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MXPA06010555A - Conjugados de calicheamicina. - Google Patents

Conjugados de calicheamicina.

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Publication number
MXPA06010555A
MXPA06010555A MXPA06010555A MXPA06010555A MXPA06010555A MX PA06010555 A MXPA06010555 A MX PA06010555A MX PA06010555 A MXPA06010555 A MX PA06010555A MX PA06010555 A MXPA06010555 A MX PA06010555A MX PA06010555 A MXPA06010555 A MX PA06010555A
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MX
Mexico
Prior art keywords
calicheamicin
conjugate
antibody
formulation
concentration
Prior art date
Application number
MXPA06010555A
Other languages
English (en)
Inventor
Arthur Kunz
Mark Edward Ruppen
Justin Keith Moran
Joseph Thomas Rubino
Neera Jain
Nitin Krishnaji Damle
Erwin Raymond Arsene Boghaert
Philip Ross Hamann
Eugene Vidunas
Original Assignee
Wyeth Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wyeth Corp filed Critical Wyeth Corp
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Abstract

Los anticuerpos Anti-Lewis Y son descritos. Los metodos a preparar conjugados de drogas monomericas citotoxica/vehiculo con una carga de droga significativamente mas alta que en los procedimientos previamente reportador y con una disminucion en la agregacion y baja fraccion de conjugados (LCF) se describe. Los conjugados de derivados de drogas citotoxicas/anticuerpo, con posiciones que comprenden los conjugados y usos de los conjugados tambien se describe. Especificamente, derivados de calicheamicina monomerico/anticuerpo anti-Lewis Y, composiciones que comprenden los conjugados y usos de los conjugados tambien son descritos.

Description

CONJUGADOS DE CALICHEAMICINA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con métodos para la producción de la droga citotóxica calicheamicina monomérica conjugada a un anticuerpo lgG1 que tiene una mayor carga de droga y sustancialmente una fracción reducida baja de conjugado (LCF). Particularmente, la invención se relaciona con el conjugado con el anticuerpo anti-Lewis Y calicheamicina. La invención también se relaciona con los usos de estos conjugados.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El uso de la quimioterapia citotóxica ha mejorado la sobre vivencia de pacientes que sufre de diversos tipos de cánceres. Usado contra enfermedades neoplásicas seleccionadas tales como, por ejemplo, leucemia linfocítica aguda en población joven (Kalwinsky, D. K. (1991) 3: 39-43, 1991) y los linfomas hodking (Dusenbery, K. E, et al. (1988) American Journal of Hematology, 28: 246-251), los cócteles de drogas citotóxicas pueden inducir curas completas. Desafortunadamente, la quimioterapia, como se aplica actualmente no resulta en las remisiones completas en la mayoría de los cánceres. Múltiples razones pueden explicar cadencia relativa de eficacia (para revisar ver: Gottesman, M.M. (2002) Ann. Rev. of Med. 53, 615-62; Mashima, T. et al. (1998) Biotherapy: 12(6), 947-952; Mareel, M.M. et al. (1986) Radiotherapy and Oncology: 6, 135-142. Entre estos, en índice bajo terapéutico de la mayoría de los quimioterapéuticos es un objetivo similar para las mejoras farmacéuticas. El índice bajo terapéutico refleja el margen estrecho entre la dosis eficaz y toxica de una droga, que puede impedir la administración de dosis suficientemente altas necesarias para erradicar un tumor y obtener un efecto curativo.
Una estrategia para sobreponerse a este problema es el uso de la llamada bala mágica. La bala mágica fue concebida por Ehrlich (Ehrlich, P. (Collected Studies on Immunity 2, 442-447)y consiste de un compuesto citotóxico que es enlazado químicamente a un anticuerpo. Enlazar una droga anticáncer citotóxica a un anticuerpo que reconozca un antígeno asociado al tumor puede mejorar el índice terapéutico de la droga. Este anticuerpo debería reconocer idealmente un antígeno asociado a tumor (TAA) que es expresado exclusivamente en la superficie de las células di tumor. Esta estrategia permite el suministro del agente citotóxico al sitio del tumor mientras se minimiza la exposición de los tejidos normales. El anticuerpo puede suministrar el agente citotóxico específicamente al tumor y por lo tanto reducir la toxicidad sistémica.
Los conjugados de droga desarrollados para la farmacoterapia sistémica son agentes citotóxicos específicos adjetivos. El concepto involucra acoplar un agente terapéutico a una molécula portadora con especificidad para una población celular objetivo definido. Los anticuerpos con alta afinidad con antígenos son una escogencia natural como partes objetivan tez. Uno de tales antígenos es el antígeno Lewis Y, que es expresado en tejidos normales, pero el nivel de expresión es mayor en ciertos tipos de tumor. El antígeno Lewis Y (Le?) es encontrado en células de algunos carcinomas de pecho, colon, gástricos, esofágicos, pancráticos, duodenales, de pulmón, de vejiga y de riñon y tumores neuroendocrinos de células gástricas e isletas. Su presencia en algunas células tumorales no esta acompañada por un incremento en sus niveles de suero, así el anticuerpo especifico Lewis Y administrado no se liga significativamente por el antígeno soluble.
Con la disponibilidad de anticuerpos monoclonales de alta afinidad, los prospectos terapéuticos anticuerpos-objetivados se han vuelto promisorios. Las sustancias toxicas que han sido conjugadas a anticuerpos monoclonales incluyen toxinas, drogas citotóxicas de bajo peso molecular, modificadores de respuesta biológica y radionuclidos. Los conjugados de anticuerpos-toxina son frecuentemente llamados inmunotoxinas, en donde los inmunoconjugados consisten de anticuerpos y drogas de bajo peso molecular tales como el metrotesato y la atria ecina que son llamados quimioinmonoconjugados. Los inmonumoduladores contienen modificadores de la respuesta biológica que son conocidos por tener funciones regulatorias, tales como linfosinas, factores de crecimiento y factores de veneno de cobra activado por complemento (CVF). Los radioinmunoconjugados consisten de isótopos radioactivos, que pueden ser usados como terapéuticos para matar células por su radiación o uso de imágenes. El suministro especifico mediado por anticuerpos de drogas citotóxicas a células tumorales es esperado no solamente que aumente su eficacia antitumor, si no también que impida la toma no objetivada por tejidos normales, por lo tanto incrementando sus índices terapéuticos.
Los inmonuconjugados usan un miembro de la familia potente de agentes antibacterianos y antitumorales, conocidos colectivamente como calicheamicinas o el complejo LL-E33288, que fueron desarrollados para el uso en tratamiento de cánceres. La más potente de las calicheamicinas es designada como ?V, que es referenciada aquí simplemente como gama. Estos compuestos contiene un metiltrisolfuro que pueden hacerse reaccionar con tioles apropiados para formar bisulfuros, al mismo tiempo introducir un grupo funcional tal como una hidracida u otro grupo funcional que es útil para sujetar un derivado de calicheamicina a un portador. Las calicheamicinas contienen una cabeza de hierro de enediina (figura 1) que es activada por la reducción del enlace -S-S- que causa rupturas en el ADN de doble hélice.
MYLOTARG® (Sievers, E.L. et al (1999) Blood: 93, 3678-3684), también referido como CMA-676 o CMA, es la única droga comercialmente disponible que trabaja de acuerdo con este principio. MYLOTARG® (gemtuzumab ozogamicin) está aprobado actualmente para el tratamiento de leucemia mieloide aguda en pacientes de edad avanzada. La droga consiste de un anticuerpo contra el CD33 que se liga al calicheamicina por medio de un enlazador ácido hidrolizadle. El análogo de disulfuro de calicheamicina gama N-acetil semi-sintético fue usado para la conjugación (patente Estadounidense Número 5,606,040 5,770,710). Esta molécula, dimetil hidracida de N-acetil gama calicheamicin, es abreviada aquí como CM.
Diversas líneas de evidencia experimental refuerzan la idea de que usar anticuerpos que reconocen diferentes TAAs del CD33 pueden expandir el rango de aplicación de la enseñanza de la bala mágica. Múltiples conjugados de anticuerpos y agentes quimioterapéuticos (inmunoconjugados) han probado su habilidad para curar un anfitrión de tumores xenoingertados. Algunos ejemplos de TAAs objetivados son: HER2/neu (Starling, J.J, et al. (1992) Bioconjugate Chemistry: 3(4), 315-322; DiJoseph, J.F et al. (2002) European Journal of Cáncer: 38 (suppl. 7), S150); PSCA (Sjogren, H.O, et al. (1997) Cáncer Res.: 57, 4530-4536); glicoproteinas tipo mucina (MIRACL-26457) (Zhang, S. et al. (1997) Int. J. Cáncer, 73: 50-56; Wahl, A.F. et al (2000) Int. J. Cáncer, 93: 590-600); EGFR (Furokawa, K., et al. (1990) Mol. Immunol., 27: 723-732); CEA (Kitamura, K., et al, (1994) Proc.- Natl. Acad. Sci. USA., 91 : 12957-12961); CD22 (Clarke, K., et al. (2000) Cáncer Res., 60: 4804- 4811) y Lewisy- antigen (Ley) (Morgan, A., et al (1995) Immunology, 86: 319-324). Para lograr un efecto citotóxico, los anticuerpos contra estos antígenos de superficie fueron conjugados para la exotoxina de seutomonas (DiJoseph, J.F et al., S150), maytansinoid (Sjogren, H.O, et al. 4530-4536; Zhang, S. et al. 50-56), calicheamicina (Wahl, A.F. et al. 590-600; Clarke, K., et al. 4804-4811), RNase (Furokawa, K., et al. 723-732), alcaloide vinca (Kitamura, K., et al., 12957-12961) o doxorubicina (Morgan, A., et al. 319-324).
El uso de conjugados de derivados de calicheamicina monomérica/portador en el desarrollo de terapias para una amplia variedad de cáncer ha sido limitado tanto por la disponibilidad de los agentes de objetivo especifico (portadores), como también de las metodologías de conjugación que resultan en la formación de agregados de proteína cuando la cantidad del derivado de calicheamicina que es conjugado al portador (es decir la carga de la droga)es incrementada. Ya que cargas de droga mayores incrementa la potencia inherente del conjugado, es deseable tener la mayor droga cargada sobre el portador como se ha consistente con la retención de la afinidad de la proteína portadora La naturaleza hidrofóbica natural de muchas drogas citotóxicas, incluidas las calicheamicinas, crea dificultades en la preparación de conjugados de drogas monoméricas con buenas cargas de droga. La hidrofobicidad incrementada en el enlace, lo mismo que la distancia covalente incrementada que separa el agente terapéutico del portador (anticuerpo), parece exacerbar este problema. La presencia de proteína agregada, que puede no ser específicamente toxica e inmunogénica, y por lo tanto puede ser removida para aplicaciones terapéuticas, hace que el proceso de escalamiento industrial para la producción de estos conjugados sea más difícil y disminuya la producción de los productos.
La cantidad de calicheamicina cargada sobre la proteína portadora (carga de la droga), la cantidad de agregado que es formado en la reacción de conjugación, y la producción de conjugado monomérico purificado final que puede ser obtenido están todas relacionadas. En algunos casos, es frecuentemente difícil hacer conjugados en producciones útiles en cargas útiles para aplicaciones terapéuticas usando las condiciones de reacción descritas en la patente Estadounidense número 5,053,394 debido a la excesiva agregación. Estas condiciones de reacción utilizan DMF como el codisolvente en la reacción de conjugación. Los métodos que permiten una mayor carga de droga/producción sin agregación y las perdidas inherentes de material entonces se requieren. Las mejoras para reducir la agregación se describen en la patente Estadounidense números 5,712,374 y 5,714,586, y en la solicitud de patente Estadounidense números 2004/0082764 A1 y 2004/0192900 A1 , que se incorporan aquí en su totalidad.
La tendencia de los conjugados de calicheamicina para agregar es especialmente problemática cuando las reacciones de conjugación se llevan a cabo con los enlazadores descritos en las patentes Estadounidenses números 5,877,296 y 5,773,001 , que se incorporan aquí en su totalidad. En este caso, un gran porcentaje de los conjugados producidos están en una forma agregada, y es bastante difícil purificar los conjugados hechos por estos procesos, usando el proceso descrito en la patente Estadounidense número 5,877,296, para el uso terapéutico. Para algunas proteínas portadoras, los conjugados con aun cargas más modestas son virtualmente imposibles de hacer excepto a pequeña escala. Esto es especialmente verdad para anticuerpos en donde el isotipo del anticuerpo y los patrones de glicosilación diferencial afectan el proceso de conjugación. Consecuentemente, existe una necesidad para vislumbrar nuevos y mejorados métodos para conjugar calicheamicinas a anticuerpos particulares, minimizando así la cantidad de agregación y permitiendo una alta carga de droga como sea posible con una producción razonable de producto.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra la estructura de un anticuerpo anti-Lewis Y (hu3S193) conjugado a la calicheamicina (hu3S193-AcBut-CM).
La figura 2A y 2B muestran el efecto de un anticuerpo anti-Lewis Y conjugado a la calicheamicina (hu3S193-AcBut-CM) sobre Ley+and" células como gráficos de la frecuencia de ocurrencia contra el ED50 (ng/ml); la figura 2A muestra la línea de células Ley+ AGS y la figura 2B muestra la línea de células Ley" PC3MM2. La figura 2C muestra el efecto del hu3S193-AcBut-CM sobre la célula Ley+attd" como un gráfico del dobles de CMA contra la expresión del Lewis Y sobre la superficie de la célula (es decir, las líneas de células Ley+ LOVO, N87, HCT8/S11-R1 , AGS, LNCaP, NCI-H358 y las líneas de células Ley" PC3-MM2, A431 , y PANC-1), con n representando el número de determinaciones ED5o independientes.
La figura 3 muestra la actividad in vivo de un anticuerpo anti-Lewis Y conjugado a la calicheamicina (hu3S193-AcBut-CM) contra xenoinjertos de carcinoma gástrico N87 como gráficos de volumen de tumor (cm3) contra periodo de crecimiento del tumor (días); La figura 3A muestra los conjugados de control de CMA Y RITUXAN®-AcBut-CM y la figura 3B muestra el hu3S193 y el hu3S193-AcBut-CM.
La figura 4 muestra la actividad ¡n vivo de un anticuerpo anti-Lewis Y conjugado a la calicheamicina (hu3S193-AcBut-CM) contra el xenoinjerto del carcinoma de próstata LNCaP como un gráfico de volumen de tumor (cm3) contra el periodo de crecimiento del tumor (dias).
La figura 5 muestra la actividad in vivo de un anticuerpo anti-Lewis Y conjugado a la calicheamicina (hu3S193-AcBut-CM) contra los xenoinjertos de carcinoma de colon LOVO como gráficos de volumen de tumor (cm3) contra el periodo de crecimiento del tumor (días); la figura 5A muestra un conjugado de control RITUXAN-AcBut-CM y la figura 5B muestra el hu3S193 y hu3S193-AcBut-CM.
La figura 6 muestra la actividad in vivo de un anticuerpo anti-Lewis Y conjugado a la calicheamicina (hu3S193-AcBut-CM) contra los xenoinjertos de carcinoma de colon LOVO como gráficos de volumen de tumor (cm3) contra periodo de crecimiento de tumor (días); la figura 6A muestra los conjugados de control CMA y RITUXAN-AcBut-CM y la figura 6B muestra el hu3S193 y hu3S193- AcBut-CM administrado en 4 µg Q4Dx3 o Q4Dx4.
La figura 7 muestra una comparación de la secuencias de aminoácido de los anticuerpos anti-Lewis Y maduros secretados hu3S193 (wt) y G193 (mt) lgG1 de cadenas pesadas en las cuales los sitios mutantes son resaltados en negrilla y los CDRs son puestos en negrilla y sombreados.
La figura 8 muestra un comparación de las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas del lgG1 de hu3S193 (Wyeth wt) hu3S193 (Ludwig Institute for Cáncer Research llamado de aquí en delante como LICR wt) en el cual los CDRs son puestos en negrilla y sombreados y las diferencias alotípicas son resaltadas y puestas en negrilla.
La figura 9 muestra la inhibición del crecimiento inditro del A431 (figura 9A) y el A431/Ley (figura 9B) de las células epidermoides del carcinoma de un conjugado de anticuerpo anti-Lewis Y a la calicheamicina (CMD-193) como un gráfico del control en porcentaje (CMA) contra la concentración de calicheamicina (cal. eq., ng/ml).
La figura 10 muestra la inhibición del crecimiento in vivo de los anticuerpos anti-Lewis y conjugados a la calicheamicina (hu3S193-AcBut-CM y CMD-193) contra los xenoinjertos de carcinoma gástrico N87 como gráficos de volumen de tumor (cm3) contra periodo de crecimiento del tumor (días); la figura 10A muestra el conjugado del control CMA, la figura 10B muestra el CMD-193 y el hu3S193-AcBut-CM, y la figura 10C muestra el anticuerpo limpio.
La figura 11 muestra la inhibición del crecimiento in vivo de los anticuerpos anti-Lewis Y conjugados a la calicheamicina (hu3S193-AcBut-CM y CMD-193) contra los xenoinjertos de carcinoma de pulmón L2987 como gráficos de volumen de tumor (cm3) contra periodo de crecimiento de tumor (días); la figura 11A muestra el conjugado de control CMA y la figura 11 B muestra el CMD-193.
La figura 12 muestra la inhibición del crecimiento in vivo de los anticuerpos anti-Lewis Y conjugados a la calicheamicina (hu3S193-AcBut-CM y CMD-193) contra los xenoinjertos de carcinoma de pulmón L2987 como gráficos del número de ratones con un tumor de menor volumen que el volumen promedio inicial de cada grupo (%) contra el periodo de crecimiento del tumor (días); la figura 12A muestra el conjugado de control CMA y la figura 12B muestra el CMD-193.
La figura 13 muestra la inhibición del crecimiento ¡n vivo de un anticuerpo anti-Lewis Y conjugados a la calicheamicina (CMD-193} contra los xenoinjertos de carcinoma de pulmón L2987 como un gráfico de volumen de tumor(cm3) contra el periodo de crecimiento del tumor (días).
La figura 14 muestra la inhibición del crecimiento in vivo de un anticuerpo anti-Lewis Y conjugados a la calicheamicina (CMD-193) contra los xenoinjertos del carcinoma epidermoide A431/Ley como un gráfico de volumen de tumor (CM3)contra periodo de crecimiento del tumor (días).
La figura 15 muestra la inhibición de crecimiento ¡n vivo de un anticuerpo anti-Lewis Y conjugado a la calicheamicina (CMD-193) contra los xenoinjertos de carcinoma epidermoide A431/LEY como gráficos de volumen de tumor (cm3) contra periodo de crecimiento del tumor (días); la figura 15A muestra la eficacia del conjugado de control CMA y la figura 15B muestra la eficacia del CMD.
La figura 16 muestra la inhibición del crecimiento ¡n vivo de un anticuerpo anti-Lewis Y conjugados a la calicheamicina (CMD-193) contra el xenoinjerto del carcinoma epidermoide A431/ley como un gráfico del número de ratones con un volumen menor de tumor que el volumen de promedio inicial de cada grupo (%) contra el periodo de crecimiento del tumor (días); la figura 16A muestra la eficacia del conjugado del control CMA y la figura 16B muestra la eficacia del CMD.
La figura 17 muestra la inhibición del crecimiento in vivo de un anticuerpo anti-Lewis Y conjugados a la calicheamicina (CMD-193) contra células de xenoinjertos del carcinoma de colon LS174T como gráficos de volumen de tumor (cm3) contra el periodo del crecimiento del tumor (días); la figura 17A muestra la eficacia de los conjugados de control CMA y la figura 17B muestra la eficacia del CMD.
La figura 18 muestra la inhibición del crecimiento in vivo de los anticuerpos anti-Lewis Y conjugados a la calicheamicina (CMD-193 y hu3S193-AcBut-CM) contra los xenoinjertos del carcinoma de colon LOVO como gráficos de volumen de tumor (cm3) contra periodo del crecimiento del tumor (días); la figura 18A muestra la eficacia del conjugado de control CMA y G193,las figuras 10B y 18C muestran la eficacia del CMD en Z4DX3 y Q4DX4, respectivamente, y las figuras 18D y 18E muestran la eficacia del CMD en diversos intervalos de tiempo.
La figura 19 muestra la supervivencia de ratones desnudos luego de la inyección con varias dosis de un anticuerpo anti-Lewis Y conjugado a la calicheamicina (CMD-193) como un gráfico de supervivencia en porciento contra el periodo de observación (días).
La figura 20 muestra la especificidad de ligado de un anticuerpo anti-Lewis Y conjugado a la calicheamicina (CMD-193)al antígeno Lewis Y como un gráfico de Lewis Y y antígenos estructuralmente relacionados contra las unidades de resonancia BIAcore.
La figura 21 muestra la actividad in vivo de un anticuerpo anti- Lewis Y conjugado a la calicheamicina (hu3S193-AcBut-CM) contra xenoinjertos del carcinoma de colon HCT8S11 como gráficos de masa tumoral (g) contra periodo del crecimiento del tumor (días); la figura 21 A muestra pequeños tumores y la figura 21 B muestra grandes tumores.
La figura 22 muestra la actividad in vivo de un anticuerpo anti-Lewis Y conjugado a la calicheamicina (CMD-193) contra xenoinjertos del carcinoma de pecho MX1 como un gráfico de crecimiento de tumor relativo contra periodo del crecimiento del tumor (días).
La figura 23 muestra la actividad in vivo con base en diferentes cargas de droga de un anticuerpo anti-Lewis Y conjugado a la calicheamicina (CMD-193) contra el xenoinjerto de carcinoma gástrico N87 como un gráfico de masa tumoral (g) contra periodo de crecimiento del tumor (días).
La figura 24 muestra la actividad de citotoxicidad dependiente de complemento inditro (CDC) de un anticuerpo anti-Lewis Y (G193) y su conjugado de calicheamicina (CMD-193) contra células de carcinoma gástrico N87 como un gráfico de citotoxicidad en porcentaje contra concentración del anticuerpo (µg/ml).
La figura 25 muestra la actividad de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo inditro (ADCC) de un anticuerpo anti-llllewis Y (G193) y su conjugado de calicheamicina (CMD-193) contra las células del carcinoma epidermoide A431/Ley; La figura 25A muestra la actividad contra las células del carcinoma Lewis Y+++ A431 y la figura 25B muestra la actividad contra las células de carcinoma y Lewis Y negativo A431.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención suministra procesos para preparar un conjugado de calicheamicina que comprende hacer reaccionar a un pH de alrededor de 7 hasta alrededor de 9 (preferiblemente alrededor de 8,2) (i) un derivado de enlazador de enlazador hidrolizadle de calicheamicina activada y (ii) un anticuerpo lgG1 en la presencia de un miembro de la familia de desoxicolato o una sal del mismo, lo mismo que conjugados preparados por este proceso. También se suministra por la presente invención composiciones que comprenden un conjugado de un derivado enlazador hidrolizadle con calicheamicina covalentemente sujetados a un anticuerpo anti-Lewis Y.
En una modalidad, el miembro de la familia desoxicolato tiene una de las siguientes estructuras: (A) En donde Dos de Xi a X5 son H o OH y los otros tres son independientemente O o H; Ri es (CH2)N en donde n es 0-4 y R2 es OH, NH(CH2)MCOOH, NH(CH2)mSO3H, o NH(CH2)mPO3H2 en donde m es 1-4. O (B) En donde Uno de Xi a X4 es H o OH y los otros tres son ¡ndependientemente O o H; Ri es (CH2)n en donde n es 0-2 y R2 es OH, NH(CH2)mCOOH, o NH(CH2)rt.SO3H. en donde m es 2.
O (C) En donde uno de Xi a X es OH y los otros tres son H; Ri es (CH2)n en donde n es 0-2 y R2 es OH, NH(CH2)2SO3H.
El miembro de la familia desoxicolato puede también ser ácido quenodeoxicolico, giodeocoxicolato, ácido udosodeoxicolico, ácido glicodeoxicolico, ácido taurodeoxicolico, o tauroquenodeoxicolico.
Preferiblemente, el miembro de la familia desoxicolato es ácido de oxicolico a una concentración de cerca de 10mM.
En otra modalidad, el derivado de calicheamicina es de cerca de tres a cerca de 9% en peso en peso del anticuerpo lgG1 preferiblemente cerca de 7% en peso del anticuerpo lgG1.
El anticuerpo lgG1 , en una modalidad, es un anticuerpo anti-Lewis Y que, preferiblemente es el anticuerpo anti-Lewis G193 o Hu3s193.
En otra modalidad, el derivado de calicheamicina es un derivada de N-acilo de calicheamicina o un análogo de disolfuro de calicheamicina. Preferiblemente, el derivado de calicheamicina es N-acetil gama calicheamicina dimetil hidracida (N-acetil calicheamicina DMH) Todavía otra modalidad, el enlazador hidrolizadle es ácido 4-(4-acetilefenoxi) butanoico (AcBut).
El proceso puede comprender adicionalmente opcionalmente purificar el conjugado de calicheamicina. Tal purificación puede comprender la separación cromatografica y la ultrafiltración/diafiltración.
Preferiblemente, la separación cromatografica es cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) o cromatografía de interacción hidrofobica (HIC). Luego de la etapa de purificación, preferiblemente el promedio de carga del conjugado esta entre cerca de 5 a 7 moles de calicheamicina formol de anticuerpo lgG1 y en la fracción baja de conjugado (LCF) del conjugado es menos de cerca de 10%.
Los conjugados de calicheamicina de la presente invención preferiblemente tienen un KD de cerca de 1 x 10~7 M a cerca de 4 x 10~7 M y, más preferiblemente, un KD de cerca de 3,4 x 10.7 M. Tales conjugados ligan al antígeno Lewis Y y no ligan al Lewis X y a los antígenos del grupo H-2 de sangre, tiene actividad citotóxica, y tiene actividad antitumoral. Preferiblemente, el conjugado esta presente en la composición en una cantidad terapéuticamente efectiva.
Así, la presente invención suministra una composición que comprende un conjugado de n-acetil gama calicheamicina dimetil hidracida-ácido 4-(4-acetilfenoxi) butanoico (N-acetil calicheamicina DMH-AcBut) ligado covalentemente a G193, en donde el promedio de carga esta entre cerca de 5 a cerca de 7 moles de N-acetil calicheamicina DMH formol de G193 y la fracción conjugada baja (LCF) del conjugado es menos de cerca de 10%.
La presente invención también suministra un proceso para preservar la actividad biológica de estas composiciones que comprenden: poner en contacto la composición con un crioprotector, un tensoactivo, un agente amortiguador, y un electrólito en una solución; y liofilizar la solución.
En una modalidad, ei conjugado esta a una concentración de cerca de 0,5mg/mL hasta cerca de 2mg/mL. Preferiblemente, el conjugado, esta en una concentración de 1 mg/mL.
En otra modalidad, el crioprotector esta en una concentración de cerca de 1 ,5% a cerca de 6% en peso. El crioprotector puede ser un alcohol de azúcar o un carbohidrato; preferiblemente, el crioprotector es trealosa, manitol, sorbitol, y, más preferiblemente, el crioprotector es sacarosa a una concentración de cerca de 5%.
El tensoactivo en una modalidad esta a una concentración de cerca de 0,005% hasta cerca de 0,05%. Preferiblemente, el tensoactivo es polisorbato 80 a una concentración de 0,01% en peso o tween 80 a una concentración de cerca de 0,01 %.
En otra modalidad, el agente amortiguador esta a una concentración de cerca de 5mM a cerca de 50mM. Preferiblemente, el agente amortiguador es tris a una concentración de cerca de 20mm.
El electrolito en otra modalidad esta a una concentración de cerca de 5mM a cerca de 100mM. Preferiblemente, el electrolito es una sal de sodio o de potasio y, más preferiblemente el electrolito es NaCI a una concentración de cerca de 10mM.
Antes de la liofilización, en una modalidad, el pH está cerca de 7,8 a cerca de 8,2 y, preferiblemente, el pH está en cerca de 8,0.
En una modalidad, la liofilización comprende: congelar la solución a una temperatura de cerca de -35° a cerca de -50°C; inicialmente secar la solución congelada a una presión d secado primaria de cerca de 20 a 80 micrones en una temperatura de almacenamiento de cerca de -10° a cerca -40°C durante 24 a 78 horas; y secar en segundo lugar el producto seco congelado a una segunda presión de secado de cerca de 20 a cerca de 80 micrones a una temperatura de almacenamiento de cerca de +10° a cerca de +30°C durante de 15 a 30 horas. Preferiblemente, el congelado se lleva a cabo a cerca de -45°C; el secado congelado inicial se hace a una presión de secado primaria de cerca de 60 micrones a una temperatura de almacenamiento de cerca de -30°C durante 60 horas; y la etapa de secado secundaria es a una presión de secado de cerca de 60 micrones y a una temperatura de almacenamiento de cerca de +25°C durante cerca de 24 horas.
El proceso puede opcionalmente comprender agregar un agente de abultado antes de la liofilización. Preferiblemente, el agente de abultado esta a una concentración de cerca de 0,5 a cerca de 1 ,5% en peso y, más preferiblemente, el agente de abultado es de estran 40 a una concentración de cerca de 0,9% en peso o almidón de hidroxietilo 40 a una concentración de cerca de 0,9% en peso.
La presente invención suministra adicionalmente una formulación que comprende una composición de conjugado de calicheamicin-anticuerpo anti-Lewis Y descrita anteriormente, un crioprotector, un tensoactivo, un agente amortiguador, y un electrolito.
Un método para tratar cáncer u otro desorden proliferativo también se suministra por la presente invención el cual comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de las composiciones descritas aquí, que también pueden ser usadas en la fabricación de un medicamento para tratar el cáncer.
Estas composiciones pueden ser administradas como una monoterapia de segunda línea o como una terapia da combinación de primera línea.
Preferiblemente, el cáncer es positivo para el antígeno Lewis Y y, más preferiblemente, el cáncer es un carcinoma. También, preferiblemente, el cáncer es un cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer de pecho, cáncer de próstata o cáncer colorectal.
Los métodos de la presente invención pueden ser practicados en combinación con un agente bioactivo tal como, por ejemplo, un agente anticáncer.
También se suministra por la presente invención kits que comprenden (i) un contenedor que sostiene cualquiera de las formulaciones de la presente invención; y (ii) instrucciones para reconstituir la formulación con un diluyente a una concentración de conjugado en la formulación reconstituida dentro del rango de 0,5mg/mL a cerca de 5mg/ml.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención suministra procesos para preparar conjugados de calicheamicina. Los procesos involucran hacer reaccionar, a un pH entre cerca de 7 a cerca de 9, (i) una calicheamicina activada-derivado de enlazador hidrolizadle y (ii) un anticuerpo lgG1 , por ejemplo, un anticuerpo anti-Lewis Y en la presencia de un miembro de la familia desoxicolato o una sal de ellos, lo mismo que los conjugados producidos así. También se suministra por la presente invención composiciones que tienen conjugados de una calicheamicina-enlasador hidrolisable covalentemente ligado a un anticuerpo anti-Lewis Y. los procesos también se suministran para preservar la actividad biológica de estas composiciones que involucran poner en contacto la composición con un crioprotector, un tensoactivo, un agente de amortiguador, y electrolito en una solución; y liofilizar la solución. Las formulaciones de calicheamicina-anticuerpo-Lewis Y como conjugados, un crioprotector, un tensoactivo, un agente de amortiguador, y electrolito son suministradas adicionalmente, los mismo que los artículos de fabricación. Finalmente, la presente invención suministra métodos para tratar el cáncer u otros desordenes proliferativos por medio de administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de tales composiciones/formulaciones, incluyendo los usos de estas composiciones/formulaciones en la fabricación de medicamentos para tratar el cáncer u otras enfermedades proliferativas. Se describe más adelante diversas modalidades de la presente invención.
Las condiciones de conjugaciones establecidas han sido aplicadas a la formación de MYLOTARG (referida a también como CMA-676 o CMA) y CMC-544, un conjugado de anticuerpo G5 anti-CD22 humanizado/44 calicheamicina. Ambos de estos son anticuerpos igG4. Ya que la introducción de MYLOTARG, ha sido aprendida, por medio del uso de la cromatografía de intercambio iónico, que la calicheamicina no es distribuida en estos tipos de anticuerpos de una manera uniforme u homogénea. Aunque la carga promedio de estos conjugados esta entre 0.1 a 10 o 15 moles de calicheamicina por mol de anticuerpo, la mayor parte de la calicheamicina esta sobre aproximadamente la mitas del anticuerpo, mientras que otras mitades existen en una fracción conjugada baja (LCF) que contienen solo pequeñas cantidades de calicheamicina.
Métodos mejorados para conjugar drogas citotóxicas tales como las calicheamicinas portadores, minimizando así la cantidad de agregación y permitiendo una mayor carga uniforme de la droga con una producción significativamente mejorada del producto conjugado se llevo a cabo durante el desarrollo de CMC-544. Un ejemplo específico es que el G5/44-anticuerpo anti-CD22 humanizado-NAc-calicheamicina gamma DMH AcBut como conjugado (es decir CMC-544). La reducción de la cantidad de LCF a <10% del total del anticuerpo fue deseada para el desarrollo del CMC-544, y diversas opciones para la reducción de los niveles del LCF fueron consideradas. Otros atributos del inmonoconjugado, tales como el antígeno que liga la citotoxicidad, no deben ser afectadas por la ultima solución. Las opciones consideradas incluyen modificaciones genéticas y físicas de la molécula del anticuerpo, técnicas de separación cromatografica, o modificación de las condiciones de reacción.
La reacción del anticuerpo G5/44 con la NAc-gamma calicheamicina-DMH-AcBut-OSu usando las condiciones de la reacción antigua (CMA-676 Condiciones del Proceso) resulto en un producto con propiedades físicas similares (carga de droga, LCF) y agregación como el CMA-676. Sin embargo, el alto nivel (50-60%) del LCF presente después de la conjugación se considero indeseable. Las condiciones de reacción óptimas fueron determinadas por medio de metodología de diseño experimental estadístico en el cual las variables de la reacción clave, tales como temperatura, pH, entrada de derivado de calicheamicina, y concentración de aditivo, fueron evaluadas. Para poder reducir el LCF a <10%, la entrada de derivado de calicheamicina fue incrementada desde 3% hasta 8.5% (p/p) con relación a la cantidad de anticuerpo en la reacción. El aditivo fue cambiado de ácido octaonico o su sal a una concentración de 200mM (proceso CMA) a ácido decanoico o su sal a una concentración de 37.5 mM. Las condiciones de reacción que incorporan estos cambios redujeron el LCF por debajo del 10 por ciento mientras que se incremento la carga de calicheamicina, y se llama de aquí en adelante como Condiciones de Proceso CMC-544.
El ¡ncremento en la entrada de calicheamicina incremento la carga de droga desde 2.5 a 3.0 por ciento en peso hasta 5.0-9.0 (mas típicamente 5.5-8.5) por ciento en peso, y resulto en ningún incremento en agregación de proteínas en la reacción. Debido a la reacción del agregado y el LCF, las Condiciones del Proceso CMC-544 resultaron en un producto más homogéneo.
Debido a variaciones en la secuencia de aminoácidos y el iso tipo no todos los anticuerpos muestran las mismas características físicas y condiciones de reacción y las condiciones de reacción deben ser adaptadas a cada anticuerpo específico. Cuando las condiciones de reacción de la conjugación CMA-676 fueron usadas con un anticuerpo lgG1 , por ejemplo, un anticuerpo anti-Lewis Y, del conjugado resultante tenía propiedades físicas similares (carga de droga, LCF, y agregación) que el CMA-676, y el alto nivel (50-60%) de LCF presente después de la conjugación de considero indeseable. Usando las condiciones modificadas desarrolladas para el CMC-544 con un anticuerpo lgG1 resulto en un producto con menor LCF, pero la cantidad de agregado producida en las reacciones se considero muy alta. Se determino que los ácidos de bilis específicos, la familia de desoxicolato, o sus sales trabajaron como los mejores aditivos para reducir tanto el LCF como el agregado en este caso. Una comparación de un conjugado de anticuerpo lgG1 preparado con los aditivos de tanto CMA-676, CMC-544 y el nuevo proceso optimizado se muestra en la tabla 1 (Comparación de Octanoato, Decanoato y Desoxicolato).
TABLA 1 La presente invención suministra así un proceso para preparar un conjugado de calicheamicina. En este proceso, un derivado de calicheamicina activada-enlazador hidrolizable y un anticuerpo lgG1 se hacen reaccionar en la presencia de un miembro de la familia desoxicolato o una sal de el. Este proceso minimiza la cantidad de agregación e incrementa significativamente la carga de droga para los conjugados de anticuerpos lgG1.
Cualquier miembro adecuado de la familia desoxicolato de ácido de bilis o una sal de ellos puede ser usado en el presente proceso inventivo. En una modalidad, el miembro de la familia desoxicolato tiene la siguiente estructura: En donde Dos de Xi a X5 son H o OH y los otros tres son independientemente O o OH; Ri es (CH2)n en donde n es 0-4 y R2 es OH, NH (CH2)m COOH, NH(CH2)m SO3H, o NH(CH2)m PO3H2 en donde m es 1-4.
Alternativamente, el miembro de la familia desoxicolato puede tener la siguiente estructura: En donde Uno de Xi a X es H o OH y los otros tres son independientemente O o OH; R-i es (CH2)n donde n es 0-2 y R2 es OH, NH(CH2)m COOH, o NH(CH2)m SO3H, en donde m es 2.
También alternativamente, el miembro de la familia de desoxicolato puede tener la siguiente estructura: En donde Uno de X1 a X es OH y los otros tres son H; R! es (CH2)p en donde n es 0-2 y R2 es OH, NH(CH2)2 SO3H.
Preferiblemente, el miembro de la familia de desoxicolato es ácido desoxicólico, ácido quenodesoxicólico, hiodesoxicolato, ácido urosodesoxicólico, ácido glicodesoxicólico, ácido taurodesoxicólico, ácido tauroursodesoxicólico, o ácido tauroquenodesoxicólico. Más preferiblemente, el miembro de la familia desoxicolato, ácido de desoxicólico, que es preferiblemente presente en una concentración de cerca de 10 mM.
Como se discutía anteriormente, la calicheamicina se refiere a una familia de agentes antibacterianos y antitumorales, como se describió en la patente U.S No. 4,970,198 (ver también la patente U.S. No. 5,108,912). En una modalidad preferida el presente proceso la calicheamicina es un derivado de N-acilo de calicheamicina o un disulfuro de análogo de calicheamicina. Los derivados dihidro de estos compuestos son descriptos en la patente U.S. No 5,037,651 y los derivados N-acilados se describen en la patente U.S. No. 5,079,233. Compuestos relacionados, que también son útiles en esta invención, ¡ncluyen las esperamicinas, descritas en las patentes U.S. Nos. 4,675,187; 4,539,203; 4,554,162; y 4,837,206. Todos de estos compuestos contienen un metiltrisulfuro que puede hacerse reaccionar con los tioles apropiados para formar disulfuros, y al mismo tiempo introducir un grupo funcional tal como una hidracida o núcleofilo similar. Toda la información de las citaciones de patentes anteriormente mencionadas se incorpora aquí como referencia. Dos compuestos que son utilices en la presente invención se escriben en la patente U.S. No. 5,053,394, y se muestran en la tabla 1 de la patente U.S. No. 5,877,296, gamma dimetil hidracida y N-aceti gamma dimetil hidracida.
Preferiblemente, en el contexto de la siguiente invención, la calicheamicina es N-acetil gamma calicheamicina dimetil hidracida (N-acetil calicheamicina DMH). La N-acetil calicheamicina DMH es por lo menos 10 a 100 veces más potente que la mayoría de los agentes quimioterapéuticos citotóxicos de uso actual. Su alta potencia la hace un candidato ideal para la terapia objetivada a anticuerpo, minimizando así la actividad antitumoral mientras se reduce la expocisión no especifica de órganos y tejidos normales.
Así, en una modalidad, los conjugados de la presente invención tienen la formula: En donde: Pr es un anticuerpo lgG1; X es un enlazador que comprende un producto de cualquier grupo reactivo que pueda reaccionar con el anticuerpo lgG1 ; W es una droga citotóxica de la familia de la calicheamicina; m es la carga promedio para un producto de conjugación purificado tal que la calicheamicina constituye de 3-9% del conjugado en peso; y (-X-W)m es un derivado de drogas citotóxicas. Preferiblemente, X tiene la formula (CO-Alk1-Sp1-Ar-Sp2-Alk2-C(Z1)=Q-Sp) En donde Alk1 y Alk2 son independientemente una cadena de alquileno de (CrC10) enlace o ramificada o no ramificada; Sp1 es un enlace, -S-, -O-, -CONH-, -NHCO-.-NR-, -N(CH2CH2)2N-, O -X-Ar-Y-(CH2)n-Z en donde X,Y, y Z son independientemente un enlace, -NR-, -S-,to -O-, con la condición de que cuando n=0, entonces por lo menos uno entre Y y Z debe ser un enlace y Ar es 1 ,2-, 1 ,3-, o 1 ,4-fenileno opcionalmente sustituido con uno, dos, o tres grupos de alquiloconm (C-1-C5), alcoxi (C-?-C4), tioalcoxi (C-?-C ), halógeno, nitro, -COOR, -CONHR, -(CH2)n COOR, -S(CH2)n COOR, -O(CH2)n CONHR, o -S(CH2)n CONHR, con la condición de que cuando Alk1 es un enlace, Sp1 es un enlace; N es un entero entre 0 a 5; R es una cadena con (C-1-C5) ramificada o no ramificada opcionalmente sustituida por uno o dos grupos entre -OH, alcoxi (C?-C ), tioalcoxi (C?-C ), halógeno nitro, dialquilamíno con (C1-C3), o trialquilamonio-A" con (C1-C3) en donde A" es un anión farmacéuticamente aceptable que completa una sal; Ar es 1 ,2-, 1 ,3-, o 1 ,4-fenileno o posteriormente sustituido con uno, dos, o tres grupos entre alquilo (C?-C6), alcoxi (C1-C5), tioalcoxi (C-?-C4), halógeno, nitro, -COOR, -CONHR,-O(CH2)n COOR, -S(CH2)n COOR, - 0(CH2)n CONHR, o -S(CH2)n CONHR, en donde n y R son como se definió anteriormente o 1 ,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6-, 1,7-, 1 ,8-, 2,3-, 2,6-, o 2,7-naftilideno o Con cada naftilideno o fenotiacina funcionalmente sustituidos con uno, dos, tres, o cuatro grupos entre alquilo con (C-i-Cß), alcoxi (C-i a C5), tioalcoxi (C1-C4), halógeno, nitro, -COOR, -CONHR, -O(CH2)n COOR, -S(CH2)n COOR, o -S(CH2)n CONHR en donde n y R son como se definido aquí anteriormente con la condición de que cuando Ar es fenotiacina, Sp1 es en enlace solamente conectado a nitrógeno; Sp2 es un enlace, -S-, o -O-, con la condición de que cuando Alk2 es un enlace, Sp2 es un enlace; Z1 es H, alquilo con (C1-C5) o fenilo opcionalmente sustituido con uno, dos, o tres grupos entre alquilo con (C Cs), alcoxi (C1-C5), tioalcoxi (d-C4), halógeno, nitro, -COOR, -ONHR, -O(CH2)n COOR, -S(CH2)n COOR, -O(CH2)n CONHR, o -S(CH2)n CONHR en donde n y R son como se definió anteriormente; Sp es un radical de (Ci-Ciß) divalente o trivalentes de cadena recta o ramificada, arilo divalente o trivalente o un radical heteroarilo, un radical cicloalquilo divalente o trivalente con (C3-C-?8) o heterocicloalquilo, un radical heteroalil- arilo con (C Ci8)o arilo divalente o trivalente, radical cicloalquilo-o heterocicloalqui-alquilo con (C-?-C18) divalente o trivalente o radical alquilo no saturado con (C2-C?8) divalente o trivalente, en donde el heteroalilo es preferiblemente furilo, tienilo, N-metilpirrolilo, piridinilo, N-metilimadazolilo, oxazolilo, pirimidinilo, quinolilo, isoquinolilo, N-metilcarbazoilo, aminocourmarinilo, o fenazinilo y en donde si Sp es un radical trivalente, Sp puede ser adicionalmente sustituido por dialquilamino, con (C1-C5) inferior, alcoxi (C1-C5) inferior, hidroxi, o grupos alquitio con (C1-C5) inferiores; y Q is = NHNCO-, =NHNCS-, =NHNCONH-, =NHNCSNH-, o =NHO- Preferiblemente, Alk1 es una cadena alquileno con (C-t-C?o)ramif¡cada o no ramificada; Sp es un enlace, -S-, -O-, -CONH-, -NHCO-, o -NR en donde R es como se definió anteriormente, con la condición de que cuando Alk1 es un enlace, Sp1 es un enlace; Ar es 1 ,2-, 1 ,3-, o 1 ,4-fenileno opcionalmente sustituido con uno, dos, o tres grupos entre alquilo con (C-i-Ce), alcoxi (C1-C5), tioalcoxi (C-r C4), halógeno, nitro, -COOR, CONHR, -O(CH2)n COOR, -S(CH2)n COOR, -O(CH2)n CONHR, o -S(CH2)n CONHR en donde n y R son como se definieron anteriormente, o Ar es 1 ,2-, 1 ,3-, 1 ,4-, 1 ,5-, 1 ,6-, 1 ,7-, 1 ,8-, 2,3-, 2,6-, o 2,7-naftilideno cada uno opcionalmente sustituido con uno, dos, tres, o cuatro grupos entre alquilo (C-?-C6), alcoxi (C-1-C5), tioalcoxi (C-1-C4), halógeno, nitro, -COOR, -CONHR, -O(CH2)n COOR, -S(CH2)n COOR, o -S(CH2)n CONHR.
Z1 es una alquilo (C1-C5), o fenilo opcionalmente sustituido con uno, dos, o tres grupos entre alquilo (C1-C5), alcoxi (C1-C4), tioalcoxi (C-i-C4), halógeno, nitro, -COOR, -CONHR, -O(CH2)n COOR, -S(CH2)n COOR, -O(CH2)n CONHR, o -S(CH2)n CONHR.
Alk2 y Sp2 son juntos un enlace. Sp y Q son como se definió inmediatamente el anterior. En le presente proceso, la calicheamicina es preferiblemente agregar a la reacción en cerca de 3 a cerca de 9% en peso del anticuerpo lgG1 y más preferiblemente alrededor del 7% en peso del anticuerpo lgG1.
Los conjugados de la presente invención utilizan la calicheamicina derivada como droga citotóxica con un enlazador que incluye cualquier grupo reactivo que reacciona con un anticuerpo IgG1 , que es usado como un portador proteinacio como agente objetivante para formar un conjugado de drogas derivadas citotóxicas-anticuerpo. La patente U.S. No. 5,773,001 ; 5,739,116 y 5,877,296, encontradas aquí en su totalidad, describen enlazadores que pueden ser usados con derivados núcleofilicos, particularmente hidracidas y núcleofilos relacionados, preaparados a partir de calicheamicina. Estos enlazadores son útiles especialmente en aquellos casos en donde una mejor actividad es obtenida cuando el enlace formado entre la droga y el enlazador es hidrolizable. Estos enlazadores contienen dos grupos funcionales. Un grupo típicamente es un ácido carboxílico que es utilizado para reaccionar con el portador. El grupo funcional ácido, cuando es activado adecuadamente, puede formar un enlace amida con un grupo amida libre del portador, de modo que, por ejemplo, la amina en la cadena lateral de una lisina de un anticuerpo u otro portador proteínaceo. El otro grupo funcional comúnmente es un grupo carbonilo, es decir, un aldehido o una cetona, que reaccionara con el agente terapéutico apropiadamente modificado. Los grupos carbonilos pueden reaccionar con un grupo hidracida sobre la droga para formar un enlace hidrazona. Este enlace es hidrolizable permitiendo la liberación del agente terapéutico a partir del conjugado después del ligar con las células objetivo. Preferiblemente, el enlazador hidrolizable es ácido 4-(4-acetilfenoxi) (AcBut).
N-hidroxisuccinimida (OSu) u otros esteres comparablemente activados pueden ser usados para generar la calicheamicina activada-enlazador hidrolizable generado. Ejemplo de otros esteres activados incluyen NHS (N-hidroxisuccinimida), sulfo-NHS (NHS sulfonatada), PFP (pentafluorofenilo), TFP (tetrafluorofenilo), y DNP (dinitrofenilo).
Ejemplos de anticuerpos que pueden ser usados en la presente invención e incluyen los anticuerpos monoclonales (mAbs), por ejemplo, anticuerpos y médicos, anticuerpos humanizados, anticuerpos privatizados, anticuerpos resuperficialisados, anticuerpos humanos y fragmentos activos biológicamente de los mismos. El termino anticuerpo, como se usa aquí, a menos que se indique de otra manera, es usado ampliamente para referirse tanto a moléculas de anticuerpo y una variedad de moléculas derivadas de anticuerpo. Tales moléculas derivadas de anticuerpo comprenden por lo menos una región variable (sea una región de cadena pesada o de cadena liviana variables) e incluye moléculas tales como fragmentos de Fab, fragmentos de F (ab')2, fragmentos Fd, fragmentos Fabc, anticuerpos Sc (anticuerpos de cadena única), diacuerpos, cadenas únicas livianas de anticuerpos individuales, cadenas pesadas de anticuerpos individual, funciones quiméricas entre cadenas y anticuerpos y otras moléculas, y similares.
Preferiblemente los anticuerpos lgG1 de la presente invención están dirigidos contra antígenos de superficie celular expresada sobre célula objetivo y/o tejido objetivo en desordenes proliferativos tales como el cáncer. En otra modalidad el anticuerpo lgG1 es un anticuerpo anti-Lewis Y. El Lewis Y es un antígeno carbohidrato con la estructura Fuc(1 ? 2Galß1 ? 4[Fuc<1 ?3]GlcNacß1?3R (Abe et al. (1983) J. Biol. Chem., 258 11793-11797). El antígeno Lewis Y es expresado sobre la superficie de 60% a 90% de tumores epiteliales humanos (incluyendo aquellos de el pecho, colon, pulmón, y próstata), por lo menos 40% de los cuales sobre expresa este antígeno, y tiene expresión ilimitada en tejidos normales.
Para poder objetivar Ley y objetivar efectivamente un tumor, un anticuerpo con especificidad exclusiva al antígeno es requerido idealmente. Así, preferiblemente, los anticuerpos anti-Lewis Y no reaccionan cruzadamente con las estructuras tipo 1 (es decir las lacto-series de grupo sanguíneo (Lea y Leb)) y, preferiblemente, no ligan con otro epítopes tipo 2 (es decir, neolacto-estructura) similar a las estructuras Lex y H-tipo 2.
Durante las pasadas décadas, varios anticuerpos que reconocen Ley han sido generados. La mayoría de estos, sin embargo, muestran reactividad cruzada con Lex y las estructuras de antígeno tipo 2 H (Furokawa, K., et al. 723-732). Un ejemplo de un anticuerpo anti-Lewis Y preferido es designado hu3S193 (ver la patente U.S. No. 6,310,185; 6,518,415; 5,874,060, incorporadas aquí en su totalidad). Otros ejemplos de anticuerpos anti-Lewis Y (por ejemplo la patente Europea No. 0 285 059; las patentes U.S. No. 4,971 ,792 y 5,182,192) incluyen el anticuerpo monoclonal BR96 (por ejemplo la patente U.S. Nos. 5,491 ,088; 5,792,456; 5,869,045), que esta siendo evaluado actualmente como un conjugado de doxorubicina en SGN-15 (por ejemplo la patente U.S. No. 5,980,896), el anticuerpo monoclonal de LMB-9 (B3(dsFv)PE38), que es un disulfuro recombinante estabilizado de inmunotoxina anti-Lewis Y IgGk que contienen 38 Kd de elemento derivados de la exotoxina A de Pseudomonas Aeruginosa (PE) (por ejemplo la patente U.S. No. 5,980,895), y el anticuerpo humanizado IGN311 (por ejemplo, la patente Europea No. 0 528 767 y la patente U.S. No. 5,562,903).
El anticuerpo humanizado hu3S193 (Attia, M.A., et al. 1787-1800) fue generado por injerto de CDR desde 3S193, que es un anticuerpo monoclonal de murina nació contra la célula adenocarcinoma con especificidad excepcional por Ley (Kitamura, K., 12957-12961). El Hu3S193 no solamente se retiene la especificidad de 3S193 por Ley si no que también ha ganado en la capacidad para mediar citotoxicidad dependiente de complemento (referida de aquí en adelante como CDC) y citotóxicidad celular dependiente de anticuerpos (referida de aquí en adelante como ADCC) (Attia, M.A., et al. 1787-1800). Este anticuerpo objetiva los xenoinjertos que expresan Ley en ratones desnudos como se demostró por estudios de biodistribución con hu3S193 marcado con 25l, 111ln, o 18F, como también con otros radiomarcadores que requieren un agente quelante, tal como 111ln 99mTc, o 99Y (Clark, et al. 4804-4811 ).
La invención objeto suministra numerosos anticuerpos humanizados específicos para el antígeno Lewis Y con base en el descubrimiento de que las regiones CDR del anticuerpo monoclonal de murina puede dividirse en estructuras aceptoras humanas de modo que se produce un anticuerpo recombinante humanizado especifico para el antígeno Lewis Y. Los CDR pueden ser definidos usando cualquier nomenclatura convencional conocida en la técnica, tal como el sistema de numeración Kabat, el sistema de numeración Chothia, o la definición AbM, que es un compromiso entre kabat y Chothia usado por el software de modelado de anticuerpo AbM de molecular de Oxford. Particularmente las modalidades preferidas de la invención son las moléculas de anticuerpos humanizados ilustradas que tienen propiedades de ligado con antígenos superiores. El protocolo para producir anticuerpos recombinantes humanizados específicos para el antígeno Lewis Y se establece la patente U.S. No. 6,518,415, incorporada aquí en su totalidad. Como se escucho previamente, en una modalidad preferida de la invención objeto, los CDR del anticuerpo especifico Lewis Y humanizado son derivados del anticuerpo de murina 3S193.
Cuando los CDR son injertados, cualquier secuencia de estructura de región variable aceptora apropiada puede ser usada teniendo en cuenta la clase/tipo de anticuerpo donor del cual los CDR son derivados, incluyendo ratón, primate y regiones de estructura humana. Ejemplos de estructuras humanas, que pueden ser usadas en la presente invención son KOL, NEWM, REÍ, EU, TUR, TEI, LAY y POM (Kabat et al. Seq Proteins of Immunol. Interest, 1:310-334 (1994)). Por ejemplo, KOL y NEWM pueden ser usadas para la cadena pesada, REÍ puede ser usada para la cadena liviana y EU, LAY y POM pueden ser usadas tanto para la cadena pesada como para la cadena liviana.
En la práctica, para la generación de anticuerpos humanizados eficaces que retengan la especificidad del anticuerpo de murina original, no es simplemente suficiente usualmente sustituir los CDR. Hay un requerimiento para la intuición de un número pequeño de residuos de anticuerpos de murina crítica en las estructuras de región variable humana. La identidad de estos residuos depende de la estructura tanto del anticuerpo de murina original y del anticuerpo humano receptor. Así, los anticuerpos humanizados descritos aquí contienen algunas alteraciones del anticuerpo aceptor, es decir, humano, regiones de estructura de dominio variable de cadenas pesadas y/o liviana que son necesarios para retener la especificidad de ligado del anticuerpo monoclonal donor. En otras palabras, la región de estructura algunas modalidades, los anticuerpos humanizados descritos aquí, no necesariamente consisten de la consecuencia de aminoácidos precisa de la región de estructura de una región variable del anticuerpo humano de ocurrencia natural, sino que contiene diversas sustituciones que mejoran las propiedades de ligado de una región de anticuerpo humanizado que es especifica para el mismo objetivo como el anticuerpo de murina 3S193. un número mínimo de sustituciones son hechas a la región de estructura para poder evitar introducciones a gran escala de residuo de estructuras no humanos y para asegurar la inmunogenisidad minima del anticuerpo humanizado. Los anticuerpos -Lewis Y preferidos en el contexto de la presente invención son por lo tanto hu3S193 y G193.
En una modalidad, las variantes de las moléculas de anticuerpos de la presente invención están dirigidas contra el Lewis Y y muestran una afinidad mejorada para el Lewis Y. Tales variantes pueden ser obtenidas por un numero de protocolo de maduración de afinidad que incluye mutar los CDR (Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), mezclado de cadena (Marks et al., Bio Technology, _10, 779-783, 1992), uso de sepas mutadoras de E. coli (Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), mezclado de ADN (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724- 733, 1997), visualización de fagos (Thompson el, al., J. Mol. Biol., 256. 77-88, 1996) y PCR (Crameri et., al., Nature, 391, 288-291 , 1998).
Los anticuerpos humanizados de la invención objeto, pueden ser producidos por una variedad de métodos útiles para la producción de polipéptidos, por ejemplo, síntesis en producción de ADN recombinante, y similares. Preferiblemente, los anticuerpos humanizados son producidos por tecnología de ADN recombinante. Los anticuerpos específicos al Lewis Y humanizados de la invención pueden ser producidos por métodos de expresión de proteína recombinante que usan tecnología de ADN. Las técnicas para manipulación del ADN (por ejemplo, polinucleótidos) es bien conocida para las personas normalmente laxadas en la técnica de la biología molecular. Ejemplo de tales técnicas bien conocidas pueden encontrarse en molécula Cloning: A Laboratory Manual 2nd Edition, Sambrook et al, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). Las técnicas para la expreción recombinante de inmunoglobulinas incluyendo inmunoglobulinas humanizadas, también puede ser encontradas, entre otros lugares en Goeddel et al, Gene Expression Technology Methods in Enzymology, Vol. 185, Academic Press (1991), y Borreback, Antibody Engineering, W.H. Freeman (1992). Información adicional concerniente a la generación, diseño y expresión de anticuerpos recombinantes pueden encontrarse en Mayforth, Designing Antibodies, Academic Press, San Diego (1993). Ejemplo de técnicas de biología molecular convencionales ¡ncluyen, pero no se limitan a, ligación vitro, digestión de endonucleasa por restricción, PCR, transformación celular, hibridización, electroforesis, secuenciamiento de ADN, y similares.
Los métodos generales para la construcción del vector de la invención, la transfección de las células para producir células anfitrionas de la invención, el cultivo de células para producir el anticuerpo de la invención son todos métodos de biología molecular convencionales. Similarmente una vez producido los anticuerpos recombinantes de la invención pueden ser purificados por procedimientos estándar de la técnica, incluyendo filtración de flujo cruzado, precipitación de sulfato de amonio, cromatografía de columna de afinidad, electroforesis de gel, diafiltración y similares. Las células anfitrionas usadas para expresar el anticuerpo recombinante pueden ser células bacterianas, tales como £. coli, o preferiblemente, una célula eucariótica. Preferiblemente, una célula de mamífero tal como una célula PER.C.6 o un a célula de ovario de hámster chino (CHO) son las usadas. La escogencia del vector de expresión es dependiente de la escogencia de la célula anfitriona, y es seleccionada de modo que tenga la expresión deseada y las características regulatorias en las células anfitrionas seleccionadas.
El uso de codisolventes, aditivos, y condiciones de reacciones específicas particulares junto con el proceso de separación resulta en la formación de un conjugado de anticuerpo derivado de droga citotóxica monomerica con una reducción significativa en el LCF. La forma monomerica de los conjugados en oposición a la forma agregada tiene un valor terapéutico significativo, y minimiza el LCF y reduce sustancialmente los resultados de agregación en la utilización del material repartido anticuerpo de una manera terapéuticamente significante para impedir el LCF compita con la fracción más altamente conjugada (HCF).
En el contexto de la presente invención, un conjugado de drogas citotóxicas monomerica se refiere a un anticuerpo único covalentemente sujetado a cualquier número de moléculas de calicheamicina sin agregación significativa de los anticuerpos. El número de partes de calicheamicina covalentemente sujetadas a un anticuerpo también se llama carga de droga. Por ejemplo, de acuerdo con la presente invención, la carga promedio puede estar en cualquier lugar entre 0.1 a 10 o 15 partes de calicheamicina por anticuerpo. Una población de conjugados dada (por ejemplo, en una composición o formulación) puede ser heterogénea u homogénea en términos de carga de droga. En una población heterogénea, ya que la carga promedio representa el número promedio de moléculas de droga (o moles) conjugadas a un anticuerpo, el numero real de partes de drogas para anticuerpo puede variar sustancialmente. El porcentaje de anticuerpo en una población dada que tiene anticuerpo no conjugado o significativamente subconjugado se llama como la fracción baja de conjugado o LCF.
El uso del desoxicolato con una solución amortiguada, compatible aproteína, no nucleofilica se encontró que produce generalmente conjugados de derivados de drogas citotóxicas monomerica/aportador con una carga de droga/producción alta y con agregación disminuida que tiene actividad excelente. La solución amortiguada preferida para los conjugados hechos de N de esteres-hidroxisuccinimida (OSu) u otros esteres comparativamente activados son la salina amortiguada con fosfato (PBS), N-(2-hidroxietil) piperazina-N-(ácido 4-butanosulfónico) (HEPBS), o ácido N-2-hidroxietil piperazina -N-2-etanosulfonico (HEPES amortiguador). La solución amortiguada usada en metales reacciones de conjugación no pueden contener aminas y libres o nucleofilos. Aquellos interesados en la técnica pueden fácilmente determinar los amortiguadores aceptables para otro tipo de conjugado.
La cantidad de aditivo necesaria para formar efectivamente un conjugado monumerico también varía de anticuerpo a anticuerpo. Esta cantidad puede también ser determinada por una persona basada en la técnica sin experimentación indebida. En las presentes reacciones, la concentración del anticuerpo puede variar entre 1 a 15 mg/ml y la concentración del derivado de calicheamicina, por ejemplo la N-acetil gamma-calicheamicina DMH AcBut OSu su ester varia de 3-9% en peso del anticuerpo.
Los codisolventes pueden alternativamente ser etanol, para los cuales buenos resultados se han demostrado en concentración que varia entre 6 a 11.4% (volumen base). La reacción pueden llevarse a cabo en PBS, HEPES, N-(2-Hidroxietil) piperazina -N-(ácido 4-butanosulfonico) (HEPBS), u otros amortiguadores compatibles a un pH entre cerca de 7 a 9, preferiblemente 8 a 9, a una temperatura que varia entre cerca de 25°C a cerca de 40°C, preferiblemente cerca de 30°C a 35°C, durante tiempos que varían entre 15 minutos a 24 horas. Más preferiblemente, la reacción se lleva a cabo a un pH de alrededor de 8.2. Aquellos basados en la técnica pueden fácilmente determinar rangos de pH aceptables para otros tipos de conjugados. Para diversos anticuerpos el uso de ligeras variaciones en las combinaciones de los aditivos anteriormente mencionados se ha encontrado que mejoran la carga de la droga y la producción del conjugado monumerico, y se entiende que cualquier anticuerpo particular puede requerir algunas alteraciones menores en las condiciones exactas o escogencia de los aditivos para lograr los resultados óptimos.
Luego de la conjugación, los conjugados monumericos pueden ser purificados a partir de reactivos no conjugados (tales como moléculas portadoras proteínaceas/anticuerpo y drogas citotóxicas libres/calicheamicina) y/o formas agregadas de los conjugadas. Los métodos convencionales para la purificación, por ejemplo, cromatografía por exclusión de tamaño (SEC), cromatografía de interacción hidrofobica (HIC), cromatografía de ¡ntercambio ¡ónico (lEC), cromatoenfocado (CF), pueden ser usadas. Luego de, por ejemplo la separación cromatográfica, es conjugado puede ser ultrafiltrado y/o diafiltrado.
Los conjugados purificados son monumericos y usualmente contienen entre 3 a 9% en peso de drogas citotóxicas/calicheamicina. En una modalidad preferida los conjugados son purificados usando HIC. Cuando una droga citotóxica tiene una naturaleza altamente hidrofobica, tal como un derivado de calicheamicina, y es usado en un conjugado, el HIC es el candidato preferido para suministrar la separación efectiva del conjugado y de anticuerpo no conjugado. El HIC presenta tres ventajas claves sobre el SEC: (1) tiene la capacidad de reducir eficientemente el contenido de LCF lo mismo que el agregado: (2) la capacidad de carga de columna para HIC es mucho mayor; y (3) el HIC evita la dilución excesiva del producto. Un número de medios de HIC de alta capacidad, adecuados para la producción a escala de uso, tales como Butilo, Fenilo y Octal Sefarosa 4 de Flujo Rápido (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) podría separar efectivamente no conjugados y agregados del conjugado a partir de componentes conjugados monumericos luego de del proceso de conjugación.
Preferiblemente, el HIC es llevado a cabo usando la resina Butil Sefarosa FF con una carga y un amortiguador de lavado de fosato de potasio el 0.60M y un amortiguador de elusión de 20mM Tris/25mM NaCl. También preferiblemente, la ultrafiltración es llevada a cabo usando una membrana de celulosa regenerada y la diafiltración es llevada a cabo usando 10 diavolumenes de 20Mm de Tris/1 OmM NaCI como amortiguador a un pH de 8.0.
Así, de acuerdo con el proceso inventivo presente, luego de la etapa de purificación, la carga promedio del conjugado esta entre cerca de 5 a 7 moles de calicheamicina por mol de anticuerpo IgG1. Adicionalmente, luego de la etapa de purificación, la fracción de conjugado baja (LCF) del conjugado es menor a cerca de 10%.
La presente invención también suministra conjugados preparados por estos procesos. Tales conjugados preferiblemente mantienen la cinética de ligado y la especificidad del anticuerpo desnudo. Como tal, los conjugados de la presente invención preferiblemente tienen un caso de cerca de 100 a 400 nM, preferiblemente 3.4 x 10"7M, como se determino por el análisis BIAcore, ligan el antígeno y no se ligan al Lewis X y a los antígenos del grupo sanguíneo H-2, tienen actividad citotóxica, y/o tienen actividad anti-tumoral. Cualquier método conocido puede ser usado para determinar las cinéticas de ligado y la especificidad de los conjugados, tales como análisis FACS o BIAcore, por ejemplo.
Un conjugado de calicheamicina preferido preparado por el proceso de la presente invención es la N-acetil gamma calicheamicina dimetil hidracida (N-acetil calicheamicina DMH) covalentemente sujeta al enlazador hidrolizable ácido 4-(4-acetilfenoxi) butanoico (AcBut), covalentemente sujetados al anticuerpo anti-Lewis Y G193 (llamado variadamente como CMD-193 o CMD) con la carga promedio del conjugado de calicheamicina entre cerca de 5 a cerca de 7 moles de calicheamicina por mol de anticuerpo y la fracción baja del conjugada (LCF) del conjugado menor a cerca de 10%.
También se suministra por la presente invención composiciones que comprenden un conjugado de una calicheamicina-enlazador hidrolizable covalentemente sujetados a un anticuerpo anti-Lewis Y junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable, diluyente o portador. Así, una composición preferida de acuerdo con la presente invención comprende un conjugado de N-cetil gamma calicheamicina dimetil hidracida-ácido -4-(4-acetilfenoxi) butanoico (N-acetil calicheamicina DMH-AcBut) covalentemente enlazado a G193, en donde la carga promedia esta en cerca de 5 a cerca 7 moles de N-acetil calicheamicina de DMH por mol de G193 y la fracción baja del conjugado (LCF) del conjugados es menor a cerca de 10%.
Los anticuerpos específicos al Lewis Y humanizados pueden ser usados en conjunto con, o sujetados a otros anticuerpos (o parte ellos} tales como anticuerpos monoclonales humanos o humanizados. Estos otros anticuerpos pueden ser reactivos con otros marcadores (epitopos) característicos para la enfermedad con la cual los anticuerpos están dirigidos o pueden tener diferentes especificidades escogidas, por ejemplo, para reclutar moléculas o células del sistema inmune humano para las células enfermas. Los anticuerpos de la invención (o partes de ellos) pueden ser administrados con tales anticuerpos (o partes de ellos) como composiciones separadamente administradas o como una composición única con dos agentes enlazados por química convencional o por métodos biológicos moleculares. Adicionalmente, el valor del diagnostico y terapéutico de los anticuerpos de la invención puede ser aumentado por medio de marcar los anticuerpos humanizados con marcadores que producen una señal detectable (sea in vitro o in vivo) o con un marcado que tenga una propiedad terapéutica. Algunos marcadores, por ejemplo, radionuclidos pueden producir una señal detectable y tienen una propiedad terapéutica. Ejemplos de marcadores de radionuclidos ¡ncluyen el 125l, 131l, 14C. Ejemplos de otros marcadores detectables incluyen un cromoforo fluorescente, tal como la fluoresceína, la ficobiliproteina o la tetraetil rodamina para la microscopia de fluorescencia una encima que produce un producto fluorescente o coloreado para la detección por fluorescencia, absorbancia de color visible o aglutinación, que produce un producto denso en electrones para la demostración por microscopia del electrón; o una molécula densa en electrones tal como la ferritina, peroxidasa o granulos de oro para visualizar microscópicamente por electrones directa o indirectamente. Los marcadores que tienen propiedades terapéuticas ¡ncluyen drogas para el tratamiento del cáncer, tal como el metotrexato y similares.
El conjugado de derivado de drogas citotóxicas monumerica/portador puede ser el único ingrediente activo en la composición/formulación terapéutica de diagnostico o puede estar acompañado por otros ingredientes activos (por ejemplo agentes de quimioterapia, agentes de terapia hormonal, o agentes de terapia biológica descritos adelante), incluyendo otros ingredientes de anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos anti-CD19, anti-CD20, anti-CD33, anti-célula T, anti-IFN ? o anti-LPS, o ingredientes que no son anticuerpos tales como citosinas, factores de crecimiento, hormonas, antihormonas drogas citotóxicas o xantinas.
Estas composiciones/formulaciones pueden ser administradas a pacientes para el tratamiento del cáncer. De acuerdo con la presente invención, una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición o formulación de un conjugado de calicheamicina-anticuerpo anti-Lewis Y, un crioprotector un tensoactivo, un agente de amortiguador, y un electrolito es administrado a un paciente que lo necesita. Alternativamente, la composición o formulación es usada para fabricar un medicamento para el tratamiento del cáncer. Debería apreciarse que este método o medicamento puede ser usado para tratar cualquier paciente con un desorden proliferativo caracterizado por células que expresan el antígeno Lewis Y en su superficie. Así, en una modalidad, el cáncer tratado es positivo para el antígeno Lewis Y. el cáncer es preferiblemente uno que exprese un numero alto de antígeno Lewis Y (es decir tumores que expresan alto Lewis Y}. El cáncer tratado puede ser un carcinoma y, preferiblemente, es un cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) o cáncer de pecho o, alternativamente, cáncer de próstata o cáncer colorectal.
Preferiblemente, el hu3S193-AcBut-CM o CMD-193 puede ser utilizado en cualquier terapia en donde es deseado reducir el nivel de células que expresan Lewis Y que están presentes en el sujeto que esta siendo tratado con la composición o medicamento descrito aquí. Específicamente, la composición o medicamento es usada para tratar humano o animales con desordenes proliferativos particularmente carcinomas que expresan el antígeno Lewis Y sobre la superficie de las células. Estas células que expresan Lewis Y pueden ser circulantes en el cuerpo o pueden estar presentes en un numero indeseablemente grande localizado en un sitio particular del cuerpo.
Los métodos de tratamiento presentes pueden ser usados en combinación con otros tratamientos de cáncer, incluyendo cirugía, radiación, quimioterapia, terapia de hormonas, terapias biológicas, transplante de médula de hueso (para leucemia y otros canceres con dosis muy alta de quimioterapia necesarias). Nuevos tratamientos también actualmente en desarrollo y aprobados con base en un entendimiento incrementado de la biología del cáncer.
Dos clases generales de terapia de radiación existen y pueden ser usadas en los presentes métodos. En una clase, braquiterapia, implantes dirigidos de un radioisótopo son hechos en el tumor para suministrar una dosis concentrada en esa área. En otras clases, teleterapia, un rayo es usado para suministrar radiación a un área grande del cuerpo o para el cuerpo completo en una irradiación total del cuerpo (TBI).
Cualquier agente quimioterapéutico adecuado puede ser usado en los presentes métodos. Estos agentes quimioterapéuticos generalmente caen en las siguientes clases (con ejemplos de cada uno): antimetabolitos (por ejemplo antagonista de ácido fólico tales como metotrexato, antagonistas de purina tales como 6-marcaptopurina (6-MP), y antagonistas de pirimidina tales como 5-fluorouacil (5-FU)); agentes alquilantes (ciclofosfamida); agentes de ligado al ADN (cisplatina o oxaliplatina); antibióticos antitumorales (doxorubicina o mitoxantrona); inhibidores mitóticos (por ejemplo los taxanos o inhibidores de microtubulos tales como vincristina) o inhibidores de topoisomerasa (camptothecan o taxol). Ejemplo más específicos se describen adelante.
Las terapias de hormonas relevantes a los presentes métodos incluyen, por ejemplo, corticusteroides para leucemia y mielomas, estrógenos y anti-estrógenos para canceres de pecho, y andrógenos y anti andrógenos para cáncer de próstata. La terapia biológica usa sustancias derivadas del cuerpo. Ejemplos de terapias adecuadas en los métodos presentes incluyen anticuerpos (por ejemplo anticuerpos anti-EGFR, tal como cetuximab o trastuzumab o anticuerpos anti-VEGF, tañles como bevacizumab), terapias de células T, ¡nterferonas, interleucinas, y factores de crecimiento hematopoyéticos.
Los transplantes de médula de hueso pueden ser usados para el tratamiento en algunos canceres, particularmente leucemias. Para tratar leucemias, las células de médula del paciente son destruidas por tratamiento quimioterapéutico de radiación. La meudla de hueso de un donor que tiene un case o un case cercano con los antígenos HLA sobre la superficie celular es entonces introducida dentro del paciente. El trasplante de médula de hueso también es usado para reemplazar la médula en pacientes que requieren dosis muy altas de radiación o quimioterapia para matar las células tumorales. Los trasplantes son calificados con base en ia fuente donora. En trasplantes alogeneicos el donor de la medula frecuentemente no esta relacionado genéticamente pero casa con por lo menos 5 de 6 antígenos de superficie celular que son las proteinas mayores del sistema inmune (antígenos HLA). En trasplantes autologos, el paciente recibe su propia medula después de quimioterapia o tratamiento de radiación. Este tipo de trasplante de medula de hueso puede ser usado para canceres no relacionados con la medula para los cuales las dosis del tratamiento convencional han sido efectivas de manera incompleta.
Adicionalmente, nuevas enseñanzas emergen que pueden ser usadas con los presentes métodos, algunas de las cuales son aprobadas o están en ensayos clínicos, y están siendo desarrolladas con base de un entendimiento incrementado del las bases moleculares y celulares del cáncer y la progresión de la enfermedad. Los inhibidores de la proteína kinasa (tanto moléculas pequeñas como anticuerpos que inhiben la cascada de fosforilación pueden ser usados (por ejemplo, eriotinib o imatinib mesilato). Cualquier agente antimetastasis puede ser usado que bloquee el esparcimiento de las células cancerosas y la invasión de nuevo tejidos. Los agentes de antiangiogenesis pueden ser usados los cuales bloquean el desarrollo de vasos sanguíneos que nutren un tumor (por ejemplo talidomida). Otros agentes que pueden ser usados son los oligonucleotidos antisentido, que bloquean la producción de proteínas ahorrantes que causan la proliferación de células tumorales. La terapia de genes también puede ser usada para introducir genes en la célula T que son inyectados en los pacientes y son diseñadas para matar las células específicas de tumor. También, el P53 puede ser objetivado por medio de introducir genes P53 normales y en células cancerosas mutantes, por ejemplo, para reestablecer la sensibilidad a las drogas quimioterapéuticas.
En una modalidad, las composiciones/formulaciones de la presente invención se utilizan en combinación con agentes bioactivos. Los agentes bioactivos comúnmente utilizados incluyen anticuerpos, factores de crecimiento, hormonas, citoquinas, anti-hormonas, xantinas, interleuquinas, interferones, drogas citotóxicas y proteínas antiangiogénicas.
Drogas citotóxicas bioactivas comúnmente utilizadas para tratar trastornos proliferativos tales como cáncer, y que se pueden utilizar junto con la calicheamicina-conjugados de anticuerpo anti-Lewys incluyen: antraciclinas tales como doxorubicina, daunorubicina, idarubicina, aclarubicina, zorubicina, mitoxantrona, epirubicina, carubicina, nogalamicina, menogaril, pitarubicina, y valrubicina durante hasta tres días; pirimidin o nucleósidos de purina tal como citarabina, gemcitabina, trifluridina, ancitabina, enocitabina, azacitidina, doxifluridina, pentostatina, broxuridina, capecitabina, cladribina, decitabina, floxuridina, fludarabina, gougerotin, puromicin, tegafur, tiazofurina; agentes de alquliación tales como ciclofosfamida, melfalan, tiotepa, ifosfamida, carmustina, cisplatina, CKD-602, ledoxantrona, rubitecan, clorhidrato de topotecan, LE-SN38, clorhidrato de afeletecan, XR-11576 y XR-11612; antimetabolitos tal como metotrexato, 5 flurouracilo, tegafur/uracilo (UFT), ralititrexed, capecitabina, leucovorin/UFT, S-1 , pemetrexed disodio, tezacitabina, trimetrexato glucuronato, timectacina, decitabina; anticuerpos anti-tumor tales como edrecolomab, mitomicina, mitomicina C y oxaliplatina; alquiloides vinca tal como vincristina, vinblastina, vinorelbina, anhidrovinblastina; inhibidores de angiogénesis tal como succinato de vatalanib, oglufanida, RPI-4610; inhibidores de transducción de señal tal como gefitinib, 317615.2 HCL, indisulam, lapatinib, sorafenib, WHI-P131 ; apoptosis inductores de apóptosis tal como clorhidrato de alvocidib, irofulven, fenilbutirato de sodio, bortezomib, exisulind, MS-2167; epipodofilotoxinas tales como etoposida; y taxanos tal como paclitaxel, doceltaxel, DHA-paclitaxel, ixabepilona, poliglutamato de paclitaxel, o epotilonas.
Otros agentes quimioterapéuticos/anti-neoplásicos que se pueden administrar en combinación con hu3S193-AcBut-CM o CMD-193 o AG G193-AcBut-CM ¡ncluyen adriamicina, cisplatina, carbo platina, ciclofosfamida, dacarbacina, ifosfamida, altretamina, carboplatina, teniposida, topotecan, gemcitabina, thiotepa, fluxiridina, (FUDR), MeCCNU, vinblastina, vincristina, mitoxantrone, bleomicina, mecloretamina, prednisone, procarbacina, metrotexan, flurouraciles, etoposide, taxol y sus diversos análogos, mitomicina, thalidomide y sus diversos análogos, GBC-590, troxacitabina, ZYC-300, TAU, (R) flurbiprofen, clorhidrato de histamina , tariquidar, devanat-1 , ONT-093. La administración puede ser concurrentemente con uno o más de estos agentes terapéuticos o, alternativamente, secuencialmente con uno o de estos agentes terapéuticos.
Los anticuerpos bioactivos que pueden ser administrados con los conjugados de anticuerpo de esta invención incluyen, pero no se limitan a Herceptin, Zevalin, Bexxar, Campath, cetuximab, bevacizumab, ABX-EGF, MDX-210, pertuzumab, trastuzumab, 1-131 ch-TNT-1/b, hl_M609, 6H9, CEA-Cide Y90, IMC-1C11 , ING-1 , sibrotuzumab, TRAIL-R1 Mab, YMB- 1003, 2C5, givarex and MH-1.
Los conjugados de calicheamicina - anticuerpo anti-Lewis Y pueden también ser administrados solos, concurrentemente, o secuencialmente con una combinación de otros agentes bioactivos tales como factores de crecimiento, citocinas, esteroides, anticuerpos tales como anti Lewis Y, rituxibam y agentes quimioterapéuticos como una parte de un régimen de tratamiento. Los conjugados de calicheamicina-anti Lewis Y también pueden ser administrados solos, concurrentemente, o secuencialmente con cualquiera de los anteriores regímenes de terapia identificados como parte de la fase de terapia de inducción, una fase de terapia de consolidación y una fase de terapia de mantenimiento.
Los conjugados de la presente invención también pueden ser administrados junto con otros agentes bioactivos o quimioterapéuticos como una parte de una combinación de régimen de quimioterapia para el tratamiento de carcinoma agresivo Tal régimen de tratamiento incluye: CAP (Cyclofosfamida, Doxorubicina, Cisplatina PV (Cisplatin, Vinblastina o vindesinea), CE (Carboplatina, Etoposida), EP (Etoposida, Cisplatina), MVP (Mitomicina, Vinblastina o Vindesina, Cisplatina), PFL (Cisplatina, 5-Flurouracilo, Leucovorina), IM (Ifosfamida, Mitomicina), (E (Ifosfamida, Etoposida); IP (Ifosfamida, Cisplatina); MIP (Mitomicin, Ifosfamida, Cisplatina), ICE (Ifosfamida, Carboplatina, Etoposida); PIE (Cisplatina, Ifosfamida, Etoposida); Viorelbina and Cisplatina; Carboplatina and Paclitaxel; CAV (Cyclophosphamida, Doxorubicina, Vincristina), CAE (Ciclofosfamida, Doxorubicin, Etoposide); CAVE (Cyclophospham.de, Doxorubicin, Vincristine, Etoposide); EP (Etoposide, Cisplatin); CMCcV (Cyclophosphamide, Methotrexate, Lomustine, Vincristine); CMF (Cyclophosphamide, Methotrexate, 5-Flurouracil); CAF (Cyclophosphamide, Doxorubicin, 5-Flurouracil); CEF (Cyclophosphamide, Epirubicin, 5- Flurouracil); CMFVP (Cyclophosphamide, Methotrexate, 5-Flurouracil, Vincristine, Prednisone); AC (Doxorubicin, Ciclofosfamida); VAT (Vinblastina, Doxorubicina, Thiotepa); VATH (Vinblastina Doxorubicina, Thiotepa, Fluosimesterona); CDDP + VP-16 (Cisplatia, Etoposida, Mitomicina C + Vinblastina).
La presente invención también suministra un método para tratar sujetos humanos o animales que sufren de un coma o tienen un riesgo de desorden proliferativo caracterizado por células que expresan el Lewis Y, el método comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de los conjugados de calicheamicina- anti cuerpo anti-Lewis Y de la presente invención. Debería apreciarse que por medio de tratar se quiere decir inhibir, prevenir, o disminuir el crecimiento del cáncer, que incluye el crecimiento retardado del tumor y la inhibición de la metástasis.
Las composiciones/formulaciones de la presente invención pueden ser administradas como una monoterapia de segunda línea. Por segunda línea se quiere decir que las presentes composiciones/formulaciones son usadas después del tratamiento con un tratamiento Anti cáncer diferente, ejemplos de los cuales se describieron anteriormente. Alternativamente, las composiciones o formulaciones pueden ser administradas como una terapia de combinación de primera línea con otro tratamiento anti cáncer descrito anteriormente.
Las composiciones de anticuerpo humanizado de la invención pueden ser administradas a un paciente de diversas maneras. Suministro directo de las composiciones generalmente se llevaran a cabo por medio de inyección, subcutáneamente, intraperitonialmente, intravenosamente o ¡ntramuscularmente, o suministrados al espacio intersticial de un tejido. Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas pueden ser administradas parenteralmente, es decir, subcutáneamente, intramuscularmente o intravenosamente. Las composiciones también pueden ser administradas dentro de una lesión. El tratamiento de dosificación puede ser la programación de dosis única o una programación de dosis múltiples.} Así, esta invención suministra composiciones/formulaciones para administración parenteral que comprenden una solución del anticuerpo monoclonal humano o un cóctel del mismo disuelto en un portador aceptable, preferiblemente un portador acuoso. Por ejemplo, las formulaciones del conjugado de calicheamicina- anticuerpo anti-Lewis Y, un crioprotector, un tensoactivo, un agente amortiguador y un electrolito.
Una variedad de portadores acuosos pueden ser usados por ejemplo, agua, agua amortiguada, salina al 0.4%, glicina al 0.3% y similares. Estas soluciones son estériles y generalmente libres de materias particuladas. Estas composiciones pueden ser esterilizadas por técnicas de esterilización convencional, bien conocida. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables como es requerido para las condiciones fisiológicas aproximadas tales como el ajuste del pH y los agentes amortiguadores, los agentes de ajuste de toxicidad y similares, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio. La concentración de anticuerpos en estas formulaciones puede variar ampliamente, por ejemplo, de menos de cerca de 0.5%, usualmente a por lo menos cerca de 1% y tanto como 15 a 20% en peso y serán seleccionados principalmente con base en los volúmenes fluidos y viscosidades, por ejemplo, de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado.
Podrá apreciarse que el ingrediente activo en la composición será un conjugado de anticuerpo anti-lewis Y-calicheamicina. Como tal, será susceptible de degradación en el tracto gastrointestinal. Así, si la composición debe ser administrada por una vía que use el tracto gastrointestinal, la composición requerirá contener agentes que protejan al portador proteinaceo de la degradación pero que liberen el conjugado una vez este ha sido absorbido por el tracto gastrointestinal.
Métodos actuales para preparar composiciones administrables parenteralmente y los ajustes necesarios para la administración a sujetos serán conocidos o evidentes para aquellos basados en la técnica y son descritos en más detalle, por ejemplo, Remingtons Pharmaceutical Science, 15th Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1980), que se incorpora aquí como referencia. Una discusión profunda de portadores farmacéuticamente aceptables está disponible en Remingtons Pharmaceutical Science (Mack Publishing Company, N.J. 1991).
Las composiciones pueden ser administradas individualmente a un paciente o pueden ser administradas en combinación con otros agentes, drogas u hormonas. Las citocinas y los factores de crecimiento que pueden ser usados para tratar desórdenes proliferativos tales como el cáncer, y que pueden ser usados junto con los conjugados de derivados de drogas citotóxicas/portador de la presente invención ¡ncluyen los interferones, interlucinas tales como la interiucina 2(IL2), TNF, CSF, GM-CSF y G-CSF. Las hormonas comúnmente usadas para tratar desórdenes proliferativos tales como el cáncer y que pueden ser usadas junto con los conjugados de drogas citotóxicas/portador de la presente invención incluyen los estrógenos (dietilestilbestrol, estradiol), andrógenos (testosterona, halotestina), progestinas (Megace, provera), y corticoesteroides (prednisona, dexametasona, hidrocortisona). Antihormonas tales como antiestrógenos (tamoxifen), antiandrógenos (flutamida) y agentes antiadrenales son comúnmente usados para tratar desórdenes proliferativos tales como el cáncer, y pueden ser usados junto con el conjugado derivado de droga citotóxica/portador de la presente invención.
En adición, agentes quimioterapéuticos/antinioplásticos comúnmente usados para tratar desórdenes proliferativos tales como el cáncer, y que pueden ser usados junto con el conjugado del derivado de droga citotóxica/portador de la presente invención incluyen, pero no se limitan a Adriamicina, cisplatina, carboplatina, vinblastina, vincristina, bleomicina, methotrexato, doxorubicina, flu muradlos, etoposida, taxol y sus varios análogos, mitomicina, talidomida y sus varios análogos.
Las composiciones/formulaciones farmacéuticas preferiblemente deberían comprender una cantidad terapéuticamente efectiva del conjugado de la invención. El término cantidad terapéuticamente efectiva como se usa aquí se refiere a una cantidad de un agente terapéutico en necesidad de tratamiento, que mejora o previene une enfermedad objetivada o condición objetivada, o para exhibir un efecto terapéutico o preventivo detectable. De cualquier conjugado, la dosis terapéuticamente efectiva puede ser estimada inicialmente sea en ensayos de cultivos celulares o en modelos de animales, usualmente en roedores, conejos, perros, cerdos o primates. El modelo animal también puede ser usado para determinar el rango de concentración apropiado y la vía de administración. Tal información puede entonces ser usada para determinar dosis útiles y vías de administración en humanos.
La cantidad precisa efectiva para un sujeto humano también dependerá de la naturaleza y severidad del estado de la enfermedad, la salud general del sujeto, la edad, el peso y el género del sujeto, la dieta, el tiempo y la frecuencia de administración, las combinaciones de drogas, la sensibilidades de reacción y la tolerancia/respuesta a la terapia. Si el conjugado está siendo usado profilácticamente para tratar una condición existente, esto también afecta la cantidad efectiva. Esta cantidad puede ser determinada por experimentación de rutina y está dentro del juzgamiento del médico. Generalmente, una dosis efectiva será entre 0.01 mg/m2 hasta 50 mg/m2, preferiblemente 0,1 mg/m2 hasta 20 mg/m2, más preferiblemente entre 10-15 mg/m2, calculado sobre la base del portador proteinario.
La frecuencia de dosis dependerá de la vida media del conjugado y la duración de su efecto. Si el conjugado tiene una vida media corta (por ejemplo, 2 a 10 horas) puede ser necesario dar una o más dosis por día. Alternativamente, si la molécula del conjugado tiene una vida promedio larga (por ejemplo, 2 a 15 días) puede ser necesario dar una dosis una vez al día, una vez por semana o aún una vez cada uno o dos meses.
Una composición también puede contener un portador farmacéuticamente aceptable para la administración del conjugado de anticuerpo. Un portador farmacéutico puede ser cualquier sustancia no tóxica compatible adecuada para el suministro de os anticuerpos monoclonales al paciente. Agua estéril, alcohol, grasas, ceras, y sólidos inertes pueden ser incluidos en el portador. El portador no debería en sí mismo inducir la producción de anticuerpos dañinos al individuo que recibe la composición y no debería ser tóxico. Portadores adecuados pueden ser macromoléculas grandes, metabolizadas lentamente tales como proteínas, polipéptidos, liposomas, polisacaridas, ácidos polilácticos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas de virus inactivas. Los adyuvantes farmacéuticamente aceptados (agentes amortiguadores, agentes de dispersión) pueden también ser incorporados en la composición farmacéutica.
Las sales farmacéuticamente aceptables pueden ser usadas, por ejemplo, sales acidas minerales, tales como clorhidratos, hidrobromuros, fosfatos y sulfatos, o sales de ácidos orgánicos, tales como acetatos, propionatos, malonatos y benzoatos.
Los portadores farmacéuticamente aceptables en las composiciones/formulaciones terapéuticas pueden contener adicionalmente líquidos tales como agua, salina, glicerol, y etanol. Las sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes y emulsificantes o sustancias amortiguadoras de pH, pueden estar presentes en tales composiciones. Tales portadores le permiten a las composiciones ser formuladas como tabletas, pildoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones y pastas, para ingestión por el paciente.
Las formas preferidas de administración incluyen las formas adecuadas para administración parenteral, por ejemplo, por inyección o infusión, por ejemplo, por inyección de bolo o infusión continua. En donde el producto es para inyección o infusión, este puede tomar la forma de una suspensión, solución emulsión en un vehículo aceitoso o acuoso y esta puede contener agentes formulatorios, tales como agentes de suspensión, de preservación, estabilizadores y/o dispersantes.
Aunque la estabilidad de las soluciones conjugadas amortiguadas es adecuada durante un tiempo corto, la estabilidad a largo término es pobre. Para promover la estabilidad del conjugado y para incrementar su vida de almacenamiento, el conjugado de anticuerpo, droga puede ser liofilizado a una forma seca, para reconstituirse antes del uso con un líquido estéril apropiado. Los problemas asociados con la liofilización de una solución de proteína son bien documentados. Pérdida de estructura secundaria, terciaria, y cuaternaria puede ocurrir durante los procesos de congelamiento y secado. Ponerlos en contacto con un crioprotector, un tensoactivo, un agente amortiguador, y un electrolito en una solución y luego liofilizar la solución puede preservar la actividad biológica de estas composiciones/formulaciones. Un lioprotector también puede ser agregado a la solución.
Una formulación estable es una en la cual un anticuerpo retiene allí esencialmente su estabilidad física y química y la integridad luego de almacenamiento. Diversas técnicas analíticas para medir la estabilidad del anticuerpo están disponibles en la técnica y se pueden repasar en Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301 , Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc New York, N.Y., Pubs. (1991) and Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993). La estabilidad puede ser medida a una temperatura seleccionada durante un período de tiempo seleccionado. Para el tamizado rápido, la formulación puede ser mantenida a 40°C durante dos semanas a un mes, tiempo durante el cual la estabilidad es medida. En donde la formulación va a ser almacenada entre 2 a 8°C, la formulación generalmente debe ser estable a 30°C o 40°C durante por lo menos un mes y/o estable a 8°C durante por al menos dos años. En donde la formulación va a ser almacenada a 30°C generalmente la formulación debería ser estable durante al menos dos años a 30°C y/o estable a 40°C durante por lo menos seis meses. El grado de agregación luego de la liofilización y almacenamiento puede ser usado como indicador de la estabilidad del anticuerpo. Por ejemplo, una formulación estable puede ser una en donde menos del 10% y preferiblemente menos de cerca del 5% del anticuerpo está presente como un agregado en la formulación. En otras modalidades, cualquier incremento en la formación de agregado luego de la liofilización y almacenamiento de la formulación liofilizada puede ser determinada. Por ejemplo, una formulación liofilizada estable puede ser una en donde el incremento en agregado en la formulación liofilizada es menos de cerca del 5% y preferiblemente menos de cerca del 3%, cuando la formulación liofilizada es almacenada entre 2 a 8°C durante por lo menos un año. Más aún, la estabilidad de la formulación del anticuerpo puede ser medida usando un ensayo de actividad biológica.
Los crioprotectores pueden tener que ser incluidos para actuar como un estabilizador amorfo del conjugado y para mantener la integridad estructural de la proteína durante el proceso de liofilización. En una modalidad, el crioprotector útil en la presente invención es un azúcar de alcohol, tal como: alditol, mannitol, sorbitol, inositol, poletilen glicol y combinaciones de ellos. En otra modalidad, el crioprotector es un ácido azucarado, que incluye un ácido aldónico, un ácido uránico, un ácido, un ácido aldárico y combinaciones de ellos.
Los crioprotectores de esta invención también pueden ser un carbohidrato. Carbohidratos adecuados son los compuestos de aldehido o acetona que contiene dos o más grupos hidroxilo. Los carbohidratos pueden ser cíclicos o lineales e incluyen, por ejemplo, aldosas, cetosas, amino azúcares, albitóles, ¡nositones, ácidos aldólicos, ácidos uránicos, ácidos aldáricos, o combinaciones de ellos. El carbohidrato también puede ser un mono- , un di- o poli-, carbohidrato, tal como por ejemplo, un disacario o un polisacario. Los carbohidratos incluyen por ejemplo, gliceraldehídos, arabinosa, lixosa, pentosa, ribosa, xylosa, galactosa, glucosa, hexosa, idosa, mannosa, talosa, heptosa, glucosa, fructosa, ácido glucónico, sorbitol, lactosa, mannitol, metol a-glucopiranosida, maltosa, isoascorbico ácido, ascorbico , lactonea, sorbosa, ácido glucárico, erithrosa, threosa, arabinosa, allosa, altrosa, gulosa, idosa, talosa, eritrulosa, ribulosa, celulosa, psicosa, tagatosa, glucuronica, ácido glucónico, ácido glucarico, ácido galacturonico, ácido mannuronico, glucosamina, galactosamina, sucrosa, trehalosa o ácido neuramínico, o derivativados polycarbohydratos que incluyen por ejemplo, arabinan, fructanes s, fucanes, galactanos, galacturonanos, glucanos, mannanos, xilanos (tales como, por ejemplo, inulin), levan, fucoidan, carrageenan, galactocarolosa, pectinas, ácidos pécticos, amilosa, pullulan, glicogen, amilopectin, celulosa, dextran, pustulan, chitina, agarosa, keratina, chondroitina, dermatan, ácido hialurónico, ácido algínico, xanthin gum, o féculas. Entre los carbohidratos particularmente útiles están la sacarosa, glucosa, lactosa, trealosa, y combinaciones de ellas. La sacarosa es un crioprotector particularmente útil.
Preferiblemente, el crioprotector de la siguiente invención es un carbohidrato o un azúcar de alcohol, que puede ser un alcohol polihídrico. Los compuestos polihídricos son compuestos que contienen más de un grupo hidroxila. Preferiblemente, los compuestos polihídricos son lineales. Tales compuestos polihídricos incluyen, por ejemplo glicoles tales como etilenglicol, polietilenglicol, glicerol, o pentaerinthritol, o combinaciones de ellos. En algunas modalidades preferidas, el agente crioprotector es sacarosa, trialosa, manitol o sorbitol. En otra modalidad, el crioprotector está en una concentración de cerca de 1.5% al cerca de 6% de su peso. Preferiblemente, el crioprotector es sacarosa a una concentración de alrededor de 5%.
Se ha encontrado que es deseable agregar un tensoactivo a la formulación preliofilizada. Alternativamente, o adicionalmente, el tensoactivo puede ser agregado a la formulación liofilizada y/o la formulación reconstituida. Tensoactivos incluyen tensoactivos no ¡ónicos tales como polisorbatos (por ejemplo, polisorbatos 20 u 80); poloxameros (por ejemplo; poloxámeros 188); Tritón; sulfato de sodio dodecilo (SDS); sulfato de sodio laurel; octil glicosida de sodio; lauril-, miristil-, linoleil-, o stearil-sulfobetaina; lauril-, miristil-, linoleil- o stearil-sarcosina; linoleil-, miristil-, o cetil-betaina; lauroamidopropil-, cocamidopropil-, linoleamidopropil-, myristamidopropil-, palnidopropil-, o isostearamidopropil-betaina (por ejemplo., lauroamidopropil); miristamidopropil-, palmidopropil-, o isostearamidopropil-dimethilamine; cocoil metil de sodio-, o oleil-taurata metil de sodio; y la MONAQUAT™ serie (Industrias Mona, Inc., Paterson, N.J.), polietil glicol, polipropil glicol, y copolimero de etileno y glicol propileno (por ejemplo, Pluronicos o PF68), y Tween 80. El tensoactivo en una modalidad, está en una concentración alrededor de 0.005% hasta cerca de 0.5% en peso. En una modalidad preferida el tensoactivo es polisorbato 80 a una concentración de 0.01% en peso o Tween 80 en una concentración de cerca de 0.01 % en peso.
Una formulación reconstituida es una que se ha preparado al disolver una formulación de anticuerpos liofilizado en un diluyente de tal forma que el anticuerpo se dispersa en la formulación reconstituida. La formulación reconstituida es adecuada para la administración (por ejemplo, administración parenteral) a un paciente para ser tratado con el anticuerpo de interés y, en ciertas modalidades de la invención, puede ser uno que es adecuado para la administración subcutánea.
Por isotónico se significa que la formulación de interés tiene esencialmente la misma presión osmótica como la sangre humana. Las formulaciones isotónicas tendrán generalmente una presión osmótica de aproximadamente 250 a 350 mOsm. La isotonicidad se puede medir utilizando una presión de vapor osmómetro de tipo congelado de por hielo, por ejemplo.
También se puede agregar un lioprotector a la formulación preliofilizada. Un lioprotector es una molécula que, cuando se combina con un anticuerpo de interés, evita significativamente o reduce la inestabilidad química y/o física del anticuerpo luego de liofilización y posterior almacenamiento. Lioprotectores de ejemplo incluyen azucares tales como sacarosa o trehalosa; un aminoácido tal como glutamato monosodio o histidina; una metilamina tal como botaina; un almidón liotropico tal como sulfato de magnesio; un poliol tal como alcoholes de azúcar trihídricos o mayores, por ejemplo, glicerina, eritritol, glicerol, arabitol, xilitol, sorbitol, y manitol; propileno glicol; propileno glicol; plurónicos; y combinaciones de estos. El lioprotector preferido es un azúcar no reductor, tal como trehalosa o sacarosa.
En modalidades preferidas el lioprotector es una azúcar no reductora tal como sacarosa o trehalosa. La cantidad de lioprotector en la formulación preliofilizada es generalmente tal que, luego de reconstitución, la formulación resultante será isotónica. Sin embargo, las formulaciones hipertónicas reconstituidas también pueden ser adecuadas. Adicionalmente, la cantidad de lioprotector no debe estar muy por debajo de tal forma que una cantidad no aceptable de degradación/agregación del anticuerpo ocurre luego de liofilización. En donde el lioprotector es un azúcar (tal como sacarosa o trehalosa), las concentraciones de lioprotector de ejemplo en la formulación preliofolizada son aproximadamente de 10Mm aproximadamente 400mM, preferiblemente aproximadamente 30mM aproximadamente 300mM, y mas preferiblemente de aproximadamente 50mM aproximadamente 100mM. La proporción del anticuerpo para el lioprotector se selecciona para alcanzar cada anticuerpo y combinación de lioprotector. En el caso de una azúcar (por ejemplo sucrosa o trehalosa), como el lioprotector para generar una formulación reconstituida isotónica con una alta concentración de anticuerpo, la proporción molar del lioprotector para el anticuerpo puede ser aproximadamente 100 aproximadamente 1500 moles de lioprotector a 1 mol de anticuerpo, y preferiblemente de aproximadamente 200 aproximadamente 1000 moles de lioprotector a 1 mol de anticuerpo, y mas preferiblemente aproximadamente 200 aproximadamente 600 moles de lioprotector a 1 mol de anticuerpo.
Se agrega el lioprotector a la formulación preliofilizada en una cantidad de lioprotector que significa que, luego de liofilización del anticuerpo en la presencia de la cantidad lioprotectora del lioprotector, el anticuerpo esencialmente retiene su estabilidad física y química de su integridad luego de la liofilización de almacenamiento.
El diluyente de interés aquí es uno que es farmacéuticamente aceptable (seguro y no tóxico para administración a un humano) y es útil para la preparación de una formulación reconstituida. Diluyentes ilustrativos ¡ncluyen agua estéril, agua bacterio estática, para inyección (BWFI), una solución amortiguadora de pH (por ejemplo, salina amortiguada con fosfato), solución salina estéril, solución de Ringers o solución de dextrosa.
Un preservativo es un compuesto que puede ser agregado al diluyente para reducir esencialmente la acción bacteriana en la formulación reconstituida, facilitando así la producción de formulación reconstituida multiuso, por ejemplo. Ejemplos de preservativos potenciales incluyen el cloruro de octadecilmetilbencilo amoneo, cloruro de hexametóneo, cloruro de benzalconeo (una mezcla de cloruros de alquibenzildimetilamonio en el cual los grupos alquilo son compuestos de cadena larga), y cloruro de benzetonio. Otros tipos de preservativos ¡ncluyen alcoholes aromáticos tales como fenol, alcohol de butilo y bencilo, parabens alilo tales como paraben de metilo o de propilo, catecol, resorsino, cicloexanol, 3-pentanol, y m-cresol. El preservativo más preferido aquí es el alcohol de bencilo.
Un agente de abultado es un compuesto que agrega más a la mezcla liofilizada y contribuye a la estructura física del ponqué liofilizado (por ejemplo, facilita la producción de un ponqué liofilizado esencialmente uniforme que mantiene una estructura de poro abierto). Los agentes de abultado ilustrativos ¡ncluyen manitol, glacina, polietilen glicol, y sorbitol.
En algunos casos, una mezcla del lioprotector (tal como sacarosa o trialoza) y un agente de abultado por ejemplo, manitol o glicina) es usado en la preparación en la formulación preliofilizada. El agente de abultado puede permitir la producción de un ponqué liofilizado uniforme sin bolsillos excesivos en él. Así, una gente de abultado puede también ser agregado antes de la liofilización. Agentes de abultado adecuados pueden tener una concentración de 0.5 a acerca de 1.5% por peso. Preferiblemente, el agente de abultado es Dextran 40 a una concentración de 0.9% en peso o almidón de hidroxietilo 40 a una concentración de 0.9$ en peso.
Otros portadores farmacéuticamente aceptables, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables tales como aquellos descritos en Remigntons Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) pueden ser incluidos en la formulación preliofilizada (ylo la formulación liofilizada y/o la formulación reconstituida) siempre que ellos no afecten adversamente las características deseadas de la formulación. Portadores, excipientes o estabilizadores aceptables son no tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas e incluyen agentes de amortiguación adicionales; preservativos; codisolventes; antioxidantes que incluyen ácido abscórbico y metionina; agentes como EDTA; complejos metales (por ejemplo, complejo de Zn-anticuerpo); polímeros biodegradables tales como poliésteres; y/o cuenteriones formadores de sal tales como sodio.
Las formulaciones a ser usadas para la administración in vivo deben ser estériles. Esto es fácilmente logrado por filtración a través de membranas de filtración estériles, antes de, o, luego de la liofilización y reconstitución. Alternativamente, la esterilidad de la mezcla completa puede ser lograda por autoclavado de los ingredientes, excepto para el anticuerpo, acerca de 120°C durante 30 minutos, por ejemplo.
Después de la preparación del anticuerpo de interés, una formulación preliofilizada es producida. La cantidad de anticuerpo presente en la formulación preliofilizada es determinada tomando en cuenta los volúmenes de dosis deseados, los modos de administración. El anticuerpo está generalmente presente en solución. Por ejemplo, como el anticuerpo pude estar presente en una solución con pH amortiguado. Los amortiguadores ilustrativos incluyen la histidina, el fosfato, Tris, Citrato, succinato y otros ácidos orgánicos. En una modalidad, el conjugado está a una concentración de 0.5 mg/mL hasta cerca de 2mg/mL y, preferiblemente, una concentración de 1 mg/mL. En una modalidad, el agente amortiguador está a una concentración de cerca de 5 mM hasta cerca de 50 mM. En una modalidad preferida, el agente amortiguador es Tris a una concentración de cerca de 20mM. Antes de la liofilización, el pH puede ser cualquier pH adecuado, por ejemplo, desde cerca de 7.8 hasta cerca de 8.2, y preferiblemente, alrededor de 8.0.
El electrolito en otra modalidad de la presente formulación está a una concentración de alrededor de 5 mM hasta cerca de 100 mM. Cualquier electrolito adecuado puede ser usado, tal como sodio, potasio, magnesio, cloruro, fosfato, y bicarbonato, por ejemplo. Preferiblemente, el electrolito es una sal de sodio o de potasio y, más preferiblemente el electrolito es NaCL a una concentración de alrededor de 10mM.
Después de que el anticuerpo, el lioprotector y otros y otros componentes opcionales son mezclados juntos, la formulación es liofilizada. Muchos secadores y congeladores diferentes están disponibles para este propósito tal como el Hull 50.TM. (Hull, USA) O GT20.TM (Leibol-Heraeus, Alemania) que son secadores congeladores. El secado por congelador se lleva a cabo por medio de congelar la formulación y subsecuentemente subliminizar con hielo desde el contenido congelado a una temperatura adecuada para el secado principal. Bajo esta condición, la temperatura del producto está por debajo del punto eutectico o la temperatura de colapso de la formulación. Típicamente, la temperatura de almacenamiento para el secado principal variará entre -30 a 25°C (siempre que el producto permanezca congelado durante el secado principal) a una presión adecuada que varia típicamente desde cerca de 50 a 250 m Torr. La formulación, tamaño y tipo del contenedor que sostiene la muestra (por ejemplo, un frasco de vidrio) y el volumen del líquido dictarán principalmente el tiempo requerido para el secado, que puede variar desde unas pocas horas a varios días (por ejemplo, 40 a 60 horas). Una etapa de secado secundario puede ser llevada a cabo entre cerca de 0 a 40°C dependiendo principalmente del tipo y tamaño del contenedor y del tipo de anticuerpo empleado. Sin embargo, se encontró aquí que una etapa de secado secundario puede no ser necesaria, por ejemplo la temperatura de almacenamiento durante la fase de remoción completa de agua de la liofilización puede estar entre cerca de 15 a 30°C (por ejemplo, cerca de 20°C). El tiempo y la presión requeridas para el secado secundario serán aquellas que produzcan un ponqué liofilizado adecuado, dependiente, por ejemplo, de la temperatura o de otros parámetros. El tiempo de secado secundario está dictado por el nivel de humedad residual deseado en el producto y típicamente toma por lo menos cerca de 5 horas (por ejemplo, 10-15 horas). La presión puede ser la misma que aquella empleada durante la etapa de secado principal. Las condiciones de secado por congelamiento pueden variar dependiendo de la formulación y el tamaño del frasco.
La liofilización de acuerdo con la presente invención puede comprender el congelamiento de la solución a una temperatura entre cerca de -35°C a cerca de -50°C; secar inicialmente la solución congelada a una presión de secado principal de 20 a 80 micrones a una temperatura de almacenamiento de cerca de -10° a -40° durante 24 a 78 horas; y secar secundariamente el producto secado por congelamiento a una presión de secado secundaria de 20 a 80 micrones a una temperatura de almacenamiento de +10° a 40°C durante 15 a 30 horas. El congelamiento puede llevarse a cabo a una presión de secado principal de 60 micrones y a una temperatura de almacenamiento de -30°C durante 60 horas y con la etapa de secado secundaria a una presión de secado de de 60 micrones y a una temperatura de almacenamiento de +25°C durante 24 horas.
Puede ser deseable liofilizar la formulación de anticuerpo en el contenedor en el cual la reconstitución del anticuerpo se va a llevar a cabo para poder evitar una etapa de transferencia. El contenedor de esta manera puede, por ejemplo ser un frasco de 3, 5, 1020, 50 o 100 cc.
Como una propuesta general, la liofilízación resultará en una formulación liofilizada en la cual el contenido de humedad de la misma es menos de cerca de 5%, y preferiblemente menos de cerca de 3%.
En la etapa deseada, típicamente cuando es el momento de administrar el anticuerpo al paciente, la formulación liofilizada puede ser reconstituida con un diluyente de modo que la concentración de anticuerpo en la formulación reconstituida sea por lo menos 50 mg/mL, por ejemplo, cerca de 50mg)mL hasta cerca de 400mg/mL, más preferiblemente desde cerca de 80MG/mL hasta cerca de 300mg/mL, y más preferiblemente desde cerca de 90mg/mL hasta cerca de 150mg/MI. Tales concentraciones altas de anticuerpos en la reformulación constituidas son considerados particularmente útiles donde el suministro subcutáneo de la formulación reconstituida es lo propuesto, sin embargo, para otras rutas de administración, tales como administración intravenosa, concentraciones más bajas del anticuerpo en la formulación reconstituida pueden ser deseadas (por ejemplo, desde cerca de 5 a 50mg/mL o desde cerca de 10 a 40 mg/MI de anticuerpo en la formulación reconstituida). En ciertas modalidades, ia concentración de anticuerpo en la formulación reconstituida es significativamente mayor que en la formulación preliofilizada. Por ejemplo, la concentración de anticuerpo en la formulación reconstituida puede estar en alrededor de 2 a 40 veces, preferiblemente 3 a 10 veces y más preferiblemente 3 a 6 veces (por ejemplo, por lo menos tres veces o por lo menos cuatro veces) aquella de la formulación preliofilizada.
La reconstitución generalmente tiene lugar a una temperatura de alrededor de 25°C para asegurar la hidratación completa, aunque otras temperaturas pueden ser empleadas según se desee. El tiempo requerido para la reconstitución dependerá, por ejemplo, del tipo de diluyente, la cantidad de excipientes y el anticuerpo. Diluyentes ilustrativos ¡ncluyen agua estéril, agua bacteriestática para inyección (BWFI), una solución con pH amortiguado (por ejemplo, salina amortiguada-fosfato, solución salina estéril, solución de Ringers o solución de dextrosa. El diluyente contiene opcionalmente un preservativo. Los preservativos ilustrativos han sido descritos anteriormente, con alcoholes aromáticos tales como alcohol de bencilo o de fenol. Siendo los preservativos preferidos. La cantidad de preservativo empleado es determinada para lograr diferentes concentraciones de preservativo para la compatibilidad con el anticuerpo y el ensayo de eficacia de preservación. Por ejemplo, si el preservativo es un alcohol aromático (tal como alcohol de bencilo), este puede estar presente entre una cantidad de 0.1 -2.0% y preferiblemente entre cerca de 0.5 - 1.5%, pero más preferiblemente cerca de 1.0 a 1.2%. Preferiblemente, la formulación reconstituida tiene menos de seis mil partículas por frasco que < 10? en tamaño.
La formulación reconstituida es administrada a un humano que necesita el tratamiento con un anticuerpo, de acuerdo con métodos conocidos, tal como administración intravenosa como un bolo o por infusión continua durante un período de tiempo, por vías intramusculares, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o por inhalación.
Un artículo de manufactura está provisto el cual contiene la formulación liofilizada de la presente invención y suministra instrucciones para su reconstitución y/o uso. Este artículo de manufactura o kit tiene (i) un contenedor que contiene las composiciones/formulaciones de la presente invención; y (ii) instrucciones para reconstituir la formulación liofilizada con un diluyente a una concentración de conjugado en la formulación reconstituida dentro del rango de 0.5 mg/mL. Contenedores adecuados incluye, por ejemplo, botellas, sascos (sascos de cámara dual), jeringas, (tales como jeringas de cámara dual) y tubos de ensayo. El contenedor puede estar formado de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El contenedor contiene la formulación liofilizada y el marcador en, o asociación con el contenedor puede indicar direcciones para su reconstitución y/o uso. Por ejemplo, la etiqueta puede indicar que la formulación liofilizada es reconstituida a concentraciones de anticuerpo como se describió anteriormente. La etiqueta también puede indicar adicionalmente que la formulación es útil o propuesta para administración subcutánea. El contenedor que contiene la formulación puede ser un frasco multiuso, que permite repetidas administraciones (por ejemplo, de 2-6 administraciones) de la formulación reconstituida. El artículo de manufactura puede adicionalmente comprender un segundo contenedor que comprende un diluyente adecuado (por ejemplo, BWFI). Luego de mezclar el diluyente y la formulación liofilizada, la concentración de anticuerpo final en la formulación reconstituida generalmente estará en por los menos 50mg/mL. El artículo de manufactura puede también incluir otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros amortiguadores, diluyentes, filtro, agujas, jeringas, e injertos de empaque con instrucciones de uso.
Una vez formuladas, las composiciones de la invención pueden ser administradas directamente al sujeto. Los sujetos a ser tratados pueden ser animales. Sin embargo, se prefiere que las composiciones estén adaptadas para administración a sujetos humanos.
Las composiciones de la presente invención pueden ser administradas por cualquier número de rutas incluyendo, pero sin limitarse a oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedularmente, intratecal, intraventricular, transdérmica, transcutánea (ver PCT Publicación No. WO98/20734) subcutpanea, intraperitoneal, intranasal, enteral, tópica, sublingual, intravaginal, o rectal. Los hiporoceados pueden también ser usados para administrar las composiciones de la invención. Típicamente, las composiciones pueden ser preparadas como inyectables, sea como soluciones o suspensiones líquidas. Las formas sólidas adecuadas para solución en o suspensión en, vehículos líquidos antes de la inyección también pueden ser preparadas.
EJEMPLOS MATERIAL Y MÉTODOS GENERALES CÉLULAS DE CARCINOMA Las líneas de células de carcinoma humano que expresan niveles variados de antígenos Lewis Y en la superficie fueron seleccionadas. Estas ¡ncluyen líneas de células que tenían un alta expresión del antígeno Lewis Y (carcinoma de pulmón L2987, carcinoma gástrico N87, carcinoma epidérmico A431/LeY, carcinoma de colon AGS, y carcinoma de colon LS174T), líneas de células que tenían una baja expresión del antígeno Lewis Y(carcinoma de colon LOVA y carcinoma de próstata LNCaP), y líneas de células que tenían un muy baja o ninguna expresión del antígeno Lewis Y (carcinoma de próstata PC3MM2, y carcinoma epidermoide A431 ). El estado de expresión de Lewis Y de las líneas de células de carcinoma usadas fueron confirmadas por citometría de flujo. Ejemplos de las líneas celulares usadas con las siguientes.
DLD-1 (CCL-221), HCT8S11/R1 y LOVO (CCL-229)son células de línea de carcinoma de colon que muestran el antígeno Ley sobre la membrana celular.
NCI-H157 (CRL-5802), NCI-H358 (CRL-5807) y A549 (CCL-159) son líneas de célula de carcinoma de pulmón. De estas tres líneas celulares, la NCI-H358 mostró niveles detectables de Ley sobre la superficie celular.
Carcinomas gástricos N87 (CRI-5802), y AGS (CRL-1739) expresan el Ley.
A431 (CRL1555) y A431/Le? son células de carcinoma epidermoide (cervical). Solamente la última variante expresa el Ley.
MDA-MB435 (Ley) y el MDA-MB (Ley) fueron usados como modelos para carcinomas de mama.
PC3-MM2 (Ley) y LNCaP (Ley, CRL-1740)fueron derivados de carcinomas de próstata.
Todas las líneas celulares excepto la HCT8S11 , HCT8S11/R1 , MDA-MB435, PC3-MM2 y A431/Ley, fueron compradas a la American Type Culture Collection (ATCC). Las líneas celulares obtenidas del ATCC fueron mantenidas en un medio de cultivo como se especifica en el catalogo ATCC. La HCT8S11 y la HCT8S11/R1 son un regalo del Dr. M. Mareel (university Hospital, Ghent, Bélgica). Estas células crecieron en RPMl 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal al 10% v/v (FBS), piruvato de sodio 1 mM, estreptomicina 100 µg/ml y penicilina al 100 U/ml (posteriormente llamada pen/strip). El MDA-MB435 y PC3-MM2 se obtuvo del Dr. I. Fidler (MD Anderson, TX). Estas células se cultivaron en un medio esencial mínimo suplementado con 10% v/v FBS, 2 mM de glutamina, 1 mM de piruvato de sodio, 0.2 mM de aminoácidos no esenciales, 2% de solución de vitamina MEM, y pen/strep. El A431/Ley se suministro por el instituto Ludwig Para La Investigación del Cáncer (Melbourne Australia). Ellos se cultivaron en DMEM/F12 suplementado con FBS al 10%, glutamina 2mM y pen/strep.
ANTICUERPOS El RITUXAN® (rituximab; I DEC Pharmaceuticals Corporation y Genentech, San Diego y San Francisco, CA) es un anticuerpo quimérico que combina las regiones variables de cadena pesada y ligera con las regiones constantes IgGI K humanas. El anticuerpo reconoce el marcador B-linfocito CD20. Para los análisis FACS, ellgG humano (hulgG, Zymed, San Francisco, CA) y el anti-hulgG de cabra marcado con FITC (FITC/a-hulgG, Zymed, San Francisco, CA) se utilizo como anticuerpo de control como un anticuerpo secundario, respectivamente. El RITUXAN se utilizó como un control negativo en razón a que los análisis FACS mostraron que el antígeno reconocido por R1TUXAN (CD20) estaba presente en cantidades en trazas sobre la superficie de las células utilizadas en los experimentos descritos. Un conjugado de calicheamicina de RITUXAN controlado para la función portadora de inmunoglobulinas y la liberación hidrolítica de calicheamicina.
MYLOTARG® (gemtuzumab ozogamicina, también denominada como CMA-676 o simplemente CMA) es un conjugado de calicheamicina (Wyeth, Madison, NJ).Se utilizó una tanda con una cantidad promedio de 35 ug de calicheamicina conjugada con 1 mg de anticuerpo. La porción de anticuerpo de CMA o CMA-676 es específica para CD33, que es un antígeno de diferenciación de leucocito expresado por células madre hematopoiéticas multipotenciales y células leucémicas miloides agudas. Ninguna de las células utilizadas en cualquiera de los experimentos descritos expreso niveles significativos CD33. De hecho, los análisis FACS mostraron que la cantidad de CMA unida a esta línea celular era similar que la cantidad hulgd de control que demuestra la falta de la expresión de CD33. La unión más alta del CMA se determino en las células PC3MM2 (re MCF=2.3).
Por lo tanto, el CMA también controla la eficacia del CM liberado sin el blanco del antígeno del conjugado.
ANÁLISIS DE RESONANCIA DE PLASMON (BIACORE) Los conjugados Lewis-BSA (es decir H tipo I- H tipo II-, Sialyl Lea-, Sialyl Lex-, Sulfo Lea-, Sulfo Lex-, Lea-, Leb-, Lex-, y Ley-BSA) se compraron de Alberta Research Council (Edmonton, Alberta, Canadá). La carga de antígeno/BSA estaba entre 20 a 42 antígeno de mole/mole de BSA. Cada antígeno se inmovilizó en la superficie de un chip biosensor CM5 a una densidad de 4.000 a 9.000 RU. El chip se activó al acoplar el reactivo EDC/NHS [1-etiI -3-(3-dimetilaminopropii)-carbodiimida-HCI]/[N-hidroxisuccinimida] a una velocidad de flujo de 5 µl/min durante 6 minutos seguido por la adición de los antígenos Lewis-BSA a 5 µl/min durante 6 minutos a una concentración de 50 µg/ml en 10mM de amortiguador de acetato de sodio pH 4.5. Los conjugados Sulfa/Lewis y Sialyl-Lewis-BSA se acoplaron al pH 4.0. Los sitios de unión excedentes fueron bloqueados con 1 M de etanolamina-HCI Ph 8.5 a 5 µl/min durante 6 minutos. Los análisis de especificidad de unión se desarrollaron en un amortiguador HBS-EP (10 mM HEPES, 150mM NaCI, 3 mM EDTA, 50 ppm de polisorvato 20) a una velocidad de flujo de 20 µl/min. El Hu3S193 se inyectó durante 3 minutos a 6.67 nN o 50 nM. La cantidad del anticuerpo que permaneció unido después de un lavado de 30 segundos con el amortiguador HBS-EP se midió. La superficie antihigiénica se regeneró mediante 10 mM de NaOH, 200 mM de NaC1 durante un minuto a 20 µl/min para restablecer una línea base.
Para los análisis cinéticos, se utilizó un anticuerpo en concentraciones de 1 a 16 nM. La densidad del Ley-BSA fue de 9.000. La asociación y disociación fueron medidas en el amortiguador HBS-EP durante 3 y 15 minutos a 30 µl/min.
ANÁLISIS- FACS La presencia de Ley sobre una serie de líneas de células tumorales humanas se evaluó mediante los análisis FACS. Las alicotas de 105 células se suspendieron en solución salina amortiguada en 100 µl de solución salina amortiguada con fosfato suplementada con 1 % v/v de de serum albúmina bovina (PBS/BSA). Las células fueron entonces incubadas a 4°C durante 30 minutos en varias concentraciones de anticuerpo primario hu3S193 o G193, hu3S193, o corrugado CM la unión del anticuerpo primario a la célula se reveló mediante el FITC marcado/a-hulgG.
Los valores MCF (fluorescencia de canal medio) son la intensidad fluorescente promedio de las poblaciones de célula luego de unirse con los anticuerpos primarios (hulgG y hu3S193) y el teñido consecutivo con el anticuerpo secundario marcado fluorescente.
El HulgG es un control negativo. El MCF es directamente proporcional al número de moléculas de anticuerpo primario de unión. La mayoría (8 de 13) de las líneas celulares investigadas expresaron Ley como se ve en al menos un incremento de 10 veces (MCF, reMCF relativo) del MCF después que el hu3S193 se unió sobre el CMF del control negativo. Los ejemplos de las líneas celulares con la alta expresión del Ley se encontraron en cada categoría de tumor histiotípico. Todas las células tumorales de origen colorectal y gástrico fueron Ley-positivas.
ED50 DE ANTICUERPOS Y ANTI-LEWIS CONJUGADOS A CALICHEAMICINA Un teñido de tinte vital (MTS) se utilizo para determinar el número de células supervivientes luego de la exposición a varios tratamientos. El MTS (kit de ensayo de proliferación de célula no radioactiva) se compró de Promega (Madison, Wl) y se utilizó de acuerdo a las especificaciones del fabricante. Para cada línea celular, se estableció una curva de calibración (numero de células versus densidad óptica después de 2 h) para estimar una densidad de sembrado inicial apropiado. Las células fueron sembradas en platos de 96 multipozos a una densidad de 750 a 5.000 células por pozo. Inmediatamente después del sembrado las células fueron expuestas a varias concentraciones (0, 0.01 , 0.05, 0.1 , 1, 10, 100, y 500 ng de equivalente de calicheamicina/ml) de CMA, hu3S193-AcBut-CM, o CM o a PBS. Cada pozo recibió 10 µl de 100x de solución de droga. Luego de la determinación del número de células supervivientes 96 h de exposición de la droga, el ED5o se calculó con base en los parámetros de regresión logística derivados de las curvas de respuestas a dosis. El ED50 se definió como la concentración molar de la droga (CM) que causó una reducción del 50% del número de células después de 96 horas de exposición a la droga. Se debe denotar que un equivalente de calicheamicina (cal. eq.) es la concentración de CM dada como sustancia pura o como un conjugado. Dependiendo de la cantidad de CM unido al anticuerpo (carga de droga de anticuerpo), un equivalente de calicheamicina de diferentes conjugados puede implicar diferentes concentraciones de proteína.
EJEMPLO 1. GENERACIÓN DE ANTICUERPOS Y ANTI-LEWIS Los anticuerpos Y anti-Lewis tipo silvestre (hu3S193) y mutante (G193) fueron generados. El murino 3S193 mAb se generó mediante inmunización de los ratones BALB/c con células positivas de adenocarcinoma humano para el antígeno Y Lewis. Una versión humanizada del anticuerpo 3S193 fue generada subsecuentemente (hu3S193). El análisis de especificidad detallado demostró que el hu3S193 fue altamente específico para Ley (no unido a los antígenos H-tipo 2 o tipo 1) y desplegaron solo reactividad cruzada mínima con el trisacarido Lex. La versión lgG1 mutada del hu3S193 (G193) difiere del hu3S193en que este tiene dos sustituciones de aminoácido en su dominio CH2, a saber: leucina (234) a alanina y glicina (237) a alanina. Además de la anterior dos mutaciones, habían dos mutaciones conservadoras adicionales (ácido espártico en la posición 358 a ácido glutámico, y metionina en la posición 360 a leucina) que corresponden a lo tipo Gmz en el dominio CH3 del lgG1. Así, el anticuerpo Y anti-Lewis IgGi mutante humanizado difirió de el hu3S193 en 4 residuos dentro de la región Fc; L236A, G239A, D358E, y M360L. Esta forma lgG1 mutante del anticuerpo Y anti-Lewis se denominó G193, expresado en células de ovario de hámster chino, y se utilizó para crear CMD-193. La figura 7 suministra una comparación de las secuencias de aminoácido de las cadenas pesadas secretadas maduras de los dos anticuerpos. En esta figura, los residuos mutantes son negreados y resaltados y el CDRs es negreado y sombreado.
CONDICIONES DE CÉLULAS Y CULTIVO Las células de hibridoma que expresaron el anticuerpo hu3S193 se obtuvieron del Ludwig Institute for Cáncer Research. La Hu3S193 es un anticuerpo anti-Ley humanizado (lgG1) derivado del anticuerpo monoclonal de ratón MuS193, que ha sido trabajado por ingeniería de tal forma que solamente las regiones de determinación complementarias son de origen murino.
La línea celular es una línea celular dependiente de colesterol y requiere la adición de colesterol en el medio de crecimiento Hyclone HyQ- CCM®1 (Hyclone Labs, Logan, Utah). En razón a que el colesterol no es soluble en agua, el medio se suplemento con 0.2 % de ExCyte VLE (Miles Pentex, Kankake, IL). Las células se mantuvieron a 37°C en 5 % de CO2. Las células COS-7 se compraron del ATCC (Rockville, Maryland) y se mantuvieron en un medio Eagle Modificado Dulbeccos (DMEM), suplementado con 10 % de suero bovino fetal (FBS) y 2 mM de glutamina, 100 U/ml de penicilina, y 10 µg/ml de estreptomicina (en lo sucesivo denominada pen/strep).
Las células PA-DUKX 153.8 son deficientes en producción de dihidrofolato reductasa (dhfr). Estas células se mantuvieron en un medio esencial mínimo (MEM-a, Gibco BRL, Grand Island, NY) suplementadas con 10 µg/ml de adenosina, desoxiadenosina, y timidina (Sigma, St, Louis, MO), 10 % de FBS, 20 mM HEPES, 0.1 % de bicarbonato de sodio, 2 mM de glutamina y pen/strep. Después de la transfeccion de las células crecieron en ausencia de nucleótidos y se mantuvieron con un mg/ml de G418 (Gibco) y 250nM de metotrexato (Sigma) como marcadores de selección.
VECTORES Para crear unas construcciones de cadena pesada y ligera de los anticuerpos Y anti-Lewis tipo silvestre (hu3S193) y mutante (G193), se utilizaron los siguientes vectores: vectores Kappa PED6_HC_lgG1 , PED6_HC_mlgG1 y pED6_LC. El vector PED6_HC_mlgG 1 contiene la plantilla para un dominio CH2 mutado (los vectores codifican Alanina tanto en la posición 234, remplazando una leucina y en la posición 237, remplazando una glicina). El ADN de la región variable de la cadena ligera del hu3S193 se ligó entre el BssH II y los sitios de restricción Pací del vector de expresión pED6_LC K el ADN de la región variable de la cadena pesada del hu3S193 se ligó entre los sitios de restricción de BssHIl y Sal I del vector de expresión pED6_HCIgG1. El vector pED6_Hc_mlgG1 se utilizó para generar la cadena pesada de G193. Este vector difirió del pED6_HC_lgG1 en la secuencia de su dominio. La expresión del pED6_HC_mlgG1 produjo una cadena pesada con Alanina sustituyéndola por leucina (234) y glicina (237).
El ADN que codifica la región variable y constante de la cadena pesada del G 193 o del hu3S193 se cortó del plasmado pED6_LCk ligado entre los sitios de restricción PpUM y EcoR I del vector pMEN2. El ADN que codifica a la región variable y constante de la cadena pesada del G 193 por hu3S193 se cortó de los vectores pED6_HC_lgG1 o pED6_HC_mlgG1 y se insertaron entre los sitios de restricción Bgl II y Xba I del vector pTDMEDL.
EXTRACCIÓN Y CLONACIÓN El ARN se extrajo de las células que producen hu3S193 por medio de un kit RNAzolB (RNAzol B, TEL-TEST, Inc., Friendswood, TX) de acuerdo a las instrucciones del fabricante utilizando un kit (Stratagene, La Jolla, CA), el ARN extraído se transcribió en un cADN de hebra simple. 10 µg del ARN total se mezclaron con un iniciador oligo dT. Esta mezcla de reacción se calentó a 65°C durante 5 minutos y fue lentamente enfriada hasta 22°C. El primer cADN de hebra se sintetizó en una mezcla que contiene 5 µl del amortiguador de primer hebra concentrado 10 veces, 5µl DTT, 1µl de bloque ARNse, 2 µl de DNTPs (1.25mM) y 1 µl de transcriptasa inversa MMLV (20U/µl) en un volumen total de 50 µl. Los componentes fueron mezclados suavemente e incubados a 37°C durante 1 hora. Este cADN se utilizó para amplificar tanto el VH como el VK del hu3S193. Los siguientes iniciadores se utilizaron para la reacción de cadena de polimerasa (PCR): Hu3S193. VH UP (BssH ll) GCTTGGCGCGCACTCC GAG GTC CAA CTG GTG GAG AGC GGT GGA GGT GTT (SEQ. ID. NO.1 ) Hu3S193 VH DN (Sal l) GGACGTCGACAGGACTCACC TGA GGA GAC GGT GAC CGG GGT CCC TTG GCC CCA GTA AGC AAA (SEQ. ID.NO.2) Hu3S193 VK UP (BssH ll) GCTTGGCGCGCACTCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG A (SEQ.ID.NO.3) Hu3S193 VK DN (Pac l) GCCCTTAATTAAGTTATTATTCTACTCACG TGT GAT TTG CAG CTT GGT CCC TTG GCC GAA (SEQ.ID.NO.4) La reacción PCR se llevó a cabo de una mezcla de 5 µl de la primer hebra de c ADN, 100 ng del iniciador con sentido y 5 µl de amortiguador de polimerasa 10X PFU, 500 µM de MgCI , 1.25 mM de DNTPs y un µl de enzima PFU (2 U/ µl) en un volumen total de 50 µl. La reacción consistió de 35 ciclos alternantes de desnaturalización (95°C-1 min) y la síntesis (72°C-4 min) y un ciclo de terminación (72°C-7 min). El producto de reacción finalizo mediante electroforesis en 1 % de agarosa. Los productos PCR se purificaron, el producto PCR de cadena pesada se digirió con BssH II y Sal l y se ligó en los vectores de expresión pED6_HC_mlg1 o pED6_HCJg1 digerido con BssH ll/Sal l para crear las construcciones de cadena pesada G193 y hu3S193, respectivamente. El producto PCR de cadena similarmente ligera se digirió con BssH I I/Pac I y se ligo en un vector de expresión Kappa pED6_LC digerido con BssH I I/Pac I para crear la construcción de cadena ligera G 193. Los vectores pED se utilizaron para determinar la expresión del anticuerpo en un experimento de transfección transitoria.
Además, los vectores pED que contenían en la cadena pesada y ligera del G 193 o el hu3S193 se subclonaron en el pTDMEDL-DHFR/VH y el pMEN2-Neo/VK. Para hacer esas construcciones, el hu3S193 pED6_HC_mlgG1 VH (hu3S193 VH+ CH1+ mtCH2+CH3) y hu3S193 pED6_HCJgG1 VH (hu3S193 VH+ CHI+CH2+CH3) fueron digeridos con Bgl II y Xba l y ligados al Bgl ll/Xba I ligados al vector pTDMEDL digerido con Bgl ll/Xba I para crear el G193 VH/pTDMEDL-DHFR o el hu3S193 VH/pTDMEDL-DHFR. De manera similar el pED6_LC Kappa hu3S193 VK se digirió con PpUM y EcoR I (hu3S193 VK+CK) y se ligo en el vector pMEN2 es digerido con PpUM y EcoR I para crear el Hu3S193 VK7pMEN2-Neo. La secuencia para el G193 mAB es la SEQ. ID NO: 13.
LIGACIÓN, TRANSFORMACIÓN, Y PURIFICACIÓN DE PLASMIDO Los productos digeridos fueron ligados con ligasa ADN T4 (Gibco) a 12°C durante toda la noche y transformados en células de DH5a. Las colonias siempre se inocularon en cultivos de LB de 2ml en la presencia de ampicilina de 50 µg/ml de ampicilina y crecieron a 37°C durante toda la noche. El mapeo de restricción sobre los ADN miniprep confirmo la longitud apropiada de los insertos luego de la confirmación el ADN maxiprep se hizo utilizando Qiagen-Kit (Qiagen, Valencia, CA) de acuerdo con la recomendación del fabricante.
SECUENCIACIÓN DEL ADN VH Y VK El ADN maxiprep se envió a la instalación núcleo de ADN para secuenciar la cadena pesada y ligera variable de hu3S193. La secuencia de ADN se determinó como sigue. Un robot Qiagen de 9600(Qiagen) hecho de minipreps luego del método turbo prep suministrado por el fabricante. Cien ug del ADN miniprep se mezcló con el ADN iniciador con 20pMde ADN iniciador en 13µl de H2O. El ADN luego se desnaturalizó al calentar (98°C, 5 min) y enfriar (4°C, 5min). Ocho µl de Big Dye Terminators (ABI. Foster City. CA) agregó al AND desnaturalizado. La mezcla se calentó a 98°C y se sometió a una serie de 25 termociclos (96°C, 20 s; 55°C, 20 s; 62°C, 120 s) y 20 termociclos (96°C, 20 s; 60°C, 120 s) las mezclas de reacción se filtraron a través de placas de filtración de 96 pozos Biosystem (Edge, Gaithersburg, MD) para remover el exceso de terminadores de tinte. Los fragmentos de ADN fueron entonces analizados sobre un secuencíador de disposición capilar 3700 (ABI). La secuencia tanto de la cadena pesada como ligera del G193 y el hu3S193 se representan en las figuras 7 y 8.
TRANSFECCION TRANSITORIA DE LAS CÉLULAS COS-7 La expresión del anticuerpo se confirmó luego de la transfección transitoria de las células COS-7. Un millón de células COS-7 se pusieron en placas sobre un plato de 6 pozos. Al siguiente día, las concentraciones equimolares (una mezcla de 1 µg de cada una) de cualquiera del hu3S193 pED6_HC_mlgG1 VH y hu3S193 pED6_HC_mlgG1 VH o hu3S193 pED6_HC_lgG1 VH y hu3S193 pED6_HC_lgG1 VH se diluyeron en 250 µl de DMEM libre de suero. También, 6 µl de 1 mg/ml de lipofectamina (Invitrogen) también se diluyeron en 250 de DMEM libre de suero. El ADN y la lipofectamina se mezclaron y se encubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Esta mezcla se agregó a las células (las células fueron lavadas con un medio libre de suero antes de la exposición del complejo de ADN-lipofectamina). Después de la incubación a 37°C durante 8 horas, se agregó medio fresco a las células. El medio de cultivo que fue expuesto a las células durante 48 horas fue ensayado para la presencia de anticuerpo mediante FACS y el análisis BIAcore.
LÍNEAS DE CÉLULAS ESTABLES Luego de la confirmación de la expresión del anticuerpo, las líneas estables que expresan los anticuerpos lgG1 Y anti-Lewis mutante (G193) y tipo silvestre (hu3S193) se generaron en células PA-DUKX 153.8 como sigue. Cinco millones de células fueron puestas en placas en platos con un diámetro de 10 cm. Después de 16 h, una mezcla equimolar (10 µg de cada una) de G193 VH/pTDMEDL (clon # 18) y VK/pMEN2 (clon # 1) o las construcciones equivalentes para el hU3S193 se diluyeron con 1.5 ml de MEM-a libre suero. 60 µl de lipofectamina también se diluyeron con 1.5 ml de MEM libre de suero. El ADN y la lipofectamina se mezclaron e incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Esta mezcla se agregó a las células que fueron entonces ubicadas a 37°C durante 8 horas. Después de este periodo la mezcla se reemplazo con 15 ml de medio de crecimiento fresco. Después de 24 horas, las células de cultivo se pasaron en una dilución 1 :10 a un medio de crecimiento (sin ribonucleosidos y desoxirribonucleosidos) que contienen un 1 mg/ml de G418 en una concentración que se incrementa a manera de etapas en Metotrexato fresco (20, 40, 80, 100, 120, 160, 200, y 250 nM/ml). Las colonias fueron picadas y expandidas. El medio de cultivo acondicionado de estos clones se analizó mediante FACS, BIAcore y ELISA. Las líneas de célula estable expresaron el G 193 o el hu3S193 se utilizaron entonces para producción en masa y purificación del anticuerpo.
FUNCIONES EFECTUADORAS DEL G193 Para determinar las capacidades del y efectuadoras del G193 y su conjugado, el CMD-193, ambas fueron examinadas utilizando ambas células de carcinoma gástrico N87 que tuvieron expresión del antígeno Y Lewis y de las células de carcinoma de epidermoides A431 que tuvieron muy baja o ninguna expresión del antígeno Y Lewis. El anticuerpo Y anti-Lewis lgG1 humanizado tipo silvestre hu3S193, se utilizó como un control positivo. Este anticuerpo ha sido mostrado por mediar tanto las actividades ADCC como las CDC. Células mononucleares de sangre periférica o humana recientemente aisladas (PBMNC) fueron utilizadas como una fuente de las células efectuadoras durante los ensayos ADCC y suero humano recientemente preparado se utilizó como una fuente del complemento en los ensayos CDC.
La actividad CDC del G193 y el CMD-193 se evaluó utilizando un número fijo de células tumorales cultivadas durante 4 h con diferentes concentraciones de anticuerpos Lewis Y en la presencia de una dilución 1 :100 de suero humano fresco como una fuente de complemento. La actividad de la Lactato deshidrogenasa liberada como resultado de la lisis de las células tumorales se midió. La liberación de la actividad LDH por un detergente noniónico se midió como una representación de la lisis total. La evaluación similar se condujo con células A431 que expresan un alto nivel de Lewis Y (Lewis Y+++), es decir Lewis Y alto.
La actividad ADCC del G193 y el CMD-193 se determinó utilizando un número fijo de células tumorales cultivadas durante 4 horas con diferentes concentraciones de anticuerpo anti-Lewis Y en la presencia o ausencia de células mononucleares de sangre periférica utilizadas como células efectuadoras en la célula efectuadora: proporción de célula blanco de 50. La actividad de lactato deshidrogenasa liberada como resultado de la lisis de las células tumorales se midió. La liberación de la actividad LDH por un detergente noniónico se midió como una representación de la lísis total. Se condujo una evaluación similar con las células Lewis Y+++ N87.
Tanto el anticuerpo anti-Lewis Y lgG1 mutante como el lgG1 tipo silvestre fueron igualmente capases de mediar tanto las actividades ADCC como CDC contra las células de carcinoma N87 que tuvieron una alta expresión de antígeno Lewis Y como se muestra en las figuras 24 y 25. la actividad similar de cualquier anticuerpo no se observó contra las células A431 y tuvieron muy poca o ninguna expresión del antígeno Lewis Y. como contraste, a la versión lgG4 del anticuerpo anti-Lewis Y con secuencias VH y VK idénticas a aquellas del hu3S193 y G193 fueron incapaces de promover ambas actividades ADCC y CDC. El isotipo lgG4 humano es conocido por ser deficiente en su capacidad para mediar ADCC y CDC, inconsistente con esta noción, el anticuerpo lgG4 anti Lewis Y es inactivo en los ensayos ADCC y CDC.
Estos resultados sugieren que la introducción de las mutaciones L236A y G239A en el Fc del G193 no hace en el G193 deficiente en sus capacidades funcionales efectuadotas. El CMD-193 también fue tan efectivo como el G193 en mediar la actividad CDC contra las células de carcinoma N87 que tuvieron una alta expresión del antígeno Lewís Y.
Estos resultados indican además que la conjugación del G193 a la calicheamicina no altera la capacidad del G193 para mediar la actividad CDC. Así, tanto el G193 como el CMD-193 son capaces de mediar las actividades funcionales efectuadotas, y el CMD-193 es un conjugado de anticuerpo competente de función efectuadora. EJEMPLO 2. CONJUGACIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-LEWIS Y A CALICHEAMICINA Los anticuerpos fueron inicialmente conjugados a calicheamicina (CM) como sigue. El anticuerpo en una concentración de proteína de aproximadamente 10mg/ml se ajusto a un pH 8-8.5 con un amortiguador no nucleofílico de alta molaridad (HEPES 1 M). Luego, un excipiente (octanoato de sodio) que evita la agregación de proteínas se agregó a una concentración final de 0.1-0.2M. Finalmente, 5% de la masa de proteína del derivado de calicheamicina activado se agregó como una solución concentrada (10-20 mg/ml) en un solvente orgánico (etanol o dimetilformamida). Esta mezcla de reacción fue entonces incubada a 25-35°C durante 2 h. el progreso de la reacción se monitoreó mediante SEC-HPLC. Después de completar la reacción el conjugado se separó del anticuerpo agregado y la calicheamicina libre sobre una columna SEC preparativa. La cantidad de CM por anticuerpo de preparaciones de conjugado que se utilizaron en los presentes experimentos varió entre 22 y 47 µg/mg y entre 17 y 30 µg/mg para hu3S193-AcBut-CM y RITUXAN-AcBut-CM, respectivamente.
OPTIMIZAR CONDICIONES DE CONJUGACIÓN En una reacción de conjugación típica, el anticuerpo anti-Lewis Y humanizado (hu3S193) se conjugó al NAc-gamma-calicheamicina-DMH-AcBut-OSu (derivado de calicheamicina) donde la concentración de proteína blanco fue de 10 mg/ml y la carga de derivado de calicheamicina blanco fue de 7.0% en peso de la proteína. El pH de la reacción blanco fue de 8.2±0.2 y la concentración blanco de los otros componentes de reacción fue como sigue: 50 mM HEPBS, 10 mM de desoxicolato de sodio, y 9% v/v de etanol. La reacción se condujo a 33±2° C durante una hora. Los resultados del análisis de esta reacción típica antes de la purificación fue como sigue: proteína: 9.92 mg/ml; carga de caliquemicina: 70 mcg/mg; agregado: 1.9%; proteína no conjugada (LCF): 0.81 %.
El efecto de varios aditivos de tensoactivo y su concentración sobre el rendimiento del producto y la pureza fueron ensayados para determinar su efecto sobre la producción del monómero conjugado de hu3S193. Los resultados son mostrados adelante en la tabla 2. Las reacciones fueron realizadas donde todas las variables fueron mantenidas constantes excepto para el aditivo y su concentración. Los conjugados producidos de estas reacciones fueron analizados para el agregado, LCF y la recuperación de proteína. Aunque varios aditivos produjeron conjugados con bajo agregado o bajo LCF, solamente el Desoxicolato produjo un conjugado con bajo agregado, bajo LCF y alta recuperación de proteína.
TABLA 2 El octanoato es el catalizador estándar utilizado en la reacción de conjugación CMA-676, mientras el decanoato es un catalizador estándar utilizado en la conjugación estándar CMC-544. Los resultados del desoxicolato son el promedio de 5 reacciones con el rango en paréntesis. Otros miembros de la familia del ácido de bilis de los detergentes fueron ensayados y dieron resultados similares.
El agregado porcentual y la proteína libre porcentual en el extremo de la reacción de conjugación se determinó para varios anticuerpos lgG1 e lgG4 utilizando octanoato, decanoato, y desoxicolato. Los anticuerpos lgG1 ensayados fueron G193 y un anticuerpo de control, mAb 01 , mientras que los anticuerpos lgG4 ensayados fueron G193 con una región constante lgG4 (G193-lgG4), mAb 676 del conjugado CMA-676, mAb G544 del conjugado CMC-544, y el anticuerpo de control, mAb 02. Como se muestra adelante en la tabla 3, la conjugación de los anticuerpos lgG1 en la presencia de desoxicolato resulto un agregado en bajo porcentaje y una proteína no conjugada en bajo porcentaje (o LCF), mientras la conjugación en la presencia del octanoato o decanoato dio como resultado un agregado con alto porcentaje o una proteína no conjugada con alto porcentaje. Esto es en contraste a los anticuerpos lgG4, que tenían bajo agregado porcentual y baja proteína no conjugada porcentual cuando se conjugaban en la presencia de decanoato o desoxicolato TABLA 3 promedio de tres procedimientos DIFERENTES CARGAS DE DROGA DEL CMD-193 Diferentes cargas de droga de calicheamicina por anticuerpo anti- Lewis Y (G193)se evaluaron. Las preparaciones CMD-193 con las cargas de droga de 30,60 a 90 mg de NAc-gamma calicheamicina DMH por miligramo de anticuerpo G193 se generaron y administraron IP Q4Dx3 a dosis de 160 mg de equivalente de calicheamicina por kilogramo en ratones semi injertados N87. La eficacia del antitumor del CMD-193no se impacto por las diferencias en la carga de droga.
Como se mostró en la figura 23, la eficacia antí tumoral del CMD-193 con diferentes cargas de calicheamicina fue esencialmente idéntica.
En razón a que el anticuerpo blanco no conjugado G193 es inefectivo en mediar actividad antitumoral, la eficacia antitumoral total del CMD-193 se puede atribuir a la calicheamicina como blanco a las células tumorales. Estos resultados también sugieren que el grado de conjugación de la calicheamicina (carga) en el rango de 30 a 90 µg/mg de CMD-193 no impacta su resultado terapéutico.
PURIFICACIÓN CROMATOGRÁFICA En el material de partida para la purificación fue una mezcla de reacción de conjugación que contiene 9.92 mg/mL de proteína en una carga de derivado de calicheamicina de 70 µg/mg, con un contenido de agregado de 1.9% (área porcentual de (HPLC), y un contenido LCF de 0.82% (área porcentual de HPLC). Después de que se completo la reacción de conjugación la mezcla de reacción se diluyó 10 veces mediante la adición de solución de fosfato de potasio hasta una concentración de fosfato final de 0.6 M (pH 8.2). Después de mezclar esta solución se filtró a través de filtros de 0.45 micron. La solución diluida se cargó sobre una columna de flujo rápida de Butil Sefarosa 4. La cantidad total de proteína cargada sobre la columna fue de 20mg por mL de volumen del hecho. Después de un lavado con fosfato de potasio 0.6 m, la columna se diluyo utilizando un gradiente de etapa de 0.6 M a 4mM de fosfato de potasio pH 8.2 (alternativamente, la columna se puede diluir con 20 mMde Tris/25 mM NaCI). Las fracciones del gradiente de etapa fueron reunidas y la reunión contenía: proteína 8.3 mg/mL; calicheamicina 69.3 mcg/mg; agregado 0.42%; LCF: 0.31 %.
El intercambio de amortiguador se logró utilizando ultrafiltraciones/diafiltracion con una membrana de celulosa regenerada. El conjugado se diafiltró contra 20mM de Tris/10 mM NaCI, pH 8.0 (10 diavolumenes). O la cromatografía de expresión de tamaño o la ultrafiltracion/diafiltracion se puede utilizar para procesar la reunión de un amortiguador apropiado para la formulación.
EJEMPLO 3. ESPECIFICIDAD Y CINÉTICA DE LOS CONJUGADOS DE CALICHEAMICINA DE ANTICUERPO ANTI-LEWIS Y Para averiguar que la conjugación de calicheamicina al tipo silvestre (hu3S193) y al anti-Lewis Y mutante (G193) no borra la unión al Ley, estos anticuerpos y sus respectivos conjugados fueron sometidos a análisis de resonancia de plasmon (BIAcore) y/o análisis FACS. El Hu3S193, así como también el hu3S193-AcBut-CM, solamente reconoció el Ley- BSA y ninguno de los siguientes antígenos de oligosacárido: H tipo I, H tipo II, Sialil-Lea, Sialil-Lex, Sulfo-Lea, sulfo-Lex, Lea, Leb o Lex. Las cinéticas de la unión del hu3S193-AcBut-CM difirieron de aquellas del hu3S193. El Ka y el Kd del anticuerpo también se alteraron mediante la conjugación CM.
Tomados juntos como los resultados del análisis BIAcore y el FACS indicaron que la conjugación del CM al hu3S193 o al G193 no afectaba la especificidad para las células positivas Ley-BSA o para el Ley (datos no mostrados). Los parámetros cinéticos alterados del hu3S193-AcBut-CM comparados con el hu3S193 no necesariamente se traducían en diferentes cantidades o conjugado de anticuerpo que se pudiera unir a las células N87.
ANÁLISIS BIACORE Para confirmar la especificidad del G193, hu3S193, hu3S193-AcBut-CM y CMD para el Ley, la afinidad de los anticuerpos y sus conjugados CM para varios antígenos relacionados con Ley se examinaron al utilizar análisis de resonancia de plasmon de superficie utilizando BIAcore 3000. El Y-BSA Lewis (30 moles de Lewis Y/mole de BSA) se inmovilizó sobre un chip biosensor y se expuso a varias concentraciones de varios agentes reactivos a Lewis Y (2,4, 8, 12, y 16 nM). El G193 y hu3S193, el hu3S193-AcBut-CM y CMD-193 se une al Ley-BSA con idéntica afinidad y especificidad como el hu3S193. Los parámetros cinéticos determinados mediante BIAcore confían en la unión del anticuerpo o conjugado al sustrato Ley-BSA artificial.
Los tres anticuerpos tenían constante cinéticas idénticas. Estas evaluaciones indicaron que los anticuerpos anti-Lewis Y no conjugados, G193 y hu3S193, se unen a Lewis Y-BSA con una afinidad modesta (rango KD 100-300 nM). Como se muestra delante en la tabla 4, la conjugación a la calicheamicina dio como resultado una ligera reducción en la resistencia de unión al Lewis Y de estos anticuerpos en este sistema artificial. El CMD-193 se une al antígeno Lewis Y con una baja afinidad y un alto KD nanomolar.
TABLA 4 Los anticuerpos solo reconocieron el Ley y ninguno de los oligosacáridos relacionados. La unión del G193, hu3S193 y sus conjugados de calicheamicina a varios antígenos de carbohidratos estructuralmente relacionados con el Lewis Y también fueron investigados utilizando análisis de biosensor. Varios antígenos relacionados con Lewis Y conjugados al BSA se inmovilizaron sobre los chips de biosensores se expusieron a los anticuerpos anti-Lewis Y y sus conjugados de calicheamicina. Estos resultados, mostrados en la figura 20, indicaron que el G193 y el CMD-193 son específicos para el antígeno Lewis Y y no exhiben ninguna unión a aquellos antígenos que son estructuralmente más cercanos al Lewis Y, el Lewis Y y los antígenos del grupo sanguíneo H-2. Estos resultados también sugirieron adicionalmente que la conjugación a la calicheamicina no altera la especificidad del antígeno de los anticuerpos anti-Lewis Y.
ANÁLISIS FACS Para verificar si la conjugación afectaba la unión de las células hu3S193 ha Ley más las cantidades de hu3S193 y hu3S193-AcBut-CM que se unen a las células N87 se compararon mediante citometrina de flujo (FACS). La florescencia de canal medio (MCF) obtenida después de exponer N87 varias concentraciones de hu3S193 o hu3S193-AcBut-CMfueron similares. Las células N87 se encubaron con varias concentraciones de hu3S193 y hu3S193-AcBut-CM. La cantidad de conjugado o de anticuerpo de unión se expresó como MCF. La tabla 5 de adelante muestra la detección de citometria de flujo de la unión de hu3S193 a varias líneas de célula de carcinoma (un lgG1 humano se utilizo como un anticuerpo de control). El estado de expresión de Lewis Y se asigno arbitrariamente con base en la proporción del MCF con el anticuerpo-MCF anti-Lewis Y con anticuerpo de control. Es la proporción en el rango de 3-10 significa nivel +, o más nivel que entre 10 y 100 indica nivel ++, que entre 100 y 300 indica nivel +++, y que mayor de 300 indica nivel ++++ de la expresión Lewis Y. con base en la evaluación inicial las líneas de célula de carcinoma que expresan alto o bajo Lewis Y fueron utilizadas en estudios adicionales.
TABLA 5 El G193 y hu3S193 conjugan la unión similarmente que el hu3S193 a las células de carcinoma gástricos Ly+ (N87) en cultivo. Los valores de MCF (florescencia de canal medio) se determinaron después de exponer las monocapas N87 varias concentraciones de hu3S193 o las G193 también fueron idénticas. De esta manera, además de igualar la unión al Ley-BSA demostrada con BIAcore, la unión de hu3S193, G193, y hu3S193 al Ly naturalmente desplegado también fue idéntico.
FARMACOCINÉTICAS Los estudios farmacocinéticos con CMD-193 consistieron en lo siguiente: la validación de los ensayos de inmunoabsorventes ligados a encima (ELISA) para determinar las concentraciones de CMD 193 (ratas), el anticuerpo G 193 (ratas, perros),derivados de calicheamicina no conjugados (ratas, perros), total derivados de calicheamicina (ratas, perros), y la presencia de anticuerpos específicos para CMD-193 en suero de rata y para el anticuerpo G 193 en suero de perro; la evaluación farmacocinética del anticuerpo G 193 después de la administración de una dosis intraperitoneal simple (IP) de CMD-193 en ratones hembra desnudos; el metabolismo in vitro de la gama calicheamicina dimetil hidracida(CM)y NAc gama calicheamicina DMH AcBut en microsomas y citosol de hígado humano, y la NAc gama calicheamicina de DMH en células de leucemia promielocítica HL 60.
Para el estudio farmacocinético in vivo en ratones desnudos, el CMD-193 se administró IP en un vehículo que contenía 5% de sucrosa, 0.01 % de polisorbato 80, 2.92 mg/mL (50 mM)de cloruro de sodio, 2.42 mg/mL (20 mM) de Tris, y agua estéril para inyección, el pH ajustado a 8.0. En este estudio, la carga fue aproximadamente 75 mg de derivado de calicheamicina/mg de anticuerpo, que es equivalente a aproximadamente 6 moles de calicheamicina/mol del anticuerpo.
Las farmacocinéticas del anticuerpo G 193 después de una administración de IP de dosis simple de CMD 193 a una dosis de 15 mg de equivalentes de calicheamicina/kg (la dosis de eficacia mínima (MED)) en ratones desnudos hembra se caracterizaron por una proporción de absorción moderada y una vida media terminal aparente larga (t1/2). El área media bajo la curva de concentración versus tiempo (AUCO-Y) del anticuerpo G 193 fue de 222 mg.h/mL.
La muerte metabólica de la NAc gama calicheamicina DMH y NAc gama calicheamicina DMH AcBut se examino in vitro en microsomas de hígado humano y citosol, y La muerte metabólica de la NAc gama calicheamicina DMH se examinó en células de leucemia promelocitica HL-60. Muchos metabolitos se encontraron después de la incubación en microsomas de hígado humano y citosol. Las sendas de biotransformación en microsomas fueron la hidroxilación y demetilación, mientras que la formación NAc-epsilon calicheamicina o sus derivados parecieron ser las sendas principales en citosol. Varios metabolitos, incluyendo la calicheamicina NAc-epsilon y su isómero, se produjeron durante la incubación con las células de leucemia HL-60. Los metabolitos comunes se observaron en ambos preparaciones de célula de hígado y leucemia, sugiriendo que el metabolismo de los derivados de calicheamicina no puede ser específico de célula. La detección de la NAc-epsilon calicheamicina y sus derivados en células sostienen la hipótesis de que las especies de diradicales reactivas de NAc-epsilon calicheamicina probablemente esta formada por vía de la reducción dependiente de glutathione del enlace de disulfuro de la NAc-gama calicheamicina DMH dentro de las células.
EJEMPLO 4. EFICACIA DE LOS CONJUGADOS DE CALICHEAMICINA DEL ANTICUERPO ANTI-LEWIS-Y EN CRECIMIENTO IN VITRO DE LÍNEAS DE CÉLULA DE CARCINOMA HUMANO El efecto de la Calicheamicina conjugada a ambos hu3S193 (hu3S193-CM) y G193 (CMD-193) sobre un crecimiento in vitro de líneas de célula de carcinoma humano fue evaluada contra las líneas celulares de carcinoma humano. Las líneas celulares evaluadas incluyeron carcinomas que tenían alta o baja expresión del antígeno Lewis Y y carcinomas de pecho, colon, pulmón, y próstata. La eficacia del hu3S193-AcBut-CM y CMD-193 fueron ambas comparadas in vitro con aquella del CM (droga libre) y/o varios conjugados de control.
Como se muestran en las Tablas 6 y 7 adelante, tanto el hu3S193 como el CMD-193 fueron consistentemente más efectivos que el conjugado de control (por ejemplo, CMA-676) contra las células de carcinoma que expresan Lewis Y. Como contraste, el hu3S193 y el CMD-193 fueron tan eficaces o menos eficaces que las células contra conjugado de control que tenían una expresión baja o pequeña del antígeno Lewis Y.
HU3S193-CM El Hu3S193-AcBut-CM inhibe específicamente el crecimiento de células de carcinoma que expresan Ley in vitro. El anticuerpo hu3S193 libre no afectó el crecimiento del LOVO, L2987, N87 o AGS cuando se utilizó en concentraciones que variaron desde 1x10"4 a 6.9 ug de proteína/ml. Este rango de concentraciones de proteína fue el equivalente a las cantidades del anticuerpo dado como un conjugado. El ED50 indica la dosis (ng/ml) en la cual el 50% del cultivo de células sobrevive luego de la exposición a CM o al conjugado por 96 h. El ED5o del hu3S193-AcBut-CM fue consistentemente inferior en las células positivas Ley (re MCF>10) que el ED5o del CMA.
Se observó la variación interexperimental del ED50 de ambos conjugados. Sin embargo, el rango ED50 del hu3S193-AcBut-CM fue consistentemente inferior aquel del CMA cuando la eficacia de los conjugados sobre las células Ley+ AGS fueron ensayadas. Como contraste, estos rangos fueron superimpuestos cuando la eficacia de ambos conjugados se determinó sobre las células PC3MM2 Ley. Este resultado fue diferentemente causado por la selección de dos líneas celulares. Una comparación del ED50 del CMA y hu3S193-AcBut-CM en experimentos paralelos utilizando células Ley+ mostró en promedio un ED50 inferior para el hu3S193-AcBut-CM que para el CMA (doble CMA<1).
Este descubrimiento fue independiente del origen de la línea celular, su sensibilidad a la calicheamicina y su cantidad relativa de Ley. El parámetro de doblez del CMA fue > 1 cuando varias células Ley" fueron utilizadas. Varias preparaciones conjugadas de hu3S193-AcBut-CM fueron utilizadas para estos experimentos (22 y 47µg de Calicheamicina por mg de proteína) indicando que las observaciones fueron independiente de esta variable. Tomando ambos, los resultados ilustran la citotoxicidad selectiva de hu3S193-AcBut-CM debido a la calicheamicina blanco para el Ley.
Los hallazgos se confirmaron por una serie de experimentos con diferentes tandas de hu3S193-AcBut-CM. Las separaciones de conjugado utilizadas para estos experimentos tenían entre 22 y 47 µg CM por mg de proteína). Los valores ED50 de hu3S193-AcBut-CM y MYLOTARG (CMA) se reunieron de 9 experimentos y se graficaron como una función de su frecuencia de ocurrencia (ver Figura 2A y 2B). La eficacia de las células Ley+ (AGS, Figura 2A) se comparó con la eficacia de las células Ley" (PC3MM2, Figura 2B). Para un grupo de 10 líneas de células, los valores ED50 de hu3S193-AcBut-CM fueron también evaluados contra aquellos del CMA, utilizados como un control interno en cada experimento (dobles CMA), donde n es el número de determinaciones ED50 independiente (ver Figura 2C). A pesar de alguna variación interexperimental del ED50 el hu3S193-AcBut-CM consistentemente permaneció más eficaz (doble- AcBut-CMA<1) que el CMA sobre las células positivas Ley. Este resultado ilustra la citotoxicidad selectiva debido al CM blanco de Ley. TABLA 6 En este experimento, las células de carcinoma humano fueron cultivadas durante 96 hr en la presencia de concentraciones crecientes de calicheamicina conjugada o no conjugada (CMA-676 o CMD-193) después de lo cual las células viables en cada cultivo fueron enumeradas utilizando el Kit de ensayo MTS. En la Tabla 6 anterior, CM se refiere a Nac-Calich DNH, las concentraciones de ambos CMA-676 y CMD-193 se expresaron en términos de calicheamicina equivalentes (mM), y la proporción de selectividad doble se expresó como la proporción del ED50 del CMA al ED50 del CMD. Los anticuerpos anti-Lewis Y no conjugados a 6.7 mg/mL (la concentración más alta ensayada) no tuvo efecto en el crecimiento de ninguna de las líneas celulares tumorales examinadas.
CMD-193 El anticuerpo G 193 libre no afectó el crecimiento de ningún tipo de célula investigado cuando se utilizó en concentraciones que variaban desde 5,700 a 6,900 ng de proteína/ml. Como fue el caso para el hu3S193, el ED50 del CMD fue consistentemente inferior en células positivas Ley que el ED50 del CMA. Las separaciones de conjugado utilizadas para estos experimentos tenían entre 56 y 88 ug CM por mg de proteína. A pesar de alguna variación interexperimental del ED50, el CMD consistentemente permaneció más eficaz (doble-AcBut-CMA<1) que el CMA sobre las células positivas Ley. Este resultado ¡lustró la citotoxicidad selectiva debido al CM blanco para Ley.
La selectividad del CMD-193 se ilustró mejor mediante la comparación de las gráficas de eficacia de A431 y A431/Ley luego del tratamiento con CMA y CMD (Figura 9). En este experimento, las monocapas de las células A431 y A431/Ley fueron cultivadas durante 96 h en la presencia de CMD O CMA. El número de células que permanecieron después del tratamiento se determino mediante un método de tinte vital y se expresó como un porcentaje del control. Los dos tipos de células A431 tenían una sensibilidad similar al CM. La vida media significativa, con relación al CMA, de la curva de decaimiento CMD observó el siguiente tratamiento de la línea celular positiva Ley (A431/ Ley), como se muestra en la Figura 9B, y no siguiendo el tratamiento de la línea celular negativa Ley, como se muestra en la figura 9A.
TABLA 7 En estos experimentos, las células de carcinoma humano fueron cultivadas durante 96 h en la presencia de concentraciones crecientes de calicheamicina conjugada o no conjugada (cma-676 o CMD-193), después de lo cual las células viables en cada cultivo se enumeraron utilizando el kit de ensayo MTS. En la tabla 7 anterior, el CM se refiere a las concentraciones Nac-Calich DNH, las concentraciones de ambos CMA-676 y CMD-193 se expresaron en términos de calicheamicina equivalentes (mM), y la proporción de selectividad doble se expresó como la proporción del ED5o del CMA al ED50 del CMD. Los anticuerpos anti-Lewis Y no conjugados a 6.7 µg/mL (la concentración más alta ensayada) no tuvo efecto en el crecimiento de ninguna de las líneas celulares tumorales examinadas.
EJEMPLO 5. EFICACIA DE LOS CONJUGADOS DE CALICHEAMICINA DEL ANTICUERPO ANTI-LEWIS-Y EN CRECIMIENTO IN VIVO DE LOS XENOINJERTOS DE CÉLULA DE CARCINOMA HUMANO La eficacia antitumoral de la calicheamicina conjugada a los anticuerpos anti-Lewis Y se evaluó contra los injertos de carcinoma humano establecidos simultáneamente (SC) en ratones desnudos. Los xenoinjertos evaluados incluidos los carcinomas que tenían expresión del antígeno Lewis Y alta o baja son carcinomas de mama, colon, pulmón, y próstata. Los ratones que llevan tumores sólidos con una masa promedio de 150 a 300mg fueron aleatorizados a varios grupos de tratamiento.
HU3S193-CM La eficacia in vivo del hu3S193-AcBut-CM se ensayo sobre xenoinjertos subcutáneos de carcinomas gástrico (N87, Figura 3), próstata (LNCaP, Figura 4) y colon (LOVO, Figuras 5 y 6). Los tumores subcutáneos del N87, LOVO y LNCaP crecieron en ratones desnudos atimicos (Charles River, Wilmington, MA). Los ratones hembra de 1.5 a 3 meses de edad se inyectaron con células 5x106 N87 o 107 LOVO respectivamente por ratón. Las células LNCaP se inyectaron en ratones desnudos macho que tenían 3 meses de edad. Para el crecimiento de los tumores, las células N87 y LNCaP tuvieron que ser mezcladas (1 :1, vol/vol/) con MATRIGEL® (Collaborative Biomedical Products, Belford, MA) antes de la inyección. Dos diámetros perpendiculares de los tumores se midieron al menos una vez a la semana por medio de calibradores. El volumen del tumor se calculó de acuerdo con la fórmula de Attia & Weiss: A2xBx0.4.
A menos que se indique otra cosa, 3 dosis de cada conjugado y control fue dada intraperitonealmente con un intervalo de 4 días (Q4Dx3). In vivo, hu3S193-AcBut-CM inhibió el crecimiento en estos tres modelos separados. El hu3S193-AcBut-CM curó ratones de xenoinjertos de carcinoma gástrico (N87) que tienen alta expresión de antígeno Lewis-Y (Figura 3). Los xenoinjertos de carcinoma de próstata (LNCaP) cesaron de crecer luego de la administración del hu3S193-AcBut-CM y la inhibición del crecimiento del tumor se obtuvo con xenoinjertos de carcinoma de colon (LOVO) (figura 5 y 6, respectivamente). En el modelo LOVO, la eficacia del hu3S193-AcBut-CM se mejoró e incrementó la cantidad del conjugado (Figura 5).
XENOINJERTOS DE CARCINOMA GÁSTRICO N87 Los ratones que llevan xenoinjertos N87 (Ley+, CD33" Y CD20") de 100 mm3 trataron con conjugados de control (CMA, RITUXAN-AcBut-CM), PBS, hu3S193 o hu3S1930-AcBut-CM. Los ratones en cada grupo recibieron tres dosis i.p. Los conjugados y controles se inyectaron los días 1 , 5 y 9. La Figura 3A muestra la eficacia del control de conjugados y la figura 3B ilustra los efectos del hu3S193 y de su conjugado de calicheamicina. Las barras de error representan la desviación estándar del volumen de tumor promedio en cada punto de tiempo. La diferencias en el tamaño del tumor entre los grupos tratados de los ratones que llevan tumor han sido probadas mediante pruebas t de student de dos colas, los valores p en el día 28 son mostrados en el C, y n igual el número de ratones por grupo. En 1 ,2, y 4µg cal.eq/dosis/ratón, el hu3S193-AcBut-CM inhibió significativamente el crecimiento de tumor de los xenoinjertos N87 (Figura 3). Una velocidad de cura de 100, 60 y 10% también se observó en 4, 2, y 1 µg cal.eq/dosis/ratón, respectivamente, indicando que el tamaño del xenoinjerto disminuyó y nunca excedió el volumen del tumor promedio inicial durante 100 días luego del tratamiento.
HU3S193-CM La eficacia in vivo del hu3S193-AcBut-CM se ensayó sobre xenoinjertos subcutáneos de carcinomas gástricos (N87, Figura 3), próstata (LNCap, Figura 4) y colon (LOVO. Figuras 5 y 6). Los tumores subcutáneos de N87, LOVO y LNCaP crecieron en ratones desnudos atímicos (Charles River, Wilmington, MA.). Los ratones hembra de 1.5 a 3 meses de edad se inyectaron con 5x106 o 107 células N87 LOVO por ratón. Las células LNCaP se inyectaron en ratones desnudos macho que tenían tres meses de edad. Para el crecimiento de los tumores, las células N87 y LNCaP se mezclaron (1 :1 , vol/vol) con MATRIGEL® (Collaborative Biomedical products, Belford, MA) antes de la inyección. Los diámetros perpendiculares de los tumores se midieron al menos una vez a la semana por medio de calibradores. El volumen del tumor se calculó de acuerdo con la fórmula de Attia & Weiss : A2xBx0.4.
A menos que se indique otra cosa, 3 dosis de cada conjugado y control fue dada intraperitonialmente con un intervalo de 4 días (Q4Dx3). In vivo, el hu3S193-AcBut-CM inhibió el crecimiento del tumor en estos tres modelos separados. El Hu3S193-AcBut-CM curó ratones de xenoinjertos de carcinoma gástrico (N87) que tiene alta expresión de antígenos Lewis Y (Figura 3). Los xenoinjertos de carcinoma de próstata (LNCaP) cesaron de crecer luego de la administración del hu3S193-AcBut-CM y la inhibición del crecimiento del tumor se obtuvo con xenoinjertos de carcinoma de colon (LOVO) (Figuras 5 y 6, respectivamente). En el modelo LOVO, la eficacia del hu3S193-AcBut-CM se mejoró e incrementó la cantidad del conjugado (Figura 5).
XENOINJERTOS DE CARCINOMA GÁSTRICO N87 Ratones que llevan xenoinjertos N87 (Ley+,CD33" y CD20") de 100 mm3 se trataron con conjugados de control (CMA, RITUXAN-AcBut-CM), PBS, hu3S193 o hu3S193-AcBut-CM. Los ratones en cada grupo recibieron tres dosis i.p. Los conjugados y controles se inyectaron en los días 1 , 5 y 9. La Figura 3A muestra la eficacia del control de con jugados y la Figura 3B ilustra los efectos del hu3S193 y de su conjugado de calicheamicina. Las barras de error representan la desviación estándar del volumen del tumor promedio en cada punto de tiempo. Las diferencias en el tamaño del tumor entre los grupos tratados de los ratones que llevan tumor han sido probadas mediante pruebas tailed students de 2 colas, los valores p del día 28 son mostrados en C, y n iguala el número de ratones por grupo. En 1 ,2 y 4 µg cal.eq/dosis/ratón, el hu3S193-AcBut-CM inhibió significativamente el crecimiento del tumor de los xenoinjertos N87 (Figura 3). Una velocidad de cura de 100, 60 y 10% también se observó en 4, 2, y 1 µg cal.eq/dosis/ratón, respectivamente, indicando que el tamaño del seno injerto disminuyó y nunca excedió el volumen del tumor promedio inicial durante 100 días luego del tratamiento.
XENOINJERTOS DE CARCINOMA DE PRÓSTATA LNCAP Los ratones que llevan tumor de próstata LNCaP fueron tratados con hu3S193-AcBut-CM, PBS o el conjugado de control CMA. El número entre paréntesis en la leyenda indica la cantidad de calicheamicina por dosis por ratón. Las diferencias en el tamaño del tumor entre los grupos tratados ha sido sondeada mediante dos pruebas de t student de 2 colas. Los valores p en el día 30 se reportaron y n igual al número de ratones. Como se muestra en la Figura 4, los conjugados de control inhibieron el crecimiento del tumor en una menor proporción que el hu3S193-AcBut-CM a dosis equivalentes o inferiores. Más aún, una velocidad de cura del 0% se observó luego del tratamiento con conjugados de control. El hu3S193, cuando se administra a una dosis y régimen equivalente ai de la cantidad de proteína (120µg) dada con 4µg cal.eq. El hu3S193-AcBut-CM, no tuvo efecto. Los experimentos previos mostraron que la administración de calicheamicina en dosis equivalentes a hu3S193-AcBut-CM no inhibió ninguno de los modelos tumorales ensayados hasta ahora. La administración de calicheamicina ha sido por lo tanto omitida como un control en los estudios normales.
XENOINJERTOS DE CARCINOMA DE COLON LOVO La capacidad del hu3S193-AcBut-CM para inhibir el crecimiento tumoral también se demostró en el modelo de carcinoma de colon (LOVO). Los ratones que llevan xenoinjertos LOVO de 100mm3 se ensayaron con conjugados de control (RITUXAN-AcBut-CM, Figura 5A), PBS (Figuras 5A y 5B), hu3S193 (Figura 5B) o hu3S193-AcBut-CM (Figura 5B). Excepto para el grupo ensayado con hu3S193-AcBut-CM en 4µg/dosis, los ratones en cada grupo recibieron tres dosis i.p. La cantidad de cada dosis de calicheamicina se especificó en la leyenda. Los conjugados y los controles se inyectaron en el día 1. 5 y 9. Los grupos fueron designados como sigue: hu3S193-AcBut-CM, recibieron un régimen adicional de tres dosis en el día 43, 47 y 51. El número de ratones por grupo (n) reportó en C. Las diferencias en el tamaño del tumor en el día 30 se sondearon para significancia estadística en la prueba t student de dos colas.
El hu3S193-AcBut-CM inhibió el crecimiento de xenoinjertos LOVO en una menor proporción que la observada con los xenoinjertos N87. Los conjugados de control (RITUXAN-AcBut-CM O CMA) originaron una disminución de tumor insignificante. La inhibición originada por el hu3S193-AcBut-CM fue más prolongada que aquella de los conjugados de control. Así, las diferencias entre, de una parte, el tamaño del tumor luego del tratamiento con RITUXAN-AcBut-CM en dosis de 4 y 2 µg cal.eq. por ratón (Q4Dx3) y, de otra parte, el tamaño del tumor luego del tratamiento con PBS fueron solo significativas durante 16 días (p<0.05).
Como contraste, el tratamiento con hu3S193-AcBut-CM en dosis de 4, 2 y 1µg cal.eq por ratón (Q4Dx3) dio como resultado diferencias estadísticas del tratamiento PBS para 43, 22 y 16 días respectivamente. Los ratones que llevan xenoinjertos LOVO de 100mm3 fueron tratados con conjugados de control: RITUXAN-AcBut-CM Y CMA (Fígura 6A), PBS o hu3S193-AcBut-CM (Figura 6B). Los ratones en cada grupo recibieron tres o cuatro dosis i.p. La cantidad de cada dosis en equivalentes de calicheamicina se especifico en la leyenda. Los conjugados y controles se inyectaron en el día 1 , 5 y 9. El grupo designado: hu3S193-AcBut-CM*, recibió una adicional en el día 13. El número de ratones por grupo que iguala los valores de n y p de 2 pruebas de t student de 2 colas.
XENOINJERTOS DE CARCINOMA DE COLON HCT8S11 Los ratones que llevan xenoinjertos de carcinoma de colon HCT8S11 se ensayaron para determinar la cantidad in vivo de hu3S193-AcBut-CM. Rituximab conjugado de calicheamicina con blanco CD20 se utilizó como un control no ligante. Los conjugados fueron administrados 1P Q4Dx3 a 80 o 160 mg/kg. La figura 21 muestra que el conjugado de calicheamicina hu3S193 fue capaz de originar fuerte inhibición del crecimiento de los xenoinjertos de carcinoma de colon HCT8S11 , tanto en tumores pequeños como en grandes. La actividad antitumoral de los conjugados con blanco Lewis Y siempre fue mayor que aquella de conjugados no ligantes no específicos con blanco A CD20 ó CD33.
CMD-193 La eficacia in vivo de CMD-193 se ensayó sobre xenoinjertos subcutáneos provenientes de carcinomas gástricos (N87), de pulmón (L2987), cervical/epidermoide (A431/Ley) y de colon (LS174T y LOVO). A menos que se indique otra cosa, todos los conjugados y controles fueron inyectados intraperitonialmente de acuerdo al programa Q4Dx3. Para monitorear el blanco tumoral debido a la función portadora de la inmunoglobulina, se utilizó CMA como un control negativo. Con base en los estudios descritos adelante, la dosis de 15 mg/kg de CMD-193 (equivalente a una dosis de proteína de anticuerpo conjugado en el rango de 562 a 803 mg/m2) se consideró como una dosis eficaz mínima (MED).
XENOINJERTOS DE CARCINOMA GÁSTRICO N87 Los ratones que llevan xenoinjertos N87 de 150mm3 se trataron con un conjugado de control (CMA), PBS, G193-AcBut-CM, G193 o hu3S193. Los ratones en cada grupo recibieron tres dosis i.p. La cantidad de cada dosis equivalente de calicheamicina se especifica en las leyendas. Los conjugados y controles fueron inyectados en el día 1 , 5 y 9. La Figura 10B muestra la eficacia de los conjugados de control. La Figura 10B ilustra los efectos de CMD-193 y el hu3S193-AcBut-CM, aunque la figura 10C demuestra la falta de la eficacia del anticuerpo libre. Las barras de error representan la desviación estándar del volumen tumoral promedio en cada punto de tiempo.
El CMA inhibió el crecimiento significativamente menos que el hu3S193-AcBut-CM o CMD en dosis equivalentes. A 4µg cal.eq/dosis/ratón, el hu3S193-AcBut-CM así como también el G193-AcBut-CM (CMD) se curó los ratones de xenoinjertos N87 (Figura 10). Específicamente, 40% y 60% de los ratones se curaron de sus tumores después de la administración de 4µg cal.eq./dosis/ratón de hu3S193-AcBut-CM, respectivamente. El término cura indica que el tamaño del seno injerto disminuyó y nunca excedió el volumen promedio de tumor inicial durante 100 días luego del tratamiento, más aún, la inhibición del crecimiento del tumor originada por el hu3S193-AcBut-CM o CMD también fue equivalente a una dosis de 2µg cal.eq./dosis/ratón (Figura 10). Experimentos anteriores mostraron que la administración de CM en dosis equivalentes a hu3S193-AcBut-CM nunca inhibió ninguno de los modelos tumorales habitualmente descritos (datos no mostrados). La administración de CM había sido por lo tanto omitida como un control.
El G193 así como el hu3S193 no inhibió el crecimiento de los xenoinjertos N87.
XENOINJERTOS DE CARCINOMA DE PULMÓN L2987 Los ratones que llevan xenoinjertos L2987 de 100mm3 fueron tratados con un conjugado de control (CMA), PBS o CMD. Los ratones en cada grupo recibieron tres dosis i.p. La cantidad de dosis en equivalente de calicheamicina se especificó en las leyendas. Los conjugados y controles se inyectaron en el día 1 , 5 y 9. La Figura 11A muestra la eficacia de los conjugados de control y la figura 11 B ilustra el efecto del CMD. Las barras de error representan la desviación estándar del volumen del tumor promedio en cada punto de tiempo. El número de ratones (expresado como porcentaje) con un tamaño de tumor más pequeño que el tamaño de tumor inicial de cada grupo se gráfico como una función del período de observación en la Figura 12. El tratamiento con CMA (Figura 12A) o CMD (Figura 12B) se comparó con el tratamiento con el control de vehículo (PBS).
La Figura 12 muestra que el CMD inhibió el crecimiento de L2987 en un rango de dosis de 0.375 a 3µg/dosis/ratón. La interpretación de la selectividad de esta inhibición se enredó por dos factores. En primer lugar, el CMA ejerció un efecto inhibitorio significativo de crecimiento en este modelo de tumor (figura 12). A dosis inferiores, esta inhibición fue menor que la inhibición originada por el CMD. En segundo lugar, la regresión espontánea del tumor ocurrió en 2 de 10 ratones del grupo de control (Figura 12). Sin embargo, el número de tumores regresados por grupo fue diferentemente mayor en os grupos tratados con CMD que en aquellos tratados con CMA. El CMD también inhibió el crecimiento de los xenoinjertos L2987.
Para el experimento mostrado en la Figura 13, 10 ratones recibieron xenoinjertos L2987. Estos tumores crecieron hasta que ellos alcanzaron un volumen promedio de 1.25cm3. Tres ratones con volúmenes tumorales mayores de 0.25cm3 (es decir, 0.66, 1.97 y 1.11cm3) fueron tratados con dosis de 4 µg cal.eq. CMD (Q4Dx3). Estos tumores se encogieron después de la primera dosis durante un período de 30 días. Suficiente enfermedad residual, sin embargo, para permitir el recrecimiento de los tumores. Un ratón con un tumor de 2.31 cm3 también recibió 4µg cal.eq. CMD (Q4DX3). Este tumor grande no respondió a la terapia y el ratón tuvo que ser muerto por razones éticas antes de la tercer inyección. De esta forma, tres dosis de 4µg cal.eq. CMD (Q4Dx3) fue suficiente para inhibir el crecimiento de tumores L2987 con volúmenes entre 0.66 y 1.97 cm3 pero fueron inadecuados para curar. Las barras de error representan la desviación estándar del volumen de tumor promedio en cada punto de tiempo.
XENOINJERTOS DE CARCINOMA EPIDERMOIDE A431/LEy La inhibición del crecimiento del CMD-193 del carcinoma epidermoide A431/LEy también se evaluó. Los ratones que llevan xenoinjertos A431/LEy de aproximadamente 300mm3 se trataron con PBS o CMD. Los ratones en cada grupo recibieron tres dosis i.p. La cantidad de cada dosis equivalentes en calicheamicina se especificó en la leyenda. Los conjugados y controles fueron inyectados en los días 1 , 5, y 9. Las barras de error representan la desviación estándar del volumen de tumor promedio en cada punto de tiempo. Los resultados son mostrados en la Figura 14. Los ratones que llevan xenoinjertos A431/LEy de aproximadamente 100mm3 también fueron tratados con conjugados de control (CMA), PBS, o CMD. Los ratones en cada grupo recibieron tres dosis i.p. La cantidad de cada dosis en calicheamicina se especifica en la leyenda. Los conjugados y controles fueron inyectados en el día 1 , 5, y 9. Los resultados son mostrados en la Figura 15; la Figura 15A muestra la eficacia de los conjugados de control y la Figura 15B ilustra los efectos del CMD. Las barras de error representan la desviación estándar del volumen del tumor en cada punto de tiempo.
Como se muestra en las Figuras 14 y 15, la interpretación de la especificidad de la inhibición del tumor CMD de A431/LEy también se complicó por regresión espontánea de los tumores y por la inhibición del crecimiento originada por el CMA. Una comparación del número de ratones curados luego del tratamiento con dosis equivalente de CMD o CMA (Figura 16) indicó una ventaja selectiva del tratamiento CMD.
XENOINJERTOS DE CARCINOMA DE COLON LS174T La inhibición del crecimiento de los xenoinjertos LS174T después del tratamiento con CMD no fue tan pronunciada como con los tumores anteriores; sin embargo, fue más eficaz que los conjugados de control (Figura 17). Los ratones llevan injertos LS174T de 150mm3 fueron tratados con un conjugado de control (CMA), PBS o CMD. Los ratones en cada grupo recibieron tres dosis i.p. La cantidad de cada dosis en equivalentes de calicheamicina se especifica en las leyendas. Los conjugados y controles fueron inyectados en el día 1 , 5 y 9. los tumores LS174T proliferaron tan rápido que en el grupo de control todos los ratones habían muerto en un período de 51 días en razón a la carga tumoral grande (<2.5 cm3). En el grupo tratado con 4µg cal.eq. CMD (Q4Dx3), 3 de cada cinco ratones fue muerto en los 44 días en razón de la carga tumoral (1/3) o por la necrosis del tumor (2/3). De los otros dos ratones uno permaneció libre de tumor durante 125 días aunque el otro habría desarrollado un tumor pequeño. Ninguna cura se observó en los grupos tratados con 2µg cal.eq. CMD (Q4DX3) o 4 µg cal.eq. CMA (Q4DX3). Como contaste, uno de los cinco ratones tratados con 2µg cal.eq. CMA (Q4DX3) se curó. La figura 17A muestra la eficacia de ios conjugados de control y la Figura 17B ilustra el efecto del CMD. Las barras de error representan la desviación estándar del volumen de tumor promedio en cada punto de tiempo.
XENOINJERTOS DE CARCINOMA DE COLON LOVO Los ratones que llevan xenoinjertos LOVO se ensayaron para investigar los beneficios potenciales de los diferentes regímenes de 4µg cal.eq./dosis/ratón de Q4DX3. Los ratones que llevan xenoinjertos LOVO de aproximadamente 100mm3 fueron tratados con PBS, G193 o varios regímenes de control conjugados CMA o CMD. La cantidad de cada dosis equivalentes de calicheamicina se especifican en las leyendas. El modelo LOVO fue escogido para este tipo de experimento en razón a la eficacia marginal vista como con 4µg cal.eq. en Q4DX3.
La Figura 18A muestra la eficacia de CMA y G193. Las Figuras 18B y 18C ilustran los efectos de CMD en Q4DX3 y Q4DX4 respectivamente. Las Figuras 18D y 18E muestran la eficacia del CMD cuando se da con varios intervalos. Las barras de error representan la desviación estándar del volumen de tumor promedio en cada punto de tiempo. La inhibición del crecimiento de xenoinjertos LOVO después del tratamiento con CMD no fue tan pronunciada como con los tumores anteriores. Si embargo, se sugirió la adición de una cuarta dosis, reduciendo el intervalo de inyección, así también como la administración de una dosis inferior más frecuentemente mejorando la eficacia del CMD.
XENOINJERTOS DE CARCINOMA DE MAMA MX1 El efecto del CMD-193 sobre el crecimiento de xenoinjertos establecidos de carcinomas que tenían baja expresión de antígenos Lewis Y también se examinó en carcinoma de mama MX1. El CMA-676 se utilizó como un conjugado de control no ligante. Los ratones desnudos explantados con carcinoma de mama MX1 fueron tratados con varias dosis de CMD-193 (40 a 240 mg/kg) o CMA-676 (un control negativo). El crecimiento de tumor se registró durante al menos 35 días. El CMD-193 en dosis tan bajas como 80 mg/kg originó una inhibición de crecimiento significativa del crecimiento del seno injerto MX1 , como se muestra en la Figura 22. Como contraste, CMA-676 fue efectivo solamente en las dosis más altas ensayadas (160mg/kg).
DOSIS NO LETAL MÁXIMA DE CMD-193 Para el experimento ilustrado en la Figura 19, se utilizaron ocho grupos de 10 ratones. A cada grupo se administró CMD a dosis crecientes que varían de 0 a 9.9 ug cal.eq. (0 a 396 µg/kg) cada 4 días para un total de 3 administraciones (Q4DX3) y su supervivencia se monitoreó por hasta 105 días. El grupo de control se trató con un vehículo que tenía una letalidad durante el período de observación completo. La dosis más alta que condujo a una letalidad similar fue de 5.7µg cal.eq. CMD. En razón a que esta letalidad ocurrió antes que en el grupo de control, uno podría argumentar que esto se debió a la toxicidad relacionada con la droga. Las dosis mayores o iguales a 284µg/kg dieron como resultado una incidencia significativamente superior en la letalidad en los ratones tratados y el tratamiento con 7.1 , 8.5 y 9.9 ug cal.eq. Resultaron en no solamente una incidencia distintamente mayor de la letalidad, sino también una letalidad en un ataque entre letalidad más temprana que el tratamiento con el vehículo control. La supervivencia de los ratones tratados con CDM-193 en dosis menores o iguales a 228 µg/kg fue similar a aquella en los ratones con vehículo control. Tomados juntos estos datos indicaron que la dosis no letal máxima (MND) de CMD fue de 5.7µg cal.eq. (228µg/kg, que es equivalente a las dosis de proteína de anticuerpo conjugado en el rango de 8.5 a 12.2 mg/m2) Q4DX3. Este MND es considerablemente superior que la dosis eficaz (MED) en la mayoría de los modelos de tumor, por ejemplo, dado su MED de 15 µg/kg en el modelo L2987, el CMD-193 exhibe fuerte actividad antitumoral con un índice terapéutico (MND/MED) DE 19.
EJEMPLO 6. TOXICOLOGÍA La toxicidad del conjugado, CMD 193, se evaluó en estudios de toxicidad intravenosa de dosis simple y en estudios de toxicidad (IV) de 4 ciclos de dosis variante y dosis repetida (ciclo es una dosis/2 semanas) en ratas y perros. Las evaluaciones toxico cinéticas y de inmunogenicidad también se condujeron como parte de los estudios de toxicidad de 4 ciclos en ratas y perros. El potencial genotóxico del CMD-193 se evaluó en mutación inversa material y en ensayos de micro núcleo de ratón.
La administración de dosis simple o repetida de CMD-193 en ratas y perros (seleccionada para la expresión del antígeno de Lewis Y) produjo generalmente efectos similares en vida (disminución del peso del cuerpo y consumo de alimento y cambios de hematología indicativos de toxicidad de médula ósea y órgano linfoide) y toxicidad del órgano blanco. En total, la toxicidad del CMD-193 fue comparable en ratas y perros. Hallazgos comparables relacionados con compuestos se observaron en machos y hembras. Los órganos blanco de toxicidad en ambas especies fueron la médula ósea, el timo, y los órganos reproductores masculinos. El hígado (en ratas) y e tracto gastrointestinal (Gl) (en perros) también fueron órganos blanco. La observación de los de los efectos relacionados con el CMD-193 en órganos multiblanco en ratas y perros es consistente con la cito toxicidad no específica atribuible a derivados de calicheamicina no conjugados en CMD-193; sin embargo, el G1 cambia en perros tratados con CMD-193 puede también reflejar la unión del anticuerpo G193 al epitelio del tracto G1 como se observó en estudios de reactividad cruzada de tejido y las subsecuente liberación derivados de calicheamicina no conjugados cito tóxicos.
ESTUDIOS IV DE DOSIS SIMPLE Los estudios farmacológicos intravenosos de seguridad (IV) en dosis simple en ratas, CMD-193 en dosis de 1.18, 3.54, o 10.69 mg proteina/m2 no produjeron ningún efecto adverso sobre el sistema nervioso central (CNS) o el sistema respiratorio. En estudios farmacológicos de seguridad cardiovascular de dosis simple en perros, El CMD 193 en dosis IV de 1.3 o 6.7. mg proteína/m2 no produjo cambios adversos en los pulsos del corazón o la presión arterial sanguínea. No hubo evidencias de anormalidades morfológicas, arritmias atriales o ventriculares, o prolongación del QTc relacionado con compuesto ninguno de los electrocardiogramas (ECGs) examinados en 6.7 mg proteína/m2 (los ECGs no fueron examinados a 1.3 proteína/m2).
Cuando se administró IV como una dosis simple, las dosis no letales más altas del CMD-193 fue donde 15.30 mg proteína/m2 en ratones de 30.09 mg proteína/m2 en ratas; estas fueron las dosis factibles máximas basadas en la concentración máxima de 76 mg/mL (equivalentes de calicheamicina) y el volumen de dosis máximo de 5 mL/Kg. Las dosis que no produjeron efectos adversos fueron de 15.30 mg de proteína/m2 para ratones y 15.81 mg proteína/m2 para ratas.
ESTUDIOS DE DOSIS VARIANTE En los estudios de dosis variante con CMD-193, los moribundos que necesitan eutanasia ocurrió en un perro a la dosis simple más alta ensayada de 12 mg de proteína/m2; el moribundo fue atribuido a cambios gastroentéricos relacionados con CMD-193 de degeneración y necrosis de mucosa ligera moderada. Ninguna rata se encontró muerta ni electivamente eutanizada a ninguna dosis ensayada (hasta 30.09 mg de proteína/m2).
ESTUDIOS DE 4 CICLOS En los estudios de toxicidad de 4 ciclos, las dosis de CMD-193 administradas fueron de 0.55, 1.98, o 5.5 mg de proteína/m2/ciclo en ratas y 0.36, 1.2, o 3.59 mg de proteína/m2/cicIo en perros. En estos estudios, el anticuerpo G193 solo se administró a 5.55 mg proteína/m2/ciclo en ratas de 3.59 mg proteína/m2/ciclo en perros las dosis máximas toleradas (MTDs) de CMD-193 fue de 5.55 mg proteína/m2/ciclo en ratas y 3.59 mg proteína/m2/ciclo en perros (las dosis más altas administradas); estas dosis no elicitaron toxicidad limitante de dosis o de amenaza de vida. En el estudio de 4 ciclos en ratas, no se estableció nivel de efecto adverso (NOAEL) para CMD-193 en machos con base en los hallazgos microscópicos (atrofia tubular testicular) observada en 0.55 mg proteína/m2/ci o. Con base en la cariomegalia-citomegalia hepatocelular tanto en machos como en hembras a 5.55 mg proteína/m2/ciclo, el NOAEL en hembras en estudio de 4 ciclos en ratas fue de 1.98 mg proteína/m2/ciclo. En estudio de 4 ciclo en perros, el NOAEL para CMD-193 en machos los estableció con base en los hallazgos microscópicos (degeneración tubular testicular con hipospermia epididimal secundaria y ligera generación epitelial epididimal) a 0.36 mg proteína/m2/ciclo Con base en los hallazgos microscópicos de la generación epitelial de mucosa en el tracto G1 a 3.59 mg de proteína/m2/ciclo en tanto machos como hembras, the NOAEL para CMD-193 en hembras en estudios de 4 ciclos en perros fue de 1.2 mg proteína/m2/ciclo. En estudio de toxicidad de 4 ciclos en ratas, la dosis ensayada del anticuerpo G193 sola de 5.55 mg proteína/m2/ciclo no dio como resultado ninguna toxicidad relacionada con el anticuerpo G193. En el estudio de toxicidad de 4 ciclos en perros, la dosis ensayada del anticuerpo G193 sola de 3.59 mg proteína/m2/ciclo no dio como resultado una dosis limitante o la toxicidad que amenaza la vida. La toxicidad relacionada con el anticuerpo G 193 en este estudio en perros incluyó ligera degeneración tubular testicular y ligera degeneración de mucosa gástrica.
Las evaluaciones toxicocinéticas del anticuerpo G193, derivados de calicheamicina no conjugados (libre), y derivados de calicheamicina total (solamente ratas), así como también la determinación de la presencia de anticuerpos específicos para CMD-193 en suero de rata y para el anticuerpo G193 en suero de perros, se condujo como parte de los estudios de toxicidad IV de dosis repetida de 4 ciclos. ESTUDIOS GENOTÓXICOS El CMD-193 fue negativo para mutagenicidad en el ensayo de mutación inverso bacterial pero clastogénico previo ensayo de micro núcleo de ratón in vivo. La respuesta positiva en este ensayo se esperó y es consistente con la inducción de rupturas de ADN (clastogenicidad) mediante calicheamicinas y otros antibióticos antitumorales de enediyna.
ESTUDIOS DE REACTIVIDAD CRUZADA En los estudios de reactividad cruzada, de anticuerpo G193 no conjugado mostró teñido específico en la glándula salivar y el tracto G1 de ratas y perros, y en el páncreas e hígado (epitelio biliar) solamente en perros. En un estudio adicional, el teñido más prominente y consistente con anticuerpos G193 fue en el tracto G1 (epitelio en el intestino grueso estómago), vejiga urinaria (epitelio), vagina (epitelio), y pituitaria (células endocrinas y de adenohipófisis) en ratas, perros y humanos. En razón a que el componente del anticuerpo G193 del CMD-193 reaccionó de manera cruzada con los tejidos asociados con la expresión del antígeno Lewis Y en ratas, perros, y humanos, esos resultados demuestran que las ratas y perros son especies apropiadas para los estudios no clínicos que fueron conducidos con CMD 193. EJEMPLO 7. LAS FORMULACIONES ESTABLES DE CONJUGADOS DE CALICHEAMICINA DE ANTICUERPO ANTI-LEWIS Las formulaciones estables de conjugados de calicheamicina de anticuerpos anti Lewis Y (hu3S193-AcBut-CM y CMD-193) para administración in vivo se prepararon. Aproximadamente 19 mg de CMD-193 en 20mM TRIS (pH 8.0), y 100mM de cloruro de sodio se formularon como sigue de acuerdo a la tabla 8 o 9.
TABLA 8 TABLA 9 Se liofiliza dos tandas de CMD-193. La diferencia en las formulaciones fue del pH como fue el amortiguador a pH 7.5, y el otro a pH 8.0. Cuatro frascos similares fueron utilizados para configurar un estudio similar a pH 7.5. Cuando las soluciones se combinaron, el pH tuvo que ser reajustado con ácido clorhídrico 0.1 N a 7.5. Cuatro frascos más también se utilizaron para hacer una solución a pH 7.0. Las soluciones les fueron dada para análisis inicial y el resto se mantuvo en cámaras de estabilidad a 25°C). Las soluciones fueron analizadas después de 2 días y 7 días y los resultados son mostrados adelante en la tabla 10 (estabilidad CMD-193 a pH 7.0 y pH ,7.5 y 8.0 durante una semana a 25°C. Las soluciones se observaron por ser un precipitado turbio y claro se observaron en soluciones con pH 7.0 y pH 7.5 después de una semana a 25°C. Con base en los resultados, la solución amortiguada a pH 8.0 dio como resultado una mejor estabilidad en todos los tres casos y el TRIS se seleccionó como el amortiguador.
TABLA 10 En otro ejemplo, aproximadamente 35 mg de CMD-193 en 20 mM TRIS (pH 8.0) y 100mM fueron utilizados. De esto, dos formulaciones adicionales de CMD-193 fueron elaboradas. La primer formulación contenía 5% sucrosa y fue amortiguada con TRIS a pH 8.0. La formulación final está descrita abajo en la Tabla 11. TABLA 11 Para elaborar la segunda formulación, el concentrado de CMD-193 utilizado (proteína total 2.23 mg/mL) se diluyó con agua para inyección de tal forma que la concentración de la proteína fue de 1, mg/mL. Esta solución fue entonces centrifugada utilizando unidades de filtros centricon que son permeables a moléculas menores a 30,000 Daltons. Cuando el volumen de solución fue demidiada, ésta entonces diluida con 5mM K2HP04, 50 mM NaCI, 10% solución sucrosa. La formulación final está descrita abajo en la Tabla 12.
TABLA 12 Los frascos de CMD-193 elaborados a pH 7.5 y pH 8.0 fueron reconstituidos con varias soluciones listadas en la Tabla 13 (segunda formulación), que muestra una inspección visual de CMD-193 reconstituida con diferentes soluciones, y los frascos se observaron para partículas visuales. En todos los casos, las soluciones amortiguadas a pH 8.0. Fueron más claras que aquellas a pH 7.5. La adición de tenso activo fue benéfica en todos los casos. El precipitado en los frascos reconstituidos con agua para inyección (wfi) se filtró y se recolectó para examen microscópico. TABLA 13 Basado en lo anterior, se encuentra necesaria la adición de un tensoactivo a la solución para asegurar la solubilidad. Se utiliza una elección de Tween 80 (0.01 %) para mantener la solubilidad de 1 mg/ml. La formulación final contenía 5% de sucrosa, 0.01% Tween 80, 20 mM TRIS (pH 8.0), y 50 mM de cloruro de sodio).
Se utilizan dos tantas más de CMD-193. La primer tanda se purifica utilizando HIC seguido por ultra filtración, y la segunda tanda se pasa directamente a través del proceso de ultra-filtración después de conjugación. Las dos formulaciones se formulan como se muestra adelante en las Tablas 13 y 14. TABLA 14 Estabilidad de la solución masa en 5o C (Tabla 15) y el producto liofilizado a 25° C (Tabla 16) se desarrolla en la Tabla resumida adelante.
TABLA 15 TABLA 16 DILUCIÓN Y ADMINISTRACIÓN El CMD-193 para inyección se suministra como un polvo estéril blanco, libre de preservativos, secado por congelamiento en un frasco de vidrio ámbar de 20 mL. Cada empaque de frasco sencillo contiene 5 mg de polvo CMD-193 secado por congelamiento. El CMD-193 para inyección se puede refrigerar (2 a 8o C/36 a 46° F) y proteger de la luz.
El producto de droga es ligeramente sensible y se puede proteger de la luz del sol directa e indirecta y desprotegido de luz fluorescente durante la preparación y administración. Toda la preparación se hace preferiblemente dentro de una caperuza de seguridad biológica. La droga liofilizada se puede reconstituir sin el equilibrio del frasco a temperatura ambiente. Se utilizan jeringas estériles para reconstituir los contenidos de cada frasco con 5 mL de agua estéril para inyección, USP. Se puede agitar gentilmente para ayudar a este proceso. Después de la reconstitución y antes de la administración, cada frasco de droga se inspecciona visualmente para materia particulada y decoloración. La concentración final de la solución reconstituida es 1 mg/mL.
Agua estéril para inyección, USP que contiene alcohol bencilo o cualquier otro preservativo no se recomienda para reconstitución de CMD-193 para inyección.
Una vez se reconstituye, la solución de droga se diluye adicionalmente en 0.9% de inyección de cloruro de sodio, USP y se administra dentro de 4 horas después de reconstitución de los frascos.
Los frascos reconstituidos de CMD-193 para inyección no se les debe permitir congelar.
Para producir la dosis final para administración, la cantidad apropiada de droga reconstituyente se inyecta en 0.9% de inyección de cloruro de sodio suficiente, USP para producir un volumen final de 50 mL. La bolsa de la mezcla o contendor se compone de poliolefina o contiene una superficie de contacto cubierta con polietileno y con protector de luz ultravioleta.
El CMD-193 para inyección no se debe administrar como un push IV o bolo.
El paciente recibe la solución de la mezcla (dosis total) mediante infusión IV en una proporción constante durante un periodo de 1 hora (-15 minutos) por vía de una bomba de infusión programable. Aunque el contenedor de infusión se debe proteger de la luz, no necesariamente se protege el tubo de infusión de la luz. El tubo de infusión puede ser de poliolefina o cubierto con polietileno. En los filtros recubiertos por dentro no se debe utilizar con administración CMD-193.
Todas las referencias y patentes citadas anteriormente se incorporan aquí como referencia. Numerosas modificaciones y variaciones de la presente invención se incluyen en la especificación identificada anteriormente y se espera que sean obvias para un experto en la técnica. Tales modificaciones y alteraciones a los procesos de conjugación, los conjugados hechos por el proceso, y a las composiciones/formulaciones que comprenden conjugados se considera se abarca dentro del alcance de las reivindicaciones.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES Un proceso para preparar un conjugado de calicheamicina que comprende hacer reaccionar en un pH de aproximadamente 7 a aproximadamente 9 (i) un derivado de ligador de calicheamicina hidrolizable activado y (ii) un anticuerpo lgG1 en la presencia de un miembro de la familia desoxicolato o una sal de estos. El proceso de la reivindicación, en donde el miembro de la familia desoxicolato tiene una de las siguientes estructuras (A) donde de Xi a X5 son H u OH y los otros tres son independientemente O o H; s (CH)2 en donde n es 0-4 y R2 es OH, NH(CH2)mCOOH, NH(CH2)mS03H, o NH(CH2)mP03H2 en donde m es 1-4. O ÍB) en donde uno de Xi a X4 es H u OH y los otros tres son independientemente O o H; R1 es (CH)2 en donde n es 0-4 y R2 es OH, NH(CH2)mCOOH, o NH(CH2)mS03H, en donde m es 2. O (C) en donde uno de X-i a X es OH y los otros tres son independientemente H; R? es (CH)2 en donde n es 0-2 y R2 es OH, o NH(CH2)2S03H. 3. El proceso de la reivindicación 1 , en donde el miembr de la familia desoxicolato es ácido quenodesoxicólico, ácido hiodesoxicolato, ácido urosodesoxicólico, ácido glicodesoxicólico, ácido taurodesoxicólico, ácido tauroursodesoxicólico o ácido tauroquenodesoxicólico. 4. El proceso de la reivindicación 1 , en donde el miembro de la familia desoxicolato es ácido desoxicólico en una concentración de aproximadamente 10 mM. 5. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en donde el derivado de calicheamicina es de aproximadamente a aproximadamente 9% en peso del anticuerpo lgG1. 6. El proceso de la reivindicación 5, en donde el derivad de calicheamicina es de aproximadamente 75 en peso del anticuerpo lgG1. 7. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el anticuerpo lgG1 es un anticuerpo anti-Lewis Y. 8. El proceso de la reivindicación 7 en donde el anticuerpo anti- Lewis Y es G193 o Hu3S193. 9. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el derivado de calicheamicina es un derivado N-acilo de calicheamicina o un análogo de disulfuro de calicheamicina. 10. El proceso de la reivindicación 9, en donde el derivado de calicheamicina es hidrazida de dimetilo N-acetil gama calicheamicina (N-acetil calicheamicina DMH). 11. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el ligador hidrolizable es ácido 4-(4-acetilfenoxi) butanoico (AcBut). 12. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el ph es de aproximadamente 8.2. 13. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde el proceso comprende adicionalmente purificar el conjugado de calicheamicina. 14. El proceso de la reivindicación 13 en donde la purificación comprende separación cromatográfica y ultrafiltración/diafiltración. 15. El proceso de la reivindicación 14 en donde la separación cromatográfica es cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) o cromatografía de interacción hidrófoba (HIC). 16. El proceso de una cualquiera de las reivindicación 13 a 15, en donde luego de la etapa de purificación, la carga promedio del conjugado es de aproximadamente 5 a aproximadamente 7 moles de calicheamicina por mol de anticuerpo lgG1. 17. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en donde luego de la etapa de purificación, la fracción de conjugado inferior (LCF) del conjugado es menor de aproximadamente 10%. 18. Un conjugado de calicheamicina preparado por el proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17. 19. Un conjugado de calicheamicina preparado por el proceso de la reivindicación 13. 0. Un conjugado de calicheamicina preparado por el proceso de la reivindicación 13, en donde el derivado de calicheamicina es hidrazida dimetilo de N-acetil gama calicheamicina (N-acetil calicheamicina DMH) el ligador hidrolizable es ácido 4-(4- acetilfenoxi) butanoico (AcBut), el miembro de la familia desoxicolato es ácido desoxicólico en una concentración de aproximadamente 10 mM, el pH es de aproximadamente 8.2, y en donde luego de la etapa de purificación, en promedio de la carga del conjugado de calicheamicina es de aproximadamente 5 a aproximadamente 7 moles de calicheamicina por mol de anticuerpo lgG1 y la fracción de conjugado inferior (LCF) del conjugado es menor de aproximadamente del 10%. 1. Una composición que comprende un conjugado de un derivado de ligador hidrolizable de calicheamicina unido covalentemente a un aticuerpo anti-Lewis Y. 22. La composición de la reivindicación 21 , donde el derivado de calicheamicina es un derivado N-acilo de calicheamicina o un análogo de disulfuro de calicheamicina. 23. La composición de la reivindicación 22, en donde el derivado de calicheamicina es hidrazida dimetilo N-acetil gama calicheamicina (N-acetil calicheamicina DMH). 24. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, en donde el ligador hidrolizable es ácido 4-(4-acetilfenoxi) butanoico (AcBut). 25. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24, en donde el anticuerpo anti-Lewis Y es G 193 o Hu3S193. 26. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 25, en donde la carga promedio es de aproximadamente 5 a aproximadamente 7 moles de calicheamicina por mol de anticuerpo anti-Lewis Y. 27. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 26, en donde el conjugado tiene un KD de aproximadamente 1 x 10"7 M a aproximadamente 4 x 10"7 M. 8. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 26, en donde el conjugado tiene un KD de aproximadamente 3.4 x 10"7 M. 9. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 28, en donde el conjugado se une al antígeno Lewis Y y no une los antígenos de grupo sanguíneo H-2 y Lewis X. 30. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 29, en donde el conjugado tiene una actividad citotóxica. 31. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 29, en donde el conjugado tiene una actividad anti-tumoral. 32. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 31 , en donde el conjugado está presente en una cantidad terapéuticamente efectiva. 33. Una composición que comprende un conjugado de hidrazida dimetilo N-acetil gama calicheamicina de ácido 4-(4-acetiIfenox¡) butanoico (N-acetil calicheamicina DMH-AcBut) ligado covalentemente al G193, en donde la carga promedio es aproximadamente 5 a aproximadamente 7 moles de N-acetil calicheamicina DMH por mol de G193 y la fracción de conjugado inferior (LCF) del conjugado es menor de aproximadamente 10%. 4. Un proceso para preservar la actividad biológica de la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 33 comprende Poner en contacto la composición con un crioprotector, un tensoactivo, un agente de amortiguación, y un electrólito en una solución; y liofilizar la solución. 5. El proceso de la reivindicación 34, en donde el conjugado está en una concentración de aproximadamente 0.5 mg/mL a aproximadamente 2 mg/mL. 36. El proceso de la reivindicación 35, en donde el conjugado está en una concentración de un mg/mL. 37. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 34 a 36, en donde el crioprotector está en una concentración de aproximadamente 1.5% a aproximadamente 6% en peso. 38. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 34 a 37, en donde el crioprotector es un alcohol de azúcar o un carbohidrato. 39. El proceso de la reivindicación 38, en donde el crioprotector es threalosa, manitol o sorbitol. 40. El proceso de la reivindicación 38, en donde el crioprotector es sacarosa en una concentración de aproximadamente 5%. 41. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 34 a 40, en donde el tensoactivo está en una concentración de aproximadamente 0.005% a aproximadamente 0.05%. 42. El proceso de la reivindicación 41 , en donde el tensoactivo es Polysorbato 80 en una concentración de 0.01% en peso o Tween 80 en una concentración de aproximadamente 0.01%. 43. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 34 a 42, en donde el agente amortiguante está en una concentración de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 50 mM. 4. El proceso de la reivindicación 43, en donde el agente amortiguante es Tris en una concentración de aproximadamente 20 mM. 5. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 34 a 44, en donde el electrólito está en una concentración de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 100 mM. 6. El proceso de la reivindicación 45, en donde el electrólito es una sal de sodio o de potasio. 7. El proceso de la reivindicación 45, en donde el electrólito es NaCI en una concentración de aproximadamente 10 mM. 8. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 34 a 47, en donde antes de la liofilización, el pH es de aproximadamente 7.8 a aproximadamente 8.2. 9. El proceso de la reivindicación 48, en donde el pH antes de liofilización es de aproximadamente 8.0. 0. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 34 a 49, en donde la liofilización comprende congelar la solución a una temperatura de aproximadamente -35° a aproximadamente -50° C; secar inicialmente la solución congelada en una presión de secado primaria de aproximadamente 20 a aproximadamente 80 micrones en una temperatura de almacenamiento de aproximadamente -10° a aproximadamente -40° C durante 24 a 78 horas; Y segundo secar el proceso secado por congelamiento en una segunda presión de secado de aproximadamente 20 a aproximadamente 80 micrones en una temperatura de almacenamiento de aproximadamente +10° a aproximadamente +30° C durante 15 a 30 horas. 1. El proceso de la reivindicación 50, en donde el congelamiento se lleva a cabo en aproximadamente -45° C; el secado por congelamiento inicial está en una presión de secado primaria de aproximadamente 60 micrones y una temperatura de almacenamiento de aproximadamente -30° C durante 60 horas; y la etapa de secado secundaria está en una presión de aproximadamente 60 micrones y una temperatura de almacenamiento de aproximadamente +25° C durante 24 horas. 2. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 34 a 51, en donde el proceso comprende adicionalmente agregar un agente de masa antes de la liofilización. 3. El proceso de la reivindicación 52, en donde el agente de masa está en una concentración de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 1.5% en peso. . El proceso de la reivindicación 52, en donde el agente de masa es dextrano 40 en una concentración de aproximadamente 0.9% en peso o almidón de hidroxietilo 40 en una concentración de aproximadamente 0.09% en peso. . El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 34 a 54, en donde el conjugado tiene actividad citotóxica. . El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 34 a 54, en donde el conjugado tiene actividad anti-tumoral. 57. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 34 a 56, en donde el conjugado está presente en una cantidad terapéuticamente efectiva. 58. El proceso de la reivindicación 34, en donde el conjugado es hidrazida dimetilo de N-acetil gama calicheamicina-ácido 4-(4- acetilfenoxi) butanoico (N-acetil calicheamicina DMH-AcBut) ligada covalentemente al G193, en donde la carga promedio es de aproximadamente 5 a aproximadamente 7 moles de N-acetil calicheamicina DMH por mol de G193 y la fracción de conjugado inferior (LCF) del conjugado es menor de aproximadamente 10%. 59. Una formulación que comprende un conjugado de anticuerpo de calicheamicina-anti-Lewis Y, un crioprotector, un tensoactivo, un agente amortiguante, y un electrólito. 60. La formulación de la reivindicación 59, en donde el conjugado está en una concentración de aproximadamente 0.5 mg/mL a aproximadamente 2 mg/mL 61. La formulación de la reivindicación 60, en donde el conjugado está en una concentración de aproximadamente 1 mg/mL. 62. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 59 a 61 , en donde el crioprotector está en una concentración de aproximadamente 1.5% a aproximadamente 6% en peso. 63. La formulación de la reivindicación 62, en donde el crioprotector es un alcohol de azúcar o un carbohidrato. 64. La formulación de la reivindicación 63, en donde el crioprotector es threalosa, manitol o sorbitol. 65. La formulación de la reivindicación 63, en donde el crioprotector es sucrosa en una concentración de aproximadamente 5%. 66. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 59 a 65, en donde el tensoactivo está en una concentración de aproximadamente 0.005% a aproximadamente 0.05%. 67. La formulación de la reivindicación 66, en donde el tensoactivo es Tween 80 en una concentración de aproximadamente 0.01%. 68. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 59 a 67, en donde el agente amortiguante está en una concentración de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 50 mM. 69. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 59 a 68, en donde el agente amortiguante es Tris en una concentración de aproximadamente 20 mM. 70. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 59 a 69, en donde el electrólito está en una concentración de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 100 mM. 1. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 59 a 70, en donde el electrólito es una sal de sodio o de potasio. 2. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 59 a 71 , en donde el electrólito es NaCI en una concentración de aproximadamente 10 mM. 73. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 59 a 72, en donde el pH es de aproximadamente 7.8 a aproximadamente 8.2. 74. La formulación de la reivindicación 73, en donde el pH es de aproximadamente 8.0. 75. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 59 a 74, en donde la calicheamicina es un derivado N-acilo de calicheamicina o un análogo de disulfuro de calicheamicina. 76. La formulación de la reivindicación 75, en donde la calicheamicina es hidrazida dimetilo de N-acetil gama calicheamicina (N-acetil calicheamicina DMH). 77. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 59 a 76, en donde el ligador hidrolizable es ácido 4-(4-acetilfenoxi) butanoico (AcBut). 78. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 59 a 77, en donde el anticuerpo anti-Lewis Y es G 193 o Hu3S193. 79. Lá formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 59 a 78, en donde la carga promedio es de aproximadamente 5 a aproximadamente 7 moles de calicheamicina por mol de anticuerpo anti-Lewis Y. 80. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 59 a 79, en donde el conjugado tiene un KD de aproximadamente 1 x 10'7 M a aproximadamente 4 x 10"7 M. 81. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 59 a 79, en donde el conjugado tiene un KD de aproximadamente 3.4 x 10"7 M. 82. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 59 a 81 , en donde el conjugado une al antígeno Lewis Y y no los antígenos de grupo sanguíneo H-2 y Lewis X. 83. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 59 a 82, en donde el conjugado tiene una actividad citotóxica. 84. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 59 a 82, en donde el conjugado tiene una actividad anti-tumoral. 85. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 59 a 84, en donde el conjugado está presente en una cantidad terapéuticamente efectiva. 6. La formulación de la reivindicación 59, en donde el conjugado es hidrazida dimetilo de N-acetil gama calicheamicina-ácido 4-(4- acetilfenoxi) butanoico (N-acetil calicheamicina DMH-AcBut) ligada covalentemente al G193, en donde la carga promedio es de aproximadamente 5 a aproximadamente 7 moles de N-acetil calicheamicina DMH por mol de G193 y la fracción de conjugado inferior (LCF) del conjugado es menor de aproximadamente 10%. 7. La formulación de la reivindicación 86, en donde el conjugado está en una concentración de 1 mg/mL, el crioprotector es sucrosa en una concentración de aproximadamente 5%, el tensoactivo es Tween 80 en una concentración de aproximadamente 0.01% en peso, el agente amortiguador es Tris en una concentración de aproximadamente 20 mM y el electrólito es NaCI en una concentración de aproximadamente 10 mM, en donde el pH es de aproximadamente 8.0. Un método para tratar cáncer que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 32. El método de la reivindicación 88, en donde el cáncer es positivo para el antígeno Lewis Y. El método de la reivindicación 88 o 89, en donde el cáncer es un carcinoma. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 88 a 90, en donde la composición se administra como una segunda monoterapia en línea. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 88 a 90, en donde la composición se administra en una primera terapia de combinación de primera línea. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 88 a 92, en donde el cáncer es Cáncer de Pulmón de Célula no Pequeña (NSCLC) o cáncer de seno. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 88 a 92, en donde el cáncer es cáncer de próstata o cáncer colorectal. 95. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 88 a 94, en donde la composición se administra en combinación con un agente bioactivo. 96. El método de la reivindicación 95, en donde el agente bioactivo es un agente anti-cáncer. 97. Un método para tratar NSCLC que comprende administrar una composición de de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 32. 98. Un método para tratar cáncer de seno que comprende administrar una composición de de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 32. 99. Un método para tratar un paciente con un trastorno proliferativo, el método comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 32. 100. Un kit comprende: (i) un contenedor que contiene la formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 59 a 86; y (ii) instrucciones para reconstituir la formulación con un diluyente a una concentración de conjugado en la formulación reconstituida dentro del rango de aproximadamente 0.5 mg/mL a aproximadamente 5 mg/mL. CONJUGADOS DE CALICHEAMICINA Hu3S193
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Families Citing this family (86)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GT200500255A (es) * 2004-09-10 2006-04-10 Anticuerpos anti-5ta humanizados y conjugados anticuerpo anti-5ta/calicheamicina
US8008453B2 (en) * 2005-08-12 2011-08-30 Amgen Inc. Modified Fc molecules
EP1790664A1 (en) * 2005-11-24 2007-05-30 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies against claudin-18 for treatment of cancer
WO2007067602A1 (en) * 2005-12-06 2007-06-14 Wyeth Interleukin-11 compositions and methods of use
AU2007226696C1 (en) 2006-03-10 2016-02-04 Wyeth Llc Anti-5T4 antibodies and uses thereof
CY1112212T1 (el) * 2008-04-24 2015-12-09 Immatics Biotechnologies Gmbh Νεα σκευασματα πεπτιδιων που σχετιζονται με ογκους τα οποια συνδεονται σε μορια του αντιγονου ανθρωπινων λευκοκυτταρων (hla) ταξης i ή ii για εμβολια
PL2113253T3 (pl) * 2008-04-30 2010-09-30 Immatics Biotechnologies Gmbh Nowa postać leku - preparat zawierający peptydy nowotworowe wiążące się z antygenami ludzkich leukocytów klasy I i II, zastosowany w szczepionce
AR076284A1 (es) 2009-04-29 2011-06-01 Bayer Schering Pharma Ag Inmunoconjugados de antimesotelina y usos de los mismos
FR2947269B1 (fr) 2009-06-29 2013-01-18 Sanofi Aventis Nouveaux composes anticancereux
CN102905727B (zh) * 2009-10-30 2016-12-07 詹森生物科技公司 Il-17a拮抗剂
US9309322B2 (en) 2010-11-12 2016-04-12 Scott & White Healthcare (Swh) Antibodies to tumor endothelial marker 8
WO2012103165A2 (en) 2011-01-26 2012-08-02 Kolltan Pharmaceuticals, Inc. Anti-kit antibodies and uses thereof
PT2707031T (pt) 2011-05-08 2019-09-05 Legochem Biosciences Inc Conjugados de proteína e agente ativo e processo para a sua preparação
RU2011132483A (ru) * 2011-08-02 2013-02-10 Елена Александровна Моренко Биологически активный продукт для применения в ветеринарии и животноводстве, способ его получения и способы повышения выживаемости, стимуляции роста, иммуностимуляции и повышения общей неспецифической резистентности организма сельскохозяйственных животных
CA2871458C (en) * 2012-04-27 2020-06-23 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable antibodies that bind epidermal growth factor receptor and methods of use thereof
US20130309223A1 (en) 2012-05-18 2013-11-21 Seattle Genetics, Inc. CD33 Antibodies And Use Of Same To Treat Cancer
US9493562B2 (en) 2012-07-19 2016-11-15 Alethia Biotherapeutics Inc. Anti-Siglec-15 antibodies
WO2014018625A1 (en) 2012-07-25 2014-01-30 Kolltan Pharmaceuticals, Inc. Anti-kit antibodies and uses thereof
EA038512B1 (ru) 2013-03-15 2021-09-08 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Конъюгаты майтанзиноидов и их терапевтическое применение
CA2921412C (en) 2013-08-26 2024-05-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical compositions comprising macrolide diastereomers, methods of their synthesis and therapeutic uses
US9540440B2 (en) 2013-10-30 2017-01-10 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable antibodies that bind epidermal growth factor receptor and methods of use thereof
WO2015089283A1 (en) 2013-12-11 2015-06-18 Cytomx Therapeutics, Inc. Antibodies that bind activatable antibodies and methods of use thereof
KR102399005B1 (ko) 2014-03-11 2022-05-17 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 항-egfrviii 항체 및 그것의 용도
WO2016160615A1 (en) 2015-03-27 2016-10-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Maytansinoid derivatives, conjugates thereof, and methods of use
PE20180658A1 (es) * 2015-06-29 2018-04-17 Univ Rice William M Sintesis total de shishijimicina a y sus analogos
CA2987641A1 (en) 2015-07-06 2017-01-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multispecific antigen-binding molecules and uses thereof
MA45326A (fr) 2015-10-20 2018-08-29 Genentech Inc Conjugués calichéamicine-anticorps-médicament et procédés d'utilisation
FI3380525T3 (fi) * 2015-11-25 2024-01-30 Immunogen Inc Lääkeformulaatioita ja niiden käyttömenetelmiä
SI3380124T1 (sl) 2015-11-25 2024-10-30 Legochem Biosciences, Inc. Konjugati, ki obsegajo samožrtvujoče skupine in z njimi povezani postopki
JP2018536682A (ja) 2015-12-11 2018-12-13 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． Ｅｇｆｒ及び／またはｅｒｂｂ３遮断に耐性のある腫瘍の成長を低減または防止するための方法
MX390630B (es) 2016-01-25 2025-03-21 Regeneron Pharma Derivados de maitansinoide, conjugados de los mismos y metodos de uso.
EP3442584B1 (en) 2016-03-15 2021-07-28 Seagen Inc. Combinations of pbd-based antibody drug conjugates with bcl-2 inhibitors
CN105726527B (zh) * 2016-03-25 2018-05-11 苏州大学 小分子化合物的用途及其组合物
US11352446B2 (en) 2016-04-28 2022-06-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of making multispecific antigen-binding molecules
US11110179B2 (en) 2016-06-03 2021-09-07 Seagen Inc. Combination of CD33 antibody drug conjugates with chemotherapeutic agents
EP3469001A4 (en) 2016-06-09 2020-05-06 Seattle Genetics, Inc. COMBINATIONS OF PBD-BASED ANTIBODY CONJUGATES WITH FLT3 INHIBITORS
TW201811376A (zh) 2016-07-01 2018-04-01 英商葛蘭素史密斯克藍智慧財產權有限公司 抗體-藥物結合物及使用其之治療方法
MA46417A (fr) 2016-09-23 2019-07-31 Regeneron Pharma Anticorps anti-steap2, conjugués anticorps-médicament, et molécules bispécifiques de liaison à l'antigène qui se lient à steap2 et cd3, et leurs utilisations
RS63660B1 (sr) 2016-09-23 2022-11-30 Regeneron Pharma Anti-muc16 (mucin 16) antitela
MY199937A (en) 2016-11-08 2023-11-29 Regeneron Pharma Steroids and protein-conjugates thereof
TWI782930B (zh) 2016-11-16 2022-11-11 美商再生元醫藥公司 抗ｍｅｔ抗體，結合ｍｅｔ之雙特異性抗原結合分子及其使用方法
KR102085798B1 (ko) 2016-12-28 2020-03-06 주식회사 인투셀 베타-갈락토사이드가 도입된 자가-희생 기를 포함하는 화합물
WO2018213082A1 (en) 2017-05-18 2018-11-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Bis-octahydrophenanthrene carboxamides and protein conjugates thereof
KR20200007905A (ko) 2017-05-18 2020-01-22 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 사이클로덱스트린 단백질 약물 접합체
BR112019025888A2 (pt) 2017-06-07 2020-06-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. polinucleotídeo que codifica uma proteína terapêutica multidomínio, vetor de terapia gênica, proteína terapêutica multidomínio recombinante, método de expressão, métodos para reduzir o acúmulo de glicogênio em um tecido em um paciente em necessidade, para reduzir o acúmulo de glicogênio em um tecido em um paciente em necessidade epara tratar a deficiência enzimática em um paciente em necessidade e/ou tolerar o paciente à enzima para a qual é deficiente, anticorpo anti-cd63 ou fragmento de ligação a antígeno, e, composição farmacêutica
CN111601619A (zh) 2017-11-07 2020-08-28 里珍纳龙药品有限公司 用于抗体药物偶联物的亲水性连接体
US12070506B2 (en) 2018-01-08 2024-08-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Steroids and antibody-conjugates thereof
EP3788075A1 (en) 2018-04-30 2021-03-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antibodies, and bispecific antigen-binding molecules that bind her2 and/or aplp2, conjugates, and uses thereof
AU2019265703A1 (en) 2018-05-09 2020-11-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-MSR1 antibodies and methods of use thereof
MY206284A (en) 2018-05-17 2024-12-06 Regeneron Pharma Anti-cd63 antibodies, conjugates, and uses thereof
SG11202011576VA (en) * 2018-05-30 2020-12-30 Abbvie Stemcentrx Llc Anti-sez6 antibody drug conjugates and methods of use
CA3120528A1 (en) 2018-11-20 2020-05-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Bis-octahydrophenanthrene carboxamide derivatives and protein conjugates thereof for use as lxr agonists
SG11202106658XA (en) 2018-12-21 2021-07-29 Regeneron Pharma Rifamycin analogs and antibody-drug conjugates thereof
CN113454097B (zh) 2018-12-21 2024-08-30 里珍纳龙药品有限公司 微管溶素及蛋白质-微管溶素偶联物
JP2022517767A (ja) 2019-01-08 2022-03-10 レゲネロン ファーマシューティカルス，インコーポレーテッド 無痕跡型リンカー及びそのタンパク質－コンジュゲート
CN120241997A (zh) 2019-02-18 2025-07-04 伊莱利利公司 治疗性抗体制剂
JP2022523360A (ja) 2019-02-21 2022-04-22 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｍｅｔに結合する抗ｍｅｔ抗体および二特異性抗原結合分子を使用した眼癌の治療方法
US20220226496A1 (en) 2019-05-02 2022-07-21 Legochem Biosciences, Inc. Ligand-drug conjugate including linker having tris structure
GB201910899D0 (en) * 2019-07-31 2019-09-11 Scancell Ltd Binding members
CN114340684B (zh) 2019-09-16 2025-09-12 瑞泽恩制药公司 用于免疫pet成像的放射性标记的met结合蛋白
US11814428B2 (en) 2019-09-19 2023-11-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-PTCRA antibody-drug conjugates and uses thereof
CN115348874A (zh) 2020-01-24 2022-11-15 里珍纳龙药品有限公司 蛋白质-抗病毒化合物偶联物
MX2022010599A (es) 2020-02-28 2022-09-09 Regeneron Pharma Moleculas biespecificas de union al antigeno que se unen a her2, y metodos de uso de los mismos.
KR20230004651A (ko) 2020-04-16 2023-01-06 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 딜스-알더 접합 방법
BR112022024361A2 (pt) 2020-06-24 2022-12-27 Regeneron Pharma Tubulisinas e conjugados de proteína-tubulisina
BR112023000489A2 (pt) 2020-07-13 2023-03-28 Regeneron Pharma Análogos de camptotecina conjugados a um resíduo de glutamina em uma proteína, e seu uso
US12280124B2 (en) 2020-09-14 2025-04-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antibody-drug conjugates comprising GLP1 peptidomimetics and uses thereof
CA3187749A1 (en) * 2020-09-14 2022-03-17 Arnold Mcauley Method of making lyophilized protein formulations
IL301702A (en) 2020-10-22 2023-05-01 Regeneron Pharma Anti-FGFR2 antibodies and methods of using them
US20250041433A1 (en) 2021-07-28 2025-02-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Protein-antiviral compound conjugates
WO2023129518A1 (en) 2021-12-29 2023-07-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Tubulysins and protein-tubulysin conjugates
US20230287138A1 (en) 2022-01-12 2023-09-14 Regneron Pharmaceuticals, Inc. Protein-drug conjugates comprising camptothecin analogs and methods of use thereof
AU2023208050A1 (en) 2022-01-14 2024-07-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Verrucarin a derivatives and antibody drug conjugates thereof
EP4488290A1 (en) 2022-03-04 2025-01-08 ABTIS Co., Ltd. Method for increasing production yield of antibody-drug conjugate by using thiol-reactive additive
CN119072335A (zh) 2022-03-11 2024-12-03 瑞泽恩制药公司 包含glp1肽模拟物的抗glp1r抗体-药物缀合物及其用途
AU2023297610A1 (en) 2022-06-27 2025-01-09 Trioar, Inc. Novel linker compound and ligand-drug conjugate therefor
AU2023301282A1 (en) 2022-06-27 2025-01-09 Trioar, Inc. Compound comprising self-immolative group and ligand-drug conjugate comprising same
CN120239705A (zh) 2022-07-21 2025-07-01 萤火虫生物股份有限公司 糖皮质激素受体激动剂和其缀合物
KR20240117111A (ko) 2022-11-01 2024-07-31 앱티스 주식회사 Fc 결합성 유닛을 포함하는 화합물 및 이를 이용하여 제조된 컨쥬게이트
KR20250128394A (ko) 2022-11-30 2025-08-27 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 Tlr7 작용제 및 이의 항체-약물-접합체
KR20250133813A (ko) 2022-12-21 2025-09-08 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 Adc 접합을 위한 토포이소머라아제 i 억제제의 전구약물 및 이의 사용 방법
CN121001751A (zh) 2023-02-09 2025-11-21 里珍纳龙药品有限公司 借助逆电子需求狄尔斯-阿尔德反应的抗体-药物缀合物
CN121039163A (zh) 2023-05-02 2025-11-28 瑞泽恩制药公司 抗人m-钙粘蛋白（cdh15）抗体、缀合物及其用于将遗传有效负载递送至肌肉细胞的用途
WO2025014533A1 (en) 2023-07-10 2025-01-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-human cacng1 antibody-drug conjugates and uses thereof
US20250171516A1 (en) 2023-11-03 2025-05-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Peptide acids as a glp1r agonist and antibody-drug conjugates thereof
WO2025117727A1 (en) 2023-11-29 2025-06-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Analogs of quinoxaline/quinoline cytotoxins, linker- payloads, protein-drug conjugates, and uses thereof

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5822085B2 (ja) * 1977-07-19 1983-05-06 株式会社ミドリ十字 静注用ガンマ・グロブリン製剤
US4675187A (en) * 1983-05-16 1987-06-23 Bristol-Myers Company BBM-1675, a new antibiotic complex
US4554162A (en) * 1984-05-04 1985-11-19 Warner-Lambert Company CL-1724 Antibiotic compounds, their production and use
US4539203A (en) * 1984-11-13 1985-09-03 Warner-Lambert Company CL-1577D And CL-1577E antibiotic/antitumor compounds, their production and use
US4970198A (en) * 1985-10-17 1990-11-13 American Cyanamid Company Antitumor antibiotics (LL-E33288 complex)
US5108912A (en) * 1987-01-30 1992-04-28 American Cyanamid Company Antitumor antibiotics (LL-E33288 complex)
US5079233A (en) * 1987-01-30 1992-01-07 American Cyanamid Company N-acyl derivatives of the LL-E33288 antitumor antibiotics, composition and methods for using the same
US5037651A (en) * 1987-01-30 1991-08-06 American Cyanamid Company Dihydro derivatives of LL-E33288 antibiotics
US5182192A (en) * 1987-03-27 1993-01-26 The Wistar Institute Monoclonal antibodies against glycolipid antigens, methods of producing these antibodies, and use therefor
US4971792A (en) * 1987-03-27 1990-11-20 The Wistar Institute Monoclonal antibodies against glycolipid antigens
US4837206A (en) * 1987-04-29 1989-06-06 Bristol-Myers Company Esperamicin derivatives
US5053394A (en) * 1988-09-21 1991-10-01 American Cyanamid Company Targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) * 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
JPH01146826A (ja) * 1987-12-03 1989-06-08 Nippon Kayaku Co Ltd 白金化合物の凍結乾燥製剤
IL94872A (en) * 1989-06-30 1995-03-30 Oncogen Monoclonal or chimeric antibodies reactive with human carcinomas, recombinant proteins comprising their antigen binding region, pharmaceutical compositions and kits comprising said antibodies and methods for imaging human carcinoma using same
US6020145A (en) * 1989-06-30 2000-02-01 Bristol-Myers Squibb Company Methods for determining the presence of carcinoma using the antigen binding region of monoclonal antibody BR96
US5980896A (en) * 1989-06-30 1999-11-09 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies reactive with human carcinomas
ES2145004T3 (es) * 1991-08-21 2000-07-01 Novartis Ag Derivados de anticuerpos.
US6310185B1 (en) * 1994-03-08 2001-10-30 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Recombinant human anti-Lewis Y antibodies
US5773001A (en) * 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
JP3687993B2 (ja) * 1994-06-24 2005-08-24 シスメックス株式会社 インシュリン標準液
US5792456A (en) * 1994-08-04 1998-08-11 Bristol-Myers Squibb Company Mutant BR96 antibodies reactive with human carcinomas
US5712374A (en) * 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5714586A (en) * 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6267958B1 (en) * 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
JPH11513669A (ja) * 1995-10-13 1999-11-24 アメリカ合衆国 ジスルフィド安定化抗体フラグメントを含む免疫毒素
US20030175884A1 (en) * 2001-08-03 2003-09-18 Pablo Umana Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
DK1071700T3 (da) * 1998-04-20 2010-06-07 Glycart Biotechnology Ag Glykosylerings-modifikation af antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellulær cytotoksicitet
US20020128448A1 (en) * 2000-10-20 2002-09-12 Idec Pharmaceuticals Corporation Variant IgG3 Rituxan and therapeutic use thereof
ES2411007T3 (es) * 2001-10-10 2013-07-04 Novo Nordisk A/S Remodelación y glicoconjugación de péptidos
PT2371392E (pt) * 2002-05-02 2015-10-07 Wyeth Holdings Llc Conjugados de derivado da caliqueamicina - transportador
PL222220B1 (pl) * 2003-01-22 2016-07-29 Glycart Biotechnology Ag Komórka gospodarza i sposób wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza
GT200500255A (es) * 2004-09-10 2006-04-10 Anticuerpos anti-5ta humanizados y conjugados anticuerpo anti-5ta/calicheamicina

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Publication number Publication date
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