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MXPA06010782A - Ligador de profarmaco. - Google Patents

Ligador de profarmaco.

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Publication number
MXPA06010782A
MXPA06010782A MXPA06010782A MXPA06010782A MXPA06010782A MX PA06010782 A MXPA06010782 A MX PA06010782A MX PA06010782 A MXPA06010782 A MX PA06010782A MX PA06010782 A MXPA06010782 A MX PA06010782A MX PA06010782 A MXPA06010782 A MX PA06010782A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
substituted
unsubstituted
group
prodrug
branched
Prior art date
Application number
MXPA06010782A
Other languages
English (en)
Inventor
Ulrich Hersel
Harald Rau
Thomas Wegge
Dirk Vetter
Robert Schnepf
Original Assignee
Complex Biosystems Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from EP04075892A external-priority patent/EP1579873A1/en
Priority claimed from GB0415043A external-priority patent/GB0415043D0/en
Priority claimed from EP04019293A external-priority patent/EP1625855A1/en
Application filed by Complex Biosystems Gmbh filed Critical Complex Biosystems Gmbh
Publication of MXPA06010782A publication Critical patent/MXPA06010782A/es

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Abstract

Se describe un profarmaco enlazado a portador, de cascada que comprende una porcion biologicamente activa y un grupo de enmascaramiento que tiene al menos un nucleofilo y que es distinto de un portador. En una modalidad preferida de la invencion, el profarmaco tiene la siguiente estructura (ver formula).

Description

IGADOR DE PROFARMACO Campo de la Invención La presente invención se refiere a profármacos poliméricos que tienen enlaces temporales a grupos amino de entidades biológicamente activas tal como péptidos, proteínas, productos naturales o compuestos químicos sintéticos.
Antecedentes de la Invención Típicamente, los polímeros se usan ya sea de una manera no covalente, con el fármaco formulado de forma físico-química, en una mezcla de solvente-polímero, o por unión covalente permanente de un reactivo polimérico a uno de los grupos funcionales del fármaco. Se ha aplicado encapsulación no covalente de fármaco para depositar formulaciones para perfiles de liberación de acción prolongada. Típicamente, el fármaco se mezcla con el material polimérico y se procesa de una manera tal que el fármaco se llega a distribuir a todo lo largo del volumen del material polimérico. Estos agregados del polímero-proteína se pueden formar como micropartículas que se administran como una suspensión inyectable o se formulan como geles que se administran en una inyección individual de bolo. La liberación del fármaco se presenta cuando el REF:175801 polímero se hincha o cuando la degradación del polímero permite la difusión del fármaco hacia el exterior. Estos procesos de degradación pueden ser autohidrolíticos o catalizados por enzima. Un ejemplo de un fármaco comercializado basado en administración de bolo de un gel de fármaco-polímero es el Depósito Lupron. Un ejemplo de un fármaco comercializado basado en micropartículas suspendidas es el Depósito Nutropin. Una desventaja del planteamiento no covalente es que a fin de impedir la liberación descontrolada, tipo ráfaga del fármaco, la encapsulación tiene que ser altamente eficiente al crear un ambiente de una forma altamente esférica, abarrotada. La restricción de la difusión de la molécula de fármaco, soluble en agua, no unida, requiere fuertes contactos de van der Waals, frecuentemente mediados a través de porciones hidrófobas . Muchos productos terapéuticos sensibles por conformación tal como proteínas o péptidos se vuelven disfuncionales durante el procesó de encapsulación y/o durante el almacenamiento subsiguiente. Además, estos compuestos de fármaco que contiene amino sufren fácilmente reacciones secundarias con productos de degradación de polímeros (D.H. Lee et al., J. Contr. Reí., 2003, 92 , 291-299). Adicionalmente, la dependencia del mecanismo de liberación en la biodegradación puede provocar variabilidad entre pacientes.
De manera alternativa, se pueden conjugar fármacos a polímeros a través de enlaces covalentes permanentes.
Este planteamiento se aplica a varias clases de moléculas, de las llamadas moléculas pequeñas, a través de productos naturales hasta proteínas más grandes . Muchos agentes medicinales de molécula pequeña, tal como los alcaloides y agentes anti-tumor, muestran baja solubilidad en fluidos acuosos. Una manera para solubilizar estos compuestos de molécula pequeña es conjugarlos a polímeros hidrófilos. Una variedad de polímeros solubles en agua, tal como albúmina de suero humano, dextranos, lectinas, poli (etilenglicol) (PEG), poli (estireno-anhídrido co-maleico) , poli (N-hidroxipropilmetacrilamida) , poli (éter divinílico-co-anhídrido maleico) , ácido hialurónico se han descrito para este propósito (R. Duncan, Nature Rev. Drug Disc, 2003, 2, 347-360). Un reto principal en la terapia de cáncer es dirigir de forma selectiva los agentes citotóxicos a células tumorales . Un método promisorio para acumular agentes anticáncer de molécula pequeña en tejido tumoral y disminuir los efectos secundarios indeseables de estos agentes es la unión de la citotoxina a un portador macromolecular. La dirección pasiva de los conjugados poliméricos de fármaco hacia tumores se basa en el llamado efecto de retención y permeabilidad mejorada (EPR) como se describe por Matsumura, Y., y Maeda, H. , en Cáncer Res., 1986, vol 6, pp 6387-6392. Como resultado, varios conjugados de polímero-fármaco han entrado en ensayo clínico como agentes anticáncer. Se ha estudiado de forma extensiva desde finales de 1970 la modificación covalente de moléculas biológicas con poli (etilenglicol) . Las llamadas proteínas PEGiladas han mostrado eficiencia terapéutica mejorada al incrementar la solubilidad, reducir la inmunogenicidad, e incrementar la vida media en circulación in vivo debido a depuración renal reducida y proteólisis por enzimas (ver, por ejemplo, Caliceti P., Veronese F. M. , Adv. Drug Deliv. Rev. 2003, 55, 1261-1277).. Sin embargo, muchos agentes medicinales tal como INFalfa2, saquinavir o somatostatina son inactivos o muestran actividad biológica disminuida cuando un polímero se conjuga covalentemente a la molécula de fármaco (T.
Peleg-Shulman et al., J. Med. Chem., 2004, 47, 4897-4904). A fin de evitar los inconvenientes impuestos ya sea por las mezclas no covalentes de polímero o por la unión covalente permanente, se puede preferir emplear un planteamiento de profármaco para conjugación química del fármaco al portador polimérico. Estos profármacos poliméricos, las porciones biológicamente activas se enlazan típicamente a la porción del portador polimérico por un enlace temporal formado entre la porción del portador y un grupo hidroxi, amino o carboxi de la molécula del fármaco (tal como se muestra en la Figura 1) . Los profármacos son agentes terapéuticos que casi son inactivos per se pero se transforman de forma predecible en metabolitos activos (ver B. Testa, J. M. : Mayer in Hydrolysis in Drug and Prodrug Metabolism, Wiley-VCH, 2003, página 4) . El planteamiento de profármaco de portador se puede aplicar de una manera tal que el agente medicinal se libere in vivo a partir del polímero a fin de recuperar su actividad biológica. La actividad biológica reducida del profármaco en comparación al fármaco liberado es de ventaja si se desea una liberación lenta o controlada del fármaco. En este caso, se puede administrar una cantidad relativamente grande del profármaco sin efectos secundarios concomitantes y sin el riesgo de dosis excesiva. La liberación del fármaco se presenta durante el tiempo, reduciendo de este modo la necesidad de administración repetida y frecuente del fármaco . La activación del profármaco puede ocurrir por escisión enzimática o no enzimática del enlace temporal entre el portador y la molécula de profármaco, o una combinación secuencial de ambas, es decir, un paso enzimático seguido por un rearreglo no enzimático. En un ambiente in vitro libre de enzimas tal como una solución amortiguadora acuosa, un enlace temporal tal como un éster o amida puede sufrir hidrólisis, pero la velocidad correspondiente de hidrólisis puede ser demasiado lenta y no terapéuticamente útil. En un ambiente in vivo, típicamente están presentes esterasas o amidasas y pueden provocar aceleración catalítica significativa de la cinética de la hidrólisis de dos veces hasta varias órdenes de magnitud (ver, por ejemplo, R. B. Greenwald et al. J. Med. Chem. 1999, 42 (18), 3857-3867).
Definiciones basadas en IUPAC (como se da de acuerdo con http ://www. chem. qmul . ac .uk/iupac/medchem/ (se tuvo acceso el 8 de marzo de 2004) .
Profarmaco Un profármaco es cualquier compuesto que sufre biotransformación antes que exhiba sus efectos f rmacológicos . De esta manera los profármacos se pueden ver como fármacos que contienen grupos protectores no tóxicos especializados, usados de una manera momentánea para alterar o eliminar las propiedades indeseables de la molécula de origen.
Profármaco enlazado a portador (Profármaco de portador) Un profármaco enlazado a portador es un profármaco que contiene un enlace temporal de una sustancia activa dada con un grupo portador momentáneo que produce propiedades físico-químicas o farmacocinéticas mejoradas y que se puede remover fácilmente in vivo, usualmente por una escisión hidrolítica. Esto se muestra gráficamente en la Figura 1.
Profármaco en cascada • Un profármaco en cascada es un profármaco de portador para el cual la escisión del grupo portador llega a ser efectiva sólo después de desenmascarar un grupo de activación.
Profármaco en cascada polimérico Un profármaco en cascada polimérico es un profármaco de portador que contiene un enlace temporal de una sustancia activa dada con un grupo portador polimérico momentáneo para el cual la escisión del portador llega a ser efectiva sólo después de desenmascarar un grupo de activación.
Profármaco bioprecursor Un profármaco bioprecursor es un profármaco que no implica el enlace a un grupo portador, pero resulta de una modificación molecular del principio activo mismo. Esta modificación genera un nuevo compuesto, capaz de ser transformado de forma metabólica o química, el compuesto resultante que es el principio activo.
Biotransformación La bíotransformacíón es la conversión química de sustancias por organismos vivos o preparaciones enzimáticas. Los profármacos caen en dos clases, polisacárido bioprecursores y enlazados a portador. Los bioprecursores no contienen- un grupo portador y se activan por la creación metabólica de un grupo funcional. En los profármacos enlazados a portador, la sustancia activa se enlaza a una porción portadora por un enlace temporal . Esta invención se refiere como profármacos macromoleculares ' o enlazados a portador, poliméricos, donde el portador mismo es una macromolécula tal como una proteína portadora o polisacárido o polietilenglicol. De manera específica, la invención se refiere a profármacos enlazados a portador polimérico para los cuales esta escisión entre el polímero y profármaco prosiguen en dos pasos de acuerdo a un mecanismo de cascada. La escisión de un profármaco de portador genera una entidad molecular (fármaco) de bioactividad incrementada y al menos un producto secundario, el portador. Este producto secundario puede ser biológicamente inerte (por ejemplo, PEG) o puede tener propiedades de dirección (por ejemplo, anticuerpos) . Después de la escisión, la entidad bioactiva revelará al menos un grupo funcional protegido de este modo y anteriormente conjugado, y la presencia de este grupo contribuye típicamente a la bioactividad del fármaco. A fin de implementar una estrategia de profármaco, al menos un cierto grupo funcional en la molécula de fármaco se emplea para la unión del polímero portador. Los grupos funcionales preferidos son grupos hidroxilo o amino. En consecuencia, tanto la química de unión como las condiciones de hidrólisis varían en su mayor parte entre estas dos funcionalidades. En un mecanismo simple de un paso, el enlace temporal del profármaco se caracteriza por una labilidad intrínseca o dependencia de enzima. La susceptibilidad de este enlace a hidrólisis en un ambiente acuoso con o sin catálisis enzimática controla la cinética de escisión entre el portador polimérico y el fármaco. Se describen numerosos profármacos macromoleculares en la literatura donde el enlace temporal es un enlace lábil de éster. En estos casos, el grupo funcional proporcionado por la entidad bioactiva es ya sea un grupo hidroxilo o un ácido carboxílico (por ejemplo Y. Luo, MR Ziebell, GD Prestwich, "A Hyaluronic Acid - Taxol Antitumor Bioconjugate Targeted to Cáncer Cells", Biomacromolecules 2000, 1, 208-218, J Cheng et al, Synthesis of Linear, beta-Cyclodextrin Based Polymers and Their Camptothecin Conjugates, Bioconjugate Chem. 2003, 14, 1007-1017, R. Bhatt et al, Synthesis and in Vivo Antitumor Activity of Poly (L-glutamic acid) Conjugates of 20 (S) -Campthothecin, J. Med. Chem. 2003, 46, 190-193; R.B. Greenwald, A. Pendri, C.D. Conover, H. Zhao, Y.H. Choe, A. Martínez, K. Shum, S. Guan, J. Med. Chem., 1999, 42, 3657-3667; B. Testa, J. M. : Mayer in Hydrolysis in Drug and Produg Metabolism, Wiley-VCH, 2003, Capítulo 8) . Especialmente para biomacromoléculas terapéuticas pero también para ciertos fármacos de molécula pequeña, puede ser deseable enlazar el portador macromolecular a grupos amino de la entidad bioactíva (es decir, N-término o grupos amino de lisina de las proteínas) . Éste será el caso si el enmascaramiento de la bioactividad del fármaco requiere conjugación de un cierto grupo amino de la entidad bioquímica, por ejemplo un grupo amíno localizado en un centro activo o una región o epítopo comprendido en la unión al receptor. También, durante la preparación del profármaco, los grupos amino se pueden dirigir de forma más quimioselectiva y servir como una mejor agarradera para conjugar el portador y el fármaco debido a su mayor nucleofilicidad en comparación a grupos hidroxílicos o fenólicos . Esto es especialmente cierto para proteínas que pueden contener una gran variedad de diferentes funcionalidades reactivas, donde las reacciones de conjugación no selectivas conducen a mezclas de productos indeseados que requieren caracterización extensiva, o purificación, y pueden disminuir el rendimiento de la reacción y la eficiencia terapéutica del producto. Los enlaces de amida así como los carbamatos alifáticos son mucho más estables hacia la hidrólisis que los enlaces de éster, y la velocidad de escisión será demasiado lenta para utilidad terapéutica en un profármaco enlazado a portador. Por lo tanto, es ventajoso adicionar componentes químicos estructurales tal como grupos vecinos a fin de ejercer control sobre la capacidad de escisión del enlace de amida del profármaco. Estas estructuras químicas que controlan la escisión, adicionales, que no se proporcionan por la entidad del portador ni por el profármaco, se llaman ligador. Los ligadores de profármaco pueden tener un fuerte efecto en la velocidad de hidrólisis de un enlace temporal dado. La variación de la naturaleza química de estos ligadores permite manejar a un mayor grado las propiedades de ligador. Por ejemplo, los ligadores de profármaco se pueden diseñar para selectividad de enzimas. El prerrequisito para la dependencia enzimática es que la estructura de ligador exhiba un motivo estructural que se reconoce como un sustrato por una enzima endógena correspondiente (Figura 2) . La aceleración catalizada por enzimas de la escisión del profármaco es una característica deseable para aplicaciones de dirección al órgano o celular. La liberación dirigida de la entidad bioactiva se efectúa, si es una enzima que escinde de forma selectiva el enlace, está específicamente presente en el órgano o tipo celular elegido para tratamiento. Una propiedad típica de un enlace temporal dependiente de enzima es su estabilidad con respecto a la hidrólisis . El enlace temporal por sí mismo no sufrirá autohidrólisis a una velocidad que libera el fármaco a un grado tal que se puede inducir un efecto terapéutico en un régimen normal de dosificación. Sólo es en la presencia de la enzima, que el ataque de la enzima en el enlace provoca una aceleración significativa de la escisión y una mejora concomitante de la concentración del fármaco libre. Se han publicado varios ejemplos para la activación de profármaco de moléculas biológicamente activas, que contienen amina, por enzimas específicas para liberación dirigida. En estos casos, la escisión se presenta en un proceso de un paso que se cataliza por la enzima. G. Cavallaro et al., Bioconjugate Chem. 2001, 12, 143-151 describe la liberación enzimática de un agente antitumoral por el plásmido de proteasa. Se acopla citarabina mediante la secuencia tripeptídica D-Val-Leu-Lys al polímero alfa, beta-poli (N-hidroxietil) -DL-aspartamida (PHEA) . La liberación enzimática de citarabina se efectúa por el plásmido de proteasa a una concentración que es relativamente alta en varias clases de masas tumorales . Se han descrito ejemplos adicionales de profármacos poliméricos antitumorales activados por enzimas específicas tipo beta-lactamasa (R. Satchi-Fainaro et al., Bioconjugate Chem. 2003, 14, 797-804) y cisteína-proteasas tipo catepsina B (R. Duncan et al. J. Contr. Reléase 2001, 74, 135-146) . Wiwattanapatapee et al. (2003) resume un profármaco dendrímero para distribución colónica de ácido 5- amino salicílico. La molécula de fármaco se conjuga por un enlace azo para "generación 3" PAMAM-dendrímero . Se libera ácido 5-aminosalicílico en el- colon por una enzima bacteriana llamada azo-reductasa (W. R. Wiwattanapatapee, L. Lomlim, K. Saramunee, J. Controlled Reléase, 2003, 88: 1-9) . A.J. Garman et al. (A.J. Garman, S.B. Kalindjan, FEBS Lett. 1987, 223 (2), 361-365 1987) usan PEG5000-anhídrido maleico para la modificación reversible de grupos amino en activador de plasminógeno tipo tejido y urocinasa. La regeneración de enzima funcional del conjugado de PEG-uPA en la incubación en amortiguador de pH 7.4 por escisión del enlace de ácido maleámico sigue una cinética de primer orden con una vida media de 6.1 h. La escisión de profármaco no se investigó en la presencia de enzimas, y se puede esperar, como se explica anteriormente, que las proteasas presenten en el ambiente in vivo de forma- contribuirán de forma significativa la escisión del enlace temporal de amida. Una desventaja adicional de enlace es la carencia de estabilidad del conjugado a valores menores de pH. Esto limita la aplicabilidad del ligador a agentes activos que son estables a valores de pH básico, puesto que la purificación del conjugado de agente activo-polímero tiene que ser realizada bajo condiciones básicas para impedir la escisión prematura del profármaco. Los mecanismos de cascada han probado ser particularmente útiles en la liberación controlada de fármacos que contienen funcionalidades de grupos amino debido a que se pueden optimizar las características de escisión del ligador con mayor flexibilidad que en profármacos simples de un paso. La escisión en cascada se permite por los compuestos ligadores que se componen de una combinación estructural de un grupo de enmascaramiento y un grupo de activación. El grupo de enmascaramiento se une al grupo de activación por medio de un primer enlace temporal tal como un éster o un carbamato. El grupo de activación se une a un grupo amino de la molécula de fármaco a través de un segundo enlace temporal, por ejemplo un carbamato. La estabilidad, o susceptibilidad a hidrólisis del segundo enlace temporal es dependiente de la presencia o ausencia del grupo de enmascaramiento. En la presencia del grupo de' enmascaramiento, el segundo enlace temporal es altamente estable y es improbable que libere el fármaco con cinética terapéuticamente útil . En la ausencia del grupo de enmascaramiento, ese enlace llega a ser altamente lábil, provocando escisión rápida y liberación del fármaco. La escisión del primer enlace temporal es el paso limitante de la velocidad del mecanismo de cascada. Este primer paso puede inducir un rearreglo molecular del grupo de activación tal como una 1, 6-eliminación. El rearreglo vuelve al segundo enlace temporal mucho más lábil - de modo que se induce su escisión. De manera ideal, la velocidad de escisión del primer enlace temporal es idéntica a la velocidad de liberación deseada para la molécula de fármaco en un escenario terapéutico dado. Adicionalmente, es deseable que la escisión del segundo enlace temporal sea instantánea después que se ha inducido su labilidad por la escisión del primer enlace temporal . Existe una variedad de ejemplos para profármacos de portador de cascada donde la funcionalidad del grupo de enmascaramiento se realiza por el polímero portador mismo como se muestra esquemáticamente en la Figura 3. En los sistemas analizados más adelante, el grupo de enmascaramiento no es sólo parte del portador, sino también se ha manejado para dependencia de enzimas (Figura 4) . Únicamente en la presencia de una enzima correspondiente es la velocidad de escisión del primer enlace temporal suficientemente acelerado para uso terapéutico. R.B. Greenwald, A.' Pendri, C.D. Conover, H. Zhao, Y.H. Choe, A. Martínez, K. Shu , S. Guan, J. Med. Chem., 1999, 42, 3657-3667 & solicitud de patente PCT WO-A-99/30727 describen una metodología para sinterizar profármacos de poli (etilenglicol) de compuestos de molécula pequeña que contienen amino en base a una eliminación de 1,4- ó 1,6-bencilo. En este planteamiento, se une poli (etilenglicol) como el portador polimérico al grupo • bencilo por medio de un primer enlace temporal tal como un enlace de éster, carbonato, carbamato o amida. El grupo bencilo sirve como el grupo de activación, y el polímero de PEG también tiene la función del grupo de enmascaramiento en este mecanismo de escisión de cascada. El grupo amino de la molécula de fármaco se enlaza mediante un segundo enlace temporal, que contiene un grupo carbamato, a la porción bencilo. La liberación de PEG de la molécula de fármaco se inicia por escisión enzimática del primer enlace temporal seguido por una eliminación rápida de 1,4- ó 1,6-bencilo, iniciando la escisión del segundo enlace temporal . El mismo sistema ligador también se usa para conjugados liberables de poli (etilenglicol) de proteínas (S. Lee, R.B. Greenwald et al. Bioconj . Chem. 2001, 12 (2), 163- 169 ) . Se usa lisozima como una proteína modelo debido a que pierde su actividad cuando toma lugar la PEGilación en el grupo epsilon-amino de los residuos de lisina. Se conjugaron a la proteína varias cantidades de ligador de PEG. La regeneración de la proteína nativa a partir de los conjugados de PEG se presenta por escisión enzimática en plasma de rata o en un amortiguador de pH alto, no fisiológico . Greenwald et al., publicó en 2002 un sistema de distribución de fármacos de poli (etilenglicol) de profármacos que contienen amino en base a una lactonización de seguro de trimetilo (R.B. Greenwald et al. J. Med. Chem. 2000, 43 (3) , 457-487; solicitud de patente PCT número WO-A-02/089789) . En este sistema de profármaco, se enlaza ácido o-hidroxifenil-dimetilpropiónico sustituido a PEG por un grupo éster, carbonato o carbamato, como un primer enlace temporal y a grupos amino de moléculas de fármaco por medio de un enlace de amida como el segundo enlace temporal . El paso determinante de la velocidad en la liberación del fármaco es la escisión enzimática del primer enlace. Este paso se sigue por la escisión rápida de amida por lactonización, liberando u? producto secundario de lactona aromática, potencialmente tóxico. Se describieron sistemas similares de profármaco or F.M.H. De Groot et al. (WO02083180 y WO04043493 Al) y D.
Shabat et al. (WO04019993 Al) . La WO02083180 describe un sistema de profármaco con ligadores alargados y múltiples basados en la eliminación de 1, (4+2n) . Las porciones de enmascaramiento en estos ejemplos se diseñaron específicamente para escisión enzimática. Este planteamiento se extendió a un sistema de profármaco dendrítico donde un evento de activación enzimática activó la liberación de más de una molécula de fármaco (WO04043493 Al) . La WO04019993 Al describe un sistema similar de profármaco basado en un dendrímero auto-in olativo que libera muchas porciones de fármaco en un evento individual de activación enzimática. Estos sistemas se caracterizan por la ausencia de un portador polimérico. En cambio, la oligomerización de los componentes del ligador de profármaco proporciona un alto peso molecular del profármaco, y la escisión del profármaco genera residuos de ligador y fármaco libre, pero no se libera la entidad polimérica. La desventaja en los sistemas de profármaco mencionados anteriormente, descritos por Greenwald, De Groot y Shabat es la liberación de productos secundarios de molécula pequeña, aromáticos, potencialmente tóxicos tal como quinona-metidas después de la escisión del enlace temporal. Las entidades potencialmente tóxicas se liberan en una estequiometría 1:1 con el fármaco y pueden asumir altas concentraciones in vivo. Este factor de riesgo aún es mayor si se emplean estructuras dendríticas auto-inmolativas basadas en oligómeros del grupo de activación, y se liberan productos secundarios más aromáticos que las moléculas de fármaco . Más recientemente, R.B. Greenwald et al.
(Greenwald et al. J. Med. Chem. 2004, 47, 726-734) describieron un sistema de profármaco de PEG basado en un ligador de bis- (N-2-hidroxietil) glicin-amida (amida de bicina) . En este sistema, se enlazan dos moléculas de PEG a una molécula de bicina acoplada a un grupo amino de la molécula de fármaco. Los dos primeros pasos en la activación del profármaco es la escisión enzimática de ambas moléculas de PEG. Se describen diferentes enlaces entre PEG y bicina que dan por resultado diferente cinética de activación de profármaco. La desventaja principal de este sistema es la lenta velocidad de hidrólisis de la amida de bicina conjugada a la molécula de fármaco (t 1/2 = 3 h en amortiguador de fosfato) que da por resultado la liberación de un compuesto intermedio de profármaco modificado con bicina que puede mostrar diferente farmacocinética y diferentes propiedades farmacodinámicas en comparación con la molécula de fármaco de origen. Los profármacos de cascada con grupos de enmascaramiento que son parte del polímero portador se limitan en el control de la cinética de liberación del fármaco. Puesto que la escisión del grupo de enmascaramiento es el paso limitante de la velocidad en el mecanismo de cascada, su estructura molecular gobierna la cinética. Si el polímero portador es idéntico al grupo de enmascaramiento, la flexibilidad estructural se restringe a las características de los polímeros. De manera alternativa, si el polímero requiere modificación estructural a fin de hacer corresponder los requerimientos para escisión controlada, la síntesis de estructuras correspondiente puede llegar a ser más difícil . También, la incorporación de las características del grupo de enmascaramiento en un polímero puede cambiar su perfil de seguridad. Por lo tanto, se prefiere separar de manera estructural el grupo de enmascaramiento y el portador. Esto se puede lograr al emplear un enlace permanente entre el portador polimérico y el grupo de activación. Este enlace estable no precipita en el mecanismo de escisión de cascada. Si el portador no sirve como un grupo de enmascaramiento y el grupo de activación se acopla al portador por medio de un enlace estable, se evita la liberación de productos secundarios potencialmente tóxicos tal como el grupo de activación. La unión estable del grupo de activación y el polímero también suprimen la liberación de los productos intermedios de fármaco-ligador con farmacología desconocida.
Se han desarrollado sistemas para la distribución dirigida de agentes terapéuticos al volver dependiente de enzimas al grupo de enmascaramiento. Sólo en la presencia de una enzima correspondiente es la velocidad de escisión del primer enlace temporal que conecta al grupo de enmascaramiento con el grupo de activación suficientemente acelerado para uso terapéutico. Antezak et al. (Bioorg Med Chem 9 (2001) 2843-48) describen un reactivo que forma la base para un sistema de profármaco en cascada macromolecular para moléculas de fármaco que contienen amina. En este planteamiento, un anticuerpo sirve como un portador, un enlace estable conecta el anticuerpo a una porción de activación, que tiene un grupo de enmascaramiento enzimáticamente escindible. En la remoción enzimática del grupo de enmascaramiento enlazado a éster, un segundo enlace temporal que escinde y libera el compuesto de fármaco, como se muestra en la figura 6. D. Shabat et al. (Chem. Eur. J. 2004, 10, 2626-2634) describen un sistema de profármaco polimérico basado en una porción de activación de ácido mandélico. En este sistema, el grupo de enmascaramiento se enlaza a la porción de activación por un enlace de carbamato. La porción de activación se conjuga de manera permanente a un polímero de poliacrilamida mediante un enlace de amida. Después de la activación enzimática del grupo de enmascaramiento por un anticuerpo catalítico, el grupo de enmascaramiento se escinde por ciclización y el fármaco se libera. La porción de activación aún se conecta al polímero de poliacrilamida después de la liberación del fármaco. M.-R. Lee et al. describe (Angew Chem. 2004, 116, 1707-1710) un sistema de profármaco similar basado en una porción de activación de ácido mandélico y un grupo de enmascaramiento enlazado a éster, enzimáticamente escindible . En todos estos sistemas descritos de profármaco-polímero, el grupo de enmascaramiento se diseña de manera específica para hacer el sustrato a una enzima, y la escisión del grupo de enmascaramiento será casi completamente dependiente de la catálisis enzimática con las desventajas de la variabilidad entre pacientes, variabilidad en los sitios de inyección y una pobre correlación in vitro-in vivo . Una desventaja principal de la escisión predominantemente enzimática es la variabilidad entre pacientes. Los niveles de enzimas pueden diferir de manera significativa entre individuos dando por resultado variación biológica de la activación de profármaco por escisión enzimática. Los niveles de enzima también pueden variar dependiendo del sitio de administración, por ejemplo se conoce que en el caso de inyección subcutánea, ciertas áreas del cuerpo producen efectos terapéuticos más predecibles, que otras. Para reducir este efecto impredecible, la escisión no enzimática o catálisis intramolecular es de interés particular (ver, por ejemplo, B. Testa, J.M: Mayer in Hydrolysis in Drug and Prodrug Metabolism, Wiley-VCH, 2003, página 5) . Adicionalmente, es difícil establecer una correlación in vivo-in vitro en las propiedades farmacocinéticas para estos profármacos enlazados a portador, dependientes de enzima. En la ausencia de una firme correlación in vivo-in vitro, llega a ser una tarea difícil la optimización del perfil de liberación. También, la necesidad de selectividad de enzima impone una limitación severa en las características estructurales que se pueden usar en el ligador de profármaco. Esta restricción impide en su mayor parte el desarrollo de una firme relación estructura-actividad y en consecuencia la optimización de la cinética de escisión del ligador. Por estas razones, se necesita proporcionar nuevas tecnologías de ligador y/o portador para formar profármacos poliméricos de amina que contienen agentes activos a fin de superar las limitaciones de los profármacos poliméricos descritos .
Descripción Detallada de la Invención La presente invención afronta las desventajas descritas anteriormente. La invención proporciona profármacos poliméricos de cascada caracterizados por un grupo de enmascaramiento que contiene un nucleófilo y que es distinto del portador. El nucleófilo está en una distancia adecuada a un primer enlace temporal con un grupo de activación- aromático capaz de sufrir una reacción de eliminación de 1, (4+2p) (con p = 0, 1, 2, 3, 4,...) después de la escisión del primer enlace temporal. La invención se caracteriza, además, por el grupo de activación que se conecta al grupo amino de la molécula de fármaco a través de un segundo enlace temporal que se escinde como consecuencia de la eliminación de 1, (4+2p) . Una característica estructurada adicional es la unión de un portador polimérico al grupo de activación por medio de un enlace permanente. Los ' grupos de enmascaramiento de acuerdo a la presente invención contienen al menos un nucleófilo Nu. Este nucleófilo, que puede ser por ejemplo un grupo amino primario, secundario o terciario puede ayudar en la escisión del grupo de enmascaramiento de la porción de activación por catálisis intramolecular o ciclización. La invención proporciona profármacos de cascada, poliméricos y correspondientes reactivos ligadores de profármaco, de cascada, poliméricos de la Fórmula la ó Ib.
Fórmula Ib en donde Yx a Y5, Rl a R4 , T, X, W, Nu y Ar se definen a continuación :• La liberación del fármaco nativo se efectúa por un mecanismo de dos pasos. El primer paso es la escisión determinante de la velocidad del primer enlace temporal entre el grupo de enmascaramiento y la porción de activación del profármaco polimérico in vivo. Como se describe anteriormente, se puede mediar la escisión del grupo de enmascaramiento por un paso enzimático o no enzimático, tal como hidrólisis dependiente de pH o ciclización intramolecular. En la modalidad preferida de la invención, la escisión se efectúa de forma no enzimática por ciclización intramolecular o catálisis. La vida media de la cinética de escisión en un amortiguador acuoso de pH 7.4 a 37°C del grupo de enmascaramiento de acuerdo a la presente invención está de manera preferente entre 1 hora y 6 meses, de manera más preferente entre 1 día y 3 meses, y de manera más preferente entre 1 día y 2 meses. El paso segundo y final en la liberación del fármaco nativo, regenerado, es la llamada eliminación de 1,4- ó 1,6 ó 1, (4+2p) (en la cual p = 2, 3, 4 ó mayor) , rápida espontánea e irreversible de la porción del profármaco polimérico restante de la fórmula la ó fórmula Ib, respectivamente. Este mecanismo de liberación de fármaco nativo de un profármaco polimérico activada por escisión hidrólitica del grupo de enmascaramiento seguido por un' paso de 1,6- eliminación del grupo de activación se ejemplifica por un profármaco polimérico de acuerdo a la presente invención.
Fármaco escisión de grupo de enmascaramiento por catálisis intramolecular Definiciones de Yi a Y5, Rl a R4, T, X, W, Nu y Ar en la fórmula la ó Ib T es D ó A En el caso donde la estructura inventiva sea un reactivo ligador de profármaco, de cascada, polimérico, T es A, y A es un grupo saliente. Los ejemplos no limitantes de los grupos A salientes adecuados incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, cloruro, bromuro, fluoruro, nitrofenoxi, imidazolilo, N-hidroxisuccinimidilo, N- hidroxibenzotriazolilo, N-hidroxiazobenzotriazolilo, pentafluorfenoxi, N-hidroxisulfosuccinimidilo, o cualquier otro grupo saliente conocido por aquellos expertos en la técnica. En el caso donde la estructura inventiva sea un profármaco en cascada polimérico, T es D, y D es un residuo de un material biológicamente activo, que contiene amina, que incluye, de manera enunciativa y sin limitación, agentes bioactivos de molécula pequeña, o biopolímeros como proteínas, polipéptidos y oligonucleótido (ARN, ADN), ácidos nucleicos de péptidos (PNA) . Se señala que en esta descripción también se hace referencia a profármacos. Un profármaco verdadero se encuentra cuando T es el residuo del material o porción biológicamente activa, que contiene amina. Si T es un grupo saliente A, entonces la fórmula representa un reactivo ligador de profármaco, de cascada, polimérico. Por simplicidad, se referirán a profármacos en esta descripción. Se entenderá del contexto si se quiere decir un profármaco verdadero o un reactivo como un precursor. Las porciones bioactivas de molécula pequeña, orgánicas, adecuadas, incluyen, sin limitación, porciones tal como agentes activos en el sistema nervioso central, agentes anti-infectivos, anti-neoplásticos, antibacterianos, antifungales, analgésicos, anticonceptivos, anti- inflamatorios, esteroidales, vasodilatadores, vasoconstrictores y cardiovasculares con al menos un grupo amino primario o secundario. Los ejemplos no exclusivos de estos compuestos son daunorrubicina, doxorrubicina, idarrubicina, mitoxantrona, amino-glutatimida, amantadina, diafenilsulfona, etambutol, sulfadiazina, sulfamerazina, sulfametoxazol, sulfaleno, clinafloxacina, moxifloxacina, ciprofloxacina, enoxacina, norfloxacina, neomicina B, esprectinomicina, canamicina A, meropenemo, dopamina, dobutamina, lisinoprilo, serotonina, carbutamida, acivicina, etc. Las proteínas y polipéptidos adecuados que tienen al menos un grupo amino libre incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, ACTH, adenosina-desaminasa, agalsidasa, albúmina, alfa-1-antitripsina (AAT) , inhibidor de alfa-1-proteinasa (API) , alteplasa, amistreplasa, serina-proteasa ancrod, anticuerpos (monoclonal o policlonal, y fragmentos o fusiones), antitrombina III, antitripsinas, aprotinína, asparaginasas, bifaliña, proteínas morfogénicas óseas, calcitonina (salmón) , colagenaza, DNasa, endorfinas, enfuvirtida, encefalinas, eritropoyetinas, factor Vlla, factor VIII, factor Villa, factor IX, fibrinolisina, proteínas de fusión, hormonas estimuladoras de folículo, factores estimulador de colonia de granulocitos (G-CSF) , galactosidasa, glucagon, péptidos tipo glucagon tal como GLP-1, grlucocerebrosidasa, factor estimulador de colonia de granulocitos-macrófago (GM-CSF) , proteína activadora de fosfolipasa (PLAP) , gonadotropina coriónica (hCG) , hemoglobinas, vacunas de hepatitis B, hirudina, hialuronidasas, idurnonidasa, inmunoglobulinas, vacunas de influenza, interieucinas (1 alfa, 1 beta, 2, 3, 4, 6, 10, 11, 12) , antagonistas de receptor de IL-1 (rhlL-lra) , insulinas, interferonas (alfa 2za, alfa 2b, alfa 2c, beta la, beta Ib, gamma la, gamma Ib) , factor de crecimiento de queratinocito (KGF) , factores de crecimiento transformante, lactasa, leuprólido, levotiroxina, hormona leutenizante, vacuna de lime, péptido natriurético, pancrelipasa, papaína, hormona paratiroide, PDGF, pepsina, factor activador de plaquetas, acetilhídrolasa (PAF-AH) , prolactina, proteína C, octreotide, secretina, sermorelina, superóxido-dismutasa (SOD) , somatropinas (hormona de crecimiento) , somatostatina, estreoptocinasa, sucrasa, fragmento de toxina de tétanos, tilactasa, trombinas, timosina, hormona estimuladora de tiroides, tirotropina, factor de necrosis tumoral (TNF), Fe del receptor de TNF IgG, activador de plasminógeno de tejido (tPA) , TSH, urato-oxidasa, urocinasa, vacunas, proteínas vegetales tal como lectinas y ricinas . También incluidos en la presente está cualquier polipéptido sintético o cualquier porción de un polipéptido con bioactividad in vivo. Adicionalmente, se incluyen proteínas preparadas por metodologías de ADN recombinante incluyendo versiones mutantes de las proteínas mencionadas anteriormente, fragmentos de anticuerpo, proteínas de unión de cadena individual, anticuerpos catalíticos y proteínas de fusión. Las proteínas preferidas son anticuerpos, calcitonina, G-CSF, GM-CSF, eritropoyetinas , hemoglobinas, interieucinas, insulinas, interferones, SOD, somatropina, TNF, Fe de receptor de TNF-IgG y GLP-1. X es una porción separadora tal como R5-Y6. Ya, Y2 puede ser cada uno ya sea 0, S, ó NR6, independientemente entre sí. Y3, Y5 cada uno puede ser ya sea O ó S, independientemente entre sí . Y4 es O, NR6, ó -C(R7) (R8)- Y6 es O, S, NR6 , succinimida, maleimida, enlaces carbono-carbono insaturados o cualquier heteroátomo que contenga un par de electrones libres, o no está presente, R2 y R3 se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo lineal, ramificado o cílico sustituido o no sustituido, o heteroalquilo, arilos, arilos sustituidos, heteroarilos sustituidos o no sustituidos, ciano, nitro, halógeno, carboxi, carboxialquilo, alquilcarbonilo, carboxamidoalquilo, etc. El término "heteroalquilo" en el contexto de la presente invención denota cadenas de alquilo (lineal, cíclico o ramificado) donde las cadenas de alquilo contienen o están sustituidas con, en cualquier posición, uno más heteroátomos, seleccionados independientemente a partir de 0, S, N, P, Si, Cl, F, Br, I, etc. o grupos, seleccionados independientemente de carboxamida, éster carboxílico, éster de fosfonato, éster de fosfato, dobles o triples enlaces, carbamato, urea, tiourea, tiocarbamato, oxima, ciano, carboxilo, carbonilo, etc. Cada sustitución de R4 en Ar puede ser la misma o diferente y se selecciona independientemente de hidrógeno, alquilo lineal, ramificado o cíclico sustituido o no sustituido, o heteroalquilo, arilo, arilo sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, alcoxi lineal, ramificado o cíclico, sustituido o no sustituido, heteroalquiloxi lineal, ramificado cíclico sustituido o no sustituido, ariloxi, heteroariloxi, ciano, halógeno, etc. R4 se selecciona de manera preferente de sustituyentes pequeños tal como hidrógeno, metilo, etilo, etoxi, metoxi, y otros alquilos lineales, cíclicos o ramificados de Cl a C6 y heteroalquilos . n es cero o un número entero positivo. R7 y R8 se seleccionan independientemente de hidrógeno, a alquilo lineal, ramificado o cíclico sustituido o no sustituido, o heteroalquilo, arilos, arilos sustituidos, heteroarilos sustituidos o no sustituidos, ciano, halógeno, etc. R5 se selecciona de alquilo lineal, ramificado cíclico sustituido o no sustituido, o heteroalquilo, arilos, arilos sustituidos, heteroarilos sustituidos o no sustituidos, etc. R6 se selecciona de hidrógeno, alquilo lineal, ramificado o cíclico sustituido o no sustituido, o heteroalquilo, arilos, arilos sustituidos, heteroarilos sustituidos o no sustituidos, etc. Rl es un polímero Los ejemplos no limitantes para polímeros adecuados son polímeros basados en polialquiloxi tal como poli (propilenglicol) o poli (etilenglicol) dextranos, quitosan, ácido hialurónico y derivados, alginato, xilano, mannano, carragahen, agarosa, celulosa, almidón, hidroxietil -almidón (HES) y otros polímeros basados en carbohidratos, poli (alcoholes vinílicos) , poli (oxazolinas) , poli (anhídridos) , poli (otro esteres), poli (carbonatos) , poli (uretanos) , poli (ácidos acrílicos), poli (acrilamidas) tal como poli (hidroxipropilmetacrilamida) (HMPA) , poli (acrilatos) , poli (metacrilatos) tal como poli (hidroxietilmetacrilato) , poli (organofosfacenos) , poli (siloxanos) , poli (vinilpirrolidona) , poli (cianoacrilatos) , poli (esteres) tal como poli (ácido láctico) o poli (ácidos glicólicos), poli (iminocarbonatos) , poli (aminoácidos) tal como poli (ácido glutámico), colágeno, gelatina, copolímeros, copolímeros injertados, polímeros reticulados, hidrogeles, y copolímeros de bloque de los polímeros listados anteriormente. Los hidrogeles se pueden definir como redes poliméricas hidrófilas o anfifílicas, tridimensionales que están impregnadas con grandes cantidades de agua. Las redes se componen de homopolímeros o copolímeros, son insolubles debido a la presencia de reticulaciones químicas covalentes o físicas (iónica, interacciones hidrófobas, enmarañamiento) . Las reticulaciones proporcionan la estructura e integridad física de la red. Los hidrogeles exhiben una compatibilidad termodinámica con agua que les permite hincharse en medios acuosos (ver: N.A. Peppas, P. Bures, W. Leobandung, H. Ichikawa, Hydrogels in pharmaceutical formulations, Eur. J. Pharm. Biopharm. 2000, 50, 27-46) . Las cadenas de la red se conectan de una manera tal que existen poros y que una fracción sustancial de estos poros, son de dimensiones de entre 1 y 1000 nm. Al seleccionar ciertas condiciones de polimerización, el hidrogel se puede obtener en la forma de un gel amorfo o una resina perlada. Estas perlas o cuentas blandas pueden tener un diámetro de entre 1 y 1000 micrómetros. Se pueden sintetizar hidrogeles de los polímeros y copolímeros listados anteriormente y reticular de forma física o reticular de forma química por polimerización por radicales, aniónica o catiónica, por reacciones químicas tal como condensación o reacciones de adición como se describe en W.E. Hennink y C.F. van Nostrum, Adv. Drug Del. Rev. 2002, 54, 13-36. Los ejemplos adicionales incluyen polímeros ramificados e hiper-ramificados. Los ejemplos de estos polímeros incluyen dendrímeros y otros polímeros densos de estrella. (R. Esfand, D.A. Tomalia, Drug Discov Today, 2001, 6 (8), 427-436; P.M. Heegaard, U. Boas, Chem. Soc. Rev. 2004 (33(1), 43-63; S.M. Grayson, J.M. Frechet, Chem. Rev. 2001, 101 (12), 3819-3868). Rl también puede ser un biopolímero tal como una proteína. Los ejemplos no limitantes de estos polímeros incluyen albúmina, anticuerpos, fibrina, caseína, y otras proteínas plasmáticas. Cada polímero Rl puede tener una o más sustancias biológicamente activas enlazadas al polímero por conjugación con un segundo ligador de profármaco como se describe en la presente o cualquier otro ligador conocido por las personas expertas en la técnica. Los polímeros pueden tener, además, sustituyentes y se pueden funcionalizar para la unión a la porción separadora X. Los ejemplos no limitantes de estos grupos funcionales comprenden ácido carboxílico y derivados activados, amino, aleimida, tiol, ácido sulfónico y derivados , carbonato y derivados , carbamato y derivados , hidroxilo, aldehido, cetona, hidrazina, isocianato, isotiocianato, ácido fosfórico y derivados, ácido fosfónico y derivados, haloacetilo, haluros de alquilo, acriloilo, agentes de arilación tal como fluoruros de arilo, hidroxilamina, disulfuros tal como disulfuro de piridilo, vinil-sulfona, vinil-cetona, diazoalcanos, compuestos de diazoacetilo, epóxido, oxirano y aziridina. Los grupos funcionales preferidos para el polímero Rl incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, tilo, maleimida, amino, ácido carboxílico y derivados, carbonato y derivados, carbamato y derivados, aldehido y haloacetilo. Los grupos funcionales especialmente preferidos incluyen tiol, maleimida, amino, ácido carboxílico y derivados, carbamato y derivados, y carbonato y derivados de los mismos . Los ejemplos no limitantes para enlaces adecuados o grupos formados entre X y Rl incluyen disulfuro, S-succinimida, amida, amino, éster carboxílico, sulfonamida, carbamato, carbonato, éter, oxima, hidrazona, urea, tiourea, fosfato, fosfonato, etc. Los enlaces o grupos preferidos formados entre X y Rl comprenden S-succinimido, amida, carbamato y urea. De manera preferente, los polímeros Rl están bien hidratados, son degradables o excretables, no tóxicos y no inmunogénicos en mamíferos. Los polímeros Rl preferidos incluyen polímeros basados en polialcoxi tal como polietilenglicol y reactivos de polietilenglicol como aquellos que se describen en Nektar Inc. 2003 catálogo "Nektar Molecule Engineering - Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation" y polímeros e hidrogeles ramificados, hiper-ramificados, reticulados, y proteínas tal como albúmina. W se selecciona de alquilo lineal, ramificado o cíclico, sustituido o no sustituido, arilos, arilos sustituidos, heteroalquilo lineal, ramificado o cíclico, sustituido o no sustituido, heteroarilos sustituidos o no sustituidos, etc. W se selecciona de manera preferente de alquilos lineales, ramificados o cíclicos sustituidos o no sustituidos, no tóxicos, o heteróalquilos Las variaciones preferidas de Las variaciones especialmente preferidas de que forman profármacos poliméricos de las siguientes fórmulas : En la fórmula Iaa e Iba, R6 también puede ser Nu-W. Al menos un Nu está presente en Nu-W. Nu es un nucleófilo que puede realizar un ataque nucleófilo en el átomo de carbonilo de Y ir Y2 y de esta manera catalizar la escisión del grupo de enmascaramiento por catálisis intramolecular o ciclización (figura 8) . La Figura 8 muestra un ejemplo de acuerdo a la fórmula la ó Ib en donde la escisión del grupo de enmascaramiento es por ciclización intramolecular. En casos donde Nu cataliza sólo la escisión del grupo de enmascaramiento por catálisis intramolecular, no se forma producto cíclico del grupo de enmascaramiento. Los nucleófilos preferidos incluyen grupos amino primarios, secundarios y terciarios, tilo, ácido carboxílico, hidroxilamina, hidrazina, y heteroarilo que contiene nitrógeno. Los nucleófilos especialmente preferidos incluyen grupos amino primarios, secundarios y terciarios. A fin de catalizar de forma efectiva la escisión del grupo de enmascaramiento, el espaciado entre el nucleófilo Nu y Y2 es de manera preferente entre tres y quince átomos . De manera más preferente, el espaciamiento entre Nu y Y2 está entre cuatro y diez átomos. Al menos un nucleófilo Nu se puede unir donde quiera a W (por ejemplo en el término o en la parte intermedia de W) o puede ser parte de W. Las variaciones preferidas para el grupo de enmascaramiento R9V / N-W donde 10 forma un nucleófilo Nu de amina primaria, secundaria y terciaria. Estas variaciones preferidas dan por resultado profármacos poliméricos de acuerdo a las siguientes fórmulas : R9, RIO se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo o heteroalquilo sustituido o no sustituido o arilo o heteroarilo sustituido o no sustituido. Las variaciones especialmente preferidas para el grupo de enmascaramiento se selecciona de De manera preferente, R9, RIO, Rll y R12 se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido y R7 y/o R8 no son hidrógeno. R6 también puede ser y no es de manera preferente hidrógeno. Se encontró de forma sorprendente, que el grupo de enmascaramiento puede modificar de manera irreversible la porción biológicamente activa, que contiene amina, cuando el nucleófilo Nu está ausente en el grupo de enmascaramiento. Como se muestra en la sección de ejemplos, durante la liberación de la porción bioactiva, insulina, de un profármaco polimérico con un grupo de enmascaramiento de pentanoilo que no es parte de la presente invención (puesto que no contiene un nucleófilo), se modificó aproximadamente. 30 % de la molécula de insulina con el grupo de enmascaramiento por transferencia de acilo. El mecanismo de un ejemplo de esta modificación, donde D contiene un grupo amino libre adicional que sirve como nucleófilo para la transferencia de acilo del grupo de enmascaramiento se muestra en la figura 9. Ar de la fórmula la ó Ib es un hidrocarburo aromático multi-sustituido o un heterocíclo aromático multi-sustituido. Para ser aromático, el número de pi electrones debe satisfacer la regla de Hückel (4n+2) y el ciclo tiene que ser plano. Una variedad enorme de compuestos satisfacen estos criterios y de esta manera son adecuados como Ar en la fórmula la ó Ib. Las porciones aromáticas preferidas, no limitantes incluyen: en donde W es 0, N, ó S, independientemente entre sí.
Y2 y en la fórmula la ó Y2 y en la fórmula Ib tienen que ser arreglados en el anillo aromático de una manera tal que pueda tomar lugar (ver anteriormente) la eliminación de 1,4- ó 1,6- ó l,(4+2p), con p = 2, 3, 4 y superior. Por ejemplo, en el caso de un anillo de 6 miembros, los sustituyentes tienen que ser arreglados ortho o para . Las porciones preferidas para Ar son hidrocarburos aromáticos mono- y dí-cíclicos o heterociclos aromátios . Las porciones especialmente preferidas son hidrocarburos aromáticos de cinco o seis miembros, monocíclicos o heterociclos aromáticos .
Procedimientos de síntesis en general de los profármacos poliméricos La síntesis de ejemplos representativos de profármacos poliméricos de acuerdo a la presente invención se describe en la sección de ejemplos. Los profármacos de la presente invención se pueden preparar de varias maneras diferentes. La figura 10 muestra rutas generales para la síntesis de los profármacos poliméricos de la presente invención de acuerdo a la fórmula la. En un primer método, el compuesto intermedio (III) se proporciona al acilar Y2 el material de inicio (II) con eil grupo Ade enmascarami•en-to N,uM—Wv*-Y' 4T A-11 Para esto, X ó Nu pueden tener que ser protegidos con un grupo protector reversible PGX. Los grupos protectores adecuados se describen en TW Greene, P.G.M. Wuts, Protective groups in organic synthesis, 1999, John Wiley & Sons, 3rd ed. Del . compuesto intermedio (III) , se pueden usar dos rutas alternativas para producir (Iaa) . En una primera ruta, el compuesto intermedio (III) se activa por un agente de activación tal como cloroformato de 4- nitrofenilo o carbonato de disuccinilo para producir (IV) . La molécula de fármaco que contiene amina se une a (IV) para producir (V) al desplazar el grupo saliente del compuesto intermedio activado (IV) . Después de la desprotección de X tal como al tratar el compuesto intermedio (V) con reactivos tal como ácido trifluoroacético o DTT (donde es aplicable) el compuesto desprotegido (V) entonces se hace reaccionar con el polímero Rl para producir el profármaco polimérico (Iaa) . E una segunda ruta, el polímero Rl se une primero al compuesto intermedio (III) después de la desprotección de X (donde es aplicable) para formar el compuesto intermedio (VI) . Después de un paso de activación, se forma el compuesto intermedio (VII) . Se hace reaccionar (VII) con la molécula de fármaco que contiene amina para formar el profármaco polimérico (Iac) . En un segundo método, se proporciona el compuesto intermedio (VIII) al activar el material de inicio (II) por un agente de activación tal como cloroformato de 4- nitrofenilo. Para esto, Y2 y/o X pueden tener que ser protegidos con un grupo protector PG2 y/o PGi- Se hace reaccionar el fármaco que contiene amina con el compuesto intermedio (VIII) para formar (IX) . En una primera ruta, Y2 de (IX) se desprotege de manera selectiva y se hace acilar para formar el compuesto intermedio (V) que se procesa adicionalmente a (Iaa) como se describe anteriormente. En una segunda ruta, X se desprotege de forma selectiva y se hace reaccionar por el polímero Rl para formar el compuesto intermedio (X) . Y2 de (X) entonces se desprotege y acila para formar el profármaco polimérico (Iac).. En un tercer método, se hace reaccionar el material de inicio (II) con el polímero Rl para formar el compuesto intermedio (XI) . En una ruta, el compuesto intermedio (XI) se puede acilar para formar el compuesto intermedio (VI) que se procesa como se describe anteriormente para formar el profármaco polimérico (Iaa) . En una segunda ruta, Y2 se protege por el grupo protector PG2, se activa y se hace reaccionar con la molécula de fármaco que contiene amina para formar (X) . El compuesto intermedio (X) entonces se procesa como se describe anteriormente para formar el profármaco polimérico (Iac) . Para todos los métodos descritos, los grupos funcionales adicionales tal como Y3 o nucleófilos presentes en Nu-W pueden tener que ser protegidos con grupos protectores adecuados. Los profármacos poliméricos de acuerdo a la fórmula Ib se pueden preparar por los métodos descritos anteriormente para profármacos de acuerdo a la fórmula la usando el material de inicio Ilb en lugar de II en la figura 10.
Hb Se entiende que, las estructuras de ligador de acuerdo a la versión resumida y tener grupos protectores o grupos salientes como se describe y usa en la síntesis de profármacos poliméricos correspondientes, se consideran dentro del alcance de la invención.
Aplicación de profármacos poliméricos en terapia molecular Para profármacos de cascada, poliméricos,. es deseable que la cinética de escisión del primer enlace temporal prosiga bajo las condiciones presentes en la circulación sanguínea del cuerpo humano (pH 7.4, 37 °C) . De manera más importante, la escisión del primer enlace temporal se debe basar en hidrólisis y no exhibir ninguna o sólo muy limitada dependencia de entidades químicas o bioquímicas o fisicoquímicas presentes en la circulación sanguínea humana tal como enzimas, sales o proteínas de unión. Ahora se encontró de forma sorprendente que la velocidad de escisión del primer enlace temporal que conecta el grupo de enmascaramiento con el grupo de activación así como su dependencia de los compuestos sanguíneos se puede controlar por los efectos del grupo vecino mediados por grupos funcionales nucleófilos (tal como aminas primarias, secundarias o terciarias) presentes en el grupo de enmascaramiento y colocadas a una distancia al enlace temporal correspondiente. Si el grupo de enmascaramiento se estructura de esta manera, una reacción intramolecular con - contribución del nucleófilo gobierna la cinética del enlace (Figura 5 y Figura 8) . La ventaja clave de los profármacos poliméricos de la presente invención es su escisión predominantemente no enzimática: la vida media del profármaco en plasma sanguíneo humano adecuadamente amortiguado de pH 7.4 (con concentración de amortiguador acuoso < 50 %) es al menos 50 % de la vida media del profármaco en amortiguador libre de enzimas, pH 7.4. A-. • • Esta característica permite mejor capacidad de predicción y mejor control de las velocidades de liberación después de la administración al .organismo vivo y reduce la variabilidad entre pacientes.
En contraste a la dependencia enzimática de la remoción del grupo de enmascaramiento como se describe en los ejemplos mencionados anteriormente de Antzczak et al., Shabat et al . , y Lee et al . , se puede lograr un mayor nivel de control sobre las velocidades de liberación si el grupo de enmascaramiento tiene propiedades independientes de enzima y autoeliminadoras . Los grupos de enmascaramiento de acuerdo con la presente invención contienen al menos un nucleófilo Nu. Las características estructurales de este grupo de enmascaramiento tal como nucleofilicidad del grupo de amina y la capacidad de formación de anillo se pueden optimizar de forma sistemática a fin de ajustar de manera precisa la velocidad de escisión del profármaco. Estas reacciones intramoleculares que dan por resultado el desenmascaramiento y el arreglo subsiguiente son altamente independientes de las enzimas debido al hecho que las reacciones intramoleculares se prefieren en general con respecto a las reacciones intramoleculares como se muestra esquemáticamente en la Figura 8. En otra modalidad de la invención, se logra independencia de la escisión del profármaco de los niveles de enzimas al proporcionar un profármaco que contiene un grupo portador estéricamente demandante como se muestra en la Figura 7.
Esta encapsulación o protección estérica por el grupo protector estéricamente demandante se puede conferir por una estructura ramificada, hiper-ramificada, reticulada o auto-montada del polímero portador. Estos polímeros tienden a formar un volumen molecular densamente empacado, como se ejemplifica por ejemplo en dendrímeros, polímeros densos de estrella o nano- y micro-partículas en forma de perla o cuenta o geles amorfos . Si el enlace del portador polimérico del fármaco se localiza en el interior del portador polimérico, el fármaco enlazado se encapsulará de manera efectiva y se protegerá del ataque enzimático. En este caso, .el impedimento estérico por el polímero impide que las enzimas tengan acceso y escindan los enlaces temporales . En aún otra modalidad, la escisión del profármaco independiente de enzimas se logra al combinar un grupo de enmascaramiento, intramolecular, auto-eliminador, con un portador hiper-ramificado o reticulado o auto-montado, encapsulante . Una ventaja adicional de la presente invención es la liberación de una porción no modificada, biológicamente activa. En casos donde la porción biológicamente activa contiene grupos funcionales reactivos adicionales tal como grupos amino de residuos de lisina en proteínas, puede presentarse una reacción secundaria indeseada entre el grupo de enmascaramiento y la porción biológicamente activa. Los grupos funcionales reactivos de la porción biológicamente activa pueden reaccionar con el grupo de enmascaramiento, formando un enlace covalente estable y dando por resultado la liberación de una porción modificada biológicamente activa. Esta reacción secundaria potencial se muestra esquemáticamente en la Figura 9. La ocurrencia de estas reacciones secundarias se muestra en la sección de ejemplos usando profármacos polímérícos que no son parte de la presente invención con grupos de enmascaramiento simples tal como un residuo de pentanoilo sin un nucleófilo Nu presente en el grupo de enmascaramiento y como se describe por Antezak et al . , o Lee et al . La reacción secundaria en este sistema ligador se suprime usando profármacos poliméricos de acuerdo a la presente invención con grupos de enmascaramiento intramolecularmente activados que contienen nucleófilos Nu (ver sección de ejemplos) . El control de liberación independiente de enzimas permite formulaciones de depósito sin la necesidad de encapsulación. Hasta ahora, muchos materiales biocompatibles tal como hidrogeles con grandes tamaños de poro no se podían usar para formulaciones de depósito debido a la carencia de las propiedades de encapsulación. De estos materiales biocompatibles, bien hidratados y mecánicamente blandos, la porción biológicamente activa se liberará demasiado rápido para la mayoría de las aplicaciones terapéuticas. En combinación con los ligadores de profármaco descritos en esta invención, el material portador se puede optimizar para sus propiedades de biocompatibilidad puesto que la liberación se gobierna únicamente por la cinética de escisión de ligador y no requiere degradación química o enzimática del portador polimérico mismo . Las velocidades de liberación se gobiernan por una reacción química sustancialmente no enzimática que a su vez es dependiente de la estructura molecular del ligador. Las modificaciones químicas o aleatorias de la estructura química, por ejemplo, al cambiar los sustituyentes en una o más posiciones, por ejemplo un grupo de enmascaramiento en un profármaco en cascada, permite la generación de ligadores de profármaco con diferentes velocidades de liberación. Por lo tanto, es posible crear una variedad de ligadores de profármaco y seleccionar aquellos ligadores de profármaco que se escinden más rápido o más lento de acuerdo a las demandas presentadas por una aplicación terapéutica o médica dada. Otra característica ventajosa que es parte de esta invención es la unión del portador polimérico a través de un enlace covalente estable a una porción de activación comprendida en un mecanismo de liberación de profármaco en cascada o doble. Como parte de esta invención, la porción de activación permanece unida al portador polimérico después de la liberación del fármaco y por lo tanto no se puede difundir en el ambiente. El enlace permanente del portador de polímero al grupo de activación reduce su mayor parte cualquier reactividad secundaria de la porción de activación y la probabilidad de efectos tóxicos indeseados . En otros profármacos de cascada poliméricos conocidos en la técnica, la porción de activación se libera además del profármaco. Debido a los mecanismos de rearreglo molecular usados en los profármacos de cascada, la porción de activación se libera en una forma altamente reactiva y puede provocar daño directo a las moléculas circundantes, o derivados potencialmente tóxicos de la porción de activación se pueden formar in vivo .
Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 muestra un profármaco enlazado a portador . La Figura 2 muestra un profármaco enlazado a portador, dependiente de enzimas. La Figura 3 muestra un profármaco en cascada donde el grupo de enmascaramiento es parte del portador. La Figura 4 muestra un profármaco en cascada dependiente de enzimas donde el grupo de enmascaramiento es parte del portador.
La Figura 5 muestra un profármaco en cascada de auto-escisión donde el grupo de enmascaramiento está separado del portador. La Figura 6 muestra un profármaco en cascada dependiente de enzimas donde el grupo de enmascaramiento se separa del portador. La Figura 7 muestra un profármaco en cascada donde el portador está protegiendo estéricamente al grupo de enmascaramiento . La Figura 8 muestra la escisión del grupo de enmascaramiento por ciclización intramolecular. La Figura 9 muestra una posible reacción secundaria de la activación del profármaco polimérico. La Figura 10 muestra métodos generales de síntesis. La Figura 11 muestra espectro de masa de moléculas de insulina liberadas de profármaco.
Ejemplos Materiales Se compraron de Novabiochem fmoc-aminoácidos, y resinas PyBOP y se nombran de acuerdo al catálogo. Se obtuvo fmoc-Ado-OH de Neosystem. Todos los productos químicos adicionales se compraron de Sigma Aldrich. La insulina humana recombinante fue de ICN Biomedicals (EUA) . Se obtuvo maleimida-PEG5k de Nektar (EUA) . Se obtuvo de Molecular Probes éster succinimidílico de 5- (y-6-) -carboxifluoresceína (isómeros mezclados) .
Medio de reacción de síntesis en fase sólida Se realizó la síntesis en fase sólida en resina de amida NovaSyn TG Sieber -con una carga de 0.17 mmol/g o resina de cloruro de 2-clorotritilo con una carga de 1.4 mmol/g. Se usaron como recipientes de reacción jeringas equipadas con fritas de polipropileno.
Ciclo de acoplamiento normal para aminoácidos protegidos con fmoc Para remoción del grupo protector fmoc, la resina se agitó repetidamente (tres veces, 4 minutos cada vez) con piperidina/DBU/DMF 2/2/96 (v/v/v) y se lavó repetidamente (seis veces) con DMF. El acoplamiento de los aminoácidos protegidos con fmoc a grupos amino libres en resina se logró al agitar la resina con tres equivalentes (eq) de fmoc-aminoácido, 3 equivalentes de PyPOP y 6 equivalentes de DIEA con relación a loa grupos amino libres en DMF durante 60 munutos . Finalmente, la resina se lavó repetidamente (cinco veces) con DMF.
Protocolo de escisión normal para resina de amida TentalGel Sieber Al terminar la síntesis, la resina se lavó con DCM, se secó in vacuo y se trató de forma repetida (cinco veces) con DCM/TES/TFA 97/2/1 (v/v) . Después de la evaporación, los compuestos se purificaron por RP-HPLC preparativa (Waters 600) .
Protocolo de escisión normal para resina de cloruro de 2- clorotritilo En la síntesis completada, la resina se lavó con DCM, se secó in vacuo y se trató dos veces durante 30 minutos con HFIP/DMC 65/35 (v/v) . Después de combinar los eluatos, se evaporan los componentes volátiles.
Análisis Se realizó la espectrometría de masas (MS). en un instrumento Waters ZQ 4000 ESI y los espectros se interpretaron si es necesario, por el programa de Waters MaxEnt . Se realizó la cromatografía de exposición de tamaño usando un sistema básico Amersham Bíoscience AEKTA equipado con una columna Superdex 200 (Amersham Bioscience) . Se grabaron los espectros de RMN en un Bruker AC300.
Vista general . - síntesis de profármacos poliméricos de acuerdo a la fórmula la con grupos de enmascaramiento enlazados a éster R2 N y / DIC A/ R2" OH 1. NH2-R3 2. Mmt desproteoción Síntesis de profármacos poliméricos de acuerdo a la fórmula la con grupos de enmascaramiento enlazados a carbamato HO r ^~X- -aS-Mmt HO ^— S-R4 2 C M 1- °A= NO, -i o-? y- NO, H R6-N. R5 15 R6-N 15 2. R5 19 '' 20 21, 45 b) NaBH,, c) Síntesis de profármacos poliméricos de acuerdo a la fórmula Ib con grupo de enmascaramiento enlazado a carbamato b) Síntesis del compuesto 2 2 Se disolvieron en TFA Mmt-cloruro (1 equivalente) y ácido mercaptopropiónico (1.1 equivalentes) y se incubaron durante 30 minutos. El solvente se removió bajo presión reducida. El producto se disolvió en piridina, se diluyó en agua, se acidificó por ácido acético y se extrajo con éter. La fase de éter se separó y se secó sobre Na2S04. Se removió el solvente bajo presión reducida y el producto 2 se purificó por RP-HPLC.
Síntesis de compuestos 3a y 3b 3a Rl = H 3b Rl = OMe Se disolvieron en DMF clorhidrato de octopamina (la) (2 equivalentes) , DIEA (4 equivalentes) , y PyPOP (1 equivalente) se adicionó 2 (1 equivalente) y la mezcla se hizo reaccionar durante 50 minutos a temperatura ambiente. Después de la adición de ácido acético (7 equivalentes) , el producto 3a se purificó por RP-HPLC. Se sintetizó 3b a partir de clorhidrato de normetanofrina (Ib) como se describe anteriormente. 3a: MS [M+Na]+ = 536 (MW+Na calculado = 536.2 g/mol) 3b: MS [M+Na]+ = 566 (MW+Na calculado = 566.2 g/mol) Síntesis de mercaptotiazolido 4 4 Se disolvieron 2-mercaptotiazolina y trietilamina (1.5 equivalentes) en THF seco y se adicionó cloruro de pentanoilo (1 equivalente) . La mezcla se agitó durante 1 hora a 50°C bajo atmósfera de gas inerte y se dejó enfriar a temperatura ambiente. Se adicionó HCl acuoso 0.5 N y las fases orgánicas separadas se secaron sobre Na2S04. Después de la concentración in vacuo . El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice usando heptano/acetato de etilo (l/l) como fase móvil. Se recolectó mercaptotiazólido 4 como un aceite amarillo viscoso . 4 Rf/heptano/acetato de etilo 1:1) = 0.7 Síntesis de compuestos 5a y 5b 5a 5b Protocolo de síntesis general : Se incubó 1 g de resina de cloruro de 2-clorotritilo (carga 1.6 mmol/g) durante 1 hora con 850 mg (2.4 mmol) de Fmoc-Ile-OH y 840 µl (4.8 mmol) de DIEA en 5 ml de DCM/DMF l/l. Después de la remoción de fmoc y el lavado de la resina con DMF, el ácido boc-aminobutírico se acopló a 0.5 g de resina de acuerdo al método normal de acoplamiento. El compuesto 5a se escindió de la resina con DCM/TFA/TES 97/1/2 (v/v) durante 45 minutos. Después de la neutralización con piridina, los solventes se removieron bajo presión reducida y 5a se purificó por RP-HPLC. Se sintetizó 5b a partir de ácido boc-aminohexanoico como se describe anteriormente. 5a MS [M+Na]+ = 339.2 (MW+Na calculado = 339.4 g/mol) 5b MS [M+Na]+ = 367.4 (MW+Na calculado = 367.5 g/mol) Síntesis de compuesto 6a Se sometieron a reflujo en DCM, mercaptotiazólido 4 (1 equivalente) , fenol 3a (4 equivalentes) y DMAP (4 equivalentes) durante 2 horas bajo atmósfera de nitrógeno. Después de la neutralización con ácido acético, el solvente se removió in vacuo y el producto 6a se purificó por RP-HPLC. 6a MS [M+Na]+ = 620 (MW+Na calculado = 620.3 g/mol) Síntesis de compuestos 6b a 6e 6c 6d R1 = OMe 6e R1 = ? Protocolo de síntesis general : Se hicieron reaccionar ácido carboxílico 5a (1 equivalente) , fenol 3b (1 equivalente) , DIC (1 equivalente) , y DMAP (2 equivalentes) en DMF durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de la adición de ácido acético (4 equivalentes) , el éster carboxílico resultante 6c se purificó por RP-HPLC. 6d se sintetizó como se describe anteriormente usando 5b y 3b como materiales de inicio. 6b se sintetizó como se describe anteriormente usando Z-Lys (BOC) -OH y 3b. 6e se sintetizó como se describe anteriormente usando 5b y 3a. 6b MS [M+Na]+ = 928 (MW+Na calculado = 928.6 g/mol) 6c MS [M+Na]+ = 864 (MW+Na calculado = 864.5 g/mol) 6d MS [M+Na]+ = 892 (MW+Na calculado = 892.6 g/mol) 6e MS [M+NaJ+ = 862 (MW+Na calculado = 862.6 g/mol) Síntesis de compuestos 7a a 7e 7e R1 = H Protocolo de síntesis general : Alcohol 6a (1 equivalente) , cloroformiato de 4-nitrofenilo (10 equivalentes) , y DIEA (10 equivalentes) se agitaron en dioxano seco durante 3 horas a temperatura ambiente bajo atmósfera de nitrógeno. Después de la adición de ácido acético, (25 equivalentes) , las mezclas se diluyeron con acetonitrilo/H20 7/3 (v/v) y el carbonato 7a se purificó por RP-HPLC. 7b, 7c, 7d ó 7e se sintetizaron respectivamente a partir de 6b, 6c, 6d ó 6e, como se describe anteriormente. 7a MS [M+Na]+ = 785 (MW+Na calculado = 785.5 g/mol) 7b MS [M+Na]+ = 1093 (MW+Na calculado = 1093.7 g/mol) 7c MS [M+Na]+ = 1029 (MW+Na calculado = 1029.6 g/mol) 7d MS [M+Na]+ = 1057 (MW+Na calculado = 1057.6 g/mol) 7e MS [M+Na]+ = 1027 (MW+Na calculado = 1027.6 g/mol) Síntesis de compuestos 8a a 8c (Nal-ligador-insulina Protocolo de síntesis general : Se mezcló Rh-insulina en DMSO/DMF l/l (v/v) con una solución de 0.9 equivalentes de carbonato 7a en DMSO. La solución resultante se ajustó a pH básico con DIEA y se agitó durante 1.5 horas a temperatura ambiente. La purificación por RP-HPLC dio el compuesto intermedio protegido con Mmt. Después de la liofilización, el compuesto intermedio protegido con Mmt se mezcló con TFA/trietilsilano 95:5 (v/v) y se agitó durante 5 minutos. Los volátiles se removieron bajo flujo de nitrógeno y se purificó 8a por RP-HPLC y se liofilizó. La regioselectividad de modificación a insulina se verificó por reducción de DTT y análisis de MS. Se sintetizaron 8b ú 8c a partir de 7c ó 7d, respectivamente, como se describe anteriormente . 8a MS [M+2H]2+ = 3078.9; [M+3H]3t = 2053.2 [M+4H] + = 1540.6 (MW calculado = 6158 g/mol) 8b MS [M+2H]2+= 3152.9; [M+3H]3+ = 2100.6 [M+4H] + = 1575.8 (MW calculado = 6302 g/mol) 8c MS: [M+3H]3+ = 2110.7; [M+4H]4+ = 1583.7; [M+5H]5+ = 1266.6 (MW calculado = 6330 g/mol Síntesis de compuestos 8d a 8 (NeB29-Fluoresceína-NaR1- 8f R1 - OMe, R4 = H 8g R1=H,R4 = H . . .... 9f R1=OMe, R4 = Suc-PEG5k Suo = succinimid.lo 9g R1 = H> R4 = Suc-PEG5k Síntesis de N8328- fluoresceína: Se disolvieron 80 mg (13.8 µmol) de rh-insulina en 4 ml de DMF/DMSO 1/1 (v/v) y se adicionaron 40 µl de DIEA. Se adicionaron 8 mg (17 µ l) de éster succini idílico de 5- (y -6)-carboxifluoresceína y la solución se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se adicionaron 4 ml de acetonitrilo/agua/ ácido acético 5/5/1 (v/v/v) , el producto Ne^-fluoresceína-insulina se purificó por RP-HPLC y se liofilizó. El sitio de conjugación se verificó por reducción de ^29- fluoresceína- insulina con 1,4-ditiotreitol, digestión con proteasa y análisis por MS.
MS: [M+2H]2+ = 3084.0; [M+3H]3+ = 2054.6 (MW calculado = 6166 g/mol) Se mezcló NeB29-fluoresceína-insulina en DMF/DMSO 1/1 (v/v) con una solución de 0.9 equivalentes de carbonato 7b en DMSO. La solución resultante se ajustó a pH básico con DIEA y se agitó durante 3 horas a temperatura ambiente. La purificación por RP-HPLC dio el compuesto intermedio protegido con Mmt . Después de la liofilización, el compuesto intermedio se disolvió en TFA/trietilsilano 95/5 (v/v) y se agitó durante 5 minutos. Los volátiles se removieron bajo flujo de nitrógeno y se purificó 8d por RP-HPLC y se liofilizó . Se sintetizaron 8e, 8f ú 8g como se describe anteriormente usando 7c, 7d ó 7e, respectivamente. 8d MS: [M+2H]2+ = 3364.1; [M+3H]3+ = 2242.7; [M+4H]+ = 1681.5 (MW calculado = 6724 g/mol) 8e MS: [M+3H]+ = 2219.2 [M+4H]4+ = 1665.9; [M+5H]5+ = 1332.8 (MW calculado = 6660 g/mol) 8f MS: [M+3H]3+ = 2229.7 [M+4H]4+ = 1673.3; [M+5H]5+ = 1337.7 (MW calculado = 6689 g/mol) 8g MS: [M+3H]3+ = 2218.7 [M+4H]+ = 1664.9 (MW calculado = 6659 g/mol) Síntesis de compuestos 9a a 9q (compuestos de insulina mono-pegilados) Se mezclaron 70 µl de 8a 500 µM en acetonitrilo/agua 1/4 (v/v) con 7 µl de maleimida-PEG5k 10 mM en acetonitrilo/agua 1/4 (v/v) y 10 µl de amortiguador de fosfato de sodio 0.5 M pH 7.0 y se incubaron durante 15 minutos. El compuesto 9a se purificó por SEC (columna: Superdex 200, velocidad de flujo 0.75 ml/min) usando amortiguador HEPES 10 M (pH 7.4), NaCl 150 mM, EDTA 3 mM y Tween al 0.005 % como fase móvil. El eluato recolectado (aproximadamente 1.5 ml) se usó directamente como tal para determinación de velocidad de liberación. Se sintetizaron 9b, 9c, 9d, 9e, 9f ó 9g como se describe anteriormente, respectivamente de 9b, 9c, 8d, 8e, 8f, ú 8g. 9a hasta 9g: tiempo de retención de SEC: 19.5 minutos.
Síntesis de compuestos lia y 11b lia Rl = R2 = Me 11b Rl = Me, R2 = H Se disolvieron 3 , 5-dimetil-4-hidroxi-acetofenona (5.0 mmol) (10a) y CuBr2 (1.7 g, 7.5 mmol) en 10 ml de acetato de etilo y se sometieron a reflujo durante 2 horas.
Los productos secundarios sólidos se removieron por filtración. El filtrado se evaporó y el producto crudo lia se purificó por RP-HPLC. Se sintetizó 11b a partir de 4-hidroxi-3 -metil- acetofenona (10b) (0.75 g, 5.0 mmol) como se describe anteriormente . lia: Rendimiento 754 mg (62 %) MS [M+H]+ = 243.1/245.1 (MW+H calculado = 244.1 g/mol) 11b: Rendimiento 533 mg (47 %) MS [M+H]+ = 229.2/231.1 (MW+H calculado = 230.1 g/mol) Síntesis de compuestos 12a y 12b 12a Rl = R2 = Me 12b Rl = Me, R2 = H Se disolvieron 500 mg de lia (2.06 mmol) y 576 mg (4.11 mmol) de hexametilentetramina en 20 ml de triclorometano y se sometieron a reflujo durante 30 min. El solvente se removió in vacuo. Se adicionaron 4 ml de etanol y 2 ml de HCl concentrado y la suspensión espesa se calentó a 50 °C durante 4 horas. La mezcla se concentró in vacuo, se diluyó con acetonitrilo/agua y 12a se purificó por RP-HPLC. Se sintetizó 12b a partir de 472 mg (2.06 mmol) de 11b como se describe anteriormente. 12a: Rendimiento 547 mg (81 %) como sal de TFA MS [M+Na]+ = 202.2 (MW+Na calculado = 202.2 g/mol) 12b: Rendimiento 455 mg (70%) como sal de TFA MS [M+Na]+ = 188.2 (MW+Na calculado = 188.2 g/mol) Síntesis de compuesto 13 13 Se disolvieron 500 mg (1.71 mmol) de 12a (sal de TFA) en 10 ml de metanol/agua 1/1 (v/v) , se adicionaron 129 mg (3.41 mmol) de NaBH4 y la mezcla se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se adicionaron 0.5 ml de ácido acético y se purificó 13 por RP-HPLC. 13: Rendimiento 313 mg (62 %) como sal de TFA MS [M+Na]+ = 204.2 (MW+Na calculado = 204.2 g/mol) RMN (300 MHz, DMSO-ds) d[ppm] = 8.25 (s, ÍH, Fenol), 7.84 (bs, 3H, NH3+) , 6.89 (s, 2H, CHar) , 5.85 (d, 1H, Hidroxilo, J=3 . 7 Hz ) , 4 . 62 (m, ÍH, CHBenc . lo 2 . 93 (m, ÍH, CHJ , 2 . 80 (m, ÍH, CH ) , 2 . 17 ( s , 6H , CH, ) .
Síntesis de compuestos 14a a 14d 14a Rl = R2 = Me, R7 = H, R4 = Mmt 14b Rl = R2 = H, R7 = Me, R4 = Mmt 14c Rl = OMe, R2 = H, R7 = Me, R4 = Mmt 14d Rl = H, R2 = H, R7 = Me, R4 = Trt Se acopló 13 (sal de TFA, 159 mg; 0.541 mmol) al compuesto 2 como se describe para el compuesto 3a para producir 14a. Se sintetizaron 14b ó 14c como se describe anteriormente usando sinefrina (335 mg, 2.00 mmol) y metanefrina (sal de HCl, 281 mg, 1.20 mmol), respectivamente . Se acopló sinefrina (335 mg, 2.3 mmol) a ácido 3- tritilsulfanil-propiónico como se describe anteriormente para producir 14d. 14a: Rendimiento 254 mg (87 %) MS [M+Na] + = 564.7 (MW+Na calculado = 564.3 g/mol) 14b: Rendimiento 760 mg (72 %) MS [M+Na]+ = 550.2 (MW+Na calculado = 550.3 g/mol) 14c: Rendimiento 530 mg (80 %) MS [M+Na]+ = 580.4 (MW+Na calculado = 580.4 g/mol) 14d: Rendimiento 567 mg (49 %) MS [M+Na]+ = 520.5 (MW+Na calculado = 520.7 g/mol) Síntesis de compuestos 15c, 15d y 15f Protocolo de síntesis general : Se incubó 1 g de resina de cloruro de 2- clorotritilo (carga 1.4 mmol/g) durante 1 hora con N,N'- dimetilpropano-1, 3 -diamina (para síntesis de 15c), ó N,N'- dietil-propano-1, 3 -diamina (para síntesis de 15d) ó N,N- dimetil-etano-1, 2 -diamina (4 equivalentes) (para síntesis de 15f) en DCM. Después del lavado de la resina con DMF, las aminas se acilaron con anhídrido acético/piridina/DMF 1/1/2 (v/v/v) durante 14 horas. La resina se lavó con THF y se secó. Se adicionó gota a gota LiAlH (1M en THF, 4 equivalentes) a la resina suspendida en THF. La suspensión resultante se agitó durante 3 horas a 45 °C bajo atmósfera de nitrógeno. Después del enfriamiento, se adicionó la solución de sal de Rhochelle acuosa y la resina se separó y se secó. Los compuestos se escindieron de la resina con HFIP/DCM 2/1 (v/v) (2 x 30 min) .Los componentes volátiles se evaporaron y los productos 15c, 15d ó 15f se usaron en los siguientes pasos sin purificación adicional . 15c MS [M+H]+ = 131.2 (MW = 130.1 g/mol) 15d MS [M+H] + = 159 . 2 (MW = 158 . 1 g/mol ) 15f MS [M+H] + = 117 . 1 (MW = 116 g/mol ) Síntesis de compuestos 16 a 16f y 16i 16a Rl = R2 = R5 = Me, R6 = 2- (dimetilamino) etilo, R7 = H, R4 = Mmt 16b Rl = OMe, R2 = H, R5 = Et, R6 = 2- (dietilamino) etilo, R7 = H, R4 = Mmt 16c Rl = OMe, R2 = H, R5 = Me, R6 = 3- (N-etilo-N- metilamino) propilo, R7 = Me, R4 = Mmt 16d Rl = R2 H, R5 = Me, R6 = 3- (N-etil-N-metilamino) propilo, R7 = Me, R4 = Mmt 16e Rl = OMe, R2 = H, R5 = Et , R6 = 3 - (dietilamino) propilo, R7 = Me, R4 = Mmt 16f Rl = R2 = H, R5 = Et, R6 = 3- (dietilamino) propilo, R7 = Me, R4 = Mmt 16i Rl = R2 = H, R5 = Et , R6 = 2- (dietilamino) etilo , R7 = Me, R4 = Trt Se disolvió 14a (120 mg, 0.222 mmol) en 1.5 ml de THF seco. Se adicionaron cloroformiato de p-nitrofenilo (45 mg, 0.222 mmol) y DIEA (113 µl, 0.665 mmol) y la mezcla se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se adicionó 15a (N,N,N' -trimetil-etileno-1, 2-diamina) (72 µl, 0.554 mmol) y la agitación se continuo durante 30 minutos. El solvente se removió in vacuo, se adicionaron 100 µl de AcOH y se purificó 16a por RP-HPLC. Se sintetizó 16b como se describe anteriormente para 3b (80 mg, 0.15 mmol) y 15b (N,N,N' -trietil-etilen-1, 2- diamina) (55 mg, 0.38 mmol). Se sintetizaron 16c ó 16d como se describe anteriormente a partir de 14c (56 mg, 0.1 mmol) ó 14b (53 mg, 0.1 mmol), respectivamente y diamina 15c. Se sintetizaron le ó 16f como se describe anteriormente a partir de 14c (56 mg, 0.1 mmol) ó 14b, respectivamente, (53 mg, 0.1 mmol) y diamina 15d. Se sintetizó 16i como se describe anteriormente a partir de 14d (350 mg, 0.7 mmol) y 15b (N,N,N' -trietil-etilen-1, 2-diamina) (180 [µl, 1 mmol). 16a: Rendimiento 120 mg ( 69 %) como sal de TFA MS [M+Na]+ = 692.4 (MW+Na calculado = 692.9 g/mol) 16b: Rendimiento 48 mg (40 %) como sal de TFA MS [M+Na]+ = 736.3 (MW+Na calculado = 736.4 g/mol) 16c : Rendimiento 8 mg (10 %) como sal de TFA MS [M+Na]+ = 736.4 (MW+Na calculado = ^736.4 g/mol) 16d: Rendimiento 20 mg (25 %) como sal de TFA MS [M+Na]+ = 706.3 (MW+Na calculado = 706.3 g/mol) 16e: Rendimiento 2 mg (3 %) como sal de TFA MS [M+Na]+ = 764.6 (MW+Na calculado = 764.4 g/mol) 16f: Rendimiento 6 mg (8 %) como sal de TFA MS [M+Na]+ = 734.4 (MW+Na calculado = 734.3 g/mol) 16i: Rendimiento 152 mg (28 %) como sal de TFA MS [M+Na]+ = 690.5 (MW+Na calculado = 690.9 g/mol) Síntesis de compuesto 17 17 La amina 12b (sal de TFA) se acopló al compuesto 2 como se describe para el compuesto 3a. 17: Rendimiento 608 mg (74 %) MS [M+Na]+ = 548.3 (MW+Na calculado = 548.7 g/mol) Síntesis de compuestos 18a y 18b 18a Rl = R5 = Me, R2 = H, R6 = 3- (dimetilamino) propilo 18b Rl = R5 = Me, R2 = H, R6 = 2- (N-etil-N-metilamino) etilo Se hicieron reaccionar 383 mg, (0.729 mmol) de 17 con cloroformiato de p-nitrofenilo y N,N,N' -trimetil-1-propanoato-1, 3 -diamina (15e) ó 15f, respectivamente, para producir 18a ó 18b como se describe para el compuesto 16a. 18a: Rendimiento 287 mg (50 %) como sal de TFA MS [M+Na]+ = 690.7 (MW+Na calculado = 690.9 g/mol) 18b: Rendimiento 148 mg (26 %) como sal de TFA MS [M+Na]+ = 690.9 (MW+Na calculado = 690.9 g/mol) Síntesis de compuestos 16g y 16b 16g Rl = R5 = Me, R2 = H, R6 = 3- (dimetílamino) propílo 16h Rl = R5 = Me, R2 = H, R6 = 2~ (N-etil-N-metilamino) etilo Se disolvió 18a (287 mg, 0.367 mmol, sal de TFA) en 5 ml de metanol, se adicionó NaBH (41 mg, 1.07 mmol) y la mezcla se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se adicionaron 0.5 ml de ácido acético y 16g se purificó por RP-HPLC. Se hizo reaccionar 18b (8 mg, 0.010 mmol, sal de TFA) para producir 16h. 16g: Rendimiento 201 mg (70 %) como sal de TFA MS [M+Na]+ = 692.7 (MW+Na calculado = 692.9 g/mol) 16h: Rendimiento 6 mg (77%) como sal de TFA S [M+Na]+ = 692.7 (MW+Na calculado = 692.9 g/mol) Síntesis de compuestos 19a a 19i 19a Rl = R2 = R5 = Me, R6 = 2- (dimetilamino) etilo, R7 = H, R4 = Mmt 19b Rl = OMe, R2 = H, R5 = Et, R6 = 2- (dietilamino) etilo, R7 = H, R4 = Mmt 19c Rl = OMe, R2 = H, R5 = Me, R6 = 3- (N-etil-N-metilamino) propilo, R7 = Me, R4 = Mmt 19d Rl = R2 H, R5 = Me, R6 = 3- (N-etilo-N-metilamino) propilo, R7 = Me, R4 = Mmt 19e Rl = OMe, R2 = H, R5 = Et , R6 = 3- (dietilamino) propilo, R7 = Me, R4 = Mmt 19f Rl = R2 = H, R5 = Et , R6 = 3 - (dietilamino) propilo, R7 = Me, R4 = Mmt 19g Rl = R5 = Me, R2 = H, R6 = 3- (dimetilamino) propilo, R7 = H, R4 = Mmt I9h Rl = R5 Me, R2 H, R6 2- (N-etilo-N-metilamino) etilo, R7 = H, R4 = Mmt 19i Rl = R2 = H, R5 = Et, R6 = 2- (dietilamino) etilo, R7 = Me, R4 = Trt Se sintetizaron los carbonatos 19a a 19i a partir de 16a a 16i, respectivamente, como se describe para el compuesto 7a. 19a: Rendimiento 98 mg (72 %) como sal de TFA MS [M+Na]+ = 857.8 (MW+Na calculado = 858.0 g/mol) 19b: Rendimiento 6 mg (11 %) como sal de TFA MS [M+Na]+ = 901.8 (MW+Na calculado = 901.5 g/mol) 19c: Rendimiento 1 mg (15 %) como sal de TFA MS [M+Na]+ = 901.4 (MW+Na calculado = 901.5 g/mol) 19d: Rendimiento 8 mg (29 %) como sal de TFA MS [M+Na]+ = 871.4 (MW+Na calculado = 871.4 g/mol) 19e: Rendimiento 0.3 mg (18 %) como sal de TFA S [M+Na]+ 929.4 (MW+Na calculado = 929.5 g/mol) 19f : Rendimiento 4 mg (45 %) como sal de TFA S [M+Na]+ = 899.7 (MW+Na calculado = 899.6 g/mol) 9g: Rendimiento 6 mg (6 %) como sal de TFA S [M+Na]+ = 857.8 (MW+Na calculado = 858.0 g/mol) 9h: Rendimiento 0.8 mg (11 %) como sal de TFA S [M+Na]+ = 857.7 (MW+Na calculado = 858.0 g/mol) 9i Rendimiento 77 mg (49 %) como sal de TFA S [M+Na]+ = 856.2 (MW+Na calculado = 856.0 g/mol) Síntesis de compuestos 20a a 20f 20a Rl = R2 = R5 = Me, R6 = 2- (dimetilamino) etilo, R7 = H 20b Rl = OMe, R2 = H, R5 = Et, R6 = 2- (dietilamino) etilo, R7 = H 20c Rl OMe, R2 = H, R5 Me, R6 = 3- (N-etil-N-metilamino) ropilo, R7 = Me 20d Rl = R2 H, R5 = Me, R6 = 3- (N-etilo-N-metilamino) ropilo, R7 = Me 20e Rl = R5 = Me, R2 = H, R6 = 3- (dimetilamino) propilo, R7 = H 20f Rl = R5 = Me, R2 = H, R6 = 2- (N-etil-N-metilamino) etilo, R7 = H Los derivados de insulina 20a, 20b, 20c, 20d, 20e, o 20f se sintetizaron a partir de 19a, 19b, 19c, 19d, 19g, o 19h respectivamente, como se describe para el compuesto 8a. 20a MS [M+3H]3+ = 2077.3 [M+4H]4+ = 1559.2 (MW calculado = 6231.3 g/mol) 20b MS [M+3H]3t = 2093 .0 [M+4H]4* = 1569.6 (MW calculado = 6274 g/mol) 20c MS [M+3H] 3+ = 2090 . 8 [M+4H] + = 1568 . 7 (MW calculado = 6274 g/mol) 20d MS [M+3H]3+ = 2081.3 [M+4H] 4+ = 1561.8 (MW calculado = 6244 g/mol) 20e MS [M+3H]3+ = 2077.1 [M+4H] 4+ = 1558.2 (MW calculado = 6231.3 g/mol) 20f MS [M+3HJ3+ = 2076.7 [M+4H] + = 1559.3 (MW calculado = 6231.3 g/mol) Síntesis de compuestos 21a a 21f (derivados de insulina mono-pegilados ,21a Rl = R2 = R5 = Me, R6 = 2- (dimetílamino) etilo, R7 = H 21b Rl = OMe, R2 = H, R5 = Et , R6 = 2- (dietilamino) etilo, R7 = H 21c Rl = OMe, R2 = H, R5 = Me, R6 = 3- (N-etil-N-metilamino) propilo, R7 = Me 21d Rl = R2 H, R5 = Me, R6 = 3- (N-etilo-N-metilamino) propilo, R7 = Me 21e Rl = R5 = Me, R2 = H, R6 = 3- (dimetilamino) propilo, R7 = H 21f Rl = R5 = Me, R2 = H, R6 = 2- (N-etil-N-metilamino) etilo, R7 = H Los derivados de insulina 21a, 21b, 21c, 21d, 21e, o 21f se sintetizaron a partir del compuesto 20a, 20b, 20c, 20d, 20e, o 20f, respectivamente, como se describe para el compuesto 9a. 21a hasta 21f: tiempo de retención SEC: 19.5 min Síntesis de compuestos 23a y 23b 23a Rl = Me, R2 = H 23b Rl = R2 = Me Se calentaron o-Cresol (22a) (1 equivalente) , anhídrido succínico (1 equivalente) , A1C13 (3 equivalentes) en nitrobenceno a 100 °C durante 1 hora. La mezcla de reacción se vertió en HCl/hielo y se extrajo con éter, La capa orgánica se extrajo con NaOH 1N y la capa acuosa se acidificó con HCl concentrado. La capa acuosa se extrajo con éter y el éter se evaporó. Se purificó a 23a por RP-HPLC. Se sintetizó 23b a partir de 2 , 6-dimetilfenol (22b) como se describe anteriormente. 23a: Rendimiento 552 mg (31 %) S [M+Na]+ = 231.0 (MW+Na calculado = 231.2 g/mol) RMN (300 MHz, DMSO-ds) d [ppm] = 12.05 (bs, ÍH, C02H) , 10.23 (s, 1 H, fenol OH), 7.74 (s, 1H, CHar) , 7.7 (d, ÍH, CHar, 3JH,H = 8.4 Hz), 6.86 (d, ÍH, CHar, 3JH,H = 8.4 Hz) , 3.13 (t, 2H, C(0)CH2, 3JH,H = 6.4 Hz) , 2,53 (t, 2H, CH2C02, 3JH,H = 6.4 Hz) , 2.16 (s, 3H, CH3) 23b: Rendimiento 166 mg (15 %) MS [M+Na]+ = 245.4 (MW+Na calculado = 245.2 g/mol) Síntesis de compuesto 24 Se disolvieron 1.85 g (16.02 mmol) de clorhidrato de cisteamina en 15 ml de TFA y se adicionaron 2.47 g (8.01 mmol) de MmtCl . Después de la agitación de la mezcla a temperatura ambiente durante 20 minutos, el solvente se evaporó in vacuo. El residuo se disolvió en éter dietílico y se extrajo con NaHC03 acuoso saturado, H2S04 1N y salmuera. El solvente se evaporó y se purificó a 24 por RP-HPLC. 24: Rendimiento 1.11 g (30 %) como sal de TFA TLC (AcOEt/Et3N 99/1), Rf = 0.24 Síntesis de compuestos 25a y 25b 25a Rl = Me, R2 = H 25b Rl = R2 = Me Se disolvieron 23a (1 equivalente), HOBt (1.1 equivalentes) y DIC (1 equivalente) en DMF y se agitaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se adicionaron 24 (sal de TFA, 1 equivalente) y DIEA (3 equivalentes) y la solución se agitó durante 60 minutos. Se adicionó ácido acético y 25a se purificó por RP-HPLC. Se sintetizó 25b a partir de 23b como se describe anteriormente. 25a: Rendimiento 552 mg (25 %) MS [M+Na]+ = 562.7 (MW+Na calculado = 562.7 g/mol) 25b: Rendimiento 15 mg (40 %) MS [M+Na]+ = 576.6 (MW+Na calculado = 576.6 g/mol) Síntesis de compuestos 26a y 26b 26a Rl = Me, R2 = H, R5 = R6 = 3- (dimetilamino) propilo 26b Rl = R2 = R5 = Me, R6 = 2- (dimetilamino) etilo Se hicieron reaccionar 267 mg, (0.495 mmol) de 25a con cloroformiato de p-nitrofenilo y N- (3-dimetilamino-propil) -N' ,N-dimetil-propano-1, 3-diamina (15 g) para producir 26a como se describe para el compuesto 16a. Se sintetizó 26b como se describe anteriormente usando 15 mg de 25b y N,N,N' -trimetil-etano-1, 2-diamina (15a) . 26a: Rendimiento 282 mg (58 %) como sal doble de TFA MS [M+Na]+ = 775.2 (MW+Na calculado = 776.0 g/mol) 26b: Rendimiento 17 mg (70 %) como sal de TFA MS [M+Na]+ = 704.5 (MW+Na calculado = 704.6 g/mol) Síntesis de compuestos 27a y 27b 27a Rl = Me, R2 = H, R5 = R6 = 3- (dimetilamino) propilo 27b Rl = R2 = R5 = Me, R6 = 2- (dimetilamino) etilo Se disolvió 26a (272 mg, 0.277 mmol, sal doble de TFA) en 5 ml de metanol, se adicionó NaBH4 (42 mg, 1.09 mmol) y la mezcla se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se adicionaron 0.5 ml de ácido acético y se purificó 27a por RP-HPLC. El alcohol 27b se sintetizó igualmente de 26b (17 mg, µmol, sal de TFA) . 27a: Rendimiento 142 mg (52 %) como sal doble de TFA MS [M+Na]+ = 777.9 (MW+Na calculado = 778.0 g/mol) 27b: Rendimiento 6 mg (40 %) como sal de TFA MS [M+Na] + = 706 . 5 (MW+Na calculado = 706 . 6 g/mol ) Síntesis de compuestos 28a y 28b 28a Rl = Me, R2 = H, R5 = R6 = 3- (dimetilamino) propilo 28b Rl = R2 = R5 = Me, R6 = 2- (dimetilamino) etilo Se sintetizaron los carbonatos 28a o 28b a partir de 27a o 27b, respectivamente, como se describe para el compuesto 7a. 28a: Rendimiento 1 mg (29%) MS [M+Na]+ = 942.9 (MW+Na calculado = 943.2 g/mol) 28b: Rendimiento 1.5 mg (19 %) MS [M+Na]+ = 871.6 (MW+Na calculado = 871.7 g/mol) Síntesis de compuestos 29a y 29b aB A1NHt 2 29a Rl = Me, R2 = H, R5 = R6 = 3 - (dimetilamino) propilo 29b Rl = R2 = R5 = Me, R6 = 2- (dimetilamino) etilo Se sintetizaron los derivados de insulina 29a o 29b a partir de 28a o 28b, respectivamente, como se describe para el compuesto 8a. 29a MS [M+3H]3+ = 2105.8 [M+4H] + = 1580.2 (MW calculado = 6316.4 g/mol) 29b MS [M+3H]3+ = 2081.8 [M+4H] 4+ = 1562.4 (MW calculado = 6244 g/mol) Síntesis de derivados mono-pegilados de insulina 30a y 30b Insulina o B1 2 30a Rl = Me, R2 = H, R5 = R6 = 3- (dimetilamino) propilo 30b Rl = R2 = R5 = Me, R6 = 2- (dímetilamino) etil Se sintetizaron los derivados de insulina 30a o 30b a partir de 29a o 29b, respectivamente, como se describe para el compuesto 9a. 30a y 30b: tiempo de retención de SEC: 19.5 minutos Síntesis de un profármaco polimérico de acuerdo a la fórmula la con un grupo de enmascaramiento enlazado a éster y un portador dendrítico (9h) Síntesis de compuesto 31 31 Se obtuvo 31 de acuerdo al protocolo normal de síntesis en fase sólida. Los aminoácidos Fmoc-Dpr (Boc) -OH, Fmoc-Dpr (Fmoc) -OH, Fmoc-Dpr (Fmoc) -OH, Fmoc-Ado-OH, y Fmoc-Dpr(Fmoc)-OH se acoplaron a la resina de amida NovaSyn TG Sieber. Después de la remoción final de fmoc, la resina se agitó con 5 equivalentes de ácido maleimidopropiónico y 5 equivalentes de DIC con relación a los grupos amino en DMF durante 30 minutos. Se escindió 31 de la resina con TFA/TES/agua 95/3/2 (v/v/v) . Después de la evaporación del solvente, el producto se purificó por RP-HPLC. MS: [M+H]+ = 2494.6 (MW calculado = 2495.4 g/mol) Síntesis de compuesto 32 32 El compuesto 32 se sintetizó de acuerdo al protocolo normal de síntesis en fase sólida. Los aminoácidos Fmoc-Cys (Mmt) -OH, Fmoc-Dpr (Fmoc) -OH, Fmoc-Dpr (Fmoc) -OH, Fmoc-Ado-OH, y Fmoc-Dpr (Fmoc) -OH se acoplaron a la resina de amida NovaSynTG Sieber. Después de la remoción final de fmoc, la resina se agitó con 3 equivalentes de ácido Boc-aminoxiacético, 3 equivalentes de DIC, y 3 equivalentes de HOBt con relación a los grupos amino en DMF durante 30 minutos. 32 se escindió de la resina con DCM/TFA/TES 97/1/2 (v/v/v) . Después de a adición de 0.8 equivalentes de piridina con relación a TFA, el solvente se evaporó y el producto 32 se purificó por RP-HPLC. MS: [M+H]+ = 2688.2 g/mol (MW calculado =2688.8 g/mol) Síntesis de compuesto 33 33 El compuesto 33 se obtuvo de acuerdo al protocolo normal de síntesis en fase sólida. Los aminoácidos Fmoc- Dpr (ivDde) -OH, Fmoc-Dpr (Fmoc) -OH, Fmoc-Dpr (Fmoc) - OH, F oc- Lys (Fmoc) -OH, y Fmoc-Ado-OH se acoplaron a la resina de amida NovaSyn TG Sieber. Después de la remoción final de fmoc, la resina se agitó con 3 equivalentes de ácido 3 , 6, 9-trioxadecanoico, 3 equivalentes de PyBOP, y 6 equivalentes de DIEA con relación a grupos amino en DMF durante 60 minutos. Para escindir el grupo protector ivDde, la resina se trató tres veces con hidrazina al 2 % en DMF. Después del lavado, se acoplaron 3 equivalentes de Fmoc-Ser-OH con 3 equivalentes de DIC y con 3 equivalentes de HOBt durante 30 minutos. Después de la remoción final de fmoc, la resina se lavó y el producto se escindió de la resina con DCM/TFA/TES 88/10/2 (v/v/v) . El solvente se evaporó y el residuo se oxidó con 10 equivalentes de periodato de sodio en fosfato de sodio 0.1 M pH 7/acetonitrilo 3/2 (v/v) durante 15 minutos para producir 33. El producto 33 se purificó Producto RP-HPLC y se liofilizó. MS: [M+H]+ = 3372.1 g/mol (3372.8 g/mol) Síntesis de compuesto 34 Se disolvieron 6 mg (2.4 µmol) del compuesto 31 en 1 ml de amortiguador de acetonitrilo/fosfato de sodio 0.1 M 2/1 (v/v), pH 7 y se adicionaron 65 mg (24.2 µmol) del compuesto 32. La solución se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas y luego el producto se purificó por RP-HPLC y se liofilizó (rendimiento: 45 mg (78 %) ) . El producto liofilizado (45 mg) se disolvió en 0.5 ml de DMF y se adicionaron 10 µl de DIEA. Se adicionaron 5 mg (30 µmol) de ácido 3-maleimidopropiónico y 4.7 µl -(30 µmol) de DIC 150 µl de DMF y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 20 minutos. El producto se purificó por RP-HPLC y se liofilizó. El producto liofilizado se incubó durante 10 minutos en TFA/agua 95/5 (v/v) y luego el solvente se removió en una corriente de nitrógeno. El producto 34 se purificó por RP-HPLC y se liofilizó (rendimiento total para los tres pasos: 20 mg (47 %) ) . MS: 17700 -18200 (pico amplio) (MW calculado = 17749 g/mol) Síntesis de compuesto 9h Se mezclaron 1.5 mg (225 nmol), 8g y 5 mg (280 nmol) de 34," se disolvieron en 300 µl de amortiguador de fosfato de sodio 0.1 M pH 7/acetonitrilo 2/1 (v/v) y se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente. El producto se purificó por RP-HPLC y se liofilizó (rendimiento 4 mg, 160 nmol, 70 %) . El producto liofilizado se disolvió en 200 µl de amortiguador de citrato de sodio 0.1 M, pH 1.5 y se adicionaron 69 mg (20.5 µmol) de 33 en 200 µl de acetonitrilo/amortiguador de citrato de sodio pH 1.5 2/1 (v/v) . La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas y el producto 9h se purificó por cromatografía de exclusión de tamaño (columna: Superdex 200, amortiguador: HEPES 10 mM pH 7.4, Tween 20 al 0.005 %, EDTA 3mM, velocidad de flujo: 0.75 ml/min) Tiempo de elución de SEC: 15 min Síntesis de compuesto 37a Se incubaron 250 mg (0.35 mmol) de resina de cloruro de 2 -clorotritilo (carga 1.4 mmol/g) durante 1.5 horas con 308 mg (4 equivalentes, 1.4 mmol) de 4,7,10-trioxatridecano-1, 13-diámina en 4 ml de DCM para producir 35a. La resina se lavó con DCM y se secó. Se adicionaron 107 mg (0.7 mmol) de HOBt, 110 µl (0.7 mmol) de DIC, y 150 mg (0.9 mmol) de ácido 5-formil-salicílico en 3 ml de DMF y la suspensión resultante se agitó durante 1 hora a la suspensión resultante se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente para producir 36a. Después del lavado con DCM y THF, la resina se suspendió en 6 ml de THF y se adicionaron gota a gota 3 ml (3 mmol) de BH3 THF, (1 M en THF, 8.5 equivalentes). La mezcla de reacción se agitó durante 18 horas a 45°C bajo atmósfera de nitrógeno. Después del enfriamiento, se adicionaron sucesivamente 4 ml de THF, 0.8 ml de DIEA y 1.6 de MeOH. Se adicionaron 210 mg (0.84 mmol) de I2 (como una solución concentrada de THF) y la suspensión se agitó durante 1 hora. La resina se lavó de manera repetida (tres veces cada vez) con THF, DMF, MeOH y DCM. La resina seca se hizo reaccionar con 107 mg (0.7 mol) de HOBt, 110 µl (0.7 mmol) de DIC, y 55 µL (0.9 mmol) de AcOH en 3 ml de DMF durante 1 hora. Después del lavado de la resina con DMF y DCM, el compuesto 37a se escindió de la resina con HFIP/DCM 2/1 (v/v) (dos veces durante 30 minutos) . Los componentes volátiles se evaporaron y el producto 37a se usó en el siguiente paso sin purificación adicional . 37a: Rendimiento 29 mg (20 %) como sal de TFA MS [M+Na]+ = 421.4 (MW+Na calculado = 421.5 g/mol) Síntesis de compuesto 38 38 Se hicieron reaccionar durante 50 minutos a temperatura ambiente 24 mg (0.06 mmol) de 37a, 31 mg (0.06 mmol) de PyBOP, 32 µl (0.18 mmol) de DIEA, y 23 mg (0.06 mmol) de 2 en 0.5 ml de DMF. Después de la adición de 50 µl de ácido acético, el producto 38 se purificó por RP-HPLC. 38: Rendimiento 7 mg (15 %) MS [M+Na]+ = 781.3 (MW+Na calculado = 781.6 g/mol) Se incubaron 300 mg (0.42 mmol) de resina de cloruro de 2-clorotritilo (carga 1.4 mmol/g) durante 1.5 horas con 245 mg (4 equivalentes, 1.7 mmol) de 1,8- diaminooctano en 4 ml de DCM para producir 35b. La resina se lavó con DCM y se secó. Se adicionaron 107 mg (0.7 mmol) de HOBT, 110 µl (0.7 mmol) de DIC, y 150 mg (0.9 mmol) de ácido 5-formil-salicílico en 3 ml de DMF y la suspensión resultante se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente para producir 36b. Después del lavado con DCM y THF, la resina se suspendió en 6 ml de THF y se adicionaron gota a gota 3 ml (3 mmol) de BH3 THF (1 M en THF) . La mezcla de reacción se agitó durante 18 horas a 45°c bajo atmósfera de nitrógeno. Después del enfriamiento, se adicionaron sucesivamente 4 ml de THF, 0.8 ml de DIEA y 1.6 ml de MeOH. Se adicionaron 210 mg (0.84 mmol) de I2 (como una solución concentrada de THF) y la suspensión se agitó durante 1 hora. La resina se lavó repetidamente (tres veces cada vez) con THF, DMF, MeOH, y DCM. La resina seca se hizo reaccionar con 107 mg (0.7 mmol) de HOBT, 110 µl (0.7 mmol) de DIC, y 55 µl (0.9 mmol) de AcOH en 3 ml de DMF durante 1 hora. Después del lavado de la resina con DMF y DCM, el compuesto 37b, se hicieron reaccionar 78 mg (0.39 mmol) de cloroformiato de p-nitrofenilo y 210 µl (1.2 mmol) de DIEA en THF/DCM l/l (v /v) durante 30 minutos a temperatura ambiente. La resina separada se suspendió en THF/DCM l/l (v/v) y se adicionaron 210 µl (1.2 mmol) de N,N,N'-trimetiletílendiamina. La suspensión resultante se agitó durante 25 minutos a temperatura ambiente. La resina se separó y se lavó con DCM. El producto 39 se escindió de la resina con HFIP/DCM 2/1 (v/v) (dos veces durante 30 minutos) . Los componentes volátiles se evaporaron y el producto 39 se purificó por HPLC. 39: Rendimiento 16 mg (8 %) como sal de TFA MS [M+Na]+ = 473.5 (MW+Na calculado = 473.3 g/mol) Síntesis de compuesto 40a Se disolvió 38 (7 mg, 9 µmol) en 200 µl de THF seco. Se adicionaron cloroformiato de p-nitrofenilo (2.0 mg, 10 µmol) y DIEA (4.4 µl, 25 µmol) y la mezcla se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se adicionó N,N,N' -trietiletilendiamina (15b) (18 µl , 1 mmol) y la agitación se continuó durante 30 minutos. El solvente se removió in vacuo, se adicionaron 10 µl de AcOH y se purificó 40a por RP-HPLC. 40a: Rendimiento 1 mg (11 %) como sal de TFA MS [M+Na]+ = 951.1 (MW+Na calculado = 951.8 g/mol) Síntesis de compuesto 40b Se hicieron reaccionar durante 45 minutos a temperatura ambiente 15 mg (33 µmol) de 39, 18 mg (33 µmol) de PyBOP, 23 µl (0.13 mmol) de DIEA, y 13 mg (35 µmol) de 2 en 0.5 ml de DMF. Después de la adición de 50 µl del ácido acético, el producto 40 se purificó por RP-HPLC. 40b: Rendimiento 10 mg (37 %) como sal de TFA MS [M+H]+ = 811.5 (MW+Na calculado = 810.5 g/mol) Síntesis de compuesto 41a y 41b Se sintetizaron el carbonato 41a o 41b a partir de 0a o 40b como se describe para el compuesto 7a. 1a: Rendimiento 0.4 mg como sal de TFA S [M+Na]+ = 1116.8 (MW+Na calculado = 1116.9 g/mol) 41b: Rendimiento 2 mg (16 %) como sal de TFA MS [M+H]+ = 976.8 (MW calculado = 975.8 g/mol) Se sintetizó el derivado 42 de insulina a partir de- 41b como sé describe para el compuesto 8a. 42 MS [M+3H]3+ = 2124.5 [M+4H] + = 15 94.6 (MW calculado = 6371 g/mol) Síntesis de compuesto 43 ^ Se sintetizó el derivado 43 de insulina a partir de 42 como se describe para el compuesto 9a. 43: Tiempo de retención de SEC: 18.0 min Síntesis de hidrogel 45 de PEGA cargado con rh-insulina PEGA-hidrogel H2 + D1C P Derivatización por maleimida de hidrogel basado en poliacrilamida (PEGA) : Se compraron de Novabiochem cuentas de hidrogel. NH2-PEGA con una carga de 0.4 mmol/g y con un tamaño de cuenta de 150-300 µm. Se pesaron 2.5 g de NH2-PEGA-hidrogel humectado con metanol (0.4 mmol/g de carga de NH2) en una jeringa equipada con una frita de polipropileno. La carga de maleimida se ajustó por acilación empleando una mezcla de ácido maleimidopropiónico y ácido acético activados como se describe en lo siguiente. El hidrogel se lavó 5 veces con DMF y se hizo reaccionar con 13.5 mg (0.08 mmol) de ácido 3-maleimidopropiónico, 115.2 µl (1.92 mmol) de ácido acético y 313 µl (2 mmol) de DIC en 4 ml de DMF durante 30 minutos. El hidrogel 44 derivatizado con maleimida se lavó 10 veces con DMF y DCM y finalmente con acetonitrilo. Se hicieron reaccionar 30 mg de la resina 44 derivatizada con maleimida (carga 16 µmol/g) con 3 mg del compuesto 20b (480 nmol, 1.06 equivalente) en 600 µl de acetonitrilo/amortiguador de fosfato 50 mM (pH 7.4) 20/80 (v/v) durante 10 minutos para dar el hidrogel 45 cargado con rh-insulina. El hidrogel 45 se lavó 5 veces con acetonitrilo/agua 50/50 (v/v) y tres veces con acetonitrilo y se secó bajo vacío.
Síntesis de hidroqel 46 basado en carbohidrato de rh- insulina 46 Se compraron de Amersham cuentas de hidrogel "Sefarosa 4 Fast Flow" activadas con NHS (azarosa químicamente reticulada, reticulador de epiclorhidrina) . Se pesaron 1.5 g del hidrogel Sepharose humectado con etanol (150 mg de hidrogel seco) en una jeringa equipada con una frita de polipropileno y se hicieron reaccionar con 4, 7, 10-trioxatridecano-l, 13-óu.amina 1 M en IMF durante 30 minutos . Después de 5 pasos de lavado con EMF, el hidrogel se hizo reaccionar con 8.5 mg (0.05 mmol) de ácido 3-maleimidopropiónico, 57 µl (0.95 mmol) de ácido acético, 151 mg (1 mmol) de HOBt y 158 µl (1 mmol) de DIC y 4 ml de IMF durante 30 minutos para dar hidrogel derivatizado con maleimida. El hidrogel se lavó 10 veces con EMF y finalmente con acetonitrilo. Se disolvieron 1 . 5 mg de 8c en acetonitrilo/amortiguador de fosfato 50 mM a pH 7 . 4 25 /75 (v/v) y se hicieron reaccionar con 10.8 mg de hidrogel derivatizado con maleimida durante 10 minutos. El hidrogel 46 cargado con rh-insulina se lavó tres veces con acetonitrilo/agua 50/50 (v/v) y tres veces con acetonitrilo y se secó bajo vacío. Esquema de síntesis de Fluoresceína-Insulina-rHSA (50) Síntesis de bismaleimida 47 Se hizo reaccionar ácido 3-maleimido-propiónico (92 mg, 0.54 mmol) en 20 µl de DMF con DIC (78 µl, 0.50 mmol) a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se adicionó , 7-10-trioxa-tridecan-1, 13 -diamina (43.5 µl, 0.20 mmol) y la mezcla se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la adición de 800 µl de ácido acético/agua 1/4 (v/v) se purificó 47 por RP-HPLC. 47: Rendimiento 23 mg (22 %) MS [M+Na]+ = 545.5 (MW+Na calculado = 545.6 g/mol) Síntesis de rHSA-maleimida (48) 66.5 µl de solución 3 mM de rHSA en NaCl 145 mM, octanoato de sodio 32 mM, Tween 80 al 0.0015 % se mezclaron con 66.5 µl de amortiguador de fosfato 0.5 M, pH 7.0. Se adicionaron 0.41 mg de bismaleimida 47 (0.8 µmol) y -la mezcla se hizo reaccionar durante 15 minutos a temperatura ambiente. El compuesto 48 se purificó por SEC (columna Superdex 200, velocidad de flujo: 0.75 ml/mín) usando amortiguador 'HEPES 10 mM pH 7.4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, y Tween al 0.005 % como fase móvil (Rendimiento: 2.6 ml , 77.5 µM de 48) Tiempo de retención de SEC: 17.1 min (280 nm) ESI-MS = 66988 (MW calculado = 66984 g/mol) Síntesis de fluoresceína-insulina-ligador-maleimida (49) Se mezclaron 40 µl de bismaleimida 47 2.4 mM en acetonitrilo/agua l/l (v/v) (96 nmol) con 40 µl de amortiguador de borato de sodio 0.5 M, pH 5.8. Se adicionaron 24 nmol de 8f en 16.8 µl de acetonitrilo/agua l/l (v/v) y la mezcla se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se adicionaron 5 µl de AcOH y 49 se purificó por RP-HPLC. ESI-MS = 7211 (MW calculado = 7211 g/mol) Síntesis de fluoresceína-insulina-ligador-rHSA 50 a) de 49 y rHSA b) de 48 y 8f a) Se mezclaron 30 µl de 49 80 µM en acetonitrilo/agua l/l (v/v) (2.4 nmol) con 70 µl de amortiguador de fosfato de sodio 0.25 M, pH 6.4. Se adicionaron 8 µl de rHSA 3 mM en NaCl 145 mM, octonoato de sodio 32 mM, Tween 80 al 0.0015 % (24 nmol) y la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos . El compuesto 50 se purificó por SEC (columna: Superdex 200, velocidad de flujo: 0.75 ml/min) usando amortiguador HEPES 10 mM, pH 7.4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM EDTA, y Tween al 0.005 % como fase móvil. Tiempo de retención de SEC: 17.3 min (500 nm) ESI-MS = 73676 (MW calculado = 73673 g/mol) b) Se mezcló el eluato de SEC de rHSA-maleimida 48 (241 µl, 77.5 µM, 18.7 nmol) con 20 µl de amortiguador de borato de sodio 0.5 M 5.8. Se adicionaron 14 µl de 8f 1.41 mM (19.6 nmol) en acetonitrilo/agua 1/1 (v/v) y la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se adicionaron 1.2 µl de ácido 3-maleimido-propiónico 48.5 mM (58 nmol) en acetonitrilo/agua 1/1 (v/v) y el compuesto 50 se purificó por SEC (columna: Superdex 200, velocidad de flujo: 0.75 ml/min) usando amortiguador HEPES 10 mM pH 7.4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, y Tween al 0.005 % como fase móvil . Tiempo de retención de SEC: 17.1 min (500 nm) ESI-MS = 73698 (MW calculado = 73673 g/mol) Esquema de síntesis de rHSA-liqador-GLP-1 53a y 53b 52 Síntesis de 51a Se sintetizó GLP (7-36) (secuencia.-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-amida) en resina de amida Rink empleando la estrategia de fmoc (Specialty Peptide Laboratories, Heidelberg, Alemania). Se removió el grupo protector fmoc N-terminal y la resina se lavó con DCM y se secó. Se suspendieron 118 mg de resina (0.11 mmol/g, 13.2 µmol) en una solución de 50 mg de 19i (53 µmol) en 750 µl de DMSO seco y 22.4 µl de DIEA. Se adicionaron 2.1 µl de piridina y la mezcla se agitó durante 48 horas a temperatura ambiente. Después del lavado de la resina 6 veces cada vez con DMF y DCM, la escisión del péptido de la resina y la remoción de los grupos protectores se logró con TFA/trietilsilano/agua 96/2/2 (v/v/v) . Los volátiles se removieron bajo flujo de nitrógeno y se purificó 51a por RP- HPLC y se liofilizó. 51a: Rendimiento 4.6 mg (9 %) MS: [M+3H]3+ = 1251.0 (MW calculado = 3750.3 g/mol) Síntesis de 51b GLP (7-36) protegido en cadena lateral de Lys28 ivDde (secuencia: HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVK (ivDde) GR-amida) se sintetizó en resina de amida Rink empleando la estrategia de fmoc (Specialty Peptide Laboratories, Heidelberg, Alemania) . Se removió el grupo protector fmoc N-terminal y la resina se lavó con DCM y se secó. Se suspendieron 50 mg de resina (0.11 mmol/g, 5.5 µmol) en una solución de 25 mg de 19i (20 µmol) en 400 µl de DMSO seco y 11.2 µl de DIEA. Se adicionaron 1.1 µl de piridina y la mezcla se agitó durante 48 horas a temperatura ambiente. Después del lavado de la resina seis veces con DMF, el grupo protector ivDde se escindió al incubar la resina 3 veces con hídrazina al 5 % en DMF durante 20 minutos. Se acopló el ácido Fmoc-8-amino, 3 , 6-dioxaoctanoico de acuerdo al ciclo de acoplamiento normal . El grupo protector fmoc se removió y se acopló carboxi-fluoresceína al incubar la resina con 8 mg de éster 5- (y-6) -carboxifluoresceína-succinimidilo y 2 µl de DIEA durante 60 minutos. La resina se lavó seis veces cada vez con DMF y DCM. La escisión del péptido de la resina y remoción de grupos protectores se logró con TFA/trietilsilano/agua 96/2/2 (v/v/v) . Los volátiles se removieron bajo flujo de nitrógeno. Se usó 51b para la síntesis de 52 sin purificación adicional. MS: [M+3H]4+ = 1064.3, [M+2H]3+ = 1418.3 (MW calculado = 4254 g/mol) Síntesis de 52 Se disolvió el material 51b al natural en 500 µl de acetonitrilo/fosfato de sodio 0.25 M pH 7 1/1 (v/v) y se adicionaron 8 mg de N,N' -bis (3-maleimidopropionil) -2-hidroxi-1, 3-propanodiamina. La solución se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos y se purificó 52 por RP-HPLC y se liofilizó. 52: Rendimiento: 5.1 mg MS [M+3H] + = 1162.8, [M+2H]3+ = 1549.4 (MW calculado = 4645 g/mol) Síntesis de compuesto 53a 53a Se mezclaron 30 µl de 48 1.54 mM (47 nmol). en amortiguador HEPES 10 mM, pH 7.4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, y Tween al 0.005 % con 10 µl de amortiguador de fosfato de sodio 0.5 M, pH 7.4. Se adicionó una mezcla de 2 µl de DMSO y 12 µl de 51a 6.06 mM (73 nmol) en agua/acetonitrilo 9/1 (v/v) y la solución se incubó a temperatura ambiente durante minutos. 53a se purificó por SEC (columna: Superdex 200, velocidad de flujo: 0.75 ml/min) usando amortiguador de fosfato 10 mM, -je pH 7.4, NaCl 150 mM, y Tween al 0.005 % como fase móvil. Tiempo de retención de SEC: 17.7 min (280 nm) ESI-MS = 70745 (MW calculado = 70734 g/mol) Síntesis de 53b 53b 5 100 µl de 52 3 mM (300 nmol) en amortiguador de fosfato de sodio 50 mM pH 7.0/acetonitrilo 9/1 se mezclaron con 100 µl de HSA 3 mM (300 nmol) y la solución se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se purificó 53b por SEC (columna: Superdex 200, velocidad de flujo: 0.75 ml/min) usando amortiguador HEPES 10 mM pH 7.4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, y Tween al 0.005 % como fase móvil. Tiempo de retención de SEC: 17.7 min (500 nm) Síntesis de compuestos 54a y 54b 54a Rl = Me 54b Rl = H Se suspendió A1C13 (1.05 equivalentes) en DCM y se adicionó cloruro de ácido 6-bromohexanoico (1 equivalente) . Después de la agitación a temperatura ambiente durante 20 minutos se adicionó o-cresol (1 equivalente) y la mezcla se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 25 minutos. La mezcla de reacción se vertió en agua con hielo y se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica separada se secó sobre Na2S04 y se concentró in vacuo . El producto 54a se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice usando heptano/acetato de etilo (4/1) como fase móvil.
Se sintetizó 54b como se describe anteriormente usando cloruro de ácido 6-bromohexanoico y fenol. 54a: Rendimiento 3.7 g (33 %) MS [M+H]+ = 285.1 y 287.2 (MW+H calculado = 386.2 g/mol) 54b: Rendimiento 620 mg (15 %) MS [M+H]+ = 271.2 (MW calculado = 271.0 g/mol) Síntesis de compuestos 55a y 55b 55a Rl = Me 55b Rl = H Se adicionó DBU (105 µl 701 µmol) a una solución del bromuro 54a (105 mg, 369 µmol) y tritiltiol (204 mg, 738 µmol) en 50 ml de DMSO seco. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 40 minutos y acidificó con H2S04 1 N. La capa acuosa se extrajo con acetato de etilo y se evaporó. Se purificó 55a por RP-HPLC. Se sintetizó 55b de acuerdo al mismo protocolo usando 54b (180 mg, 0 . 66 mmol) . 55a: Rendimiento 173 mg (97 %) MS [M+Na]+ = 503.6 (MW+Na calculado = 503.7 g/mol) 55b: Rendimiento 160 mg (85 %) S [M + Na]+ = 489.5 (MW + Na calculado = 489.3 g/mol) Síntesis de compuestos 56a y 56b 56a Rl = Me, R2 = R3 = 3- (dimetilamino) propilo, 56b Rl = H, R2 = Me, R3 = 3- (N-etil-N-metilamino) propilo Se preparó 56a a partir de 55a (9 mg, 19 µmol) , cloroformiato de p-nitrofenilo y bis (3-dimetilamino-propil) amina (25 µl, 94 µmol) como se describe para el compuesto 16a. Se sintetizó 56b a partir 55b (160 mg, 0.34 mmol), cloroformiato de p-nitrofenilo y N-etil-N,N' dimetil-1, 3-propanodiamina (15c) como se describe para el compuesto 16a. 56a: Rendimiento 12 mg (70 %) como sal de TFA MS [M+Na]+ = 716.8 (MW+Na calculado = 717.0 g/mol) 56b: Rendimiento 80 mg (32 %) como sal de TFA MS [M+Na]+ = 645.6 (MW+Na calculado = 645.4 g/mol) Síntesis de compuestos 57a y 57b 57a Rl = Me, R2 = R3 = 3-dimetilamino-propilo, 57b Rl = H, R2 = Me, R3 = 3- (N-etil-N-metilamino) propilo Se sintetizaron 57a y 57b a partir de 56a (12 mg, 13 µmol, doble sal de TFA) y 56b (80 mg, 110 µmol, sal de TFA) , respectivamente, como se describe para el compuesto 16g. 57a: Rendimiento 9 mg (75 %) como sal de TFA MS [M+Na]+ = 719.0 (MW+Na calculado = 718.7 g/mol) 57b: Rendimiento 60 mg (75 %) como sal de TPA MS [M+Na]+ = 647.4 (MW+Na calculado = 647.4 g/mol) Síntesis de compuestos 58a y 58b 58a Rl = Me, R2 = R3 = 3- (dimetilamino) propilo, 58b Rl = H, R2 = Me, R3 = 3- (N-etil-N-metilamino) propilo Se agitaron 57a (1 equivalente, 8 mg, 9 µmol) , cloroformiato de 4-nitrofenilo (3.5 equivalentes, 6 mg, 30 µmol), DIEA (6 equivalentes, 9 µl , 52 µmol) y DMAP (1 equivalente, 1 mg, 9 µmol) en 1 ml de DCM seco a temperatura ambiente durante 45 minutos bajo atmósfera de nitrógeno. Los productos volátiles se evaporaron y se adicionó ácido acético. La mezcla se disolvió en acetonitrilo/agua .l/l (v/v) y el carbonato 58a se purificó por RP-HPLC. Se preparó el carbonato 58b igualmente de 57b (135 mg, 0.18 mmol) . 58a Rendimiento 7 mg (70 %) como sal de TFA MS [M+Na]+ = 883.8 (MW+Na calculado = 884.1 g/mol) 58b: Rendimiento 110 mg (77 %) como sal de TFA MS [M+Na]+ = 812.4 (MW+Na calculado = 812.5 g/mol) Síntesis de compuesto 59 Se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 30 minutos Rh-Insul Xina)y44.5 mg, 7.7 µmol, carbonato 58a (1 equivalente, 7 mg, dSAmmol), DIEA (15 µl, 88 µmol) y DMAP (1.5 mg, 12 µmol) en 0.3 ml de DMSO. La mezcla de reacción se neutralizó con ácido acético y se diluyó con acetonitrilo/agua l/l (v/v) . La purificación por RP-HPLC dio el compuesto intermedio protegido con Trt apropiado. Después de la liof lizacio-n se mezcló el compuesto intermedio protegido por Trt con TFA/trietilsilano 95/5 (v/v) y se agitó durante 5 minutos . Se removieron los volátiles bajo flujo de nitrógeno y se purificó por 59 por RP-HPLC y se liofilizó. La posición de la modificación de insulina se verificó por reducción de DTT y análisis de MS. 59: MS [M+3H]3+ = 2095.5 [M+4H]4+ = 1572.2 (MW calculado = 6288 g/mol) 60 se preparó de 59 (0.17 µmol) como se describe para el compuesto 9a. 60: Tiempo de retención de SEC: 19.5 minutos Síntesis de compuesto 61 Se agitaron 57b (70 mg, 90 µmol), DSC (161 mg, 630 µmol), DIEA (192 µl, 1.1 mmol), y DMAP (11 mg, 90 µmol) en 1 ml de acetonitrilo seco a temperatura ambiente durante 14 h bajo atmósfera de nitrógeno. Los volátiles se evaporaron y se adicionó ácido acético. La mezcla se disolvió en acetonitrilo/agua 1/1 (v/v) y el carbonato 61 se purificó por RP-HPLC. 61: Rendimiento 40 mg (51 %) como sal de TFA MS [M+Na]+ = 788.4 (MW+Na calculado = 788.5 g/mol) Síntesis de compuesto 62 Se agitaron 61 (12 mg, 13 µmol) y NPys-Cl (4 mg, 21 µmol) en 1 ml de DCM a -10°C durante 2 h bajo atmósfera de nitrógeno. Los volátiles se removieron bajo flujo de nitrógeno y se purificó 62 por RP-HPLC. 62: Rendimiento 7 mg (65 %) como sal de TFA MS [M+Na]+ = 700.9 (MW+Na calculado = 701.4 g/mol) Se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 3 h 09 mg de rhGH desalada (ProspecTany, Israel, MW 22250 g/mol, 40 nmol) en 200 amortiguador de borato 50 mM (pH 8.0), 8 µl de carbonato 62 en acetonitrilo (38 mM, 300 nmol), y 40 µl de DMSO. La mezcla de solventes y los compuestos de bajo peso molecular se reemplazaron por agua y subsiguientemente por amortiguador de acetato (25 mM, pH 4.2, Tween 20 al 0.005 %) por ultrafiltración usando un filtro Centricon 5 (corte5 kDa) . Se adicionaron 8 µl (80 nmol) de DTT 10 mM en amortiguador de acetato 25 mM, pH 4.2, se adicionó Tween al 0.005 % y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Los compuestos de bajo peso molecular se removieron por ultrafiltración usando un filtro Centricon 5 y amortiguador de acetato 25 M, pH 4.2, Tween al 0.005 % como eluato . Después de la concentración a un volumen de 100 µl , (Centricon 5) se adicionaron 20 µl (100 nmol) de maleimida-PEG5k 5 mM en agua y 80 µl de amortiguador de fosfato 0.5 M pH 7.0. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos . Se separó el monoconjugado 63 por SEC (columna: Superdex 200, velocidad de flujo: 0.75 ml/min) usando amortiguador de fosfato 10 mM pH 7.4, NaCl 150 mM, y Tween 20 al 0.005 % como la fase móvil. El eluato recolectado (aproximadamente 1.0 ml) se diluyó con 0.5 ml de amortiguador que contiene NaN3 al 0.05 % y se usó directamente para la determinación de la velocidad de liberación. 63: tiempo de retención de SEC: 17.5 minutos -Liberación de insulina o fluoresceína-insulina de conjugados én amortiguador pH 7.4 La liberación de (fluoresceína) -insulina de los conjugados 9a a 9h, 21a a 21f, 30a, 30b, 43, 50, y 60, de (fluoresceína) -insulina, liberación de fluoresceína-GLP-1 de 53b y liberación de rhGH de 63 se efectuó por hidrólisis de ligador en amortiguador acuoso pH 7.4. Los eluatos recolectados de SEC de los conjugados de (fluoresceína) -insulina (ver anteriormente) , conjugado de fluoresceína-GLP~ 1 y conjugado de rhGH, respectivamente, se incubaron a 37°C y se tomaron muestras en intervalos de tiempo y se analizaron por RP-HPLC (conjugados de insulina) o SEC (conjugado de rhGH, conjugado de fluoresceína-insulina y conjugado de fluoresceína-GLP-1) y detección de UV 215 a 280 nm o detección por VIS a 500 nm. Los picos que correlacionan con el tiempo de retención de la insulina nativa, fluoresceína-insulina, fluoresceína-GLP-1, y rhGH, respectivamente, se integraron y graficaron contra el tiempo de incubación, se aplicó un programa de ajuste a la curva para estimar el tiempo medio correspondiente de la liberación.
Liberación de insulina de conjugados 45 y 46 de hidroqel Se pesaron 4 mg de 45 o 2 mg de 46 en un tubo de prueba y se incubaron con 1 ml de amortiguador HEPES 10 mM pH 7.4, NaCl 150 mM, Tween al 0.005% a 37°C. Se tomaron muestras de 45 µl en diferentes intervalos de tiempo y se analizaron de forma cuantitativa para rh-insulina por un ensayo de RP-HPLC. Los picos de rh-insulina se integraron y se obtuvo la concentración de rh-insulina de una curva normal. Se ajustó una cinética de liberación de primer orden a los puntos de datos para dar la vida media del ligador .
Análisis por MS de insulina liberada de compuestos 9a, 9b y 30a Se analizaron las muestras de insulina liberada de amortiguador (ver anteriormente) por espectrometría de masas . La Figura 11 muestra los espectros de masa de insulina liberada de los compuestos 9a, 9b y 30a. El espectro de masas de la insulina libera del compuesto 9a muestra claramente un producto secundario principal (indicado por flechas) , que corresponde a la insulina modificada irreversiblemente por pentanoilo. En este caso, la remoción del grupo de enmascaramiento de pentanoilo no fue por hidrólisis sino por transferencia de acilo a la insulina. El espectro de masa de la insulina liberada del compuesto 9a y 30a no muestra modificación.
Liberación de fluoresceína-insulina de conjugado 9d y 9e en plasma humano al 80 % La liberación de fluoresceína-insulina de 9d o 9e se efectuó por hidrólisis en plasma humano al 80 % en HEPES 20 mM, pH 7.4 a 37°C. Se tomaron muestras a intervalos de tiempo y se analizaron por SEC y detección de VIS a 500 nm. Los picos que correlacionan al tiempo de retención de fluoresceína-insulina se integraron y graficaron contra el tiempo de incubación, se aplicó un programa de ajuste a la curva para estimar el tiempo medio correspondiente de la liberación.
Tabla: Hidrólisis de profármacos poliméricos nd = no determinado Lo anterior se considera ilustrativo de los principios de la ivención y puesto que se presentarán numerosas modificaciones para aquellos expertos en la técnica, se propone limitar la invención a la construcción y operación exacta descritas. Todas las modificaciones equivalentes caen dentro del alcance de las reivindicaciones .
Abreviaciones Boc t-butiloxicarbonilo DBU 1 , 3 -diazabiciclo [5.4.0] undeceno DCM diclorómetano iv) Dde 1- (4, 4-dimetil-2, 6-dioxo-ciclohexiliden) 3-metil-butilo DIC diisopropilcarbodii ida DIEA diisopropiletilamina DMAP dimetilamino-piridina DMF N,N-dimetilformamida DMSO dimetilsulfoxido Dpr ácido diaminopropiónico DSC disuccinidilcarbonato EDTA ácido etilendiaminatetra-acético Et etilo Eq equivalente estoiquiométrico fmoc 9-fluorenilmetoxicarbonilo Fmoc-Ado-OH ácido Fmoc-8-amino-3 , 6-dioxaoctanoico HFIP hexafluoroisopropanol HEPES N- (2-hidroxietil)piperazina-N' - (ácido 2- etanosulfónico) HOBt N-hidroxibenzotriazol LCMS espectrometría de masas acoplada a cromatografía líquida Mal maleimidopropionilo Me metilo Mmt 4-metoxitritilo MS espectro de masa MW masa molecular Npys 3-nitro-2-piridinasulfenilo PyBOP benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidino- fosfonio-hexafluorofosfato rHSA albúmina de suero humano recombinante rhGH hormona humana de crecimiento, recombinante RP-HPLC cromatografía líquida de alto desempeño de fase invertida RT temperatura ambiente SEC cromatografía de exclusión de tamaño Suc succinimidopropionilo TES trietilsilano TFA ácido trifluoroacético THF tetrahidrofurano UV luz ultravioleta VIS visual Z benciloxicarbonilo Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Claims (88)

  1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Profármaco en cascada, polimérico, caracterizado porque comprende: una amina que contiene una porción biológicamente activa; - un grupo de enmascaramiento que tiene al menos un nucleófilo y que es distinto del portador.
  2. 2. Profármaco de conformidad con la reivindicación 1 o reactivo ligador de profármaco, de cascada, polimérico, correspondiente que tiene la siguiente estructura: caracterizado porque T es D o A D que es un residuo de una amina que contiene una porción biológicamente activa; y A que es un grupo saliente; X es una porción separadora como R5-Y6 Y?, ?2 pueden ser cada uno ya sea O, S o NR6, independientemente entre sí . Y3, Y5 pueden ser cada uno ya sea 0, S, independientemente entre sí, Y4 es O, NR6, o -C(R7) (R8)- Y6 es 0, S, NR6, succinimida, maleimida, enlaces carbono-carbono insaturados o cualquier heteroátomo que contiene un par de electrones libres o está ausente. R3 se selecciona de hidrogeno, alquilo lineal, ramificado o cíclico, sustituido o no sustituido, o heteroalquilo, arilos, arilos sustituidos, heteroarilos sustituidos o no sustituidos, ciano, nitro, halógeno, carboxi, carboxialquilo, alquilcarbonilo o carboxamidoalquilo; R4 se selecciona independientemente de hidrógeno, alquilo lineal, ramificado o cíclico, ' sustituido o no sustituido o heteroalquilo, arilo, arilo sustituido, h.eteroarilo sustituido o no sustituido, alcoxi lineal, ramificado o cíclico sustituido o no sustituido, heteroalquiloxi lineal, ramificado o cíclico, sustituido o no sustituido, o heteroariloxi, ciano, halógeno; R5 se selecciona de alquilo lineal, ramificado o cíclico, sustituido o no sustituido, o heteroalquilo, arilos, arilos sustituidos, heteroarilos sustituidos o no sustituidos; R7 y R8 se seleccionan de hidrógeno, alquilo lineal, ramificado o cíclico, sustituido o no sustituido, o heteroalquilo, arilos, arilos sustituidos, heteroarilos sustituidos o no sustituidos, carboxialquilo, alquilcarbonilo, caboxamidoalquilo, ciano, o halógeno; R6 se selecciona de hidrógeno, alquilo lineal, ramificado o cíclico, sustituido o no sustituido, o heteroalquilo, arilos, arilos sustituidos, heteroarilos sustituidos o no sustituidos; Rl es un polímero; W se selecciona de alquilo lineal, ramificado o cíclico, sustituido o no sustituido, arilos, arilos sustituidos, heteroalquilo lineal, ramificado o cíclico, sustituido o no sustituido, heteroarilos sustituidos o no sustituidos Nu es un nucleófilo; n es cero o un número entero positivo; y Ar es un hidrocarburo aromático multisustituido o un heterocíclo aromático multi-sustituido.
  3. 3. Profármaco de conformidad con la reivindicación 1 o reactivo ligador de profármaco, de cascada, polimérico, correspondiente, que tiene la siguiente estructura : caracterizado porque T es D o A D que es un residuo de una amina que contiene una molécula biológicamente activa, y A que es un grupo saliente; X es una porción separadora tal como R5-Y6 Yi/ Y pueden ser cada uno ya sea O, S o NR6, independientemente entre sí, Y3, Y5 pueden ser cada uno ya sea O, S, independientemente entre sí, Y4 es O, NR6, o -C(R7) (R8) - Y6 es O, S, NR6, succinimida, maleimida, enlaces carbono-carbono insaturados o cualquier heteroátomo que contiene un par de electrones libres o está ausente. R2 y R3 se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo lineal, ramificado o cíclico, sustituido o insustituido, o heteroalquilo, arilos, arilos sustituidos, heteroarilos sustituidos o no sustituidos, ciano, nitro, halógeno, carboxi, carboxialquilo, alquilcarbonilo o carboxamidoalquilo; R4 se selecciona independientemente de hidrógeno, alquilo lineal, ramificado o cíclico, sustituido o no sustituido, o heteroalquilo, arilo, arilo sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, alcoxi lineal, ramificado o cíclico sustituido o no sustituido, heteroalquiloxi lineal, ramificado o cíclico, sustituido o no sustituido, ariloxi, o heteroaríloxi, ciano, halógeno; R5 se selecciona de alquilo lineal, ramificado o cíclico, sustituido o no sustituido, o heteroalquilo, arilos, arilos sustituidos, heteroarilos sustituidos o no sustituidos; R7 y R8 se seleccionan de hidrógeno, alquilo lineal, ramificado o cíclico, sustituido o no sustituido, o heteroalquilo, arilos, arilos sustituidos, heteroarilos sustituidos o no sustituidos, carboxialquilo, alquilcarbonilo, caboxamidoalquilo, ciano, o halógeno; R6 se selecciona de hidrógeno, alquilo lineal, ramificado o cíclico, sustituido o no sustituido, o heteroalquilo, arilos, arilos sustituidos, heteroarilos sustituidos o no sustituidos; Rl es un polímero; W se selecciona de alquilo lineal, ramificado o cíclico, sustituido o no sustituido, arilos, arílos sustituidos, heteroalquílo lineal, ramificado ' o cíclico sustituido o no sustituido, heteroarilos sustituidos o no sustituidos Nu es un nucleófilo; n es cero o un número entero positivo; y Ar es un hidrocarburo aromático multisustituido o un heterocíclo aromático multí-sustituido .
  4. 4. Profármaco de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la porción biológicamente activa se selecciona del grupo de porciones biológicas que consisten de agentes o biopolímeros biológicamente activos de molécula pequeña.
  5. 5. Profármaco de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque los biopolímeros se seleccionan del grupo de biopolímeros que consisten de proteínas, polipéptidos, oligonucleótidos y ácidos nucleicos peptídicos.
  6. 6. Profármaco de conformidad con la reivindicación 5 , caracterizado porque los polipéptidos se seleccionan del grupo de polipéptidos que consisten de ACTH, adenosina-desaminasa, agalsidasa, albúmina, alfa-1-antitripsina (AAT) , inhibidor de alfa-1-proteinasa (API) , alteplasa, anistreplasa, serina-proteasa ancrod, anticuerpos (monoclonal o policlonal, y fragmentos o fusiones), antitrombina III, antitripsinas, aprotinina, asparaginasas, bifalina, proteínas morfogénicas óseas, calcitonina (salmón), colagenasa, DNasa, endorfinas, enfuvirtida, encefalinas, eritropoyetinas, factor Vlla, factor VIII, factor Villa, factor IX, fibrinolisina, proteínas de fusión, hormonas estimuladoras del folículo, factor estimulador de colonia de granulocitos (G-CSF) , galactosidasa, glucagon, péptidos tipo glucagon tal como GLP-1, glucocerebrosidasa, factor estimulador de colonia de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) , proteína activadora de fosfolipasa (PLAP) , gonadotropina coriónica (hCG) , hemoglobinas, vacunas de hepatitis B, hirudina, hialuronidasas, idurnonidasa, globulinas, vacunas de influenza, interieucinas (1 alfa, 1 beta, 2, 3, 4, 6, 10, 11, 12), antagonista de receptor de IL-1 (rhlL-lra) , insulinas, interferones (alfa 2a, alfa 2b, alfa 2c, beta la, beta Ib, gamma la, gamma Ib) , factor de crecimiento de queratínocitos (KGF) , factores de crecimiento transformante, lactasa, leuprólido, levotiroxina, hormona luteinizante, vacuna de lyme, péptido natriurético, pancrelipasa, papaina, hormona paratiroide, PDGF, pepsina, factor activador de plaquetas, acetilhidrolasa (PAF-AH) , prolactina, proteína C, octreotida, secretina, sermorelina, superóxido-dismutasa (SOD) , somatropinas (hormona de crecimiento) , somatostatina, estreptocinasa, sucrasa, fragmento de toxina de tétano, tilactasa, trombinas, timosina, hormona estimulante de tiroides, tirotropina, factor de necrosis tumoral (TNF) , receptor de TNF-IgG Fe, activador de plasminógeno de tejido (tPA) , TSH, urato- oxidasa, urocinasa, vacunas, y proteína vegetal tal como lectina o ricino.
  7. 7. Profármaco de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la proteína es una proteína preparada por tecnología de ADN recombinante.
  8. 8. Profármaco de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la proteína se selecciona del grupo de proteínas que consisten de fragmentos de anticuerpo, proteínas de unión de cadena individual, anticuerpos catalíticos y proteínas de fusión.
  9. 9. ' Profármaco de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la proteína se selecciona del grupo de proteínas que consisten de anticuerpos, calcitonina, G-CSF, GM-CSF, eritropoyetinas, hemoglobinas, interieucinas, insulinas, interferones, SOD, somatropina, TNF, receptor de TNF-IgC Fe, péptidos tipo glucagon tal como GLP-1.
  10. 10. Profármaco de conformidad con - la reivindicación 4, caracterizado porque los agentes biológicamente activos de molécula pequeña se seleccionan del grupo de agentes que consisten de agentes activos en el sistema nervioso central, agentes anti-infectivos, antineoplásticos, antibacterianos, antifungales, analgésicos, anticonceptivos, anti-inflamatorios, esteroidales, vasodilatadores, vasoconstrictivos, y cardiovasculares con al menos un grupo amino primario o secundario.
  11. 11. Profármaco de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque los agentes biológicamente activos de molécula pequeña se seleccionan del grupo que consiste de daunorrubicina, doxorrubicina, idarrubicina, mitoxantron, aminoglutetimida, amantadita, diafenilsulfon, etambutol, sulfadiazina, sulfamerazina, sulfametoxazol, sulfaleño, clinafloxacina, moxifloxacina, ciprofloxaxina, enoxacina, norfloxacina, neomicina B, esprectinomicina, canamicina A, meropenemo, dopamina, dobutamina, lisinoprilo, serotonina, acivicina y carbutamida.
  12. 12. Profármaco de conformidad con la reivindicación 2 o 3, caracterizado porque R4 se selecciona del grupo de sustituyentes pequeños que consisten de hidrógeno, metilo, etilo, etoxi, metoxi, y otros alquilos lineales, cicloalquilos o alquilos ramificados y heteroalquilo que consisten de uno a seis átomos de carbono.
  13. 13. Profármaco de conformidad con la reivindicación 2 o 3, caracterizado porque Rl se selecciona del grupo de polímeros que consisten de polímeros basados en polialquiloxi tal como poli (propilenglicol) o poli (etilenglicol) , dextrano, quitosan, ácido hialurónico y derivados, alginato, xilano, mannano, carragaen, agarosa, celulosa, almidón, hidroxietil-almidón (HES) y otros polímeros basados en carbohidratos, poli (alcoholes vinílicos) , poli (oxazolinas) , poli (anhídridos) , poli (orto- esteres), poli (carbonatos) , poli (uretanos) , poli (ácidos acrílicos) , poli (acrilamidas) tal como poli (hidroxipropilmetacrilamida) (HMPA), poli (acrilatos) , poli (metacrilatos) tal como poli (hidroxietilmetacrilato) , poli (organofosfacenos) , poli (siloxanos) , poli (vinilpirrolidona) , poli (cianoacrilatos) , poli (esteres) tal como poli (ácido láctico) o poli (ácidos glicólicos), poli (iminocarbonatos) , poli (aminoácidos) tal como poli (ácido glutámico), colágeno, gelatina, copolímeros, copolímeros injertados, polímeros reticulados, y copolímeros de bloque de los copolímeros listados anteriormente .
  14. 14. Profármaco de conformidad con la reivindicación 2 o 3, caracterizado porque Rl es un hidrogel .
  15. 15. Profármaco de conformidad con la reivindicación 2 o 3, caracterizado porque Rl es un polímero ramifico o hiper-ramificado.
  16. 16. Profármaco de conformidad con la reivindicación 2 o 3, caracterizado porque Rl es un dendrímero o polímero de estrella, denso.
  17. 17. Profármaco de conformidad con la reivindicación 2 o 3, caracterizado porque Rl es un biopolímero.
  18. 18. Profármaco de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque Rl es una proteína.
  19. 19. Profármaco de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la proteína es albúmina, un anticuerpo, fibrina, caseína o cualquier otra proteína de plasma.
  20. 20. Profármaco de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 19, caracterizado porque Rl incluye además una o más sustancias biológicamente activas .
  21. 21. Profármaco de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 20, caracterizado porque el polímero de Rl tiene al menos un grupo funcional para enlace a X.
  22. 22. Profármaco de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque al menos un grupo funcional se selecciona del grupo de grupos funcionales que consisten de ácido carboxílico y derivados activados, amino, maleimida, tiol, ácido sulfónico y derivados, carbonato y derivados, carbamato y derivados, hidroxilo, aldehido, cetona, hidrazina, isoacianato, isotiocianato, ácido fosfórico y derivados, ácido fosfónico y derivados, haloacetilo, haluros de alquilo, acriloilo, agentes de arilación tal como fluoruros de arilo, hidroxílamina, disulfuros tal como piridil-disulfuro, vinil-sulfona, vinil-cetonas, diazoalcanos, compuestos de diazoacetilo, epóxido, oxirano, y aziridina.
  23. 23. Profármaco de conformidad con la reivindicación 21 o 22, caracterizado porque al menos un grupo funcional se selecciona de grupos funcionales que consisten de tiol, maleimida, amino, ácido carboxílico y derivados, carbonato y derivados, carbamato y derivados, aldehido y haloacetilo.
  24. 24. Profármaco de conformidad con una de las reivindicaciones 21 a 23, caracterizado porque el enlace o grupo formado entre X y Rl se selecciona del grupo de enlaces o grupos que consisten de disulfuro, S-succinimido, amida, amino, éster carboxílico, sulfonamida, carbamato, carbonato, oxima, hidrazona, urea, tiourea, fosfato, fosfonato .
  25. 25. Profármaco de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24, caracterizado porque los enlaces o grupos formados entre X y Rl se seleccionan del grupo de enlaces o grupos que consisten de S-succinimido, amida, carbamato y urea.
  26. 26. Reactivo ligador de profármaco, de cascada, polimérico, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 25, caracterizado porque A se selecciona del grupo de grupos salientes que consisten de cloruro, bromuro, fluoruro, nitrofenoxi, imidazolilo, N- hidroxisuccinimidilo , N-hidroxibenzotriazolilo , N- hidroxiazobenzotriazolilo, pentafluorfenoxi y N- hidroxisulfosuccinimidilo .
  27. 27. Profármaco de conformidad con la reivindicación 2 o 3, caracterizado porque la porción se selecciona de manera preferente del grupo de porciones que consisten de
  28. 28. Profármaco de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la porción
  29. 29. Profármaco de conformidad con la reivindicación 27 o 28, caracterizado porque R6 puede ser un Nu-W adicional .
  30. 30. Profármaco de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 29, caracterizado porque es 5 en las cuales R9, RIO, Rll y R12 se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo o heteroalquilo sustituido o no sustituido, arilo o heteroarilo sustituido o no sustituido.
  31. 31. Profármaco de conformidad con la X0 reivindicación 30, caracterizado porque R9 , 10, Rll, y R12 se seleccionan independientemente de hidrógeno o alquilo sustituido o no sustituido.
  32. 32. Profármaco de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 31, caracterizado porque Nu se 5 selecciona del grupo de nucleófilos que consisten de grupos aminos primarios, secundarios y terciarios, tiol, ácido carboxílico, hidroxilamina, hidrazina y heteroarilo que contiene nitrógeno.
  33. 33. Profármaco de conformidad con la 0 reivindicación 30 o 31, caracterizado porque R7 y/o R8 no son hidrógeno .
  34. 34. Profármaco de conformidad con la reivindicación 2 o 3, caracterizado porque Ar se selecciona del grupo de porciones que tienen la siguiente estructura: 5 y en donde W es 0, S, o N, independientemente entre sí.
  35. 35. Profármaco de conformidad con la reivindicación 2 o 3, caracterizado porque Ar es un hidrocarburo aromático monocíclico o dicíclico o heterociclo aromático.
  36. 36. Profármaco de conformidad con la reivindicación 2 o 3, caracterizado porque Ar es un hidrocarburo aromático De cinco miembros o seis miembros, o heterociclo aromático.
  37. 37. Reactivo ligador de profármaco, de cascada, polimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-36 o anteriores, caracterizado porque T es un grupo saliente A, para conjugación covalente con una porción biológicamente activa.
  38. 38. Reactivo ligador de profármaco, de cascada, polimérico de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque la porción biológicamente activa es una molécula que contiene amina.
  39. 39. Reactivo ligador de profármaco, de cascada, polimérico de conformidad con la reivindicación 37 o 38, caracterizado porque la porción biológicamente activa es un péptido, polipéptido o proteína.
  40. 40. Método para la síntesis de un profármaco polimérico, caracterizado porque comprende: - proporcionar una molécula de inicio de la fórmula II - sintetizar al menos un compuesto intermedio de la molécula de inicio de la fórmula II; - unir una porción D biológicamente activa que contiene amina, a al menos un compuesto intermedio para formar el profármaco polimérico; en donde - Y2 se selecciona de O, S o NR6 Y3 se selecciona de O, o S X es una porción separada tal como R5-Ys; R3 se selecciona independientemente de hidrógeno, alquilo lineal, ramificado o cíclico sustituido o no sustituido, o heteroalquilo, arilo sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, ciano, nitro, halógeno, carboxi, carboxialquilo, alquilcarbonilo o carboxamidoalquilo; R4 se selecciona de hidrógeno, alquilo lineal, ramificado o cíclico, sustituido o no sustituido, o heteroalquilo, arilo, arilo sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, alcoxi lineal, ramificado o cíclico, sustituido o no sustituido, heteroalquiloxi lineal, ramificado o cíclico, sustituido o no sustituido, ariloxi o heteroariloxi, ciano o halógeno; R5 se selecciona de alquilo lineal, ramificado o cíclico, sustituido o no sustituido o heteroalquilo, arios, arilos sustituidos, heteroarilos sustituidos o no sustituidos; R6 se selecciona de hidrógeno, alquilo lineal, ramificado o cíclico, sustituido o no sustituido, o heteroalquilo, arilo sustituido, heteroarilo insustituido o sustituido; y Ye es O, S, NR6, succinimida, maleimida, enlaces carbono-carbono insaturados o un heteroátomo que contiene un par de electrones libres; n es cero o un número entero positivo y Ar es un hidrocarburo aromático multi-sustituido o un heterocicló aromático multi-sustituido.
  41. 41. .Método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque un primer compuesto intermedio de al menos los compuestos intermedios es una molécula intermedia de la fórmula III sintetizada al Acilar Y2 con y uniendo opcionalmente un primer grupo protector PGX, en donde Un es un nucleófilo; W se selecciona de alquilo lineal, ramificado o cíclico, sustituido o no sustituido, arilos, arilos sustituidos, heteroalquilo lineal, ramificado o cíclico, sustituido o no sustituido, heteroarilos sustituidos o no sustituidos ; Yi se selecciona del grupo de porciones que consisten de O, S, o NR6 ; Y4 se selecciona del grupo de porciones ue consisten de -C(R7) (R8)-, O, o NR6; R7 y R8 se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo lineal, ramificado o cíclico, sustituido o no sustituido, o heteroalquilo, arilo, arilo sustituido, heteroarilo "sustituido o no sustituido, carboxialquilo, alquilcarbonilo, carboxamidoalquilo, ciano o halógeno, R6 se selecciona de hidrógeno, alquilo lineal, ramificado o cíclico, sustituido o no sustituido, o heteroalquiLo, arilos, arilos sustituidos, heteroarilos sustituidos o no sustituidos.
  42. 42. Método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque un segundo compuesto intermedio del al menos un compuesto intermedio es un compuesto intermedio de la fórmula IV (IV) formado al activar el compuesto de la fórmula III con un agente de activación, en donde A es un grupo saliente y Y5 se selecciona de O o S .
  43. 43. Método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque A se selecciona de cloruro, bromuro, fluoruro, nitrofenoxi, imidazolilo, N- hidroxisuccinimidilo, N-hidroxibenzotriazolilo, N- hidroxiazobenzotriazolilo, pentafluorofenoxi y N- hidroxisulfosuccinimidilo .
  44. 44. Método de conformidad con una de las reivindicaciones 42 o 43, caracterizado porque el agente de activación se selecciona del grupo de agentes de activación que consisten de cloroformiato de 4-nitrofenilo o carbonato de disuccinilo.
  45. 45. Método de conformidad con una de las reivindicaciones 42 o 43, caracterizado porque la porción D biológicamente activa que contiene amina se une al segundo de al menos un compuesto intermedio (Fórmula IV) por desplazamiento del grupo saliente A.
  46. 46. Método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque comprende un paso de remoción del primer grupo protector PGX reversible, del segundo de al menos un compuesto intermedio.
  47. 47. Método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el paso de remoción del grupo protector reversible PGX se lleva a cabo usando un reactivo seleccionado del grupo de reactivos que consisten de ácido trifluoroacético o DTT.
  48. 48. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 46 o 47, caracterizado porque comprende además un paso para unir un polímero Rl a .
  49. 49. Método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque además comprende el paso de remover el primer grupo protector polimérico PGi y unir un polímero Rl a X para formar un tercero de al menos un compuesto intermedio y que tiene una fórmula VI.
  50. (VI) 50. Método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque además comprende el paso de activar el tercero de al menos un compuesto intermedio al usar un agente de activación para formar un cuarto de al menos un compuesto intermedio y que tiene una Fórmula VII y en donde A es un grupo saliente.
  51. (Vil) 51. Método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque A se selecciona de cloruro, bromuro, fluoruro, nitrofenoxi, imidazolilo, N-hidroxisuccinimidilo, N-hidroxibenzotriazolilo, N- hidroxiazobenzotriazolilo, pentafluorofenoxi y N- hidroxisulfosúccinimidilo .
  52. 52. Método de conformidad con la reivindicación 50 o 51, caracterizado porque el agente de activación se selecciona del grupo de agentes de activación que consisten de cloroformiato de 4-nitrofenilo o carbonato de disuccinilo .
  53. 53. Método de conformidad con una de las reivindicaciones 50 a 52, caracterizado porque la porción D biológicamente activa que contiene amina se une al compuesto de la fórmula VII por desplazamiento del grupo A saliente .
  54. 54. Método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque además comprende un paso de hacer reaccionar la molécula de inicio de la Fórmula II con un primer polímero Rl para unir el primer polímero Rl a X.
  55. 55. Método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque además comprende un paso de proteger Y2 con un segundo grupo protector PG2 -
  56. 56. Método de conformidad con la reivindicación 54 o 55, caracterizado porque además comprendé el paso de activar el profármaco' con un agente de activación y hacer reaccionar con una porción D biológicamente activa, que contiene amina, para formar un quinto de al menos un compuesto intermedio y que tiene la fórmula X
  57. 57. Método de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque el agente de activación se selecciona del grupo de agentes de activación que consisten de cloroformiato de 4-nitrofenilo o carbonato de disuccinilo . 58. Método de conformidad con la reivindicación 56 o 57, caracterizado porque el segundo grupo protector PG2 se remueve de Y2 e Y2 se acila con en donde W se selecciona de alquilo lineal, ramificado o cíclico, sustituido o no sustituido, arilos, arilos sustituidos, heteroalquilo lineal, ramificado o cíclico, sustituido o no sustituido, heteroarilos sustituidos o no sustituidos; Nu es un nucléofilo; Yi se selecciona del grupo de porciones que consisten de O, S o NR6; Y4 se selecciona del grupo de porciones que consisten de ~C(R7) (R8)-, O, NR6 ; y
  58. R7 y R8 se seleccionan de hidrógeno, alquilo lineal, ramificado o cíclico, sustituido o no sustituido, o heteroalquilo, arilo, arilo sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, carboxialquilo, alquilcarbonilo, carboxamidoalquilo, ciano o halógeno.
  59. 59. Método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque la remoción del segundo grupo reversible PG2 se lleva a cabo usando un reactivo seleccionado del grupo de reactivos que consisten de ácido trifluoroacético o DTT.
  60. 60. Método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque comprende el paso de unir un primer grupo protector removible PG1 a X y un segundo grupo protector removible PG2 al compuesto de inicio de la Fórmula II y después de la activación usando un agente de activación para formar un sexto de al menos un compuesto intermedio y que tiene la fórmula VIII, en donde A es un grupo saliente
  61. 61. Método de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque A se selecciona del grupo de grupos salientes seleccionados del grupo de grupos salientes que consisten de cloruro, nitrofenoxi, imidazolilo, N-hidroxisuccinimidilo, N- hidroxibenzotriazolilo , N-hidroxiazobenzotriazolilo, pentafluorofenoxi y N-hidroxisulfosuccinimidilo.
  62. 62. Método de conformidad con la reivindicación 60 o 61, caracterizado porque el agente de activación se selecciona del grupo de agentes de activación que consisten de cloroformiato de 4-nitrofenilo o carbonato de disuccinilo.
  63. 63. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 60 a 62, caracterizado porque la porción D biológicamente activa que contiene amina se une al sexto de al menos un compuesto intermedio por desplazamiento del grupo saliente A.
  64. 64. Método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque comprende el paso de remover el primer grupo protector PGX de X y unir un polímero Rl .
  65. 65. Método de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado porque el segundo grupo protector PG2 se remueve de Y2 y Y2 se acila con en donde W se selecciona de alquilo lineal, ramificado o cíclico, sustituido o no sustituido, arilos, arilos sustituidos, heteroalquilo lineal, ramificado o' cíclico, sustituido o no sustituido, heteroarilos sustituidos o no sustituidos; Nu es un nucleófilo; Yl se selecciona del grupo de porciones que consisten de O, S o NR6; Y4 se selecciona del grupo de porciones que consisten de -C(R7) (R8)-, 0, o NR6 ; y R7 y R8 se seleccionan de hidrógeno, alquilo lineal, ramificado o cíclico, sustituido o no sustituido o heteroalquilo, arilo, arilo sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, carboxialquilo, alquilcarbonilo, carboxamidoalquilo, ciano o halógeno.
  66. 66 . Método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque el segundo grupo protector PG2 se remueve de Y2 e Y2 se acila con en donde W se selecciona de alquilo lineal, ramificado o cíclico, sustituido o no sustituido, arilos, arilos sustituidos, heteroalquilo lineal, ramificado o cíclico, sustituido o no sustituido, heteroarilos sustituidos o no sustituidos; Nu es un nucleófilo; Yl se selecciona del grupo de porciones que consisten de O, 'S o NR6; Y4 se selecciona del grupo de porciones que consisten de -C(R7) (R8)-, 0, o NR6 ; y R7 y R8 se seleccionan de hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, alquilo ramificado o alquilo cíclico, arilo, arilo sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido o heteroarilo, carboxialquilo, alquilcarbonilo, carboxamidoalquílo, cíano o halógeno.
  67. 67. Método de conformidad con la reivindicación 66 , caracterizado porque el paso de remover el primer grupo protector PGi de X y unir un polímero Rl .
  68. 68. Método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque comprende el paso de acilar Y2 con para formar un tercero de al menos un compuesto intermedio; en donde W se selecciona de alquilo lineal, ramificado o cíclico sustituido o no sustituido, arilos, arilos sustituidos, heteroalquilo lineal, ramificado o cíclico sustituido o no sustituido, heteroarilos sustituidos o no sustituidos ; Nu es un nucleófilo; Yl se selecciona del grupo de porciones que consisten de O, S o NR6 ; Y se selecciona del grupo de porciones que consisten de -C(R7) (R8)-, 0, o NR6 ; y R7 y R8 se seleccionan de hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, alquilo ramificado o alquilo cíclico, arilo, arilo sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido o heteroarilo, carboxialquilo, alcoxicarbonilo, carboxamidoalquilo, ciano o halógeno.
  69. 69. Método de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque además el paso de activar el tercero de al menos un compuesto intermedio al usar un agente de activación para formar un séptimo de al menos un compuesto intermedio y que tiene una Fórmula VII y en donde A es un grupo saliente (Vil)
  70. 70. Método de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque A se selecciona del grupo de grupos salientes que consisten de cloruro, nitrofenoxi, imidazolilo, N-hidroxisuccinimidilo, N-hidroxibenzotriazolilo, N-hidroxiazobenzotriazolilo, pentafluorofenoxi y N-hidroxisulfosuccinimidilo .
  71. 71. Método de conformidad con la reivindicación 69 o 70, caracterizado porque el agente de activación se selecciona del grupo de agentes de activación que consisten de cloroformiato de 4-nitrofenilo o carbonato de disuccinilo.
  72. 72. Método de conformidad con una de las reivindicaciones 69 a 71, caracterizado porque la porción D biológicamente activa que contiene amina se une al compuesto de la fórmula VII por desplazamiento del grupo saliente A.
  73. 73. Método de conformidad con una de las reivindicaciones 40 a 72, caracterizado porque la molécula de inicio de la fórmula II se reemplaza por una molécula de inicio de la fórmula Ilb llb en donde R2 se selecciona de hidrógeno, alquilos lineales, ramificados o cíclicos, sustituidos o no sustituidos, o heteroalquilos, arilos, heteroarilos sustituidos o no sustituidos, ciano, nitro, halógeno, carboxi, carboxialquilo , alquilcarbonilo o carboxamidoalquilo .
  74. 74. Método para hidrolizar el profármaco de de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 36, caracterizado porque comprende el paso de colocar el profármaco en solución con un pH de aproximadamente 7.4.
  75. 75. Método de conformidad con la reivindicación 74, caracterizado porque la solución es un fluido extra- celular.
  76. 76. Método de administración de una porción que contiene amina a un organismo vivo, caracterizado porque comprende : - un primer paso de proporcionar un profármaco en cascada polimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 39; - un segundo paso de administrar el profármaco en cascada polimérico al organismo vivo; y - un tercer paso de escindir la porción que contiene amina del profármaco en cascada polimérico por medio de una reacción sustancialmente no enzimática.
  77. 77. Método de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado porque el tercer paso se lleva a cabo con un fluido extra-celular.
  78. 78. Método de conformidad con una de las reivindicaciones 76 a 77, caracterizado porque la reacción sustancialmente no enzimática comprende un paso de hidrólisis .
  79. 79. Método de conformidad con una de las reivindicaciones 76 a 78, caracterizado porque la reacción sustancialmente no enzimática comprende un paso de ciclización intramolecular o catálisis intramolecular.
  80. 80. Método de conformidad con una de las reivindicaciones 76 a 79, caracterizado porque además comprende el paso de proteger de forma esférica al menos una parte de ligador por un portador estéricamente demandante.
  81. 81. En un profármaco en cascada polimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 39, un método para escindir la porción que contiene amina del portador caracterizado porque es por una reacción sustancialmente no enzimática del ligador que contiene nucleófilo .
  82. 82. Método de conformidad con la reivindicación 81, caracterizado porque la reacción sustancialmente no enzimática se lleva a cabo a un pH de aproximadamente 7.4
  83. 83. Método de conformidad con la reivindicación 81 u 82, caracterizado porque la porción que contiene amina unida al portador se escinde en un fluido extra-celular.
  84. 84. Método de conformidad con una de las reivindicaciones 81 a 83, caracterizado porque la reacción sustancialmente no enzimática comprende un paso de hidrólisis .
  85. 85. Método de conformidad con una de las reivindicaciones 81 a 84, caracterizado porque la reacción sustancialmente no enzimática comprende un paso de ciclización o catálisis intramolecular.
  86. 86. Método de conformidad con una de las reivindicaciones 81 a 85, caracterizado porque además comprende el paso de proteger esféricamente al menos parte del ligador que contiene nucleófilo por un portador estéricamente demandante.
  87. 87. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 81 a 86, caracterizado porque la porción que contiene amina es una porción biológicamente activa.
  88. 88. Método para proporcionar una concentración terapéuticamente útil de una molécula biológicamente activa, caracterizado porque es por escisión in vivo de la molécula biológicamente activa del profármaco de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 39.
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