticuerpo en la muestra que se une a la proteina: (b) un recipiente que contiene un anticuerpo anti- idiotipico detectable que se une al idiotipo del anticuerpo de interés pero no al idiotipo de al menos otro anticuerpo en la muestra que se une a la proteina; y (c) instrucciones para detectar dicho anticuerpo de interés. Preferentemente, el equipo es útil en un método ELISA para detectar el anticuerpo de interés, más preferentemente un método ELISA a base de célula. También, en una modalidad preferida el equipo comprende además un soporte sólido para el reactivo de captura, en donde preferentemente el reactivo de captura se inmoviliza en el soporte sólido tal como revistiéndose en una placa de microtitulación . El equipo puede comprender además un medio de detección para los anticuerpos detectables, tal como HRP de estreptavidina o avidina. El equipo puede comprender además anticuerpo purificado de interés como un estándar. En otras modalidades preferidas, el reactivo de captura y anticuerpo detectable son anticuerpos monoclonales, y pueden ser los mismos o diferentes. La proteina es preferentemente CD20, y el anticuerpo de interés es preferentemente un anticuerpo humanizado, más preferentemente un anticuerpo 2H7 humanizado. El método en la presente utiliza anticuerpos anti-idiotipico específicos como agentes de revestimiento y detección para resolver el problema de detectar específicamente anticuerpos para proteínas de superficie celular con dominios extracelulares pequeños. Está preferentemente en un formato a base de célula, más preferentemente utilizando células vivas, y aún más preferentemente células WIL2 de suspensión vivas o células de ovario de hámster Chino (CHO) transfectadas, adherentes, vivas. El ensayo puede superar la interferencia de otros anticuerpos para reducir el soporte y pegado no específicos. Representa un ensayo reproducxble, limpio para anticuerpos en muestras biológicas, específicamente suero, dando un alto rendimiento de manera que muchas muestras pueden correrse una vez, como a través de un ELISA que es automático utilizando una placa. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figuras 1A y IB muestran curvas de concentración de IgG anti-CD20 quimérica (línea sólida) e IgG anti-CD20 humanizada (línea rayada) en ensayo de unión WIL2 de suspensión (Fig. 1A) y ensayo de unión de clon 2H3 CHO (Fig. IB). Las lecturas de fondo (OD 450 nm) fueron 0.064±0.003 y 0.116±0.003 para los ensayos de unión WIL2 y CHO, respectivamente. Las actividades relativas de IgG anti-CD20 humanizado fueron calculadas para ser 0.68+0.04 y 0.70±0.02 para los ensayos de unión WIL2 y 2H3, respectivamente (n=2). Figura 2 muestra curvas de concentración de RITÜXAN® que se une a clones CHO (Tabla 1) con expresión de CD20 diferente. Clon 3G8, que tuvo poca expresión de CD20 (fluorescencia promedio de 0.5 en comparación con 9.8 para el clon 4H10) , También se incluye para comparación. El ensayo se realiza utilizando 300,000 células/cavidad en el formato de suspensión. La lectura de fondo (OD 450 nm) para clon 4H10 fue 0.016±0.001 (n=2) . Figuras 3A y 3B muestran especificidad de anticuerpos anti-idiotipicos 8C5 (Fig. 3A) y 8A3 (Fig. 3B) . IgG anti-CD20 humanizada serialmente diluida, HERCEPTIN® (Cárter et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 4285-4289 (1992))·, factor de crecimiento endotelial anti-vascular (VEGF) (Presta et al., Cáncer Res., 57: 4593-4599 (1997)), E25 (Presta et al., J. Immunology, 151: 2623-2632 (1993)), RITÜXAN®, e IgG de humano normal (Zymed, South San Francisco, CA) fueron incubados en placas ELISA revestidas con 8C5 o 8A3 y anticuerpo unido se detecta utilizando IgG anti-humano Fc-HRP de cabra. La lectura de fondo (OD 450 nm) fue 0.01210.001 (n=2) . Figuras 4A y 4B muestran un ELISA utilizando anticuerpo anti-idiotipico 8C5 para 8A3 revestido y biotinilado para detección. Fig. 4A muestra curvas de concentración de IgG anti-CD20 humanizada en regulador (linea sólida) o 20% suero de humano (linea rayada) . Las lecturas de fondo (OD 450 nm) fueron 0.02010.004 y 0.01510.003 en regulador o 20% suero de humano, respectivamente (n=3) . Fig. 4B muestra curvas de concentración de anti-CD20 murino de origen en regulador (linea sólida) o en 10% suero de ratón (linea rayada) . Las lecturas de fondo (OD 450 nm) fueron 0.057+0.004 y 0.018±0.001 en regulador o 10% suero de ratón, respectivamente (n=2 ) . Figuras 5A-5E muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de anticuerpo 8A3, con Fig. 5A mostrando la secuencia de aminoácidos de la- cadena pesada de MAb 8A3 (SEQ ID NO: 6), Fig. 5B mostrando la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de MAb 8A3 con la secuencia de señal de 23 aminoácidos (SEQ ID NO:7), Fig. 5C mostrando la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de MAb 8A3 (SEQ ID NO:8), Fig. 5D mostrando la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de MAb 8?3 sin la secuencia de señal de 23 aminoácidos (SEQ ID NO: 9), y Fig. 5E mostrando la secuencia de nucleótidos codificando las cadenas ligeras y pesadas de MAb 8A3, en donde el residuo de nucleótido 40 es el comienzo de la secuencia de señal para la cadena ligera (SEQ ID NO: 10) . Figura 6A es una alineación de secuencia comparando las secuencias de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera (VL) de cada uno de 2H7 murino (SEQ ID NO: 11), variante 2H7.vl6 humanizada (SEQ ID NO:12), y el subgrupo 1 de cadena ligera kappa de humano (SEQ ID NO: 13). CDRs de VL de 2H7 y hu2H7.vl6 son como sigue: CDR1 (SEQ ID NO:14), CDR2 (SEQ ID N0:15), y CDR3 (SEQ ID N0:16). Figura 6B es una alineación de secuencia comparando las secuencias de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada (VH) de cada uno de 2H7 murino (SEQ ID NO: 17), variante 2H7.vl6 humanizada (SEQ ID NO:18), y la secuencia consenso de humano del subgrupo III de cadena pesada (SEQ ID NO:19). CDRs de VH de 2H7 y hu2H7.v!6 son como sigue: CDR1 (SEQ ID NO: 20), CDR2 (SEQ ID NO: 21), y CDR3 (SEQ ID NO: 22). En la Figura 6A y Figura 6B, CDRl, CDR2, y CDR3 en cada cadena se encierran dentro de paréntesis, flanqueados por las regiones de estructura, FR1-FR4, como se indica. 2H7 se refiere al anticuerpo 2H7 murino. Los asteriscos entre dos filas de secuencias indican las posiciones que son diferentes entre las dos secuencias. La numeración de residuo es de acuerdo a Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) , con inserciones mostradas como a, b, c, d, y e. Figuras 7A y 7B muestran las secuencias de aminoácidos de la cadena 2H7.vl6 L, con Fig. 7A mostrando la cadena L completa que contiene los primeros 19 aminoácidos antes DIQ que son la secuencia de señal secretora no presente en la cadena de polipéptido maduro (SEQ ID NO: 23), y Fig. 7B mostrando la cadena L de polipéptido maduro (SEQ ID NO: 24) . Figuras 8A y 8B muestran las secuencias de aminoácidos de la cadena 2H7.vl6 H, con Fig. 8? mostrando la cadena H completa que contiene los primeros 19 aminoácidos antes EVQ que son la secuencia de señal secretora no presente en la cadena de polipéptido maduro (SEQ ID NO:25), y Fig. 8B mostrando la cadena H de polipéptido maduro (SEQ ID NO:26). La alineación de la secuencia VH en. FIG. 6B (SEQ ID NO: 18) con la secuencia de cadena H completa, la región constante ?? de humano es de posición de aminoácido 114-471 en SEQ ID NO:25. Figuras '9A y 9B muestran las secuencias de aminoácidos de la cadena 2H7.v31 H, con Fig. 9? mostrando la cadena H completa que contiene los primeros 19 aminoácidos antes EVQ que son la secuencia de señal secretora no presente en la cadena de polipéptido maduro (SEQ ID NO: 27), y Fig. 9B mostrando la cadena H de polipéptido maduro (SEQ ID NO:28). La cadena L es la misma para 2H7.vl6 (ver FIG. 7). Figura 10 es una alineación de secuencia comparando las secuencias de aminoácidos de cadena ligera de la variante 2H7.vl6 humanizada (SEQ ID NO: 12) y variante 2H7.vl38 humanizada (SEQ ID NO:33). Figura 11 es una alineación de secuencia comparando las secuencias de aminoácidos de cadena pesada de la variante 2H7.vl6 humanizada (SEQ ID NO: 18) y variante 2H7.vl38 humanizada (SEQ ID NO:34). Figura 12 es una alineación de secuencia comparando las secuencias de aminoácidos de cadena ligera de la variante 2H7.vl6 humanizada (SEQ ID NO: 18) y 2H7.v511 humanizada (SEQ ID NO: ) , en donde los residuos se numeran completamente utilizando el sistema de numeración de EE.üü. Con respecto al anticuerpo de EE.UU., vi6 y v511 tienen una eliminación en la posición 30 en el * dominio variable; por lo tanto, S30 en la numeración secuencial de vl6/v511 se asigna como posición 31 (EE.UU. ) . Figura 13 es una alineación de secuencia comparando las secuencias de aminoácidos de cadena pesada de la variante 2H7.V16 humanizada (SEQ ID NO: 18) y 2H7.v511 humanizada (SEQ ID NO: ) , en donde los residuos se numeran completamente utilizando el sistema de numeración de EE.UU. En el dominio variable, vi6 y v511 tienen una inserción de cinco residuos, designados 104a-e, en comparación con el anticuerpo EE.UU. El primer dominio constante, CH1, comienza en la posición 118 (EE.UU. ) . Figura 14 es una alineación de secuencia comparando las secuencias de aminoácidos de cadena ligera de la variante 2H7.vl6 humanizada (SEQ ID NO: 18) y 2H7.v511 humanizada (SEQ ID NO: 38), en donde los residuos se numeran utilizando el sistema de numeración Kabat. Observe que vi6 y v511 tienen una eliminación en la posición Kabat 31; por lo tanto el residuo Y31 en numeración secuencial se designa como Y32 (Kabat) .

Figura 15 es una alineación de secuencia comparando las secuencias de aminoácidos de cadena pesada de la variante 2H7.vl6 humanizada (SEQ ID NO: 18) y 2H7.v511 humanizada (SEQ ID NO:39), en donde los residuos en el dominio variable (1-113) se numeran utilizando el sistema de numeración Kabat. Los residuos en los dominios constantes (118-447) se numeran utilizando el sistema de numeración EE.UU. Figura 16 muestra las curvas estándar de tres variantes 2H7 de ratón en el ELISA a base de anticuerpo anti-idiotipico en la presente (vl6, v96, y v327) en suero de ratón utilizando MAb 85C como anticuerpo de revestimiento y MAb 8A3 biotinilado (8A3-bio) como anticuerpo de detección. Figura 17 muestra las curvas estándar de cuatro variantes 2H7 humanizadas en el ELISA a base de anticuerpo anti-idiotipico en la presente (vl6, vll4, v488, y v511) en suero de ratón utilizando MAb 8C5 como anticuerpo de revestimiento y MAb 8A3 biotinilado (8A3-bio) como anticuerpo de detección. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE MODALIDADES PREFERIDAS I . Definiciones El término "proteína multi-transmembrana, de superficie celular que comprende un dominio extracelular de intervención (ECD) de menos de aproximadamente 75 aminoácidos" se refiere a una proteína que tiene dominio (s) que cruza la membrana y solamente un dominio extracelular corto que puede utilizarse para generar anticuerpos. Por "corto" se entiende generalmente un rango de aproximadamente 20 a menos de aproximadamente 75 aminoácidos, más preferentemente aproximadamente 20 a aproximadamente 50 aminoácidos. La multi-transmembrana se refiere a más de dos dominios de transmembrana en la proteina. Ejemplos de tales proteínas incluyen, pero no se limitan a, receptores acoplados a proteína G tales como receptores para la relaxin de hormona (por ejemplo, LGR7 y LGR8) y receptores de quimoquina, y marcadores de superficie celular B que satisfacen la definición anterior de la proteína, tal como el antígeno CD20 (CD20) . El término "quimoquina" se refiere a todas las citoquinas quimiotácticas conocidas expresadas dentro de los organismos mamíferos que median el reclutamiento e infiltración de leucocitos en tejidos. El término "quimoquina" incluye pero no se limita a todos los miembros mamíferos de las familias C, CC, CXC, y CXXXC de citoquinas quimiotácticas, clasificadas dentro de la técnica en base a la distribución de residuos de cistina en las mismas. La frase "receptor de quimoquina" se refiere a proteínas de transmembrana ejemplificadas en la materia, que interactúa con una o más quimoquinas. La categoría de "receptor de quimoquina" incluye, pero no se limita a, todos los receptores de quimoquina clasificados dentro de la técnica como CR, CCR, CXCR, y CXXXCR. El término "citoquina" se refiere a todas las citoquinas de humano conocidas dentro de la materia que unen receptores extracelulares en la superficie celular y modulan asi la función celular, incluyendo pero no limitándose a IL-2, IFN-gamma, TNF-alfa, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, y IL-13. Ejemplos de receptores de quimoquina incluyen aquellos receptores para interleuqina-8 (IL-8), RANTES (regulada en activación, expresada en célula T normal, y secretada presumiblemente) , proteina-1 inflamatoria de macrófago (MIP-1), CCR1, CCR2, CCR2B, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7 , CCR8, CCR9, CCR10, CCR11, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CX3CR1, XCR1, el receptor de quimoquina huérfana GPR-9-6, factor 4 de plaqueta (PF4) , monocitos, factor quimiotáctico y de activación (MCAF) , y pro-teina-2 de activación de neutrófilo (NAP-2) , que tienen ECDs de intervención pequeños. Un "marcador de superficie celular B" o "antigeno de superficie celular B" en la presente es un antigeno expresado en la superficie de una célula B que puede ser objetivo con un antagonista que se une al mismo y también satisface los criterios anteriores para la proteina multi-transmembrana . Los marcadores de superficie celular B ej emplificativos incluyen marcadores de superficie de leucocito CD10, CD19, CD20, CD21, CD23, CD24, CD37, CD40, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85, y CD86. (Para descripciones, ver The Leukocyte Antigen Facts Book, 2nd Edition, Barclay et al., ed. (Academic Press, Harcourt Brace & Co., New York: 1997)). Otros marcadores de superficie celular B incluyen RP105, FcRH2, CD79A, C79B, célula B CR2, CCR6, CD72, P2X5, HLA-DOB, CXCR5, FCER2, BR3, Btig, NAG14, SLGC16270, FcRHl, IRTA2, AT D578, FcRH3, IRTA1, FcRH6, BCMA, y 239287_at. El marcador de superficie celular B de interés particular se expresa preferentemente en las células B en comparación con otros tejidos de no célula B de un mamifero y puede expresarse tanto en células B precursoras y células B maduras . El antigeno "CD20", o "CD20" es una fosfoproteina no glicosilada de aproximadamente 35 kDa encontrada en la superficie de más del 90% de las células B de órganos linfoides y sangre periférica. CD20 está presente tanto en células B normales asi como también en células B malignas, pero no se expresa en células germinales. Otros nombres para CD20 en la literatura incluyen "antigeno restringido de linfocito B" y "Bp35". El antigeno CD20 se describe en Clark et al., PNAS (USA) , 82:1766 (1985), por ejemplo. "Mamifero" para propósitos de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como un mamifero, incluyendo humanos, animales domésticos y de granja, y animales del zoológico, deportes, o mascotas, tales como perros, caballos, gatos, oveja, puercos, vacas, etc. Preferentemente, el mamífero es humano. Los términos "cáncer", "canceroso" y "maligno" se refieren a o describen la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por crecimiento celular no regulado. Ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma incluyendo adenocarcinoma, linfoma, blastoma, melanoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen cáncer de célula escamosa, cáncer de pulmón de célula pequeña, cáncer de pulmón de célula no pequeña, cáncer gastrointestinal, linfoma de Hodgkin y no Hodgkin, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer ovárico, cáncer de hígado, tales como carcinoma hepática y hepatoma, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de colón, cáncer colorectal, carcinoma endometrial, carcinoma de glándula salivar, cáncer de riñon tal como carcinoma de célula renal y tumores de Wilms, carcinoma de célula básica, melanoma, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, cáncer testicular, cáncer esofágico, y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello. Los cánceres preferidos para tratamiento en la presente son mama, colón, pulmón, colorectal, próstata, linfoma tal coma linfoma no Hodgkin y melanoma . El término "enfermedad mediada por quimoquina " se refiere a una enfermedad que puede tratarse o prevenirse o sus síntomas mejorados por un antagonista para un receptor de quimoquina. Tales enfermedades incluyen, por ejemplo, soriasis, dermatitis atópica, asma, desorden pulmonar obstructivo crónico, enfermedad respiratoria de adulto, artritis, enfermedad de intestino inflamatorio, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, ataque séptico, ataque endotóxico, sepsis de gram negativo, síndrome de ataque tóxico, apoplejía, lesión por reperfusión renal y cardiaca, glomerulonefritis, trombosis, enfermedad de Alzheimer, reacción de injerto contra huésped, rechazo de aloinjerto, malaria, síndrome de distensión respiratoria aguda, reacción de hipersensibilidad tipo retrasado, ateroesclerosis, isquemia cardiaca y cerebral, osteoartritis, esclerosis múltiple, restenosis, angiogenesis, osteoporosis, gingivitis, virus respiratorios, virus del herpes, virus de hepatitis, VIH, virus asociado con sarcoma de Kaposi, meningitis, fibrosis cística, labor pre-término, tos, pruritis, disfunción de multi-órgano, trauma, tensiones, dislocaciones, contusiones, artritis psoriática, herpes, encefalitis, vasculitis CNS, lesión cerebral traumática, tumores CNS, hemorragia subaracnoide, trauma post quirúrgico, pneumonitis intersticial, hipersensibilidad, artritis inducida de cristal, pancreatitis crónica y aguda, hepatitis alcohólica aguda, enterocolitis necrotizante, sinusitis crónica, enfermedad ocular angiogénica, inflamación ocular, retinopatía prematura, retinopatia diabética, degeneración macular tipo húmedo, neovascularización corneal, polimiositis, vasculitis, acné, úlcera gástrica y duodenal, enfermedad celiac, esofagitis, glositis, obstrucción de flujo de aire, hiperresponsividad de la via respiratoria, broquiectasis, broquiolitis, broquiolitis obliterans, broquitis crónica, cor pulmonae, dispenia, enfisema, hipercapnea, hiperinflación, hipoxemia, inflamación inducida por hiperoxia, hipoxia, reducción de volumen de pulmón quirúrico, fibrosis pulmonar, hipertensión pulmonar, hipertrofia ventricular derecha, peritonitis asociada con diálisis peritoneal ambulatoria continúa, erliquiosis granulocitica, sarcoidosis, enfermedad de via respiratoria pequeña, desacoplamiento de perfusión por ventilación, jadeos, resfriados, gota, enfermedad alcohólica del higado, lupus, terapia de quemaduras, periodontitis, lesión por reperfusión de transplante, transplante temprano, artritis reumatoide (todos los tipos) , y cáncer. Las enfermedades de intestino inflamatoria incluyen enfermedad del intestino inflamatorio crónico y agudo, y VIH incluye SIDA. Fármacos ej emplificativos que pueden utilizarse junto con un anticuerpo contra un receptor de quimoquina para tratar tal enfermedad incluyen aquellos descritos en Pub. de EE.UU. No. US 20040053953. El término "detectar" se utiliza en el sentido más amplio para incluir tanto mediciones cualitativas como cuantitativas de una molécula objetivo. En un aspecto, el método de detección como se describe en la presente se utiliza para identificar la mera presencia del anticuerpo de interés en una muestra biológica. En otro aspecto, el método se utiliza para probar si el anticuerpo de interés en una muestra está presente en un nivel detectable. En todavía otro aspecto, el método puede utilizarse para cuantificar la cantidad del anticuerpo de interés en una muestra y además para comparar los niveles de anticuerpo de diferentes muestras . El término "anticuerpo de interés" se refiere a un anticuerpo que se une a una proteína como se describe en la presente. Tal anticuerpo es preferentemente un anticuerpo monoclonal, más preferentemente un roedor, por ejemplo, anticuerpo murino o un anticuerpo humanizado, aún más preferentemente un anticuerpo humanizado. Ejemplos de tales anticuerpos incluyen un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que se une a un receptor de quimoquina CC de mamífero (CCR) , tal como receptor 2 de quimoquina C (también referido como CCR2, CKR-2, MCP-1RA, o MCP-1RB) o porción del receptor (por ejemplo, anti-CCR2) . Tal anticuerpo, por ejemplo, puede tener especificidad para CCR2 de reshus o humano o una porción del mismo y/o unión de bloque de un ligado (por ejemplo, MCP-1, MCP-2, MCP-3, o MCP-4) al receptor e inhibir la función asociada con la unión del ligado al receptor (por ejemplo, tráfico de leucocito) . Tal anticuerpo es preferentemente anticuerpo monoclonal murino (MAb) LS132.1D9 (1D9) o un anticuerpo que puede competir con 1D9 para unión a CCR2 de humano o una porción de CCR2 de humano, tales como los anticuerpos humanizados como se describe en Pat. de EE.ÜÜ. No. 6,696,550. Los ejemplos también incluyen anticuerpos que se unen a receptores de quimoquina CCR3 o CCR10, la preparación de los cuales se describe en Pat. de EE.UU. No. 6,692,922. Otro ejemplo es un anticuerpo para el receptor de quimoquina GPR-9-6, tal como MAb 3C3, que reacciona selectivamente con transfectantes GPR-9-6 (ver Pat. de EE.UU. No. 6,689,570). Ejemplos adicionales son anticuerpos que unen específicamente y/o modulan una topología de un receptor de quimoquina, pero no una segunda topología del receptor, como se describe, por ejemplo, en Pub. de EE.UU. No. US 20040018563. Otro ejemplo es anticuerpos IgM de receptor anti-leucocito heterogéneo aislado que tienen como objetivo al menos CCR5, CCR3, CXCR4, y/o CCR2B, como se describe en Pat. de EE.UU. No. 6,610,834. Ejemplos adicionales son los anticuerpos anti-CD3 completamente humanos tal como fhCD3mAb descrito en Pub. de EE.UU. No. US 20030216551 que interfieren con el papel in vivo de receptores de quimoquina de mamífero cuando se administran in vivo. Ejemplos adicionales son anticuerpos humanos monoclonales contra CXCR4 humano capaz de inhibir la infección por VIH y quimotaxis en células de cáncer de mama de humano, tales como anticuerpos que se une al ciclo 6 de CXCR4 de humano, por ejemplo, Abl24 y Abl25, como se describe en Pub. de Pat. de EE.UU. US 20030206909. El anticuerpo más preferido de interés en la presente es un anticuerpo 2H7 humanizado . El término "muestra biológica" se refiere a cualquier substancia biológica que puede contener el •anticuerpo de interés. Una muestra puede ser fluido biológico, tal como sangre completa o componentes de sangre completa incluyendo células de glóbulos rojos, células de glóbulos blancos, plaquetas, suero y plasma, ascitis, orina, fluido vitreo, fluido linf, fluido sinovial, fluido folicular, fluido seminal, fluido amniótico, leche, saliva, esputo, lagrimas, sudor, moco, fluido cerebroespinal, y otros constituyentes del cuerpo que pueden contener el analito de interés, asi como también medio de cultivo de tejido y extractos de tejido tales como tejido homogeneizado, y extractos celulares. Preferentemente, la muestra es una muestra del cuerpo de cualquier animal, pero preferentemente es de un mamífero, más preferentemente de un sujeto humano, por ejemplo, cuando se mide un anticuerpo tal como un anticuerpo humanizado en una muestra clínica, o un sujeto de ratón, por ejemplo, cuando se mide el anticuerpo de ratón de origen en muestras de ratón, particularmente el suero. Más preferentemente, tal muestra biológica es de pacientes clínicos. La muestra biológica preferida en la presente es suero, plasma u orina, más preferentemente suero, y más preferentemente suero de un paciente clínico. El término "reactivo de captura" o "anticuerpo de revestimiento" se refiere a un anticuerpo anti-idiotípico o mezcla de tales anticuerpos que unen un idiotipo del anticuerpo de interés y son capaces de unión y captura del anticuerpo de interés en una muestra biológica de manera que bajo condiciones adecuadas, el complejo de reactivo de captura y anticuerpo de interés pueden separarse del resto de la muestra. Anticuerpo anti-idiotípicos son anticuerpos que se unen al dominio VH y/o VL del anticuerpo semejante, en este caso el anticuerpo de interés. Típicamente, tales anticuerpos anti-idiotípicos se preparan al inmunizar un mamífero tal como un ratón con el anticuerpo de interés y producir un hibridoma y seleccionar del panel de anticuerpos derivados del hibridoma aquellos anticuerpos que dan la señal más limpia en el ensayo, ya sea para el reactivo de captura o el anticuerpo detectable. Típicamente, el reactivo de captura se inmoviliza o es inmovilizable . Preferentemente, tales anticuerpos anti-idiotípicos son anticuerpos monoclonales , más preferentemente anticuerpos roedores, aún más preferentemente, anticuerpos de rata o murino, y más preferentemente anticuerpos murino. El término "anticuerpo detectable" se refiere a un anticuerpo anti-idiotípico o mezcla de tales anticuerpos que unen un idiotipo del anticuerpo de interés y son capaces de detectarse ya sea directamente a través de una marca amplificada por un medio de detección, o indirectamente a través, por ejemplo, de otro anticuerpo que se marca. Para marcado directo, el anticuerpo se conjuga típicamente a una porción que es detectable por algunos medios . El anticuerpo detectable preferido es anticuerpo biotinilado. Los preferidos tales anticuerpos anti-idiotípicos son anticuerpos monoclonales, más preferentemente, anticuerpos de roedor, aún más preferentemente anticuerpos de rata o murino, y más preferentemente anticuerpos murino. El término "medio de detección" se refiere a una porción o técnica utilizada para detectar la presencia del anticuerpo detectable a través del reporte de señal que se lee entonces en el ensayo en la presente. Incluye reactivos que amplifican la marca inmovilizada tal como la marca capturada en una placa de microtitulación. Preferentemente, el medio de detección es HRP de estreptavidina o avidina. El término "anticuerpo" en la presente se utiliza en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) formados de al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpo siempre que muestren la actividad biológica deseada . "Fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, preferentemente que comprende la unión de antigeno o región variable de la misma. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F{ah')2, y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena única; y anticuerpos multiespecificos formados de fragmentos de anticuerpo. Para los propósitos en la presente, un "anticuerpo intacto" es uno que comprende dominios variables de cadena ligera y pesada asi como también una región Fe. "Anticuerpos nativos" son usualmente glicoproteinas heterotetraméricas de aproximadamente 150,000 daltones, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera se enlaza a una cadena pesada por un enlace de disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces de disulfuro varia entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina . Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes de disulfuro de intracadena regularmente espaciados. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido por un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. Los residuos aminoácidos particulares se cree que forman una interfase entre los dominios variables de cadena pesada y cadena ligera. El término "anticuerpo monoclonal" como se utiliza en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos substancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos excepto para mutaciones que ocurren de manera natural, posibles que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigiéndose contra un sitio antigénico único. Además, en contraste a preparaciones de anticuerpo convencional (policlonal) que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos) , cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un determinante único en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos en que se sintetizan por el cultivo de hibridoma, sin contaminar por otras inmunoglobulinas . El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como obteniéndose de una población substancialmente homogénea de anticuerpos, y no es para construirse como producción requisito del anticuerpo por cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a utilizarse de acuerdo con la presente invención pueden hacerse por el método de hibridoma primero descrito por Kohler et al., ature, 256: 495 (1975), o puede hacerse por métodos de ADN recombinante (ver, por ejemplo, Patente de EE.ÜÜ. No. 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" pueden también aislarse de bibliotecas de anticuerpo de fago utilizando las técnicas descritas en Clackson et al. Nature 352 : 62 -628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), por ejemplo. Los anticuerpos monoclonales en la presente incluyen especifreamente anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en las cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s) cadena (s) es idéntico con u homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpo, asi como también fragmentos de tales anticuerpos, siempre que muestren la actividad biológica deseada (Patente de EE.ÜÜ. No. 4,816,567; Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 8JL: 6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de interés en la presente incluyen anticuerpos "de primate" que comprende secuencias de unión a antigeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo, mono del Viejo Mundo, tal como babuino, rhesus o mono cinomolgo) y secuencias de región constante de humano (Pat. de EE.Uü. No. 5, 693,780) . Formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murino) son anticuerpos quiméricos que contienen secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Para la mayor parte, anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas de humano (anticuerpo receptor) en los cuales los residuos de una región hipervariable del receptor se reemplazan por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano teniendo la especificidad deseada, afinidad y capacidad. En algunos casos, los residuos de región de estructura (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se hacen además para refinar el desempeño del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá substancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los cuales todos o substancialmente todos los ciclos hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todos o substancialmente todos los Frs son aquellos de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe) , típicamente aquella de una inmunoglobulina de humano. Para detalles adicionales, ver Jones et al., Nature, 321 : 522-525 (1986); Riechmann et al.r Nature, 332 : 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct . Biol . , 2:593-596 (1992). El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren-extensivamente en secuencia entre anticuerpos y se utilizan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye de manera uniforme por todos los dominios variables de anticuerpos. Se concentra en tres segmentos llamados regiones hipervariables en tanto el dominio variable de cadena pesada y de cadena ligera. Las porciones más altamente conservadas de dominios variables se llaman las regiones de estructura (FRs) . Los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada uno cuatro FRs, adoptando grandemente una configuración de hoja ß, conectados por tres regiones hipervariables, que forman ciclos conectando, y en algunos casos formando parte de, la estructura de hoja ß. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen en proximidad cercana por FRs y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de antigeno de anticuerpos (ver Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) ) . Los dominios contantes no se incluyen directamente en la unión de un anticuerpo a un antigeno, pero muestran varias funciones efectoras, tal como participación del anticuerpo en citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) . Digestión de papaina de anticuerpos produce dos fragmentos de unión a antigeno idénticos, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un sitio de unión a antigeno único, y un fragmento "Fe" residual, cuyo nombre refleja su habilidad para cristalizarse fácilmente. El tratamiento de pepsina produce un fragmento F(ab' >2 que tiene dos sitios de unión a antigeno y es aún capaz de degradar el antigeno. "Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de unión a antígeno y de reconocimiento de antígeno completo. Esta región consiste de un dímero de un dominio variable de cadena ligera y uno de cadena pesada en asociación no covalente, hermética. Es en esta configuración que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, las seis regiones hipervariables confieren especificidad de unión a antigeno al anticuerpo. Sin embargo, aún un dominio variable único (o mitad de un Fv que comprende solamente tres regiones hipervariables especificas para un antigeno) tiene la habilidad de reconocer y unir el antigeno, aunque una afinidad inferior que el sitio de unión completo. El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en el término carboxi del dominio CH1 de cadena pesada incluyendo una o más cisteinas de la región de articulación de anticuerpo. Fab'-SH es la designación en la presente para Fab' en la cual el (los) residuo (s) de cisterna de los dominios constantes llevan al menos un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 originalmente se producen como pares de fragmentos Fab' que tienen cisternas de articulación entre ellos. Otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo también se conocen. Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrados pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, llamados kappa (?) y lambda (?) , en base a las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, anticuerpos pueden asignarse a diferentes clases. Existen cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varios de estos pueden dividirse además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, y IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos se llaman a, d, e, ?, y µ, respectivamente. Las estructuras de subunidad y configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas se conocen bien. "Fv de cadena única" o fragmentos de anticuerpo "scFv" comprenden los dominios VH y VL de anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una cadena de polipéptido único. Preferentemente, el polipéptido Fv comprende además un enlazador de péptido entre los dominios VH y VL que permite al scFv formar la estructura deseada para unión de antigeno. Para una revisión de scFv, ver Plückthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol . 113, Rosenburg and Moore eds . , Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994). El término "región hipervariable" cuando se utiliza en la presente se refiere a los residuos de aminoácido de un anticuerpo que son responsables para unión de antigeno. La región hipervariable comprende residuos de aminoácidos de una "región de determinación complementaria" o "CDR" (por ejemplo, residuos 24-34 (Ll), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena pesada; y 31-35 (Hl) , 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) ) y/o aquellos residuos de un "ciclo hipervariable" (por ejemplo, residuos 26-32 (Ll) , 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (Hl), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Residuos de "Estructura" o "FR" son aquellos residuos de dominio variable diferentes a los residuos de región hipervariable como se define en la presente. Ejemplos de anticuerpos que unen el antigeno CD20 incluyen: "C2B8" que ahora se llama "rituximab" ("RITUXAN®") (Patente de EE.UU. No. 5,736,137); el anticuerpo murino 2B8 marcado con itrio- [90] designado "Y2B8" o "Ibritumomab Tiuxetan" ZEVALIN® (Patente de EE.UU. No. 5,736,137); IgG2a murino "Bl, " también llamado "Tositumomab, " opcionalmente marcado con 131I para generar el anticuerpo "131I-B1" (yodo 1131 tositumomab, BEXXAR™) (Patente de EE.UU. No. 5,595,721); anticuerpo monoclonal murino "1F5" (Press et al., Blood, _69(2) : 584-591 (1987) y "estructura en parche" o 1F5 humanizado (WO03/002607, Leung, S.); depósito ATCC HB-96450); anticuerpo 2H7 murino y 2H7 quimérico (Patente de EE.UU. No. ,677,180); un 2H7 humanizado; huMax-CD20 (Genmab, Dinamarca) ; ???-133 (Evolución Molecular Aplicada) ; y anticuerpos monoclonales L27, G28-2, 93-1B3, B-Cl o NÜ-B2 disponibles de International Leukocyte Typing Workshop (Valentine et al., In: Leukocyte Typing III (Mc ichael, Ed. , p. 440, Oxford University Press (1987)). El término "rituximab" o "RITUXAN®" en la presente se refiere al anticuerpo monoclonal murino/humano quimérico genéticamente formado dirigido contra el antigeno CD20 y "C2B8" designado en la Patente de EE.UU. No. 5,736,137, incluyendo fragmentos de los mismos que retienen la habilidad para unir CD20. Puramente para los propósitos en la presente, ??2?7 humanizado" se refiere a un anticuerpo humanizado que une CD20 de humano, o un fragmento de unión de antigeno del mismo, en donde el anticuerpo es efectivo para eliminar células B de primate in vivo, el anticuerpo que comprende en la región variable de cadena H (VH) al menos una secuencia CDR3 de SEQ ID NO: 22 (Fig. 6B) de un anticuerpo CD20 antihumano y substancialmente los residuos de estructura consenso de humano (FR) del subgrupo III de cadena pesada (VHIII) . En una modalidad preferida, este anticuerpo^ comprende además la secuencia CDR1 de cadena H de SEQ ID NO: 20 y secuencia CDR2 de SEQ ID NO: 21, y más preferentemente, comprende además la secuencia CDR1 de cadena L de SEQ ID NO: 14, secuencia CDR2 de SEQ ID NO: 15, secuencia CDR3 de SEQ ID NO: 16 y substancialmente los residuos de estructura consenso de humano (FR) del subgrupo 1 de cadena ligera ? de humano (VKI) , en donde la región VH puede unirse a una región constante de cadena IgG de humano, en donde la región puede ser, por ejemplo, IgGl o IgG3. En una modalidad preferida, tal anticuerpo comprende la secuencia VH de SEQ ID NO: 18 (vl6, como se muestra en la Fig. 6B) , opcionalmente también que comprende la secuencia VL de SEQ ID NO: 12 (vl6, como se muestra en Fig. 6A) , que puede tener las substituciones de aminoácido de D56A y N100A en la cadena H y S92A en la cadena L (v.96). Tal anticuerpo más preferido es 2H7.vl6 teniendo las secuencias de aminoácidos de cadena pesada y ligera de SEQ ID NOS: 26 y 28, respectivamente, como se muestra en Figs . 7B y 8B. Otra modalidad preferida es donde el anticuerpo es 2H7.v31 teniendo las secuencias de aminoácidos de cadena ligera y pesada de SEQ ID NOS: 26 y 30, respectivamente, como se muestra en Figs. 7B y 9B. El anticuerpo en la presente puede comprender además al menos una substitución de aminoácido en la región Fe que mejora la actividad DAC y /o CDC, tal como una en donde las substituciones de aminoácido son S298A/E333A/K334A, más preferentemente 2H7.v31 teniendo la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 28 (como se muestra en Fig. 9B) . Cualquiera de estos anticuerpos puede comprender además al menos una substitución de aminoácido en la región Fe que disminuye la actividad de CDC, por ejemplo, que comprende al menos la substitución 322A. Tales anticuerpos preferentemente son 2H7.vll4 o 2H7.vll5 teniendo al menos actividad ADCC 10 veces mejorada en comparación con RITUXAN®. Un 2H7 humanizado preferido es un anticuerpo intacto o fragmento de anticuerpo que comprende la secuencia de cadena ligera variable: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEI R (SEQ ID NO:l); y la secuencia de cadena pesada variable: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYN QKFKGRFTI SVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:2) Donde el anticuerpo 2H7 humanizado es un anticuerpo intacto, preferentemente comprende la secuencia de aminoácidos de cadena ligera: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGT VEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT SFNRGEC (SEQ ID NO: 3); y la secuencia de aminoácidos de cadena pesada: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYN QKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR VYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQD LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:4) o la secuencia de aminoácidos de cadena pesada: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYN Q FKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN ALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD SRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:5). El término "instrucciones" se utiliza para referirse a instrucciones incluidas por costumbre en paquetes comerciales de productos terapéuticos que contienen información acerca de las indicaciones, uso, dosificación, administración, contraindicaciones y/o advertencias concernientes al uso de tales productos terapéuticos. II . Modos para Llevar a Cabo la Invención El ensayo descrito en la presente es un ELISA que utiliza anticuerpos anti-idiotipicos como reactivos de captura y anticuerpos detectables para un anticuerpo de interés. Preferentemente, ELISA es a base de célula. En la primer etapa del ensayo la muestra biológica que se sospecha que contiene o contiene el anticuerpo de interés, se contacta e incuba con los anticuerpos de captura (o revestimiento) de manera que los anticuerpos de captura, capturan o se unen al anticuerpo de interés de manera que puede detectarse en una etapa de detección. La etapa de detección incluye el uso del •anticuerpo anti-idiotipico detectable, que, cuando se contacta con cualquiera del anticuerpo unido de interés, se une al anticuerpo de interés, si está presente, y un medio de detección se utiliza para detectar la marca en el anticuerpo y por lo tanto la presencia o cantidad de anticuerpo de interés presente. En una modalidad más preferida, el ensayo utiliza las siguientes etapas . Primer Etapa En la primer etapa del ensayo en la presente, la muestra biológica que se sospecha que contiene o contiene el anticuerpo de interés como se define en la presente se contacta e incuba con los reactivos de captura inmovilizados (o revestimiento) , que son anticuerpos anti-idiotipicos dirigidos contra el anticuerpo de interés. Estos anticuerpos son preferentemente anticuerpos monoclonales, y pueden ser de cualquier especie, pero preferentemente son roedores, más preferentemente murino o rata, aún más preferentemente murino y más preferentemente MAb 8A3 o 8C5 derivados de los hibridomas identificados en la presente. MAb 8A3 comprende SEQ ID NOS : 7 y 9 para las cadenas pesadas y ligeras, respectivamente. Por lo tanto, en una modalidad especifica, el anticuerpo anti-idiotipico inmovilizado es un anticuerpo monoclonal murino, más preferentemente MAb 8C5 o 8?3. La inmovilización convencionalmente se realiza al insolubilizar los reactivos de captura ya sea antes del procedimiento de ensayo, o por adsorción a una superficie o matriz insoluble en agua (Pat. de EE.UU. No. 3,720,760) o acoplamiento covalente o no covalente (por ejemplo, utilizando degradación de carbodiimida o glutaraldehido, con o sin activación previa del soporte con, por ejemplo, ácido nítrico y un agente reductor como se describe en Pat. de EE.UU. No. 3,645,852 o en Rotmans et al., J. Immunol. Methods, 5_7: 87-98 (1983)), o después, por ejemplo, por inmunoprecipitación . La fase sólida utilizada para inmovilización puede ser cualquier soporte inerte o vehículo que es esencialmente insoluble en agua y útil en ensayos inmunométricos, incluyendo soportes en la forma, de por ejemplo, superficies, partículas, matrices porosas, etc. Ejemplos de soportes comúnmente utilizados incluyen hojas pequeñas, geles SEPHADEX®, cloruro de polivinilo, poliestireno, y lo similar, incluyendo placas de microconcentración de 96 cavidades, así como también materiales particulados tales como papel de filtro, agarosa, dextran degradado, y otros polisacáridos .

Alternativamente, las matrices insolubles en agua reactivas tales como carbohidratos activados de bromuro-cianogenos y los substratos reactivos descritos en las Pats . de EE.ÜU. Nos. 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; y 4,330,440 se emplean de manera adecuada para inmovilización de reactivo de captura. En una modalidad preferida, los reactivos de captura inmovilizados se revisten en una placa de microtitulación, y en particular la fase sólida preferida utilizada es una placa de microtitulación de multi-cavidad que puede utilizarse para analizar varias muestras en un momento. La más preferida es una placa ELISA de 96 cavidades MICROTEST™ o MAXISORP™ tal como aquella vendida como NÜNC MAXISORB™ o IMMULON™. La fase sólida se reviste con los reactivos de captura como se define arriba, que puede enlazarse por una interacción covalente o no covalente o enlace físico como se desee. Técnicas para unión incluyen aquellos descritos en la Pat. de EE.UU. No. 4,376,110 y las referencias citadas en la presente. Si es covalente, la placa u otra fase sólida se incuba con un agente de degradación junto con el reactivo de captura bajo condiciones bien conocidas en la materia tal como por una hora a temperatura ambiente. Los agentes de degradación comúnmente utilizados para unir los reactivos de captura al substrato de fase sólida incluyen, por ejemplo, 1, 1-bis (diazoacetil) -2- feniletano, glutaraldehido, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres de disuccinimidilo tal como 3, 3 ' -ditiobis (succinimidilpropionato) , y maleimidas bifuncionales tal como bis-N-maleimido-1, S-octano. Los agentes de derivación tal como metil-3- ( (p-azidofenil) -ditio) propioimidato produjeron compuestos intermediarios fotoactivables capaces de formar degradaciones en la presencia de luz. Si placas de 96 cavidades se utilizan, se revisten preferentemente con la mezcla de reactivos de captura típicamente diluidos en un regulador tal como 0.05M carbonato de sodio por incubación por al menos aproximadamente 10 horas, más preferentemente al menos durante la noche, a temperaturas de aproximadamente 4-20°C, más preferentemente aproximadamente 4-8 °C, y a un pH de aproximadamente 8-12, más preferentemente aproximadamente 9-10, y más preferentemente aproximadamente 9.6. Si los tiempos de revestimiento más cortos (1-2 horas) se desean, uno puede utilizar placas de 96 cavidades con partes inferiores de filtro de nitrocelulosa (Millipore MULTISCREEN™) o revestirse a 37 °C. Las placas pueden apilarse y revestirse por adelantado al ensayo, y después el ensayo puede llevarse a cabo simultáneamente en varias muestras en una manera manual, semi-automática, o automática, tal como al utilizar robóticas.

Las placas revestidas se tratan entonces típicamente con un agente de bloqueo que se une no específicamente a y satura los sitios de unión para prevenir unión no deseada del ligando libre a los sitios de exceso en las cavidades de la placa. Ejemplos de agentes de bloqueo apropiados para este propósito incluyen, por ejemplo, gelatina, albúmina de suero de bovino, albúmina de huevo, caseína y leche sin grasa. El tratamiento de bloqueo típicamente toma lugar bajo condiciones de temperaturas ambientes por aproximadamente 1-4 horas, preferentemente aproximadamente 1.5 a 3 horas . Después de revestir y bloquear, la muestra estándar (anticuerpo purificado de interés) o biológica a analizarse, diluida apropiadamente, se agrega a la fase inmovilizada. La tasa de dilución preferida es aproximadamente 5-15%, preferentemente aproximadamente 10% en volumen. Los reguladores que pueden utilizarse para dilución para este propósito incluyen (a) salina regulada por fosfato (PBS) que contiene 0.5% BSA, 0.05% detergente TWEEN 20™ (P20) , 0.05% antibiótico PROCLIN™ 300, 5 mM EDTA, 0.25% agente tensioactivo 3- ( (3-colamidopropil) dimetilamonio) -1-propanosulfonato (CHAPS) , 0.2% beta-gamma globulin, y 0.35M NaCl; (b) PBS que contiene 0.5% albúmina de suero de bovino (BSA), 0.05% P20, y 0.05% PROCLIN™ 300, pH 7; (c) PBS que contiene 0.5% BSA, 0.05% P20, 0.05% PROCLIN™ 300, 5 mM EDTA, y 0.35 M NaCl, pH 6.35; (d) PBS que contiene 0.5% BSA, 0.05% P20, 0.05% PROCLIN™ 300, 5 mM EDTA, 0.2% beta-gamma globulin, y 0.35 M NaCl; y (e) PBS que contiene 0.5% BSA, 0.05% P20, 0.05% PROCLIN™ 300, 5 mM EDTA, 0.25% CHAPS, y 0.35 M NaCl. Regulador (a) es el regulador preferido para el ensayo en la presente ya que tiene la mejor diferenciación entre cada estándar asi como también la proporción de señal a ruido más grande. PROCLIN™ 300 actúa como un conservador, y TWEEN 20™ actúa como un detergente para eliminar la unión no específica. EDTA agregada y sal de regulador (a) actúan para disminuir el fondo sobre los otros reguladores, incluyendo regulador (b) . La cantidad de reactivos de captura empleados es suficientemente grande para dar una buena señal en comparación con los estándares, pero no en exceso molar en comparación con el nivel esperado máximo de anticuerpo de interés en la muestra. Para suficiente sensibilidad, se prefiere que la cantidad de muestra biológica agregada sea tal que los reactivos de captura inmovilizados están en exceso molar de la concentración molar máxima de anticuerpo libre de interés anticipado en la muestra biológica después de dilución apropiada de la muestra. Este nivel anticipado depende principalmente de cualquier correlación conocida entre los niveles de concentración del anticuerpo libre de interés en la muestra biológica particular que se analiza con la condición clínica del paciente. De esta manera, por ejemplo, un paciente adulto puede tener una concentración esperada máxima de anticuerpo libre de interés en su suero que es muy alta, mientras que puede esperarse que un niño tenga un nivel inferior de anticuerpo libre de interés en su suero en base a las dosis dadas. Aunque la concentración de los reactivos de captura generalmente se determinará por el rango de concentración de interés del anticuerpo de interés, tomando en cuenta cualquier dilución necesaria de la muestra biológica, la concentración final de los reactivos de captura normalmente se determinarán de manera empírica para maximizar la sensibilidad del ensayo sobre el rango de interés. Sin embargo, como una directriz general, el exceso molar es adecuadamente menos que aproximadamente diez veces de la concentración molar esperada máxima de anticuerpo de interés en la muestra biológica después de cualquier dilución apropiada de la muestra. Las condiciones para incubación de muestra y reactivo de captura inmovilizado se seleccionan para maximizar la sensibilidad del ensayo y para minimizar la disociación, y para asegurar que cualquier anticuerpo de interés presente en la muestra se una al reactivo de captura inmovilizado. Preferentemente, la incubación se realiza a temperaturas casi constantes, variando de aproximadamente 0°C a aproximadamente 40 °C, preferentemente a o aproximadamente temperatura ambiente. El tiempo para incubación es generalmente no mayor a aproximadamente 10 horas. Preferentemente, el tiempo de incubación es de aproximadamente 0.5 a 3 horas, y más preferentemente aproximadamente 1.5-3 horas a o aproximadamente temperatura ambiente para maximizar la unión del anticuerpo de interés a los reactivos de captura. La duración de incubación puede ser más larga si un inhibidor de proteasa se agrega para prevenir que proteasas en el fluido biológico degraden el anticuerpo de interés . En esta etapa, el pH de la mezcla de incubación ordinariamente será en el rango de aproximadamente 4-9.5, preferentemente en el rango de aproximadamente 6-9, más preferentemente aproximadamente 7 a 8. El pH del regulador de incubación se elige para mantener un nivel significativo de unión especifica de los reactivos de captura al anticuerpo de interés que se captura. Varios reguladores pueden emplearse para lograr y mantener el pH deseado durante esta etapa, incluyendo borato fosfato, carbonato, TRIS-HC1 o TRIS-fosfato, acetato, barbital y lo similar. El regulador particular empleado no es critico para la invención, pero en ensayos individuales uno regulador puede preferirse sobre otro . Segunda Etapa Opcional En una segunda etapa del método de ensayo en la presente, que es opcional, pero preferida, la muestra biológica se separa (preferentemente por enjuague) de los reactivos de captura inmovilizados para remover anticuerpo de interés no capturado. La solución utilizada para enjuague es generalmente un regulador ("regulador de enjuague") con un pH determinado utilizando las consideraciones y reguladores descritos arriba para la etapa de incubación, con un rango de pH preferible de aproximadamente 6-9. El enjuague puede hacerse tres o más veces. La temperatura de enjuague es generalmente de temperaturas de refrigerador a moderada, con una temperatura constante mantenida durante el periodo de ensayo, típicamente de aproximadamente 0-40°C, más preferentemente aproximadamente 4-30°C. Por ejemplo, el regulador de enjuague puede colocarse en hielo a 4°C en un receptor antes del enjuague y un lavaplatos puede utilizarse para esta etapa. ün agente de degradación u otro agente adecuado también puede agregarse en esta etapa para permitir que el anticuerpo ahora unido de interés sea covalentemente unido a los reactivos de captura si existe cualquier interés de que el anticuerpo capturado de interés pueda desasociarse a algún grado en las etapas subsiguientes. Tercer Etapa En la siguiente etapa, los reactivos de captura inmovilizados con cualquier anticuerpo unido de interés presente se hacen contacto con con anticuerpo detectable, preferentemente a una temperatura de aproximadamente 20-40 °C, más preferentemente aproximadamente 36-38 °C, con el tiempo y temperatura exactos para poner en contacto los dos siendo dependientes principalmente en el medio de detección empleado. Por ejemplo, cuando 4-metilumbeliferil-ß- galactosido (MUG) , streptavidin-HRP, o streptavidin-ß- galactosidasa se utiliza como el medio para detección, preferentemente el contacto se lleva a cabo durante la noche (por ejemplo, aproximadamente 15-17 horas o más) para amplificar la señal al máximo. Aunque el anticuerpo detectable puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal, preferentemente es un anticuerpo monoclonal, más preferentemente roedor, aún más preferentemente murino, todavía aún más preferentemente M7Ab 8A3 o 8C5, y más preferentemente MAb 8A3, para reducir el ruido de fondo. También, el anticuerpo detectable preferido es directamente detectable, y preferentemente es biotinilado. El medio de detección para la marca biotinilada es preferentemente HRP de streptavidina o avidin, y la lectura del medio de detección es preferentemente fluorimétrica o colorimétrica. Preferentemente, un exceso molar de un anticuerpo con respecto a la concentración máxima de anticuerpo libre de interés esperado (como se describe arriba) se agrega a la placa después se enjuaga. Este anticuerpo (que es directa o indirectamente detectable) es preferentemente un anticuerpo monoclonal, aunque cualquier anticuerpo puede emplearse. La afinidad del anticuerpo debe ser suficientemente alta que las cantidades pequeñas del anticuerpo libre de interés pueden detectarse, pero no es tal anta que causa que el anticuerpo de interés se empuje de los reactivos de captura. El mismo anticuerpo anti-idiotipico puede utilizarse para revestimiento y detección en el ensayo, o diferentes anticuerpos pueden utilizarse para revestimiento y detección. Se seleccionan preferentemente de manera que el ruido de fondo se minimiza. Cuarta Etapa En la última etapa del método de ensayo, el nivel de cualquier anticuerpo libre de interés de la muestra que es ahora unida a los reactivos de captura se mide utilizando un medio de detección para el anticuerpo detectable. Si la muestra biológica es de un paciente clínico, la etapa de medición preferentemente comprende comparar la reacción que ocurre como un resultado de las tres etapas anteriores con una curva estándar para determinar el nivel de anticuerpo de interés comparado con la cantidad conocida. El anticuerpo agregado a los reactivos de captura inmovilizados se marcarán ya sea directamente, o detectarán indirectamente por la adición, después del enjuague de exceso del primer anticuerpo, de un exceso molar de un segundo anticuerpo marcado dirigido contra IgG de las especies animales del primer anticuerpo. En el último ensayo indirecto, los antisueros marcados contra el primer anticuerpo se agregan a la muestra para producir el anticuerpo marcado in situ. La marca utilizada para ya sea el primer o segundo anticuerpo es cualquier funcionalidad detectable que no interfiere con la unión de anticuerpo libre de interés a los anticuerpos anti-idiotipicos . Ejemplos de marcas adecuadas son aquellas numerosas marcas conocidas para utilizarse en inrnunoensayo, incluyendo porciones que pueden detectarse directamente, tal como fluorocromo, marcas quimioluminescentes y radioactivas, asi como también porciones, tales como enzimas, que deben reaccionarse o derivarse para detectarse. Ejemplos de tales marcas incluyen los radioisótopos 32P, 1C, 125I, 3H, y 1311, fluoroforos tales como quelatos de tierra rara o fluoresceina y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansil, umbeliferona, luceriferasas, por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (Pat. de EE.UU. No. 4,737,456), luciferin, 2 , 3-dihidroeftalazinadionas, HRP, fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas de sacárido, por ejemplo, oxidasa de glucosa, oxidasa de galactosa, y glucosa-6-fosfato dehidrogenasa, oxidasas heterociclicas tal como uricaza y oxidasa de xantina, acoplada con una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de tinte tal como HRP, lactoperoxidasa, o microperoxidasa, biotin (detectable por, por ejemplo, avidin, estreptavidin, estreptavidin-HRP, and estreptavidin-ß-galactosidasa con MÜG) , marcas de giro, marcas de bacteriófago, radicales libres estables, y lo similar. La marca preferida es biotin y el medio de detección preferido es HRP de estreptavidina o avidina. Métodos convencionales están disponibles para unir estar marcas covalentemente a proteínas o polipéptidos . Por ejemplo, agentes de acoplamiento tales como dialdehidos, carbodiimidas, dimaleimidas, bis-imidatos, benzidina bis-diazotizida y marcas de enzima. Ver, por ejemplo, Pats. de EE.ÜÜ. Nos. 3,940,475 (fluorimetría) y 3,645,090 (enzimas); Hunter et al., Nature, 144 : 945 (1962); David et al., Biochemistry, 13:1014-1021 (1974); Pain et al., J. Immunol. Methods, 40:219-230 (1981); y Nygren, J. Histochem. and Cytochem. , _30:407-412 (1982). La marca más preferida en la presente es biotin utilizando estreptavidin-HRP para medios de detección. La conjugación de tal etiqueta, incluyendo las enzimas, al anticuerpo es un procedimiento manipulador estándar para alguien experto en la materia en técnicas de inmunoensayo . Ver, por ejemplo, O'Sullivan et al. "Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay, " en Methods in Enzymology, ed. J.J. Langone and H. Van Vunakis, Vol . 73 (Academic Press, New York, New York, 1981), pp. 147-166. Siguiendo la adición del último anticuerpo marcado, la cantidad de anticuerpo unido se determina al remover anticuerpo marcado no unido en exceso a través de enjuague y después medir la cantidad de la marca unida utilizando un método de detección apropiado para la marca, y correlacionando la cantidad medida con la cantidad del anticuerpo de interés en la muestra biológica. Por ejemplo, en el caso de enzimas, la cantidad de coloro desarrollada y medida será una medición directa de la cantidad del anticuerpo de interés presente. específicamente, si HRP es la marca, el color se detecta utilizando el OPD de substrato a absorbancia de 490 nm. En un ejemplo, después de un segundo anticuerpo marcado con enzima dirigido contra el primer anticuerpo no marcado se enjuaga de la fase inmovilizada, color o quimioluminescencia se desarrolla y mide al incubar el reactivo de captura inmovilizado con un substrato de la enzima. Después, la concentración del anticuerpo de interés se calcula al comparar con el coloro o quimioluminescencia generado por el anticuerpo estándar de interés que corre en paralelo . Producción de Anticuerpo Sigue una descripción en cuanto a técnicas ej emplificativas para la producción de los anticuerpos anti- idiotipicos utilizados de acuerdo con la presente invención. (i) Anticuerpos policlonales Los anticuerpos policlonales se originan preferentemente en animales por inyecciones subcutáneas múltiples (se) o intreperitoneales (ip) del antigeno relevante y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antigeno relevante con una proteina que es inmunogénica en las especies a inmunizarse, por ejemplo, hemocianina de limpeto clave, albúmina de suero, tiroglobulina de bovino, o inhibidor de tripsina de semilla de soya, utilizando un agente de derivación o bifuncional, por ejemplo, éster de sulfosiccinimida de maleimidobenzoil (conjugación a través de residuos de cisteina) , N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina) , glutaraldehido, anhídrido succínico, S0C12, o R1N=C=NR, donde R y R1 son grupos alquilo diferentes. Los animales se inmunizan contra el antígeno, conjugados inmunogénicos, o derivados al combinar, por ejemplo, 100 pg o 5 µg de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución intradérmicamente en múltiples sitios. ün mes después los animales se refuerzan con 1/5 a 1/10 la cantidad original de péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund por inyección subcutánea en múltiples sitios. Siete a 14 dias después los animales sangran y el suero se ensaya para concentración de anticuerpo. Los animales se refuerzan hasta que la concentración se nivelan. Preferentemente, el anima se refuerza con el conjugado del mismo antigeno, pero se conjuga con una proteina diferente y/o a través de un reactivo de degradación diferente. Los conjugados también pueden hacerse en cultivo- celular recombinante como fusiones de proteina. También, los agentes de agregado tales como alum se utilizan de manera adecuada para mejorar la respuesta inmune . (ii) Anticuerpos monoclonales Los anticuerpos monoclonales se obtienen de una población de anticuerpos substancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos excepto para posibles mutaciones que ocurren de manera natural que pueden estar presentes en cantidades menores. De esta manera, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como no siendo una mezcla de anticuerpos discretos . Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden hacerse utilizando el método de hibridoma primero descrito por Kohler et al.r Nature , 256 : 95 (1975), o puede hacerse por métodos de ADN recombinante (Patente de EE.UU. No. 4, 816, 567) .

En el método de hibridoma, un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster se inmuniza como se describe en la presente anteriormente para producir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína utilizada para inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. Los linfocitos se fusionan entonces con células de mieloma utilizando un agente de fusión adecuado, tal como glicol de polietileno, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Las células de hibridoma preparadas de esta manera se siembran y desarrollan en un medio de cultivo adecuado que contiene preferentemente una o más substancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma de origen, sin fusionar. Por ejemplo, si las células de mieloma de origen carecen de la transferasa de fosforibosil de guanina de hipoxantina de enzima (HGPRT o HPRT) , el medio de cultivo para las hxbridomas típicamente incluirán hipoxatina, aminopterin, y timidina (medio HAT) , tales substancias previenen el crecimiento de células deficientes de HGPRT. Las células de mieloma preferidas son aquellas que se fusionan de manera eficiente, soportan producción de alto nivel estable de anticuerpo por las células productoras anticuerpo seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como medio HAT. Entre estas, las estirpes de célula de mieloma preferidas son estirpes de mieloma murino, tales como aquellas derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, y células SP-2, P3X63Ag.U.l, o X63-Ag8-653 células disponibles de la Recolección del Cultivo Tipo Americano, Manassas, Virginia USA. Las estirpes de célula de heteromieloma de ratón-humano y mieloma de humano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales de humano (Kozbor, J. Immunol . , 133 : 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987) ) . El medio de cultivo en el cual las células de hibridoma se desarrollan se analiza para producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el anticuerpo de interés. Preferentemente, la especificidad de unión de anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se determina por inmunoprecipitación o por un ensayo de unión in vltro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ELISA. Tales clones también se selecciona para aquellos que producen menos ruido de fondo en el ensayo cuando se utilizan como reactivos de captura y/o anticuerpos detectables. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, determinarse por el análisis Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980). Después de que se identifican las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad deseada, afinidad, y/o actividad, los clones pueden subclonarse al limitar los procedimientos de dilución y desarrollarse por métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986) ) . Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden desarrollarse in vivo como tumores de ascitis en un animal. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan de manera adecuada del medio de cultivo, fluido de ascitis o suero por procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales tales como, por ejemplo, cromatografía de agarosa de proteína A-SEPHAROSE™, cromatografía de hidroxiapatatita, electroforesis de gel, diálisis, o cromatografía de afinidad. Una técnica de preparación específica utilizando tecnología de hibridoma comprende ratones inmunizantes tales como ratones CAF1 o Balb/c, por ejemplo, por inyección en las patas o bazo, con el anticuerpo de interés en un adyuvante tal como lípído A de monofosforilo/dicorinomicolato de trehalosa o como un conjugado del anticuerpo de interés con hemocianin de limpeto clave (KLH) o con hemocianin de Limulus . Las inyecciones, se hacen tantas veces como se necesite. Los ratones se sacrifican y los nodos linf popliteales o esplenocitos obtenidos de los ratones inmunizados, especialmente aquellos con altas concentraciones, se fusionan con una estirpe de célula de mieloma murino tal como SP2/0 o P3X63Ag.ü.l (Colección de Cultivo de Tipo Americano (ATCC, Manassas, VA) ) . Los hibridomas resultantes se seleccionan para anticuerpos con afinidad de unión para el anticuerpo de interés pero no otros anticuerpos que se une a un antigeno diferente. Esta selección puede tener lugar por ELISA convencional para secreción de anticuerpo que se une a anticuerpo inmovilizado de interés o para producción de IgG con una capacidad de inhibición de más de aproximadamente 95% (inhibición de unión del anticuerpo de interés al antigeno de proteina) . Esta selección define una población de anticuerpos con reactividad nominal o más alta asi como también selectividad para el anticuerpo de interés. La selección adicional puede realizarse para identificar aquellos anticuerpos con propiedades especialmente preferidas para ELISAs. Los criterios utilizados para seleccionar un anticuerpo anti-idiotipico preferido incluyen que debe unirse al anticuerpo de interés con afinidad relativamente alta (Kd< aproximadamente 10~8 M) , y su unión al anticuerpo de interés debe ser mutualmente exclusiva con unión a la proteina de transmembrana de analito. Debe también proporcionar el ensayo más limpio con el menos ruido de fondo. Los clones positivos pueden re-seleccionarse utilizando resonancia de plasmón de superficie utilizando un instrumento BIACORE™ para medir la afinidad del anticuerpo anti-idiotipico para el anticuerpo de interés (como se refleja en su tasa opuesta) y la exclusividad mutua de unión. IgG(Fc) anti-ratón de conejo puede inmovilizarse sobre la superficie del biosensor y utilizada para capturar anticuerpos anti-idiotípicos de sobrenadantes de cultivo de hibridoma . El anticuerpo de interés a 0.2 nM solo y en la presencia de 0.9 nM proteína reactiva C (CRP) puede inyectarse sobre la superficie del anticuerpo anti-idiotipico inmovilizado y la acumulación de masa relativa comparada. Las células de hibridoma que se seleccionan se clonan al limitar la dilución para obtener los clones deseados. El anticuerpo anti-idiotipico puede entonces purificarse y aislarse de estos clones. Ver Pub. de EE.UU. No. US 20020142356 para un ejemplo para preparar un anticuerpo anti-idiotipico, así como también Durrant et al., Int J. Cáncer, J_92 (3) : 414-20 (2001) y Bhattacharya-Chatterjee, Curr ¦ Opin . Mol. Ther., 3(l):63-9 (2001). Los anticuerpos monoclonales también pueden producirse de manera recombinante . ADN codificando los anticuerpos monoclonales se aislan fácilmente y secuencian utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, al utilizar sondas de oligonucleótido que son capaces de unirse específicamente a genes codificando las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos murino) . Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de tal ADN. Una vez aisladas, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que se transfectan entonces en células huésped tales como células E. coli células, células COS de simio, células de Ovario de Hámster Chino (CHO) , o células de mieloma que no producen de otra manera proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. Los artículos de revisión en expresión recombinante en bacterias de ADN codificando el anticuerpo incluyen Skerra et al . , Curr . Opinión in Immunol . , 5:256-262 (1993) y Plückthun, Immunol . Revs . , 130:151-188 (1992) . En una modalidad adicional, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo pueden aislarse de bibliotecas de fago de anticuerpo generadas utilizando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature, 348^552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352 : 624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222 : 581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos de humano y murino, respectivamente, utilizando bibliotecas de fago. Las publicaciones subsecuentes describen la producción de anticuerpos de humano de alta afinidad (rango nM) al cambiar la cadena (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), asi como también infección de combinación y recombinación in vivo como una estrategia para construir bibliotecas de fago muy grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids . Res., 21:2265-2266 (1993)). De esta manera, estas técnicas son alternativas viables para técnicas de hibridoma de anticuerpo monoclonal tradicionales para aislamiento de anticuerpos monoclonales. El ADN también puede modificarse, por ejemplo, al sustituir la secuencia de codificación para dominios constantes de cadena ligera y pesada en lugar de las secuencias murino homologas (Patente de EE.UU. No. 4,816,567; Morrison, et al., Proc. Nati Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), o al unir covalentemente a la secuencia de codificación de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia de codificación para un polipéptido de no inmunoglobulina. Muchos de los procedimientos útiles para practicar la presente invención, ya sea o no descritos en la presente en detalle, se conocen bien por aquellos expertos en las materias de biología molecular, bioquímica, inmunología, y medicina. Una vez que el anticuerpo de interés se identifica, generando el anticuerpo anti-idiotípico estaría dentro de la experiencia del practicante experto ordinario en este campo. Equipo Como una materia de conveniencia, el método de ensayo de esta invención puede proporcionarse en la forma de un equipo. Tal equipo es una combinación empacada incluyendo los elementos básicos de: (a) capturar los reactivos comprendidos de anticuerpos anti-idiotipicos contra el anticuerpo de interés, en donde los anticuerpos se unen específicamente a dos diferentes sitios de unión en el anticuerpo de interés; (b) anticuerpos anti-idiotipicos detectables (marcados o no marcados) que se unen específicamente a dos diferentes sitios de unión en el anticuerpo de interés; y (c) instrucciones en como realizar el método de ensayo utilizando estos reactivos. Estos elementos básicos se definen anteriormente en la presente. Preferentemente, el equipo puede comprender un soporte sólido para los reactivos de captura, que pueden proporcionarse como un elemento separado o en el cual los reactivos de captura ya se inmovilizan. Por lo tanto, los anticuerpos de captura en el equipo pueden inmovilizarse en un soporte sólido, o pueden inmovilizarse en tal soporte que se incluye con el equipo o proporciona por separado del equipo. Preferentemente, los reactivos de captura se revisten en una placa de microtitulación . Los anticuerpos detectables pueden ser anticuerpos marcados detectados directamente o anticuerpos no marcados que se detectan por anticuerpos marcados dirigidos contra los anticuerpos no marcados originados en una especie diferente. Donde la marca es una enzima, el equipo incluirá de manera ordinaria substratos y cofactores requeridos por la enzima, donde la marca es un fluoroforo, un precursor de tinte que proporciona el cromoforo detectable, y donde la marca es biotin, una avidina tal como avidin, estreptavidin, o estreptavidina conjugada con HRP o ß-galactosidasa con MUG. En una modalidad especifica preferida, los reactivos de captura son anticuerpos monoclonales, preferentemente roedor, más preferentemente murino o rata, aún más preferentemente murino, y más preferentemente MAb 8A3 o MAb 8C5. También en modalidades preferidas, el anticuerpo detectable es un anticuerpo monoclonal biotinilado, el anticuerpo monoclonal es roedor, más preferentemente murino o rata, aún más preferentemente murino, todavía aún más preferentemente MAb 8A3 o MAb 8C5, y más preferentemente MAb 8A3. Preferentemente, los reactivos de captura se inmovilizan en este equipo. El equipo también típicamente contiene el anticuerpo de interés como un estándar (por ejemplo, anticuerpo purificado de interés) , así como otros aditivos tales como estabilizadores, reguladores de enjuague e incubación, y lo similar.

Ejemplos de estándares para el anticuerpo de interés son anticuerpos monoclonales, más preferentemente anticuerpos humanizados, y ' aún más preferentemente un anticuerpo 2H7 humanizado tal como disponible de Genentech, Inc., South San Francisco, California. Los componentes del equipo se proporcionarán en proporciones predeterminadas, con las cantidades relativas de los diversos reactivos variados de manera adecuada para proporcionar las concentraciones en solución de los reactivos que maximizan la sensibilidad del ensayo. Particularmente, los reactivos pueden proporcionarse como polvos secos, usualmente liofilizados, incluyendo excipientes, que en disolución proporcionarán una solución de reactivo teniendo la concentración apropiada para combinar con la muestra a probarse . III . E emplos Experimentales Las características anteriores y otras de la invención se describirán ahora más particularmente con referencia a las figuras acompañantes y señaladas en las reivindicaciones. Las modalidades particulares descritas abajo se proporcionan a manera de ilustración y no se entienden como construyéndose como una limitación en el alcance de la invención. Será aparente para un experto en la materia que muchas modificaciones pueden hacerse a la presente invención sin apartarse del espíritu o características esenciales de la invención. Los siguientes ejemplos se proponen para ilustrar modalidades ahora conocidas para practicar la invención, pero la invención no se considera limitada a los ejemplos. Las descripciones de todas las citaciones en la presente se incorporan de manera expresa para referencia. Ejemplo 1 Materiales y Métodos Anticuerpo anti-CD20 Las variantes de anticuerpo anti-CD20 humanizado y anticuerpo quimérico de longitud completa se generan de un anticuerpo CD20 anti-humano de ratón utilizando una estructura IgGi de humano en Genentech, Inc. Fueron expresados en 293 células y purifican utilizando una columna de proteína A como se describe previamente (Presta et al.r Cáncer Res . , supra) . Ver Figuras 6A y 6B para las secuencias de aminoácidos de los dominios variables de cadena pesada y ligera respectivas (VL y VH) del anticuerpo murino de origen, variante humanizada h2H7.vl6 (SEQ ID NO: 12), y la cadena ligera de kappa de humano de subgrupo 1 o la secuencia de consenso humana de subgrupo III de cadena pesada. Clones CHO expresando CD20 cADN CD20 de humano (Genentech, Inc.) fue subclonado en un vector de intrón de reductasa de dihidrofolato modificado (DHFR) en el sitio Spel como se describe en Meng et al., Gene, 242: 201-207 (2000). Células CHO Kl DUX Bll (DHFR-) (Universidad de Columbia) fueron desarrolladas en 50:50 F12/DMEM medio complementado con 2 mM L-glutamina, 10 :g/ml glicina, 15 :g/ml hipoxatina, 5 :g/ml timidina, 100 unidades/ml penicilina, 100 :g/ml estreptomicin, y 5% suero de bovino fetal (FBS) (Gibco BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD) en un incubador de 5% C02 humectado a 37°C. Células CHO en placas de 100-mm de diámetro fueron transfectadas con un vector de plásmido linearizado 4 :g/ml utilizando sistema de transfección POLYFECT™ (Qiagen Inc., Santa Clarita, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células CHO transfectadas se desarrollan en 50:50 F12/DMEM medio complementado con 2 mM L-glutamina, 100 unidades/ml penicilina, 100 :g/ml estreptomicina y 5% FBS dializado. Los clones con diferentes niveles de expresión de CD20 se obtienen por clasificador de célula activado por fluorescencia (FACS) clasificándose como se describe por Meng et al., supra, utilizando 5 :g/ml RITÜXAN® seguido por IgG Fe anti-humano de cabgra conjugado con isotiocianato de fluorescein (FITC) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) para coloración. Clon C12M se obtiene al desarrollar células 2H3 de clon en 25-nM ntetotrexato . Ensayo de unión WIL2 Células WIL2-S B-linfoblastoide de humano (Colección de Cultivo Tipo Americano, Manassas, VA) se desarrollaron en RPMI 1640 complementado con 2 mM L-glutamina, 20 mM HEPES, pH 7.2, y 10% FBS inactivado por calor en un incubador 5% C02 humectado a 37°C. Se enjuagan con PBS que contiene 1% FBS (regulador de ensayo) y se colocan en 250,000-300,000 célula/cavidad en placas de fondo redondo de 96 cavidades (Nunc, Roskilde, Dinamarca) . Los estándares (15.6-1000 ng/ml de IgG anti-CD20 humanizado en diluciones seriales dobles) y muestras (2.7-2000 ng/ml de IgG anti-CD20 humanizada en diluciones seriales triples) en regulador de ensayo 100-:1 fueron agregadas a las placas. Las placas se incuban en hielo por 45 min. Para remover el anticuerpo no unido, 100 :1 de regulador de ensayo se agrega a las cavidades. Las placas se centrifugan y los sobrenadantes se remueven. Las células se enjuagan dos veces más con 200 :1 de regulador de ensayo. El anticuerpo unido se detecta al agregar anticuerpo IgG anti-humano de cabra conjugado con HRP (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) a las placas. Después de una incubación de 45 min, las células se enjuagan y el substrato 3, 3 ' , 5, 5 '-tetrametil benzidina (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) fue agregado. La reacción se detiene al agregar 1 M ácido fosfórico. La absorbencia se lee a 450 nm en un lector apilador TITERTEK™ (ICN, Costa Mesa, CA) . Curvas de concentración fueron ajustadas con un programa de ajuste de curva de regresión de cuatro parámetros (software KALEIDAGRAPH™, Synergy Software, Reading, PA) . La absorbencia en el punto medio de la curva de concentración (mid-OD) de estándar se calcula. Las concentraciones correspondientes de estándar y muestras en esta mid-OD se determinan (software KALEIDAGRAPH™) . La actividad relativa se calcula al dividir la concentración mid-OD de estándar por aquella de la muestra. Coeficiente de variación (CV) por análisis ANOVA se calcula utilizando el programa STATVIEW™ (Instituto SAS, Cary, NC) . Los valores mostrados fueron desviación promedio ± estándar. Las barras de error en las figuras son desviaciones estándar. Ensayo de unión CHO El ensayo se realiza de manera similar como el ensayo de unión WIL2 al menos que se menciona otra manera. Para el formato de suspensión, células CHO se separan utilizando una solución de disociación de célula no enzimática (Sigma, St. Louis, MO) . Para el formato adherente, las células 2H3 CHO fueron desarrolladas en placas de cultivo celular de 96 cavidades de fondo plano (Falcon, Becton Dickinson Labware, Franklin, NJ) y fueron 80-90% confluentes en el día del ensayo. El medio de crecimiento se utiliza para el ensayo para mantener las células unidas a las placas. Las células se enjuagan entre etapas de incubación al agregar el medio de crecimiento a las placas y sacudir las placas para remover el regulador de enjuague. Análisis Scatchard RITUXAN® (Genentech Inc., South San Francisco, CA y IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA; Reff et al., Blood, 83 : 435-445 (1994)) fue yodado utilizando el método de lactoperoxidasa (13.7 mCi/mg) . Para el formato adherente, las células CHO se colocan en placas de 24 cavidades a 50,000 células/cavidad. Después de un crecimiento de dos días, 0.2 nM RITUXAN® marcado y RITUXAN® no marcado serialmente diluido 2.5 veces (10-1000 nM) en 0.4-ml F12/DMEM 50:50, 2% FBS (regulador de unión) fueron agregados a las células. Después de una incubación de dos horas en hielo, las células se enjuagan con el regulador de unión y separan utilizando tripsin-EDTA (CLONTICS®, Cambrex Bio Science Walkersville, Inc., Walkersville, MD) y cuentan en un contador gamma (Packard Instrument Company, Perkin-Elmer, Downers Grove, IL) . El número de células por cavidad utilizadas para análisis de datos se determina al contar las células en cavidades de control que no reciben RITUXAN®. Para el formato de suspensión, las células se separan utilizando solución de disoaciación celular no enzimática (Sigma) . Los anticuerpos RITUXAN® marcados y no marcados se incuban con 300,000 células en tubos de prueba cónicos de 1.5-ml como se describe arriba. Células fueron centrifugadas y enjuagadas con 0.8 mi FBS. Fueron suspendidas en 0.5 mi PBS y contaron como se describe arriba. Las constantes de unión y número de receptores se calculan utilizando el programa NEW LIGAND™ (Genentech, Inc.) escritas de acuerdo con el programa LIGAND™ (Munson and Rodbard, Anal. Biochem. , 107 : 220-239 (1980)). Generación de anticuerpos anti-idiotípicos específicos Los anticuerpos monoclonales para un anticuerpo anti-CD20 humanizado se generan al inyectar 0.5 :g de un IgG anti-CD20 humanizada (2H7.vl6 mostrada en Fig. 6) en lipido A de monofosforil/adyuvante de dicorinomicolato de trehalosa (Corixa, Hamilton, MT) en las patas de ratones Balb/c (Charles River Laboratories, Wilmington, DE) once veces. Los nodos linf popliteales de ratones con altas concentraciones se fusionan con células de mieloma P3X63Ag.ü.l (Colección de Cultivo Tipo Americano (ATCC, Manassas, VA) ) . Las células de hibridoma produciendo anticuerpos con afinidad de unión para IgG anti-CD20 humanizado, pero no HERCEPTIN®, fueron clonadas al limitar la dilución para obtener clones 8C5 y 8A3. Estos hibridomas, llamados 8C5.1 y 8A3.10, se depositan como ATCC Nos. PTA-5915 y PTA-5914, produciendo estos anticuerpos, respectivamente. La secuencia de anticuerpo 8A3 se proporciona en la Figura 5. ELISA para cuantificación de anticuerpos anti~CD20 Placas de microcavidad de 96 cavidades MAXISORP™ (Nunc, Roskilde, Dinamarca) fueron revestidas durante la noche a 4°C con 0.25 :g/ml anticuerpo anti-idiotipico 8C5 en 50 mM regulador de carbonato, pH 9.6. Las placas se bloquean con 0.5% albúmina de suero de bovino, 10 ppm PROCLIN 300™ (Supelco, Bellefonte, ??) en PBS . Los estándares de IgG anti-CD20 humanizada o IgG anti-CD20 de ratón de origen (2.0-250 ng/ml en dilución serial 2 veces) en PBS que contiene 0.5% albúmina de suero de bovino, 0.05% surfactante no iónico POLYSORBATE 20™, 5 mM EDTA, 0.25% CHAPS, 0.2% globulinas gamma de bovino (Sigma, St. Louis, MO) y 0.35N NaCl (regulador muestra) fueron agregados a las placas. Después de una incubación de 2 horas a temperatura ambiente, el anticuerpo unido a las placas se detecta al agregar 8A3 biotinilado seguido por estreptavidin-HRP (Amdex, Copenhagen, Dinamarca) . Las placas fueron desarrolladas y la curva de concentración del estándar ' se ajusta como se describe arriba. Los puntos de datos que caen en el rango de la curva estándar se utilizan para calcular el anticuerpo anti-CD20, concentración en muestras. Los efectos de suero se estudian utilizando suero de humano o ratón agrupado (Golden West Biologicals Inc., Temecula, CA) . Resultados Ensayos de unión a célula para medir afinidad de unión relativa de anticuerpos anti~CD20 humanizados ün ensayo de unión WIL2 se desarrolla para medir afinidad de unión relativa de variantes de anticuerpo anti-CD20 humanizado, ya que CD20 es una proteina de multi- transmembrana y un CD20 soluble nativo extracelular no está disponible. En este ensayo, las células WIL2 se incuban con anticuerpos anti-CD20 serialmente diluidos y anticuerpo anti- CD20 unido se detecta utilizando Fc-HRP IgG anti-humano. Las células se enjuagan entre etapas de incubación al agregar regulador de enjuague, centrifugar las células, y remover el regulador de enjuague. Este ensayo fue cuantitativo y reproducible . Las curvas de concentración representativas de una IgG anti-CD20 humanizada y el anticuerpo anti-CD20 quimérico derivado del mismo anticuerpo de ratón de origen se muestran en Fig. 1A. Esta IgG anti-CD20 humanizada se ensaya en 12 ensayos independientes por duplicado y la actividad de unión relativa a la IgG anti-CD20 quimérica fue 0.63 ± 0.08. Cvs de inter- e intra-ensayo fueron 11.2% y 8.77%, respectivamente. También se evalúa el ensayo de unión a célula utilizando células CHO transfectadas adherentes para simplificar las etapas de enjuague e incrementar el rendimiento del ensayo. Las curvas de concentración representativas de la IgG anti-CD20 quimérica e IgG anti-CDlO humanizada que se une al clon CHO de alta expresión 2H3 se muestran en la Fig. IB. Las señales fueron inferiores que aquellas obtenidas utilizando las células WIL2 (Fig. 1A) , probablemente debido, sin limitarse a ninguna otra teoría, a pocas células dobles utilizadas en el formato adherente.

Varias variantes de anticuerpo humanizado se analizan tanto en los ensayos de unión WIL 2 y CHO 2H3 y resultados similares se obtienen. Ya que toma tiempo amplificar las células para obtener clones de alta expresión, el número minimo de moléculas CD20 por célula requerida para generar una buena curva de concentración se prueba. Los clones CHO expresando diferentes niveles de CD20 se obtienen por clasificación FACS . Los clones seleccionados se evalúan para unirse a RITUXAN® (Fig. 2) y analizarse por análisis Scatchard (Tabla 1) . El número de moléculas CD20 se estima para ser 1.2 millones por célula para el clon 2H3 utilizando el formato de célula adherente. Los números de las moléculas CD20 se estiman para ser 1.0 y 0.16 millones por célula para WIL2 y clon 2H3, respectivamente, utilizando el formato de célula de suspensión. Las afinidades de unión para células WIL 2 y 2H3 CHO células fueron estimadas para ser 8.6 y 3.9 nM, respectivamente (Tabla 1). Estas afinidades están próximas a la afinidad de unión 5.2 nM estimada de RI UXAN® para células SB de humano (Reff et al., supra) . Clon 4H10 de CHO expresando tan pocas como 33,000 moléculas CD20 por célula dieron una buena curva de concentración en el ensayo de unión (Tabla 1 y Fig. 2) . Este nivel de expresión está dentro de dos veces la expresión de 60,000 moléculas CD20 por célula encontrada en células Daudi (Bubien et al., J. Cell . Biol., 121: 1121-1132 (1993) ) y puede ser suficiente para evaluar anticuerpos anti-CD20 en general. Tabla 1 Análisis Scatchard de células expresando CD20 (n = 3) aCalculado asumiendo que un anticuerpo se une a una molécula CD20. Ensayo de unión de anticuerpo anti-idiotipico para medir concentraciones de suero de anticuerpo anti-CD20 humanizado Para medir las concentraciones de suero de anticuerpo anti-CD20 humanizado para estudios clínicos, un planteamiento alternativo incluyendo un ensayo de alto rendimiento se desarrolla utilizando anticuerpos anti-idiotípicos específicos para el anticuerpo anti-CD20 humanizado 2H7.vl6, ya que una molécula CD20 nativa no se requiere. Los anticuerpos 8C5 y 8A3 bloquearon la unión del 2H7 humanizado (2H7.vl6) y anticuerpo anti-CDO 2H7 quimérico, pero no RITUXAN®, a células WIL2. Cuando se revisten en placas, se unen a IgG anti-CD20 humanizada (2H7.vl6 y 2H7.v31-ver Figs . 6 y 8 para secuencias), pero no HERCEPTIN®, E25, y anti-VEGF, que fueron humanizadas utilizando la misma estructura IgGi de humano. También mostraron no unión a RITUXAN® y poca unión (<50,000 veces) a IgG normal de humano (Fig. 3). Una ELISA utilizando 8C5 para revestimiento y 8A3 biotinilado para detección toleraron 20% de cavidad de suero de humano. La recuperación de 3.9-250 ng/ml IgG anti-CD20 humanizada en 20% suero de humano fue 93-117% (Fig. 4A) . Por lo tanto, este ensayo tuvo una sensibilidad de 20 ng/ml para IgG anti-CD20 humanizada en suero de humano y puede utilizarse para soportar estudios clínicos. Anticuerpos anti-idiotípicos 8C5 y 8A3 también reconocieron que el anticuerpo anti-CD20 de ratón utilizado para humanización. IgG anti-CD20 de ratón origen dio una buena curva de concentración en ELISA utilizando 8C5 para revestimiento y 8A3 biotinilado para detección. La recuperación de 2.0-250 ng/ml IgG anti-CD20 de ratón en 10% suero de ratón fue 97-109% (Fig. 4B) . La reproducción del ensayo se evalúa utilizando una IgG anti-CD20 de ratón que tuvo el mismo dominio variable como el anticuerpo anti-CD20 de ratón de origen. Las alícuotas congeladas de controles alto, medio y bajo, en el regulador muestra se analizan con los estándares y sus concentraciones fueron 96.1+6.5, 17.4+1.2 y 2.26+0.69 ng/ml, respectivamente. El por ciento CV para los controles alto, medio y bajo en regulador fueron 4.56, 7.06, y 29.3 para el inter-ensayo, respectivamente, y 7.05, 2.58, y 13.8 para el intra-ensayo, respectivamente (n=12). El control bajo tuvo una concentración próxima a la concentración de 2.0 ng/ml del estándar más bajo y tuvo variaciones de ensayo más altas. Discusión Para cuantificación de concentraciones de suero de anticuerpo anti-CD20 humanizado para estudios clínicos, el efecto de suero de humano en ensayos de unión CHO y WIL2 se analiza. En el ensayo de unión WIL2, la presencia de 10% suero de humano dio un fondo equivalente a 100 ng/ml de IgG anti-CD20 humanizada y reduce la señal. En el ensayo de unión CHO, no dio un fondo significativo pero reduce grandemente la señal. La reducción de señal también se observa en un ELISA utilizando una preparación de membrana de células IL2 para revestimiento. Sin limitarse a cualquier teoría, esta reducción de señal también puede deberse a CD20 de humano circulante en suero (Manshorai et al., Blood, 101 : 2507-2513 (2003) ) . La presencia de 10% suero de ratón no afecta el ensayo de unión WIL2 significativamente. La recuperación de 16-1000 ng/ml IgG anti-CD20 humanizada en 10% suero de ratón fue 75-102%. Ya que no fue necesario utilizar una molécula CD20 nativa, un anticuerpo para el dominio intracelular de CD20 (clon 1H1 (FBl) , BD PharMingen, San Diego, CA) fue utilizado para capturar CD20 en las células WIL2 Usadas, pero no resulta en sensibilidad de ensayo suficiente . Como un método mejorado, alternativo, un ELISA utilizando anticuerpos anti-idiotipicos específicos, principalmente, 8C5 para revestimiento y 8A3 biotinilado para detección, fue desarrollado para cuantificación de anticuerpo anti-CD20 humanizado en suero de humano (Fig. 4A) . Ya que el anticuerpo 8C5 tuvo una afinidad ligera para IgG de humano normal (Fig. 3A) e IgG de humano estuvo presente a una alta concentración en suero de humano, 20% suero de humano dio. un fondo equivalente a 4 ng/ml IgG anti-CD20 humanizada cuando IgG anti-humano Fc-HRP fue usada para detección. Por lo tanto, el uso de 8A3 biotinilado para detección fue importante para reducir el fondo de suero. El anticuerpo de detección 8A3 en solución compitió con 8C5 revestido en la placa para unirse a IgG anti-CD20 humanizada (v.16). Sin embargo, ya que IgG tiene dos sitios de unión y puede unirse a un 8C5 y un 8A3 al mismo tiempo, IgG anti-CD20 humanizada dio una buena curva de concentración en este ELISA. El revestimiento con 0.25 :g/ml 8C5 dio señales más altas en comparación con el revestimiento con 1 :g/ml . Sin limitarse a ninguna teoría, se cree que a una densidad de revestimiento inferior, IgG anti-CD20 humanizada fue más probable que se una a la placa revestida con 8C5 solamente un sitio de unión, permitiendo al otro sitio de unión unirse al anticuerpo de detección 8A3. ELISA utilizando 8C5 para revestimiento y 8A3 biotinilado para detección también podría utilizarse para medir el anticuerpo anti-CD20 de ratón de origen en suero de ratón para xenoinjerto u otros estudios de ratón (Fig. 4B) . El ensayo de unión WIL2 utilizando Fc-HRP anti-ratón para detección podría no utilizarse para este propósito ya que 10% suero de ratón dio un fondo alto. Concentraciones de suero de un anticuerpo anti-CD20 de ratón que tuvieron el mismo dominio variable como el anticuerpo anti-CD20 de ratón de origen se miden por este ELISA. Los resultados estuvieron de acuerdo con aquellos obtenidos por un ELISA menos sensible utilizando 8?3 Fab para revestimiento y IgG anti-ratón Fc-HRP para detección, que no compite con el anticuerpo de revestimiento. Este anticuerpo anti-CD20 de ratón también dio una buena curva de concentración en un ELISA utilizando 8A3 para revestimiento y 8A3 biotinilado para detección. Por lo tanto, es posible desarrollar un ELISA para anticuerpo anti-CD20 utilizando solamente un anticuerpo anti-idiotípico específico, con resultados similares obteniéndose para ambos.

Ejemplo 2 ün ELISA como se establece en el Ejemplo 1 puede emplearse para detectar anticuerpos para un receptor de quimoquina. Esto seria útil, por ejemplo, para detectar anticuerpos humanizados para un receptor de quimoquina en una muestra clinica, donde los anticuerpos humanizados se administran a pacientes clínicos para tratar un desorden mediado por quimoquina. De esta manera, anticuerpos monoclonales anti-idiotípicos se generan para MAb LS132.1D9 (1D9) o para un anticuerpo humanizado que puede competir con ID9 para unión a CCR2 de humano como se describe en Pat. de EE.UU. No. 6, 696,550, al inyectar 0.5 :g de 1D9 o el anticuerpo humanizado formulado en adyuvante de lípido A de monofosforilo/dicorinomicolato de trehalosa (Corixa, Hamilton, MT) en las patas de ratones Balb/c (Charles River Laboratories, Wilmington, DE) once veces. Nodos linf popliteales de ratones con altas concentraciones se fusionan con células de mieloma P3X63Ag.U.l (Colección de Cultivo Tipo Americano (ATCC, Manassas, VA) ) . Las células de hibridoma produciendo anticuerpos con afinidad de unión para 1D1 o el anticuerpo humanizado utilizado como inmunógeno, pero no para otros anticuerpos de ratón de la misma subclase como 1D1 u otro anticuerpo humanizado, que se humaniza utilizando la misma estructura, dirigida a un epítopo diferente o antígeno, se clonan para limitar la dilución para obtener clones adecuados. Los anticuerpos de tales clones, que son anti- idiotipicos para 1D1 o el anticuerpo humanizado utilizado como inmunógeno, se aislan de los clones y utilizan como revestimiento y medios de detección en una muestra biológica que contiene o que se sospecha que contiene 1D1 o el anticuerpo humanizado utilizado como inmunógeno, utilizando el método ELISA básico descrito en el Ejemplo 1. Alternativamente, MAb 3C3, que reacciona selectivamente con transíectantes GPR-9-6 (ver Pat. de EE.UU. No. 6,689,570) se utiliza para inmunizar los ratones balb/c utilizando la técnica como se observa arriba para obtener anticuerpos anti-idiotipicos para MAb 3C3, que se utilizan -entonces en el ensayo como revestimiento y agentes de detección . En resumen, un ensayo a base de anticuerpo anti-idiotipico se ha desarrollado para medir concentraciones, en muestras biológicas tal como suero, de un anticuerpo de interés, por ejemplo, un anticuerpo humanizado y su anticuerpo de ratón de origen o el anticuerpo murino/humano quimérico derivado del anticuerpo de origen. Este planteamiento a base de anticuerpo anti-idiotipico puede aplicarse en general para detectar y medir en muestras biológicas los anticuerpos o las concentraciones de anticuerpos dirigidos a proteínas de transmembrana de superficie celular con un dominio extracelular de intervención pequeño tal como CD20 y receptores de quimoquina . Ejemplo 3 Preparación de Anticuerpos Humanizados El anticuerpo 2H7 humanizado puede comprender uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las- siguientes secuencias CDR: secuencia CDR Ll RASSSVSYXH en donde X es M o L (SEQ ID NO:29), por ejemplo, SEQ ID N0:14 (Fig. 6A) , secuencia CDR L2 de SEQ ID N0:15 (Fig. 6A) , secuencia CDR L3 QQWXFNPPT en donde X es S o A (SEQ ID NO:30), por ejemplo, SEQ ID NO: 16 (Fig. 6A) , secuencia CDR Hl de SEQ ID NO:20 (Fig. 6B) , secuencia CDR H2 de AIYPGNGXTSYNQKFKG donde X es D o A (SEQ ID NO:31), por ejemplo, SEQ ID N0:21 (Fig. 6B) , y secuencia CDR H3 de VVYYSXXYWYFDV donde X en posición 6 es N, A, o Y, y X en posición 7 es S o R (SEQ ID NO:32), por ejemplo, SEQ ID NO:22 (Fig. 6B) . Las secuencias CDR anteriores están generalmente presentes sin secuencias de estructura pesadas variables y ligeras variables de humano, tales como substancialmente los residuos FR consenso de humano de subgrupo 1 kappa de cadena ligera de humano (VL61) , y substancialmente los residuos FR consenso de humano de subgrupo III de cadena pesada de humano (VHIII) - La región pesada variable puede unirse a una región constante de cadena IgG de humano, en donde la región puede ser, por ejemplo, IgGl o IgG3. Ver también WO 2004/056312 (Lowman et al.) . En una modalidad preferida, tal anticuerpo comprende la secuencia de dominio pesada variable de SEQ ID NO: 18 (??ß, como se muestra en Fig. 6B) , opcionalmente también que comprende la secuencia de dominio ligera variable de SEQ ID NO: 12 (v!6, como se muestra en Fig. 6A) , que opcionalmente comprende las substituciones de aminoácido de D56A y N100A en la cadena pesada y S92A en la cadena ligera (v96) . Preferentemente, el anticuerpo es un anticuerpo intacto que comprende las secuencias de aminoácidos de cadena ligera y pesada de SEQ ID NOS : 3 y 4 o 5, respectivamente. ün anticuerpo 2H7 humanizado preferido es ocrelizumab. El anticuerpo en la presente puede comprender además al menos una substitución de aminoácido en la región Fe que mejora la actividad ADCC, tal como una en donde las substituciones de aminoácido están en posiciones 298, 333, y 334, preferentemente S298A, E333A, y K334A, utilizando numeración de EE.UU. de residuos de cadena pesada. Otra modalidad preferida es donde el anticuerpo es 2H7.vl38 que comprende las secuencias de aminoácidos de cadena pesada y cadena ligera de SEQ ID Nos. 33 y 34, respectivamente, como se muestra en Figs . 10 y 11, que son alineaciones de tales secuencias con las secuencias de aminoácidos de cadena pesada y cadena ligera de 2H7.vl6. Alternativamente, tal anticuerpo 2H7 humanizado intacto preferido es 2H7.v477, que tiene las secuencias de cadena pesada y cadena ligera de 2H7.vl38 excepto para la substitución de aminoácido en posición de cadena pesada 434, por ejemplo, N434W, que incrementa unión FcRn y vida media de suero del anticuerpo. Cualquiera de estos anticuerpos puede comprender además al menos una substitución de aminoácido en la región Fe que incrementa la actividad CDC, por ejemplo, que comprende al menos la substitución en posición 326, preferentemente K326A. Ver Patente de EE.UU. No. 6,528,624B1 (Idusogie et al.). Algunas variantes 2H7 humanizadas preferidas son aquellas que comprende el dominio ligero variable de SEQ ID NO: 12 y el dominio pesado variable de SEQ ID NO: 18, incluyendo aquellas con o sin substituciones en una región Fe (si está presente), y aquellas que comprende un dominio pesado variable con alteración N100A; o D56A y N100A; o D56A, N100Y, y SlOOaR; en SEQ ID NO: 18 y un dominio ligero variable con alteración M32L; o S92A; o 32L y S92A; en SEQ ID NO: 12. En un resumen de algunas varias modalidades preferidas de la invención, la región variable de variantes en base a 2H7.V16 tendrá las secuencias de aminoácidos de vi 6 excepto en las posiciones de substituciones de aminoácidos que se indican en la Tabla 2 abajo. Al menos que se indique de otra manera, las variantes 2H7 tendrán la misma cadena ligera como aquella de vi 6. Tabla 2 Variantes 2H7 Un 2H7 humanizado particularmente preferido es un anticuerpo intacto o fragmento de anticuerpo que comprende la secuencia de dominio ligero variable: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAP PLIYAPSNLASGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 12) ; y la secuencia de dominio pesado variable: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYN QKFKGRFTISVDKS NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 18) . Donde el anticuerpo 2H7 humanizado es .un anticuerpo intacto, puede comprender la secuencia de aminoácidos de cadena ligera: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYE HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 3); y la secuencia de aminoácidos de cadena pesada: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYN QKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 4) o la secuencia de aminoácidos de cadena pesada: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYN QKFKGRFTISVDKS NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATY RVVSVLTVLHQDWLNGKEY C VSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLV GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID N0:5) . En otra modalidad preferida, el anticuerpo 2H7 humanizado intacto comprende la secuencia de aminoácidos de cadena ligera: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPG APKPLIYAPSNLASGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ AFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS DSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 35) y la secuencia de aminoácidos de cadena pesada: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYN QKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVD KVEP SCD THTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:36). En otra modalidad preferida, el anticuerpo 2H7 humanizado comprende la secuencia de dominio ligero variable de SEQ ID NO: 37 y la secuencia de dominio pesado variable de SEQ ID NO: 18, en donde el anticuerpo contiene además una substitución de aminoácido de D56A en CDR H2, y N100 en CDR H3 es substituido con Y o W, en donde SEQ ID NO: 37 tiene la secuencia : DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO:37) . En una modalidad de este último anticuerpo 2H7 humanizado, N100 se substituye con Y. En otra modalidad, N100 se substituye con W. Además, en una modalidad adicional, el anticuerpo comprende la substitución SlOOaR en CDR H3, preferentemente que comprende además al menos una substitución de aminoácido en la región Fe que mejora actividad de ADCC y/o CDC, tal como una que comprende un Fe IgGl que comprende las substituciones de aminoácido S298A, E333A, K334A, y K326A. Alternativamente, el anticuerpo comprende la substitución SlOOaR en CDR H3, preferentemente que comprende además al menos una substitución de aminoácido en la región Fe que mejora ADCC pero disminuye la actividad de CDC, tal como una que comprende al menos la substitución de aminoácido K322A, asi como también una que comprende además las substituciones de aminoácido S298A, E333A, 334?. En una modalidad preferida, el anticuerpo comprende la cadena ligera 2H7.v511: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ AFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQW VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYE HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:38) y la cadena pesada 2H7.v511: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYN Q FKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSYRYWYFDV GQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH PSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS V.FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATY RWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLV GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:39). Ver Figuras 12-15 considerando las alineaciones de secuencia de estas cadenas con aquellas de secuencias de cadena pesada y ligera, respectivamente, utilizando numeración de EE.üü o Kabat . Ejemplo 4 El ensayo a base de anticuerpo anti-idiotipico en la presente se ha utilizado para medir otras variantes de 2H7 de ratón, por ejemplo, v96 y v237, e suero de ratón. Las curvas estándar ELISA típicas para estos experimentos se muestran en la Figura 16, en comparación con vi6. Como se muestra en la Tabla 2 del Ejemplo 3, en comparación con vi6, v96 tiene en su cadena pesada D56A, N100A, y en su cadena ligera S92A. Versión 327 tiene, en comparación con vl6, N94I en su cadena ligera. Este ensayo se realiza como se describe arriba en el Ejemplo 1 utilizando los mismos anticuerpos anti-idiotipicos como en el Ejemplo 1. Las curvas estándar mostradas en la Figura 16 indican que el ensayo se utiliza exitosamente y sensiblemente para medir estos tres anticuerpos en suero de ratón. El ELISA para medir IgG de ratón no se realiza ya que también detectaría IgG de ratón endógeno en suero de ratón. Este ensayo también se utiliza para medir 2H7 humanizado en suero de ratón. Por ejemplo, variantes 2H7 humanizadas vll4 (en Tabla 2 del Ejemplo 3), v488 ((cadena pesada: N100D, K326A, S298A, E233A, K234A contra vl6) , y v511 (en Tabla 2 del Ejemplo 3) fueron medidas junto con vi6 utilizando el ensayo como se describe en el Ejemplo 1, utilizando anticuerpo 8C5 como anticuerpo de revestimiento/captura y anticuerpo 8A3 biotinilado como anticuerpo de detección. Curvas estándar ELISA típicas para estos experimentos, como se muestra en la Figura 17, indican que los ensayos para vl6 y vll4 fueron más sensibles a aquellos para v488 y v511. Para este propósito, un ELISA para medir IgG de humano en suero de ratón también se utiliza además de ELISA a base de anticuerpo anti-idiotípico para estas últimas dos versiones . Se espera que ELISA a base de anticuerpo anti-idiotípico será más sensible para medir 2H7 humanizado v488 y v511 en suero de humano/plasma para soportar pruebas clínicas utilizando diferentes anticuerpos anti-idiotípicos para v 488 y v511, que pueden prepararse por los mismos o esencialmente los mismos materiales y métodos como en el Ejemplo 1 utilizando v488 o v511 como el antigeno, respectivamente. IV. Depósito de Estirpes de Célula Las siguientes estirpes de célula de hibridoma se depositan con la Colección de Cultivo Tipo Americano (ATCC) ubicada en 10801 üniversity Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, Ü.S.A., y de acuerdo a los números de acceso: Hibridoma No. de acceso ATCC Fecha de Depósito 8C5.1 PTA-5915 15 de Abril de 2004 8A3.10 PTA-5914 15 de Abril de 2004 (Estos hibridomas corresponden a los clones 8C5 y 8?3, respectivamente.) Estos de depósitos se hacen bajo las provisiones del Tratado de Budapest en el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para el Propósito de Procedimiento de Patente y las regulaciones bajo él (Tratado de Budapest) . Esto asegura el mantenimiento de cultivos viables por 30' años desde la fecha de depósito. Los organismos se harán disponibles por ATCC bajo los términos del Tratado de Budapest, y se someten a un acuerdo entre Genentech, Inc. y ATCC, que asegura disponibilidad no limitada y permanente de la progenie de los cultivos al público en la emisión de la patente de EE.ÜÜ. pertinente o en la abertura al público de cualquier solicitud de patente extranjero o de EE.UU., cualquiera que venga primero, y asegura disponibilidad de la progenie a una determinada por el Director de Patentes y Marcas de EE.UU. en derecho de lo mismo de acuerdo a 35 USC §122 y las reglas del Directo respecto a lo mismo (incluyendo 37 CFR §1.14 con referencia particular a 886 OG 638). El cesionario en la presente solicitud establece que los depósitos se han hecho bajo los términos del Tratado de Budapest y que se someten a 37 CFR §1.808 (b), todas las restricciones impuestas por el depositante en la disponibilidad para el público del material depositado se removerán de manera irrevocable al garantizar una patente. El cesionario de la presente solicitud ha acordado que si los cultivos en depósito deben morir o perderse o destruirse cuando se cultivan bajo condiciones adecuadas, se reemplazarán de manera adecuada en notificación con un espécimen viable del mismo cultivo. La disponibilidad de las cepas depositadas no es para construirse como una licencia para la práctica de la invención en contravención de los derechos otorgados bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patente. La elaboración de estos depósitos es por ningún medio una admisión de que los depósitos se requieren para permitir la invención.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un método de ensayo inmunoabsorbente enlazado a enzimas (ELISA) para detectar específicamente en una muestra biológica un anticuerpo de interés que se une a una proteína de multi-transmembrana, de superficie celular que comprende un dominio extracelular de intervención de menos de aproximadamente 75 aminoácidos, que comprende (a) poner en contacto e incubar la muestra biológica con un reactivo de captura, en donde el reactivo de captura es un anticuerpo anti-idiotípico que se une al idiotipo del anticuerpo de interés pero no al idiotipo de al menos otro anticuerpo en la muestra que se une a la proteína, para unir cualquiera del anticuerpo de interés presente en la muestra, y (b) poner en contacto la muestra, y por lo tanto cualquier anticuerpo de interés, con un anticuerpo detectable que se une al anticuerpo de interés, y medir el nivel de cualquiera del anticuerpo de interés unido al reactivo de captura utilizando un medio de detección para el anticuerpo detectable.
2. El método de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo de interés es un anticuerpo monoclonal.
3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde el anticuerpo de interés es un anticuerpo humanizado.
4. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde el anticuerpo de interés es un anticuerpo murino.
5. El método de cualquiera de las reivindicacione's 1-4, en donde el anticuerpo detectable es un anticuerpo anti-idiotipico detectable que se une al idiotipo del anticuerpo de interés pero no al idiotipo de al menos otro anticuerpo en la muestra que se une a la proteina.
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la muestra biológica se aisla de un sujeto humano.
7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la muestra biológica se aisla de un sujeto ratón.
8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la etapa de medición comprende además utilizar una curva estándar para determinar el nivel del anticuerpo de interés en comparación con un nivel conocido .
9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde la muestra biológica es plasma, suero,- u orina.
10. El método de la reivindicación 9, en donde la muestra es suero.
11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde la proteina es CD20.
12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde el anticuerpo de interés es un anticuerpo 2H7 humanizado.
13. El método de la reivindicación 12, en donde el anticuerpo de interés es un anticuerpo intacto o fragmento de anticuerpo que comprende la secuencia de cadena ligera variable : DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO:l); y la secuencia de cadena pesada variable: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYN QKFKGRFTISVD SKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 2) . 14. El método de la reivindicación 12, en donde el anticuerpo de interés es un anticuerpo intacto que comprende la secuencia de aminoácidos de cadena ligera: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMH YQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRF
SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGT VEIKRTVAAPSVFIFPPSDE
QLKSGTASVVCLLNNFYPREA VQWKVDNALQ-SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA
DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 3); y la secuencia de aminoácidos de cadena pesada:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYN
QKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS
ASTKGPSVFPLAPSS STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG
LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS
VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY
RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN
QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR QQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:4). 15. El método de la reivindicación 12, en donde el anticuerpo de interés es un anticuerpo intacto que comprende la secuencia de aminoácidos de cadena ligera: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASVVCLLNNFYPREA VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:3); y la secuencia de aminoácidos de cadena pesada: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYN QKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH PSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 5). 16. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-15, en donde el reactivo de captura es un anticuerpo monoclonal. 17. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en donde el reactivo de captura es un anticuerpo murino. 18. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-17, en donde el reactivo de captura es anticuerpo 8?3 o anticuerpo 8C5. 19. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-18, en donde el reactivo de captura y anticuerpo detectable son el mismo. 20. El método de la reivindicación 19, en donde anticuerpo 8?3 se utiliza como reactivo de captura y anticuerpo detectable. 21. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-18, en donde el reactivo de captura y el anticuerpo detectable son diferentes. 22. El método de la reivindicación 21, en donde el anticuerpo 8C5 se utiliza como reactivo de captura y el anticuerpo 8?3 se utiliza como anticuerpo detectable. 23. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-22 que comprende las etapas de: (a) poner en contacto e incubar la muestra biológica con el reactivo de captura inmovilizado en un soporte sólido para unir cualquiera del anticuerpo de interés presente en la muestra con el reactivo de captura; (b) separar la muestra biológica del reactivo de captura inmovilizado unido a cualquiera del anticuerpo de interés presente; (c) poner en contacto el reactivo de captura inmovilizado unido a cualquiera del anticuerpo de interés presente con un anticuerpo anti-idiotipico detectable contra el anticuerpo de interés, dicho anticuerpo detectable se une al idiotipo del anticuerpo de interés pero no al idiotipo de al menos otro anticuerpo en la muestra que se une a la proteína; y (d) medir el nivel de cualquiera del anticuerpo de interés unido al reactivo de captura utilizando un medio de detección para el anticuerpo detectable .
24. El método de la reivindicación 23, en donde el reactivo de captura inmovilizado se recubre sobre una placa de microtitulación .
25. El método de la reivindicación 23 o 24, en donde el anticuerpo detectable es directamente detectable.
26. El método de la reivindicación 25, en donde el anticuerpo detectable se amplifica por un reactivo colorimétrico o fluorimétrico .
27. El método de la reivindicación 25, en donde el anticuerpo detectable es biotinilado y el medio de detección es peroxidasa de rábano picante de ß estreptavidina o avidina .
28. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-27 que se basa en células.
29. Un anticuerpo 8A3 que comprende SEQ ID NOS : 7 y 9 para las cadenas pesadas y ligeras, respectivamente y obtenibles de hibridoma 8A3.10 depositado bajo el Número ATCC PTA-5914.
30. El anticuerpo de la reivindicación 29 conjugado a una marca detectable.
31. Un anticuerpo 8C5 obtenible de hibridoma 8C5.1 depositado bajo el Número ATCC PTA-5915.
32. El anticuerpo de la reivindicación 31 conjugado a una marca detectable.
33. Un hibridoma 8C5.1 o 8A3.10 depositado bajo el número de depósito ATCC PTA-5915 o PTA-5914, respectivamente.
34. Un equipo de inmunoensayo para detectar específicamente en una muestra biológica un anticuerpo de interés que se une a una proteina de multi-transmembrana, de superficie celular que comprende un dominio extracelular de intervención de menos de aproximadamente 75 aminoácidos, comprendiendo el equipo: (a) un recipiente que contiene, como un reactivo de captura, un anticuerpo anti-idiotípico que se une al idiotipo del anticuerpo de interés pero no al idiotipo de al menos otro anticuerpo en la muestra que se une a la proteína: (b) un recipiente que contiene un anticuerpo anti-idiotípico detectable que se une al idiotipo del anticuerpo de interés pero no al idiotipo de al menos otro anticuerpo en la muestra que se une a la proteína/ y (c) instrucciones para detectar dicho anticuerpo de interés.
35. El equipo de la reivindicación 34 útil en un método ELISA para detectar el anticuerpo de interés.
36. El equipo de la reivindicación 34 o 35 que comprende además un soporte sólido para el reactivo de captura .
37. El equipo de cualquiera de las reivindicaciones 34-36, en donde el reactivo de captura se inmoviliza en el soporte sólido.
38. El equipo de cualquiera de las reivindicaciones 34-37, en donde el reactivo de captura se recubre sobre una placa de microtitulación .
39. El equipo de cualquiera de las reivindicaciones 34-38 que comprende además un medio de detección para el anticuerpo detectable.
40. El equipo de la reivindicación 39, en donde el medio de detección es peroxidasa de rábano picante de estreptavidina o avidina.
41. El equipo de cualquiera de las reivindicaciones 34-40 que comprende además un anticuerpo purificado de interés como un estándar.
42. El equipo de cualquiera de las reivindicaciones 34-41, en donde el reactivo de captura y el anticuerpo detectable son anticuerpos monoclonales.
43. El equipo de cualquiera de las reivindicaciones 34-42, en donde el reactivo de captura y el anticuerpo detectable son el mismo.
44. El equipo de cualquiera de las reivindicaciones 34-42, en donde el reactivo de captura y el anticuerpo detectable son diferentes.
45. El equipo de cualquiera de las reivindicaciones 34-44, en donde la proteina es CD20.
46. El equipo de cualquiera de las reivindicaciones 34-45, en donde el anticuerpo de interés es un anticuerpo humanizado.
47. El equipo de cualquiera de las reivindicaciones 34-46, en donde el anticuerpo de interés es un anticuerpo 2H7 humanizado.