MXPA06011429A

MXPA06011429A - Aparato y metodo para el suministro transdermico de la vacuna contra la influenza.

Info

Publication number: MXPA06011429A
Application number: MXPA06011429A
Authority: MX
Inventors: Yuh-Fun Maa; James Matriano; Scott Sellers; Asha Ramdas
Original assignee: Johnson & Johnson
Priority date: 2004-04-01
Filing date: 2005-03-18
Publication date: 2007-04-25
Also published as: EP1734993A4; BRPI0509493A; AU2005232541A1; AR048862A1; CA2562932A1; US20050220854A1; WO2005099751A2; JP2007530680A; CN101124343A; EP1734993A2; TW200536573A; WO2005099751A3; KR20060135931A

Abstract

Un aparato y un metodo para suministrar transdermicamente un agente inmunologicamente activo que comprende un sistema de suministro que tiene un miembro (o sistema) de microproyecciones que incluye una pluralidad de microproyecciones (o disposicion de las mismas) que estan adaptadas para perforar a traves de un retrato corneo hacia la capa subyacente de epidermis, o las capas de epidermis y dermis, el miembro de microproyecciones teniendo un revestimiento biocompatible dispuesto sobre el mismo que incluye el agente inmunologicamente activo; preferiblemente, el revestimiento biocompatible esta formado a partir de una formulacion de revestimiento de vacuna.

Description

APARATO Y MÉTODO PARA EL SUMINISTRO TRANSDERMICO DE LA VACUNA CONTRA LA INFLUENZA REFERENCIA RECIPROCA A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud provisional de E.U.A. No. 60/559,153, presentada en abril 1 de 2004.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere en general a sistemas y métodos de suministro de agentes transdérmicos. Más particularmente, la invención se refiere a un aparato, método y formulación para el suministro transdérmico de una vacuna contra la influenza.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Agentes activos (o fármacos) se administran más convenientemente ya sea oralmente o por inyección. Infortunadamente, muchos agentes activos son completamente ineficaces, o tienen eficacia radicalmente reducida cuando se administran oralmente, puesto que no son absorbidos o son afectados adversamente antes de que entren a la corriente sanguínea, y de esta manera no poseen la actividad deseada. Por otra parte, la inyección directa del agente en la corriente sanguínea, aunque no asegura modificación del agente durante la administración, es un procedimiento difícil, inconveniente, doloroso e incómodo, que resulta a veces en mal acatamiento por el paciente. Por lo tanto, en principio, el suministro transdérmico provee un método de administración de agentes activos que de otra manera necesitarían ser suministrados por medio de inyección hipodérmica o infusión intravenosa. El término "transdérmico", como se usa en la presente, es un término genérico que se refiere al suministro de un agente activo (por ejemplo, un agente terapéutico, tal como un fármaco o un agente inmunológicamente activo, tal como una vacuna) a través de la piel hacia el tejido local o sistema circulatorio sistémico, sin corte o penetración sustancial de la piel, tal como corte con una cuchilla quirúrgica o perforación de la piel con una aguja hipodérmica. El suministro transdérmico del agente incluye suministro por medio de difusión pasiva, así como suministro basado en fuentes de energía externas, tales como electricidad (por ejemplo, iontoforesis) y ultrasonido (por ejemplo, fonoforesis). Como es bien sabido en la técnica, la piel no es sólo una barrera física que protege al cuerpo de peligros externos, sino es también una parte integral del sistema inmune. La función inmune de la piel surge de un conjunto de constituyentes celulares y humorales residentes de la epidermis y dermis viables, con funciones innata e inmune adquirida, conocida en conjunto como el sistema inmune de la piel.

Uno de los componentes más importantes del sistema inmune de la piel, son las células de Langerhans (LC), que son células que presentan antígeno especializadas, presentes en la epidermis viable. Las LC's forman una red semicontinua en la epidermis viable debido a la ramificación extensiva de sus dendritas entre las células circundantes. La función normal de las LC's es detectar, capturar y presentar antígenos para evocar una respuesta inmune a los patógenos invasores. Las LC's realizan su función, incorporando antígenos epicutáneos, traficando hacia nodulos linfáticos regionales que drenan la piel, y presentando antígenos procesados a las células T. La eficacia del sistema inmune de la piel, es responsable del éxito y la seguridad de estrategias de vacunación que han sido dirigidas hacia la piel. La vacunación con una vacuna de la viruela atenuada viva por escarificación de la piel, ha llevado exitosamente a la erradicación global de la viruela mortal. La inyección intradérmica usando 1/5 a 1/10 de la dosis IM estándar de varias vacunas, ha sido efectiva en la inducción de respuestas inmunes con muchas vacunas, mientras que una vacuna contra la rabia de baja dosis ha sido autorizada comercialmente para aplicación intradérmica. Como una alternativa, el suministro transdérmico provee un método de administración de agentes biológicamente activos, en particular vacunas, que de otra manera necesitarían ser suministrados por medio de inyección hipodérmica, infusión intravenosa u oralmente. El suministro transdérmico de vacunas ofrece mejoras en estas áreas. El suministro transdérmico, cuando se compara con el suministro oral, evita el ambiente severo del tracto digestivo, evita el metabolismo gastrointestinal de fármacos, reduce los efectos de primer paso, y evita la desactivación posible por enzimas digestivas y del hígado. A la inversa, el tracto digestivo no es sujeto a la vacuna durante la administración transdérmica. Los sistemas de suministro transdérmico pasivo de agentes, los cuales son más comunes, incluyen típicamente un depósito de fármaco que contiene una alta concentración de un agente activo. El depósito está adaptado para entrar en contacto con la piel, lo cual permite que el agente se difunda a través de la piel y en los tejidos de! cuerpo o corriente sanguínea de un paciente. Un método común para incrementar el flujo transdérmico pasivo difusional de agentes, implica pre-tratamiento de la piel con un intensificador de permeación de la piel, o co-suministro con el agente. Un intensificador de permeación, cuando se aplica a una superficie del cuerpo a través de la cual el agente es suministrado, intensifica el flujo del agente a través. Sin embargo, la eficacia de estos métodos para intensificar el flujo transdérmico de proteínas ha sido limitada, por lo menos para las proteínas más grandes, debido a su tamaño. Se han desarrollado también muchas técnicas y sistemas para penetrar o disolver mecánicamente las capas más exteriores de la piel, creando de esta manera vías en la piel para intensificar la cantidad de agente que está siendo suministrado transdérmicamente. Los primeros dispositivos de vacunación conocidos como escarificadores, incluyeron en general una pluralidad de puntas o agujas que eran aplicadas a la piel y para raspar o hacer pequeños cortes en el área de aplicación. La vacuna era aplicada tópicamente en la piel, tal como se describe en la patente de E.U.A. No. 5,487,726, o como un líquido mojado aplicado a las puntas del escarificador, tal como se describe en las patentes de E.U.A. Nos. 4,453,926, 4,109,655 y 3,136,314. Se han sugerido escarificadores para el suministro intradérmico de vacunas, debido en parte a que sólo cantidades muy pequeñas de la vacuna necesitan suministrarse en la pie! para ser efectivas en la inmunización del paciente. Además, la cantidad de vacuna suministrada no es particularmente crítica, puesto que una cantidad excesiva logra también inmunización satisfactoria. Sin embargo, una desventaja seria en el uso de un escarificador para suministrar un agente activo, tal como una vacuna, es la dificultad para determinar el flujo transdérmico del agente y la dosificación resultante suministrada. Asimismo, debido a la naturaleza elástica, deformable y resiliente de la piel para desviar y resistir a la perforación, los elementos de perforación diminutos con frecuencia no penetran uniformemente la piel, y/o son liberados de un revestimiento líquido de un agente tras la penetración de la piel. Además, debido al proceso de autocuración de la piel, las perforaciones o hendiduras hechas en la piel tienden a cerrarse tras la remoción de los elementos de perforación del estrato córneo. De esta manera, la naturaleza elástica de la piel actúa para remover el revestimiento líquido de agente activo que ha sido aplicado a los elementos de perforación diminutos tras la penetración de estos elementos en la piel. Además, las hendiduras diminutas formadas por los elementos de perforación sanan rápidamente después de la remoción del dispositivo, limitando de esta manera el paso de la solución de agente líquido a través de los pasajes creados por los elementos de perforación, y a su vez limitando el flujo transdérmico de dichos dispositivos. Otros sistemas y aparatos que usan elementos de perforación diminutos de la piel para intensificar el suministro transdérmico de agentes, se describen en las patentes de E.U.A. Nos. 5,879,326, 3,814,097, 5,250,023, 3,964,482, nueva edición 25,637, y la publicación del PCT Nos. WO 96/37155, WO 96/37256, WO 96/17648, WO 97/03718, WO 98/11937, WO 98/00193, WO 97/48440, WO 97/48441 , WO 97/48442, WO 98/00193, WO 99/64580, WO 98/28037, WO 98/29298 y WO 98/29365; citas que se incorporan en su totalidad en la presente como referencia. Los sistemas y aparatos descritos usan elementos de perforación de varias formas y tamaños para perforar la capa más exterior (es decir, el estrato córneo) de la piel. Los elementos de perforación descritos en estas referencias se extienden en general perpendicularmente desde un miembro plano delgado, tal como una almohadilla u hoja. Los elementos de perforación en algunos de estos dispositivos son extremadamente pequeños, algunos teniendo una longitud de microproyección de sólo aproximadamente 25 a 400 mieras y un espesor de microproyección de sólo aproximadamente 5 a 50 mieras. Estos elementos de corte/perforación diminutos, hacen microcortes/microhendiduras correspondientemente pequeños en el estrato córneo, para intensificar el suministro transdérmico de agentes a través. Los sistemas descritos incluyen también típicamente un depósito para contener el agente, y también un sistema de suministro para transferir el agente desde el depósito a través de! estrato córneo, tal como mediante puntas huecas del dispositivo mismo. Un ejemplo de dicho dispositivo se describe en el documento WO 93/17754, el cua! tiene un depósito de agente líquido. Sin embargo, el depósito debe ser presurizado para forzar el agente líquido a través de los elementos tubulares diminutos y en la piel. Las desventajas de dichos dispositivos incluyen la complicación y el costo agregados para añadir un depósito de líquido presurizable, y complicaciones debidas a la presencia de un sistema de suministro accionado por presión. También como se describe en la solicitud de patente de E.U.A.

No. 10/045,842, la cual se incorpora completamente en la presente como referencia, también es posible tener el agente activo que se va a suministrar revestido sobre las microproyecciones, en lugar de estar contenido en un depósito físico. Esto elimina la necesidad de un depósito físico separado y el desarrollo de una formulación o composición de agente específicamente para el depósito. Una desventaja de los sistemas de microproyecciones revestidos es, sin embargo, que la cantidad máxima de agente activo suministrado, y en particular agentes inmunológicamente activos es limitada, puesto que la capacidad de las microproyecciones (y disposiciones de las mismas) para penetrar el estrato córneo se reduce conforme se incrementa el espesor del revestimiento. Además, para penetrar efectivamente el estrato córneo con microproyecciones que tienen un revestimiento grueso dispuesto sobre las mismas, la energía de impacto del aplicador debe incrementarse, lo cual causa sensaciones intolerables tras el impacto. Por lo tanto, sería deseable proveer una alta concentración de agente inmunológicamente activo, y en particular, una vacuna contra la influenza líquida que pueda administrarse fácilmente en una cantidad inmunológicamente (o biológicamente) efectiva por medio de microproyecciones revestidas. Por consiguiente, es un objetivo de la presente invención proveer un aparato y método para el suministro transdérmico de un agente inmunológicamente activo que reduzca o elimine sustancialmente los inconvenientes y desventajas asociados con los métodos y sistemas de suministro de agentes inmunológicamente activos de la técnica anterior. Es otro objetivo de la presente invención proveer un aparato y método para el suministro transdérmico de vacuna contra la influenza, que incluya microproyecciones revestidas con un revestimiento biocompatible que tenga la vacuna contra la influenza depositada en las mismas. Es otro objetivo de la presente invención proveer un aparato y método para el suministro transdérmico de vacuna contra la influenza, que incluya un miembro de microproyección que tenga una pluralidad de microproyecciones, en donde las microproyecciones sean revestidas con una formulación de revestimiento de vacuna contra la influenza. Es otro objetivo de la presente invención proveer una vacuna contra la influenza que pueda administrarse fácilmente en una cantidad inmunológicamente efectiva por medio de un sistema de microproyecciones revestidas. Es otro objetivo de la presente invención proveer una vacuna contra la influenza que esté sustancialmente libre de conservadores. Es otro objetivo de la presente invención proveer una vacuna contra la influenza que tenga una vida útil en depósito mejorada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN De acuerdo con los objetivos anteriores y los que se mencionarán y llegarán a ser evidentes a continuación, el aparato y método para suministrar transdérmicamente un agente inmunológicamente activo de conformidad con esta invención, comprende en general un sistema de suministro que tiene un miembro (o sistema) de microproyección que incluye una pluralidad de microproyecciones (o disposición de las mismas), que están adaptadas para perforar a través del estrato córneo en la capa de epidermis o capas de epidermis y dermis subyacentes, el miembro de microproyección teniendo un revestimiento biocompatible dispuesto sobre el mismo que incluye al agente inmunológicamente activo. En una modalidad preferida de la invención, el revestimiento biocompatible se forma de una formulación de revestimiento de agente inmunológicamente activo. En una modalidad preferida de la invención, el agente inmunológicamente activo comprende una vacuna contra la influenza. En modalidades alternativas de la invención, el agente inmunológicamente activo comprende una vacuna o agente antigénico seleccionado del grupo que consiste de virus y bacterias, vacunas basadas en proteínas, vacunas basadas en polisacáridos y vacunas basadas en ácidos nucleicos. Agentes antigénicos adecuados incluyen, sin limitación, antígenos en la forma de proteínas, conjugados de polisacáridos, oligosacáridos y lipoproteínas. Estas vacunas subunitarias incluyen Bordetella pertussis (vacuna accince - acelular de PT recombinante), Clostridium tetani (purificada, recombinante), Corynebacterium diphtheriae (purificada, recombinante), citomegalovirus (subunidad de glucoproteína), estreptococo del grupo A (subunidad de glucoproteína, polisacárido del grupo A de glucoconjugado con toxoide tetánico, péptidos/proteína M enlazados a portadores de subunidades de toxina, proteína M, epítopes específicos de tipo multivalente, cisteína proteasa, peptidasa C5a), virus de hepatitis B (Pre-S1 , Pre-S2, S recombinantes, proteína de núcleo recombinante), virus de hepatitis C (epítopes y proteínas de superficie expresados - recombinantes), virus del papiloma humano (proteína de la cápside, proteína recombinante de TA-GN L2 y EJ (de HPV-6), VLP L1 recombinante MEDI-501 de HPV-11, BLP L1 recombinante cuadrivalente [de HPV-6], HPV-11 , HPV-16 y HPV-18, LAMP-E7 [de HPV-16]), Legionella pneumophila (proteína de superficie bacteriana purificada), Neisseria meningitidis (glucoconjugado con toxoide tetánico), Pseudomonas aeruginosa (péptidos sintéticos), virus de la rubéola (péptido sintético), Streptococcus pneumoniae (glucoconjugado [1 , 4, 5, 6B, 9N, 14, 18C, 19V, 23F] conjugado con OMP de meningococo B, glucoconjugado [4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F] conjugado con CRM197, glucoconjugado [1 , 4, 5, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F] conjugado con CRM1970, Treponema pallidum (lipoproteínas de superficie), virus varicela-zoster (subunidad, glucoproteínas) y Vibrio cholerae (lipopolisacárido conjugado). Bacterias o virus enteros incluyen, sin limitación, virus debilitados o destruidos, tales como citomegalovirus, virus de hepatitis B, virus de hepatitis C, virus del papiloma humano, virus de la rubéola y virus varicela-zoster, bacterias debilitadas o destruidas, tales como Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, estreptococos del grupo A, Legionella pneumophila, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum y Vibrio cholerae, y mezclas de los mismos. Otras vacunas disponibles comercialmente, que contienen agentes antigénicos incluyen, sin limitación, vacuna contra la influenza, vacuna contra la enfermedad de Lyme, vacuna antirrábica, vacuna antisarampionosa, vacuna antiparotidítica, vacuna contra la varicela, vacuna antivariólica, vacuna contra la hepatitis, vacuna antipertussis y vacuna contra la difteria. Vacunas que comprenden ácidos nucleicos incluyen, sin limitación, ácidos nucleicos de cadena sencilla y de doble cadena tales como, por ejemplo, ADN de plásmido superenrollado; ADN de plásmido lineal; cósmidos; cromosomas artificiales bacterianos (BACs); cromosomas artificiales de levadura (YACs); cromosomas artificiales de mamífero; y moléculas de ARN tales como, por ejemplo, ARN mensajero. El ácido nucleico puede ser acoplado también con un agente proteináceo, o puede incluir una o más modificaciones químicas tales como, por ejemplo, porciones de fosforotioato. Adyuvantes adecuados que aumentan la respuesta inmune que, junto con el antígeno de vacuna pueden comprender la vacuna, incluyen gel de fosfato de aluminio; hidróxido de aluminio; glucano de algas: ß-glucano; subunidad de toxina B del cólera; CRL1005: polímero de bloque de ABA con valores medios de x = 8 e y = 205; gamma inulina: ß-D lineal (no ramificada) (2->1 ) polifructofuranoxil-a-D-glucosa; adyuvante de Gerbu: N-acetilglucosamina-(ß 1 -4)-N-acetilmuramil-L-alanil-D-glutamina (GMDP), cloruro de dimetil dioctadecilamonio (DDA), complejo de sal de L-prolina y zinc (Zn-Pro-8); Imiquimod (1-(2-metipropil)-1 H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina; ImmTher™: dipalmitato de N-acetilglucoaminil-N-acetilmuramil-L-Ala-D-isoGIu-L-Ala-glicerol; liposomas de MTP-PE: C59H?o8N6Oi9PNa-3H2O (MTP); Murametide: Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCH3; Pleuran: ß-glucano; QS-21 ; S- 28463: 4-amino-a, a-dimetil-1 H-imidazo[4,5-c]qu¡nolin-1 -etanol; salvo péptido: VQGEESNDK • HCl (péptido 163-171 de IL-1ß); y treonil-MDP (Termurtide™): N-acetil muramil-L-treonil-D-isoglutamina, e interleucina 18, IL-2, IL-12 e IL-15. Adyuvantes incluyen también oligonucleótidos de ADN tales como, por ejemplo, oligonucleótidos que contiene CpG. Además, pueden usarse secuencias de ácido nucleico que codifiquen para linfocinas inmunorreguladoras, tales como IL-18, IL-2, IL-12, IL-15, IL-4, IL10, interferón gamma y proteínas de señalización reguladoras de NF kappa B. En una modalidad de la invención, el miembro de microproyección tiene una densidad de microproyecciones de por lo menos aproximadamente 10 microproyecciones/cm2, de preferencia mayor de aproximadamente 100 microproyecciones/cm2, y más preferiblemente en la escala de aproximadamente 200 a 3000 microproyecciones/cm2. Además, cada una de las microproyecciones tiene de preferencia una longitud en la escala de aproximadamente 50 a 145 mieras, y más preferiblemente en la escala de aproximadamente 70 a 140 mieras. En una modalidad, el miembro de microproyección se construye de acero inoxidable, titanio, aleaciones de titanio y níquel, o materiales biocompatibles similares, tales como materiales poliméricos. En una modalidad alternativa, ei miembro de microproyección se construye de un material no conductor, tal como un polímero. En forma alternativa, el miembro de microproyección puede revestirse con un material no conductor, tal como Parylene®.

En una modalidad de la invención, el revestimiento biocompatible tiene un espesor menor de 100 mieras. En una modalidad preferida, el revestimiento biocompatible tiene un espesor en la escala de aproximadamente 2 a 50 mieras. La formulación de revestimiento aplicada al miembro de microproyección que forma un revestimiento biocompatible sólido, puede comprender una formulación acuosa o no acuosa que incluya al agente inmunológicamente activo. En una modalidad preferida, la formulación de revestimiento comprende una formulación acuosa. En una modalidad de la invención, la formulación de revestimiento incluye por lo menos un agente tensioactivo, el cual puede ser zwitteriónico, anfotérico, catiónico, aniónico o no ¡ónico. Agentes tensioactivos adecuados incluyen, sin limitación, lauroanfoacetato de sodio, dodecil sulfato de sodio (SDS), cloruro de cetilpiridinio (CPC), cloruro de dodeciltrimetil amonio (TMAC), cloruro de benzalconio, polisorbatos, tales como Tween 20 y Tween 80, otros derivados de sorbitán, tales como laurato de sorbitán, y alcoholes alcoxilados tales como laureth-4. En otra modalidad de la invención, la formulación de revestimiento incluye por lo menos un material polimérico o polímero que tenga propiedades anfifílicas, el cual puede comprender, sin limitación, dextrán, hidroxietil almidón (HES), derivados de celulosa, tales como hidroxietilcelulosa (HEC), hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), hidroxipropilcelulosa (HPC), metilcelulosa (MC), hidroxietilmetilcelulosa (HEMC) o etilhidroxi-etilcelulosa (EHEC), así como pluronics. En una modalidad de la invención, la concentración del polímero que presenta propiedades anfifílicas en la formulación de revestimiento está de preferencia en la escala de aproximadamente 0.001-70% en peso, más preferiblemente en la escala de aproximadamente 0.01-50% en peso, aún más preferiblemente en la escala de aproximadamente 0.03-30% en peso de la formulación de revestimiento. En una modalidad de la invención, la concentración del polímero que presenta propiedades anfifílicas en el revestimiento biocompatible sólido, está de preferencia en la escala de aproximadamente 0.002-99.9% en peso, más preferiblemente en la escala de aproximadamente 0.1-60% en peso del revestimiento biocompatible sólido. En otra modalidad, la formulación de revestimiento incluye un polímero hidrofílico seleccionado del siguiente grupo: alcohol poli(vinílico), óxido de poli(etileno), metacrilato de poli(2-hidroxietilo), poli(n-vinilpirrolidona), polietilenglicol, y mezclas de los mismos, y polímeros similares. En una modalidad preferida, la concentración del polímero hidrofílico en la formulación de revestimiento, está de preferencia en la escala de aproximadamente 0.001-90% en peso, más preferiblemente en la escala de aproximadamente 0.01-20% en peso, aún más preferiblemente en la escala de aproximadamente 0.03-10% en peso de la formulación de revestimiento. En una modalidad preferida, la concentración del polímero hidrofílico en el revestimiento biocompatible sólido está en la escala de aproximadamente 0.002-99.9% en peso, más preferiblemente en la escala de aproximadamente 0.1-20% en peso de la formulación de revestimiento. En otra modalidad de la invención, la formulación de revestimiento incluye un vehículo biocompatible, el cual puede comprender, sin limitación, albúmina humana, albúmina humana biodiseñada, ácido poliglutámico, ácido poliaspártico, polihistidina, poiisulfato de pentosán, poliaminoácidos, sacarosa, trehalosa, melezitosa, rafinosa y estaquiosa. De preferencia, la concentración de! vehículo biocompatible en la formulación de revestimiento está de preferencia en la escala de aproximadamente 0.001-90% en peso, más preferiblemente en la escala de aproximadamente 2-70% en peso, aún más preferiblemente en la escala de aproximadamente 5-50% en peso de la formulación de revestimiento. De preferencia, la concentración del vehículo biocompatible en el revestimiento biocompatible sólido está en la escala de aproximadamente 0.002-99.9% en peso, más preferiblemente en la escala de aproximadamente 0.1-95% en peso de la formulación biocompatible sólida. En otra modalidad, la formulación de revestimiento incluye un agente estabilizador, el cual puede comprender, sin limitación, un azúcar no reductor, un polisacárido, un azúcar reductor o un inhibidor de desoxirribonucleasa. En otra modalidad, la formulación de revestimiento incluye un vasoconstrictor, el cual puede comprender, sin limitación, amidefrina, cafaminol, ciclopentamina, desoxiepinefrina, epinefrina, felipresina, indanazolina, metizolina, midodrina, nafazolina, nordefrina, octodrina, omipresina, oximetazolina, fenilefrina, feniletanolamina, fenilpropanolamina, propilhexedrina, pseudoefedrina, tetrahidrozolina, tramazolina, tuaminoheptano, timazolina, vasopresina, xilometazolina, y mezclas de los mismos. Los vasoconstrictores más preferidos incluyen epinefrina, nafazolina, tetrahidrozolina, indanazolina, metizolina, tramazolina, timazolina, oximetazolina y xilometazolina. La concentración del vasoconstrictor, si se usa, está de preferencia en la escala de aproximadamente 0.1% en peso a 10% en peso del revestimiento. En otra modalidad de la invención, la formulación de revestimiento incluye por lo menos un "modulador de permeabilidad de la vía", que puede comprender, sin limitación, agentes osmóticos (por ejemplo, cloruro de sodio), compuestos zwitteriónicos (por ejemplo, aminoácidos) y agentes antiinflamatorios, tales como sai disódica de fosfato 21 de betametasona, fosfato disódico de acetónido 21 de triamcinolona, clorhidrato de hidrocortamato, sal disódica de fosfato 21 de hidrocortisona, sal disódica de fosfato 21 de metilprednisolona, sal sódica de succinato 21 de metilprednisolona, fosfato disódico de parametasona y sal sódica de succinato 21 de prednisolona, y anticoagulantes, tales como ácido cítrico, sales de citrato (por ejemplo, citrato de sodio), sulfato sódico de dextrina, aspirina y EDTA.

De preferencia, las formulaciones de revestimiento de la invención tienen una viscosidad menor de aproximadamente 0.5 pascales/seg, más preferiblemente en la escala de aproximadamente 0.03-0.2 pascales/seg. De conformidad con una modalidad de la invención, el método para el suministro de un agente inmunológicamente activo comprende los siguientes pasos: (i) proveer un miembro de microproyección que tenga una pluralidad de microproyecciones, (ii) proveer una vacuna global, (¡ii) someter la vacuna global a filtración de flujo tangencial para proveer una solución de vacuna, (iv) añadir por io menos un excipiente (por ejemplo, sacarosa, trehalosa o manitol) a la solución de vacuna, (v) secar por congelación la solución de vacuna para formar un producto de vacuna, (vi) reconstituir el producto de vacuna con una primera solución (por ejemplo, agua) para formar una formulación de revestimiento de vacuna, (vii) revestir el miembro de microproyección con la formulación de revestimiento de vacuna, y (viii) aplicar el miembro de microproyección revestido a la piel de un sujeto. En una modalidad, la vacuna comprende una vacuna contra la influenza. De preferencia, el método comprende el paso de suministrar aproximadamente 45 µg de hemaglutinina. Más preferiblemente, el paso de suministro de la vacuna comprende suministrar por lo menos aproximadamente 70% de la vacuna a la capa epidérmica abundante en APC. En otra modalidad, un método para la formulación de una solución de vacuna de la invención, comprende los siguientes pasos: (i) proveer una vacuna global, (i¡) someter la vacuna global a filtración de flujo tangencial para proveer una solución de vacuna, (iii) añadir por lo menos un excipiente a la solución de vacuna, y (iv) secar por congelación la solución de vacuna para formar un producto de vacuna. En una modalidad, el producto de vacuna exhibe una concentración que está por lo menos 500 veces más concentrada que la vacuna global. De preferencia, el producto de vacuna mantiene estabilidad a temperatura ambiente por cuando menos aproximadamente seis meses.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Otras características y ventajas llegarán a ser evidentes a partir de la descripción siguiente y más particular de las modalidades preferidas de la invención, como se ilustra en los dibujos acompañantes, y en los cuales caracteres similares referidos se refieren en general a las mismas partes o elementos a lo largo de las vistas, y en los cuales: La figura 1 es una ilustración de una partícula del virus de influenza; la figura 2 es una vista en perspectiva de una porción de una modalidad de un miembro de microproyección, de conformidad con la invención; la figura 3 es una vista en perspectiva del miembro de microproyección mostrado en la figura 2 que tiene un revestimiento biocompatible depositado sobre las microproyecciones, de conformidad con la invención; la figura 4 es una vista lateral seccionada de un miembro de microproyección que tiene un refuerzo adhesivo, de conformidad con la invención; la figura 5 es una vista en perspectiva de una porción de otra modalidad de un miembro de microproyección, de conformidad con la invención; la figura 6 es una vista lateral seccionada de un retenedor que tiene un miembro de microproyección dispuesto en el mismo, de conformidad con la invención; la figura 7 es una vista en perspectiva del retenedor mostrado en la figura 6; la figura 8 es una vista en perspectiva de un aplicador y el retenedor mostrados en la figura 6; la figura 9 es un diagrama de flujo de un procedimiento de preformulación, de conformidad con la invención; la figura 10 es una ilustración gráfica de absorbancia contra pH, que ¡lustra el efecto del pH sobre la reducción de la turbiedad de la solución, de conformidad con la invención; la figura 11 es una ilustración gráfica de viscosidad contra rpm para las vacunas Fluzone® y Vaxigrip™; la figura 12 es una ilustración gráfica de viscosidad contra temperatura para una cepa A/New Caledonia, que tiene HA con 15% de pureza a 22.5 mg/mL; las figuras 13A y 13B son ilustraciones gráficas que resumen el suministro de la vacuna para varios diseños de disposiciones de microproyecciones, de conformidad con la invención; la figura 14A es una ilustración gráfica del título de anti-HA promedio contra el tiempo para varias dosis de HA (cepa A/Panamá); la figura 14B es una ilustración gráfica de títulos totales de IgG específicos de A/Panamá contra actividad de Hl; las figuras 15A y 15B son diagramas de barras de la inmunogenicidad de varias formulaciones de HA (cepa A/Panamá), que ilustran anticuerpo de IgG específico de anti-A/Panamá y actividad de Hl; las figuras 16A y 16B son diagramas de barras de la inmunogenicidad de varias formulaciones de HA (cepa A/Panamá) revestidas en seco sobre microproyecciones, que ilustran actividad de anticuerpo de IgG anti-Ha y actividad de Hl en el día 28 y día 49; la figura 17A es una serie de diagramas de barras de la inmunogenicidad de varias formulaciones de HA trivalente (cepas A/Panamá, A/New Caledonia y B/Shangdong) revestidas en seco sobre microproyecciones, ilustrando actividad de Hi; la figura 18 es una ilustración gráfica de cantidad de HA contra tiempo, que ilustra perfiles de estabilidad de varias formulaciones de revestimiento almacenadas a 40°C por hasta ocho semanas, de conformidad con la invención; las figuras 19 y 20 son diagramas de barras de dos formulaciones trivalentes, que ilustran perfiles de estabilidad de las formulaciones almacenadas a 40°C por hasta tres meses y 5°C y 40°C por hasta seis meses, de conformidad con la invención; y la figura 21 es una ilustración gráfica de SRID/BCA contra tiempo, que muestra perfiles de estabilidad de una cepa A/New Caledonia formulada con sacarosa y almacenada a 40°C por hasta ocho semanas, de conformidad con la invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Antes de que se describa la presente invención en detalle, se entenderá que esta invención no se limita a materiales, formulaciones, métodos o estructuras particularmente ejemplificados, ya que como tales, de hecho, pueden variar. De esta manera, aunque muchos materiales y métodos similares o equivalentes a los descritos en la presente pueden usarse en la práctica de la presente invención, los materiales y métodos preferidos se describen en la presente. Se entenderá también que la terminología usada en la presente es con el propósito de describir sólo modalidades particulares de la invención, y no se pretende que sea limitativa de la misma. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como lo entienden comúnmente los expertos en la técnica a la cual esta invención pertenece. Además, todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas en la presente, ya sea anteriormente o más adelante, se incorporan en su totalidad en la presente como referencia. Por último, como se usa en esta especificación y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un" "una" y "la" incluyen referencias plurales, a menos que el contenido dicte claramente otra cosa. De esta manera, por ejemplo, la referencia a un "agente inmunológicamente activo", incluye dos o más de dichos agentes; la referencia a "una microproyección" incluye dos o más de dichas microproyecciones, y similares.

Definiciones El término "transdérmico", como se usa en la presente, significa el suministro de un agente en y/o a través de la piel, para terapia local o sistémica. El término "flujo transdérmico", como se usa en la presente, significa la velocidad de suministro transdérmico. El término "co-suministro", como se usa en ¡a presente, significa que uno o varios agentes complementarios son administrados transdérmicamente ya sea antes de que el agente sea suministrado, antes y durante el flujo transdérmico del agente, durante el flujo transdérmico del agente, durante y después del flujo transdérmico del agente, y/o después del flujo transdérmico del agente. Además, dos o más agentes inmunológicamente activos pueden formularse en los revestimientos biocompatibles de la invención, resultando en el co-suministro de diferentes agentes inmunológicamente activos. El término "agente biológicamente activo", como se usa en la presente, se refiere a una composición de materia o mezcla que contiene un agente o fármaco activo, el cual es farmacológicamente efectivo cuando se administra en una cantidad terapéuticamente efectiva. Ejemplos de dichos agentes activos incluyen, sin limitación, compuestos de pequeño peso molecular, polipéptidos, proteínas, oligonucleótidos, ácidos nucleicos y polisacáridos. El término "agente inmunológicamente activo", como se usa en la presente, se refiere a una composición de materia o mezcla que contiene un agente antigénico y/o una "vacuna" de cualquier fuente y todas las fuentes, la cual es capaz de desencadenar una respuesta inmune benéfica cuando se administra en una cantidad inmunológicamente efectiva. Un ejemplo específico de un agente inmunológicamente activo, es una vacuna contra la influenza. Otros ejemplos de agentes inmunológicamente activos incluyen, sin limitación, virus y bacterias, vacunas basadas en proteínas, vacunas basadas en polisacáridos y vacunas basadas en ácidos nucleicos. Agentes inmunológicamente activos adecuados incluyen, sin limitación, antígenos en la forma de proteínas, conjugados de polisacáridos, oligosacáridos y lipoproteínas. Estas vacunas subunitarias incluyen Bordetella pertussis (vacuna accince - acelular de PT recombinante), Clostrídium tetani (purificada, recombinante), Corynebacterium diphtheriae (purificada, recombinante), citomegalovirus (subunidad de glucoproteína), estreptococo del grupo A (subunidad de glucoproteína, polisacárido del grupo A de glucoconjugado con toxoide tetánico, péptidos/proteína M enlazados a portadores de subunidades de toxina, proteína M, epítopes específicos de tipo multivalente, cisteína proteasa, peptidasa C5a), virus de hepatitis B (Pre-S1 , Pre-S2, S recombinantes, proteína de núcleo recombinante), virus de hepatitis C (epítopes y proteínas de superficie expresados - recombinantes), virus del papiloma humano (proteína de la cápside, proteína recombinante de TA-GN L2 y E7 (de HPV-6), VLP L1 recombinante MEDI-501 de HPV-11 , BLP L1 recombinante cuadrivalente [de HPV-6], HPV-11 , HPV-16 y HPV-18, LAMP-EJ [de HPV-16]), Legionella pneumophila (proteína de superficie bacteriana purificada), Neisseria meningitidis (glucoconjugado con toxoide tetánico), Pseudomonas aeruginosa (péptidos sintéticos), virus de la rubéola (péptido sintético), Streptococcus pneumoniae (glucoconjugado [1 , 4, 5, 6B, 9N, 14, 18C, 19V, 23F] conjugado con OMP de meningococo B, glucoconjugado [4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F] conjugado con CRM197, glucoconjugado [1 , 4, 5, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F] conjugado con CRM1970, Treponema pallidum (lipoproteínas de superficie), virus varicela-zoster (subunidad, glucoproteínas) y Vibrio cholerae (lipopolisacárido conjugado).

Bacterias o virus enteros incluyen, sin limitación, virus debilitados o destruidos, tales como citomegalovirus, virus de hepatitis B, virus de hepatitis C, virus del papiloma humano, virus de la rubéola y virus varicela-zoster, bacterias debilitadas o destruidas, tales como Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, estreptococos del grupo A, Legionella pneumophila, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum y Vibrio cholerae, y mezclas de los mismos. Muchas vacunas disponibles comercialmente, que contienen agentes antigénicos tienen también utilidad con la presente invención e incluyen, sin limitación, vacuna contra la influenza, vacuna contra la enfermedad de Lyme, vacuna antirrábica, vacuna antisarampionosa, vacuna antiparotidítica, vacuna contra la varicela, vacuna antivariólica, vacuna contra la hepatitis, vacuna antipertussis y vacuna contra la difteria. Vacunas que comprenden ácidos nucleicos que pueden suministrarse también de conformidad con los métodos de la invención incluyen, sin limitación, ácidos nucleicos de cadena sencilla y de doble cadena tales como, por ejemplo, ADN de plásmido superenrollado; ADN de plásmido lineal; cósmidos; cromosomas artificiales bacterianos (BACs); cromosomas artificiales de levadura (YACs); cromosomas artificiales de mamífero; y moléculas de ARN tales como, por ejemplo, ARN mensajero. El tamaño del ácido nucleico puede ser de hasta miles de kilobases. El ácido nucleico puede ser acoplado también con un agente proteináceo, o puede incluir una o más modificaciones químicas tales como, por ejemplo, porciones de fosforotioato. Adyuvantes adecuados que aumentan la respuesta inmune que, junto con el antígeno de vacuna pueden comprender la vacuna incluyen, sin limitación, gel de fosfato de aluminio; hidróxido de aluminio; glucano de algas: ß-glucano; subunidad de toxina B del cólera; CRL1005: polímero de bloque de ABA con valores medios de x = 8 e y = 205; gamma inulina: ß-D lineal (no ramificada) (2->1 ) polifructofuranoxil-a-D-glucosa; adyuvante de Gerbu: N-acetilglucosamina-(ß 1-4)-N-acetilmuramil-L-alanil-D-glutamina (GMDP), cloruro de dimetil dioctadecilamonio (DDA), complejo de sal de L-prolina y zinc (Zn-Pro-8); Imiquimod (1-(2-metipropil)-1 H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina; ImmTher™: dipalmitato de N-acetilglucoaminil-N-acetilmuramil-L-Ala-D-isoGlu-L-Ala-glicerol; liposomas de MTP-PE: (MTP); Murametide: Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCH3; Pleuran: ß-glucano; QS-21 ; S-28463: 4-amino-a, a-dimetil-1 H-imidazo[4,5-c]quinolin-1 -etanol; salvo péptido: VQGEESNDK • HCl (péptido 163-171 de IL-1ß); y treonii-MDP (Termurtide™): N-acetil muramil-L-treonil-D-isoglutamina, e interleucina 18, IL-2, IL-12 e IL-15. Adyuvantes incluyen también oligonucleótidos de ADN tales como, por ejemplo, oligonucleótidos que contiene CpG. Además, pueden usarse secuencias de ácido nucleico que codifiquen para linfocinas inmunorreguladoras, tales como IL-18, IL-2, IL-12, IL-15, IL-4, IL10, interferón gamma y proteínas de señalización reguladoras de NF kappa B. El término "cantidad biológicamente efectiva" o "proporción biológicamente efectiva", como se usa en la presente, se refiere a la cantidad o proporción del agente ¡nmunológicamente activo que se necesita para estimular o iniciar el resultado ¡nmunológico deseado, con frecuencia benéfico. La cantidad del agente inmunológicamente activo que se usa en los revestimientos de la invención, será aquella cantidad necesaria para suministrar una cantidad del agente inmunológicamente activo necesario para lograr el resultado inmunológico deseado. En la práctica esto variará ampliamente, dependiendo del agente inmunológicamente activo particular que se esté suministrando, el sitio de suministro y la cinética de disolución y de liberación para el suministro del agente inmunológicamente activo en los tejidos de la piel. Como lo apreciarán los expertos en la técnica, la dosis del agente inmunológicamente activo que se suministre puede manipularse o hacerse variar también alterando el tamaño, densidad, etc. de la disposición (o parche) de microproyecciones. Se entiende que el término "formulación de revestimiento", como se usa en la presente, significa e incluye una composición o mezcla que fluye libremente que se usa para revestir las microproyecciones y/o disposiciones de las mismas. Se entiende que los términos "revestimiento biocompatibie" y "revestimiento sólido", como se usan en la presente, significan e incluyen una "formulación de revestimiento" en un estado sustancialmente sólido. El término "microproyecciones", como se usa en la presente, se refiere a elementos de perforación que están adaptados para perforar o cortar a través del estrato córneo en la capa de epidermis, o capas de epidermis y dermis subyacentes, de la piel de un animal vivo, en particular un mamífero, y más particularmente un humano. El término "miembro de microproyección", como se usa en la presente, connota en general una disposición de microproyecciones que comprende una pluralidad de microproyecciones dispuestas en una disposición para perforar el estrato córneo. El miembro de microproyección puede formarse atacando con un ácido o perforando una pluralidad de microproyecciones de una hoja delgada, y plegando o doblando las microproyecciones fuera del plano de la hoja para formar una configuración, tal como la que se muestra en la figura 2. El miembro de microproyección puede formarse también en otras formas conocidas, tal como formando una o más tiras que tienen microproyecciones a lo largo de un borde de cada una de las tiras, como se describe en la patente de E.U.A. No. 6,050,988, la cual se incorpora en su totalidad en la presente como referencia. En una modalidad, el miembro de microproyección tiene una disposición con una densidad de microproyecciones de por lo menos aproximadamente 10 microproyecciones/cm2, de preferencia por lo menos aproximadamente 100 microproyecciones/cm2, y más preferiblemente en la escala de aproximadamente 200 a 3000 microproyecciones/cm2. Como se indicó anteriormente, la presente invención comprende un aparato y método para el suministro transdérmico de un agente ínmunológicamente activo que incluye un miembro (o sistema) de microproyección que tiene una pluralidad de microproyecciones (o disposición de las mismas), que están adaptadas para perforar a través dei estrato córneo en la capa de epidermis o capas de epidermis y dermis subyacentes, el miembro de microproyección teniendo un revestimiento biocompatible dispuesto sobre el mismo que incluye al agente inmunológicamente activo. En una modalidad preferida de la invención, el agente ínmunológicamente activo comprende una vacuna contra la influenza, más preferiblemente una vacuna contra la influenza trivalente. De conformidad con la invención, tras la perforación de la capa del estrato córneo de la piel, el revestimiento biocompatible es disuelto por fluidos corporales (fluidos intracelulares y fluidos extracelulares, tales como fluido intersticial), y la vacuna contra la influenza es liberada en la piel (es decir, suministro por bolo) para terapia sistémica. De conformidad con la invención, la cinética de la disolución y liberación del revestimiento dependerá de muchos factores, que incluyen la naturaleza del agente inmunológicamente activo, el procedimiento de revestimiento, el espesor del revestimiento y la composición de revestimiento (por ejemplo, la presencia de aditivos de formulación de revestimiento). Dependiendo del perfil de la cinética de liberación, puede ser necesario mantener las microproyecciones revestidas en relación de perforación con la piel por períodos extendidos. Esto puede lograrse anclando el miembro de microproyección a la piel usando adhesivos, o usando microproyecciones ancladas, tal como se muestra en la figura 5 y se describe en el documento WO 97/48440, el cual se incorpora en su totalidad en la presente como referencia. Como es bien sabido en la técnica, la partícula del virus de influenza consiste de muchos componentes de proteína con hemaglutinina (HA) como el antígeno de superficie primario responsable de la inducción de anticuerpos anti-HA protectores en humanos. Una ilustración de una partícula de influenza se muestra en la figura 1. Inmunológicamente, los virus de influenza A se clasifican en subtipos, con base en dos antígenos de superficie: HA y neuraminidasa (NA). La inmunidad a estos antígenos, especialmente a la hemaglutinina, reduce la probabilidad de infección y disminuye la severidad de la enfermedad si ocurre infección. Las características antigénicas de las cepas circulantes proveen la base para la selección de las cepas del virus incluidas en la vacuna de cada año. Cada año, la vacuna contra la influenza contiene tres cepas del virus (usualmente dos de tipo A y una de tipo B) que representan los virus de influenza que es probable que circulen mundialmente en el invierno entrante. Los tipos de influenza A y B pueden distinguirse por diferencias en sus nucleoproteínas y proteínas de matriz. El tipo A es la cepa más común, y es responsable de las pandemias mayores en humanos. El contenido de HA de cada cepa en la vacuna trivalente se ajusta típicamente a 15 µg para una dosis individual en humanos, es decir, 45 µg de HA en total.

Como se discute en detalle en la presente, en virtud del procedimiento de formulación único, una dosis completa para humanos de la vacuna contra la influenza, es decir, 45 µg de hemaglutinina, puede suministrarse transdérmicamente a la capa epidérmica abundante en APC, el componente más inmunocompetente de la piel, por medio de una disposición de microproyecciones revestidas, en donde por lo menos 70% de la vacuna contra la influenza sea suministrada a la capa epidérmica indicada. De manera más importante, el antígeno continúa siendo inmunógeno en la piel para inducir fuertes respuestas inmunes seroprotectoras y de anticuerpos. Además, la formulación de vacuna revestida seca está sustancialmente libre de conservadores, y puede mantener por lo menos una estabilidad a temperatura ambiente por seis meses. Con relación ahora a la figura 2, se muestra una modalidad de un miembro de microproyección 30 para su uso con la presente invención. Como se ilustra en la figura 2, el miembro de microproyección 30 incluye una disposición de microproyecciones 32 que tiene una pluralidad de microproyecciones 34. Las microproyecciones 34 se extienden de preferencia a sustancialmente un ángulo de 90° de la hoja 36, que en la modalidad indicada incluye aberturas 38. De conformidad con la invención, la hoja 36 puede incorporarse en un parche de suministro, que incluye un refuerzo 40 para la hoja 36, y puede incluir además una tira adhesiva (no mostrada) para la adhesión del parche a la piel (véase figura 4). En esta modalidad, las microproyecciones 34 se forman atacando con un ácido o perforando una pluralidad de microproyecciones 34 a partir de una hoja de metal delgada 36, y doblando las microproyecciones 34 fuera del plano de la hoja 36. En una modalidad de la invención, el miembro de microproyección 30 tiene una densidad de microproyecciones de por lo menos aproximadamente 10 microproyecciones/cm2, más preferiblemente en la escala de por lo menos aproximadamente 200 a 3000 microproyecciones/cm2. De preferencia, el número de aberturas por área unitaria a través de la cual el agente pasa, es por lo menos aproximadamente 10 aberturas/cm2, y menos de aproximadamente 3000 aberturas/cm2. Como se indicó, las microproyecciones 34 tienen de preferencia una longitud de proyección menor de 1000 mieras. En una modalidad, las microproyecciones 34 tienen una longitud de proyección menor de 500 mieras, más preferiblemente menor de 250 mieras. En otra modalidad adaptada para reducir al mínimo la hemorragia y la irritación, las microproyecciones tienen de preferencia una longitud de proyección menor de 145 mieras, más preferiblemente en la escala de aproximadamente 50 a 145 mieras, y aún más preferiblemente en la escala de aproximadamente 70 a 140 mieras. Las microproyecciones 34 tienen también de preferencia un ancho, designado como "W" en la figura 2, en la escala de aproximadamente 25 a 500 mieras, y espesor en la escala de aproximadamente 10 a 100 mieras.

Con relación ahora a la figura 5, se muestra otra modalidad de un miembro de microproyección 50 que puede usarse dentro del alcance de la invención. El miembro de microproyección 50 incluye en forma similar una disposición de microproyecciones 52 que tiene una pluralidad de microproyecciones 54. Las microproyecciones 54 se extienden de preferencia a sustancialmente un ángulo de 90° de la hoja 51 , que incluye en forma similar aberturas 56. Como se ilustra en la figura 5, varias de las microproyecciones 54 incluyen un miembro de retención o ancla 58 dispuesto próximo al borde saliente. Como se indicó anteriormente, el miembro de retención 58 facilita la adherencia del miembro de microproyección 50 a la piel del sujeto. Los miembros de microproyección (por ejemplo 30, 50) pueden fabricarse de varios metales, tales como acero inoxidable, titanio, aleaciones de níquel y titanio o materiales biocompatibles similares, tales como materiales poliméricos. De preferencia, el miembro de microproyección se fabrica de titanio. De conformidad con la invención, los miembros de microproyección pueden construirse también de un material no conductor, tal como un polímero. En forma alternativa, el miembro de microproyección puede ser revestido con un material no conductor, tal como Parylene®, o un material hidrofóbico, tal como Teflon®, silicio u otro material de baja energía. Los materiales hidrofóbicos indicados y las capas de base asociadas (por ejemplo, fotoreist) se exponen en la solicitud de E.U.A. No. 60/484,142, la cual se incorpora en la presente como referencia. Miembros de microproyección que pueden usarse con la presente invención incluyen, pero no están limitados a, los miembros descritos en las patentes de E.U.A. Nos. 6,083,196, 6,050,988 y 6,091 ,975, y en la publicación de patente de E.U.A. No. 2002/0016562, las cuales se incorporan en su totalidad en la presente como referencia. Otros miembros de microproyección que pueden usarse con ia presente invención incluyen miembros formados atacando con un ácido silicio usando técnicas de ataque químico de chips de silicio, o moldeando plástico usando micromoldes atacados con ácido, tales como los miembros descritos en la patente de E.U.A. No. 5,879,326, la cual se incorpora en su totalidad en la presente como referencia. Con relación ahora a la figura 3, se muestra el miembro de microproyección 30 que tiene microproyecciones 34 revestidas con un revestimiento biocompatible 35. De conformidad con la invención, el revestimiento 35 puede cubrir parcialmente o completamente cada microproyección 34. Por ejemplo, el revestimiento 35 puede estar en un revestimiento de diseño seco sobre las microproyecciones 34. El revestimiento 35 puede aplicarse también antes o después de que se formen ias microproyecciones 34. De conformidad con la invención, el revestimiento 35 puede aplicarse a las microproyecciones 34 por una variedad de métodos conocidos. De preferencia, el revestimiento se aplica sólo a aquellas porciones del miembro de microproyección 30 o las microproyecciones 34 que perforan la piel (por ejemplo, puntas 39). Uno de dichos métodos de revestimiento comprende revestimiento por inmersión. El revestimiento por inmersión puede describirse como un medio para revestir las microproyecciones sumergiendo parcialmente o totalmente las microproyecciones 34 en una solución de revestimiento. Por medio del uso de una técnica de inmersión parcial, es posible limitar el revestimiento 35 a sólo las puntas 39 de las microproyecciones 34. Otro método de revestimiento comprende revestimiento por cilindro, que usa un mecanismo de revestimiento por cilindro que limita en forma similar el revestimiento 35 a las puntas 39 de las microproyecciones 34.

El método de revestimiento por cilindro se describe en la solicitud de E.U.A.

No. 10/099,604 (publicación No. 2002/0132054), la cual se incorpora en su totalidad en la presente como referencia. Como se discute en detalle en la solicitud indicada, el método de revestimiento por cilindro descrito provee un revestimiento uniforme que no es desalojado fácilmente de las microproyecciones 34 durante la perforación de la piel. De conformidad con la invención, las microproyecciones 34 pueden incluir además medios adaptados para recibir y/o aumentar el volumen del revestimiento 35, tales como aberturas (no mostradas), ranuras (no mostradas), irregularidades de superficie (no mostradas) o modificaciones similares, en donde los medios proveen área de superficie incrementada sobre la cual una cantidad mayor de revestimiento puede depositarse.

Otro método de revestimiento que puede usarse dentro del alcance de la presente invención, comprende revestimiento por aspersión. De conformidad con la invención, el revestimiento por aspersión puede abarcar formación de una suspensión en aerosol de la composición de revestimiento. En una modalidad, una suspensión en aerosol que tenga un tamaño de gotita de aproximadamente 10 a 200 picolitros es pulverizada sobre las microproyecciones 10, y entonces secada. Puede usarse también revestimiento por patrón para revestir las microproyecciones 34. El revestimiento por patrón puede aplicarse usando un sistema de dispensación que posiciona el líquido depositado sobre la superficie de la microproyección. La cantidad del líquido depositado está de preferencia en la escala de 0.1 a 20 nanolitros/microproyección. Ejemplos de dispensadores de líquido dosificado con precisión, se describen en las patentes de E.U.A. Nos. 5,916,524; 5,743,960; 5,741 ,554; y 5,738,728, las cuales se incorporan en su totalidad en la presente como referencia. Pueden aplicarse también soluciones o formulaciones de revestimiento de microproyecciones, usando tecnología de chorro de tinta usando dispensadores de válvula solenoide conocidos, medios motrices de fluido opcionales y medios de posicionamiento que son controlados en general por el uso de un campo eléctrico. Otra tecnología de dispensación de líquidos de la industria de impresión o tecnología de dispensación de líquidos similar conocida en la técnica, puede usarse para la aplicación del revestimiento por diseño de esta invención.

Con relación ahora a las figuras 6 y 7, para almacenamiento y aplicación, el miembro de microproyección 30 es suspendido de preferencia en un anillo retenedor 40 por lengüetas adhesivas 6, como se describe en detalle en la solicitud de E.U.A. co-pendiente No. 09/976,762 (publicación No. 2002/0091357), la cual se incorpora en su totalidad en la presente como referencia. Después de la colocación del miembro de microproyección 30 en el anillo retenedor 40, el miembro de microproyección 30 es aplicado a la piel del paciente. De preferencia, el miembro de microproyección 30 es aplicado a la piel usando un aplicador de impacto 45, tal como se muestra en la figura 8 y se describe en la solicitud de E.U.A. co-pendiente No. 09/976,798, la cual se incorpora en su totalidad en la presente como referencia. Como se indicó, en una modalidad preferida de la invención, la formulación de revestimiento aplicada al miembro de microproyección 30 que forma un revestimiento sólido, comprende una formulación acuosa. En una modalidad alternativa, la formulación de revestimiento comprende una formulación no acuosa. De conformidad con la invención, el agente inmunológicamente activo puede disolverse dentro de un vehículo biocompatible, o puede suspenderse dentro del vehículo. Como se indicó, en una modalidad preferida de la invención, ei agente inmunológicamente activo comprende una vacuna contra la influenza. Más preferiblemente, una vacuna contra la influenza trivalente. En modalidades alternativas de la invención, el agente inmunológicamente activo comprende una vacuna (o agente antigénico) seleccionado del grupo que consiste de virus y bacterias, vacunas basadas en proteínas, vacunas basadas en polisacáridos y vacunas basadas en ácidos nucleicos. Agentes antigénicos adecuados incluyen, sin limitación, antígenos en ia forma de proteínas, conjugados de polisacáridos, oligosacáridos y lipoproteínas. Estas vacunas subunitarias incluyen Bordetella pertussis (vacuna accince - acelular de PT recombinante), Clostridium tetani (purificada, recombinante), Corynebacteríum diphtheriae (purificada, recombinante), citomegalovirus (subunidad de glucoproteína), estreptococo del grupo A (subunidad de glucoproteína, polisacárido del grupo A de glucoconjugado con toxoide tetánico, péptídos/proteína M enlazados a portadores de subunidades de toxina, proteína M, epítopes específicos de tipo multivalente, cisteína proteasa, peptidasa C5a), virus de hepatitis B (Pre-S1 , Pre-S2, S recombinantes, proteína de núcleo recombínante), virus de hepatitis C (epítopes y proteínas de superficie expresados - recombinantes), virus del papiloma humano (proteína de la cápside, proteína recombinante de TA-GN L2 y E7 (de HPV-6), VLP L1 recombinante MEDI-501 de HPV-11 , BLP L1 recombinante cuadrivalente [de HPV-6], HPV-11 , HPV-16 y HPV-18, LAMP-E7 [de HPV-16]), Legionella pneumophila (proteína de superficie bacteriana purificada), Neisseria meningitidis (glucoconjugado con toxoide tetánico), Pseudomonas aeruginosa (péptidos sintéticos), virus de la rubéola (péptido sintético), Streptococcus pneumoniae (glucoconjugado [1 , 4, 5, 6B, 9N, 14, 18C, 19V, 23F] conjugado con OMP de meningococo B, glucoconjugado [4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F] conjugado con CRM197, glucoconjugado [1 , 4, 5, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F] conjugado con CRM1970, Treponema pallidum (lipoproteínas de superficie), virus varicela-zoster (subunidad, glucoproteínas) y Vibrio cholerae (lipopolisacárido conjugado). Bacterias o virus enteros incluyen, sin limitación, virus debilitados o destruidos, tales como citomegalovirus, virus de hepatitis B, virus de hepatitis C, virus del papiloma humano, virus de la rubéola y virus varicela-zoster, bacterias debilitadas o destruidas, tales como Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacteríum diphtheriae, estreptococos del grupo A, Legionella pneumophila, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum y Vibrio cholerae, y mezclas de los mismos. Otras vacunas disponibles comercialmente, que contienen agentes antigénicos incluyen, sin limitación, vacuna contra la influenza, vacuna contra la enfermedad de Lyme, vacuna antirrábica, vacuna antisarampionosa, vacuna antiparotidítica, vacuna contra la varicela, vacuna antivariólica, vacuna contra la hepatitis, vacuna antipertussis y vacuna contra la difteria. Vacunas que comprenden ácidos nucleicos incluyen, sin limitación, ácidos nucleicos de cadena sencilla y de doble cadena tales como, por ejemplo, ADN de plásmido superenrollado; ADN de plásmido lineal; cósmidos; cromosomas artificiales bacterianos (BACs); cromosomas artificiales de levadura (YACs); cromosomas artificiales de mamífero; y moléculas de ARN tales como, por ejemplo, ARN mensajero. El ácido nucleico puede ser acoplado también con un agente proteináceo, o puede incluir una o más modificaciones químicas tales como, por ejemplo, porciones de fosforotioato. La secuencia codificante del ácido nucleico comprende la secuencia del antígeno contra el cual se desea la respuesta inmune. Además, en el caso de ADN, pueden incorporarse también un promotor y secuencias de poliadenilación en la construcción de vacuna. Los antígenos que pueden ser codificados incluyen todos los componentes antigénicos de enfermedades infecciosas, patógenos, así como antígenos cancerosos. Los ácidos nucleicos encuentran de esta manera aplicación, por ejemplo, en los campos de enfermedades infecciosas, cánceres, alergias, enfermedades autoinmunes y enfermedades inflamatorias. Adyuvantes adecuados que aumentan la respuesta inmune que, junto con el antígeno de vacuna pueden comprender la vacuna incluyen, sin limitación, gel de fosfato de aluminio; hidróxido de aluminio; glucano de algas: ß-glucano; subunidad de toxina B del cólera; CRL1005: polímero de bloque de ABA con valores medios de x = 8 e y = 205; gamma inulina: ß-D lineal (no ramificada) (2->1 ) polifructofuranoxil-a-D-glucosa; adyuvante de Gerbu: N-acetilglucosamina-(ß 1-4)-N-acetilmuramil-L-alanil-D-glutamina (GMDP), cloruro de dimetil dioctadecilamonio (DDA), complejo de sal de L-prolina y zinc (Zn-Pro-8); Imiquimod (1-(2-metipropil)-1 H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina; ImmTher™: dipalmitato de N-acetilglucoaminil-N-acetilmuramil-L-Ala-D- isoGlu-L-Ala-glicerol; liposomas de MTP-PE: C59H?o8N6?19PNa-3H2O (MTP); Murametide: Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCH3; Pleuran: ß-glucano; QS-21 ; S-28463: 4-amino-a, a-dimetil-1 H-imidazo[4,5-c]quinolin-1 -etanol; salvo péptido: VQGEESNDK • HCl (péptido 163-171 de IL-1ß); y treonil-MDP (Termurtide™): N-acetil muramil-L-treonil-D-isoglutamina, e interleucina 18, IL-2, IL-12 e IL-15. Adyuvantes incluyen también oligonucleótidos de ADN tales como, por ejemplo, oligonucleótidos que contiene CpG. Además, pueden usarse secuencias de ácido nucleico que codifiquen para linfocinas inmunorreguladoras, tales como IL-18, IL-2, IL-12, IL-15, IL-4, IL10, interferón gamma y proteínas de señalización reguladoras de NF kappa B. De conformidad con la invención, la formulación de revestimiento puede incluir por lo menos un agente mojante. Agentes mojantes adecuados incluyen agentes tensioactivos y polímeros que presenten propiedades anfifílicas. De esta manera, en una modalidad de la invención, la formulación de revestimiento incluye por lo menos un agente tensioactivo. De conformidad con la invención, el agente tensioactivo puede ser zwitteriónico, anfotérico, catiónico, aniónico o no ¡ónico. Ejemplos de agentes tensioactivos adecuados incluyen lauroanfoacetato de sodio, dodecil sulfato de sodio (SDS), cloruro de cetilpiridinio (CPC), cloruro de dodeciltrimetil amonio (TMAC), cloruro de benzalconio, polisorbatos, tales como Tween 20 y Tween 80, otros derivados de sorbitán, tales como laurato de sorbitán, y alcoholes alcoxilados tales como laureth-4. Agentes tensioactivos más preferidos incluyen Tween 20, Tween 80 y SDS. En otra modalidad de la invención, la formulación de revestimiento incluye por lo menos un material polimérico o polímero que tenga propiedades anfifílicas. Ejemplos de los polímeros indicados incluyen, sin limitación, derivados de celulosa, tales como hidroxietilcelulosa (HEC), hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), hidroxipropilcelulosa (HPC), metilcelulosa (MC), hidroxietilmetilcelulosa (HEMC) o etilhidroxietilcelulosa (EHEC), así como pluronics. En una modalidad de la invención, la concentración del polímero que presenta propiedades anfifílicas está de preferencia en la escala de aproximadamente 0.01-20% en peso, más preferiblemente en la escala de aproximadamente 0.03-10% en peso de la formulación de revestimiento. Aún más preferiblemente, la concentración del agente mojante está en la escala de aproximadamente 0.1-5% en peso de la formulación de revestimiento. Como lo apreciarán los expertos en la técnica, los agentes mojantes indicados pueden usarse por separado o en combinaciones. De conformidad con la invención, la formulación de revestimiento puede incluir además un polímero hidrofílico. De preferencia, el polímero hidrofílico se selecciona del siguiente grupo: dextrán, hidroxietil almidón (HES), aicohol poli(vinílico), óxido de poli(etiieno), metacrilato de po!i(2-hidroxietilo), poli(n-vinilpirrolidona), polietilenglicol, y mezclas de los mismos, y polímeros similares. Como es bien sabido en la técnica, los polímeros indicados incrementan la viscosidad.

La concentración del polímero hidrofílico en ia formulación de revestimiento está de preferencia en la escala de aproximadamente 0.01-50% en peso, más preferiblemente en la escala de aproximadamente 0.03-30% en peso de la formulación de revestimiento. Aún más preferiblemente, la concentración del agente mojante está en la escala de aproximadamente 0.1-20% en peso de la formulación de revestimiento. De conformidad con la invención, ia formulación de revestimiento puede incluir además un vehículo biocompatible, tal como los que se describen en la solicitud de E.U.A. co-pendiente No. 10/127,108, la cual se incorpora en su totalidad en la presente como referencia. Ejemplos de vehículos biocompatibles incluyen albúmina humana, albúmina humana biodiseñada, ácido poliglutámico, ácido poliaspártico, polihistidina, polisulfato de pentosán, poliaminoácidos, sacarosa, trehalosa, melezitosa, rafinosa y estaquiosa. La concentración del vehículo biocompatible en la formulación de revestimiento está de preferencia en la escala de aproximadamente 2-70% en peso, más preferiblemente en la escala de aproximadamente 5-50% en peso de la formulación de revestimiento. Aún más preferiblemente, la concentración del agente mojante está en la escala de aproximadamente 10-40% en peso de la formulación de revestimiento. La formulación de revestimiento puede incluir además un vasoconstrictor, tales como los que se describen en la solicitud de E.U.A. copendiente No. 10/674,626, la cual se incorpora en su totalidad en la presente como referencia. Como se expone en la solicitud co-pendiente indicada, el vasoconstrictor se usa para controlar la hemorragia durante y después de la aplicación sobre el miembro de microproyección. Vasoconstrictores preferidos incluyen, pero no están limitados a, amidefrina, cafaminol, ciclopentamina, desoxiepinefrina, epinefrina, felipresina, indanazolina, metizolina, midodrina, nafazolina, nordefrina, octodrina, ornipresina, oximetazolina, fenilefrina, feniletanolamina, fenilpropanolamina, propilhexedrina, pseudoefedrina, tetrahidrozolina, tramazolina, tuaminoheptano, timazolina, vasopresina, xilometazolina, y mezclas de los mismos. Los vasoconstrictores más preferidos incluyen epinefrina, nafazolina, tetrahidrozolina, indanazolina, metizolina, tramazolina, timazolina, oximetazolina y xilometazolina. La concentración del vasoconstrictor, si se usa, está de preferencia en la escala de aproximadamente 0.1% en peso a 10% en peso del revestimiento. En otra modalidad de la invención, la formulación de revestimiento incluye por lo menos un "modulador de permeabilidad de la vía", tal como los que se describen en la solicitud de E.U.A. co-pendiente No. 09/950,436, la cual se incorpora en su totalidad en la presente como referencia. Como se expone en la solicitud co-pendiente indicada, los moduladores de la permeabilidad de ia vía previenen o disminuyen los procesos de curación natural de la piel, previniendo de esta manera el cierre de las vías o microhendiduras formadas en el estrato córneo por la disposición de miembros de microproyección. Ejemplos de dichos moduladores de permeabilidad de la vía incluyen, sin limitación, agentes osmóticos (por ejemplo, cloruro de sodio) y compuestos zwitteriónicos (por ejemplo, aminoácidos). El término "modulador de permeabilidad de la vía", como se define en la solicitud co-pendiente indicada, incluye además agentes antiinflamatorios, tales como sal disódica de fosfato 21 de betametasona, fosfato disódico de acetónido 21 de triamcinolona, clorhidrato de hidrocortamato, sal disódica de fosfato 21 de hidrocortisona, sal disódica de fosfato 21 de metilprednisolona, sal sódica de succinato 21 de metilprednisolona, fosfato disódico de parametasona y sal sódica de succinato 21 de prednisolona, y anticoagulantes, tales como ácido cítrico, sales de citrato (por ejemplo, citrato de sodio), sulfato sódico de dextrina, aspirina y EDTA. De conformidad con la invención, la formulación de revestimiento puede incluir además un solvente no acuoso, tal como etanol, cloroformo, éter, propilenglicol, polietilenglicol, y similares, colorantes, pigmentos, llenadores inertes, intensificadores de permeación, excipientes y otros componentes convencionales de productos farmacéuticos o dispositivos transdérmicos conocidos en la técnica. Otros adyuvantes de formulación conocidos pueden añadirse también a la formulación de revestimiento, en tanto no afecten adversamente las características necesarias de solubilidad y viscosidad de la formulación de revestimiento y la integridad física del revestimiento desecado.

De preferencia, la formulación de revestimiento tiene una viscosidad menor de aproximadamente 5 para revestir efectivamente cada microproyección 10. Más preferiblemente, las formulaciones de revestimiento tienen una viscosidad en la escala de aproximadamente 0.03-0.2 pascales/seg. De conformidad con la invención, el espesor del revestimiento es de preferencia menor de 100 mieras, más preferiblemente menor de 50 mieras. Aún más preferiblemente, el espesor del revestimiento está en la escala de aproximadamente 2 a 30 mieras. El espesor deseado del revestimiento depende de varios factores, que incluyen la dosificación requerida y, por ende, el espesor del revestimiento necesario para suministrar la dosificación, la densidad de las microproyecciones por unidad de área de la hoja, la viscosidad y concentración de la formulación de revestimiento, y el método de revestimiento elegido. En todos los casos, después de que se ha aplicado un revestimiento, la formulación de revestimiento puede desecarse sobre las microproyecciones por varios medios. En una modalidad de la invención, el miembro de microproyección revestido (por ejemplo, 30) es secado al aire en condiciones de temperatura ambiente. En otra modalidad, el miembro de microproyección revestido es secado al vacío. En otra modalidad, el miembro de microproyección revestido es secado al aire y secado al vacío después. Varias temperaturas y niveles de humedad pueden usarse también para secar la formulación de revestimiento sobre las microproyecciones. El miembro de microproyección revestido 30 puede de esta manera ser calentado, liofilizado, secado por congelación o sometido a técnicas similares, para remover el agua del revestimiento.

Estudios/ejemplos Los siguientes estudios y ejemplos ilustran ei aparato, métodos de formulación y procedimientos de la invención. Los ejemplos son únicamente para propósitos ilustrativos, y de ninguna manera significa que limitan el alcance de la invención. Primero con relación al cuadro l, se muestra un resumen de las cepas monovalentes (es decir, lotes) que se obtuvieron y usaron en los estudios expuestos a continuación: CUADRO I Procedimiento de preformulación La primera vacuna global obtenida fue una cepa monovalente A/Panamá/2007/99 (Fluzone®) en 400 µg de HA/mL. La solución era turbia como se recibió, sugiriendo la presencia de partículas insolubles debido quizá a lípidos insolubles en agua, complejos de lípidos-proteínas y proteínas agregadas. El análisis de BCA, así como la diálisis del monovalente, indicó que las sales y otros materiales de bajo peso molecular absorbieron la mayor parte del contenido de sólidos. Para enriquecer el contenido de HA del revestimiento para satisfacer los requisitos de dosis, estos componentes de bajo peso molecular tuvieron que ser removidos. Se desarrolló de esta manera un procedimiento de diafiltración/concentración para consignar este aspecto. Con relación ahora a la figura 9, se muestra un diagrama de flujo del procedimiento de pre-formulación que se usó. Los pasos expuestos en el diagrama de flujo se discuten a continuación.

Filtración de flujo tangencial (TFF) Como es sabido en la técnica, la TFF permite que la diafiltración y la concentración se realicen al mismo tiempo. Se usó diafiltración para remover materiales de bajo peso molecular. Se estableció un sistema de TFF (Millipore, Labscale) equipado con una membrana de celulosa regenerada Pellicon XL (Millipore, 50 cm2, limitación de peso molecular de 30 kD), y se evaluó para la diafiltración y concentración de la materia prima de la vacuna.

El volumen de la solución de la vacuna fue reducido a 1/20 a 1/50 del volumen original, incrementando la concentración de HA hasta 5-10 mg de HA mL. Se añadió solución de regulador de pH para intercambio y concentración del regulador de pH.

Liofilización Después de la filtración de flujo tangencial, ia vacuna concentrada fue formulada con excipientes lioprotectores, tales como sacarosa o trehalosa, llenados en viales de vidrio de 20 mL, congelados instantáneamente con nitrógeno líquido, y puestos sobre un secador por congelación estilo múltiple (Virtis, 25 EL Freezemobile). Se dejó que los viales se secaran por congelación por 2 a 5 días hasta que la presión de la cámara alcanzara un estado estable (~ 50 mTorr). El procedimiento de pre-formulación indicado, proveyó formulaciones de hemaglutinina (HA) altamente concentradas y de estado sólido, como productos intermediarios. Por supuesto, la concentración de las formulaciones de HA fue por lo menos 500 veces la concentración del producto comercial. Los productos intermediarios indicados fueron también altamente potentes e inmunógenos. Como lo apreciarán los expertos en la técnica, el procedimiento de pre-formulación de la invención indicado puede modificarse y adaptarse para pre-formular varias materias primas de vacuna, y formas de las mismas. Por ejemplo, el procedimiento podría adaptarse para usar materias primas recibidas a mayores concentraciones. En este caso, el paso de diafiltración no sería necesario, y las materias primas de alta concentración serían liofilizadas y reconstituidas directamente para producir la formulación de revestimiento. El procedimiento de pre-formulación podría adaptarse también para usar materias primas recibidas como sólidos como tales, pero no limitados a, polvos secados por pulverización o liofilizados. En este caso, las materias primas sólidas serían reconstituidas directamente para producir la formulación de solución de revestimiento. El procedimiento de pre-formulación podría modificarse también para usarse con materias primas de alta pureza tales como, pero no limitadas a, vacunas contra la influenza derivadas de células. En este caso los materiales pueden ser de pureza suficiente, que el paso de liofilización y reconstitución sería innecesario.

Desarrollo de la formulación El esfuerzo de formulación fue dirigido hacia el desarrollo de una formulación de revestimiento con propiedades y estabilidad de revestimiento adecuadas, definiendo un sistema de revestimiento que pueda producir confiablemente dosis de revestimiento reproducibles, e identificación de un diseño de disposiciones que pueda suministrar la vacuna con buena eficiencia de suministro y buena aceptabilidad por la piel.

Procedimiento de revestimiento Dos tipos de la máquina para aplicar revestimiento se usaron en el estudio. La primera máquina para aplicar revestimiento, fue adaptada con un cilindro de 0.96 cm de diámetro hecho de Delrin. El cilindro es sumergido en un depósito que tiene un volumen de carga de 0.25 mL. Este depósito no tiene capacidad de enfriamiento, pero permite que la infusión directa de agua fresca compense la evaporación durante la operación. El espesor de la película establecida sobre el cilindro es de -200-250 µm. La segunda máquina evaluada para aplicar revestimiento, fue adaptada con un cilindro de acero inoxidable de 1.57 cm de diámetro, y un depósito concéntrico. El depósito para esta máquina para aplicar revestimiento tiene un volumen de carga de 0.3 a 0.7 mL, dependiendo del diámetro del cilindro. El diámetro del cilindro controla también el espesor de la película, el cual es de aproximadamente 80 a 90 µm para el cilindro de 1.57 cm. El depósito de esta máquina para aplicar revestimiento está equipado con enfriamiento termoeléctrico (TEC). Por medio del control de la temperatura del cilindro al punto de condensación de la condición ambiental, pueden reducirse al mínimo los cambios en la concentración de la solución de revestimiento. Se determinó el peso del revestimiento por la suma de la longitud de la microproyección y el espesor de la tira de disposiciones.

Diseños de disposiciones de microprovecciones Se usaron ocho disposiciones de microproyecciones en el desarrollo de la formulación. Los diseños de las disposiciones de microproyecciones, variaron en longitud de la microproyección, ángulo de la punta y la presencia de características de diseño adicionales, tales como púas de retención y/o topes de las microproyecciones. Se evaluaron inicialmente dos diseños de disposiciones de microproyecciones, MF-1 y MF2.

Excipientes Para evaluar si las microproyecciones podrían ser revestidas usando una suspensión, es decir, una solución de revestimiento no clara, la atención inicial se centró en la estabilización de las partículas insolubles añadiendo un agente tensioactivo. Con relación ahora al cuadro II, se muestran los efectos de los agentes tensioactivos en la reducción de la turbiedad de la solución. Los datos indicados sugieren que la adición de un agente tensioactivo podría ayudar a la desagregación/solubilización de las partículas, determinada por una reducción en la turbiedad de la solución. El orden de concentración dei agente tensioactivo es SDS>Triton X100>Tween 20, el cual es consistente con la claridad de la solución en presencia de los mismos agentes tensioactivos (véase cuadro lll).

CUADRO II CUADRO lll Otra clase potente de agente tensioactivo, Zwittergent, es también capaz de romper agregados basados en proteínas/lípidos. El cuadro IV enlista tres tipos de Zwittergent, cuyo poder de solubilización se incrementa con el carácter hidrofóbico creciente del Zwittergent, es decir, Zwittergent 3-14 es el más fuerte.

CUADRO IV Se mostró también que el ajuste del pH disminuye la turbiedad de la vacuna a pH alto y bajo, como se muestra en la figura 10. Sin embargo, un gran incremento o disminución en el pH podría comprometer la estabilidad del antígeno a altas concentraciones. Por lo tanto, no se usó una desviación significativa de pH 7.2 para remover la turbiedad de la solución. Con el procedimiento de pre-formulación que permite que la vacuna sea concentrada hasta el nivel de revestimiento requerido, junto con ia estrategia de preparación de soluciones de revestimiento solubilizadas o suspendidas, se investigaron además siete formulaciones candidatas. Las formulaciones, las cuales se exponen en el cuadro V, contienen por lo menos uno o más excipientes.

CUADRO V Las formulaciones 1 a 4 fueron soluciones solubilizadas. Las formulaciones 5 a 7 fueron soluciones en suspensión/turbias. Todas las formulaciones contenían por lo menos un azúcar para estabilizar la proteína. La formulación 5 contenía un agente tensioactivo débil, Tween 80 el cual, se pensó, podría proveer solubilización incrementada de la vacuna, y quizá inmunogenicidad incrementada. La formulación 6, que contenía sólo sacarosa, era la formulación más simple de las formulaciones evaluadas. La formulación 7 incluía manitol y un agente tensioactivo sólido, Pluronic F68 el cual, se pensó, podría disminuir el carácter higroscópico del revestimiento, e incrementar la estabilidad física/integridad del revestimiento.

Caracterización de la suspensión/solución de revestimiento Como es bien reconocido en la técnica, dos parámetros físicos determinan principalmente la viabilidad del revestimiento: viscosidad y mojabilidad de la solución de revestimiento. Cada uno de estos parámetros se discute a continuación.

Viscosidad La viscosidad de la solución afecta el flujo de la solución de revestimiento durante el revestimiento de la microproyección. Si la viscosidad de la solución de revestimiento es muy baja, una porción significativa del líquido puede gotear de nuevo en el depósito cuando la disposición de microproyecciones sumergida es removida de la solución de revestimiento antes de que el líquido tenga oportunidad de formar una película alrededor de la punta de las microproyecciones. Esto resultará en un procedimiento menos eficiente que requiere muchos más ciclos de revestimiento. Por otra parte, si la viscosidad de la solución de revestimiento es muy alta, el líquido sobre la disposición de microproyecciones se moverá muy lento, y puede resultar en morfología desigual del revestimiento. El cuadro VI resume la composición de las siete formulaciones candidatas en el estado sólido. Las siete formulaciones de la solución de revestimiento contenían 2-fenoxietanol a 6 mg/mL como un conservador. El contenido de HA en la solución de revestimiento fue aproximadamente 30% en este caso, en donde la pureza de la HA es de 50%.

CUADRO VI Con relación ahora a la figura 11 , se muestra una gráfica que compara dos diferentes lotes de vacuna; Fluzone® y Vaxigrip®. Ambos lotes comprenden la cepa A/Panamá, y se formularon en la formulación No. 5 (HA: trehalosa: Tween 80 = 5:5:2 de relación en peso). La formulación de revestimiento estaba normalmente a 50 mg/mL (5%) de HA. Sin embargo, a esta concentración, la viscosidad de la solución para la Vaxigrip™ fue mucho mayor, es decir, -0.08 pascales/seg a 200 rpm. Como se ¡lustra en la figura 11 , la viscosidad de las formulaciones disminuye con la dilución. A 35 mg/mL de HA (3.5%), la viscosidad de la solución de la formulación Vaxigrip™ alcanzó el mismo nivel de la formulación Fluzone® a 50 mg/mL de HA (5%), la cual se midió a -0.04 pascales/seg a 200 rpm. Aparte de la pureza de la HA y la concentración de la HA, la temperatura de la solución de revestimiento es otro factor importante que afecta la viscosidad. Una solución de revestimiento altamente viscosa que comprende una cepa A/New Caledonia que tiene HA con 15% de pureza, se preparó de esta manera reconstituyendo la vacuna secada por congelación a 22.5 mg/mL de HA (una formulación modificada No. 6 con HA a 2.25%/sacarosa a 2.25%). La viscosidad de esta solución de revestimiento se midió a varias temperaturas abajo de temperatura ambiente (véase figura 12). La solución fue altamente viscosa, es decir, -1 JO cp a 5°C. Como es bien sabido en la técnica, la temperatura es un parámetro importante en el sistema de revestimiento, ya que el cilindro y el depósito de acero inoxidable de la solución son controlados por la temperatura en el punto de condensación del ambiente con el propósito de reducir al mínimo la pérdida de agua debida a evaporación durante el procedimiento de revestimiento. El punto de condensación bajo condiciones ambientales normales (22°C a 30-45% de humedad relativa), está típicamente en la escala de 4 a 10°C. Aunque la viscosidad de la solución puede variar significativamente, se ha encontrado que la solución de revestimiento puede revestirse fácilmente y eficientemente sobre una disposición de microproyecciones sobre una amplia escala de viscosidad, de preferencia en la escala de aproximadamente 0.03-0.2 pascales/seg.

Mojabilidad: ángulo de contacto Como es sabido en la técnica, la mojabilidad determina la capacidad del líquido para unirse a, adherirse a, y extenderse sobre, la superficie que se va a revestir. Mediciones del ángulo de contacto de gotitas de líquido sobre superficies de substrato, se usan comúnmente para caracterizar la mojabilidad de una superficie. Los ángulos de contacto medidos son con relación al agua pura, cuyo ángulo de contacto bajo la misma condición es de aproximadamente 70 a 80°. En general, cuanto menor es el ángulo de contacto, mejor es la mojabilidad. Con relación ahora al cuadro Vil, se muestran los ángulos de contacto de las siete formulaciones de vacuna contra la influenza identificadas en el cuadro V sobre una superficie metálica de titanio, la cual no había sido limpiada. En comparación con ei agua pura, todas las formulaciones mostraron buena mojabilidad con ángulos de contacto que variaron de 26° a 36°C. Esta escala estrecha de ángulos de contacto de formulación muy diferente, sugiere que las contribuciones de la vacuna a la mojabilidad podrían superar la contribución de los excipientes. Para verificar esta hipótesis, se midieron los ángulos de contacto de las mismas formulaciones en ausencia de la vacuna. Los resultados sugieren que los componentes en la vacuna parecen ayudar a mojar la superficie de metal. Sin la vacuna, estos excipientes, salvo los agentes tensioactivos potentes, no fueron capaces de mojar efectivamente la superficie de metal.

CUADRO Vil En general, la solución de revestimiento exhibió propiedades mojantes vigorosas, las cuales fueron afectadas al mínimo por la superficie revestida, y mostraron propiedades de revestimiento excelentes, a pesar del ángulo de contacto, que está en el extremo reducido de la escala óptima de ángulo de contacto. Se consideró que el ángulo de contacto óptimo está en la escala de aproximadamente 30 a 60°, el cual se estableció a partir de otras formulaciones biofarmacéuticas y de placebo.

Selección de candidatos para estudios de inmunogenicidad La selección de formulaciones finales para estudios de inmunogenicidad, se basó en desempeño de suministro y estabilidad del antígeno.

Formulación trivalente Con relación de nuevo al cuadro I, se determinó la pureza de la HA de cada lote. La pureza de la HA varió de 16% a 50%. Con base en relaciones empíricas reconocidas, el contenido de HA de la solución de revestimiento disminuye dramáticamente de aproximadamente 30% a 11 %, si la pureza de la HA disminuye del 50% deseado a 20%. A pesar de dichas variaciones de pureza de la HA, estos materiales pudieron procesarse exitosamente, sugiriendo la robustez del procedimiento de pre-formulación. Se evaluaron dos procedimientos para la preparación de la vacuna contra la influenza trivalente a partir de tres cepas monovalentes, A/Panamá/Fluzone®, A/New Caledonia/Fluzone® y B/Victoria/Fluzone®. En el primer procedimiento, los tres materiales de partida de las cepas monovalentes, A/Panamá/Fluzone®, A/New Caledonia/Fluzone® y B/Victoria/Fluzone®, fueron procesados por separado para proveer tres intermediarios monovalentes secados por congelación. El material secado por congelación de cada uno de los tres intermediarios, de la cantidad equivalente de HA, se combinó y reconstituyó con agua para revestimiento. El segundo procedimiento se realizó mezclando los tres materiales de partida monovalentes de la cantidad equivalente de HA, es decir, diferentes volúmenes. La mezcla trivalente fue entonces diafiltrada y concentrada por el sistema de TFF, y secada con congelación. La solución de revestimiento del segundo procedimiento tuvo las mismas propiedades de revestimiento que las del primer procedimiento. El revestimiento de la formulación trivalente (24 mg/ml de HA, es decir, -8 mg/ml por cepa de HA) mostró la morfología de revestimiento de puntas en un sitio similar, a pesar del diseño de disposiciones de microproyecciones usado. Medido desde la punta de las microproyecciones, el revestimiento se extendió aproximadamente 90 µm hacia abajo para todos los diseños, sugiriendo que se estableció un sistema de revestimiento bien controlado.

Caracterización de la disposición de microproyecciones revestidas Aparte de la morfología, varios aspectos físicos y bioquímicos del revestimiento necesitan caracterizarse para entender el desempeño del procedimiento de formulación. Los parámetros físicos incluyen evaporación de agua y contenido de humedad durante y después del revestimiento, y consideraciones microbiológicas del revestimiento.

Morfología/viabilidad del revestimiento: formulaciones solubilizadas (Nos. 1-4) A pesar del hecho de que diferentes formulaciones de revestimiento podrían llevar a varias morfologías de revestimiento, se obtuvieron morfología/sitio de revestimiento similares y aceptables a pesar de la formulación, sugiriendo que la presencia de algunos componentes de la vacuna favoreció el procedimiento de revestimiento reflejado por los resultados del ángulo de contacto. Se demostró la viabilidad del revestimiento con cuatro formulaciones.

Morfología/viabilidad del revestimiento: formulaciones en suspensión (Nos. 5-7) Aunque las formulaciones Nos. 5 a 7 fueron soluciones viscosas altamente turbias, la suspensión fue estable, puesto que no se observó separación de fase después de almacenamiento bajo refrigeración por más de un mes. Además, no hubo sedimentación clara de partículas después de la centrifugación a 7,000 rpm por 2 minutos. Se formó una película delgada uniforme sobre el cilindro durante el revestimiento, sin partículas obvias observadas - más evidencia de una suspensión estable fina.

Contenido de humedad Como se refleja en el cuadro VIII, se encontró que el contenido de humedad del revestimiento fue afectado por la desecación y el ambiente de procesamiento, en particular la humedad relativa de las condiciones ambientales. La solución de revestimiento de la formulación 5 (HA/sacarosa/Tween 80) secada sobre las disposiciones de microproyecciones o un substrato de hoja de titanio, resultó en contenido de humedad de 1.7% sólo si era sometida a secado al vacío después de secado al aire. Sin secado al vacío, el contenido de humedad del revestimiento fue significativamente mayor de 6.2%, el cual variaría con la humedad del aire ambiente.

CUADRO VIII Microbiología Se llevó a cabo análisis microbiológico en el área de producción de biocarga reducida, es decir, "no estéril", modo sólo para la formulación de sacarosa trivalente sin conservador alguno para un lote de producción de GLP y un lote de producción de GMP. Los resultados de este análisis se exponen en el cuadro IX.

CUADRO IX *Cantidad equivalente a concentraciones individuales de dosis para humanos. La solución de revestimiento trivalente está 466 veces más concentrada que la solución de vacuna comercializada comúnmente.

Como se refleja en el cuadro IX, en ausencia de algún conservador, ambos lotes de la solución de revestimiento contenían niveles muy bajos de endotoxina y contenido de microbios. Los resultados indican de esta manera que los procedimientos usados para derivar la solución de revestimiento, y el procedimiento de revestimiento mismo, pueden operarse de tal forma que no introduzcan una biocarga adicional en el producto.

SDS-PAGE/Westem blot Se analizó la antigenicidad de la HA en tres formulaciones finales (formulación Nos. 3, 6 y 7) revestidas sobre las microproyecciones por análisis Western Blot. En comparación con el material de partida (campo 2), todas las formulaciones secadas por congelación y revestidas exhibieron patrones de bandas similares. Se pensó que las tres bandas estaban asociadas con HA como monómero (-75 kD) o trímero (-225 kD). Por lo tanto, con base en la intensidad de bandas y bandas comparadas (respecto a la vacuna de partida), se concluyó que el antígeno de la HA en las formulaciones que habían sido secadas por congelación y revestidas sobre las disposiciones de microproyecciones, conservó su antigenicidad.

BCA contra SRID Como es bien sabido en la técnica, SRID es la única prueba aprobada para determinar la potencia de la HA in vitro que es, en general, consistente con la inmunogenicidad. Sin embargo, consume tiempo (3 días). Para monitorear la potencia de la HA durante el procedimiento de pre-formulación y revestimiento en una forma oportuna, se puso a prueba la prueba de proteínas de BCA y se comparó con los resultados de la prueba de SRID, lo cual permitiría que se evaluara la estabilidad de la HA a corto plazo. Con relación ahora al cuadro X, se muestra un resumen de los resultados de BCA/SRID para las tres cepas monovalentes después de TFF, concentración, secado por congelación, reconstitución en el líquido de revestimiento trivalente y revestimiento. Los resultados de BCA fueron, en general, consistentes con los resultados de SRID, salvo en el caso de A/New Caledonia, en donde el material secado por congelación tuvo un valor de SRID mucho menor que el valor de BCA. Sin embargo, estos dos valores fueron mejor comparados en la formulación líquida trivalente reconstituida, sugiriendo que la inconsistencia anterior se debió, con toda probabilidad, a la preparación de la muestra o la variación de la prueba.

CUADRO X Suministro de la disposición de microprovecciones y aceptabilidad por la piel Se realizaron dieciséis estudios de suministro separados para evaluar la eficiencia de suministro y la aceptabilidad por la piel. Cada estudio se resume en el cuadro XI.

CUADRO XI Estudios de suministro Nos. 1 a 7 Se dirigieron estudios de suministro Nos. 1 a 7 hacia dos diseños de microproyecciones, designados en lo sucesivo como MF-1 y MF-2. Los resultados sugieren que el suministro por el diseño de microproyecciones MF-1 es altamente efectivo, suministrando 40 a 90% del revestimiento en la piel, a pesar de la formulación.

Estudios de suministro Nos. 8 a 15 Los estudios de suministro Nos. 8 a 15 se enfocaron en diseños de microproyecciones que ofrecerían eficiencia de suministro y aceptabilidad por la piel balanceadas. Puesto que la hemorragia es causada principalmente por una penetración muy profunda, que se correlaciona directamente con la longitud de la microproyección, los seis diseños que se eligieron para más evaluación (MF-3, MF-4 y MF-5), tuvieron cada uno una longitud de microproyección de 225 µm, y una densidad de disposición de 1316 microproyecciones/2 cm2. La investigación, que comprendió ocho diseños de disposiciones de microproyecciones, abarcó siete estudios de suministro para evaluar su desempeño de suministro de fármacos. Los diseños de las disposiciones se pusieron a prueba midiendo la cantidad de contenido de fluoresceína-vacuna presente in vivo en la piel de conejillos de Indias lampiños con carga de fármaco creciente. Con relación ahora a la figura 13A, se muestra el resumen del resultado del suministro para los ocho diseños de disposiciones de microproyecciones. Se encontró que el diseño de disposiciones MF-3 mantuvo su eficiencia de alto suministro, hasta 140 µg de revestimiento de fármaco, el punto de revestimiento en el cual la cantidad máxima de sólidos de fármacos puede suministrarse con los diseños comparados. La eficiencia de suministro de los diseños de disposiciones MF-1 , MF-6 y MF-7 comenzó a disminuir cerca de 100 µg de revestimiento de fármaco, haciendo que la cantidad máxima de suministro de fármaco con estos diseños fuese menor que la de MF-3. Para confirmar el desempeño de MF-3, se preparó una serie de disposiciones MF-3 para DS No. 15 con una amplia escala de cantidad revestida; de 50 a 170 µg de sólidos totales revestidos. Los resultados de suministro mostrados en la figura 13B, sugieren que el perfil de eficiencia de suministro para DS No. 15 casi se traslapa con el perfil de eficiencia para la disposición MF-3 observada en DS Nos. 8-14 (véase cuadro XI). Las cantidades suministradas siguen inicialmente la isoclina de 70%, hasta el punto de inflexión a 140 µg, punto en el cual la cantidad suministrada se nivela a pesar de una cantidad de revestimiento incrementada. Los residuos de revestimiento después de la aplicación de la disposición fueron reducidos para las cantidades revestidas más pequeñas, y saltaron hasta una cantidad de revestimiento de 140 µg, que es consistente con ei cambio abrupto en la cantidad de revestimiento suministrada. La aceptabilidad por la piel (microhemorragia) y características relacionadas con la penetración, tales como retención, son importantes para evaluar la seguridad y robustez del sistema. Se aplicaron de esta manera parches de microproyecciones a conejillos de indias lampiños (HGP) vivos (duplicados para cada sistema) y sometidos a eutanasia por 3 a 15 minutos, respectivamente. Tras la remoción del parche, los animales se evaluaron para microhemorragia/reacción de la piel (sólo animales vivos), la función de retención y la puntuación de penetración en el sitio de aplicación teñido con azul de metileno. Con respecto a la retención, los diseños de microproyecciones con características de retención (es decir, MF-3, MF-4, MF-5 y MF-7) exhibieron retención observable en la piel, la cual disminuyó con la cantidad de revestimiento creciente. No se observó hemorragia en ningún caso con alta cantidad de revestimiento (MF-3 con 160 µg de revestimiento y MF-1 con 138 µg de revestimiento). La escala de la cantidad de revestimiento se determinó por medio de la pureza del antígeno y la dosis por suministrar. Considerando una vacuna global de HA con 40% de pureza, la cantidad de revestimiento total incluyendo el excipiente, sería aproximadamente 150 µg por disposición de 2 cm2 para ia dosis de 45 µg de HA y 50 µg por disposición de 2 cm2 para la dosis de 15 µg de HA.

Estudio de suministro No. 16 El estudio de suministro No. 16 se dedicó a varios diseños de disposiciones de microproyecciones revestidos con una baja dosis de HA, aproximadamente 15 µg/disposición, es decir, -60-70 µg de revestimiento total por disposición. El estudio, que incluyó cuatro diseños (MF-3, MF-5, MF-6 y MF-7), demostró que es más efectivo a alta dosis. Los diseños de cuatro disposiciones fueron revestidos con una cantidad de revestimiento total de 60 a 70 µg con base en la misma formulación de A/Panamá/sacarosa usada en DS Nos. 13 y 14. Con relación ahora al cuadro XII, se muestra una comparación de las disposiciones no revestidas y revestidas en términos de puntuación de retención y tendencia de hemorragia. El desempeño de retención se evaluó con base en un sistema de puntuación de 1 a 5.

CUADRO XII Los resultados de retención sugieren, que (i) las disposiciones no revestidas sobrepasaron el rendimiento de las disposiciones revestidas, y (ii) la clasificación de desempeño siguió el orden de MF-6~MF-3>MF-5>MF-5. La misma tendencia se observó con la tendencia de la hemorragia. En general, el diseño MF-5 fue vigoroso en términos de retención y penetración, y pareció ofrecer mejor aceptabilidad por la piel a la dosis reducida.

Estudios de inmunogenicidad Se llevaron a cabo cuatro estudios de inmunogenicidad en conejillos de Indias lampiños (HGPs). El primer estudio estableció la cinética de respuesta de anticuerpos y la respuesta a la dosis de antígenos usando inyecciones intramusculares (IM) a las dosis de 1 , 5 y 50 µg de A/Panamá (H3N2). Este estudio demostró que una inmunización primaria con dosis de HA crecientes de 1 a 50 µg, resultó en títulos del anticuerpo incrementados. Tras la inmunización de refuerzo (realizada en la semana 4), se observó una respuesta a la dosis entre 1 a 5 µg de HA. Sin embargo, no se observó diferencia estadística alguna entre las dosis de 5 y 50 µg de HA. Se observaron títulos del anticuerpo máximos 2 a 3 semanas después de la inmunización de refuerzo (véase figura 14A). Se estableció una correlación entre los títulos totales de IgG específicos de HA (medidos por ELISA) contra actividad de inhibición de hemaglutinina (Hl) (véase figura 14B). Con base en estos datos, se usó subsiguientemente una dosis de 5 µg de HA para evaluar formulaciones para la potencia de la HA. Se llevó a cabo un segundo estudio de inmunización para evaluar la inmunogenicidad relativa de varias formulaciones de HA/Panamá (H3N2). Se evaluaron cuatro formulaciones que contenían HA/Panamá (H3N2): (1 ) 40-52 mg/mL de HA, Zwittergent 3-14 a 10% (2) 40-52 mg/mL de HA, Zwittergent 3-14 a 5%, pH 10 (3) 40-52 mg/mL de HA, Tritón X100 a 10%, pH 10 (4) 40-52 mg/mL de HA, Tritón X100 a 10%, pH 10 Se transfirió una alícuota de cada concentrado sobre la superficie de un disco de titanio, y se dejó que se secara (es decir, "revestido en seco"). Tanto los concentrados líquidos como los discos revestidos en seco, se pusieron a prueba en el estudio. Se inyectó un volumen de 0.1 mL (dosis de 5 µg) de cada preparación diluida por la vía IM en HGPs en el día 0 (primaria) y 28 (refuerzo). Se incluyó un grupo de control que consistió de una dosis equivalente de 5 µg (material de partida). El estudio demostró que todas las formulaciones fueron capaces de inducir respuestas de anticuerpos anti-HA, medidas por prueba de ELISA y Hl (véase figuras 15A y 15B). Sin embargo, hubo diferencias entre las varias formulaciones de HA. Las formulaciones que contenían Tritón X-100 a 10% (líquidas o revestidas en seco) o SDS a 10% (revestidas en seco), tuvieron inmunopotencia reducida. Todas las demás preparaciones de HA no parecieron ser estadísticamente significativas cuando se compararon con una dosis de inyección equivalente usando el material de partida. El tercer estudio de inmunización se llevó a cabo para demostrar que formulaciones de revestimiento monovalente A/Panamá (H3N2) que fueron revestidas en seco sobre disposiciones de microproyecciones, fueron capaces de inducir respuestas de anticuerpos primarias y secundarias específicas de HA. Se incluyeron grupos de control IM usando el material de partida de HA. Se usó un diseño de disposición de microproyección individual (MF-1 ). Se puso a prueba un total de 4 formulaciones de HA a dos dosis de revestimiento de HA dirigidas sobre disposiciones de microproyecciones (5 y 15 µg/disposición): HA, Zwittergent (10%), trehalosa (2.5%) HA, Tween-80 (2%), sacarosa (5%) HA, Pluronic F68 (2%), trehalosa (2.5%), manitol (2.5%) HA, sacarosa (5%) En conjunto, los resultados (títulos de HAI en suero) de este estudio demostraron que podrían generarse respuestas de anticuerpos primaria (día 28) y secundaria (día 49), usando sistemas Macroflux revestidos de HA (véase figuras 16A y 16B). Además, se generaron anticuerpos neutralizantes en suero específicos de HA en animales inmunizados con el parche. Algunas diferencias de la formulación pudieron observarse a la dosis de revestimiento de HA dirigida superior después de la inmunización de refuerzo. Los títulos de HAI medios más altos se generaron de HGPs inmunizados con la formulación de HA usando Zwittergent 3-14/trehalosa. El nivel del título del anticuerpo neutralizante en suero de este grupo, fue más similar al control del tratamiento de IM. El cuarto estudio evaluó la prueba de inmunogenicidad de formulaciones de influenza trivalentes revestidas en seco sobre disposiciones de microproyecciones de titanio en HGPs. El estudio consistió en evaluar dos formulaciones de revestimiento trivalentes, tres diseños de disposiciones de microproyecciones Macroflux y dos dosis de revestimiento de HA. La formulación de influenza trivalente consistió de dos cepas A (A/Panamá/2007/99 [H3N2] y A/New Caledonia/20/99 [H1 N1]), y una cepa B (B/Shangdong/7/97). Las cepas de HA se formularon a una relación de 1 :1 :1.

Las dos formulaciones de revestimiento, que contenían HA trivalente, se formularon con sacarosa (5%) o Tween-80 (2%) y sacarosa (5%). Los diseños de disposiciones de microproyeccíones fueron MF-1 , MF-3 y MF-5 (2 cm2 de diámetro). Las dos dosis de revestimiento de HA cargadas sobre los diseños de disposiciones de microproyecciones se definieron como "baja" (21-23 µg) y "alta" (33-45 µg). Los datos demuestran que los parches Macroflux trivalentes pueden inducir respuestas de anticuerpos anti-HA primarias (títulos de Hl) para cada cepa de HA (véase figura 18). Los niveles del título del anticuerpo generados de HGPs inmunizados con las dos formulaciones trivalentes (sacarosa y Tween-80/sacarosa) usando disposiciones Macroflux, fueron comparables a sus controles de inyección intramuscular respectivos. No se observó diferencia significativa, con respecto a las respuestas anti-HA, entre los varios diseños de disposiciones de microproyecciones o entre las formulaciones de sacarosa contra Tween-80/sacarosa. En algunos casos, dependiendo de la cepa de HA y el grupo de tratamiento se observó una respuesta a la dosis, pero no siempre fue el caso. En general, estos estudios de inmunogenicidad sugieren que cada una de las formulaciones expuestas en el cuadro V fueron inmunógenas, a pesar de cambios de formulación significativos a la vacuna de partida.

Estabilidad a corto plazo El procedimiento de pre-formulación discutido anteriormente somete un antígeno no sólo a congelación, sino también una serie de eventos de tensión, que incluyen tensión de esfuerzo cortante durante la diafiltración de membrana, y tensión que surge de la ¡nterfaz hielo/agua y deshidratación/rehidratación. Después de la reconstitución de la vacuna secada por congelación, la solución se sometió de esta manera a 10 ciclos de congelación/descongelación (congelada por nitrógeno líquido, y descongelada inmediatamente a temperatura ambiente) para evaluar los efectos, si los hay, sobre la estabilidad del antígeno. Como se determinó por medio de ELISA, la potencia de la HA antes y después de 10 ciclos de congelación/descongelación permaneció sin cambios, sugiriendo la preservación de la estabilidad del antígeno por la trehalosa o la sacarosa. Un paso del procedimiento incluso más lleno de tensiones que el secado por congelación, es la resolubilización por un agente tensioactivo potente, tal como SDS o Zwittergent a altas concentraciones, con agitación vigorosa (acción de remolino). Estos agentes tensioactivos son conocidos por desnaturalizar proteínas alterando la conformación física de la molécula nativa. Para los antígenos de la vacuna, la consecuencia de cambios de conformación significativos podría ser pérdida total de antigenicidad e inmunogenicidad. El efecto de la resolubilización en presencia de agentes tensioactivos fuertes, se evaluó en los siguientes estudios. Se realizó análisis Western blot/SDS-PAGE en la vacuna A/Panamá después de una serie de pasos de pre-formulación que incluyeron la vacuna secada por congelación reconstituida sin agente tensioactivo y con SDS (a 10%), Triton-X 100 (a 10%) o Zwittergent 3-14 (a 5 y 10%). Bajo condiciones no reductoras para los geles teñidos con azul de Coomassie (geles de SDS-PAGE a la izquierda), fue evidente que todas las bandas presentes en la vacuna de partida estuvieron también presentes en las muestras reconstituidas, no sugiriendo degradación detectable para ninguna de las formulaciones evaluadas. Puesto que el gel fue transferido a la membrana para análisis Western Blot, de nuevo, no se observaron diferencias entre las diferentes formulaciones y la vacuna de partida. Una serie de bandas, que reflejan la unión entre la proteína HA y los anticuerpos anti-HA, ocurrieron principalmente a altos pesos moleculares. Con base en las bandas comparadas y la intensidad de bandas (respecto a la vacuna de partida), se concluyó que la HA en las formulaciones que habían sido secadas por congelación y expuestas a altas concentraciones de agentes tensioactivos fuertes, mantuvo su antigenicidad. Bajo condiciones reductoras, todas las formulaciones muestran bandas similares a las de la vacuna de partida sobre geles de SDS-PAGE. Los patrones de bandas en los geles del Western blot se compararon igualmente también entre todas las formulaciones. Junto con el análisis por ELISA, la HA parece ser vigorosa y continúa siendo antigénica incluso después de la manipulación extensiva de la formulación, que incluye diafiltración, concentración, congelación, deshidratación y rehidratación con agente tensioactivo fuerte bajo acción de remolino intensiva.

Estabilidad a largo plazo Se investigaron dos tipos de estabilidad para seleccionar e identificar la formulación óptima: (i) la estabilidad física del revestimiento, y (ii) la estabilidad bioquímica del antígeno, los cuales necesitan mantenerse durante el almacenamiento para preservar la dosis objetivo suministrable.

Estabilidad física La estabilidad física del revestimiento incluye la preservación de la ubicación y morfología del revestimiento después de almacenamiento a una temperatura específica por un cierto período. Para facilitar el estudio, se expusieron cuatro formulaciones de revestimiento (Nos. 3, 5, 6 y 7) a alta temperatura (65°C) por hasta cuatro semanas. La morfología por SEM de las formulaciones 5 y 6 antes y después de almacenamiento a 65°C, indicó que no ocurrieron cambios tras el almacenamiento por cuatro semanas. El mismo resultado se observó para las formulaciones 3 y 7, sugiriendo que las cuatro formulaciones revestidas son físicamente vigorosas aún a dichas altas temperaturas.

Estabilidad bioquímica Con relación ai cuadro Xlll, existe una similitud en los parámetros usados para investigar la estabilidad bioquímica de los antígenos.

La investigación incluyó cuatro estudios, que dieron inicio con un estudio acelerado para la selección de las formulaciones Nos. 3, 5, 6 y 7 usando una cepa monovalente. Las formulaciones más estables se pusieron a prueba en un estudio de dilución del excipiente con las otras dos cepas en una serie de composiciones del excipiente. La composición preferida determinada a partir del estudio de dilución del excipiente, se puso a prueba entonces en una formulación trivalente revestida sobre disposiciones de microproyecciones empacadas en una bolsa de hoja delgada de metal como parte del estudio de estabilidad informal. Este estudio de estabilidad empacada final se llevó a cabo para investigar el efecto del contenido de humedad en el revestimiento, sobre la estabilidad del antígeno.

CUADRO Xlll Estudio de estabilidad acelerado Se revistieron cuatro formulaciones de A/Panamá (formulaciones Nos. 3, 5, 6 y 7) sobre disposiciones de microproyecciones. Cada disposición revestida se puso en un vial de escintilación de 20 mL con una tapa superior roscada. Cada vial se selló después de secado al vacío para remover la absorción de humedad después del manejo de la disposición. Todas las muestras se incubaron en un horno a 40°C por 1 , 2, 4 y 8 semanas. Se tomaron tres muestras (por triplicado) en cada punto de tiempo, y se analizaron para determinar la potencia de la HA por ELISA. Con relación ahora a la figura 18, se muestra el perfil de estabilidad de las cuatro formulaciones. Existe una clara tendencia para la formulación de Zwittergent (formulación No. 3), cuya potencia de HA pareció disminuir con el tiempo de incubación. Fue también evidente que la formulación de Tween/sacarosa pareció perder ia mayor parte de la potencia de la HA en el punto de tiempo final (semana 8). La estabilidad de la formulación de sacarosa sola fue la tercera mejor de las formulaciones, y la formulación de Pluronic/trehalosa/manitol la mejor en el mantenimiento de potencia. Tres de las formulaciones indicadas revestidas a dos dosis diferentes, se almacenaron entonces a temperatura ambiente (bajo vacío) por hasta 25 semanas. Se monitoreó por ELISA la potencia de la HA. Con relación al cuadro IV, la formulación de trehalosa/manitol/Pluronic (formulación No. 7) mostró una tendencia para disminuir la potencia. Las otras dos formulaciones parecieron mantener la potencia del antígeno, en comparación con la potencia en el tiempo 0. Para las formulaciones Nos. 5 y 7, la tendencia de ia estabilidad pareció ser diferente entre las muestras almacenadas a 40°C y a temperatura ambiente.

Dos formulaciones trivalentes, que comprendían sacarosa sola y sacarosa-Tween, fueron revestidas sobre disposiciones y almacenadas en bolsas de hoja delgada de metal purgadas con nitrógeno y selladas, por hasta 3 meses a 40°C y hasta 6 meses a 5°C y 25°C. La potencia para cada una de las tres cepas A/Panamá (A/P), A/New Caledonia (A/NC) y B/Shangdong (B/SD) se puso a prueba por análisis SRID. Los resultados de los estudios de estabilidad de la formulación de sacarosa sola y sacarosa-Tween, se dan en las figuras 19 y 20, respectivamente. Como se muestra en las figuras 19 y 20, las disposiciones revestidas mostraron estabilidad muy buena por hasta 6 meses de almacenamiento a 5°C y 25°C para las tres cepas en ambas formulaciones.

Estudio de dilución del excipiente Para determinar la composición óptima de excipiente para la formulación de sacarosa, la cepa B/Victoria (HA con 18% de pureza) se formuló con sacarosa a las relaciones de peso de HA: sacarosa = 1 :1 , 1 :2 y 1 :4. Las disposiciones revestidas se incubaron a 40°C por hasta 8 semanas. Las muestras se almacenaron a -80°C hasta el momento del análisis, y todas las muestras se reconstituyeron con 1 mL de agua y se analizaron por SRID sobre un gel individual, y por BCA en una placa de 96 cavidades individual para eliminar la variabilidad dentro de la prueba. Los perfiles de estabilidad se muestran en la figura 21.

Después de la disminución inicial observada durante las dos primeras semanas de almacenamiento, las formulaciones de HA: sacarosa = 1 :2 y 1 :4 parecieron ser estables a través de ocho semanas incluso a 40°C. Sin embargo, para la formulación de HA: sacarosa = 1 :1 , la tendencia decreciente continuó. Se piensa que este fenómeno es causado por la presencia de proteasa que no fue removida por completo durante la purificación, y la cual puede ser activada durante el presente procedimiento. Parece haber un efecto de estabilización con cantidades crecientes de sacarosa respecto a HA. El lote de BA/ictoria usado para este estudio tuvo una pureza de HA muy baja, aproximadamente 15% respecto a la proteína total presente, y no se anticipó que sea indicativo de material de partida global futuro (HA con >40% de pureza). Sin embargo, el efecto de estabilización del incremento del porcentaje en peso de sacarosa puede no observarse a un grado relativo equivalente con mayor material de partida de pureza de HA superior. Por ejemplo, 100 mg de material de partida de HA con 15% de pureza, requieren 15, 30 y 45 mg de sacarosa cuando se formula a 1 :1 , 1 :2 y 1:4 de HA: sacarosa. Esto resulta en relaciones de peso seco de 13, 23 y 37% de sacarosa, respectivamente. Sin embargo, 100 mg de material de partida de HA con 40% de pureza requerirían 40, 80 y 160 mg de sacarosa para formular a las mismas tres relaciones, resultando en relaciones de peso seco de 29, 44 y 54% de sacarosa. Como resultado, la formulación 1 :1 de alta pureza está ya aproximándose al contenido de sacarosa en peso seco de la formulación 1 :4 de baja pureza. A estos niveles, el efecto de estabilización de la sacarosa ha alcanzado más probablemente una meseta, y cualquier otro incremento del contenido de sacarosa tendría poco efecto o ningún efecto sobre la estabilidad del producto. Por esta razón y para simplificar aún más el procesamiento global, se estableció una relación fija de sacarosa a 1 :0% para a solución pre-liofilizada. Puesto que el polvo liofilizado es reconstituido típicamente hasta 1/5 del volumen pre-liofilizado original, esto resulta en una concentración de la solución de revestimiento de sacarosa a 5%.

Resumen Como lo apreciarán los expertos en la técnica, en virtud del procedimiento de pre-formulación único, una dosis completa de la vacuna contra la influenza para humanos, es decir, 45 µg de hemaglutinina, puede suministrarse transdérmicamente por medio de una disposición de microproyecciones revestidas, en donde por lo menos 70% de la vacuna contra la influenza se suministra en la piel. El antígeno continúa siendo también inmunógeno en la piel para inducir fuertes respuestas inmunes seroprotectoras y de anticuerpos. Además, la formulación de vacuna revestida en seco está sustancialmente libre de conservadores, y puede mantener una estabilidad a temperatura ambiente por cuando menos seis meses. Sin que se aparte del espíritu y alcance de esta invención, el experto en la técnica puede hacer varios cambios y modificaciones a la invención para adaptarla a varios usos y condiciones. Como tales, estos cambios y modificaciones son propiamente, equitativamente y destinados para estar dentro de la gama total de equivalencia de las siguientes reivindicaciones.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un sistema para suministrar transdérmicamente un agente inmunológicamente activo, que comprende un miembro de microproyección que tiene una pluralidad de microproyecciones que perforan el estrato córneo que tiene un revestimiento biocompatible dispuesto sobre dichas microproyecciones, en donde dicho revestimiento contiene dicho agente inmunológicamente activo.

2.- El sistema de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho revestimiento biocompatible se forma de una formulación de dicho agente inmunológicamente activo.

3.- El sistema de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho agente inmunológicamente activo comprende una vacuna contra la influenza.

4.- El sistema de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho agente inmunológicamente activo se selecciona del grupo que consiste de virus, bacterias, vacunas basadas en proteínas, vacunas basadas en polisacáridos y vacunas basadas en ácidos nucleicos.

5.- El sistema de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho agente inmunológicamente activo se selecciona del grupo que consiste de virus, virus debilitados, virus destruidos, bacterias, bacterias debilitadas, bacterias destruidas, vacunas basadas en proteínas, vacunas basadas en polisacáridos, vacunas basadas en ácidos nucleicos, proteínas, conjugados de polisacáridos, oligosacáridos, lipoproteínas, Bordetella pertussis (vacuna accince - acelular de PT recombinante), Clostridium tetani (purificada, recombinante), Corynebacterium diphtheriae (purificada, recombinante), citomegalovirus (subunidad de glucoproteína), estreptococo del grupo A (subunidad de glucoproteína, polisacárido del grupo A de glucoconjugado con toxoide tetánico, péptidos/proteína M enlazados a portadores de subunidades de toxina, proteína M, epítopes específicos de tipo multivalente, cisteína proteasa, peptidasa C5a), virus de hepatitis B (Pre-S1 , Pre-S2, S recombinantes, proteína de núcleo recombinante), virus de hepatitis C (epítopes y proteínas de superficie expresados - recombinantes), virus del papiloma humano (proteína de la cápside, proteína recombinante de TA-GN L2 y E7 [de HPV-6], VLP L1 recombinante MEDI-501 de HPV-11 , BLP L1 recombinante cuadrivalente [de HPV-6], HPV-11 , HPV-16 y HPV-18, LAMP-E7 [de HPV-16]), Legionella pneumophila (proteína de superficie bacteriana purificada), Neisseria meningitidis (glucoconjugado con toxoide tetánico), Pseudomonas aeruginosa (péptidos sintéticos), virus de la rubéola (péptido sintético), Streptococcus pneumoniae (glucoconjugado [1 , 4, 5, 6B, 9N, 14, 18C, 19V, 23F] conjugado con OMP de meningococo B, glucoconjugado [4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F] conjugado con CRM197, glucoconjugado [1 , 4, 5, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F] conjugado con CRM1970, Treponema pallidum (lipoproteínas de superficie), virus varicela-zoster (subunidad, glucoproteínas), Vibrio cholerae (lipopolisacárido conjugado), citomegalovirus, virus de hepatitis B, virus de hepatitis C, virus del papiloma humano, virus de la rubéola, virus varicela-zoster, Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, estreptococos del grupo A, Legionella pneumophila, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Vibrio cholerae, vacuna contra la influenza, vacuna contra la enfermedad de Lyme, vacuna antirrábica, vacuna antisarampionosa, vacuna antiparotidítica, vacuna contra la varicela, vacuna antivariólica, vacuna contra la hepatitis, vacuna antipertussis, vacuna contra la difteria, ácidos nucleicos, ácidos nucleicos de cadena sencilla, ácidos nucleicos de doble cadena, ADN de plásmido superenrollado, ADN de plásmido lineal, cósmicos, cromosomas artificiales bacterianos (BACs), cromosomas artificiales de levadura (YACs), cromosomas artificiales de mamífero, moléculas de ARN y ARN mensajero.

6.- El sistema de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha formulación comprende además un adyuvante que aumenta la respuesta inmune seleccionado del grupo que consiste de gel de fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, glucano de algas, ß-glucano, subunidad de toxina B del cólera, CRL1005, polímero de bloque de ABA con valores medios de x = 8 e y = 205, gamma inulina, ß-D lineal (no ramificada) (2->1 ) polifructofuranoxil-a-D-glucosa, adyuvante de Gerbu, N-acetilglucosamina-(ß 1-4)-N-acetilmuramil-L-alanil-D-glutamina (GMDP), cloruro de dimetil dioctadecilamonio (DDA), complejo de sal de L-prolina y zinc (Zn-Pro-8), Imiquimod (1-(2-metipropil)-1 H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina, ImmTher™, dipalmitato de N-acetilglucoaminii-N-acetilmuramil-L-Ala-D-isoGlu-L-Ala-glicerol, liposomas de MTP-PE, C59H1o8N6O19PNa-3H2O (MTP), Murametide, Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCH3, Pleuran, ß-glucano, QS-21 , S-28463, 4-amino-a, a-dimetil-1 H-imidazo[4,5-c]quinolin-1 -etanol, salvo péptido, VQGEESNDK • HCl (péptido 163-171 de IL-1ß), treonil-MDP (Termurtide™), N-acetil muramil-L-treonil-D-isoglutamina, interleucina 18 (IL-18), IL-2, IL-12, IL-15, IL-4, IL-10, oligonucleótidos de ADN, oligonucleótidos que contiene CpG, interferón gamma y proteínas de señalización reguladoras de NF kappa B.

7.- El sistema de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho miembro de microproyección tiene una densidad de microproyecciones de por lo menos aproximadamente 100 microproyecciones/cm2.

8.- El sistema de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque dicho miembro de microproyección tiene una densidad de microproyecciones en la escala de aproximadamente 200-3000 microproyecciones/cm2.

9.- El sistema de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque cada una de dichas microproyecciones tiene una longitud en la escala de aproximadamente 50 a 145 mieras.

10.- El sistema de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque cada una de dichas microproyecciones tiene una longitud en la escala de aproximadamente 70 a 140 mieras.

11.- El sistema de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho revestimiento biocompatible tiene un espesor en la escala de aproximadamente 2 a 50 mieras.

12.- El sistema de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicha formulación comprende una formulación acuosa.

13.- El sistema de conformidad con ia reivindicación 2, caracterizado además porque dicha formulación de revestimiento incluye un agente tensioactivo.

14.- El sistema de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque dicho agente tensioactivo se selecciona del grupo que consiste de lauroanfoacetato de sodio, dodecil sulfato de sodio (SDS), cloruro de cetilpiridinio (CPC), cloruro de dodeciltrimetil amonio (TMAC), cloruro de benzalconio, polisorbatos, tales como Tween 20 y Tween 80, derivados de sorbitán, laurato de sorbitán, alcoholes alcoxilados y laureth-4.

15.- El sistema de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicha formulación de revestimiento incluye un polímero anfifílico.

16.- El sistema de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque dicho polímero anfifílico se selecciona del grupo que consiste de derivados de celulosa, hidroxietilcelulosa (HEC), hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), hidroxipropilcelulosa (HPC), metilcelulosa (MC), hidroxietilmetilcelulosa (HEMC), etilhidroxietilcelulosa (EHEC) y pluronics.

17.- El sistema de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicha formulación de revestimiento incluye un polímero hidrofílico.

18.- El sistema de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque dicho polímero hidrofílico se selecciona del grupo que consiste de alcohol poli(vinílico), óxido de poli(etileno), metacrilato de poli(2-hidroxietilo), poli(n-vinilpirrolidona), polietilenglicol, y mezclas de los mismos.

19.- El sistema de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicha formulación de revestimiento incluye un vehículo biocompatible.

20.- El sistema de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque dicho polímero biocompatible se selecciona del grupo que consiste de albúmina humana, albúmina humana biodiseñada, ácido poliglutámico, ácido poliaspártico, polihistidina, polisulfato de pentosán, poliaminoácidos, sacarosa, trehalosa, melezitosa, rafinosa y estaquiosa.

21.- El sistema de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicha formulación de revestimiento incluye un agente estabilizador seleccionado del grupo que consiste de un azúcar no reductor, un polisacárido, un azúcar reductor y un inhibidor de desoxirribonucleasa.

22.- El sistema de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicha formulación de revestimiento incluye un vasoconstrictor.

23.- El sistema de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque dicho vasoconstrictor se selecciona del grupo que consiste de epinefrina, nafazolina, tetrahidrozolina, indanazolina, metizolina, tramazolina, timazolina, oximetazolina, xilometazolina, amidefrina, cafaminol, ciclopentamina, desoxiepinefrina, epinefrina, felipresina, indanazolina, metizolina, midodrina, nafazolina, nordefrin, octodrina, ornipresina, oximetazolina, fenilefrina, feniletanolamina, fenilpropanolamina, propilhexedrina, pseudoefedrina, tetrahidrozolina, tramazolina, tuaminoheptano, timazolina, vasopresina y xilometazolina.

24.- El sistema de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicha formulación de revestimiento incluye un modulador de permeabilidad de la vía.

25.- El sistema de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque dicho modulador de permeabilidad de la vía se selecciona del grupo que consiste de agentes osmóticos, cloruro de sodio, compuestos zwitteriónicos, aminoácidos, agentes antiinflamatorios, sal disódica de fosfato 21 de betametasona, fosfato disódico de acetónido 21 de triamcinolona, clorhidrato de hidrocortamato, sal disódica de fosfato 21 de hidrocortisona, sal disódica de fosfato 21 de metilprednisolona, sal sódica de succinato 21 de metilprednisolona, fosfato disódico de parametasona, sal sódica de succinato 21 de prednisolona, anticoagulantes, ácido cítrico, sales de citrato, citrato de sodio, sulfato sódico de dextrán y EDTA.

26.- El sistema de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicha formulación de revestimiento tiene una viscosidad menor de aproximadamente 0.5 pascales/seg y mayor de aproximadamente 0.03 pascales/seg.

27.- Un método para suministrar transdérmicamente un agente inmunológicamente activo a un sujeto, el método comprendiendo los pasos de: proveer un miembro de microproyección que tenga una pluralidad de microproyecciones; proveer una vacuna global; someter dicha vacuna global a filtración de flujo tangencial para proveer una solución de vacuna; añadir por lo menos un excipiente a dicha solución de vacuna; secar por congelación dicha solución de vacuna para formar un producto de vacuna; reconstituir dicho producto de vacuna con una primera solución para formar una formulación de revestimiento de vacuna; revestir dicho miembro de microproyección con dicha formulación de revestimiento de vacuna; y aplicar dicho miembro de microproyección revestido a la piel de dicho sujeto.

28.- El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque el paso de añadir por lo menos un excipiente a dicha solución de vacuna comprende añadir un excipiente seleccionado del grupo que consiste de sacarosa, trehalosa y manitol.

29.- El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque el paso de proveer una vacuna global comprende proveer una vacuna contra la influenza.

30.- El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque dicha vacuna contra la influenza comprende hemaglutinina.

31.- El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque comprende el paso de suministrar aproximadamente 45 µg de hemaglutinina.

32.- El método de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque el paso de suministrar hemaglutinina comprende suministrar por lo menos aproximadamente 70% de dicha hemaglutinina a una capa abundante de APC de la epidermis de dicho sujeto.

33.- Un método para la formulación de una solución de vacuna, que comprende los pasos de: proveer una vacuna global; someter dicha vacuna global a filtración de flujo tangencial para proveer una solución de vacuna; añadir por lo menos un excipiente a dicha solución de vacuna; y secar por congelación dicha solución de vacuna para formar un producto de vacuna.

34.- El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque dicho producto de vacuna exhibe una concentración que está por lo menos aproximadamente 500 veces más concentrada que dicha vacuna global.

35.- El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque dicho producto de vacuna mantiene estabilidad a temperatura ambiente por cuando menos aproximadamente seis meses.

36.- El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque el paso de proveer una vacuna global comprende proveer una vacuna contra la influenza.

37.- El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque dicha vacuna contra la influenza comprende hemaglutinina.