PROCESO PARA PURIFICAR INTERFERON BETA Campo de la Invención La presente invención se relaciona a un proceso para purificar un interferón beta humano a partir de un cultivo que contiene interferón beta humano recombinante usando cromatografía de afinidad y cromatografía de líquidos de alta resolución de fase inversa. Antecedentes de la Invención Los interferones en un amplio significado son mensajeros extracelulares que median la reactividad de hospederos y familias de proteínas conservadas evolucionalmente que son liberadas en un tamaño relativamente pequeño a partir de las células . Los interferones son liberados a partir de células que producen interferones en respuesta a estimulación por virus, ARN de doble hebra, varios microorganismos, o citosinas tales como TNF o IL1, y después se enlazan a las superficies de células vecinas con receptores de interferones. Después de esto, los interferones inducen la síntesis de varias proteínas de tal forma que la reactividad y homeostasis de los hospederos son mantenidos por señalización consecutiva en las células. Por lo tanto, los interferones actúan como proteínas de señalización antivirales, antiproliferativas e inmunes en los cuerpos y tienen efectos antiproliferación directos en células cancerígenas, y de esta forma, han recibido mucha atención Ref.: 173637 como agentes terapéuticos [Postka S., Langer J. A. and Zoon K.C. (1987) Interferons and their actions, Annu. Rev. Biochem. 56:727-777]. Los interferones pertenecen a la clase de substancias activas fisiológicamente, helicoidales. De acuerdo a características y funcionalidades fisicoquímicas, hay dos clases de interferones: tipo 1 y 2. Los interferones alfa, beta, tau y epsilon son miembros del interferon tipo 1 [Weissman C. And Weber H. (1986) The Inferieron genes, Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 33:251-300] y el interferón gamma es un miembro del interferón tipo 2. Entre los mismos, los interferones beta que pertenecen al interferón tipo 1 son proteínas que exhiben especificidad de especies. Los interferones beta son también llamados interferones de fibroblastos considerando sus fuentes y como interferones estables al pH 2 considerando sus características biológicas. Los interferones betas enlazan a los mismos receptores de superficies celulares, junto con interferones alfas que pertenecen al interferón tipo 1, y después inducen la transcripción de factores antivirales en respuesta a un sistema de señalización celular consecutiva. Los interferones betas son glicoproteínas
(aproximadamente 20% de porción de azúcar) con una masa molecular de- aproximadamente 20 kDa y proteínas de cadena sencilla que consisten de 166 aminoácidos. Un sitio de N-glicosilación es conocido por jugar un papel en el incremento de la estabilidad o solubilidad del material así como funciones fisicoquímicas, más que participación en la actividad biológica o antigenicidad [Karpusas M. , Whytty A., Runkel L., and Hochman P. The structure of human interferon-ß; implications for activity CMLS, 54:1203-1216 1998]. El avance en la tecnología de recombinación genética permite la determinación de secuencia de aminoácidos del interf rón beta humano . y la clonación y expresión del interferón beta humano en E. coli [Taniguchhi, Gene 10:11-15, 1980]. Adicionalmente, la expresión del interferón beta en células de ovario de Hámster Chino (CHO por sus siglas en inglés) es también reportada [Patente de' los Estados Unidos de Norteamérica 4,966,843, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 5,376,567 y Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 5795779]. Actualmente, los interferones betas son fabricados por tecnología de recombinación de genes y comerciaimente disponibles bajo la marca comercial de Betaseron®, Avonex® y Rebil® . Los interferones beta recombinantes son conocidos por ser efectivos en retrasar la progresión de esclerosis múltiple en pacientes con los signos de la enfermedad y aliviar el dolor de la enfermedad. Adicionalmente, los interferones beta recombinantes son usados ampliamente como agentes terapéuticos para esclerosis múltiple, y al mismo tiempo son efectivos en regulación no específica de respuesta inmune humana, respuesta inmune a infección viral, y antiproliferación de células cancerígenas. Las tecnologías de purificación actualmente disponibles de interferones betas recombinantes expresados en células CHO implican 3-5 procedimientos de purificación incluyendo purificación primaria por cromatografía de afinidad (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 4,278,661, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 4,289,689, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 4,541,952, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 4,808,523, etc.), cromatografía de metal quelado (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 4,257,938, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 4,359, 389, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 4,541,952, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 5,244,655, etc), cromatografía CPG (vidrio de poro controlado) (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 4,359,389, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 5,066,786, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 5,244,655, etc), o cromatografía de concanavalina A (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 4,289,689, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 4,658,017, etc) seguido por cromatografía de intercambio de cationes y cromatografía de fase inversa. En las tecnologías de purificación comunes descritas anteriormente, la cromatografía de quelado de metal puede provocar contaminación ambiental debido al uso de metal pesado. La cromatografía CPG o de concanavalina A tiene pobre especificidad de purificación. Es decir, la cromatografía de concanavalina A basada en el enlace selectivo con muchas proteínas de cadena de azúcar contenidas en un cultivo celular de CHO exhibe baja especificidad. Sin embargo, la eficiencia de separación y pureza de interferones beta son menores que aquellos por cromatografía de afinidad (por ejemplo, cromatografía de columna Blue Sepharose) . Adicionalmente, las tecnologías de purificación comunes por cromatografía de afinidad implican lavado y elución con etilenglicol usando un anticuerpo monoclonal y/o un resina de tinte. Sin embargo, la cromatografía de afinidad usando un anticuerpo monoclonal requiere separadamente la remoción de la forma no glícosilada del interferón beta, lo cual lleva a la dificultad de producción en masa. En particular, el etilenglicol usado en lavado y elución es muy tóxico en el cuerpo, lo cual restringe la aplicación de purificación actual . Mientras tanto, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 4,483,849 describe un proceso para purificar y estabilizar el interferón beta usando propilenglicol, en lugar de etilenglicol tóxico, por cromatografía de afinidad. El proceso descrito en este documento de patente incluye aplicar un cultivo que contiene interferón a una columna de afinidad de tinte tal como Affi-Gel Blue equilibrado, lavando la columna con una solución de amortiguador NaCl/P0 1.0 M y una solución de amortiguador NaCl/P04 1.0 M que contiene 40% de propilenglicol, y eluyendo el interferón con 50% de propilenglicol. A pesar de que el proceso de este documento de patente implica lavado y elución de la columna, un pico de producto de final deseado y un pico de impureza coexisten por lo mismo disminuyendo la pureza. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un proceso para purificar el interferón beta, el cual incluye recuperar un producto de purificación primaria de alta pureza de interferón beta por cromatografía de afinidad incrementada usando propilenglicol no tóxico seguido por cromatografía de líquidos de alta resolución de fase inversa. Por lo tanto, la presente invención proporciona un proceso para purificar interferón beta humano a partir de un cultivo que contiene interferón beta humano recombinante el cual comprende realizar cromatografía de afinidad y cromatografía de líquidos de alta resolución de fase inversa (RP-HPLC por sus siglas en inglés) , lo cual incluye lavado y elución con una solución de amortiguador específica. De acuerdo a un aspecto de la presente invención, se proporciona un proceso para purificar interferón beta humano a partir de un cultivo que contiene interferón beta humano recombinante por cromatografía de afinidad y RP-HPLC, en donde la cromatografía de afinidad incluye: adsorber el cultivo que contiene el interferón beta a una columna de cromatografía de afinidad equilibrada, seguido por lavado con una solución de amortiguador de equilibrio; lavar la columna con una solución de amortiguador de lavado A de pH 6.5-7.5 que contiene 30-60% en peso de propilenglicol y una solución de amortiguador de lavado B de pH 6.5-7.5 que contiene 10-30% en peso de propilenglicol y NaCl 1-2M; y eluir una fracción que contiene el interferón beta humano con una solución de amortiguador de pH 6.5-7.5 que contiene 40-60% en peso de propilenglicol y NaCl 1-2M. En el proceso de purificación de la presente invención, ejemplos no limitantes del cultivo que contiene el interferón beta humano recombinante usado como una muestra incluyen células y cepas de producción de interferón beta. Por ejemplo, el cultivo que contiene ínterferón beta humano recombinante puede ser un cultivo obtenido por un método conocido descrito en Cárter and Horoszewicz. Pharm. Ther. 8, 359-377, 1980; Strander and Cantell, Ann. Med. Exp. Fenn. 44, 265-273, 1996; Wheelock, Science, 149, 310-311, 1965, y similares. Preferentemente, el cultivo que contiene interferón beta humano recombinante es un cultivo libre de suero derivado de células de ovario de hámster Chino (CHO por sus siglas en inglés) que produce el interferón humano recombinante . En el proceso de purificación de la presente invención, la columna de cromatografí de afinidad usada en la cromatografía de afinidad puede ser una columna de afinidad de tinte común, por ejemplo una columna (por ejemplo, columna XK-50, Amersham Biosciences, Suecia) empacada con Blue-Sepharose 6 (Amerscham Biosciences, Suecia) o una columna Affi-Gel Blue (Bio-Rad, America) . La solución de amortiguador de equilibrio para la columna de cromatografía de afinidad puede ser una solución de amortiguador de fosfato de sodio-EDTA (aproximadamente pH 7.2) . La columna de cromatografía de afinidad puede ser equilibrada con 3 volúmenes de columna (VC) de la solución de amortiguador de equilibrio, por ejemplo en una velocidad lineal de aproximadamente 15-30 cm/hr. En el proceso de purificación de la presente invención, la cromatografía de afinidad incluye adsorber el cultivo que contiene el interferón beta a la columna de cromatografía de afinidad equilibrada y remover una proteína no enlazada específicamente al lavar con la solución de amortiguador de equilibrio. La cromatografía de afinidad también incluye lavado de múltiples etapas, es decir, lavar la columna con una solución A de amortiguador de lavado de pH 6.5-7.5 que contiene 30-60% en peso de propilenglicol y con una solución de amortiguador de lavado B de pH 6.5-7.5 que contiene 10-30% en peso de propilenglicol y NaCl 1-2M. Preferentemente, la cromatografía de afinidad además incluye lavar con una solución C de amortiguador de lavado de pH 6.5-7.5 que contiene NaCl 1-2M. Preferentemente, cada lavado se realiza con 2-4 VC de cada solución de amortiguador. En el proceso de purificación de la presente invención, no hay limitación en la secuencia de uso de las soluciones de amortiguador de lavado. Es decir, el lavado puede ser realizado usando la solución de amortiguador de lavado A y después la solución de amortiguador de lavado B o usando la solución de amortiguador de lavado B y después la solución A de amortiguador de lavado. Además, el lavado puede ser realizado usando la solución de amortiguador de lavado A, la solución de amortiguador de lavado C, y después la solución de amortiguador de lavado B, o usando la solución de amortiguador de lavado B, la solución de amortiguador de lavado C, y después la solución de amortiguador de lavado A. El lavado con la solución A de amortiguador de lavado efectivamente remueve las impurezas con alta hidrofobicidad, el lavado con la solución C de amortiguador de lavado remueve las impurezas hidrofílicas, y el lavado con la solución B de amortiguador de lavado remueve proteínas de impurezas. La recuperación' del interferón beta puede ser realizada eluyendo una fracción que contiene el interferón beta humano con una solución de amortiguador de pH 6.5-7.5 que contiene 40-60% en peso de propilenglicol, preferentemente 50% en peso y NaCl 1-2M. Preferentemente, cada solución de amortiguador usada en el lavado o elución puede ser una solución de amortiguador de fosfato de sodio o una solución de amortiguador de fosfato de potasio. En el proceso de purificación de la presente invención, el lavado con una solución de amortiguador que contiene aproximadamente 50% de propilenglicol permite la remoción eficiente de picos de impureza, lo cual está en contraste con el proceso descrito en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 4,483,849 en la cual se realiza el lavado y elución con un gradiente de concentración de propilenglicol graduado. En el proceso de purificación de la presente invención, la cromatografía de afinidad descrita anteriormente es seguido por RP-HPLC. Preferentemente, antes a realizar la RP-HPLC, una solución eluida a partir de la cromatografía de afinidad sufre diafiltración con una membrana de ultrafiltración del corte de peso molecular de 10,000. Por la diafiltración, puede ser ajustado el interferón beta con concentración relativamente alta de sal a una concentración de sal apropiada.
La RP-HPLC se realiza como a continuación: una muestra obtenida por la diafiltración se carga en una columna y después se eluye una fracción que contiene el interferón beta humano en pH 5-7 por un gradiente de concentración de etanol que contiene HCl. En detalle, se equilibra una columna con HCl 0.1% que contiene 0.1-20%, preferentemente 5% o menos de propilenglicol, y después se carga una muestra, obtenida por diafiltración, la cual contiene 0.1-20%, preferentemente, 5% o menos de propilenglicol en la columna. Después, se lava la columna con HCl al 0.1% y fracciones que contienen el interferón beta son eluidas por un gradiente de concentración lineal a partir de 30-50%, preferentemente 45% de etanol que contiene HCl 0.1% a 65-90%, preferentemente 70% de etanol que contiene HCl 0.1%. Una columna para la RP-HPLC puede ser protein C4
(10 µm en tamaño de perla, 30 Á en tamaño de poro, Vydac)
(XK-50, 150 ml de VC, Amersham Biosciences, Suecia) y puede ser equilibrada con aproximadamente 5 VC de una solución de
HCl 0.1% que contiene propilenglicol. En la RP-HPLC, la muestra obtenida obtenida por la diafiltración se deja fluir a través de la columna equilibrada en una velocidad de flujo apropiada, lavada con 3 VC ó más de solución de amortiguador HCl 0.1%, y eluida por un gradiente de concentración lineal de aproximadamente 10-20 VC de etanol que contiene Hcl 0.1 para por lo mismo separar proteínas de impureza separada y proteínas objetivos. Una fracción la cual contiene el interferón beta obtenida por la RP-HPLC puede además ser sometida a reemplazamiento con una solución de amortiguador fresco. El reemplazamiento con una solución de amortiguador fresca puede ser realizada por filtración de gel o concentración y diafiltración. Por ejemplo, en el caso de realizar filtración de gel, las fracciones que contienen el interferón beta obtenidas por la RP-HPLC es concentrada a, por ejemplo aproximadamente 200-1000 µl/ml, dializada con 10-50 mM de solución de amortiguador de acetato de sodio (pH 3.5~5.5) y cargada en una columna de cromatografía de filtración de gel (por ejemplo, Sephacryl S-200, Amersham Biosciences) equilibrada con 10-50 mM, preferentemente 20 mM de solución de amortiguador de acetato de sodio (pH 3.5~5.5) . La solución de amortiguador de acetato de sodio 10-50 mM (pH 3.5-5.5) es entonces permitida para fluir a través de la columna en una velocidad de flujo apropiado, por lo que resulta en reemplazamiento de solución para proteínas objetivo y separación y remoción de polímeros. Un diagrama de flujo el cual ilustra el proceso de purificación de la presente invención se muestra en la Figura 1.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es un diagrama de flujo que ilustra el proceso de purificación de la presente invención. La Figura 2 es un cromatograma de análisis de C4 RP-HPLC (cromatografía de líquidos de alta resolución de fase inversa) de interferón beta eluido en cromatografía de afinidad de acuerdo al proceso de purificación de la presente invención. La Figura 3 es un cromatograma de análisis C4 RP-HPLC de interferón beta eluido sin lavar con 50% de propilenglicol . Las Figuras 4A y 4B son respectivamente un cromatograma de análisis C4 RP-HPLC de una solución de amortiguador de filtración de gel y un cromatografa de análisis de C4 RP-HPLC de una solución eluida después de la filtración en gel. Mejor Modo para llevar a cabo la invención Posteriormente en la presente, la presente invención será descrita más específicamente por los Ejemplos. Sin embargo, se proporcionan los siguientes ejemplos solamente para ilustraciones y de esta forma la presente invención no está limitada a los mismos. Ejemplo 1: Cromatografía de afinidad Se empacan 350 ml de Blue-Sepharose 6 (Amersham Biosciences, Suecia) en una columna XK-50 (Amersham Biosciences, Suecia) para hacer una columna de cromatografía de afinidad. Una solución de amortiguador de fosfato de sodio 20 mM la cual contiene EDTA 1 mM es permitida para fluir suficientemente a través de la columna para equilibrar la columna. Después, se permite fluir 25 1 de cultivo libre de suero de célula de ovario de hámster Chino (CHO) el cual contiene el interferón beta a través de la columna en una velocidad de flujo de 5-10 ml/min y después se lava la columna con aproximadamente 3 volúmenes de columna (VC) de una solución de amortiguador de equilibrio . Aproximadamente 3 VC de una solución de amortiguador de fosfato de sodio de 20 mM (pH 7.2) la cual contiene 50% de propilenglicol se permite fluir a través de la columna en una velocidad de flujo de 5 ml/min para eliminar proteínas de impurezas, seguido por lavar con aproximadamente 3 VC de una solución de amortiguador de equilibrio. Después, aproximadamente 3 VC de una solución de amortiguador de fosfato de sodio 20 mM (pH 7.2) la cual contiene NaCl 2 M se permite fluir a través de la columna en una velocidad de flujo de 5 ml/min para eliminar las proteínas de impurezas. Finalmente, aproximadamente 3 VC de solución de amortiguador de fosfato de sodio 20 mM (pH 7.2) la cual contiene NaCl 2 M y 20% de propilenglicol es permitida para fluir a través de la columna en una velocidad de flujo de 5 ml/min para eliminar las proteínas de impurezas . Aproximadamente 3 VC de una solución de amortiguador de elución (solución de amortiguador de fosfato de sodio 20 mM la cual contiene NaCl 2M y 50% de propilenglicol, pH 7.2) se permite fluir a través de la columna en una velocidad de flujo de 5 ml/min para por lo mismo recuperar una solución que contiene el interferón beta. La pureza de la solución eluida de esta forma recuperada es medida usando cromatografía de análisis en C4 HPLC y el resultado es mostrado en la Figura 2. Con referencia a la Figura 2, la pureza del interferón beta es aproximadamente 85% o más. Como un control, se realiza la cromatografía de afinidad de acuerdo a la forma descrita anteriormente excepto que el lavado con una solución de amortiguador de fosfato de sodio 20 mM (pH 7.2) la cual contiene 50% de propilenglicol es omitida. La pureza de la solución eluida resultante es medida usando cromatografía de análisis de C4 HPLC y el resultado es mostrado en la Figura 3. Puede ser visto a partir de la Figura 3 que la ausencia del lavado con solución de amortiguador de fosfato de sodio 20 mM (pH 7.2) el cual contiene 50% de propilenglicol disminuye remarcablemente la pureza del interferón beta.
Ejemplo 2: Cromatografía de líquidos de alta resolución de fase inversa (RP-HPLC) La solución la cual contiene interferón beta obtenida de acuerdo a la presente invención en el Ejemplo 1 sufre diafiltración usando un sistema de ultrafiltración
(corte de peso molecular de 10,000) y después se carga en una columna de RP-HPLC (Protein C4, 10 µm en tamaño de perla, 30
Á de tamaño de poro, Vidac) en una velocidad de flujo de 1.5 ml/min. La columna es entonces lavada con aproximadamente 3 VC de una solución de amortiguador de HCL 0.1% (pH 2.1) . La elución del interferón beta se realiza usando una solución de
HCl 0.1% (A) y una solución (B) de HCl al 0.1% en etanol al
90% por un gradiente de concentración lineal de una solución al 45% (B) a solución al 80% (B) (aproximadamente 20 VC) para por lo mismo separar proteínas de impurezas a partir de las proteínas objetivo. Ejemplo 3: Cromatografía de filtración de gel Una solución la cual contiene el interferón beta obtenida en el Ejemplo 2 es concentrada a 200 µg/ml, y el etanol contenido en el concentrado es reemplazado 500 veces o más por una solución de amortiguador de acetato de sodio 20 mM (pH 4.0) . Se carga la solución resultante en una columna de Sephacryl S-200 (1700 ml, XK-50/100, Amersham Biosciences,
Suecia) equilibrada con una solución de amortiguador de acetato de sodio 20 mM (pH 4.0) para obtener una solución la cual contiene el interferón beta. Ejemplo 4: Análisis de RP-HPLC Se carga cada solución obtenida en los Ejemplos 1,2 y 3 en una columna C4 RP-HPLC (Vydac 214TP54, 4.6 mm en diámetro interno x 25 cm en longitud, 5 µm en tamaño de partícula, 300 Á en tamaño de poro) en una velocidad de flujo de 1 ml/min. Después, se permite fluir 20 VC de un acetonitrilo el cual contiene ácido trifluoroacéitco al 0.1% a través de la columna por una gradiente de concentración lineal a partir de acetonitrilo al 30% que contiene ácido trifluoroacético al 0.1% a acetonitrilo al 80% el cual contiene ácido trifluoroacético al 0.1%, para analizar patrones de cromatograma. Las Figuras 4A y 4B muestran respectivamente un cromatograma de análisis C4 RP-HPLC de una solución de amortiguador de cromatografía de filtración de gel y cromatograma de análisis C4 RP-HPLC de una solución eluida después de la cromatografía de filtración en gel. A partir de las Figuras 4A y 4B, puede ser visto que la presente invención puede propoducir un interferón beta de alta pureza. Aplicabilidad industrial De acuerdo a un proceso de purificación de la presente invención, el interferón beta puede ser purificado con alta pureza de 99% o más usando propilenglicol no tóxico y cromatografía de afinidad mejorada. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.