MXPA06006029A - Factor de estimulacion de colonias de granulocitos modificado por glicopolietilenglicol. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona conjugaos entre el Factor de Estimulacion de Colonias de Granulocitos y porciones de PEG. Los conjugados se unen por medio de un grupo de union de glicosilo intacto que es interpuesto entre y unido covalentemente al peptido y el grupo modificador. Los conjugados se forman de peptidos tanto glicosilados como no glicosilados por la accion de una glicosiltransferasa. La glicosiltransferasa liga una porcion de azucar modificado en cualquier residuo de aminoacido o glicosilo en el peptido. Tambien se proporcionan formulaciones farmaceuticas que incluyen los conjugaos. Los metodos para preparar los conjugados tambien estan dentro del alcance de la invencion.

Description

FACTOR DE ESTIMULACIÓN DE COLONIAS DE GRANULOCITOS MODIFICADO POR GLICOPOLIETILENGLICOL ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El factor de estimulación de colonias . de granulocitos (G-CSF, por sus siglas en inglés) es una glicoproteína la cual estimula la supervivencia, proliferación, diferenciación y función de células progenitoras de granulocitos neutrófilos y neutrófilos maduros. Las dos formas de G-CSF humano, recombinante en el uso clínico son estimuladores potentes de la granul'opoyesis de neutrófilos y han demostrado eficacia en la prevención de complicaciones infecciosas de algunos estados neutropénicos . Se pueden utilizar para acelerar la recuperación de neutrófilos de tratamientos mielosupresivos. El G-CSF disminuye la morbilidad de . .la quimioterapia contra el cáncer al reducir la incidencia de- la neutropenia febril, la morbilidad de la quimioterapia a altas dosis soportada por el transplante de médula ósea y la incidencia y duración de la infección en pacientes con neutropenia crónica, severa. Además, se ha mostrado recientemente qué el G-CSF tiene un efecto terapéutico cuando se administra después del comienzo del infarto de miocardio. ' La forma humana del G-CSF fue clonada por grupos de Japón y los Estados Unidos de Norteamérica en 1986 (véase, REF: 172897 por ejemplo, Nagata y colaboradores Nature 319: 415-418, 1986) . La glicoproteína humana, natural existe en dos formas, una de 175 aminoácidos y la otra de 178 aminoácidos. La forma de 175 aminoácidos más abundante y más activa ha sido utilizada en el desarrollo de productos farmacéuticos por medio de la tecnología de 7AD? recombinante. El G-CSF humano, recombinante que es sintetizado en un sistema de expresión de E. coli es llamado filgrastim. La estructura de filgrastim difiere ligeramente de la glicoproteína natural. La otra forma del G-CSF humano, recombinante es llamada lenograstim y es sintetizada en células de ovario hámster chino (CHO) . El hG-CSF es una proteína monomérica que dimeriza el receptor de G-CSF por la formación de un complejo 2:2 de 2 moléculas de G-CSF y 2 receptores (Horan y colaboradores Biochemistry, 35(15): 4886-96 (1996)). Los siguientes residuos de hG-CSF han sido identificados por medio de estudios cristalográficos de rayos X como que son parte de las interfaces de unión de receptores: G4, P5, A6, S7, S8, L9, PÍO, Qll, S12, L15, K16, E19, Q20, L108, D109, D112, T115, T116, Q119, E122, E123 y L124 (véase por •ejemplo, Aritomi y colaboradores, (1999) Nature 401: 713) . Las formas comercialmente disponibles de rhG-CSF tienen un efecto farmacológico a corto plazo y deben administrarse frecuentemente más de una vez al día por la duración del estado leucopénico. Una molécula con un periodo de vida promedio en circulación más largo disminuiría el número de administraciones necesarias para aliviar la leucopenia y para impedir infecciones consecuentes. Otro problema con los productos de rG-CSF actualmente disponibles es la ocurrencia de dolor de huesos dependiente de la dosis . Puesto que el dolor de huesos es experimentado por pacientes como un efecto colateral significante del tratamiento con rG-CSF, sería deseable proporcionar un producto de rG-CSF que no cause dolor de huesos, ya sea por medio de un producto que no tenga inherentemente este efecto o que sea efectivo en una dosis suficientemente pequeña que no cause el dolor de huesos. De esta manera, existe claramente una necesidad por moléculas de G-CSF recombinantes, mejoradas. Se han reportado variantes diseñadas en proteínas del hG-CSF (patentes norteamericanas Nos. 5,581,476, U.S. 5,214,132, U.S. 5,362,853, U.S. 4,904,584 y Riedhaar-Ol-son y colaboradores Biochemistry 35:9034-9041, 1996). La modificación de hG-CSF y otros polipéptidos para introducir al menos una cadena de carbohidratos adicional en comparación con el polipéptido nativo también ha sido reportada (patente norteamericana No. 5,218,092). Además, las modificaciones de polímeros del hG-CSF nativo, inclusive la unión de grupos de PEG, han sido reportadas y estudiadas (véase por ejemplo, Satake-Ishikawa y colaboradores (1992) Cell Structure and Function 17: 157; Bowen y colaboradores. (1999) Experimental Hematology 27: 425; patente norteamericana No . 5,824,778, U.S. 5,824,784, WO 96/11953, WO 95/21629 y WO 94/20069). La unión de polímeros sintéticos a la estructura principal de péptidos en un intento por mejorar las propiedades farmacocinéticas de los productos terapéuticos de glicoproteínas es conocida en el campo. Un polímero ejemplar que ha sido conjugado a péptidos es el poli (etilenglicol) ("PEG") . Se ha demostrado que el uso de PEG para derivatizar productos terapéuticos de péptidos reduce la inmunogenicidad de los péptidos. Por ejemplo, la patente norteamericana No . 4,179,337 (Davis y colaboradores) describe polipéptidos no inmunógenos tales como enzimas y hormonas peptídicas acopladas a polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicol. Además' de la inmunogenicidad reducida, el tiempo de aclaramiento en la circulación es prolongado debido al tamaño incrementado del conjugado con PEG de los polipéptidos en cuestión. El modo principal de unión del PEG, y ' sus derivados, a péptidos es un enlace no específico a través de un residuo de aminoácido de péptido (véase por ejemplo, la patente norteamericana No . 4,088,538, patente norteamericana ?o . 4 ,49-6,€89, atente norteamericana ?o. 4, 414, 147,- patente norteamericana ?o. 4,055,635 y el documento PCT WO 87/00056). -Otro modo de unión del PEG a péptidos es a través de la oxidación no específica de residuos de glicosilo en un glicopéptido (véase por ejemplo, el documento WO 94/05332) . En estos métodos no específicos, el poli (etilenglicol) se adiciona de una manera aleatoria, -no específica a residuos reactivos en una estructura principal del péptido. Por supuesto, la adición aleatoria de moléculas de PEG tiene sus desventajas, inclusive una falta de homogeneidad del producto final y la posibilidad de reducción en la actividad biológica o enzimática del péptido. Por lo tanto, para la producción de péptidos terapéuticos, es superior una estrategia de derivatización que de por resultado la formación de un producto esencialmente homogéneo, fácilmente caracterizable, específicamente etiquetado. Estos métodos han sido desarrollados. Los productos terapéuticos de péptidos homogéneos, etiquetados específicamente pueden producirse in vitro a través de la acción de enzimas. A diferencia de los métodos no específicos, típicos para la unión de un polímero sintético u otra etiqueta a un péptido, las síntesis basadas en enzimas tienen las ventajas de regioselectividad y estereoselectividad. Dos clases principales de enzimas para el uso én ' la síntesis de péptidos etiquetados son las glicosiltransferasas (por ejemplo, . sialiltransferasas, oligosacariltransferasas, N-acetilglucosaminiltransferasas)' y glicosidasas. Estas enzimas se pueden utilizar para la unión específica de azucares los cuales pueden ser modificados subsecuentemente para comprender una porción terapéutica. Alternativamente, las glicosiltransferasas y .glicosidasas modificadas se pueden utilizar para transferir directamente los azucares modificados a una estructura principal del péptido (véase por ejemplo, la patente norteamericana No. 6,399,336 y las publicaciones de solicitud de patente norteamericana 20030040037, 20040132640, 20040137557, 20040126838 y 20040142856, cada una de las cuales es incorporada a manera de referencia en este documento) . Los métodos que combinan ambos elementos sintéticos tanto químicos como enzimáticos también son conocidos (véase, por ejemplo, Yamamoto y colaboradores Carbohydr. Res . 305: 415-422 (1998) y la publicación de solicitud de patente norteamericana No. 20040137557, la cual es incorporada en este documento a manera de referencia.) . En respuesta a la necesidad de un G-CSF terapéutico mejorado, la presente invención proporciona un G-CSF modificado por glico-PEG que es terapéuticamente activo y el cual tiene parámetros y propiedades farmacocinéticos que son mejorados con relación a un péptido de G-CSF idéntico, o estrechamente análogo, que no es modificado por glico-PEG. Además, la invención proporciona un método para producir de manera efectiva en cuanto al costo y a una escala industrial los péptidos de G-CSF mejorados de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Ahora se ha descubierto que la modificación controlada del factor de estimulación de . colonias de granulocitos (G-CSF) con una o más porciones .de poli (etilenglicol) proporciona un derivado novedoso de G-CSF con propiedades farmacocinéticas que son mejoradas son relación al G-CSF nativo (no modificado por . PEG) correspondiente (FIGURA 3) . Además, la actividad farmacológica del G-CSF modificado por glico-PEG es aproximadamente la misma que el filgrastim modificado por mono-PEG comercialmente disponible (FIGURA 4) . En una modalidad ejemplar, las moléculas del G-CSF "modificado por PEG" de la invención son producidas por medio de la formación mediada por enzimas de un conjugado entre un péptido de G-CSF glicosilado o no glicosilado y una porción de sacarilo enzimáticamente transferible que incluye una porción de poli (etilenglicol) dentro de su estructura. La' porción de PEG esta unida directamente a la porción de sacarilo (es decir, a través de un grupo individual que está formado por la reacción de dos grupos reactivos) o a través de una porción conectora, por ejemplo, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido • o no sustituido, etcétera. Una estructura de PEG-sacarilo- transferible, ejemplar se expone en la FIGURA 5. De esta manera, en un aspecto, la presente invención proporciona un conjugado entre una porción de PEG, por ejemplo, PEG y un péptido que tiene una actividad in vitro similar o de otra manera análoga al G-CSF reconocido en el campo. En el conjugado de la invención, la porción de PEG es unida covalentemente al péptido por vía de un grupo de unión de glicosilo intacto. Los grupos de unión de glicosilo intactos, ejemplares incluyen porciones de ácido siálico que son derivatizadas con PEG. En un aspecto ejemplar,- - la presente invención-proporciona un péptido de G-CSF que incluye, la porción: En la fórmula anterior, D es -OH y F^-L-NH-. El símbolo G representa R1-L- o -C (O) -alquilo de 1 a 6 átomos de carbono. R1 es una porción que comprende un residuo de poli (etilenglicol) de cadena recta o ramificada; - y L es un conector el cual es un miembro seleccionado de un enlace, un grupo, alquilo sustituido o no sustituido y un- grupo h teroalquilo sustituido o no sustituido. Generalmente, -cuando D es OH, G es R1-L- y cuando G es -C (O) -alquilo de 1 a 6 átomos -de car-bono, D -es R L- H-. En las estructuras modificadas de ácido siálico que son expuestas en este documento, COOH también representa C00~ y/o una sal del mismo. En otro aspecto, la invención proporciona un método para elaborar un G-CSF modificado por PEG que comprende la porción anterior. El método de la invención incluye (a) poner en contacto un péptido de G-CSF de substrato con un donador de PEG-ácido siálico y una enzima que transfiera el PEG-ácido siálico sobre un residuo de aminoácido o glicosilo del G-CSF, bajo condiciones apropiadas para la transferencia. Una porción donadora de PEG-ácido siálico ejemplar tiene la fórmula: En una modalidad, el hospedante es una célula de -mamífero. En otras modalidades,- la célula hospedante es una célula de insecto, una célula vegetal, una bacteria o un hongo . Las propiedades farmacocinéticas de los compuestos de la invención son variadas fácilmente al alterar la estructura, número o posición del (los) sitio (s) de glicosilación del péptido. De esta manera, dentro de la esfera de acción de la presente solicitud está el adicionar una o más mutaciones que inserten un sitio de glicosilación unido en O o N en el péptido de G-CSF -que no esté presente en el tipo natural. Los anticuerpos para estos mut ntes y sus productos intermedios y productos finales glicosilados también están dentro del alcance de la presente invención. En otro aspecto, la invención proporciona un conjugado de G-CSF que tiene una población de porciones de PEG, por ejemplo, PEG enlazado covalentemente al mismo a través de un grupo de unión de glicosilo intacto. En el conjugado de la invención, esencialmente cada miembro de la población es enlazado por vía del grupo de unión de glicosilo a un residuo de glicosilo del péptido y cada residuo de glicosilo tiene la misma estructura. En una modalidad ejemplar, la presente invención proporciona un conjugado de G-CSF que tiene una población de porciones de PEG, por ejemplo, PEG enlazado covalentemente al mismo a través de un grupo de unión de glicosilo .intacto. En el conjugado de la invención, esencialmente cada miembro de la población es enlazado a un residuo de aminoácido del péptido y cada uno de los residuos de aminoácidos a los cuales se -enlaza el polímero tiene la misma estructura. Por ejemplo, si un péptido incluye un residuo de glicosilo unido a Thr, al menos aproximadamente 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99%, 99.2%, 99.4%, 99.6%, o más en lugar de 99.8%, de los péptidos en la población tendrán el mismo residuo de glicosilo enlazado covalentemente al mismo residuo de Thr. La descripción anterior es igualmente relevante para los sitios tanto de O-glicosilación como de N-glicosilación. También se proporciona una composición farmacéutica. La composición incluye un portador farmacéuticamente aceptable y un conjugado covalente entre una porción de PEG de origen no natural y un péptido de G-CSF glicosilado o no glicosilado. Otros objetivos y ventajas de la invención serán aparentes para aquellas personas expertas en el campo a partir de la descripción detallada que sigue.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La FIGURA 1 es una estructura del G-CSF, que muestra la presencia y localización de una glicosilación potencial en Thr 133 (Thr 134 si está presente una metionina) . La FIGURA 2 és un esquema que muestra una modalidad ejemplar de la invención en la cual un residuo de carbohidrato en un péptido de G-CSF es remodelado al adicionar -enzimáticamente una porción de GalNAc al residuo de glicosilo en Thr 133 (Thr 134 si está presente una metipnina) antes de la adición de una porción de sacarilo derivatizada con PEG. La FIGURA 3 es un diagrama que compara los periodos de vida de residencia in vivo del G-CSF no glicosilado, Neulasta" y el G-CSF modificado enzimáticamente por glico-PEG (cuyo título es "Inyección de Bolos IV de Proteínas Etiquetadas con [125I] en Ratas") . La FIGURA 4 es un diagrama que compara las actividades de las especies mostradas en la FIGURA 3 (cuyo título es "Respuesta de WBC de Ratón a Variantes de. G-GSF (250 µg/Kg) Administradas i.v. en 0 horas"). La FIGURA 5 es un esquema de síntesis para producir un precursor del grupo de unión de PEG-glicosilo ejemplar (azúcar modificado) para el uso en la preparación de los conjugados de la invención. La FIGURA 6 muestra las secuencias de aminoácidos ejemplares de G-CSF. La SEC ID N0:1 es la variante de 175 aminoácidos, en . donde el primer aminoácido es metionina y existe un residuo de treonina en Thr 134. La SEC ID NO:2 es una variante de 174 aminoácidos la cual tiene la misma secuencia que la variante de 175 aminoácidos excepto por la ausencia de la primera metionina, de esta manera la. secuencia comienza con T y hay un residuo de treonina en la posición La FIGURA 7 ilustra algunos nucleótidos de azúcar modificados, ejemplares que son útiles en la práctica de la invención (cuyo título es "Prueba de Condiciones de crecimiento - IBs de lavado" y cuya nota al final es "Los IB's purificados se muestran en las bandas 3, 6, 9, 12 y 15. Se debe observar que las bandas de IB fueron cargadas a aproximadamente XA de la cantidad de la banda precedente (en base al peso predicho de las pelotillas)"). La FIGURA 8 ilustra además nucleótidos de azúcar modificado ejemplares que son útiles en la práctica de la invención (cuyo título es "Análisis de Inmunotransfere?cia Western de G-CSF Replegado, Electroforesis de Gel de Poliacrilamida Nativa" y cuya nota al final es "Después de SP-sepharose"11, solo se observa una banda por' el tinte de Coomassie o Western") . La FIGURA 9 demuestra la producción del G-CSF recombinante en bacterias desarrolladas en varios medios e inducidas con IPTG. La FIGURA 10 proporciona el análisis de inmunotransferencia Western del G-CSF replegado después de la cromatografía de SP-Sepharose" . Las FIGURAS 11A-11N son una tabla de sialil-transferasas que se utilizan para transferir a un receptor las especies de ácido siálico modificadas que se exponen en este documento y el ácido siálico no modificado.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Abreviaciones PEG, poli (etilenglicol) ; PPG, poli (propilenglicol) ; Ara, arabinosilo; Fru, fructosilo; Fue, fucosilo; Gal, galactosilo; GalNAc, N-acetilgalactosaminilo; Glc, glucosilo; GlcNAc, N-acetilglucosaminilo; Man, manosilo; ManAc, acetato de manosaminilo; Xyl, xilosilo; y NeuAc, (N-acetilneuraminilo) de sialilo; M6P, manosa-6-fosfato; Sia, ácido siálico, N-acetilneuraminilo, y derivados y análogos del mismos.

Definiciones A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen generalmente el mismo significado como aquellos entendidos comúnmente por una persona de experiencia ordinaria en el campo al cual pertenece esta invención. Generalmente, la nomenclatura utilizada en este documento y los procedimientos . de laboratorio en cultivos celulares, genética molecular, química orgánica y química e hibridización de ácido nucleico son aquellos bien conocidos y empleados comúnmente en el campo. Las técnicas estándar se utilizan para la síntesis de ácido nucleico y péptidos. Las técnicas y procedimientos se realizan generalmente de acuerdo con métodos convencionales en el campo y varias referencias generales (véase generalmente, Sambrook y colaboradores, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2- edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., la cual se incorpora en este documento a manera de referencia) , las cuales se proporcionan por todo este documento. La nomenclatura utilizada en este documento y los procedimientos de laboratorio en la química analítica y la síntesis orgánica descritos posteriormente son aquellos bien conocidos y empleados comúnmente en el campo. Las técnicas estándar, o modificaciones de las mismas, se utilizan para la síntesis química y análisis químicos. Todos los oligosacáridos descritos en este documento son descritos con el nombre o abreviación para el sacárido no reductor (es decir, Gal) , seguido por la configuración del enlace glicosídico (a o ß) , el enlace de anillo (1 o 2) , la posición en el anillo del sacárido reductor incluida en el enlace (2, 3, 4, 6 u 8) y luego el nombre o la abreviación del sacárido reductor (es decir, GlcNAc) . Cada sacárido es en lugar de una piranosa. Para una revisión de la nomenclatura de glicobiología estándar véase, Essential s of Glycobiology Varki y YolaJooradores eds. CSHL Press (1999) . Se considera que los oligosacáridos tienen un extremo reductor y un extremo no reductor, ya sea que el sacári-do en el extremo reductor sea de hecho un azúcar reductor o no. De acuerdo con la nomenclatura aceptada, los oligosacáridos son representados en este documento con el extremo no reductor a la izquierda y el extremo reductor a la derecha. El término "ácido siálico" se refiere a cualquier miembro de una familia de azucares carboxilados de nueve átomos de carbono. El miembro más común de la familia del ácido siálico es el ácido N-acetil-neuramínico (ácido 2-ceto-5-acetamido-3 , 5-didesoxi-D-glicero-D-galactononulopiranos-l-ónico (abreviado frecuentemente como Neu5Ac, NeuAc o NANA) . Un segundo miembro de la familia es el ácido N-glicolil-neuramínico (Neu5Gc o NeuGc) , en el cual el grupo N-acetilo de NeuAc es hidroxilado. Un tercer miembro de la familia del ácido siálico es el ácido 2-ceto-3-desoxi-nonulosónico (KDN) (Nadano y colaboradores, (1986) J. Biol . Chem. 261: 11550-11557; Kanamori y colaboradores, J. Biol . Chem. 265: 21811-21819 (1990)). También están incluidos los ácidos siálicos 9-sustituidos, tales como 9-0-acilo (C?-C6) -Neu5Ac co o 9-0-lactil-Neu5Ac o 9-0-acetil-Neu5Ac, 9-desoxi-9-fluoro-Neu5Ac y 9-azido-9-desoxi-Neu5Ac. Para una revisión de la familia del ácido siálico, véase, por ejemplo, Varki, Glycobiology 2: 25-40 (1992) ; Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and Function, R. Schauer, Ed. (Springer-Verlag, Nueva York (1992)). La síntesis y el uso de los compuestos de ácido siálico en un procedimiento de sialilación se describen en la solicitud internacional WO 92/16640, publicada el 1 de Octubre de 1992. El término "Factor de Estimulación de Colonias de Granulocitos" o "Péptido de Factor de Estimulación de Colonias de Granulocitos" o "G-CSF" o "péptido de G-CSF" se refiere a cualquier péptido de tipo natural o mutado, recombinante o nativo o cualquier fragmento de G-CSF que tenga una actividad que sea o que imite a aquella del G-CSF nativo. El término también incluye generalmente los imitadores del G-CSF no peptídicos. En una modalidad ejemplar, un péptido de G-CSF tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N0:1. En otras modalidades ejemplares, un péptido de G-CSF tiene una secuencia seleccionada de las SEC ID NOs: 3-11. El término "actividad del Factor de Estimulación de Colonias de Granulocitos" se refiere a cualquier actividad que incluye, pero no está limitada a, el enlace y la activación de receptores, la inhibición del enlace de receptores o cualquier reacción bioquímica o fisiológica que sea afectada normalmente por la acción del Factor de Estimulación de Colonias de Granulocitos de tipo natural. La actividad del Factor de Estimulación de Colonias de Granulocitos puede surgir de la acción de cualquier péptido de Factor de Estimulación de Colonias de Granulocitos, como se describiera anteriormente. "Péptido" se refiere a un polímero en el cual los monómeros son aminoácidos y se unen conjuntamente a través de enlaces de amida, alternativamente referido como un polipéptido. Adicionalmente, los aminoácidos no naturales, por ejemplo ß-alanina, fenilglicina y homoarginina, también están incluidos. Los aminoácidos que no son codificados por genes también se pueden utilizar en la presente invención. Además, los aminoácidos que han sido modificados para incluir grupos reactivos, sitios de glicosilación, polímeros, porciones terapéuticas, biomoléculas y similares también se pueden utilizar en la invención. Todos los aminoácidos utilizados en la presente invención pueden ser el isómero ya sea D o L. El isómero L se prefiere generalmente. Además, otros peptidoimitadores también son útiles en la presente invención. Como se utiliza en este documento, "péptido" se refiere a péptidos tanto glicosilados como no glicosilados . También están incluidos péptidos que son glicosilados incompletamente por un sistema que expresa el péptido.- Para una revisión general, véase Spatola, A. F., en CHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY OF AMINO ACIDS, PEPTIDES AND PROTEINS, B. Weinstein, . eds., Marcel Dekker, Nueva York, página 267 (1983). El término "conjugado peptídico". se refiere a especies de la invención en las cuales un péptido es conjugado con un azúcar modificado como, se expone en este documento. El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos de origen natural y aminoácidos sintéticos, así como también a análogos de aminoácidos e imitadores de aminoácidos que funcionan de manera similar a los aminoácidos de origen natural . -Los aminoácidos de origen natural son aquellos codificados por el código genético, así como también aquellos aminoácidos que son modificados posteriormente, por ejemplo, hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato y O-fosfoserina. Los análogos de aminoácidos se refieren a compuestos que tienen la misma estructura química básica como un aminoácido de origen natural, es decir un átomo de carbono a que está unido a un átomo de hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metil-sulfonio de metionina. Estos análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o estructuras principales de péptidos modificadas, pero retienen la misma estructura química, básica como un aminoácido de origen natural . Los imitadores de aminoácidos se refieren a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química, general de un aminoácido, pero que funcionan de manera similar a un aminoácido de origen natural. Como se utiliza en es-te documento, "aminoácido" ya sea que esté en un conector o un componente de una secuencia de péptidos se refiere al isómero tanto D como L del aminoácido, así como también mezclas de estos dos isómeros.

Como se utiliza en este documento, el término "azúcar modificado" se refiere a un carbohidrato de origen natural o de origen no natural, que -se adiciona enzimáticamente en un residuo de aminoácido o un residuo de glicosilo de un péptido en un proceso de la invención. El azúcar modificado se selecciona de una variedad de substratos de enzimas que incluyen, pero no están limitados a, nucleótidos de azúcar (mono-, di- y tri-fosfatos) , azucares activados (por ejemplo, haluros de glicosilo, esilatos de 0 glicosilo) y azucares que ni son activados ni son nucleótidos. El "azúcar modificado" es funcionalizado covalentemente con un "grupo modificador" . Los grupos modificadores útiles incluyen, pero no están limitados a, - - porciones de PEG, porciones terapéuticas, porciones de 5 diagnóstico, biomoléculas y similares. En lugar de, el grupo modificador no es de origen natural o es un carbohidrato no modificado. El sitio de funcionalización con el grupo modificador se selecciona de tal manera que no impida que el "azúcar modificado" sea adicionado • enzimáticamente a un 0 péptido. El término "soluble en agua" se refiere a porciones que tienen algún grado detectable de solubilidad en agua. Los • métodos para detectar y/o cuantificar la solubilidad en agua son bien conocidos en el campo. Las porciones de PEG 5 ejemplares incluyen péptidos, sacáridos, poli (éteres) , poli (aminas) , ácidos poli (carboxílicos) y similares. Los péptidos pueden tener secuencias mezcladas o pueden estar compuestos de un solo aminoácido, por ejemplo, poli (lisina) . De manera similar, los sacáridos pueden ser de secuencias mezcladas o pueden estar compuestos de una subunidad de sacárido individual, por ejemplo, dextrano, amilosa, quitosan y ácido poli (siálico) . Un poli (éter) ejemplar es poli (etilenglicol) . La poli (etilenimina) es una poliamina ejemplar y el ácido poli (acrílico) es un ácido poli (carboxílico) representativo. El término "grupo de unión de glicosilo", como se utiliza en este documento, se refiere a un residuo de glicosilo al cual se une covalentemente un agente (por ejemplo, porción de PEG, porción terapéutica, biomolécula) . En los métodos de la invención, el "grupo de unión de glicosilo" llega a unirse covalentemente a un péptido glicosilado o no glicosilado, uniendo con lo cual el agente a un aminoácido y/o residuo de glicosilo en el péptido. Un "grupo de unión de glicosilo" se deriva generalmente de un "azúcar modificado" por la unión enzimática del "azúcar modificado" a un aminoácido y/o residuo de glicosilo del péptido. Un "grupo de unión de glicosilo intacto" se refiere a un grupo de unión que se deriva de una porción de glicosilo en la cual el monómero de sacárido individual que une el conjugado no es degradado, por ejemplo, oxidado, por ejemplo, por el metaperyodato de sodio. Los "grupos de unión de glicosilo intactos" de la invención se pueden derivar de un oligosacárido de origen natural mediante la adición de unidad (es) de glicosilo o la remoción de una o más unidades de glicosilo de una estructura de sacárido precursora. El término "porción de fijación de objetivos", como se utiliza en este documento, se refiere a especies que se ubicarán selectivamente en un tejido o región particular del cuerpo. La ubicación es mediada por el reconocimiento específico de determinantes moleculares, tamaño molecular del agente o conjugado de fijación de objetivos, interacciones iónicas, interacciones hidrófobas y similares. Otros mecanismos para que un agente fije como objetivo un tejido o región particular son conocidos para aquellas personas expertas en el campo. Las porciones de fijación de objetivos ejemplares incluyen anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, transferrina, HS-glicoproteína, factores de coagulación, proteínas séricas, ß-glicoproteína, G-CSF, -GM-CSF, M-CSF, EPO y similares. Como se utiliza en este documento, un "portador farmacéuticamente aceptable" incluye cualquier material, el cual cuando se combina con el conjugado retiene la actividad del conjugado y no es reactivo con los sistemas inmunes del sujeto. Los ejemplos incluyen, pero no están limitados a, cualquiera de los portadores farmacéuticos estándar, tales como solución salina amortiguada con fosfato, agua, emulsiones tales como emulsión de aceite/agua y diversos tipos de agentes humectantes . Otros portadores también pueden incluir soluciones estériles, tabletas que incluyen tabletas revestidas y cápsulas. Típicamente, estos portadores contienen excipientes tales como almidón, leche, azúcar, ciertos tipos de arcilla, gelatina, ácido esteárico o sales de los mismos, estearato de magnesio o calcio, talco, grasas o aceites vegetales, gomas, glicoles u otros excipientes conocidos. Estos portadores también pueden incluir aditivos saborizantes y colorantes u otros ingredientes. Las composiciones que comprenden estos portadores se formulan por medio de métodos convencionales bien conocidos . Como se utiliza en este documento, "administración" significa la administración oral, administración como un supositorio, administración por contacto, tópico,, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intralesional, intranasal o subcutánea o el implante de un dispositivo de liberación lenta, por ejemplo, una bomba mini-osmótica, al sujeto. La administración es por medio de cualquier ruta que incluye la ruta parenteral y transmucosa (por ejemplo, . oral, nasal, vaginal, rectal o transdérmica) . La administración parenteral incluye, por ejemplo, la administración intravenosa, intramuscular, intra-arteriola, intradérmica, subcutánea, intraperitoneal, intraventricular e intracraneal. Además,. donde una inyección es para tratar un tumor, por ejemplo, para inducir la apoptosis, la administración puede ser directamente al tumor y/o dentro de los tej idos que circundan el tumor. Otros modos de suministro incluyen, pero no están- limitados a, el uso de formulaciones liposomales, infusión intravenosa, parches transdérmicos, etcétera. El término "mejoramiento" o "mejorar" se refiere a cualquier indicio de éxito en el tratamiento de una patología o condición, inclusive cualquier parámetro objetivo o subjetivo tal como abatimiento, remisión o disminución de síntomas o un mejoramiento en el bienestar físico o mental' del paciente. El mejoramiento de los síntomas se puede basar en parámetros objetivos o subjetivos; inclusive los - resultados de un examen físico y/o una evaluación psiquiátrica. El término "terapia" se refiere a "tratar" o "tratamiento" de una enfermedad o condición que incluye impedir que ocurra la enfermedad o condición en un animal que puede estar predispuesto a la enfermedad, pero que aún no. experimenta o exhibe síntomas de la enfermedad (tratamiento. profilático) , inhibir la enfermedad (disminuir la velocidad o -' detener su desarrollo) , proporcionar alivio de los síntomas o - efectos colaterales de la enfermedad (inclusive tratamiento paliativo) y aliviar la enfermedad (causando la regresión de la enfermedad) . . ..

El término "cantidad -efectiva" o "una cantidad efectiva para" o una "cantidad terapéuticamente efectiva" o cualquier término gramáticamente equivalente significa la cantidad que, cuando se administra a un animal para tratar una enfermedad, es suficiente para efectuar el tratamiento de esa enfermedad. El término "aislado" se refiere a un material que está sustancial o esencialmente libre de componentes, los cuales se utilizan para producir el material. Para los conjugados peptídicos de la invención, el término "aislado" se refiere a un material que está sustancial o esencialmente libre de componentes, los cuales acompañan normalmente al material en la mezcla utilizada para preparar el conjugado peptídico. "Aislado" y "puro" se utilizan indistintamente. Típicamente, los conjugados peptídicos, aislados de la invención tienen un nivel de pureza expresado en lugar de como un rango. El extremo inferior del rango de pureza para los conjugados peptídicos es de aproximadamente -60%, aproximadamente 70% o aproximadamente 80% y el extremo superior del rango de pureza es de aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o más de aproximadamente 90%. Cuando los conjugados peptídicos son más de aproximadamente 90% puros, sus purezas también se expresan en lugar de como un rango. El extremo inferior del rango de pureza es de aproximadamente 90%, aproximadamente 92%, aproximadamente 94%, aproximadamente 96% o aproximadamente 98%. El extremo superior del rango de pureza es de aproximadamente 92%, aproximadamente 94%, aproximadamente 96%, aproximadamente 98% o aproximadamente 100% de pureza. La pureza es . determinada por cualquier método de análisis reconocido en el campo (por ejemplo, intensidad de la banda en un gel teñido con plata, electroforesis de gel de poliacrilamida, CLAR o medios similares) . "Esencialmente cada miembro de la población", como se utiliza en este documento, describe una característica de una población de conjugados peptídicos de la invención en los cuales un porcentaje seleccionado de azucares modificados adicionados a un péptido se agregan a múltiples sitios receptores, idénticos en el péptido. "Esencialmente cada miembro de la población" se refiere a la "homogeneidad" de los sitios en el péptido conjugado con un azúcar modificado y se refiere a conjugados de la invención, los cuales son al menos aproximadamente 80%, en lugar de al menos aproximadamente 90% y más en lugar de al menos aproximadamente 95% homogéneos. La "homogeneidad" se refiere a la consistencia estructural a través de una población de porciones receptoras con las cuales son conjugados los azucares modificados. De esta manera, en un conjugado peptídico de la invención en el cual cada porción de azúcar modificado es conjugada con un sitio receptor que tiene la misma estructura como el sitio receptor al cual es conjugado cada azúcar modificado diferente, e dice que el conjugado peptídico es aproximadamente 100% homogéneo. La homogeneidad se expresa típicamente como un rango . El extremo inferior del rango de homogeneidad para los conjugados peptídicos es de aproximadamente 60%, aproximadamente 70% o aproximadamente 80% y el extremo superior del rango de pureza es de aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o más de aproximadamente 90%. Cuando los conjugados peptídicos son más de o son iguales a aproximadamente 90% homogéneos, su homogeneidad también se expresa en lugar de como un rango. El extremo inferior del rango de la homogeneidad es de aproximadamente 90%, aproximadamente 92%, aproximadamente 94%, aproximadamente 96% o aproximadamente 98%.. El extremo superior del rango de pureza es de aproximadamente 92%, aproximadamente 94%, aproximadamente '96%, aproximadamente 98% o aproximadamente 100% de homogeneidad. La pureza de los conjugados peptídicos es determinada típicamente por medio de uno o más métodos conocidos para aquellas personas expertas en el campo, por ejemplo, la cromatografía liquida-espectrometría de masas (CL-EM) , espectrometría de masas de desorpción láser asistida por una matriz con tiempo de vuelo (MALDITOF, por sus siglas en inglés) , electroforesis capilar y similares. "Glicoforma sustancialmente uniforme" o un "patrón de glicosilación sustancialmen e uniforme" , cuando se refieren a especies de glicopéptidos, se refieren al porcentaje de porciones receptoras que son glicosiladas por la glicosiltransferasa de interés (por ejemplo, fucosiltransferasa) . Por ejemplo, en el caso.de una al,2-fucosiltransferasa existe un patrón de fucosilación sustancialmente uniforme si sustancialmente la totalidad (como se define posteriormente) del Galßl,4-GlcNAc-R y análogos sialilados del mismo son fucosilados en un conjugado peptídico de la invención. Será entendido por una persona experta en el campo que el material de partida puede contener porciones receptoras, glicosiladas (por ejemplo, porciones de Galßl,4-GlcNAc-R fucosiladas) . De esta manera, el porcentaje de glicosilación calculado incluirá porciones receptoras que son glicosiladas por los métodos de la invención, así como también aquellas porciones receptoras ya glicosiladas en el material de partida. El término "sustancialmente" en las definiciones anteriores de "sustancialmente uniforme" significa generalmente que al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, o más ..en lugar de al menos aproximadamente 90%, y aún más en lugar de al menos aproximadamente 95% de las porciones receptoras para una glicosiltransferasa particular son glicosiladas. Donde los grupos sustituyentes son especificados por sus fórmulas químicas convencionales, escritas de izquierda a derecha, éstos incluyen igualmente los sustituyentes químicamente idénticos, los cuales resultarían de escribir la estructura de derecha a izquierda, por ejemplo, se propone que -CH20- también cite -OCH2- . El término "alquilo" por sí mismo o como parte de otro sustituyente significa, a menos que se- establezca de otra manera, un radical de hidrocarburo de cadena recta o ramificada o cíclico, o una combinación de los mismos, el cual puede estar completamente saturado, mono- o poliinsaturado y puede incluir radicales . divalentes y multivalentes, que tienen el número de átomos de carbono designado (es decir, C?-C?0 significa de uno a diez átomos de carbono) . Los ejemplos de radicales de hidrocarburo saturados incluyen, pero no están limitados a, grupos tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, isobutilo, sec-butilo, ciciohexilo, (ciclohexil) metilo, ciclopropilmetilo, homólogos e isómeros de, por ejemplo, n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo y similares. Un grupo alquilo insaturado es uno que tiene uno o más enlaces dobles o enlaces triples. Los ejemplos de -grupos alquilo insaturados incluyen, pero no están limitados a, vinilo, 2-propenilo, crotilo, 2-isopentenilo, 2- (butadienilo) , 2, 4-pentadienilo, 3- (1,4-pentadienilo) , etinilo, 1- y 3-propinilo, 3-butinilo y los homólogos e isómeros superiores. El término "alquilo", a menos que se observe de otra manera, también tiene la intención de incluir aquellos derivados de alquilo definidos en mayor detalle posteriormente, tales como "heteroalquilo". Los grupos alquilo que están limitados a los grupos de hidrocarburo son denominados "homoalquilo" . El término "alquileno" por sí mismo o como parte de otro sustituyente significa un radical divalente derivado de un alcano, como es ejemplificado, pero no limitado, por -CH2CH2CH2CH2- e incluye además aquellos grupos descritos posteriormente como "heteroalquileno" . Típicamente, un grupo alquilo (o alquileno) tendrá de 1 a 24 átomos de carbono, siendo preferidos en la presente invención aquellos grupos que tienen 10 o menos átomos de carbono. Un "alquilo inferior" o "alquileno inferior" es un- grupo alquilo o alquileno de cadena más corta, que tiene generalmente ocho o menos átomos de carbono. Los términos "alcoxi", "alquilamino" y "alquiltio" (o tioalcoxi) se utilizan en su sentido convencional y se refieren a aquellos grupos alquilo unidos al resto de la molécula por vía de un átomo de oxígeno, un grupo amino o un átomo de azufre, respectivamente. El término "heteroalquilo" por sí mismo o en combinación con otro término significa, a menos que se establezca de otra manera, un radical de hidrocarburo estable de cadena recta o ramificada o cíclico, o combinaciones de los mismos, que consiste de un número establecido de átomos de carbono y al menos un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste de 0, N, -Si y S, y en donde los átomos de nitrógeno y azufre pueden ser oxidados opcionalmente y el heteroátomo de nitrógeno puede ser cuaternizado opcionalmente. El (los) heteroátomo (s) 0, N y S y Si puede (n) reemplazarse en cualquier posición interior del grupo heteroalquilo o en la posición en la cual el grupo alquilo está unido al resto de la molécula. Los ejemplos incluyen, pero no están limitados a, -CH2-CH2-0-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3) -CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2, -S(0)-CH3, -CH2-CH2-S(0)2-CH3, -CH=CH-0-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3 y CH=CH-N(CH3) -CH3. Hasta dos heteroátomos pueden ser consecutivos, tales como, por ejemplo, -CH2-NH-OCH3 y -CH2-0-Si(CH3)3. De manera similar, el término "heteroalquileno" , por sí mismo o como parte de otro sustituyente, significa un radical divalente derivado de heteroalquilo, como se ejemplifica, pero no limitado por, -CH2-CH2-S-CH2-CH2- y -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2- . Para los grupos heteroalquileno, los heteroátomos también pueden ocupar cualquiera o ambas terminaciones de la cadena (por ejemplo, alquilenoxi, alquilendioxi, alquilenamino, alquil-endiamino y similares) .

Aún adicionalmente, para los grupos de unión de alquileno y heteroalquileno, ninguna orientación del grupo de unión está implicada por la dirección en la cual se escribe la fórmula del grupo de unión. Por ejemplo, la fórmula -G(0)2R'-. representa tanto -C(0)2R'- como -R'C(0)2-. Los términos "cicloalquilo" y "heterocicloalquilo" por sí mismos o en combinación con otros términos representan, a menos que se establezca de otra manera, versiones cíclicas de "alquilo" y "heteroalquilo", respectivamente. Adicionalmente, para heterocicloalquilo, un heteroátomo puede ocupar la posición en la cual el heterociclo está unido al resto de la molécula. Los ejemplos de cicloalquilo incluyen, pero no están limitados a, ciclopentilo, ciciohexilo, 1-ciclohexenilo, 3-ciclohexenilo, cicioheptilo y similares. Los ejemplos de heterocicloalquilo incluyen, pero no están limitados a, 1- (1,2,5,6-tetrahidropiridilo) , 1-piperidinilo, 2-piperidinilo, 3-piperidinilo, 4-morfolinilo, 3-morfolinilo, tetrahidrofuran-2-ilo, tetrahidrofuran-3-ilo, tetrahidrotien-2-ilo, tetrahidrotien-3-ilo, 1-piperazinilo, 2-piperazinilo y similares. Los términos "halo" o "halógeno" por sí mismos o como parte de otro sustituyente significan, a menos que se establezca de otra manera, un átomo de flúor, cloro, bromo o yodo. Adicionalmente, los términos tales como "ha oal-quil " , tienen la intención de incluir monohaloalquilo y polihaloalquilo. Por ejemplo, el término "halo-alquilo de 1 a 4 átomos de carbono" tiene la intención de incluir, pero no está limitado a, trifluorometilo, 2 , 2, 2-trifluoroetilo, 4-clorobutilo, 3-bromopropilo y similares. El término "arilo" significa, a menos que se establezca de otra manera, un sustituyente aromático, poliinsaturado que puede ser un solo anillo o múltiples anillos (en lugar de de 1 a 3 anillos) , los cuales son fusionados conjuntamente o unidos covalentemente. El término "heteroarilo" e refiere a grupos arilo (o anillos) que contienen de uno a cuatro heteroátomos seleccionados de N, O y S, en donde los átomos de nitrógeno y azufre son oxidados opcionalmente y el (los) átomo (s) de nitrógeno son cuaternizados opcionalmente. Un grupo heteroarilo se puede unir al resto de la molécula a través de un heteroátomo. Los ejemplos no limitantes de grupos arilo y heteroarilo incluyen fenilo, 1-naftilo, 2-naftilo, 4-bifenilo, 1-pirrolilo, 2-pirrolilo, 3-pirrolilo, 3-pirazolilo, 2-imidazolilo, 4-imidazolilo, pirazinilo, 2-oxazolilo, 4-oxazolilo, 2-fenil-4-oxazolilo, 5-oxazolilo, 3-isoxazolilo, 4-isoxazolilo, 5-isoxazolilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo, 5-tiazolilo, 2-furilo, 3-furilo, 2-tienilo, 3-tienilo, 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 2-pirimidilo, 4-pirimidilo, 5-benzotiazolilo, purinilo, 2-bencimidazolilo, 5-indolilo, 1-isoquinolilo, 5-isoquinolilo, 2-quinoxalinilo, 5-quinoxalinilo, 3-quinolilo, tetrazolilo, benzo [b] furanilo, benzo [b] tienilo, 2,3-dihidrobenzo [1,4] dioxin-6-ilo, benzo [1, 3] dioxol-5-ilo y 6-quinolilo. Los sustituyentes para cada uno de los sistemas de anillos de arilo y heteroarilo observados anteriormente se seleccionan del grupo de sustituyentes aceptables descritos posteriormente . Por brevedad, el término "arilo" cuando se utiliza en combinación con otros términos (por ejemplo, ariloxi, ariltioxi, arilalquilo) incluye anillos tanto de arilo como de heteroarilo como se definiera anteriormente. De esta manera, el término "arilalquilo" tiene la intención de incluir aquellos radicales en los cuales un grupo arilo está unido a un grupo alquilo (por ejemplo, bencilo, fenetilo, piridilmetilo y similares) inclusive aquellos grupos alquilo en los cuales un átomo de carbono (por ejemplo, un grupo metileno) ha sido reemplazado por, por ejemplo, un átomo de oxígeno (por ejemplo, fenoximetilo, 2-piridiloximetilo, 3-(l-naftiloxi) propilo y similares). Cada uno de los términos anteriores (por ejemplo, "alquilo" , "heteroalquilo" , "arilo" y "heteroarilo" ) tienen la intención de incluir formas tanto sustituidas como no sustituidas del radical indicado. Los sustituyentes preferidos para cada tipo de radical se proporcionan posteriormente.

Los sustituyentes para los radicales de alquilo y heteroalquilo (inclusive aquellos grupos - referidos frecuentemente como alquileno, alquenilo, heteroalquileno, heteroalquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquenilo y heterocicloalquenilo) son referidos genéricamente como "sustituyentes de grupos alquilo" , y pueden ser uno o más de una variedad de grupos seleccionados de, pero no limitados a: -OR' , =0, =NR' , =N-OR' , -NR' R" , -SR' , -halógeno, -SiR'R"R"', -0C(0)R', -C(0)R' , -C02R' , -CO?R'R", -0C(0)?R'R", -?R"C(0)R', -?R' -C (-0) NR"R" ' , ?R"-C(0)2R', -?R-C(?R'R"R"')=?R"'", -?R-C (?R'R" ) =?R" ' , -S.(0)R', -S(0)2R', -S(0)2?R'R", -?R'S02R' , -C? y -?02 en un número que varía de cero a (2m'+l), donde m' es el número total de átomos de carbono en este radical. En lugar de, cada R' , R" , R" ' y R"" se refiere independientemente a hidrógeno, heteroalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, por ejemplo, arilo sustituido por 1-3 átomos de halógeno, alquilo sustituido o no sustituido, grupos alcoxi o tioalcoxi, o grupos arilalquilo. Cuando un compuesto de la invención incluye más de un grupo R, or ejemplo, cada uno de los grupos R se selecciona independientemente como se seleccionan cada uno de los grupos R' , R" , R" ' y R"" cuando está presente más de uno de estos grupos. Cuando R' y R" están unidos al mismo átomo de -nitrógeno, se pueden combinar con el átomo de nitrógeno para formar un anillo de 5, 6 o 7 miembros. Por ejemplo, -NR'R" tiene la intención de incluir, pero no está limitado a, 1-pirrolidinilo y 4-morfolinilo. A partir de la descripción anterior de los sustituyentes, una persona experta en el campo entenderá que el término "alquilo" tiene la intención de incluir grupos que incluyen átomos de carbono enlazados a grupos diferentes de grupos de hidrógeno, tales como haloalquilo (por ejemplo, -CF3 y -CH2CF3) y acilo (por ejemplo, -C(0)CH3, -C(0)CF3, -C(0)CH2OCH3 y similares) . De manera similar a los sustituyentes descritos para el radical alquilo, los sustituyentes para los grupos arilo y heteroarilo son referidos genéricamente como "sustituyentes de grupos arilo" . Los sustituyentes se seleccionan de, por ejemplo: halógeno, -OR' , =0, =NR' , =N-OR' , -NR'R", -SR' , -halógeno, -SiR'R"R"', -0C(0)R' , -C(0)R', -C02R' , -CONR'R", -0C(0)NR'R", -NR"C(0)R', -NR' -C (0)NR"R" ' , -NR"C(0)2R', -NR-C(NR'R"R"')=NR"", -NR-C (NR'R" ) =NR" ' , S(0)R', -S(0)2R', -S(0)2NR'R", -NRS02R' , -CN y -N02, -R',-N3, -CH(Ph)2, fluoro-alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono y fluoro-alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, en un número que varía de cero al número total de valencias abiertas en el sistema de anillos aromáticos; y donde en lugar de R' , R" , R" ' y R"" se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido y heteroarilo sustituido . o no sustituido. Cuando un compuesto de la invención incluye más de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R se seleccionan independientemente como se seleccionan cada uno de los grupos R' , R" , R"'. y R"" .cuando está presente más de uno de estos grupos. En los esquemas de reacción que siguen, el símbolo X representa "R" como se describiera anteriormente . Dos de los sustituyentes en los átomos adyacentes del anillo de arilo o heteroarilo pueden reemplazarse opcionalmente por un sustituyente de la fórmula -T-C(O)- (CRR')g-U-, en donde T y U son independientemente -NR- , -0-, -CRR' - o un enlace individual y q es un número entero de 0 a 3. Alternativamente, dos de los sustituyentes en los átomos adyacentes del anillo de arilo o heteroarilo pueden reemplazarse opcionalmente por un sustituyente de la fórmula -A- (CH2)r-B- , en donde A y B son independientemente -CRR'-, O-, -NR-, -S-, -S(O)-, -S(0)2-, -S(0)2NR'- o un enlace individual, y r es un número entero de l a 4. Uno de los enlaces individuales del nuevo anillo formado de esta manera puede reemplazarse opcionalmente por un enlace doble. Alternativamente, dos de los sustituyentes en los átomos adyacentes del anillo de arilo o heteroarilo pueden reemplazarse opcionalmente por un sustituyente de la fórmula. -tCRR' ) s-X- (CR"R" ' ) -, donde s y d son independientemente números enteros -de 0 a 3, y X es -O-, -NR'-, -S-, -S(0)-, -S(0)2- o -S(0)2NR'-. En lugar de, los sustituyentes R, R' , R" y R" ' se seleccionan independientemente de hidrógeno o alguilo de 1 a 6 átomos de carbono sustituido o no sustituido . Como se utiliza en este documento, el término "heteroátomo" tiene la intención de incluir oxígeno (0) , nitrógeno (N) , azufre (S) y silicio (Si) .

Introducción La presente invención incluye un método para la modificación de la estructura de glicano en G-CSF. El G-CSF es bien conocido en el campo como una citocina producida por células T activadas, macrófagos, células endoteliales y fibroblastos estromales. El G-CSF actúa principalmente sobre la médula ósea para incrementar la producción de leucocitos inflamatorios y funciona además como una hormona endocrina para iniciar el reabastecimiento de neutrófilos consumidos durante las funciones inflamatorias. El G-CSF también tiene aplicaciones clínicas en el reemplazo de la médula ósea después de la quimioterapia. La presente invención proporciona un conjugado del factor de estimulación de colonias de granulocitos (G-CSF) . La invención proporciona conjugados de péptidos glicosilados y no glicosilados que tienen la actividad de estimulación de colonias de granulocitos. Los conjugados se pueden modificar adicionalmente por la conjugación adicional con diversas especies tales como porciones terapéuticas, porciones de diagnóstico, porciones de fijación de objetivos y similares. La presente invención incluye además un método para remodelar y/o modificar el G-CSF. El G-CSF es una herramienta valiosa en el tratamiento de numerosas enfermedades, pero como se estableciera anteriormente, su eficacia clínica ha sido impedida por su farmacocinética relativamente pobre. En las modalidades ejemplares, un péptido de G-CSF de la invención puede administrarse a pacientes -con el propósito de prevenir la infección en pacientes con cáncer que se someten a ciertos tipos de terapias de radiación, quimioterapia y transplantes de médula ósea, para movilizar células progenitoras para la recolección en transplantes de células progenitoras de sangre periférica, para el tratamiento de leucopenia crónica o relativa severa, sin importar la causa, y para soportar el tratamiento de pacientes con leucemia mieloide aguda. Adicionalmente, el conjugado o composición de polipéptido de la invención se puede utilizar para el tratamiento del SIDA u otras enfermedades de inmunodeficiencia así como también infecciones bacterianas. "' El G-CSF ha sido clonado y secuenciado. En una modalidad ejemplar, el G-CSF tiene una secuencia de aminoácidos de conformidad «con la SEC ID NO:l. El artífice' experto apreciará fácilmente que la presente invención no está limitada a las secuencias representadas en este documento, como variantes de G-CSF, como se describiera anteriormente en este documento. De esta manera, la presente invención incluye además variantes de G-CSF, como es bien conocido en el campo. Como un ejemplo, pero de ninguna manera propuesta para ser limitante de la presente invención, una variante de G-CSF ha sido descrita en la patente norteamericana No. 6,166,183, en la cual se describe un G-CSF que comprende el complemento natural de residuos de lisina y unida adicionalmente a una o dos moléculas de polietilenglicol. Adicionalmente, las patentes norteamericanas Nos. 6,004,548, 5,580,755, 5,582,823 y 5,676,941 describen una variante de G-CSF en la cual uno o más de los residuos de cisteína en la posición 17, 36, 42, 64 y 74 son reemplazados por alanina o alternativamente serina. La patente norteamericana No. 5, 416, 195.describe una molécula de G-CSF en la cual la cisteína en la posición 17, el ácido •aspártico en la posición 27 y las serinas en las posiciones 65 y 66 son sustituidos por serina, serina, prolina y prolina, respectivamente. Otras variantes son bien conocidas en el campo y se describen en, por ejemplo, la patente norteamericana No. 5,399,345. Las variantes aún adicionales tienen un aminoácido seleccionado de las SEC ID Nos: 3-11. - La expresión y la actividad de una molécula de G-CSF modificada de la presente invención se puede someter a ensayo utilizando métodos bien conocidos en el campo y como se describen en, por ejemplo, la patente norteamericana No. 4,810,643. Como un ejemplo, la actividad se puede medir utilizando ensayos de. captación de timidina radioetiquetada. En resumen, la médula ósea humana de donadores saludables se sujeta a un corte de densidad con Ficoll-Hypaque"11 (1.077 g/ml, Pharmacia, Piscataway, NJ) y las células de baja densidad son suspendidas en medio de Iscove (GIBCO, La Jolla, CA) que contiene 10% de suero bovino fetal, glutamina y antibióticos. Aproximadamente 2 x 104 células de médula ósea humana son incubadas con ya sea un medio de control o el G-CSF o la presente invención en placas de fondo plano de 96 pocilios a aproximadamente 37°C en C02 5% en el aire durante aproximadamente 2 días. Los cultivos entonces son impulsados durante aproximadamente 4 horas con 0.5 µCi/pocillo de 3H-timidina (New England Nuclear, Boston, Mass.) y la captación se mide como se describe en, por ejemplo, Ventua y colaboradores (1983, Blood 61:781). Un incremento en la incorporación de 3H-timidina en las células de médula ósea humana en comparación con las células de médula ósea tratadas con un compuesto de control es una indicación de un compuesto de G-CSF activo y viable. Como se describiera anteriormente, los conjugados de la invención se forman por medio de la unión enzimática de un azúcar modificado al péptido de G-CSF glicosilado. o no glicosilado. El azúcar modificado cuando se interpone entre el péptido de G-CSF y el grupo modificador en el azúcar se convierte en lo que puede ser referido en este documento como, por ejemplo, un "grupo de unión de glicosilo intacto". Utilizando la intensa selectividad de enzimas, tales como glicosiltransferasas, el presente método proporciona péptidos-que llevan un grupo deseado en una o más ubicaciones específicas. De esta manera, de acuerdo con la presente invención, un azúcar modificado se une directamente a un sitio seleccionado en la cadena del péptido de G-CSF o, alternativamente, el azúcar modificado se anexa en una porción de carbohidrato de un glicopéptido. Los péptidos en los cuales se enlazan los azucares modificados tanto a un carbohidrato de glicopéptido como directamente a un residuo de aminoácido de la estructura principal del péptido de G-CSF también están dentro del alcance de la presente invención. En contraste a las estrategias de elaboración de -péptidos químicas y enzimáticas, conocidas, los métodos de la invención hacen posible que los péptidos y glicopéptidos de ensamble tengan un patrón de derivatización sustancialmente homogéneo; las enzimas utilizadas en la invención son. generalmente selectivas para un residuo de aminoácido particular o una combinación de residuos de aminoácido del péptido de G-CSF. Los «métodos también son prácticos para la producción a gran escala de péptidos y glicopéptidos modificados. De esta manera, los métodos de la invención proporcionan un medio práctico para la preparación a gran escala de glicopéptidos que tienen patrones de derivatización uniformes, preseleccionados. Los métodos son particularmente muy adecuados para la modificación de péptidos terapéuticos que incluyen, pero no están limitados a, glicopéptidos que son glicosilados incompletamente durante la producción en células de cultivos celulares (por ejemplo, células de mamífero, células de insecto, células vegetales, células fúngales, células de levadura o células procarióticas) o plantas o animales transgénicos . La presente invención también proporciona conjugados de péptidos de G-CSF glicosilados y no glicosilados con un periodo de vida promedio, terapéutico, incre entado debido a, por ejemplo, una velocidad reducida de aclaramiento o una velocidad reducida de captación por el sistema inmune o reticuloendotelial (RES, por sus siglas en inglés) . Además, los métodos de la invención proporcionan un medio para enmascarar determinantes antigénicos en los péptidos reduciendo o eliminando de esta manera una respuesta inmune del hospedante hacia el péptido. La unión selectiva de los agentes de fijación de objetivos a un péptido también se puede utilizar para fijar como objetivo un péptido a un tejido particular o un receptor de la superficie celular que es específico para el agente de fijación de objetivos, particular.

Los conjugados En un primer aspecto, la presente invención proporciona un conjugado entre un grupo modificador seleccionado y un péptido de G-CSF. La unión entre el péptido de G-CSF y la porción seleccionada incluye un grupo de unión de glicosilo intacto que está interpuesto entre el péptido y la porción seleccionada. Como se describe en este documento, la porción seleccionada es esencialmente cualquier especie que se pueda unir a una unidad de sacárido, lo que da por resultado un "azúcar modificado" que es reconocido por una enzima transferasa apropiada, la cual anexa el azúcar modificado en el péptido de G-CSF. El componente de sacárido del azúcar modificado, cuando está interpuesto entre el .péptido de G-CSF y una porción seleccionada, se vuelve un "grupo de unión de glicosilo intacto" . El grupo de unión de glicosilo está formado de cualquier mono- u oligo-sacárido que, después de la modificación con una porción selec-cionada, es un substrato para una transferasa apropiada . Los conjugados de la invención corresponderán típicamente a la estructura general: en la cual, los símbolos a, b, c, d y s representan un número, entero, positivo, diferente de cero; y t es ya sea 0 o un número entero positivo. El "agente" es típicamente una porción soluble en agua, por ejemplo una porción de PEG. El conector puede ser cualquiera de un amplio conjunto de grupos de unión, infra . Alternativamente, el conector puede ser un enlace individual o un "conector de orden cero" . En una modalidad ejemplar, el grupo modificador seleccionado es un polímero soluble en agua, por ejemplo, m-PEG. El polímero soluble en agua está unido covalentemente al péptido de G-CSF por vía de un grupo de unión de glicosilo, el cual se une covalentemente a un residuo de aminoácido o un residuo de glicosilo del péptido de G-CSF. La invención también proporciona conjugados en los cuales un residuo de aminoácido y un residuo de glicosilo se modifican con un grupo de unión de glicosilo. Un polímero soluble en agua, ejemplar es el poli (etilenglicol) , por ejemplo, metoxi-poli (etilenglicol) . El poli (etilenglicol) utilizado en la presente invención no está restringido a alguna forma o rango de peso molecular particular. Para las moléculas de poli-(etilenglicol) no ramificadas, el peso molecular está en lugar de entre 500 y 100,000. En lugar de, se utiliza un peso molecular de 2,000-60,000 y más en lugar de de aproximadamente 5,000 a aproximadamente 30,000. En otra modalidad, el poli (etilenglicol) es un PEG ramificado que tiene más de una porción de PEG unida. Los ejemplos de PEGs ramificados se describen en la patente norteamericana No. 5,932,462; patente norteamericana No. 5,342,940; patente norteamericana No. 5,643,575; patente norteamericana No. 5,919,455; patente norteamericana No. 6,113,906; patente norteamericana No. 5,183,660; WO 02/09766; Rodera Y., Bioconjugate Chemistry 5: 283-288 (1994); y Yamasaki y colaboradores, Agrie. Biol . Chem. 52: 2125-2127, 1998. Otras estructuras de PEG ramificadas que son útiles se describen en este documento. En una modalidad ejemplar, el peso molecular de cada poli (etilenglicol) del PEG ramificado es igual a o mayor que aproximadamente 2,000, 5,000, 10,000, 15,000, 20,000, 40,000 o 60,000 daltons. Los péptidos de la presente invención -incluyen al menos un sitio de glicosilación unido a N u O. Además de proporcionar conjugados que se forman a través de un grupo de unión de glicosilo adicionado enzimáticamente, la presente invención proporciona conjugados que son altamente homogéneos en sus patrones de sustitución. Utilizando los métodos de la invención, es posible formar conjugados peptídicos en los cuales esencialmente todas las porciones de azúcar modificadas a través de una población de conjugados de la invención se unen a múltiples copias de un residuo de aminoácido o glicosilo estructuralmente idéntico. De esta manera, en un segundo aspecto, la invención proporciona un conjugado peptídico que tiene una población de porciones de polímero soluble en agua, lasf-cuales están enlazadas covalentemente al péptido de G-CSF a través de un grupo de unión de glicosilo intacto. En un conjugado preferido de la invención, esencialmente cada miembro de la población es enlazado por medio del grupo de unión de glicosilo a un residuo de glicosilo del péptido de G-CSF y cada residuo de glicosilo del péptido de G-CSF al cual se une el grupo de unión de glicosilo tiene la misma estructura. También se proporciona un conjugado peptídico que tiene una población de porciones de polímero soluble en agua enlazadas covalentemente al mismo a través de un grupo de unión de glicosilo. En una modalidad preferida, esencialmente cada miembro de la población de porciones de polímero soluble en agua es enlazado a un residuo de aminoácido del péptido de G-CSF por vía de un grupo de unión de glicosilo y cada residuo . de aminoácido que tiene un grupo de unión de glicosilo unido al mismo tiene la misma estructura. La presente invención también proporciona conjugados análogos a aquellos descritos anteriormente en los cuales el péptido de G-CSF es conjugado a una porción terapéutica, porción de diagnóstico, porción de fijación de objetivos, porción de toxina o similares por vía de un grupo de unión de glicosilo intacto. Cada una de las porciones citadas anteriormente puede ser una molécula pequeña, polímero natural (por ejemplo, polipéptido) o polímero sintético. Esencialmente cualquier péptido o agente del Factor de Estimulación de Colonias de Granulocitos, que tiene cualquier secuencia, se utiliza como el componente peptídico de los conjugados de la presente invención. El Factor de Estimulación de Colonias de Granulocitos ha sido clonado y secuenciado. En una modalidad ejemplar, el péptido de G-CSF tiene la secuencia presentada en la SEC ID NO:l:> MTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKL CATYKLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLA GCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLD VADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAF QRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP (SEC ID NO: 1) . En otra modalidad ejemplar, el péptido de G-CSF tiene la secuencia presentada en la SEC ID NO: 2: TPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCA TYKLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGC LSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVA DFATTIWQQMEELGMAPALQPTO.GAMPAFASAFQR RAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP (SEC ID NO : 2 ) . En otras modalidades ej emplares , el péptido de G-CSF tiene la secuencia presentada en las SEC ID Nos : 3 -11 , a continuación : MTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKL VSECATYKLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQAL QLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTL QLDVADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFA SAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP (SEC ID NO : 3 ) MAGPATQS PMKLMALQLLLWHSALWTVQEATPLGP ASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCATYKL CHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQL HSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFAT TIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGG VLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP (SEC ID NO : 4) MAGPATQSPMKLMALQLLLWHSALWTVQEATPLGP A-SSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLVS?CAT YKLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCL SQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVAD FATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRR AGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP (SEC ID N0 : 5 ) MVTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEK LCATYKLCHPEELVLLGHTLGIPWAPLSSCPSQALQL AGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGI SPELGPTLDTLQL DVADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASA FQRRAGGVLVASHLQS FLEVS YRVLRHLAQP (SEC ID NO : 6) ; MTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKL CATYKLCHPEELVLLGHTLGI PWAPLS SCPSQALQLA GCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLD VADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAF QRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP ( SEC ID N0 : 7 ) ; MVTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEK LCATYKLCHPEELVLLGSSLGIPWAPLSSCPSQALQL AGCLSQLHSGLFLYOGLLQALEGISPELGPTLDTLQL DVADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASA FQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP (SEC ID NO: 8) ; MQTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEK LCATYKLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQL AGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQL DVADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASA FQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP (SEC ID NO: 9) ; MTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKL CATYKLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLA GCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLD VADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAF QRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQPTQGAMP; (SEC ID NO: 10) y MTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKL CATYKLCHPEELVLLGSSLGIPWAPLSSCPSQALQLA GCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLD VADFATTIWQQMEELGMAPTTTPTQTAMPAFASAF QRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP (SEC ID NO: 11) La presente invención no está limitada de ninguna manera a la secuencia expuesta en este documento. En una modalidad ejemplar, los péptidos de G-CSF de la invención incluyen al menos un sitio de glicosilación unido a O, el cual es glicosilado con un residuo de glicosilo que incluye una porción de PEG. El PEG es unido covalentemente al péptido de G-CSF por vía de un grupo de unión de glicosilo intacto. El grupo de unión de glicosilo es unido covalentemente a ya sea un residuo de aminoácido o un residuo de glicosilo del péptido de G-CSF. Alternativamente, el grupo de unión de glicosilo está unido a una o más unidades de glicosilo de un glicopéptido. La- invención también proporciona conjugados en los cuales el grupo de unión de glicosilo está unido tanto a un residuo de aminoácido como a un residuo de glicosilo. La porción de PEG está unida directamente a un conector de glicosilo intacto, o por vía de un conector diferente de glicosilo, por ejemplo, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido. En una modalidad preferida, el péptido de G-CSF comprende una porción que es representada por la fórmula I.

Fórmula I en la cual D es un miembro seleccionado de -OH y RX-L-HN-; G es un miembro seleccionado de R1-!- y -C-(0) -alquilo de 1 a 6 átomos de carbono; R1 es una porción que comprende un miembro seleccionado de una porción que comprende un residuo de poli (etilenglicol) de cadena recta o ramificada; y L es un •conector - el cual es un miembro seleccionado de un enlace, un grupo alquilo sustituido o no sustituido y heteroalquilo sustituido o no sustituido, de manera que cuando D es OH, G es R L- y cuando G es -C (O) -alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, D es R^L-NH-. En las estructuras de ácido siálico modificadas que se exponen en este documento, COOH también representa COO" y/o una sal del mismo. En una modalidad, un R1-L es representado por la fórmula: en donde a es un número entero de 0 a 20. En una modalidad ejemplar, R1 tiene una estructura que es un miembro seleccionado de: 3 en donde e . y f son números enteros seleccionados independiente ente de 1 a 2500; y q es un número entero de 1 a 20. En otras modalidades, R1 tiene una estructura que es un miembro seleccionado de: en donde e, f y f son números enteros seleccionados independientemente de 1 a 2500; y q y q' son números enteros seleccionados independientemente de 1 a 20. En todavía otra modalidad, la invención proporciona un conjugado peptídico del factor IX, en donde R1 tiene una-estructura que es un miembro seleccionado de: en donde e, f y f son números enteros seleccionados independientemente de 1 a 2500; y q, q' y q" son números enteros seleccionados independientemente de 1 a 20. En otras modalidades, R1 tiene una estructura que es un miembro seleccionado de: —C(0)CH2CH2(OCH2CH2)eOCH3 ; ¥ |—C(0)OCH2CH2(OCH2CH2)fOCH3 en donde e y f son números enteros seleccionados independientemente de 1 a 2500. En otra modalidad ejemplar, la invención proporciona un péptido que comprende una porción que tiene la fórmula: El Gal puede estar unido a un residuo de aminoácido o a un residuo de glicosilo que está unido directa o indirectamente (por ejemplo, a través de un residuo de glicosilo) a un aminoácido. En otras modalidades, la porción tiene la fórmula: El GalNAc puede estar unido a un residuo de aminoácido o a un residuo de glicosilo que está unido directa o indirectamente (por ejemplo, a través de un residuo de glicosilo) a un aminoácido . En una modalidad ejemplar aún adicional, el péptido comprende una porción de acuerdo con la fórmula en donde AA es un residuo de aminoácido del péptido y, en cada una de las estructuras anteriores, D y G son como se describiera en este documento. Un residuo de aminoácido ejemplar del péptido de G- CSF en el cual se pueden conjugar una o más de las especies anteriores incluyen serina y treonina, por ejemplo la treonina 133 de la SEC ID NO:l. En otra modalidad ejemplar, la invención proporciona un conjugado de G-CSF que incluye un residuo de glicosilo que tiene la fórmula: en donde a, b, c, d, i, r, s, t y u son números enteros seleccionados independientemente de 0 y 1. El índice q es 1. Los índices e, f, g y h se seleccionan independientemente de los números enteros de 0 a 6. Los índices j, k, 1 y m se seleccionan independientemente de los números enteros de 0 a 100. Los índices v, w, x e y se seleccionan independientemente de 0 y 1 y al menos uno de v, , x e y es 1. El símbolo AA representa un residuo de aminoácido del péptido de G-CSF. El símbolo Sia- (R) representa un grupo que tiene la fórmula: en donde D se selecciona de -OH y R1-L-HN- . El símbolo G representa Rx-L- o -C (O) -alquilo de 1 a 6 átomos de carbono. R1 representa una porción que incluye un residuo de poli (etilenglicol) de cadena recta o -ramificada. L es un conector el cual es un miembro seleccionado de un enlace, alquilo sustituido o no sustituido y heteroalquilo sustituido o no sustituido. En general, cuando D es OH, G es R1-L- y cuando G es -C (O) -alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, D es RYL-NH-.

En otra modalidad ejemplar, la porción de ácido siálico modificada por PEG en el conjugado de la invención tiene la fórmula: en la cual el índice "s" representa un número entero de 1 a 20 y n es un número entero de 1 a 2500. En una modalidad preferida, s es igual a 1; y la porción de m-PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 20 kD. En una modalidad ejemplar aún adicional, el ácido siálico modificado por PEG tiene la fórmula: en la cual L es una porción cone-ctora de alquilo sustituido o no sustituido o heteroalquilo sustituido o no sustituido que une la porción de ácido siálico y la porción de PEG. En una modalidad preferida, al menos dos, más en lugar de tres, más en lugar de cuatro de los residuos de asparagina nombrados anteriormente es funcionalizado con la cadena de glicano unida a N que se muestra anteriormente. Los conjugados de la invención incluyen grupos de unión de glicosilo intactos que son mono- o multivalentes (por ejemplo, estructuras de antenas) . De esta manera, los conjugados de la invención incluyen ambas especies en las cuales una porción seleccionada es unida a un péptido por vía de un grupo de unión de glicosilo monovalente y un grupo de unión multivalente. También están incluidos dentro de la invención los conjugados en los cuales más de una porción seleccionada es unida a un péptido por vía de un grupo de unión multivalente.

Azucares Modificados La presente invención proporciona azucares modificados, nucleótidos de azucares modificados y conjugados de los azucares modificados. En los compuestos de azucares modificados de la invención, la porción de azúcar es en lugar de un sacárido, un desoxi-sacárido, un amino-sacárido o un N-acil-sacárido. El término "sacárido" y sus equivalentes, "sacarilo", "azúcar" y "-glicosilo" se refieren a monómeros, dímeros, oligómeros y polímeros. La porción de azúcar también es funcionalizada con un grupo modificador. El grupo modificador es conjugado a la porción, de azúcar, típicamente a través de la conjugación con una amina, sulfhidrilo o hidroxilo, por ejemplo, hidroxilo primario, porción en el azúcar. En una modalidad ejemplar, el grupo modificador es unido a través de una porción de amina en el azúcar, por ejemplo, a través de una amida, un uretano o una urea que se forma a través de la reacción de la amina con un derivado reactivo del grupo modificador. Se puede utilizar cualquier azúcar como el núcleo de azúcar de los conjugados de la invención. Los núcleos de azúcar ejemplares que son útiles en la formación de las composiciones de la invención incluyen, pero no están limitados a, glucosa, galactosa, mañosa, fucosa y ácido siálico. Otros azucares útiles incluyen azucares de amino tales como glucosamina, galactosamina, manosamina, el análogo 5-amina de ácido siálico y similares. El núcleo de azúcar puede ser una estructura encontrada en la naturaleza o puede ser modificada para . proporcionar un sitio para conjugar el grupo modificador. Por ejemplo, en ..una modalidad, la invención proporciona un conjugado peptídico que comprende un derivado de ácido siálico en el cual la porción 9-hidroxi es reemplazada por una amina. La amina es derivatizada fácilmente «con un análogo activado de un grupo modificador seleccionado. En la descripción que sigue, la invención es ilustrada por .referencia al uso de los derivados seleccionados de ácido siálico. Aquellas personas expertas en el campo reconocerán que el enfoque de la discusión es por claridad de ilustración y que las estructuras y composiciones expuestas son aplicables generalmente a través del género de grupos de sacáridos, grupos de sacáridos modificados,, grupos de sacáridos modificados, activados y conjugados de grupos de sacáridos modificados. En una modalidad ejemplar, la invención proporciona un conjugado peptídico que comprende una amina de azúcar modificado que tiene la fórmula: en la cual G es una porción de glicosilo, L es un enlace o un conector y R1 es el grupo modificador. Los -enlaces ejemplares son aquellos que se forman entre un NH2 en la porción de glicosilo y un grupo de reactividad complementaria en el grupo modificador. De esta manera, los enlaces ejemplares incluyen, pero no están limitados a, NHR1, OR1, SR1 y similares. Por ejemplo, cuando R1 incluye una -porción de ácido carboxílico, esta porción puede ser activada y acoplada con una porción de NH2 en el residuo de glicosilo que proporciona un enlace que tiene la estructura NHCÍOJR1. De manera similar, los grupos OH y SH se pueden convertir a los derivados de éter o tioéter correspondientes, respectivament . Los conectores ejemplares incluyen porciones de alquilo y heteroalquilo. Los conectores incluyen grupos de unión, por ejemplo grupos de unión basados en acilo, por ejemplo, -C(0)NH-, -OC(0)NH- y similares. Los grupos de unión son enlaces formados entre componentes de las especies de la invención, por ejemplo, entre la porción de glicosilo y el conector (L) o entre el conector y el grupo modificador (Rx) . Otros grupos de unión son éteres, tioéteres y aminas. Por ejemplo, en una modalidad, el conector es un residuo de aminoácido tal como un residuo de glicina. La porción de ácido carboxílico de la glicina es convertida a la amida correspondiente por medio de la reacción con una amina en el residuo de glicosilo y la amina de la glicina es convertida a la amida o uretano correspondiente por medio de la reacción con un ácido -carboxílico activado o carbonato del grupo modificador. Otro conector ejemplar es una porción de. PEG o una porción de PEG que es funcionalizada con un residuo. de. aminoácido. El PEG es para el grupo glicosilo a través del residuo de aminoácido en una terminación de PEG y se enlaza a R1 través de la otra terminación de PEG. Alternativamente, el residuo de aminoácido se enlaza a R1 y la terminación de PEG no se enlaza al aminoácido que es enlazado al grupo glicosilo. Una especie ejemplar para NH-L-R1 tiene la fórmula: -NH{C(0) (CH2)aNH}s{C(0) (CH2) b (OCH2CH2) c0 (CH2) dNH}tRx, en la cual los índices s y t son independientemente 0 o 1. Los índices, a, b y d son independientemente números enteros de 0 a 20 y c es un número entero de 1 a 2500. Otros conectores similares se basan en especies en las cuales la porción de — NH es reemplazada por, por ejemplo, -S, -O y CH2. Más particularmente, la invención proporciona un conjugado peptídico que comprende los compuestos en los cuales NH-L-R1 es: NHC (O) (CH2) aNHC (O) (CH2)b (OCH2CH2) cO (CH2) dNHRx, NHC (O) (CH2 ) b (OCH2CH2 ) cO ( CH2 ) dNHRx , NHC (O ) O ( CH2 ) b (OCH2CH2 ) cO < CH2 ) ¿iNHR1 , ?H(CH2)a?HC(O) (CHa OCHsCHaYOÍCH^d?HR1, ?HC(O) (CHaY?HR1, ?HÍCH^a?HR1 y ?HR1. En estas fórmulas, los índices a, b y d se seleccionan independientemente de los números enteros de 0 a 20, en lugar de de 1 a 5. El índice c es un número entero de 1 a 2500. En una modalidad ilustrativa, G es ácido siálico y los compuestos seleccionados de la invención tienen las f rmulas : Como apreciarán aquellas personas expertas en el campo, la porción -de ácido siálico en los compuestos ejemplares anteriores puede ser reemplazada por cualquier otro amino-sacárido que incluye, pero no está limitado a, glucosamina, galactosamina, manosamina, sus derivados de N-acetilo y similares . En otra modalidad ilustrativa, una porción de hidroxilo primario del azúcar es funcionalizada con el grupo modificador. Por ejemplo, el 9-hidroxilo de ácido siálico uede ser convertido a la amina correspondiente y puede ser funcionalizado para proporcionar un compuesto de acuerdo con la invención. Las fórmulas de acuerdo con esta modalidad incluyen: En una modalidad ejemplar adicional, la invención proporciona un conjugado peptídico que comprende azucares modificados en los cuales la posición 6-hidroxilo es convertida a la porción de amina correspondiente, la cual lleva un cásete de conector-grupo modificador tales como aquellos expuestos anteriormente. Los grupos sacarilo ejemplares que se pueden utilizar como el núcleo de estos azucares modificados incluyen Gal, GalNac, Glc, GlcNac, Fue, Xyl, Man y similares. Un azúcar modificado, representativo de acuerdo con esta modalidad tiene la -fórmula: en la cual R3-R5 y R7 son miembros seleccionados independientemente de H, OH, C(0)CH3, NH y NHC(0)CH3. R6 es OR1, NHR1 o NH-L-R1, la cual es como se describiera anteriormente. Los conjugados seleccionados de la invención se basan en mañosa, galactosa o glucosa o en especies que tienen la estereoquímica de mañosa, galactosa o glucosa. Las fórmulas generales de estos conjugados son: En otra modalidad ejemplar, la invención proporciona los compuestos expuestos anteriormente que son activados como los azucares de nucleótidos correspondientes. Los nucleótidos de azúcar ejemplares que se utilizan en la presente invención en su forma modificada incluyen mono-, di-o trifosfatos de nucleótidos o análogos de los mismos. En una modalidad preferida, el nucleótido de azúcar modificado se selecciona de un UDP-glicósido, CMP-glicósido o GDP-glicósido. Aún más en lugar de, la porción de nucleótido de azúcar del nucleótido de azúcar modificado se selecciona de UDP-galactosa, UDP-galactosamina, UDP-glucosa, UDP-glucosamina, GDP-manosa, GDP-fucosa, CMP-ácido siálico o CMP-NeuAc. En una modalidad ejemplar, el fosfato de nucleótido es unido a C-1. De esta manera, en una modalidad ilustrativa en la cual la porción de glicosilo es ácido siálico, la invención proporciona conjugados peptídicos que se forman utilizando los compuestos que tienen las fórmulas: en las cuales L-R1 es como se describiera anteriormente y L1-Rx representa un conector enlazado al grupo modificador. Como con L, las especies de conectores ejemplares de acuerdo con L1 incluyen un enlace, porciones de alquilo o heteroalquilo. Los compuestos de nucleótidos de azúcar modificado ejemplares de acuerdo con esas modalidades se exponen en la Figura 1 y la Figura 2. En otra modalidad ejemplar, la invención proporciona un conjugado que está formado entre un azúcar modificado de la invención y un substrato, por ejemplo, un péptido, lípido, aglicona, etcétera, más particularmente entre un azúcar modificado y un residuo de glicosilo de un glicopéptido o un glicolípido. En esta modalidad, la porción de azúcar del azúcar modificado se vuelve un grupo de unión de glicosilo interpuesto entre el substrato y el grupo modificador. Un grupo de unión de glicosilo ejemplar es un grupo de unión de glicosilo intacto, en el cual la porción o porciones de glicosilo que forman el grupo de unión no son degradadas por procesos químicos (por ejemplo, metaperyodato de sodio) o procesos enzimáticos (por ejemplo, oxidasa) . Los conjugados seleccionados de la invención incluyen un -grupo modificador que es unido a la porción de amina de un amino- sacárido, por ejemplo, manosamina, glucosamina, galactosamina, ácido siálico, etcétera. El casete ejemplar del grupo modificador-grupo de unión de glicosilo intacto de acuerdo con esta configuración se basa en una estructura de ácido siálico, de manera quela que tiene las fórmulas: En las fórmulas anteriores, R1, L1 y L2 son como se describiera anteriormente. En aún una modalidad ejemplar adicional, el conjugado se forma entre un substrato y la posición 1 de una porción de sacárido en la cual el grupo modificador es unido a través de un conector en la posición 6-carbono de la porción de sacarilo. De esta manera, los conjugados ilustrativos de acuerdo con esta modalidad tienen las fórmulas: en las cuales los radicales son como se describiera anteriormente. Aquellas personas expertas en el campo apreciarán que las porciones de sacarilo modificado expuestas anteriormente también se pueden conjugar a un substrato en los átomos de carbono 2, 3, 4 o 5.

Los compuestos ilustrativos de acuerdo con está modalidad incluyen compuestos que tienen las fórmulas: en las cuales los grupos R y los índices son como se describieran anberi-ormente.

La invención también proporciona nucleótidos de azúcar modificados con L-R1 en la posición de 6-carbono. Las especies ejemplares de acuerdo con esta modalidad incluyen: en la cual los grupo R y L representan porciones como se describiera anteriormente. El índice "y" es 0, 1 o 2. Un azúcar de nucleótido ejemplar, adicional de la invención se basa en una especie que tiene la estereoquímica de GDP-manosa. Una especie ejemplar de acuerdo con esta modalidad tiene la estructura: En una modalidad ejemplar aún adicional, la invención proporciona un conjugado, basado en la estereoquímica de UDP-galactosa. Un compuesto ejemplar de acuerdo con esta modalidad tiene la estructura: En otra modalidad ejemplar, el azúcar de nucleótido se basa en la estereoquímica de glucosa. Las -especies ejemplares de acuerdo con esta modalidad tienen las fórmulas: ; y El grupo modificador, R1, es cualquiera de una variedad de especies que incluyen, pero no están limitadas a, polímeros solubles en agua, polímeros insolubles en agua, agentes terapéuticos, agentes de diagnóstico y similares. La naturaleza de los grupos modificadores ejemplares se describe con mayor detalle posteriormente en este documento.

Grupos Modificadores Polímeros Solubles en Agua Muchos polímeros solubles en agua son conocidos para aquellas personas expertas en el campo y son útiles en la práctica de la presente invención. El término polímero soluble en agua incluye especies tales como sacáridos (por ejemplo, dextrano, amilosa, ácido hialourónico, ácido poli (siálico) , heparanos, heparinas, etcétera); poli (aminoácidos) , por ejemplo, ácido poli (aspártico) y ácido poli (glutámico) ; ácidos nucleicos; polímeros sintéticos (por ejemplo, ácido poli (acrílico) , poli (éteres) , por ejemplo, poli (etilenglicol) ; péptidos, proteínas y similares. La presente invención puede practicarse con cualquier polímero soluble en agua con la única limitación que el polímero debe incluir un punto en el cual se pueda unir el resto del conjugado . Los métodos para la activación de polímeros también se pueden encontrar en el documento WO 94/17039, la patente norteamericana No. 5,324,844, el documento WO 94/18247, el documento WO 94/04193, la patente norteamericana No. 5,219,564, la patente norteamericana No. 5,122,614, el documento WO 90/13540, la patente norteamericana No. 5,281,698 y además el documento WO 93/15189 y para la conjugación entre polímeros y péptidos activados, por ejemplo, el Factor de Coagulación VIII (WO 94/15625) , hemoglobina (WO 94/09027) , molécula portadora de oxígeno (patente norteamericana No. 4,412,989), ribonucleasa y superóxido-dismutasa (Veronese y colaboradores, App. Biochem. Biotech. 11: 141-145 (1985)). Los polímeros solubles en agua pref ridos son aquellos en los cuales una porción sustancial de las moléculas poliméricas en una muestra del polímero son de aproximadamente el mismo peso molecular; tales polímeros son "homodispersos" . La presente invención es ilustrada adicionalmente por referencia a un conjugado de poli (etilenglicol) . Están disponibles varias revisiones y monografías sobre la funcionalización y conjugación de PEG. Véase, por ejemplo Harris, Macronol . Chem. Phys . C25: 325-373 (1985) : Scouten, Methods irt Enzymology 135: 30-65 (1987); Wong y colaboradores, Enzyme Microb . Technol . 14: 866-874 (1992); Delgado y colaboradores, Cri tical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6: 150-165 (1995); y Bhadra y colaboradores, Pharmazie, 57:5-29 (2002). Las rutas para preparar moléculas de PEG reactivas y para formar -conjugados utilizando las moléculas reactivas son conocidas en el campo. Por ejemplo, la patente norteamericana No. 5,672,662 describe un conjugado soluble en agua y aislable de un éster activo de un ácido polimérico seleccionado de óxidos de poli (alquileno) lineales o ramificados, poli (polioles) oxietilados, alcoholes poli (olefínicos) y poli (acrilomorfolina) . La patente norteamericana No. 6,376,604 expone un método para preparar un éster de 1-benzotriazolilcarbonato soluble en agua de un polímero soluble en agua y no peptídico al hacer reaccionar un hidroxilo. terminal del polímero con di (1-benzotriazoil)carbonato en un solvente orgánico. El éster activo se utiliza para formar conjugados con un agente biológicamente activo tal como una proteína o un péptido. El documento WO 99/45964 describe un conjugado que comprende un agente biológicamente activo y un polímero soluble en agua, activado que comprende una estructura principal del polímero que tiene al menos una ter inación unida a la estructura principal del polímero a través de una unión estable, en donde al menos una terminación comprende una porción de ramificación que tiene grupos reactivos próximos unidos a la porción de ramificación, en la cual el agente biológicamente activo es unido a al menos uno de los grupos reactivos próximos. Otros poli (etilenglicoles) ramificados se describen en el documento WO 96/21469, la patente norteamericana No. 5,932,462 describe un conjugado que está formado por una molécula de PEG ramificada que incluye una terminación ramificada que incluye grupos funcionales reactivos. Los grupos reactivos libres están disponibles para reaccionar con especies biológicamente activas, tal como una proteína o un péptido, formando conjugados entre el poli (etilenglicol) y las especies biológicamente activas. La patente norteamericana No. 5,446,090 describe un conector de PEG bifuncional y su uso en la formación de conjugados que tienen un péptido en cada una de las terminaciones de conector de PEG. Los conjugados que incluyen uniones de PEG degradables se describen n el documento WO 99/34833; y el documento WO 99/14259, así como -también en la patente norteamericana No. 6,348,558. Estas uniones degradables son aplicables en la presente invención. Los métodos reconocidos en el campo para la activación de polímeros expuestos anteriormente se utilizan en el contexto de la presente invención en la formación de polímeros ramificados expuestos en este documento y también para la conjugación de esos polímeros ramificados a otras especies, por ejemplo, azucares, nucleótidos de azúcar y similares. Las moléculas de poli (etilenglicol) ejemplares que se utilizan en la invención incluyen, pero no están limitadas a, aquellas que tienen la fórmula: en la cual R8 es H, OH, NH2, alquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, por ejemplo acetal, OHC-, H2N-(CH2)q-, HS-(CH2)q o - (CH2) 4C (Y) Z1. El índice "e" representa un número entero de 1 a 2500. Los índices b,d y q representan independientemente números enteros de 0 a 20. Los símbolos Z y Z1 representan independientemente OH, NH2, grupos salientes, por ejemplo, imidazol, p-nitrofenilo, HOBT, tetrazol, haluro, S-R9, la porción de alcohol de ésteres activados; - (CH2)PC (Y1) V o -(CH2)pU(CH2)sC(Y1)v. El símbolo Y representa H(2), =0, =3, =N-R10. Los símbolos X, Y, Y1, A1 y U representan independientemente las porciones 0, S, N-R11. El símbolo V representa OH, NH2, halógeno, S-R12, el componente de alcohol de esteres activados, el componente de amina de amidas activadas, azúcar-nucleótidos y "proteínas. Los índices p, q, s y v son miembros seleccionados independientemente de números enteros de 0 a 20. Los símbolos R9, R10, R11 y R12 representan independientemente H, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido y heteroarilo sustituido o no sustituido. En otras modalidades ejemplares, la molécula de poli (etilenglicol) se selecciona de las siguientes: El poli (etilenglicol) útil en la formación del conjugado de la invención es ya sea lineal o ramificado. Las moléculas de poli (etilenglicol) ramificadas que son adecuadas para el uso en la invención incluyen, pero no están limitadas a, aquellas descritas por la siguiente fórmula:- en la cual R8 y R8' son miembros seleccionados independientemente de grupos definidos por R8, anteriormente. A1 y A2 son miembros seleccionados independientemente de los grupos definidos por A1, anteriormente. Los índices e, f, o y q, son como se describiera anteriormente. Z e Y son como se describiera anteriormente. X1 y X1' son miembros seleccionados independientemente de S, SC(0)NH, HNC{0)S, SC(0)0, O, NH, NHC(O), (O)CNH y NHC (O) O, 0C(0)NH. En otras modalidades ejemplares, el PEG ramificado se basa en un núcleo de cisteína, serina o di-lisina. De esta manera, los PEGs ramificados, ejemplares, adicionales incluyen: En todavía otra modalidad, la porción de PEG ramificada se basa en el péptido de tri-lisina. La tri-lisina puede ser modificada por mono-, di-, tri- o tetra-PEG. Las especies ejemplares de acuerdo con esta modalidad tienen las fórmulas . en las cuales e, f y f son números enteros seleccionados independientemente de 1 a 2500; y q, q' y q" son números enteros seleccionados independientemente de 1 a 20. En las modalidades ejemplares de la invención, el PEG es m-PEG (5 kD, 10 kD o 20 kD) . Una especie de PEG ramificado, ejemplar es una serina- o cisteína- (m-PEG) 2 en la cual m-PEG es un m-PEG 20 kD. Como será aparente para aquellas personas expertas en el campo, los polímeros ramificados para el uso en la invención incluyen variaciones sobre los temas expuestos anteriormente. Por ejemplo, el conjugado de di-lisina-PEG mostrado anteriormente puede incluir tres subunidades poliméricas, la tercera enlazada a la a-amina mostrada como no modificada en la estructura anterior. De manera similar, el uso de una tri-lisina funcionalizada con tres o cuatro subunidades poliméricas está dentro del alcance de la invención. Las modalidades específicas de acuerdo con la invención incluyen: y carbonatos y esteres activos de estas especies, tales como: Otros grupos activadores, o salientes, que son apropiados para activar los PEGs lineales para el uso en la preparación de los compuestos expuestos en este documento incluyen, pero no están limitados a, las especies: Las moléculas PEG que son activadas con estas y otras especies y métodos para elaborar los PEGs activados se exponen en el documento WO 04/083259. Aquellas personas expertas en el campo apreciarán que uno o más de los brazos de m-PEG del polímero ramificado pueden ser reemplazados por una porción de PEG con una terminación diferente, por ejemplo, OH, COOH,- NH2, alquilo de 2 a 10 átomos de carbono, etcétera. Además, las estructuras anteriores son modificadas fácilmente al insertar conectores de alquilo -(o retirar átomos de carbono) entre el átomo de a-carbono y el grupo funcional de la cadena lateral. De esta manera, los derivados "homo" y homólogos superiores, así como también homólogos inferiores están dentro del alcance de los núcleos para PEGs ramificados que se utilizan en la presente invención. Las especies de PEG ramificado expuestas en este documento se preparan fácilmente por medio de métodos tales como aquellos expuestos en el siguiente esquema de reacción: en el cual Xa es O o S y r es un número entero de 1 a- 5. Los índices e y f son números enteros seleccionados independientemente de 1 a 2500. De esta manera, de acuerdo con este esquema de reacción, un aminoácido natural o no natural es conectado con un derivado de m-PEG activado, en este caso el tosilato, formando el compuesto 1 por la alquilación del heteroátomo de cadena lateral Xa. El aminoácido de m-PEG mono-funcionalizado se somete a condiciones de N-acilación con un derivado de m-PEG reactivo, ensamblando con lo cual el —PEG ramificado 2.

Como apreciará una persona experta en el campo, el grupo saliente tosilato puede ser reemplazado por cualquier grupo saliente adecuado, por ejemplo, halógeno, mesilato, triflato, etcétera. De manera similar, el carbonato reactivo que se utiliza para acilar la amina puede ser reemplazado por un éster activo, por ejemplo, N-hidroxisuccinimida, etcétera, o el ácido puede ser activado in si tu utilizando un agen e deshidratante tal como diciclohexilcarbodiimida, carbonildiimidazol, etcetera. En una modalidad ejemplar, el grupo modificador es una porción de PEG, sin embargo, cualquier grupo modificador, por ejemplo, un polímero soluble en agua, polímero insoluble en agua, porción terapéutica, etcétera, se puede incorporar en una porción de glicosilo a través de una unión apropiada. El azúcar modificado está formado por medios enzimáticos, medios químicos o una combinación de los mismos, produciendo con lo cual un azúcar modificado. En una modalidad ejemplar, los azucares son sustituidos por una amina activa en cualquier posición que permita la unión de la porción modificadora, permitiendo todavía que el azúcar funcione como un substrato para una enzima capaz de acoplar el azúcar modificado al péptido de G-CSF. En una modalidad ejemplar, cuando la •galactosamina es el azúcar modificado, la porción de amina se une al átomo de carbono en la posición 6.

Especies Modificadas por Polímeros Solubles en Agua Las especies de azúcar de nucleótidos modificadas por polímeros solubles en agua en las cuales la porción de azúcar es modificada con un polímero soluble en agua se utilizan en la presente invención. Un nucleótido de azúcar modificado, ejemplar lleva un grupo de azúcar que es modificado a través de una porción de amina en el azúcar. Los nucleótidos se azúcar modificados, por ejemplo derivados de sacaril-amina de un nucleótido de azúcar, también se utilizan en los métodos de la invención. Por ejemplo, una sacaril-amina (sin el grupo modificador) se puede conjugar enzimáticamente a un péptido (u otras especies) y la porción de sacaril-amina libre se puede conjugar subsecuentemente a un grupo modificador deseado. Alternativamente, el nucleótido de azúcar modificado puede funcionar como un substrato para una enzima que trasfiere el azúcar modificado a un receptor de sacarilo en un substrato, por ejemplo, un péptido, glicopéptido, lípido, aglicona, glicolípido, etcétera. En una modalidad en la cual el núcleo de sacárido es galactosa o glucosa, R5 es NHC (O)Y. En una modalidad ejemplar, el azúcar modificado se basa en una porción de 6-amino-N-acetil-glicosilo . Como se muestra posteriormente para ?-acetilgalactosamina, la porción de 6-amino-azúcar se prepara fácilmente por medio de métodos estándar. a. g En el esquema de reacción anterior, el índice n representa un número entero de 1 a 2500, en lugar de de 10 a 1500 y más en lugar de de 10 a 1200. El símbolo ,?A" representa un grupo activador, por ejemplo, un halo, un componente de un éster activado (por ejemplo, un éster de N-hidroxisuccinimida) , un componente de un carbonato (por ejemplo, carbonato de p-nitrofenilo) y similares. Aquellas personas expertas en el campo apreciarán que otros azucares de nucleótidos de PEG-amida se preparan fácilmente por medio de este método y por medio de métodos análogos . En otras modalidades ejemplares, la porción de amida es reemplazada por un grupo tal como un uretano o una urea.

En modalidades aún adicionales, R1 es un PEG ramificado, por ejemplo, una de aquellas especies expuestas anteriormente. Los compuestos ilustrativos de acuerdo con esta modalidad incluyen: en las cuales X es un enlace u O Además, como se describiera anteriormente, la presente invención proporciona conjugados peptídicos que se forman utilizando azucares de nucleótidos que son modificados con un polímero soluble en agua, el cual es ya sea de cadena recta o ramificada. Por ejemplo, los compuestos que tienen la fórmula mostrada posteriormente están dentro del alcance de la presente invención: en la cual X4 es O o un enlace. De manera similar, la invención proporciona conjugados peptídicos que se forman utilizando azucares de nucleótidos de aquellas especies de azúcar modificado en las cuales el átomo de carbono en la posición 6 es modificado: en la cual X4 es un enlace u 0. También se proporcionan conjugados de péptidos y glicopéptidos, lípidos y glicolípidos que incluyen las composiciones de la invención. Por ejemplo, la invención proporciona conjugados que tienen las siguientes fórmulas: Polímeros Insol?bles en Agua En otra modalidad, análoga a aquellas descritas anteriormente, los azucares modificados incluyen un polímero insoluble en agua, en lugar de que un polímero soluble en agua. Los conjugados de la invención también pueden incluir uno o más polímeros insolubles en agua. Esta modalidad de la invención es ilustrada por el uso del conjugado como un vehículo con el cual se suministra un péptido terapéutico de manera controlada. Los sistemas de suministro de fármacos poliméricos son conocidos en el campo. Véase, por ejemplo, Dunn y colaboradores, Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991. Aquellas personas expertas en el campo apreciarán que sustancialmente cualquier sistema de suministro de fármacos conocido es aplicable para los -conjugados de la presente invención. Los polímeros insolubles en agua representativos incluyen, pero no están limitados a, polifosfazinas, alcoholes poli(vinílicos) , poliamidas, policarbonatos, polialquilenos, poliacrilamidas, polialquilenglicoles, óxidos de polialquileno, polialquilen-tereftalatos, éteres de polivinilo, esteres de polivinilo, haluros de polivinilo, polivinilpirrolidona, poliglicólidos, polisiloxanos, poliuretanos, poli (metil-metacrilato) , poli(etil-metacrilato) , poli (butil-metacrilato) , poli (isobutil-metacrilato), poli (hexil-metacrilato) , poli (isodecil-metacrilato) , poli (laurel-metacrilato) , poli(fenil-metacrilato) , poli (metil-acrilato) , poli (isopropil-acrilato) , poli (isobutil-acrilato) , poli (octadecil-acrilato) polietileno, polipropileno, poli (etilenglicol) , óxido de poli (etileno) , poli (etilen-tereftalato) , acetal de poli (vinilo) , cloruro de polivinilo, poliestireno, polivinilpirrolidona, pluronics y polivinilfenol y copolímeros de los mismos. Los polímeros naturales sintéticamente modificados para el uso en los conjugados de la invención incluyen, pero no están limitados a, alquil-celulosas, hidroxialquil-celulosas, éteres de celulosa, esteres de celulosa y nitrocelulosas. Los miembros particularmente preferidos de las amplias clases de polímeros naturales sintéticamente modificados incluyen, pero no están limitados a, metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxibutilmetilcelulosa, acetato de celulosa, propionato de celulosa, butirato de acetato de celulosa, ftalato de acetato de celulosa, caboximetilcelulosa, triacetato de celulosa, sal sódica de sulfato de celulosa y polímeros de esteres acrílicos y metacrílicos y ácido algínico. Estos y otros polímeros descritos en este documento se pueden obtener fácilmente de fuentes comerciales tales como Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO.), Polysciences (Warrenton, PA.), Aldrich (Milwaukee, Wl . ) , Fluka (Ronkonkoma, NY) , y BioRad (Richmond, CA) , o también se pueden sintetizar a partir de monómeros obtenidos de estos proveedores utilizando técnicas estándar. Los polímeros biodegradables, representativos para el uso en los conjugados de la invención incluyen, pero no están limitados a, polilactidas, poliglicolidos y copolímeros de los mismos, poli (etilentereftalato) , ácido poli (butírico) , ácido poli (valérico) , poli (lactida-co-caprolactona) , poli (lactida-co-glicolido) , polianhídridos, poliortoésteres, combinaciones y copolímeros de los mismos. Las composiciones que forman geles son de uso particular, tales como aquellas que incluyen colágeno, pluronics y similares. Los polímeros para el uso en la invención incluyen polímeros "híbridos" que incluyen materiales insolubles en agua que tienen dentro al menos una porción de su estructura una molécula biorreabsorbible. Un ejemplo de este polímero es uno que incluye un copolímero insoluble en agua, el cual tiene una región biorreabsorbible, una región hidrófila y una pluralidad de grupos funcionales r-eticulafol-.es por cadena polimérica. Para propósitos de la presente invención, los "materiales insolubles en agua" incluyen materiales que son sustancialmente insolubles en agua o ambientes que contienen agua. De esta manera, aunque ciertas regiones o segmentos del copolímero pueden ser hidrófilos o aún solubles en agua, la molécula de polímero, como un total, no se disuelve en agua a alguna medida sustancial . Para propósitos de la presente invención, el término "molécula biorreabsorbible" incluye una región que puede ser metabolizada o descompuesta y reabsorbida y/o eliminada a través de rutas excretorias, normales por el cuerpo. Estos metabolitos o productos de descomposición son de manera preferible sustancialmente no tóxicos para el cuerpo. La región biorreabsorbible puede ser ya sea hidrófoba o hidrófila, siempre y cuando la composición de copolímero como un total no se vuelva soluble en agua. De esta manera, la región biorreabsorbible se selecciona en base a la preferencia que el polímero, como un total, permanece insoluble en agua. Por consiguiente, las propiedades relativas, es decir, las clases de grupos funcionales contenidos por, - y las proporciones relativas de la región biorreabsorbible, y la región hidrófila se.seleccionan para asegurar que las composiciones biorreabsorbibles - útiles permanezcan insolubles en agua. Los polímeros reabsorbibles, ejemplares incluyen, por ejemplo, copolímeros de bloque reabsorbibles que son producidos sintéticamente de ácido poli (a-hidroxi-carboxílico) /poli (oxialquileno) , (véase, Cohn y colaboradores, patente norteamericana No. 4,826,945). Estos copolímeros no son reticulados y son solubles en agua de manera que el cuerpo puede excretar las composiciones degradadas de copolímeros de bloque. Véase, Younes y colaboradores J Biomed. Mater. Res . 21: 1301-1316 (1987) ; y Cohn y colaboradores J Biomed. Mater. Res . 22: 993-1009 (1988) . Los polímeros biorreabsorbibles actualmente preferidos incluyen uno o más componentes seleccionados de poli (esteres) , ácidos poli (hidroxi) , poli (lactonas) , poli (amidas) , poli (éster-amidas) , poli (aminoácidos) , poli (anhídridos) , poli (ortoésteres) , poli (carbonatos) , poli (fosfazinas) , poli (fosfoésteres) , poli (tioésteres) , polisacáridos y mezclas de los mismos. Más en lugar de aún, el polímero biorreabsorbible incluye un componente de ácido poli (hidroxi) . De los ácidos poli (hidroxi) , se prefieren el ácido poliláctico, ácido poliglicólico, ácido policapróico, ácido polibutírico, ácido polivalérico y copolímeros y mezclas de los mismos. Además de formar fragmentos que son absorbidos in vivo ("biorreabsorbidos") , los revestimientos poliméricos preferidos para el uso en los métodos de la invención también pueden formar un fragmento excretable y/o metabolizable. Los copolímeros de orden superior también se pueden utilizar en la presente invención. Por ejemplo, Casey y colaboradores, patente norteamericana No. 4,438,253, la cual fue expedida el 20 de Marzo de 1984, describe copolímeros de tres bloques producidos a partir de la transesterificación de ácido poli (glicólico) y un poli (alquilenglicol) terminado en hidroxilo. Estas composiciones se describen para el uso -como suturas monofilamentosas reabsorbibles . La flexibilidad de estas composiciones es controlada por la incorporación de un ortocarbonato aromático, tal como ortocarbonato de tetra-p-tolilo en la estructura del copolímero. También se pueden utilizar otros polímeros basados en ácidos lácticos y/o glicólicos. Por ejemplo, Spinu, patente norteamericana No. 5,202,413, la cual fue expedida el 13 de Abril de 1993, describe copolímeros de múltiples bloques biodegradables que tienen bloques secuencialmente ordenados de poliláctida y/o poliglicólido producidos por medio de la polimerización de abertura de anillos de láctida y/o glicólido sobre ya sea un diol oligomérico o un residuo de diamina seguido por la extensión de cadenas con un compuesto di-funcional, tal como un diisocianato, diacil-cloruro o diclorosilano.

Las regiones biorreabsorbibles de revestimientos útiles en la presente invención se pueden diseñar para ser hidrolítica y/o enzimáticamente escindibles . Para propósitos de la presente invención, "hidrolíticamente escindible" se refiere a la susceptibilidad del copolímero, especialmente la región biorreabsorbible, a la hidrólisis en agua o un ambiente que contiene agua. De manera similar, "enzimáticamente escindible" como se utiliza en este documento se refiere a la susceptibilidad del copolímero, especialmente la región biorreabsorbible, a la escisión por medio de enzimas endógenas o exógenas. Cuando se coloca dentro del cuerpo, la región hidrófila puede ser procesada en fragmentos excretables y/o metabolizables. De esta manera, la región hidrófila puede incluir, por ejemplo, poliéteres, óxidos de polialquileno, polioles, poli (vinil-pirrolidina) , alcohol poli (vinílico) , poli (alquil-oxazolinas) , polisacáridos, carbohidratos, péptidos, proteínas y copolímeros y mezclas de los mismos. Además, la región hidrófila también puede ser, por ejemplo, un óxido de poli (alquileno) . Estos óxidos de poli (alquileno) pueden incluir, por ejemplo, óxido de. poli (etileno) , óxido de poli (propileno) y mezclas y copolímeros de los mismos. Los polímeros que son componentes de hidrogeles también son útiles en la presente invención. Los hidrogeles son materiales poliméricos que son capaces de absorber cantidades relativamente grandes de agua. Los ejemplos de compuestos formadores de hidrogeles incluyen, pero no están limitados a, ácidos poliacrílicos, carboximetilcelulosa de sodio, alcohol polivinílico, polivinil-pirrolidina, gelatina, carragenina y otros polisacáridos, ácido hidroxietilenmetacrílico (HEMA) , así como también derivados de los mismos y similares. Se pueden producir hidrogeles que sean estables, biodegradables y biorreafosorbibles . Además, las composiciones de hidrogel pueden incluir subunidades que exhiben una o más de estas propiedades. Las composiciones de hidrogel biocompatibles cuya integridad puede ser controlada a través de la reticulación son conocidas y son preferidas actualmente para el uso en los métodos de la invención. Por ejemplo, Hubbell y colaboradores, patente norteamericana No. 5,410,016, la cual fue expedida el 25 de Abril de 1995 y la patente nortoamericana No. 5,529,914, la cual fue expedida el 25 de Junio de 1996, describen sistemas solubles en agua, los cuales son copolímeros de bloque reticulados que tienen un segmento de bloque central que es soluble en agua interpuesto entre dos extensiones hidrolíticamente lábiles. Estos copolímeros son rematados adicionalmente con funcionalidades de acrilato fotopolimerizabl . Cuando se reticulan, estos sistemas se vuelven hidrogeles. El bloque central soluble en agua de estos copolímeros puede incluir poli (etilenglicol) ; mientras que, las extensiones hidrolíticamente lábiles pueden ser un ácido poli (a-hidroxi) , tal como ácido poliglicólico o ácido poliláctico. Véase, Sa hney y colaboradores, Macromolecules 26: 581-587 (1993). En otra modalidad preferida, el gel es un gel termorreversible. Los geles termorreversibles que incluyen componentes tales como pluronics, colágeno, gelatina, ácido hialourónico, polisacáridos, hidrogel de poliuretano, hidrogel de poliuretano-urea y combinaciones de los mismos son actualmente preferidos. En todavía otra modalidad ejemplar, el conjugado de la invención incluye un componente de un liposoma. Los liposomas se pueden preparar de acuerdo con métodos conocidos para aquellas personas expertas en el campo, por ejemplo, como se describe en Eppstein y colaboradores, patente norteamericana No. 4,522,811, la cual fue expedida el 11 de Junio de 1985. Por ejemplo, las formulaciones de liposomas se pueden preparar al disolver lípidos apropiados (tales como fosfatidil-etanolamina de estearoilo, fosfatidil-colina de estearoiio, fosfatidil-colina de aracadoilo y colesterol) en un solvente inorgánico que entonces es evaporado, d ando atrás una película delgada de lípido seco sobre la superficie del recipiente. Una solución acuosa del compuesto activo o su sal farmacéuticamente aceptable entonces se introduce en el recipiente. El recipiente entonces es remolineado a mano hasta formar un material de lípidos libres de los costados del recipiente y para dispersar los agregados de lípidos, formando con lo cual una suspensión liposomal. Las micropartículas citadas anteriormente y los métodos para preparar las micropartículas son ofrecidos a manera de ejemplo y no se debe considerar que definen el alcance de las micropartículas para el uso en la presente invención. Será aparente para aquellas personas expertas en el campo que cualquier conjunto de micropartículas, fabricadas por medio de diferentes métodos, se utilizan en la presente invención. Los formatos estructurales descritos anteriormente en el contexto de los polímeros solubles en agua, tanto de cadena recta como ramificada, también son generalmente aplicables con respecto a los polímeros insolubles en agua. De esta manera, por ejemplo, los núcleos de ramificación de cisteína, serina, dilisina y trilisina pueden ser funcionalizados con dos porciones de polímero insoluble en agua. Los métodos utilizados para producir estas especies son en general estrechamente análogos a aquellos utilizados para producir los polímeros solubles en agua. El periodo de vida promedio in vivo de los glicopéptidos terapéuticos tambi n se puede mejorar con porciones de PEG tales como polietilenglicol (PEG) . Por ejemplo, la modificación química de proteínas con PEG (PEGilación) incrementa su tamaño molecular y disminuye su accesibilidad a la superficie y grupos funcionales, cada uno de los cuales son dependientes del tamaño del PEG unido a la proteína. Esto da por resultado un mejoramiento de los periodos de vida promedio en el plasma y de la estabilidad proteolítica y una disminución en la inmunogenicidad y captación hepática (Chaffee y colaboradores J. Clin. Invest. 89: 1643-1651 (1992); Pyatak y colaboradores Res. Commun. Chem. Pathol Pharmacol . 29: 113-127 (1980)). Se ha reportado que la modificación por PEG de interleucina-2 incrementa su potencia antitumoral in vivo (Katre y colaboradores Proc. Nati . Acad. Sci . EUA. 84: 1487-1491 (1987)) y la modificación por PEG de un F (ab' ) 2. derivado del anticuerpo monoclonal A7 ha mejorado su localización de tumores - (Kitamura y colaboradores Biochem. Biophys. Res. Commun. 28: 1387-1394 (1990) ) . De esta manera, en otra modalidad preferida, el periodo de vida promedio in vivo de un péptido derivatizado con una porción de PEG por medio de un método de la invención es incrementado con relación al periodo de vida promedio in vivo del péptido no derivatizado. El incremento en el periodo de vida promedio in vivo del péptido es mejor expresado como un rango de porcentaje de incremento en esta cantidad. El extremo inferior del rango del porcentaje de incremento es de aproximadamente 40%, aproximadamente 60%, aproximadamente 80%, aproximadament 100%, aproximadamente 150% o aproximadamente 200%. El extremo superior del rango es de aproximadamente 60%, aproximadamente 80%, aproximadamente 100%, aproximadamente 150% o más de aproximadamente 250%. En una modalidad ejemplar, la~ presente invención proporciona un FSH modificado por PEG (FIGURA 1# FIGURA 2 y FIGURA 5) .

Los Métodos Además de los conjugados descritos anteriormente, la presente invención proporciona métodos para preparar estos y otros conjugados. De esta manera, en un aspecto adicional, la invención proporciona un método para formar un conjugado covalente entre una porción seleccionada y un péptido de G-CSF. Adicionalmente, la invención proporciona métodos para que los conjugados de la invención fijen como" objetivo un tejido o región particular del cuerpo. En las modalidades ejemplares, el conjugado se forma entre una porción de PEG (o una porción de glicosilo enzimáticamente transferible que comprende la porción de PEG) y un péptido glicosilado o no glicosilado. El PEG es conjugado al péptido de G-CSF por vía de un grupo de unión glicosilo intacto, el cual es interpuesto entre, y está unido covalentemente tanto al péptido de G-CSF como a la porción de P?G, o a una construcción de conectores de PEG sin glicosilo (por ejemplo, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido) . El método incluye poner en contacto el péptido de G-CSF con una mezcla que contiene un azúcar modificado y una glicosiltransferasa para la cual el azúcar modificado es un substrato. La reacción se conduce bajo condiciones suficientes para formar un enlace covalente entre el azúcar modificado y el péptido de G-CSF. La porción de azúcar del azúcar modificado se selecciona en lugar de de azucares de nucleótidos, azucares activados y azucares, los cuales ni son nucleótidos ni están activados. El péptido receptor (glicosilado o no glicosilado) es sintetizado típicamente de novo o es expresado recombinantemente en una célula procariótica (por ejemplo, célula bacteriana, tal como E. coli) o en una célula eucariótica tal como una célula de mamífero, levadura, insecto, fungal o vegetal. El péptido de G-CSF puede ser ya sea una proteína de longitud completa o un fragmento. Además, el péptido de G-CSF puede ser un péptido de tipo natural o mutado. En una modalidad ejemplar, el péptido de G-CSF incluye una mutación que adiciona uno o más sitios de glicosilación unidos a N u O a la secuencia del péptido. En una modalidad ejemplar, el Factor IX es O-glicosilado y funcionalizado con un polímero .soluble en agua de la siguiente manera. El péptido ya sea es producido con un sitio de glicosilación de aminoácido disponible o, si es glicosilado, la porción de glicosilo es ordenada para exponer el aminoácido. Por ejemplo, una serina o treonina es un a-1 N-acetil-amino galactosilado (GalNAc) y el péptido NAc-galactosilado es sialilado con un cásete de ácido siálico-grupo modificador utilizando ST6GalNAcTl . Alternativamente,, el péptido NAc-galacto ilado es galactosilado utilizando un núcleo-l-GalT-1 y el producto es sialilado con un cásete de ácido siálico-grupo modificador utilizando ST3GalTl. Un conjugado ejemplar de acuerdo con este método tiene las siguientes uniones: Thr-a-YGalNAc-ß-1, 3-Gal-a2, 3-Sia*, en la cual Sia* es el cásete de ácido siálico-grupo modificador. En los métodos de la invención, de manera que expuesto anteriormente., que utilizan múltiples enzimas y donadores de sacarilo, los pasos de -glicosilación individuales se puede realizar por separado o combinados en una reacción de "crisol individual". Por ejemplo, en la reacción de tres enzimas expuesta anteriormente la GalNAc transferasa, GalT y SiaT y sus donadores se pueden combinar en un recipiente individual. Alternativamente, la reacción de GalNAc se puede realizar sola y tanto GalT como SiaT y los donadores de sacarilo apropiados se pueden. adicionar como un, paso individual . Otro modo para conducir las reacciones involucra adicionar secuencialmente cada enzima y un donador apropiado y conducir la reacción en una configuración de un "crisol individual" . Las combinaciones de cada uno de los métodos expuestos anteriormente son para el uso en la preparación de los compuestos de la invención. En los conjugados de la invención, particularmente los glicanos unidos a N modificados por glico-PEG, el casete de Sia-grupo modificador se puede unir al Gal en una unión de a-2,6 o a-2,3. El método de la invención también proporciona la modificación de péptidos incompletamente glicosilados que son producidos de manera recombinante . Empl ando un azúcar - modificado en un método de la invención, el péptido de G-CSF puede ser además glicosilado y derivatizado simultáneamente con, por ejemplo, una porción de PEG, un agente terapéutico o similares. La porción de azúcar del azúcar modificado puede ser el residuo que sería conjugado apropiadamente al receptor en un péptido completamente glicosilado u otra porción de azúcar con propiedades deseables. Los péptidos de G-CSF modificados por medio de los métodos de la invención pueden ser péptidos sintéticos o de tipo natural o pueden ser péptidos mutados, producidos por medio de métodos conocidos en el campo, tal como la mutagénesis dirigida al sitio. La glicosilación de péptidos es típicamente ya sea unida a N o unida a O. Una unión a N ejemplar es - -la unión del azúcar modificado a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tres péptidos de asparagina-X-serina y asparagrna-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias dé reconocimiento para la unión enzimática de una porción de carbohidrato a la cadena lateral de asparágina. De esta manera, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tres péptidos en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial . La glicosilación unida a 0 se refiere a la unión de un azúcar (por ejemplo, N-acetilgalactosamina, galactosa, mañosa, GlcNAc, glucosa, fucosa o xilosa) a una cadena lateral de hidroxi de- un ácido hidroxiamino, en - lugar de serina o treonina, aunque también se puede utilizar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina. Por ejemplo, en una modalidad, el G-CSF es expresado en un sistema de mamífero y es modificado por medio del tratamiento de sialidasa para ordenar nuevamente los residuos de ácido siálico terminales, seguidos por la modificación por PEG utilizando ST3Gal3 y un donador de PEG-ácido siálico. En otra modalidad ejemplar, el G-CSF expresado en células de mamífero es tratado primero con sialidasa para ordenar nuevamente los residuos de ácido siálico terminales, luego modificado por PEG utilizando ST3Gal3 y un donador de PEG-ácido siálico y luego sialilado utilizando ST3Gal3 y un donador de 'ácido siálico. El G-CSF expresado en un sistema de mamífero también puede ser tratado con sialidasa y galacbosidasa para ordenar nuevamente sus residuos de ácido siálico y galactosa, luego galactosilado utilizando un donador de galactosa y una galactosiltransferasa y luego modificado por PEG utilizando ST3Gal3 y un donador de PEG-ácido siálico. En todavía otra modalidad ejemplar, el G-CSF no es tratado primero con sialidasa, sino que es modificado por glico-PEG utilizando una reacción de transferencia de ácido siálico con el cásete de grupo modificador-ácido siálico y una enzima tal como ST3Gal3. En una modalidad ejemplar adicional, el G-CSF es expresado en células de insecto y es modificado en el siguiente procedimiento: se adiciona primero N-acetilglucosamina al G-CSF utilizando un donador de N-acetilglucosamina apropiado y uno o más de GnT-I, II, IV y V; el G-CSF entonces es modificado por PEG utilizando un donador de PEG-galactosa y una galactosiltransferasa. El G-CSF producido en levadura también puede ser modificado por glico-PEG. Por ejemplo, el G-CSF es tratado primero con endoglicanasa para ordenar nuevamente los grupos glicosilo, es galactosilado utilizando un donador de galactosa y una galactosil-transferasa y luego es modificado por PEG con "ST3Gall y un donador de PEG-ácido siálico. La adición de sitios de glicosilación a un péptido u otra estructura se realiza convenientemente al alterar la secuencia de aminoácidos de tal manera que contenga uno o más sitios de glicosilación. La adición también se puede hacer por medio de la incorporación de una o más especies presentando un grupo -OH, en lugar de residuos de serina o treonina, dentro de la secuencia del péptido G-CSF (para los sitios de glicosilación unidos a 0) . La adición se puede realizar por medio de la mutación o por medio de la síntesis química completa del péptido de G-CSF. La secuencia de aminoácidos del péptido de G-CSF es alterada en lugar de a través de cambios en el nivel de ADN, particularmente por medio de la mutación del ADN que codifica el péptido en bases preseleccionadas de tal manera que se generen codones que se traducirán en los aminoácidos deseados. La(s) mutación (es) de ADN se realiza (n) en lugar de utilizando métodos conocidos en el campo. En una modalidad ejemplar, el sitio de glicosilación se adiciona al entremezclar polinucleótidos. Los polinucleótidos que codifican un péptido candidato se pueden modular con protocolos de entremezclado de ADN. El entremezclado de ADN es un proceso de recombinación y mutación recurrentes, realizado por medio de la fragmentación aleatoria de una acumulación de genes relacionados, seguido por el reensamblaje de los fragmentos por medio de un proceso similar a la reacción en cadena de la polimerasa. Véase por ejemplo Stemmer, Proc. Nati . Acad. Sci . EUA 91 : 1-0747-10751 (1994); Stemmer, Nature 370:389-391 (1994); y las patentes norteamericanas Nos. 5,605,793, 5,837,458, 5,830,721 y 5,811,238. La presente invención también proporciona medios para adicionar (o retirar) uno o más residuos de glicosilo seleccionados a un péptido, después de lo cual un azúcar modificado se conjuga a al menos uno de los residuos de glicosilo seleccionados del péptido. La presente modalidad es útil, por ejemplo, cuando se desea conjugar el azúcar modificado a un residuo de glicosilo seleccionado que ya sea no está presente en un péptido o no está presente en una cantidad deseada. De esta manera, antes de acoplar un azúcar modificado a un péptido, el residuo de glicosilo seleccionado se conjuga al péptido de G-CSF por medio del acoplamiento enzimático o químico. En otra modalidad, el patrón de glicosilación de un glicopéptido es alterado antes de la conjugación del azúcar modificado por medio de la remoción de un residuo de carbohidrato del "glicopéptido. Véase, por ejemplo, el documento WO 98/31826. La adición o la remoción de cualquier porción de carbohidrato presente en el glicopéptido se realizan ya sea de manera química o enzimática. La desglicosilación química es originada en lugar de por la exposición de la variante de polipéptido al compuesto ácido trifluor-ometanosulfónico o un compuesto equivalente. Este tratamiento da por resultado la escisión de la mayoría o la totalidad de azucares excepto el azúcar de unión (N-acetilglucosamina o " N-acetilgalactosamina) , mientras que deja intacto el péptido. La desglicosilación química es descrita por' Hakimuddin y colaboradores, Arch. Biochem. Biophys . 259: 52 (1987) y por Edge y colaboradores, Anal . Biochem. 118: 131 (1981). -La escisión enzimática de porciones de carbohidrato en variantes de polipéptido se puede lograr por medio del uso de una variedad de endo- y exo-glicosidasas como es descrito por Thotakura y colaboradores, Meth. Enzymol . -138 : 350 (1987). La adición química" de porciones" de glicosilo" se lleva a cabo por medio de cualquier método reconocido en el campo. La adición enzimática de porciones de azúcar se logra en lugar de utilizando una modificación de los métodos expuestos en este documento, sustituyendo unidades de glicosilo nativas por los azucares modificados que son utilizados en la invención. Otros métodos para adicionar porciones de azúcar son descritos en las patentes norteamericanas Nos. 5,876,980, 6,030,815, 5,728,554 y 5,922,577. Los puntos de unión ejemplares para el residuo de glicosilo seleccionado incluyen, pero no están limitados a: <a) sitios consensúales para la N- y O-glicosilación; (b) porciones de glicosilo terminales que son receptoras para una glicosiltransférasa; (c) arginina, ásparáragi?a e histidina; (d) grupos carboxilo libres; (e) grupos sulfhidrilo libres tales como aquellos de cisteína; (f) grupos hidroxilo libres tales como aquellos de serina, treonina o hidroxiprolina; (g) residuos aromáticos tales como aguellos de fenilalanina, tirosina o triptofano; o (h) el grupo amida de glutamina. Los métodos ejemplares para el uso en la presente invención son descritos en el documento WO 87/05330 publicado el 11 de Septiembre de 1987 y en Aplin y Wriston, CRC CRIT. REV. BIOCHEM., páginas 259-306 (1981).

Los Métodos Además de los conjugados descritos anteriormente, la presente invención proporciona métodos para preparar estos y otros conjugados. Además, la invención proporciona métodos para prevenir, curar o mejorar un estado- de enfermedad al administrar un conjugado de la invención a un sujeto en riesgo de desarrollar la enfermedad o a un sujeto que tiene la enfermedad. De esta manera, la invención proporciona un método para formar un conjugado .covalente entre una porción seleccionada y un péptido de G-CSF. En las modalidades ejemplares, el conjugado se. forma entre un polímero soluble en agua, una porción terapéutica, una porción de fijación de objetivos o una biomolécula y un péptido de G-CSF glicosilado o no glicosilado. El polímero, porción terapéutica o biomolécula es conjugado con el péptido de G-CSF por vía de un grupo de unión de glicosilo, el cual es interpuesto entre y unido covalentemente tanto al péptido como al grupo modificador (por ejemplo, un polímero soluble en agua) . El método incluye poner en contacto el péptido de G-CSF con una mezcla que contiene un azúcar modificado y una enzima, por ejemplo, una glicosiltransferasa, que conjuga el azúcar modificado con el substrato (por ejemplo, péptido, aglicona, glicolípido) . La reacción se conduce bajo condiciones apropiadas para formar un enlace covalente entre el azúcar modificado y el péptido de G-CSF. El péptido de G-CSF receptor es sintetizado típicamente de novo, o es expresado de manera recombinante en una célula procariótica (por ejemplo, célula bacteriana, tal como E. coli) o en una célula eucariótica tal como una célula de mamífero, levadura, insecto, fungal o vegetal. El péptido de G-CSF puede ser ya sea una proteína de longitud completa o un fragmento. Además, el péptido de G-CSF puede ser un péptido de tipo natural o mutado. En una modalidad ejemplar, el péptido de G-CSF incluye una mutación que adiciona uno o más sitios de glicosilación unidos a N u 0 a la secuencia del péptido. El método de la invención también proporciona la modificación de péptido de G-CSF glicosilados incompletamente que son producidos de manera recombinante . Muchas glicoproteínas producidas de manera recombinante son glicosiladas incompletamente, exponiendo los residuos de carbohidratos que pueden tener propiedades indeseables, por ejemplo, inmunogenicidad, reconocimiento por medio de RES. Empleando un azúcar modificado en un método de la invención, el péptido puede ser glicosilado simultáneamente además y derivatizado con, por ejemplo, un polímero soluble en agua, un agente terapéutico o similares. La- porción de azúcar del azúcar modificado puede ser un residuo que sería conjugado apropiadamente al receptor en un péptido completamente glicosilado u otra porción de azúcar con propiedades deseables. Los métodos ejemplares para modificar péptidos para el uso en la presente invención son expuestos en los documentos WO 04/099231, WO 03/031464 y las referencias expuestas en los mismos. En una modalidad ejemplar, la invención proporciona un método para elaborar un G-CSF modificado por PEG que comprende la porción: en donde D es -OH o R1-L-HN- . El símbolo .G representa R1-L- o -C (O) -alquilo de 1 a 6 átomos de carbono- R1 es una porción que comprende un residuo de poli (etilenglicol) de cadena recta o ramificada. El símbolo L representa un conector seleccionado de un enlace, alquilo sustituido o no sustituido y heteroalquilo sustituido o no sustituido. En general, cuando D es OH, G es R1-L- y cuando G es -C (0) -alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, D es R1-L-NH-, El método de la invención incluye (a) poner en contacto un péptido de G-CSF de substrato con un donador de PEG-ácido siálico . y una enzima que es capaz de transferir la porción de PEG-ácido siálico del donador al péptido de G-CSF de substrato. Un donador de PEG-ácido siálico ejemplar es un azúcar de nucleótidos de manera que que tiene la fórmula: y una enzima que transfiere el PEG-ácido siálico sobre un residuo de aminoácido o glicosilo del péptido de G-CSF, bajo condiciones apropiadas para la transferencia. En una modalidad, el péptido de G-CSF de substrato es expresado en una célula hospedante antes de la formación del conjugado de la invención. Una célula hospedante ejemplar es una célula de mamífero. En otras modalidades, la célula hospedante es una célula de insecto, una célula vegetal, una bacteria o un hongo. El método presentado en este documento es aplicable a cada uno de los conjugados de G-CSF expuestos en las secciones anteriores . Los péptidos de G-CSF modificados por medio de los métodos de la invención pueden ser péptidos sintéticos o de tipo natural o pueden ser péptidos mutados, que son producidos por medio de métodos conocidos en el campo, tal como la mutagénesis dirigida al sitio. La glicosilación de péptidos es típicamente ya sea unida a N o -unida a O. Una unión a N ejemplar es la unión del azúcar modificado a la cadena lateral de un residuo de asparagina. La secuencia de tres péptidos de asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de una porción de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. De esta manera, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tres péptidos en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. La glicosilación unida a O se refiere a la unión de un azúcar (por ejemplo, N-acetilgalactosamina, galactosa, mañosa, GlcNAc, glucosa, fucosa o xilosa) a la cadena lateral de hidroxi de un ácido hidroxiamino, en lugar de serina o treonina, aunque los aminoácidos inusuales o no usuales, por ejemplo, 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina también se pueden utilizar. La adición de sitios de glicosilación a un péptido u otra estructura se realiza convenientemente al alterar la secuencia de aminoácidos de tal manera que contenga uno- o más sitios" de glicosilación. La adición también se puede realizar por medio de la incorporación de una o más especies que presentan un grupo -OH, en lugar de residuos de serina o treonina, dentro de la secuencia del péptido (para sitios de glicosilación unidos a O) . La adición se puede realizar por medio de la mutación o por medio de la síntesis química completa del péptido. La secuencia de aminoácidos del péptido es alterada en lugar de a través de cambios a nivel del ADN, particularmente por medio de la mutación del ADN que codifica el péptido en bases preseleccionadas de tal manera que se generen codones que. se traducirán- en los aminoácidos deseados. La(s) mutación (es) de ADN se realiza (n) . en lugar de utilizando métodos conocidos en el campo. En una modalidad ejemplar, el sitio de glicosilación se adiciona al entremezclar los polinucleótidos. Los polinucleótidos que codifican un péptido candidato pueden ser modulados con protocolos . de entremezclado de ADN. El entremezclado de ADN es un proceso de recombinación y mutación recurrentes, realizado por medio de la fragmentación aleatoria de una acumulación de genes relacionados, seguida por el reensamblaje de los fragmentos por medio de un proceso similar a la reacción en cadena de la polimerasa. Véase, por ejemplo, Stemmer, Proc. Nati . Acad.

Sci . EUA 91:10747-10751 (1994); Stemmer, Nature 370:389-391 (1994); y las patentes norteamericanas Nos. 5,605,793, 5,837,458, 5,830,721 y 5,811,238. Los métodos ejemplares para adicionar o retirar sitios de glicosilación y para adicionar o retirar estructuras o subestructuras de glicosilo son descritos en detalle en los documentos WO 04/099231, WO 03/031464 y las solicitudes norteamericanas y del PCT relacionadas . _ La presente invención también utiliza medios para adicionar (o retirar) uno o más residuos de glicosilo seleccionados a un péptido de G-CSF, después de lo cual un azúcar modificado es conjugado con al menos uno de los residuos de glicosilo seleccionados del péptido. Estas técnicas son útiles, por ejemplo, cuando se desea conjugar el azúcar modificado a un residuo de glicosilo seleccionado que ya sea no está presente en un péptido de G-CSF o que no esté presente en una cantidad deseada. De esta manera, antes del acoplamiento de un azúcar modificado a un péptido, el residuo de glicosilo seleccionado es conjugado con el péptido de G-CSF por medio del acoplamiento enzimático o químico. En otra modalidad, el patrón de glicosilación de un glicopéptido es alterado antes de la conjugación del azúcar modificado or medio de la remoción de un residuo de carbohidrato del glicopéptido. Véase, por ejemplo el documento WO 98/31826. Los puntos de unión ejemplares para el residuo de glicosilo seleccionado incluyen, pero no están limitados a: (a) sitios consensuales para la glicosilación unida a N y sitios para la glicosilación unida a O; (b) porciones de glicosilo terminales que son receptoras para una glicosiltransferasa; (c) arginina, asparagina e histidina; -(d) grupos carboxilo libres; (e) grupos sulfhidrilo libres tales como aquellos de cisteína; (f) grupos hidroxilo libres tales como aquellos de serina, treonina o hidroxiprolina; (g) residuos aromáticos tales como aquellos . de fenilalanina, tirosina o triptofano; o (h) el grupo amida de glutamina. Los métodos ejemplares . para el uso en la presente invención son descritos en el documento WO 87/05330 publicado el 11 de Septiembre de 1987 y en Aplin y Wriston, CRC CRIT. REV. BIOCHEM. , páginas 259-306 (1981) , Los azucares modificados por PEG se conjugan a un péptido glicosilado o no glicosilado utilizando una enzima apropiada para mediar la conjugación. En -lugar de, las concentraciones del (los) azúcar (es) donador (es), modificado (s) , enzima (s) y péptido (s) receptor (es) se-seleccionan de tal manera que la glicosilación proceda hasta que se alcance el grado deseado de modificación del receptor. Las consideraciones descritas posteriormente, mientras que se exponen en el contexto de una sialiltransferasa, son aplicables generalmente a otras reacciones de glicosiltransferasas . Se conoce una variedad de métodos para utilizar las glicosiltransferasas para sintetizar las estructuras de oligosacáridos deseadas y son aplicables generalmente para la presente invención. Los métodos ejemplares se describen, por ejemplo, en el documento WO 96/32491, Ito y colaboradores, Puré Appl . Chem. 65: 753 (1993) y las patentes norteamericanas Nos. 5,352,670, 5,374,541 y 5,545,553 y las patentes norteamericanas de propiedad común Nos. 6,399,336 y 6,440,703 las cuales se incorporan en este documento a manera de referencia. La presente invención se practica utilizando una sola glicosiltransferasa o una combinación de glicosiltransferasas. Por ejemplo, uno puede utilizar una combinación de una sialiltransferasa y una galactosiltransferasa. En aquellas modalidades que utilizan más de una enzima, las enzimas y los substratos se combinan en lugar de en una mezcla de reacción inicial, o las enzimas y los reactivos para una segunda reacción enzimática se adicionan al medio de reacción una vez que la primera reacción enzimática se completa o casi se completa. Al conducir dos reacciones enzimáticas en secuencia en un recipiente individual, los rendimientos totales son mejorados sobre los procedimientos en los cuales se aisla una especie intermedia. Además, la limpieza y la eliminación de solventes adicionales y subproductos se reduc . En una modalidad preferida, cada una de la primera enzima y la segunda enzima es una glicosiltransferasa. En otra modalidad preferida, una enzima es una endoglicosidasa. En una modalidad preferida adicional, se utilizan más de dos enzimas para ensamblar la glicoproteína modificada de la invención. Las enzimas se utilizan para alterar una estructura de sacáridos en el péptido de G-CSF en cualquier punto, ya sea antes o después de la adición del azúcar modificado al péptido. En otra modalidad, el método hace uso de una o más exo- o endoglicosidasas. La glicosidasa es típicamente mutante, la cual está diseñada para formar enlaces de glicosilo en lugar de que escindirlos. La glicanasa mutante incluye típicamente una sustitución de un residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido, de sitio activo, ácido. Por ejemplo, cuando la endoglicanasa es endo-H, los residuos de sitio activo, sustituidos serán típicamente Asp en la posición 130, Glu en la posición 132 o una combinación de los mismos. Los aminoácidos son reemplazados generalmente por serina, alanina, asparagina o glutamina. La enzima mutante cataliza la reacción, usualmente por medio de un paso de síntesis que es análogo para la reacción inversa del paso de hidrólisis de endoglicanasa. En estas modalidades, la molécula donadora de glicosilo (por ejemplo, una estructura de oligo- o mono-sacárido deseada) contiene un grupo saliente y la reacción procede con la adición de la molécula donadora a un residuo de GlcNAc en la proteína. Por ejemplo, el grupo saliente puede ser un halógeno, tal como fluoruro. En otras modalidades, el grupo saliente es un Asn o una porción de Asn-péptido. En modalidades todavía adicionales, el residuo de GlcNAc en la molécula donadora de glicosilo es modificado. Por ejemplo, el residuo de GlcNAc puede comprender una porción de 1,2-oxazolina. En una modalidad preferida, cada una de las enzimas utilizadas para producir un conjugado de la invención está presente en una cantidad catalítica. La cantidad catalítica de una enzima particular varía de acuerdo con la concentración de ese substrato de enzima así como también de acuerdo con las condiciones de reacción, tales como temperatura, tiempo y valor de pH. Los medios para determinar la cantidad catalítica para una enzima proporcionada bajo concentraciones de substrato preseleccionadas y las condiciones de reacción son bien conocidos para aquellas personas expertas en el campo. La temperatura a la cual se lleva a cabo el procedimiento anterior puede variar de escasamente sobre el congelamiento a la temperatura a la cual se desnaturaliza la enzima más sensible . Los rangos de temperatura preferidos son de aproximadament 0°C a aproximadamente 55°C y, más en lugar de, de aproximadamente 20°C a aproximadamente 37°C. En otra modalidad ejemplar, uno o más componentes del presente método son conducidos a una temperatura elevada utilizando una enzima termofílica. La mezcla de reacción se mantiene durante un periodo de tiempo suficiente para que el receptor sea glicosilado, formando con lo cual el conjugado deseado. Algo del conjugado se puede detectar frecuentemente después de algunas horas, con cantidades recuperables que se obtienen usualmente dentro de 24 horas o menos. Aquellas personas expertas en el campo entenderán que la velocidad de reacción es dependiente de una variedad de factores variables (por ejemplo, concentración de enzimas, concentración de donadores, concentración de receptores, temperatura, volumen de solvente) , los cuales son optimizados para un sistema seleccionado. La presente invención también proporciona la producción a escala industrial de péptidos modificados. Como se utiliza en este documento, una escala industrial produce en general al menos un gramo de conjugado purificado, terminado. En la descripción que sigue, la invención es ejemplificada por la conjugación de porciones de ácido siálico modificado a un péptido glicosilado. El ácido siálico modificado, ejemplar es etiquetado con P?G. El enfoque de la siguiente descripción sobre el uso de ácido siálico modificado por PEG y péptidos glicosilados es por claridad de ilustración y no se propone que implique que la invención está limitada a la conjugación de estos dos compañeros. Una persona experta en el campo entiende que . la descripción es aplicable generalmente a las adiciones de porciones de glicosilo modificado diferentes de ácido siálico. Además, la descripción es igualmente aplicable a la modificación de una unidad de glicosilo con agentes diferentes de PEG que incluyen otras porciones de PEG, porciones terapéuticas y biomoléculas. Se puede utilizar un planteamiento enzimático para la introducción selectiva de carbohidratos modificados por PEG o PPG en un péptido o glicopéptido. El método utiliza azucares modificados que contienen PEG, PPG o un grupo funcional, reactivo, enmascarado y se combina con la glicosiltransferasa o la glicosintasa apropiada. Al seleccionar la glicosiltransferasa que hará la unión de carbohidrato deseada y al utilizar el azúcar, modificado como el substrato donador, el PEG o PPG se puede introducir directamente en la estructura principal del péptido de G-CSF, sobre los residuos de azúcar existentes de un glicopéptido o sobre los residuos de azúcar que han sido adicionados a un péptido. Un receptor para la sialiltransferasa está presente en el péptido de G-CSF a ser modificado por los métodos de lá presente invención ya sea como una estructura de origen natural o una estructura colocada ahí de manera recombinante, enzimática o química. Los receptores adecuados incluyen, por ejemplo, receptores de galactosilo, tales como Galßl,4GlcNAc, Galßl,4GalNAc, Galßl, 3GalNAc, lacto-N-tetraosa, Galßl,3GlcNAc, Galßl,3Ara, Galßl, 6GlcNAc, Galßl,4Glc (lactosa) , y otros receptores conocidos para aquellas personas expertas en el campo (véase, por ejemplo, Paulson y colaboradores, J. Biol . Chem. 253: 5617-5624 (1978)). En una modalidad, un " receptor para la sialiltransferasa está presente en el glicopéptido a ser modificado con la síntesis in vivo del glicopéptido. Estos glicopéptidos pueden ser sialilados utilizando los métodos reclamados sin una modificación previa del patrón de glicosilación del glicopéptido. Alternativamente, los métodos de la invención se pueden utilizar para sialilar un péptido que no incluye un receptor adecuado; uno modifica primero el péptido de G-CSF para incluir un receptor por medio de métodos conocidos para aquellas personas expertas en el campo. En una modalidad ejemplar, se adiciona un residuo de GalNAc por medio de la acción de una GalNAc transferasa. En una modalidad ejemplar, "el receptor de galactosilo es ensamblado al unir un residuo de galactosa a un receptor apropiado que está unido al péptido de G-CSF, por ejemplo, un GlcNAc. El método incluye incubar el péptido de G-CSF a modificarse con una mezcla de reacción que contiene una- cantidad adecuada de una galactosiltransferasa (por ejemplo, Galßl,3 o Galßl,4), y un donador de galactosilo adecuado (por ejemplo, UDP-galactosa) . La reacción se deja proceder sustancialmente hasta la terminación o, alternativamente, la reacción se termina cuando se adiciona una cantidad preseleccionada del residuo de galactosa. Otros métodos para ensamblar un receptor .de sacárido seleccionado serán aparentes para aquellas personas expertas en el. campo. En todavía otra modalidad, los oligosacáridos unidos a glicopéptidos son "ordenados" primero, ya sea como un total o en parte, para exponer ya sea un receptor para la sialiltransferasa o una porción a la cual se pueden adicionar uno o más residuos apropiados para obtener un receptor adecuado. Las enzimas, tales como glicosiltransferasas y endoglicosidasas (véase, por ejemplo la patente norteamericana No. 5,716,812) son útiles para las reacciones de unión y ordenamiento. En la descripción que sigue, el método de la invención es ejemplificado por el uso de azucares modificados que tienen una porción de PEG unida a los mismos. El enfoque de la descripción es para claridad de ilustración. Aquellas personas expertas apreciarán que la descripción es igualmente relevante para aquellas modalidades en las cuales el azúcar-modificado lleva una porción terapéutica, biomolécula o similares .

En una modalidad ejemplar de la invención en la cual un residuo de carbohidrato es "ordenado" antes de la adición del azúcar modificado, la mañosa alta es ordenada nuevamente a la estructura de dos antenas de primera generación. Un azúcar modificado que lleva una porción de PEG es conjugado con uno o más de los residuos de azúcar expuestos por el "ordenamiento nuevamente" . En un ejemplo,, una porción de PEG se adiciona por vía de una porción de GlcNAc conjugada a la porción de PEG. La porción de GlcNAc modificada se une a uno o ambos residuos de mañosa terminales de la ' estructura de dos antenas. Alternativamente, se puede. adicionar un GlcNAc no modificado a una o ambas terminaciones de las especies ramificadas. En otra modalidad ejemplar, una porción de PEG se adiciona a uno o- ambos residuos de ma osa terminales de la estructura de dos antenas por vía de un azúcar modificado que tiene un residuo de galactosa, el cual es conjugado con un residuo de GlcNAc adicionado en los residuos de mañosa terminales. Alternativamente, un Gal no modificado se puede adicionar a uno o ambos residuos de GlcNAc terminales. En todavía un ejemplo adicional, una porción de PEG se adiciona a un residuo de Gal utilizando un ácido siálico modificado. En otra modalidad ejemplar, una estructura de mañosa alta es "ordenada nuevamente" a la mañosa de la cual se ramifica la estructura de dos antenas. En un ejemplo, una porción de PEG se adiciona por vía de un GlcNAc modificado por el polímero. Alternativamente, un GlcNAc no modificado se adiciona a la mañosa, seguido por un Gal con una porción de PEG unida. En todavía otra modalidad, los residuos de GlcNAc y Gal no modificados se adicionan secuencialmente a la mañosa, seguido por una porción de ácido siálico modificada con una porción de PEG. En una modalidad ejemplar adicional, la mañosa alta es "ordenada nuevamente" al GlcNAc al cual se une la primera mañosa. El GlcNAc es conjugado a un residuo de Gal que lleva una porción de PEG. Alternativamente, un Gal no modificado se adiciona al GlcNAc, seguido por la adición de un ácido siálico modificado con un azúcar soluble en agua. En todavía un ejemplo adicional, el GlcNAc terminal es conjugado con Gal y el GlcNAc es fucosilado subsecuentemente con una fucosa modificada que lleva una porción de PEG. La mañosa alta también puede ser ordenada nuevamente al primer GlcNAc unido al Asn del péptido. En un ejemplo, el GlcNAc del residuo de GlcNAc- (Fue) a es conjugado con ha GlcNAc que lleva un polímero soluble n agua. En otro ejemplo, el GlcNAc del residuo del GlcNAc- (Fuc)a es modificado con Gal, el cual lleva un polímero soluble en agua. En una modalidad aún adicional, el GlcNAc es modificado con Gal, seguido por la conjugación con el Gal de un ácido siálico modificado con una porción de PEG. Otras modalidades ejemplares se exponen en las publicaciones de solicitud de patente norteamericanas de propiedad común: 20040132640; 20040063911; 20040137557; solicitudes de patente norteamericanas Nos. 10/369,979; 10/410,913; 10/360,770; 10/410,945 y PCT/US02/32263.cada una de las cuales es incorporada en este documento a manera de referencia. Los ejemplos expuestos anteriormente proporcionan una ilustración del poder de los métodos expuestos en este documento. Utilizando los métodos descritos en este documento, es posible "ordenar nuevamente" y construir un residuo de carbohidrato de sustancialmente cualquier estructura deseada. El azúcar modificado se puede adicionar a las terminaciones de la porción de carbohidrato expuestas anteriormente o se puede interponer entre el núcleo de péptido y las terminaciones del carbohidrato. En una modalidad ejemplar, un ácido siálico existente es retirado de un glicopéptido de G-CSF utilizando una sialidasa, desenmascarando con lo cual todos o la mayoría de los residuos de galactosilo subyacentes. Alternativamente, un péptido o glicopéptido es etiquetado con residuos de •galactosa, o un residuo de oligosacárido que termina en una unidad de galactosa. Después de la exposición de o la adición de los residuos de galactosa, -se utiliza una sialiltransferasa apropiada para adicionar un ácido siálico modificado. El planteamiento se resume en el esquema de reacción 1.

Esquema de Reacción 1 Sialiltransferasa CMP-SA-5-NHCOCH2NH — PEG(PPG) SA-5-NHCOCH2NH-PEG Glicoproteína Gal Y Q -G Gal— SA-5-NHCOCH2NH-PEG Gal I SA-5-NHCOCH2NH-PB3 En un planteamiento todavía adicional, resumido en el esquema de reacción 2, una funcionalidad reactiva, enmascarada está presente en el ácido siálico. El grupo reactivo, enmascarado no es afectado en lugar de por las condiciones utilizadas para unir el ácido siálico modificado al G-CSF. Después de la unión covalente del ácido siálico modificado al .péptido de G-CSF, la mascara se retira y el péptido de G-CSF es conjugado con un agente, tal como PEG. El • agente es conjugado ai péptido de una manera específica por medio de su reacción con el grupo reactivo no enmascarado en el residuo de azúcar modificado.

Esquema de Reacción 2 Se puede utilizar cualquier azúcar modificado expuesto en este documento con su glicosiltransferasa apropiada, dependiendo de los azucares terminales de las cadenas laterales "de oligosacáridos del glicopéptido (Tabla 1) . Como se describiera anteriormente, el azúcar terminal del glicopéptido requerido para la introducción de la estructura modificada por PEG se puede introducir de manera natural durante la expresión o se puede producir después de la expresión utilizando la(s) glicosidasa ( s ) , glicosiltransferasa ( s ) apropiadas o una mezcla de qlicosidasa^s) - y glicosiltransferasa (s) .

Tabla 1 Derivados de UDP-galactosamina Derivados de UDP-galactosa (cuando A = NH, R4 puede ser acetilo) Derivados de UDP-glucosa Derivados de UDP-glucosamina (cuando A = NH, R4 puede ser acetilo) X = O, NH, S, CH2, N- (Rr -5)2- Y = X; Z = X; A = X; B = = X. Q = H2, 0, s, NH, N-R R. R?-4 = H, ( ?onector -M, M. M = PEG, por ejemplo m-PEG En una modalidad ejemplar adicional, UDP-galactosa-PEG se hace reaccionar con ßl, 4 -galactosiltransferasa de leche de bovino, transí iriendo con lo cual la galactosa modificada a la estructura de N-acetilglucosamina terminal, apropiada. Los residuos de GlcNAc terminales en el glicopéptido se pueden producir durante la expresión, como puede ocurrir en sistemas de expresión tales como mamíferos, insectos, plantas u hongos, pero también se pueden producir por medio del tratamiento del glicopéptido con una sialidasa y/o glicosidasa y/o glicosiltransf erasa como se requiera. En otra modalidad ejemplar, una GlcNAc transferasa, tal como GNT1-5, se utiliza para transferir el GlcN modificado por PEG a un residuo de mañosa terminal en un g-licopéptido. En una modalidad ejemplar aún adicional, las estructuras de glicano unidas a N y/u O son retiradas enzimáticamente de un glicopéptido para exponer un residuo de aminoácido o un residuo de glicosilo terminal que es conjugado subsecuentemente con el azúcar modificado. Por ejemplo, una endoglicanasa se utiliza para retirar las estructuras unidas a N de un gllicopéptido para exponer un GlcNAc terminal co o un Asn unido a GlcNAc en el glicopéptido. UDP-Gal-PEG y la galactosiltransferasa apropiada se utilizan para introducir la funcionalidad de PEG-galactosa en el GlcNAc expuesto. En una. modalidad alternativa, el azúcar modificado se adiciona directamente a la estructura principal del péptido de G-CSF utilizando una glicosiltransferasa conocida para transferir los residuos de azúcar a la estructura principal del péptido. Esta modalidad ejemplar se expone en el esquema de reacción 3. Las glicosiltransferasas ejemplares que son útiles en la práctica de la presente invención incluyen, pero no están limitadas a, GalNAc transferasas (GalNAc Tl-14) , GlcNAc transferasas, fucosiltransferasas, glucosiltransferasas, xilosiltransferasas, manosiltransférasas y similares . El uso de este planteamiento permite la adición directa de azucares modificados en los péptidos que carecen de algún carbohidrato o, alternativamente, en los. glicopéptidos existentes. En ambos casos, la adición del azúcar modificado ocurre en posiciones específicas en la estructura principal del péptido definidas por la especificidad del substrato de la glicosiltransferasa y no de una manera aleatoria como ocurre durante la modificación de una estructura principal del péptido de la proteína utilizando métodos químicos. Se puede introducir un conjunto de agentes en las proteínas o glicopéptidos que carecen de la secuencia del .péptido de substrato de glicosiltransferasa por medio del diseño de la secuencia de aminoácidos apropiada en la cadena del polipéptido . Esquema de Reacción 3 En cada una de las modalidades ejemplares expuestas anteriormente, se pueden utilizar uno o más pasos adicionales de modificación química o enzimática -después de la conjugación del azúcar modificado con el péptido. En una modalidad ejemplar, una enzima (por ejemplo, fucosiltransferasa) se utiliza para anexar una unidad de glicosilo (por ejemplo, fucosa) en el azúcar modificado, terminal unido al péptido de G-CSF. En otro ejemplo,- una reacción enzimática se utiliza para "rematar" sitios en los cuales el azúcar modificado dejó de conjugarse. Alternativamente, una reacción química se utiliza para alterar la estructura del azúcar modificado, conjugado. Por ejemplo, el azúcar modificado, conjugado se hace reaccionar con agentes que estabilizan o desestabilizan su unión con el componente peptídico al cual se une el azúcar modificado. En otro ejemplo, un componente del azúcar modificado es desprotegido después de su conjugación con el péptido. Una persona experta en el campo apreciará que existe un conjunto de procedimientos enzimáticos y químicos que son útiles en los métodos de la invención en una etapa después de que el azúcar modificado se conjuga con el péptido de G-CSF. La elaboración adicional del conjugado de azúcar modificado-péptido está dentro del alcance de la invención.

Enzimas Además de las enzimas descritas anteriormente en el contexto de la formación del conjugado unido a acilo, el patrón de glicosilación del conjugado y los substratos de partida (por ejemplo, péptidos, lípidos) se puede elaborar, ordenar nuevamente o de otra manera modificar por medio de métodos que utilizan otras enzimas. Los métodos para remodelar péptidos y lípidos utilizando enzimas que transfieren un donador de azúcar a un receptor son descritos con mayor detalle en DeFrees, documento WO 03/031464. A2 , publicado el 17 de /Abril de 2003. A continuación se expone una breve descripción de las enzimas seleccionadas para el uso en el presente método.

Glicosiltransferasas Las glicosiltransferasas catalizan la adición de azucares activados (NDP- o NMP-azucares donadores) , en una forma gradual, a una proteína, glicopéptido, lípido o glicolípido o al extremo no reductor de un oligosacárido crecient . Los glicopéptidos unidos a N son sintetizados por vía de una transferasa y un donador de oligosacáridos unido a lípidos Dol-PP-NAG2Glc3Man9 en una transferencia de bloques seguida por el ordenamiento del núcleo. En este caso, la naturaleza del sacárido de "núcleo" es algo diferente de las uniones subsecuentes. En el campo, se conoce una variedad muy grande de glicosiltransferasas. La glicosiltransferasa a utilizarse en la presente invención puede ser cualquiera siempre y cuando pueda utilizar el azúcar modificado como un donador de azúcar. Los ejemplos de estas enzimas incluyen la glicosiltransferasa de la vía Leloir, tal como galactosiltransferasa, N-acetilglucosaminiltransíerasa, N-acetilgalactosaminil-transferasa, fucosiltransferasa, sialiltransferasa, manosiltransferasa, xilosiltransferasa, glucurononil-transf rasa y similares. Para las sacárido-sintasas enzimáticas que incluyen reacciones de glicosiltransferasa, la glicosiltransferasa se puede clonar o aislar de cualquier fuente. Se conocen muchas glicosiltransferasas clonadas, así como también sus secuencias de polinucleótidos. Véase, por ejemplo, "The WWW Guide To Cloned Glycosyltransferases" , (http : //www.vei . co.uk/TGN/gt_guide .htm) . Las secuencias de aminoácidos y las secuencias de nucleótidos de glicosiltransferasa que codifican las glicosiltransferasas de las cuales se pueden deducir las secuencias de aminoácidos también se encuentran en diversas bases de datos disponibles para el público que incluyen GenBank, Swiss-Prot, EMBL y otras . Las glicosiltransferasas que se pueden emplear en los métodos de la invención incluyen, pero no están limitadas a, galactosiltransferasas, fucosiltransferasas, glucosiltransferasas, N-acetilgalactosaminiltransferasas, N-acetilglucosaminiltransferasas, glucuroniltransíerasas, sialiltransferasas, manosiltransferasas, transferasas de" ácido glucurónico, transferasas de ácido galacturónico y oligosacariltransferasas. Las glicosiltransferasas adecuadas incluyen aquellas obtenidas de células eucarióticas, así como también de células procarióticas . El ADN que codifica las glicosiltransferasas se puede obtener mediante la síntesis química, mediante la selección de transcripciones inversas de ARNm de células apropiadas o cultivos de líneas celulares, mediante la selección de bibliotecas genómicas de células apropiadas o or medio de combinaciones de estos procedimientos. La selección de" ARNm o ADN genómico se puede llevar a cabo con sondas de oliqonucleótidos generadas a partir de la secuencia genética de las glicosiltransfcrasas. Las sondas pueden etiquetarse con un grupo detectable, tal como un grupo fluorescente, un átomo radioactivo o un grupo quimioluminiscente de acuerdo con procedimientos conocidos y se pueden utilizar en ensayos de hibridización convencionales. En una alternativa, las secuencias genéticas de las glicosiltransferasas se pueden obtener mediante el uso del procedimiento de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) , con los cebadores de oligonucleótidos de PCR que son producidos a partir de la secuencia genética de las glicosiltransferasas. Véase, la patente norteamericana No. 4,683,195 expedida a Mullís y colaboradores y la patente norteamericana No. 4,683,202 expedida a Mullís. La glicosiltransferasa se puede sintetizar en células hospedantes transformadas con vectores que contienen el ADN que codifica la enzima glicosiltransferasa. Los vectores se utilizan ya sea para amplificar el ADN que codifica la enzima glicosiltransferasa y/o para expresar el ADN que codifica la enzima glicosiltransferasa. Un vector de expresión es una construcción de ADN replicable en la cual una secuencia de ADN que codifica la enzima glicosiltransferasa es unida de manera operable a las secuencias de control adecuadas que son capaces de efectuar la expresión de la enzima glicosiltransferasa en un hospedante adecuado. La necesidad de estas secuencias de control variará dependiendo del hospedante seleccionado y el método de transformación seleccionado. Generalmente, .las secuencias de control incluyen un promotor de transcripción, una secuencia operadora opcional para controlar la transcripción, una secuencia que codifica los sitios de enlace ribosómicos de ARNm adecuados y las secuencias que controlan la terminación de la transcripción y la traducción. Los vectores de amplificación no requieren la expresión de. dominios de control . Todo lo que se necesita es la capacidad para replicarse en un hospedante, conferida usualmente por un origen de replicación y un gen de selección para facilitar el reconocimiento de los transformantes. En una modalidad ejemplar, la invención utiliza una enzima procariótica. Estas glicosiltransferasas incluyen enzimas involucradas en la síntesis de lipopoligosacáridos (LOS) , los cuales son producidos por muchas bacterias gramnegativas (Preston y colaboradores, Cri tical Reviews in Microbiology 23(3): 139-180 (1996)). Estas enzimas incluyen, pero no están limitadas a, las proteínas de los operones rfa de especies tales como E. coli y Salmonella typhimurium, las cuales incluyen una ßl, 6-galactosiltransferasa y una ßl,3-galactosiltransferasa (véase, por ejemplo, los Accesos de EMBL Nos. M80599 y M86935 (E. coli) ; Acceso de EMBL No. S56361 (S. typhimurium) ) , una glucosiltransferasa (Acceso de Swiss-Prot No. P25740 (E. coli) , - una ßl,2-glucosiltransferasa (rfaJ) (Acceso de Swiss-Prot No. P27129 (E. coli) y Acceso de Swiss-Prot No. P19817 (S. typhimurium) ) y una ßl, 2-N-acetilglucosaminiltransferasa (rfaK) (Acceso de EMBL No. U00039 (E. coli) . Otras glicosiltransferasas para las cuales son conocidas las secuencias de aminoácidos incluyen aquellas que son codificadas por operones, tales como rfaB, las cuales han sido caracterizadas en organismos tales como Klebsiella pneumoniae, - E. coli, Salmonella typhimurium, Salmonella entérica, Yersinia enterocoli tica, Mycobacterium leprosum y el operón rhl de Pseudomonas aeruginosa . También son adecuadas para el uso en la presente invención las glicosiltransferasas que están incluidas en la producción de estructuras que contienen lacto-N-neotetraosa, D-galactosil-ß-l,4-N-acetil-D-glucosaminil-ß-l,3-D- galactosil-ß-l,4-D-glucosa y la secuencia de tres sacáridos del grupo sanguíneo Pk, D-galactosil-a-1, 4-D-galactosil-ß- 1, 4-D-glucosa, las cuales han sido identificadas en los LOS de los agentes patógenos de mucosas Neisseria gonnorhoeae y N. meningitidis (Scholten y colaboradores, J. Med. Microbiol . 41: 236-243 (1994)). Los genes de N. meningi tidis y N. gonorrhoeae que codifican las glicosiltransferasas - -involucradas en la biosíntesis de estas estructuras han sido identificados a partir de los inmunotipos L3 y Ll de N. meningi tidis (Jennings y colaboradores, Mol . Microbiol . 18: 729- '40 (1995)) y el mutante F62 dé N.. gonórrhoeae (Gotshlich, J. Exp. Med. 180: 2181-2190 (1994)). En N. meningi tidis, un sitio que consiste de tres genes, lgtA, lgtB y Ig E, codifica las enzimas glicosiltransferasas requeridas para la adición de los últimos tres azucares en la cadena lacto-N-neotetraosa (Wakarchuk y colaboradores, J. Biol . Chem. 271: 19166—73 (1996)). Recientemente se demostró la - actividad enzimática del producto genético de IgrtB y IgtA, proporcionado la primera evidencia directa para su función de glicosiltransferasa propuesta (Wakarchuk y colaboradores, J. Biol . Chem. 271(45): 28271-276 (1996)). En N. gonorrhoeae, existen dos genes adicionales, IgtD- el cual adiciona ß-D- Gal?Ac a la posición 3 de la galactosa terminal de la estructura de lacto-N-neotetraosa y IgtC el cual adiciona un a-D-Gal terminal al elemento de lactosa de un LOS truncado, creando de esta manera la estructura antigénica del grupo sanguíneo P (Gotshlich (1994), supra . ) . En -N. meningi tidis, un inmunotipo Ll separado también expresa -el antígeno del grupo sanguíneo Pk y se ha mostrado que lleva un gen lgtC (Jennings y colaboradores, (1995), supra . ) . Las glicosiltransferasas de Neisseria y los genes asociados también se describen en la patente USP? 5,545,553 (Gotschlich) . Los genes para una al,2-fucosiltransferasa y una al,3-fucosiltransferasa de Helicobacter pylori también han sido caracterizados (Martin y colaboradores, J. Biol . Chem. 272: 21349-21356 (1997)). Las glicosiltransferasas de Campylobacter jejuni también se utilizan en la presente invención (véase, por ejemplo, http://afmb.cnrs-mrs . fr/~pedro/CAZY/gtf_42.html) .

Fucosiltransf erasas En algunas modalidades, una glicosiltransferasa utilizada en el método de la invención es una fucosiltransferasa. Las fucosiltransfcrasas son conocidas para aquellas personas expertas en el campo. Las fucosiltransferasas ejemplares incluyen enzimas, las cuales transfieren la L-fucosa de GDP-fucosa a una posición hidroxi de un azúcar receptor. Las fucosiltransferasas que transfieren los azucares diferentes de nucleótidos a un receptor también se utilizan en la presente invención. En algunas modalidades, el azúcar receptor es, por ejemplo, el residuo GlcNAc en un grupo Galß (l-»3,4)GlcNAcß-en un glicósido de oligosacárido. Las fucosiltransferasas adecuadas para esta reacción incluyen la Galß (l-»3,4)GlcNAcßl-a(l?3, 4) fucosiltransferasa (FTIII E.C. No. 2.4.1.65), la cual fue caracterizada primero a partir de la leche humana (véase, Palcic y -colaboradores, Carbohydrate Res . 190: 1-11 (1989); Prieels y colaboradores, J. Biol . Chem. 256: 10456-10463 (1981); y Nunez y colaboradores, Can. J. Chem. 59: 2086-2095 (1381)) y las Galß (1?4) GlcNAcß-afucosiltransferasas (FTIV, FTV, FTVI) las cuales se encuentran en el suero humano. La FTVII (E.C. No. 2.4.1.65), una sialil-a(2->3)Galß ( (l-»3)GlcNAcß-fucosiltransferasa, también- ha sido caracterizada. Una forma recombinante de la Galß (l-»3,4)GlcNAcß~a (1?3, 4) fucosiltransferasa también ha sido caracterizada (véase, Dumas y colaboradores, Bioorg. Med. Letters 1: 425-428 (1991) y Kukowska-Latallo y colaboradores, Genes and Development 4: 1288-1303 (1990)). Otras fucosiltransferasas ejemplares incluyen, por ejemplo, la al, 2fucosiltransferasa (E.-C. No. 2.4.1.69). La fucosilación enzimática se puede llevar a cabo por medio de los métodos descritos en Mollicone y colaboradores, Eur. J. Biochem. 191: 169-176 (1990) o en la patente norteamericana No. 5,374,655. Las células que se utilizan para producir una fucosiltransferasa también incluirán un sistema enzimático para sintetizar la GDP-fucosa.

Galactosiltransf erasas En otro grupo de modalidades, la glicosiltransferasa es una galactosiltransferasa. Las galactosiltransferasas ejemplares . incluyen las a(l, 3)qalactosiltransferasas (E.C. No. 2.4.1.151, véase, por ejemplo, Dabkowski y colaboradores, Transplant Proc. 25: 2921 (1993) y Yamamoto y colaboradores, Nature 345: 229-233 (1990) , bovinas (GenBank J04989, Joziasse y colaboradores, J. Biol . Chem. 2-64: 14290-14297 (1989)), .murinas (GenBank m26925; Larsen y colaboradores, Proc. Nat 'l . Acad. Sci . EUA 86: 8227-8231 (1989)), porcinas (GenBank L36152; Strahan y colaboradores, Immunogenetics 41: 101-105- (1995)). Otra al,3-galactosiltransferasa adecuada es aquella que está involucrada en la síntesis del antígeno del grupo sanguíneo B (EC 2.4.1.37, Yamamoto y colaboradores, J. Biol . Chem. 265: 1146-1151 (1990) (humano) ) . Todavía una galactosiltransferasa ejemplar, adicional es Gal-TI de núcleo. También son adecuadas para el uso en los métodos de la invención las ß (1,4) galactosiltransfcrasas, las cuales incluyen, por ejemplo, EC 2.4.1.90 (LacNAc sintetasa) y EC- 2.4.1.22 (lactosa sintetasa) (bovina (D'Agostaro y colaboradores, Eur. J. Biochem. 183: 211-217 (1989)), humana (Masri y colaboradores, Biochem. Biophys . Res . Commun. 157: 657-663 (1988)), murina (Nakazawa y colaboradores, J. Biochem. 104: 165-168 (1988)), así como también E.C. 2.4.1.38 y la ceramida galactosiltransferasa (EC 2.4.1.45, Stahl y colaboradores, J. Neuroso i . Res . 38: 234-242 (1994)). Otras galactosiltransferasas adecuadas incluyen, por ejemplo, las al,2 galactosiltransferasas (de, por ejemplo, Schizosaccharomyces pombe, Chapell y colaboradores, Mol . Biol . Cell 5: 519-528 (1994)).

Sialiltransf erasas Las sialiltransferasas son otro tipo de glicosiltransferasas que son útiles en las células recombinantes y mezclas de reacción de la invención. Las células que producen las sialiltransferasas recombinantes también producirán el CMP-ácido siálico, el cual es un donador de ácido siálico para las sialiltransferasas. Los ejemplos de sialiltransferasas que son adecuados en la presente invención incluyen ST3Gal III (por ejemplo, una ST3Gal III de rata o humana), ST3Gal IV, ST3Gal I, ST3Gal II, ST6Gal I, ST3Gal V, ST6Gal II, ST6GalNAc I, STdGalNAc II y ST6GalNAc III (la nomenclatura de las sialiltransferasas utilizada en este documento es como se describiera en Tsuji y colaboradores, Glycobiology 6: v-xiv (1996)). Una 0.(2,3) sialiltransferasa ejemplar referida como a (2, 3) sialiltransferasa (EC 2.4.99.6) transfiere ácido siálico al residuo Gal terminal, no reductor de un disacárido o glicósido de Galßl-»3Glc. Véase, Van den Eijnden y colaboradores, J. Biol . Chem. 256: 3159 (1981), Weinstein y colaboradores, J. Biol . Chem. 257: 13845 (1982) y Wen y colaboradores, J. Biol . Chem. 267: 21011 (1992). Otra a2,3-sialiltransferasa ejemplar (EC 2.4.99.4) transfiere ácido siálico al residuo Gal terminal, no reductor del disacárido o glicósido. Véase, Rearick y colaboradores, J. Biol . Chem. 254: 4444 (1979) y Gillespie y colaboradores, J. Biol . Chem. 267: 21004 (19S2). Las enzimas ejemplares, adicionales incluyen la Gal-ß-l,4-GlcNAc a-2 , 6-sialiltransferasa (Véase, Kurosawa y colaboradores, Eur. J. Biochem .. 219: 375-381 (1994)). . En lugar de, para la glicosilación de carbohidratos de glicopéptidos, la sialiltransferasa será capaz de transferir ácido siálico a la secuencia Galßl, 4GlcNAc-, la penúltima secuencia más común que es fundamental para el ácido . siálico terminal en las estructuras de carbohidratos sialiladas completamente ( véase, Tabla 2) .

Tabla 2: Sialiltransferasas que utilizan la secuencia de Galßl, 4GlcNAc como un substrato receptor 1). Goochee y colaboradores, Bio /Technology 9 : 1347-1355 (1991) 2) Yamamoto y colaboradores, J. Bioche . 120: 1O4-11O (1996) 3) Gilbert y colaboradores, J. Biol . Chem. 271: 28271- 28276 (1996) Un ejemplo de una sialiltransferasa que es útil en los métodos reclamados es ST3Gal III, la cual también es referida como a (2,3) sialiltransferasa (EC 2.4.99.6). Esta enzima cataliza la transferencia de ácido siálico al Gal de un glicósido de Galßl, 3GlcNAc o Galßl, 4GlcNAc (véase, por ejemplo, Wen y colaboradores, J. Biol . Chem. 267: 21011 (1992); "Van den Eijnden y colaboradores, J. Biol . Chem. 256: 3159 (1991) ) y es responsable de la sialilación de oligosacáridos unidos a asparagina en los glicopéptidos. El ácido siálico es unido a un Gal con la formación de una unión a entre los dos sacáridos . El enlace (unión) entre los sacáridos es entre la posición 2 de NeuAc y la posición 3 de Gal. Esta enzima particular se puede aislar del hígado de rata (Weinstein y colaboradores, J. Biol . Chem. 257: 13845 (1982)); las secuencias del ADNc humano (Sasaki y colaboradores, (1993) J. Biol . Chem. 268: 22782-22787; Kitagawa & Paulson (1994) J". Biol . Chem. 269: 1394-1401). y ADN genómico (Kitagawa y colaboradores, (1996) J. Biol . Chem. 271: 931-938) son conocidas, facilitando la producción de esta enzima mediante la expresión recombinante. En una modalidad preferida, los métodos de sialilación reclamados utilizan una ST3Gal III de rata.

Otras sialiltransferasas ejemplares para el uso en la presente invención incluyen aquellas "aisladas de Campylobacter jejuni, que incluyen CST-I y CST-II y aquellas que forman uniones a(2,3). Véase, por ejemplo, el documento WO99/49051. Las sialiltransferasas diferentes de aquellas listadas .en la Tabla 2, también son útiles en un proceso económico y eficiente a gran escala para la sialilación de glicopéptidos comercialmente importantes. Como una prueba simple para encontrar la utilidad de estas otras enzimas, varias cantidades de cada enzima (1-100 mU/mg de proteína) se hacen reaccionar con asialo-a_ AGP (a 1-10 mg/ml) para comparar la capacidad de la sialiltransferasa de interés para sialilar los glicopéptidos con relación a cualquiera de las sialiltransferasas de bovino ST6Gal I, ST3Gal III o ambas. Alternativamente, otros glicopéptidos o glicopéptidos, u oligosacáridos unidos a N que son liberados enzimáticamente de la estructura principal del péptido se pueden utilizar en lugar de asialo-ai AGP para esta evaluación. Las sialiltransferasas con la capacidad para sialilar los oligosacáridos unidos a N de glicopéptidos más eficientemente que ST6Gal I son útiles en un procedimiento práctico a gran escala ara la sialilación de péptidos. Estas sialiltransferasas y aún otras dialiltransferasas adicionales se exponen en la FIGURA 11, la cual es una tabla de sialiltransferasas que se utilizan para transferir a un receptor las especies de ácido siálico modificado que son expuestas en este documento y el ácido siálico no modificado. GalNAc transferasas Las ?-acetilgalactosaminiltransferasas se utilizan en la práctica de la presente invención, particularmente para el enlace de una porción de Gal?Ac a un aminoácido del sitio de glicosilación unido a 0 del péptido. Las ?-acetilgalactosaminiltransferasas adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, a(l,3)?-acetilgalactosaminiltransferasa, ß (l,4)?-acetilgalactosaminiltransferasas (?agata y colaboradores, J. Biol . Chem. 267: 12082-12089 (1992) y Smith y colaboradores, J. Biol Chem. 269: 15162 (1994)) y el polipéptido ?-acetilgalactosaminiltransferasa (Homa y colaboradores, J. Biol . Chem. 268: 12609 (1993)). La producción de proteínas, tales como la enzima Gal?Ac Ti-xx de genes clonados mediante la ingeniería genética es bien conocida. Véase, por ejemplo, la patente norteamericana ?o. 4,761,371. Un método involucra la colección de suficientes muestras, entonces la secuencia de aminoácidos de la enzima se determina mediante la secuenciación ?-terminal . Esta información entonces se -utiliza para aislar un clon de AD?c que codifica una transferasa de longitud completa (enlazada a la membrana) , la cual con la expresión en la línea de células de insecto Sf9 da por resultado la síntesis de una enzima completamente activa. La " especificidad de los receptores de la enzima entonces se determina utilizando un análisis semicuantitativo de los aminoácidos que circundan los sitios de glicosilación conocidos en 16 diferentes proteínas seguidos por estudios de glicosilación in vitro- de los : péptidos sintéticos. Este trabajo ha demostrado que ciertos residuos de aminoácidos son sobrerrepresentados en segmentos de péptidos glicosilados y que los residuos en las posiciones específicas que circundan los residuos -glicosilados de serina y treonina pueden tener una influencia más marcada sobre la eficacia de los receptores que otras porciones de aminoácidos .

Glicosiltransferasas Enlazadas a Células En otra modalidad, las enzimas utilizadas en el método de la invención son glicosiltransferasas enlazadas a células . Aunque se conocen muchas glicosiltransfcrasas solubles (véase, por ejemplo, la patente norteámericana No. 5,032,519), las glicosiltransferasas están generalmente en una forma enlazada a la membrana cuando son asociadas con células. De esta manera, se considera en gran medida que muchas de las enzimas enlazadas a membranas, estudiadas son proteínas intrínsecas; esto es, no son liberadas de las membranas mediante la sonicación y requieren detergenbes para la solubilización. Las glicosiltransferasas superficiales han sido identificadas sobre las superficies de células de animales vertebrados e invertebrados y también se ha reconocido que estas transferasas superficiales mantienen una actividad catalítica bajo condiciones fisiológicas. Sin embargo, la función más reconocida de las glicosiltransferasas de. la superficie celular . es para el reconocimiento . intercelular (Roth, MOLECULAR APPROACHES to SUPRACELLULAR PHENOMENA, 1990) . Se han desarrollado métodos para alterar las glicosiltransferasas expresadas por células. Por ejemplo, Larsen y colaboradores, Proc. Nati . Acad. Sci . EUA 86: 8227-8231 (1989) , reportan un planteamiento genético para aislar secuencias de ADNc clonado que determinan la expresión de estructuras de oligosacáridos de la superficie celular y sus glicosiltransferasas cognadas. Una biblioteca de ADNc generada a partir del ARNm aislado de una línea de células de murino que se sabe que expresa la UDP-galactosa: .ß. -D-galactosil-l,4-N-acetil-D-glucosaminida a-1, 3-galactosiltransferasa se transfectó en células COS-1. Las células transfectadas entonces -se cultivaron y se sometieron a ensayo por la actividad de al-3galactosiltransferasa. Francisco y colaboradores, Proc. Nati . - Acad. Sci . EUA 89: 2713-2717 (1992), describen un método para fijar la ß-lactamasa a la superficie externa de Escherichia coli . Una fusión tripartita que consiste de (i) una secuencia de señales de una proteína de membrana exterior, (ii) una sección que se extiende sobre la membrana de una proteína de membrana exterior y (iii) una secuencia completa de ß-lactamasa madura se produce dando por resultado una molécula activa de ß-lactamasa enlazada a la superficie. Sin embargo, el método de Francisco está limitado únicamente a sistemas de células procarióticas y, como es reconocido por los autores, requiere la fusión tripartita, completa para el funcionamiento apropiado.

Sulfotransf rasas La invención también proporciona métodos para producir péptidos que incluyen moléculas sulfatadas, inclusive, por ejemplo polisacáridos sulfatados, tales como heparina, sulfato de heparan, carragenina y compuestos relacionados. Las sulfotransferasas adecuadas incluyen, por ejemplo, condroitin-6-sulfotransferasa (ADNc de pollo descrito por Fukuta y colaboradores, J. Biol . Chem. 270: 18575-18580 (1995); Acceso de GenBank No. D49915) , glicosaminoglican-N-acetilglucosamina-N-desacetilasa/N-sulfotransferasa 1 (Dixon y colaboradores, Genomics 26: 239-241 (1995); UL18918) y glicosaminoglican-N-acetilglucosamina-N-desacetilasa/N-sulfotransferasa 2 (ADNc de murino descrito en Orellana y colaboradores, J. Biol . Chem. 269: 2270-2276 (1994) y Eriksson y colaboradores, J. Biol .

Chem. 269: 10438-10443 (1994); ADNc de humano descrito en el Scceso de GenBank No. U2304) .

Glicosidasas Esta invención también comprende el uso de glicosidasas de tipo natural y mutantes. Se ha demostrado que las enzimas ß-gal.actosidasas mutantes catalizan la formación de disacáridos a través del acoplamiento de un fluoruro de a-glicosilo a una molécula receptora de galactosilo. (Withers, patente norteamericana No. 6,284,494; presentada el 4 de Septiembre de 2001) . Otras glicosidasas que se utilizan en esta invención incluyen, por ejemplo, ß-glucosidasas, ß-galactosidasas, ß-manosidasas, ß-acetil-glucosaminidasas, ß-N-acetil-galactosaminidasas, ß-xilosidasas, ß-fucosidasas, celulosas, xilanasas, galactanasas, mananasas, hemicelulasas, amilasas, glucoamilasas, a-glucosidasas, a-galactosidasas, a-manosidasas, a-N-acetil-glucosaminidasas, a-N-acetil-galactosa-aminidasas, a-xilosidasas, a-fucosidasas y neuraminidasas/sialidasas .

Enzimas Inmovilizadas La presente invención también proporciona el uso de enzimas que son inmovilizadas sobre- un soporte sólido y/o soluble. En una modalidad ejemplar, se proporciona una glicosil-transferasa que es conjugada a un PEG por vía de un conector de glicosilo intacto de acuerdo con los métodos de la invención. El conjugado de PEG-conector-enzima se une opcionalmente a un soporte sólido. El uso de enzimas unidas a soportes sólidos en los métodos de la invención simplifica la preparación de la mezcla de reacción y la purificación del producto de reacción y también hace posible una fácil recuperación de la enzima. El conjugado de glicosiltransferasa se utiliza en los métodos de la invención. Otras combinaciones de enzimas y soportes serán aparentes para aquellas personas oxpertas en el campo.

Proteínas de Fusión En otras modalidades ejemplares, los métodos de la invención utilizan proteínas de fusión que tienen más de una actividad enzimática que está involucrada en la síntesis de un conjugado de glicopéptido deseado. Los polipéptidos de fusión pueden estar compuestos de, por ejemplo, un dominio catalíticamente activo de una glicosiltransferasa que está unida a un dominio catalíticamente activo de una enzima accesorio. El dominio catalítico de la enzima accesorio puede catalizar, por ejemplo, un paso en la formación de un azúcar de nucleótido que es un donador para la glicosiltransferasa, o puede catalizar una reacción involucrada en un ciclo de glicosiltransferasa. Por ejemplo, un polinucleótido que codifica una glicosiltransferasa puede unirse, dentro de la estructura, a un polinucleótido que codifica una enzima involucrada en la síntesis del azúcar de nucleótido. La-proteína de fusión resultante entonces puede catalizar no únicamente la síntesis del azúcar de nucleótido, sino también la transferencia de la porción de azúcar a la molécula receptora. La proteína de fusión puede estar compuesta de dos o más enzimas del ciclo unidas en una secuencia de nucleótidos expresable. En otras modalidades, la proteína de fusión incluye los dominios catalíticamente activos de dos o más glicosiltransferasas. Véase, por ejemplo, la patente 5,641,668. Los glicopéptidos modificados de la presente invención pueden diseñarse y prepararse fácilmente utilizando diversas proteínas de fusión adecuadas (véase, por ejemplo, la solicitud de patente del PCT, PCT/CA98/01180, la cual fue publicada como WO 99/31224 el 24 Junio de 1999) .

Preparación de Azucares Modificados En general, los grupos de la porción de azúcar o el cásete de porción de azúcar-conector y el PEG o casete de PEG-conector son unidos conjuntamente a través del uso de grupos reactivos, los cuales son transformados típicamente por el proceso de unión en un nuevo grupo funcional orgánico o especies no reactivas. El (los) grupo (s) funcional (es) reactivo (s) de azúcar está localizado en cualquier posición en la porción de azúcar. Los grupos reactivos y las clases de reacciones útiles en la práctica de la presente invención son generalmente aquellos que son bien conocidos en el campo de la química de los bioconjugados. Las clases actualmente favorables de reacciones disponibles con porciones de azúcar reactivas son aquellas que proceden bajo condiciones relativamente suaves. Estas incluyen, pero no están limitadas a, sustituciones nucleofílicas (por ejemplo, reacciones de aminas y alcoholes con haluros de - acilo, ésteres activos) , substituciones electrofílicas (por ejemplo, reacciones de enamina) y adiciones a enlaces múltiples de carbono-carbono y carbono-heteroátomo (por ejemplo reacción Michael, adición Diels-Alder) . Estas y otras reacciones útiles se describen en, por ejemplo, March, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY, 3a edición, John Wiley & Sons, Nueva York, 1985; Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, San Diego, 1996; y Feeney y colaboradores, MODIFICATION OF PROTEINS; Advaces in Chemistry Series, Vol. 198, American Chemical Society, Washington, D.C., 1982. Los grupos funcionales, reactivos, útiles que son pendientes de un núcleo de azúcar o un grupo modificador incluyen, pero no están limitados a: (a) grupos carboxilo y varios derivados de los mismos que incluyen, pero no están limitados a, esteres de N- hidroxisuccinimida, ésteres . de N-hidroxibenzotriazol, haluros de ácido, imidazoles de acilo, tioésteres, esteres de p-nitrofenilo, alquilo, alquenilo, alquinilo y esteres aromáticos; (b) grupos hidroxilo, los cuales pueden ser convertidos a, por ejemplo, esteres, éteres, aldehidos, etcétera. (c) grupos haloalquilo, en donde el haluro puede ser desplazado posteriormente con un grupo nucleofílico tal como, por ejemplo, una amina, un anión de carboxilato, un anión de tiol, .carbanión o un ion de alcóxido, dando por resultado con lo cual la unión covalente de un nuevo grupo en el grupo funcional del átomo de halógeno; (d) grupos dienofilo, los cuales son capaces de participar en las reacciones Diels-Alder tales como, por ejemplo, grupos maleimido; (e) grupos aldehido o cetona, de tal - manera que la derivatización subsecuente sea posible por vía de. la formación de derivados de carbonilo tales como, por ejemplo, iminas, hidrazonas, semicarbazonas u oximas o por vía de mecanismos tales como la adición Grignard o la adición de alquil-litio; (f) grupos haluro de sulfonilo para la reacción subsecuente con aminas, por ejemplo, para formar sulfonamidas; (g) -grupos tiol, los cuales pueden ser, por ejemplo, convertidos a disulfuros o se pueden hacer reaccionar con haluros de acilo; (h) grupos amina o sulfhidrilo, los cuales pueden ser, por ejemplo, acilados, alquilados u oxidados; (i) alquenos, los cuales se pueden someter a, por ejemplo, cicloadiciones, acilación, adición de Michael, etcétera; y (j) epóxidos, los cuales pueden reaccionar con, por ejemplo, aminas y compuestos de hidroxilo. Los grupos funcionales, reactivos se pueden seleccionar de tal manera que no participen en, o interfieran con, las reacciones necesarias para ensamblar el núcleo de azúcar reactivo o grupo modificador. Alternativamente, un grupo funcional, reactivo se puede proteger de participar en la reacción por medio de la presencia de un grupo protector. Aquellas personas expertas en el campo entenderán como proteger un grupo funcional, particular de tal manera que no interfiera con un conjunto seleccionado de condiciones de reacción. Para los ejemplos de grupos protectores útiles véase, por ejemplo, Greene y colaboradores, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, John Wiley & Sons, Nueva York, 1991. En la descripción que -sigue, se expone una variedad -de ejemplos específicos de azucares modificados que son útiles en la -práctica de la presente invención. En las modalidades ejemplares, un derivado de ácido siálico se utiliza como el núcleo de azúcar al cual se une el grupo modificador. El enfoque de la descripción sobre derivados de ácido siálico es por claridad de ilustración únicamente y no se debe considerar que limita el alcance de la invención. Aquellas personas expertas en el campo apreciarán que se puede activar una variedad de otras porciones de azúcar y se puede derivatizar de manera análoga a aquella expuesta utilizando ácido siálico como un ejemplo. Por ejemplo, numerosos métodos están disponibles para modificar galactosa, glucosa, N-acetilgalactosamina y fucosa por nombrar algunos substratos de azúcar, los cuales son fácilmente modificados por métodos reconocidos en el campo. Véase, por ejemplo, Elhalabi y colaboradores, Curr. Med. Chem. 6:93 (1999); y Schafer y colaboradores, J. Org. Chem. 65: 24 (2000)). En una modalidad ejemplar, el péptido de G-CSF que es modificado por un método de la invención es un glicopéptido que es producido en células de mamífero (por ejemplo, células de CHO) o en un animal transgénico y, de esta manera, contiene cadenas de oligosacáridos unidas a N y/u 0, las cuales son sialiladas incompletamente. Las cadenas de oligosacáridos del glicopéptido que carecen de un ácido siálico y que contienen un residuo de galactosa terminal pueden ser modificadas por PEG, modificadas por PPG o modificadas de otra manera con un ácido siálico modificado. En el esquema de reacción 4, el glicósido de amino 1 es tratado con el éster activo de un derivado de aminoácido protegido (por ejemplo, glicina) , convirtiendo el residuo de amina de azúcar en el aducto de amida de aminoácido protegido correspondiente. El aducto es tratado con una aldolasa para formar el carboxilato de a-hidroxi 2. El compuesto 2 se convierte al derivado de CMP correspondiente por medio de la acción de la CMP-SA sintetasa, seguida por la hidrogenación catalítica del derivado de CMP para producir el compuesto 3. La amina introducida por vía de la formación del aducto de glicina se utiliza como un sitio de unión de PEG por medio de la reacción del compuesto 3 con un derivado de PEG o PPG activado (por ejemplo, PEG-C(0)NHS, PEG-OC (O) O-p-nitrofenil) , produciendo especies tales como el compuesto 4 o 5, respectivamente .

Esquema de Reacción 4 CMP-SA-5-NHCOCH2NH — C(0)0-PEG 5 La Tabla 3 expone ejemplos representativos de monofosfatos de azúcar que son derivatizados con una porción de PEG. Ciertos compuestos de la Tabla 3 se preparan por medio del método del esquema de reacción 4. Otros derivados se preparan por medio de métodos reconocidos en el campo. Véase, por ejemplo, Keppler y colaboradores, Glycobiology 11: 11R (2001); y Charter y colaboradores, Glycobiology 10: 1049 (2000)). Otros análogos de PEG y PPG reactivos de amina son comercialmente disponibles o se pueden preparar por medio de métodos fácilmente accesibles para aquellas personas expertas en el campo.

Tabla 3 C P-NcuAc-8-O-R CMP-NeuAc-4-NH-R CMP-NeuAc-4-O-R Los fosfatos de azúcar modificados para el uso en la práctica de la presente invención pueden ser sustituidos en otras posiciones así como también aquellas expuestas anteriormente. Las sustituciones actualmente preferidas de ácido siálico se exponen en la siguiente fórmula: en la cual X es un grupo de unión, el cual se selecciona en lugar de de -O-, -N-(H)-, -S, -CH2- y N(R)2, en la cual cada R es un miembro seleccionado independientemente de R1-R5. Los símbolos Y, Z, A y B representan cada uno un grupo que se selecciona del grupo expuesto anteriormente para la identidad de X. X, Y, Z, A y B se seleccionan independientemente cada uno y, por lo tanto, pueden ser los mismos o diferentes. Los símbolos R1, R2, R3, R4 y R5 representan H, una porción de PEG, una porción terapéutica, una biomolécula u otra porción. Alternativamente, estos símbolos representan un conector que se enlaza a una porción de PEG, porción terapéutica, biomolécula u otra porción. Las porciones ejemplares unidas a los conjugados descritos en este documento incluyen, pero no están limitadas a, derivados de PEG (por ejemplo, acil-PEG, acil-alquil-PEG, alquil-acil-PEG carbamoil-PEG, aril-PEG) , derivados de PPG (por ejemplo, acil-PPG, acil-alquil-PPG, alquil-acil-PPG carbamoil-PPG, aril-PPG) , porciones terapéuticas, porciones de diagnóstico, manosa-6-fosfato, heparina, heparan, SLex, mañosa, manosa-6-fosfato, Sialilo Lewis X, FGF, VFGF, proteínas, condroitina, queratan, dermatan, albúmina, integrinas, oligosacáridos de antenas, péptidos y similares. Los métodos para conjugar los diversos grupos modificadores con una porción de sacárido son fácilmente accesibles para aquellas personas expertas en el campo (POLY (ETHYLENE GLYCOL CHEMISTRY: BIOTECHNICAL AND BIOMEDI-CAL APPLICATIONS, J. Milton Harris, Ed., Plenum Pub. Corp., 1992; POLY {ETHYLENE GLYCOL) CHEMICAL AND BIOLOGICAL APPLICATIONS, J. Milton Harris, Ed. , ACS Symposium Series No. €SO , American Chemical Society, 1997; Hermanson, BIOCON UGATE TECHNIQUES , Academic Press , San Diego, 1996 ; y Dunn y colaboradores Eds . POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS , ACS Symposium Series Vol . 469 , American Chemical Society, Washington, D . C . 1991) .

Grupos Conectores (Grupos de Reticulación) La preparación del azúcar modificado para el uso en los métodos de la presente invención incluye la unión de una porción de PEG a un residuo de azúcar y en lugar de la formación de un aducto estable, el cual es un substrato para una glicosiltransferasa. De esta manera, se prefiere frecuentemente utilizar un conector, por ejemplo, uno formado por medio de la reacción de la porción de PEG y azúcar con un agente de reticulación para conjugar el PEG y el azúcar. Los compuestos bifuncionales, ejemplares que se pueden utilizar para unir los grupos modificadores a porciones de carbohidrato incluyen, pero no están limitados a, poli (etilenglicoles) bifuncionales, poliamidas, poliéteres, poliésteres y similares. Los planteamientos generales para unir carbohidratos a otras moléculas son conocidos en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Lee y colaboradores, Biochemistry 28: 1856 (1989); Bhatia y colaboradores, Anal Biochem. 178: 408 (1989); Janda y colaboradores, J. Am. Chem. Soc. 112: 8886 (1990) y Bednarski y colaboradores, WO 92/18135. En la descripción que sigue, los grupos reactivos son tratados como favorables en la porción de azúcar del azúcar modificado, incipiente. El enfoque de la descripción es por claridad de ilustración. Aquellas personas expertas en el campo apreciarán que la descripción también es relevante para grupos reactivos en el grupo modificador. Se utiliza una variedad de reactivos para modificar los componentes del azúcar modificado con reticulaciones químicas, intramoleculares (para revisiones de los roactivos de reticulación y los procedimientos de reticulación véase: Wold, F., Met . Enzymol . 25: 623-651, 1972; Weetall, H. H. , y Cooney, D. A., En: ENZYMES AS GDRUGS. (Holcenberg, and Roberts, eds.) páginas 395-442, Wiley, Nueva York, 1981; Ji, T. H., Meth. Enzymol . 91: 580-609, 1983; Mattson y colaboradores, Mol. Biol. Rep. 17: 167-183, 1993, todas las cuales son incorporadas en este documento a manera de referencia) . Los reactivos de reticulación preferidos se derivan de varios reactivos de reticulación de longitud cero, homo-bifuncionales y hetero-bifuncionales. Los reactivos de reticulación de longitud cero incluyen la conjugación directa de dos grupos químicos, intrínsecos sin la introducción de material extrínseco. Los agentes que catalizan la formación de un enlace de disulfuro pertenecen a esta categoría. Otro e-jemplo son los reactivos que inducen la condensación de un grupo carboxilo y un grupo amino primario para formar un enlace de amida tales como carbodiimidas, etilcloroformiato, reactivo K de Woodward (2-etil-5-fenilisoxazolio-3 ' - sulfonato) y carbonildiimidazol. Además de estos reactivos químicos, la enzima transglutaminasa (glutámil-péptido ?- glutamiltransf rasa; EC 2.3.2.13) se puede utilizar como el reactivo de reticulación de longitud cero. Esta enzima cataliza las. reacciones de transferencia de acilo en los grupos carboxamida de los residuos de glutaminilo enlazados a proteínas, usualmente con un grupo amino. primario como substrato. Los reactivos homo- y hetero-bifuncionales - preferidos contienen dos sitios idénticos o dos sitios desemejantes, respectivamente, los cuales pueden ser reactivos para los grupos amino, sulfhidrilo, guanidino, indol o no específicos.

Purificación de Conjugados de G-CSF Replegamiento de G-CSF insoluble Muchas proteínas recombinantes expresadas en bacterias son expresadas como agregados insolubles en cuerpos de inclusión bacterianos. Los cuerpos de inclusión son depósitos de proteína encontrados en el espacio tanto citoplásmico como periplásmico de las bacterias. (Véase, por ejjemplo, Clark, Cur. Op. Biotech . 12:202-207 (2001)).- Las proteínas de G-CSF recombinantes son expresadas en cuerpos de inclusión bacterianos y los métodos para el repliegue de estas proteínas para producir proteínas de G-CSF activas se proporcionan en este documento.

A. Condiciones para replegar el G-CSF activo Para producir proteínas de G-CSF activas a partir de células bacterianas, las proteínas de G-CSF son expresadas en cuerpos de inclusión bacterianos, las bacterias son recolectadas, alteradas y los cuerpos de inclusión son aislados y lavados. En una modalidad, se realizan tres lavados: un primer lavado en un amortiguador a un pH entre 6.0 y 9.0; una sal monovalente, por ejemplo, cloruro de sodio; un detergente no iónico, por ejemplo, Tritón X-100; un detergente iónico, por ejemplo, desoxicolato de sodio; y EDTA; un segundo lavado en un amortiguador libre de detergente y un tercer lavado en H20. Las proteínas dentro de los cuerpos de inclusión entonces son solubilizadas. La solubilización se puede realizar utilizando desnaturalizantes, cloruro de guanidinio o urea; extremos de pH; o detergentes o cualquier combinación de éstos. En una modalidad de 5-6M, se utiliza HCl de guanidina o urea para solubilizar el G-CSF. En otra modalidad, se adiciona DTT. Después de la solubilización, los desnaturalizantes son retirados de la mezcla de proteínas de G-CSF. El retiro de desnaturalizantes se puede realizar por medio de una variedad de métodos, que incluyen la dilución en métodos de amortiguador de repliegue o de intercambio de amortiguador. Los métodos de intercambio de amortiguador incluyen la diálisis, diafiltración, filtración en gel e inmovilización de la proteína sobre un soporte sólido (véase, por ejemplo, Clark, Cur. Op . Biotech. 12:202-207 (2001)). Cualquiera de los métodos anteriores se puede combinar para retirar los desnaturalizantes . La formación de enlaces de disulfuro . en las proteínas de G-CSF es promovida por la adición de un amortiguador de repliegue que comprende un acoplamiento redox. Los acoplamientos. redox incluyen productos glutationicos tanto reducidos como oxidados ( (-JSF-I/GSSG) , cisteína/cistina, cisteamina/cistamina, DTT/GSSG y DTE/GSSG.

( Véase, por ejemplo, Clark, Cur. Op. Biotech. 12:202-207 (2001) ) . En una modalidad, el acoplamiento redox es GSH/GSSG a una relación de 10:1. El repliegue se puede realizar en amortiguadores a pH que varían de, por ejemplo, 6.0 a 10.0. Los amortiguadores de repliegue, pueden incluir otros aditivos para mejorar el repliegue, por ejemplo, L-arginina (0.4-1 M) ; PEG; bajas concentraciones de desnaturalizantes,- tales como urea (1-2 M) y cloruro de guanidinio (0.5-1.5 M) ; y detergentes (por ejemplo, Chaps, SDS, CT7AB, maltosida de laurilo, Tween 80 y Tritón X-100) . Después del repliegue, la proteína de G-CSF puede dializarse para retirar el acoplamiento redox u otros componentes de amortiguador no deseados . En una modalidad, la diálisis se realiza utilizando un amortiguador que incluye acetato de sodio, glicerol y un detergente no iónico, por ejemplo, Tween 80. Después de la diálisis, la proteína de G-CSF puede ser purificada adicionalmente y/o concentrada por medio de la cromatografía de intercambio iónico. En una modalidad, se utiliza una resina de intercambio catiónico SP-Sepharosem. Aquellas personas expertas reconocerán que una proteína ha sido replegada correctamente cuando la proteína replegada tiene actividad biológica detectable. Para una proteína de G-CSF, la actividad biológica puede ser medida utilizando una variedad de métodos. Por ejemplo, las proteínas de G-CSF biológicamente activas son substratos para la glicosilación unida a O descrita en las Solicitudes de patente norteamericana 60/535 284, presentada el 8 de Enero de 2004; 60/544411, presentada el 12 de Febrero de 2004 y el número de registro de apoderado 019957-018820US, presentada el 20 de Febrero de 2004; cada una de las cuales es incorporada -en este documento a manera de referencia para todos los propósitos. La actividad de la proteína de G-CSF también puede ser medida utilizando ensayos de proliferación de células o ensayos de glóbulos blancos (WBC, por sus siglas en inglés) en ratas. (También descritos en las Solicitudes de patente norteamericana 60/535284, presentada el 8 de Enero de 2004; 60/544411, presentada el 12 de Febrero de 2004 y el Número de Registro de Apoderado 019957-018820US presentada el 20 de Febrero de 2004; cada una de las cuales es incorporada en este documento a manera de referencia para todos los propósitos) . Los ensayos de proliferación y los ensayos de WBC se pueden realizar antes o después de la glicosilación unida a O de las proteínas de G-CSF replegadas .

Otros Métodos para Aislar los Conjugados de la Invención Alternativamente, los productos generados mediante los procedimientos anteriores se pueden utilizar sin purificación. Sin embargo, usualmente se prefiere recuperar el producto. Se pueden utilizar técnicas estándar bien conocidas para la recuperación de los sacáridos glicosilados, tales como la cromatografía de capa delgada o gruesa, cromatografía en columna, cromatografía de intercambio iónico o filtración en membrana. Se prefiere utilizar la filtración en membrana, más en lugar de utilizando una membrana osmótica, inversa o una o más técnicas de cromatografía en columna para la recuperación como se describe posteriormente en este documento y en la bibliografía citada en este documento. Por ejemplo, la filtración en membrana en donde las membranas tienen una limitación de peso molecular de aproximadamente 3000 a aproximadamente 10,000 se puede utilizar para retirar proteínas, tales como glicosiltransferasas. La nanofiltración u osmosis inversa entonces se puede utilizar para retirar sales y/o para purificar los. sacáridos del producto (véase, por ejemplo, el documento WO 98/15581) . Las membranas de nanofiltro son una clase de membranas de osmosis inversa que pasan sales monovalentes pero que retienen sales polivalentes y solutos sin carga más grandes de aproximadamente 100 a aproximadamente 2,000 Daltons, dependiendo de la membrana utilizada. De esta manera, en .una aplicación típica, los sacáridos preparados por medio de los métodos de la presente invención serán retenidos en la membrana y las sales contaminantes pasarán a través de ésta. Si la glicoproteína modificada se produce intracelularmente-, como un primer paso, los restos particulados, ya sea las células hospedantes o fragmentos lisados, son eliminados, por ejemplo, mediante la centrifugación o ultrafiltración; opcionalmente, la proteína se puede concentrar con un filtro de concentración de proteínas comercialmente disponible, seguido por la separación de la variante del péptido de otras impurezas por uno o más pasos seleccionados de la cromatografía de inmunoafinidad, fraccionamiento en columna de intercambio iónico {por ejemplo, en dietilaminoetilo (DEAE) o matrices que contienen grupos carboximetilo o sulfopropilo) , cromatografía en Blue- Sepharose", CM Blue-Sepharose", MONO-Qm, MONO-S*, lentil lectin-Sepharose", WGA-Sepharose", Con A-Sepharosem, Ether Toyopearl", Butyl Toyopearl*1, Phenyl Toyopearl", o SepharoseMR de proteína A, cromatografía de SDS-PAGE, cromatografía en sílice, cromatoenfoque, CLAR de fase inversa (por ejemplo, gel de sílice con grupos alifáticos anexos) , filtración en gel utilizando, por ejemplo, tamiz molecular Sephadex"1* o cromatografía de exclusión de tamaño, cromatografía en columnas que se unen selectivamente al polipéptido y precipitación de etanol o sulfato de amonio. Los glicopéptidos modificados que son producidos en cultivo se aislan usualmente por medio de la extracción inicial de células, enzimas, etcétera, seguida por uno o más pasos de concentración, desplazamiento salino, intercambio iónico acuoso o cromatografía de exclusión de tamaño. Adicionalmente, la glicoproteína modificada se puede purificar por medio de la cromatografía de afinidad. Finalmente, la CLAR se puede emplear para los pasos de purificación finales. Un inhibidor de proteasa, por ejemplo, metilsulfonilfluoruro (PMSF) , se puede incluir en cualquiera de los. pasos anteriores para inhibir la proteólisis y se pueden incluir antibióticos para prevenir el crecimiento de contaminantes adventicios.

Dentro de otra modalidad, los sobrenadantes de los sistemas que producen el glicopéptido modificado de la invención son concentrados primero utilizando un filtro de concentración de proteínas comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon"11 o Millipore Pellicon"11. Después del paso de concentración, el producto concentrado se puede aplicar a una matriz de purificación adecuada. Por ejemplo, una matriz de afinidad adecuada puede comprender un ligando para el péptido, una lectiná o una molécula de anticuerpo unida a un soporte adecuado. Alternativamente, se puede emplear una resina de intercambio aniónico, por ejemplo, una matriz o substrato que tiene grupos DEAE pendientes . Las matrices adecuadas incluyen acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos comúnmente empleados en la purificación de proteínas. Alternativamente, se puede emplear un paso de intercambio catiónico. Los intercambiadores catiónicos adecuados incluyen diversas matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Los grupos sulfopropilo son particularmente preferidos. Finalmente, uno o más pasos de CLAR-FI que emplean medios hidrófobos de la CLAR de fase inversa, por ejemplo, gel de sílice que tiene grupos metilo pendientes u otros grupos alifáticos, se pueden emplear. para purificar adici-onalmente una composición de variantes de polipéptidos.

Algunos o la totalidad de los pasos de purificación anteriores, en diversas combinaciones, también se pueden emplear para proporcionar una glicoproteína modificada, homogénea. El glicopéptido modificado de la invención que es resultante de una fermentación a gran escala se puede purificar por medio de métodos análogos a aquellos descritos por Urdal y colaboradores, J. Chromatog. 296: 171 (1984). Esta referencia describe dos pasos secuenciales de CLAR de fase inversa para la purificación de IL-2 humana, recombinante en una columna de CLAR - preparativa. Alternativamente, las .técnicas, tal como la cromatografía de afinidad, se pueden utilizar para purificar la glicoproteína modificada.

.Composiciones Farmacéuticas En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica. La composición farmacéutica incluye un diluyente farmacéuticamente aceptable y un conjugado covalente entre una porción de PEG que no es de origen natural, una porción terapéutica o biomolécula y un péptido glicosilado o no glicosilado. El polímero, la porción terapéutica o la biomolécula se conjuga con el péptido de G-CSF por vía de un grupo de unión de glicosilo intacto interpuesto entre y unido covalentemente tanto al péptido de G-CSF como al polímero, la porción terapéutica o la biomolécula. Las composiciones farmacéuticas de la invención son adecuadas para el uso en una variedad de sistemas de suministro de fármacos. Las formulaciones adecuadas para el uso en la presente invención se encuentran en Remington 's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Filadelfia, PA, 17a edición (1985) . Para una breve revisión de los métodos para el suministro de fármacos, véase, Langer, Science 249: 1527-1533 (1990). Las composiciones farmacéuticas se pueden formular para cualquier forma apropiada de administración, inclusive, por ejemplo, la administración tópica, oral, nasal, intravenosa, intracraneal, intraperitoneal, subcutánea o intramuscular. Para la administración parenteral, tal como la inyección subcutánea, el portador comprende en lugar de agua, solución salina, alcohol, una grasa, una cera o un amortiguador. Para la administración oral, se puede emplear cualquiera de los portadores anteriores o un portador sólido tal como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, sacarosa y carbonato de magnesio. Las microesferas biodegradables (por ejemplo, poliglicolato de polilactato) también se pueden emplear como portadores para las composiciones farmacéuticas de esta invención. Las microesferas biodegradables, adecuadas se describen en, por ejemplo, las patentes norteamericanas Nos. 4,897,268 y 5,075,109. Comúnmente, las composiciones farmacéuticas se administran por la ruta o parenteral, por ejemplo, intravenosa. De esta manera, la invención proporciona composiciones para la administración parenteral, las cuales comprenden el compuesto disuelto o suspendido en un portador aceptable, en lugar de un portador acuoso, por ejemplo, agua, agua amortiguada, solución salina, PBS y similares. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables como sea requerido" para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes para el ajuste y amortiguamiento del pH, agentes para el ajuste de tonicidad, agentes humectantes, detergentes y similares. Estas composiciones se pueden esterilizar por medio de técnicas de esterilización convencionales o se pueden filtrar de manera estéril . Las soluciones acuosas, resultantes se pueden empacar para el uso como están, o liofilizadas, la preparación liofilizada se combina con un portador acuoso, estéril antes de la administración. El pH de las preparaciones será típicamente entre 3 y 11, más en lugar de de 5 a 9 y mucho más en lugar de de 7 y 8. En algunas modalidades, los glicopéptidos de la invención se pueden incorporar en liposomas formados de lípidos para la formación de vesículas estándar. Está disponible una variedad de métodos para preparar liposomas como se describe en, por ejemplo, Szoka y colaboradores, Ann . Rev. Biophys . Bioeng. 9: 467 (1980), "las patentes norteamericanas Nos. 4,235,871, 4,501,728 y 4,837,028. La fijación de objetivos de los liposomas utilizando una variedad de agentes de fijación de objetivos (por ejemplo, los galactósidos de sialilo de la invención) es bien conocida en el campo (véase, por ejemplo, las patentes norteamericanas Nos. 4,957,773 y 4,603,044) . Se pueden utilizar métodos estándar para acoplar agentes de fijación de objetivos a liposomas. Estos métodos incluyen generalmente la incorporación en liposomas de componentes lípidos, tal como fosfatidiletanolamina, los cuales se pueden activar para la unión de agentes para fijación de objetivos, o compuestos lipófilos derivatizados, tales como glicopéptidos derivatizados con lípidos de la invención. Los mecanismos para la fijación de objetivos requieren generalmente que los agentes de fijación de objetivos sean colocados sobre la superficie del liposoma de tal manera que las porciones objetivo estén disponibles para la interacción con el objetivo, por ejemplo, un receptor de la superficie celular. Los carbohidratos de la invención se pueden unir a una molécula de lípido antes de que se forme el liposoma utilizando métodos conocidos para aquellas personas expertas en el campo (por ejemplo, alquilación o acilación de un grupo hidroxilo que está presente en el carbohidrato con un haluro de alquilo de cadena larga o con un ácido graso, respectivamente) . Alternativamente, el liposoma se puede formar de tal manera que la porción conectora sea incorporada primero en la membrana al momento de formar la membrana. La porción conectora debe tener una porción lipófila, la cual es incrustada y fijada firmemente en la membrana. También debe tener una porción reactiva, la cual es disponible químicamente sobre la superficie acuosa del liposoma. La porción reactiva se selecciona de manera que sea químicamente adecuada para formar un enlace químico, estable con el agente de fijación de objetivos o carbohidrato, el cual se adiciona posteriormente. En algunos casos, es posible unir el agente objetivo a la molécula conectora directamente, pero en la mayoría de los casos es más adecuado utilizar una tercera molécula para actuar como una conexión química, uniendo de esta manera la molécula conectora que está en la membrana con el agente objetivo o carbohidrato que está extendido, tridimensionalmente , fuera de la superficie de la vesícula. Los compuestos preparados por medio de los métodos de la invención también encuentran uso" como reactivos de diagnóstico. Por ejemplo, los compuestos etiquetados se pueden utilizar para localizar áreas de inflamación o metástasis tumoral en un paciente quién se sospecha que tiene una inflamación. Para este uso, los compuestos se pueden etiquetar con 125I, 14C o tritio. El ingrediente activo . utilizado en las composiciones farmacéuticas de la presente invención es el G-CSF modificado por glico-PEG y sus derivados que tienen las propiedades biológicas de la Hormona de Estimulación de Folículos para incrementar, por ejemplo, la ovulación. En lugar de, la composición del G-CSF de la presente invención se administra por la ruta parenteral (por ejemplo IV, IM, SC o IP) . Se espera que las dosificaciones efectivas varíen considerablemente dependiendo de la condición que es tratada y la ruta de administración, pero se espera que estén en el rango de aproximadamente 0.1 (~7U) a 100 (-7000U) µg/kg de peso corporal del material activo. Las dosis preferibles para el tratamiento de condiciones anémicas son de aproximadamente 50 a aproximadamente 300 unidades/kg tres veces a la semana. Debido a que la presente invención proporciona un G-CSF con un tiempo de residencia in vivo aumentado, las dosificaciones establecidas son disminuidas opcionalmente cuando se administra una composición de la invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar los conjugados y los métodos de la presente invención, pero no para limitar la invención reclamada . EJEMPLOS EJEMPLO 1 Modificación por Glico-PEG del G-CSF producido en células de CHO a. Preparación del Asialo-Factor de Estimulación de Colonias de Granulocitos (G-CSF) El G-CSF producido en células de CHO es disuelto a 2.5 mg/mL en Tris 50 mM, Tris-HCl 50 mM pH 7.4, NaCl 0.15 M, CaCl2 5 mM y se concentra a 500 µL en un filtro de centrifuga Centricon Plus 20" . La solución se incuba con 300 mU/mL de Neuraminidase II" (Vibrio cholerae) durante 16 horas a 32 °C. Para supervisar la reacción, una pequeña alícuota de la reacción se diluye con el amortiguador apropiado y se elabora un gel de IEF. La mezcla de reacción entonces se adiciona al conjugado de ácido N- (p-aminofenil) oxamico-agarosa lavado previamente (800 µL/mL de volumen de reacción) y las perlas lavadas se hacen girar suavemente durante 24 horas a 4°C. La mezcla se centrifuga a 10,000 rpm y el sobrenadante se recolecta. Las perlas son lavadas 3 veces con amortiguador de Tris-EDTA, una vez con 0.4 mL de amortiguador de Tris-EDTA y una vez con 0.2 mL de amortiguador de Tris-EDTA y todos los sobrenadantes se acumulan. El sobrenadante es dializado a 4°C contra Tris-HCl 50 mM pH 7.4, NaCl 1 M, NaN3 0.O5% y luego dos veces más contra Tris-HCl 50 mM pH 7.4, NaCl 1 M, NaN3 0.05%. La solución dializada entonces se concentra utilizando un filtro de centrifuga Centricon Plus 20™* y se almacena a 20°C. Las condiciones del gel de IEF se condujeron de acuerdo con los procedimientos y reactivos proporcionados por Invitrogen. Las muestras de G-CSF nativo y desialilado son dializadas contra agua y analizadas por medio de la EM MALDI-TOF. b. Preparación de G-CSF- (alfa2,3) -Sialil-PEG El G-CSF desialilado se disolvió a 2.5 mg/mL en -Tris-HCl 50 mM, NaCl 0.15 M, .NaN3 0.05%, pH 7.2. La solución es incubada con CMP-ácido siálico-PEG 1 mM y 0.1 U/mL de ST3Gall a 32 °C durante 2 días. Para supervisar la incorporación de ácido siálico-PEG, una pequeña alícuota de la reacción tenía el CMP-SA-PEG-ligando fluorescente adicionado; la etiqueta incorporada en el péptido se separa a partir de la etiqueta libre por medio de la filtración en gel en una columna analítica Toso Hass G3000SW"11 utilizando amortiguador de PBS (pH 7.1). La incorporación de la etiqueta fluorescente en el péptido es cuantificada utilizando un detector fluorescente en línea. Después de 2 días, la mezcla de reacción es purificada utilizando una columna preparativa Toso Haas SOOOSW" utilizando amortiguador de PBS (pH 7.1) y al- recolectar las- fracciones basándose en la absorción de luz UV. El producto de la reacción es analizado utilizando el análisis de SDS-PAGE e IEF de acuerdo con los procedimientos y reactivos suministrados por Invitrogen. Las muestras de G-CSF tanto nativo como modificado por PEG son dializadas contra agua y analizadas por medio de la EM MALDI-TOF. c. Preparación de G-CSF- (alfa2 8) -Sialil-PEG El G-CSF producido en células de CHO, el cual contiene un glicano unido a O alfa2,3-sialilado, se disuelve a 2.5 mg/mL en Tris-HCl 50 mM, NaCl 0.15 M, NaN3 0.05%, pH 7.2. La solución se incuba con CMP-ácido siálico-PEG 1 mM y 0.1 U/mL de CST-II a 32°C durante 2 días. Para supervisar la incorporación de ácido siálico-PEG, una pequeña alícuota de la reacción tiene el CMP-SA-PEG-ligando fluorescente adicionado; la etiqueta incorporada en el péptido es separada de la etiqueta libre por medio de la filtración en gel en una columna analítica Toso Haas GSOOOSW" utilizando amortiguador de PBS (pH 7.1). La incorporación de la etiqueta fluorescente en el péptido es cuantificada utilizando un detector fluorescente en línea. Después de 2 días, la mezcla de reacción es purificada utilizando una columna preparativa Toso Haas GSOOOS " utilizando amortiguador de PBS (pH 7.1) y al recolectar las fracciones basándose en la absorción de luz UV. El producto de la reacción es analizado utilizando los análisis de SDS-PAGE e IEF de acuerdo con los procedimientos y reactivos suministrados por Invitrogen. Las muestras del G-CSF tanto nativo como modificado por PEG son dializadas contra agua y analizadas por medio de la EM MALDI-TOF. d. Preparación de G-CSF- (alfa2, 6) -Sialil-PEG El G-CSF, que contenía únicamente el GalNac unido a O, se disuelve a 2.5 mg/mL en Tris-HCl 50 mM, NaCl 0.15 M, NaN3 0.05%, pH 7.2. La solución es incubada con CMP-ácido siálico-PEG 1 mM y 0.1 U/mL de ST€GalNacI o II a 32 °C durante 2 días. Para supervisar la incorporación de ácido siálico-PEG, una pequeña alícuota de la reacción tiene el CMP-SA-PEG-ligando fluorescente adicionado; la etiqueta incorporada en el péptido es separada de la etiqueta libre por medio de la filtración en gel en una columna analítica Toso Haas GSOOOS " utilizando amortiguador de PBS (pH 7.1). La incorporación de la etiqueta fluorescente en el péptido es cuantificada utilizando un detector fluorescente en línea. Después de 2 días, la mezcla de reacción es purificada utilizando una columna preparativa Toso Haas GSOOOS " utilizando amortiguador de PBS (pH 7.1) y por medio de la recolección de fracciones basándose en la absorción de luz UV. El producto de la reacción es analizado utilizando los análisis de SDS-PAGE e IEF de acuerdo con los procedimientos y reactivos suministrados por Invitrogen. Las muestras del G-CSF tanto nativo como modificado por PEG son díalizadas contra agua y analizadas por -medio de la EM ALDI-TOF.

El G-CSF producido en células de CHO fue tratado con sialidasa Arthrobacter"11 y luego se purificó por medio de la exclusión de tamaño en Superdex 75"* y fue purificado con ST3Gall o ST3 Gal2 y luego con CMP-SA-PEG 20Kda. La molécula resultante se purificó por medio del intercambio iónico o la filtración en gel y el análisis por medio de SDS-PAGE demostró que la modificación por PEG estaba completa. Esta es la primera demostración de la modificación por glico-PEG de un glicano unido a 0.

EJEMPLO 2 G-CSF Recombinante-expresión, repliegue y purificación • Recolectar células por medio de la centrifugación, desechar el sobrenadante. Los resultados del crecimiento en varios medios se muestran en la Figura 9. • Resuspender la pelotilla de células en Tris 10 mM pH 7.4, NaCl 75 mM, EDTA 5 mM - utilizar 10 ml/g (amortiguador de lisis) • Microfluidificar células (también trabajos en prensa francesa) • Centrifugar durante 30 minutos, 4°C a 5,000 RPM- desechar el sobrenadante • Resuspender la pelotilla en amortiguador de lisis y centrifugar como antes • Lavar IB's en Tris 25 mM pH 8, NaCl 100 mM, TX-100 1%, - NaDOC 1%, _ EDTA 5 mM. Las pelotillas se resuspenden por medio del tratamiento en pipeta y el remolineo. Centrifugar durante 15 minutos a 4°C, 5,000 RPM. Repetir este paso una vez más (un total de dos lavados) • Lavar las pelotillas dos veces en Tris 25 mM pH 8, NaCl 100 mM, EDTA 5 mM ara retirar los detergentes, centrifugar como antes • Resuspender las pelotillas en dH20 para prorratear y centrifugar como antes. Las pelotillas son congeladas a -20 °C • Los IB's son resuspendidos a 20 mg/ml en guanidina- HC1 6 M, EDTA 5 mM, NaCl 100 mM, Tris 100 mM pH 8, DTT 10 mM utilizando un pipeteador, seguido por la rotación durante 2-4 horas a temperatura ambiente.

• Centrifugar los IB's solubilizados durante un minuto a temperatura ambiente a 14,000 RPM. Conservar el sobrenadante. • Diluir el sobrenadante 1:20 con amortiguador de repliegue de MES 50 mM pH6, NaCl 240 mM, 10 mM • KCl, maltosida de laurilo 0.3 mM, PEG3350 0.055%, GSH 1 mM, GSSG 0.1 M, arginina 0.5 M y replegar en un aparato rotatorio durante toda la noche a 4°C. • Transferir el repliegue a .MWCO 7 kDa Pierce snakeskin para la diálisis. Amortiguador de diálisis NaOAc 20 mM pH 4, NaCl 50 mM, Tween-80 0.005%, EDTA 0.1 mM. Dializar un total de 3 veces contra un exceso de al menos 200 veces a 4°C. • Después de la diálisis pasar el material a través de un filtro de 0.45 µM. • Equilibrar la columna SP-Sepharose" con el amortiguador de diálisis y aplica la muestra. Lavar la columna con el amortiguador de diálisis y eluir con el amortiguador de diálisis que contienen un gradiente de sal de NaCl hasta 1 M. La proteína es eluida típicamente en NaCl a 300-400 mM. • Supervisar el material en el análisis de SDS-PAGE (véase, por ejemplo, la Figura 10) EJEMPLO 3 El método de Dos Enzimas en Dos Crisoles El siguiente ejemplo ilustra la preparación de G-CSF-GalNac-SA-PEG en dos pasos secuenciales en donde cada producto intermedio es purificado antes de ser utilizado en el siguiente paso . a. Preparación de G-CSF-GalNAc (pH €.2) a partir de G-CSF y UDP-GalNAc utilizando GalNAc -T2. El -G-CSF (9€0 mcg) en 3.2 mL de amortiguador empacado se concentró por medio de la ultrafiltración utilizando un filtro UF (MWCO 5K) y luego se reconstituyó con 1 mL de amortiguador de MES 25 mM (pH 6.2, NaN3 0.005%). El UDP-GalNAc (6 mg, 9.24 mM) , GalNAc-T2 (40 µL, 0.04 U) y MnCl2 100 mM (40 µL, 4 mM) entonces se adicionaron y la solución resultante se incubó a temperatura ambiente. Después de 24 horas, el análisis MALDI indicó que la reacción estaba completa. La mezcla de. reacción se -sujetó directamente a la purificación por medio de CLAR utilizando SEC (Superdex 75 y Superdex 200) y un amortiguador de elusión que comprendía PBS (solución salina amortiguada con. fosfato, pH 4.9 y Tween 80 0.005%). El pico recolectado de G-CSF-GalNAc se concentró utilizando el filtro MWCO de 5 KDa Centricon a aproximadamente 150 µL y el volumen se ajustó a 1 ml utilizando PBS (solución salina amortiguada con fosfato, pH 4.9 y Tween 80 0.005%). Concentración final de proteína 1 mg/mL (A2so) , rendimiento 100%. La muestra se almacenó a 4°C.

Jb. Preparación de G -CSF- GalNAc -SA- PEG utilizando G-CSF-GalNAc purificado, CMP-SA-PEG (20 KDa) y ST6GalNAc-TI de ratón (pH 6.2) A la solución de G-CSF-GalNAc que contenía 1 mg de proteína se le intercambió el amortiguador por amortiguador de MES 25 mM (pH 6.2, NaN3 0.005%) y se adicionó CMP-SA-PEG (20 KDa) (5 mg, 0.25 umol). Después de la disolución, se adicionó MnCl2 (100 mcL, solución 100 mM) y ST6GalNAc-I (100 mcL, enzima de ratón) y la mezcla de reacción se meció lentamente a 32 °C durante tres días. La mezcla de reacción se concentró por medio de la ultrafiltración (MWCO 5K) y el amortiguador se intercambió por NaOAc 25 mM (pH 4.9) una vez y luego se concentró a 1 mL de volumen total. El producto entonces se purificó utilizando SP-Sepharose" (A: NaOAc 25 mM+Tween-80 0.005% pH 4.5; B: NaOAc 25 mM+Tween-80 0.005% pH 4.5+NaCl 2 M) a un tiempo de retención de 13-18 minutos y SEC (Superdex 75; PBS-pH 7.3, Tween 80 0.005%) a- un tiempo de retención de 8.6 minutos (superdex 75, flujo de 1 ml/minuto) . Las fracciones deseadas se recolectaron, se concentraron a 0.5 mL y se almacenaron a 4°C.

EJEMPLO 4 Método en un Crisol para Elaborar el G-CSF-GalNAc-SA-PEG con la Adición Simultánea de Enzimas El siguiente ejemplo ilustra la preparación de G-CSF-GalNAc-SA-PEG en un crisol utilizando la adición simultánea de enzimas. 1. Proceso en un crisol utilizando ST6GalNAc-I de ratón (pH 6. 0) El G-CSF (960 µg de proteína disuelta en 3.2 mL del amortiguador de formulación del producto) se concentró por medio de la ultrafiltración (MWCO 5 K) a 0.5 ml y se reconstituyó con amortiguador de MES 25 mM (pH 6.0, NaN3 0.005%) a un volumen total de aproximadamente 1 mL o una concentración de proteína de 1 mg/mL. Luego se adicionó UDP-GalNAc (6 mg, 9.21 µmol), GalNac-T2 (80 µL, 80 mU) , CMP-SA-PEG (20 KDa) (6 mg, 0.3 µmol) y enzima de ratón ST6GalNAc-I (120 µL) y MnCl2 100 mM (50 µL) . La solución se meció a 32 °C durante 48 horas y se purificó utilizando condiciones de cromatografía estándar en SP-Sepharose" . Se obtuvo un total de 0.5 mg de proteína (A280) o un r-endimiento total de aproximadamente 50%. La estructura del producto se confirmó por medio del análisis con tanto MALDI como SDS-PAGE. 2. Proceso en un crisol utilizando ST6GalNAc-I de pollo (pH 6. 0) 14.4 mg de G-CSF se concentraron a un volumen final de 3 mL, el amortiguador se intercambió por amortiguador de MES 25 mM (pH 6.0, NaN3 0.05%, Tween 80 0.004%) y el volumen se ajustó a 13 mL. Luego se adicionó el UDP-GalNAc (90 mg, 150 µmol), GalNAc-T2 (0.59 U) , CMP-SA-PEG-20 KDa (90 mg) , ST6GalNAc-I de pollo (0.44 U) y MnCl2 100 mM (600 mcL) . La mezcla resultante se almacenó a temperatura ambiente durante 60 horas . La mezcla de reacción entonces se concentró utilizando UF {MWCO 5 K) y la centrifugación. El residuo (aproximadamente 2 mL) se disolvió en amortiguador de NaOAc 25 mM (pH 4.5) y se concentró nuevamente a un volumen final de 5 mL. Esta muestra se purificó utilizando SP-Sepharose" durante aproximadamente 10-23 minutos, SEC (Superdex 75, 17 minutos, velocidad de flujo de 0.5 ml/minuto) y un SEC adicional (Superdex 200, 23 minutos, velocidad de flujo de 0.5 ml/minuto), para producir 3.6 mg (rendimiento total de 25%) de G-CSF-GalNAc-SA-PEG-20 KDa (método A280 y BCA) .

EJEMPLO 5 Método en un crisol para Elaborar el G-CSF-GalNAc-Gal-SA-PEG con la Adición Secuencial de Enzimas El siguiente ejemplo ilustra un método para elaborar el G-CSF-GalNAc-Gal-SA-PEG en un crisol con la adición secuencial de enzimas. 1. Inicio a partir de GalNAc-G-CSF a . Preparación de G-CSF-GalNAc (pH 6.2) a partir de G-CSF y ÜDP-GalNAc utilizando GalNAc-T2 El G-CSF (960 mcg) en 3.2 mL de amortiguador empacado se concentró por medio de la ultrafiltración utilizando un filtro UF (MWCO 5 K) y luego se reconstituyó con 1 mL de amortiguador de MES 25 mM (pH 6.2, NaN3 0.005%) . Luego se adicionó UDP-GalNAc (6 mg, 9.24 mM) , GalNAc-T2 (40 µL, 0.04 U) y MnCl2 100 mM (40 µL, 4 mM) y la solución resultante se incubó a temperatura ambiente.

Jb. Preparación de G - CSF -GalNAc- Gal -SA- PEG a partir de G-CSF-GalNAc; UDP- Galactosa, SA-PEG-20Kdalton y las Enzimas Apropiadas La UDP-Galactosa (4 mg, 6.5 µmoles), núcleo-1-Gal-T (320 µL, 160 mU) , CMP-SA-PEG-20 KDa (8 mg, 0.4 µmol), ST3Gal2 (80 µL, 0.07 mU) y MnCl2 100 mM (80 µL) se adicionaron directamente a la mezcla de reacción cruda de G-CSF-GalNac (1.5 mg) en 1.5 ml de amortiguador de MES 25 mM (pH 6.0) del paso a anterior. La mezcla resultante se incubó a 32°C durante 60 horas. La mezcla de reacción se. centrifugó y la solución se concentró utilizando la ultrafiltración (MWCO 5 K) a 0.2 mL y luego se disolvió nuevamente en NaOAc 25 mM (pH 4.5) a un volumen final de 1 mL. El producto se purificó utilizando SP-Sepharose"R (tiempo de retención entre 10-15 minutos) , la fracción del pico se concentró utilizando un filtro de rotación (MWCO 5 K) y el residuo se purificó adicionalmente utilizando SEC (Superdex 75, tiempo de retención de 10.2 minutos). Después de la concentración utilizando un filtro de rotación (MWCO 5 K) , la proteína se diluyó a 1 mL utilizando amortiguador de formulación con PBS, manitol 2.5%, polisorbato 0.005%, pH 6.5 y se formuló a una concentración de proteína de 850 mcg de proteína por mL (A28o) • El rendimiento total fue 55%.

EJEMPLO 6 Método en un Crisol para Elaborar el G-CSF-GalNAc-Gal-SA-PEG con la Adición Simultanea de Enzimas a. Iniciando a partir de G-CSF El G-CSF (960 mcg, 3.2 ml) se concentró por medio de la ultrafiltración (MWCO 5 K) y se reconstituyó con amortiguador de Mes 25 mM (pH 6.0, NaN3 0.005%). El volumen total de la solución de G-CSF fue aproximadamente 1 mg/ml . Entonces se adicionó UDP-GalNAc (6 mg) , GalNAc-T2 (80 µL, ~80 µU) , UDP-Gal (6 mg) , Núcleo 1 GalT (160 µL, 80 µU) , CMP-SA-PEG (20 K) (6 mg) y una 2 , 3- (0) -sialiltransferasa (160 µL, 120 µU) , MnCl2 100 mM (40 µL) . La mezcla resultante se incubó a 32 °C durante 48 horas. La purificación se realizó como se describe posteriormente utilizando IEX y SEC. La fracción resultante que contenía el producto se concentró utilizando la .ultrafiltración (MWCO 5 K) y el volumen se ajustó a aproximadamente 1 mL con amortiguador. Se determinó que la concentración de proteína era 0.392 mg/ml por medio de A2-80, dando un rendimiento total de 40% del G-CSF. Se entiende que los ejemplos y las modalidades que se describen en este documento son para propósitos ilustrativos únicamente y que varias modificaciones o cambios en vista de los mismos serán sugeridos a las personas expertas en el campo y deben incluirse dentro del espíritu y esfera de acción de esta solicitud y el alcance de las reivindicaciones anexas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas en este documento son incorporadas por este acto a manera de referencia en su totalidad para todos los propósitos.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un péptido de factor de estimulación de colonias de granulocitos, caracterizado porque comprende la porción: en donde D es un miembro seleccionado de -OH y R1-L-HN-; G es un miembro seleccionado de R1-L- y -C(O)-alquilo de 1 a 6 átomos de carbono; R1 es una porción que comprende un miembro seleccionado de una porción que comprende un residuo de poli (etilenglicol) de cadena recta o ramificada; y L es un conector el cual es un miembro seleccionado de un enlace, un grupo alquilo sustituido o no sustituido o heteroalquilo sustituido o no sustituido, de manera que cuando D es OH, G es Rx-L- y cuando G es -C (O) -alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, D es Ra-L-NH-. 2. El péptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque L-R1 está representado por la fórmula: en donde a es un número entero o de 0 a 20. 3. El péptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque R1 tiene una estructura que es un miembro seleccionado de: , en donde e y f son números enteros seleccionados independientemente de 1 a 2500; y q es un número entero de 0 a 20. . El péptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque R1 tiene una estructura que es un miembro seleccionado de: en donde e, f y £' son números enteros seleccionados independientemente de 1 a 25O0; y q y q' son números enteros seleccionados independientemente de 1 a 20. 5. El péptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque R1 tiene una estructura que es un miembro seleccionado de: en donde e, f y f son números enteros seleccionados independientemente de 1 a 2500; y q, q' y q" son números enteros seleccionados independientemente de 1 a 20. 6. El péptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque R1 tiene una estructura que es un miembro seleccionado de: — C(O)CH2CH2(OCH2CH2)eOCH3 . y J— e(O)OCH2CH2(OCH2CH2) CH3 en donde e y f son números enteros seleccionados independientemente de 1 a 2500. 7. El péptido de G-CSF de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la porción tiene la fórmula: 8. El péptido de G-CSF de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la porción tiene la fórmula : 9. El péptido de G-CSF de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la porción tiene la fórmula: en donde AA es un residuo de aminoácido del péptido. .10. El péptido de G-CSF de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el residuo de aminoácido es un miembro seleccionado de serina o treonina. 11. El péptido de G-CSF de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID.. NO:l. 12. El péptido de G-CSF de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el residuo de aminoácido es treonina en la posición 133 de la SEC. ID. NO:l. 13. El péptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEC. ID. NO:l y la SEC ID NO: 2. 14. El péptldo de G-CSF de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la porción tiene la fórmula: en donde a, b, c, d, i, r, s, t y u son números enteros seleccionados independientemente de 0 y 1. q es 1; e, f, g y h son miembros seleccionados independientemente de los números enteros de 0 a 6; j , k, 1 y m son miembros seleccionados independientemente de los números enteros de 0 a 100; v, w, x e y se seleccionan independientemente de 0 y 1 y al menos uno de v, w, x e y es 1; AA es un residuo de aminoácido del péptido de G- CSF; Sia-(R) tiene la fórmula: en donde D es un miembro seleccionado de -OH y R1-L-HN-; G es un miembro seleccionado de R^L- y -C(O)-alquilo de 1 a 6 átomos de carbono; R1 es una porción que comprende un miembro seleccionado de un residuo de poli (etilenglicol) de cadena recta. o ramificada; y L es un conector el cual es un miembro seleccionado de un enlace, alquilo sustituido o no sustituido o heteroalquilo sustituido o no sustituido, de tal manera que cuando D es OH, G es R1-L- y cuando G es -C(O) -alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, D es Ra-L-NH-. 15. El péptido de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el. residuo de aminoácido es un residuo de asparagina. 16. El péptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido es un péptido de factor de estimulación de colonias de granulocitos bioactivo. 17. ün método para preparar un conjugado del péptido de G-CSF que comprende la porción: en donde D es un miembro seleccionado de -OH y R1-L-HN-; G es un miembro seleccionado de R1-L- y -C(O)-alquilo de 1 a 6 átomos de carbono; R1 es una porción que comprende un miembro seleccionado de un residuo de poli (etilenglicol) de cadena recta o ramificada; y L es un conector el cual es un miembro seleccionado de un enlace, alquilo sustituido o no sustituido o heteroalquilo sustituido o no sustituido, de tal manera que cuando D es OH, G es R1-L- y cuando G es -C (0) -alquilo de 1 a 6 átomos de. carbono, D es R1-L-NH-, el método está caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto un péptido de G-CSF de substrato con una porción donadora de PEG-ácido siálico que tiene la fórmula:. y una enzima que transfiera el PEG-ácido siálico sobre un residuo de aminoácido o glicosilo del péptido de G- CSF, bajo condiciones apropiadas para la transferencia. 18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque L-R1 está representado por la 5 fórmula: en donde 10 a es un número entero de 0 a 20. 19. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque R1 tiene una estructura que es un miembro seleccionado de: 20 en donde e y f son números enteros seleccionados independientemente de 1 a 2500; y q es un número entero de 0 a 20. -25 20. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque R1 tiene una estructura que es un miembro seleccionado de: en donde e, f y f son úmeros enteros seleccionados independientemente de 1 a 2500; y q y q' son números enteros seleccionados independientemente de 1 a 20. 21. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque R1 tiene una estructura que es un miembro seleccionado de: en donde e, f y f son números enteros seleccionados independientemente de 1 a 2500; y q, q' y q" son números enteros seleccionados independientemente de 1 a 20. 22. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque R1 tiene una estructura que es un miembro seleccionado de: |— C(0)CH2CH2(OCH2CH2)eOCH3 5 y — C(O)OCH2CH2(OCH2CH2)fOCH3 en donde e y f son números enteros seleccionados independientemente de 1 a 2500. 23. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque comprende además, antes del paso (a) : (b) expresar el péptido de factor de estimulación de colonias de granulocitos de substrato en un hospedante adecuado. 24. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el hospedante se selecciona de una célula de insecto y una célula de mamífero. 25. Un método para estimular la producción de leucocitos inflamatorios en un mamífero, el método está caracterizado porque comprende administrar al mamífero un péptido de conformidad con la reivindicación 1. 26. Un método para tratar la infección en un sujeto en necesidad del mismo, el método está caracterizado porque comprende el paso que consiste en administrar al sujeto una cantidad de un péptido de conformidad con la reivindicación 1, que es efectiva para aliviar la condición en el sujeto. 27. Una formulación farmacéutica, caracterizada porque comprende el péptido de factor de estimulación de colonias de granulocitos de conformidad con la reivindicación 1 y un portador farmacéuticamente aceptable. 28. Un método para replegar una proteína recombinante, insoluble del factor de estimulación de colonias de granulocitos (GCSF) , el método está caracterizado porque comprende los pasos que consisten n: (a) solubilizar la proteína del GCSF; y (b) poner en contacto la proteína soluble del GCSF con un amortiguador que comprende un acoplamiento redox para replegar la proteína del GCSF, en donde la proteína del GCSF replegada es biológicamente activa. -