MXPA06005584A - Metodo para purificar hormona estimulante de foliculo - Google Patents

Abstract

La invención proporciona un método para purificar FSH recombinante.

Description

MÉTODO PAIRA PURIFICAR HORMONA ESTIMULANTE DE FOLÍCULO CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere al campo de la purificación de proteínas, particularmente la purificación de la hormona estimulante del folículo (FSH, por sus siglas en inglés) .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La hormona estimulante del folículo (FSH) es una proteina inyectable que cae en la clase de las gonadotropinas . La FSH es utilizada en el tratamiento de la infertilidad y trastornos reproductivos en pacientes masculinos y femeninos. En la naturaleza, la FSH es secretada por la glándula pituitaria. Para el uso farmacéutico, la FSH puede ser producida reco binantemente (rFSH) , o ésta puede ser aislada de la orina de mujeres postmenopáusicas (uFSH) . La FSH es utilizada en pacientes femeninos en la inducción de la ovulación (01, por sus siglas en inglés) y en la hiperestimulación ovárica controlada (COH, por sus siglas en inglés) para tecnologías reproductivas asistidas (ART, por sus siglas en inglés) . En un régimen de tratamiento tipico para la inducción de la ovulación, una paciente es administrada diariamente con inyecciones de FSH o una variante (aproximadamente 75 a 300 Ul de FSH/dia) por un Ref . : 172634 periodo de aproximadamente 6 a aproximadamente 12 días . En un régimen de tratamiento típico para la hiperestimulación ovárica controlada, a un paciente se le administran inyecciones diarias de FSH o una variante (aproximadamente 150-600 Ul de FSH/día) por un periodo de aproximadamente 6 a aproximadamente 12 días . La FSH es también utilizada para inducir la espermatogénesis en hombres que sufren de oligospermia. Un régimen que utiliza 150 Ul de FSH 3 veces a la semana en combinación con los 2 '500 Ul de hCG dos veces a la semana, ha sido exitoso en lograr un mejoramiento en la cuenta de espermatozoides en hombres que sufren de hipogonadismo hipogonadotrópico [Burges et al; Subcutaneous self-administation of highly purified follicle stimulating hormone and human chorionic gonadotrophin for the treatment of male hypogonadotrophic hypogonadism. Spanish Collaborative Group on Male Hypogonadotrophic Hypogonadism; Hum. Reprod; 1997, 12, 980-6] . Debido a la importancia de la FSH en el tratamiento de trastornos de la fertilidad, la provisión de FSH de alta pureza y alta actividad específica, es deseable. El tratamiento de FSH requiere la inyección repetida. Las preparaciones de FSH altamente purificadas pueden ser administradas subcutáneamente, permitiendo la auto-administración por el paciente, incrementado de este modo en gran medida la conveniencia y cumplimiento del paciente. Lynch et al . [The extraction and purification of human pituitary follicle-stimulating hormona and luteinising hormone; Acta Endocrinologica, 1988, 288, 12-19] describe un método para purificar la FSH de pituitaria humana. El método involucra la cromatografía de intercambio aniónico y catiónico, y la cromatografía de exclusión de tamaño. Se dice que el método da como resultado la FSH de pituitaria que tiene una actividad específica de 4,990 Ul (inmunoensayo) /mg, con 16 IU/mg de LH. El contenido de proteína fue determinado ya sea por el peso seco o en solución por absorción a 280 nm (asumiendo que A280?cm para 1 g/litro es igual a 1) . El documento WO 98/20039 (IBSA Institut Biochimique SA) describe un proceso para la purificación de la FSH de-orina humana, comenzando con extractos urinarios llamados gonadotropinas menopáusicas humanas (hMG, por sus siglas en inglés) . El proceso utiliza la cromatografía de intercambio iónico sobre resinas de intercambio aniónico débilmente alcalinas del tipo DEAE, seguido por cromatografía de afinidad sobre resina que tiene un derivado de antraquinona como un ligando. Se dice que el proceso produce una FSH urinaria libre de LH y que tiene una actividad específica de 6,870 Ul (inmunoensayo) /mg. El contenido de proteína fue determinado asumiendo que una solución en agua de 1 mg/ml de proteína tiene densidad óptica de 0.62 a 277 nm, en cubetas de cuarzo con una longitud de trayectoria de 1 cm. El documento WO 00/63248 (Instituto Massone SA) describe un proceso para la purificación de las gonadotropinas , incluyendo la FSH, a partir de orina humana. El proceso involucra los siguientes pasos : cromatografía de intercambio iónico con una resina catiónica fuerte del tipo sulfopropilo, cromatografía de intercambio iónico con una resina aniónica fuerte y cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC, por sus siglas en inglés) . Una preparación de FSH que tiene una utilidad específica de 8,400 Ul/mg (método de Steeleman-Pohley: Assay of the follicle stimulating hormone based on the argumentation with human chorionic gonadotrophin; Endocrinology; 1953, 53, 604-616) y menos de 1 Ul de LH (método de ganancia en peso de vesícula seminal de rata: Van Hell H, Matthijsen R & GA Overbeek; Acta Endocrinol, 1964, 47, 409) la actividad biológica por 75 Ul de FSH es al parecer obtenido. El contenido de proteína fue realizado mediante el método de Lowry [O. H. Lowry et al . , J. Biol. Chem. 1951, 193, 265] . La Patente de los Estados Unidos No. 5,990,288 (Musick et al) , describe un método para purificar FSH a partir de muestras biológicas, tales como glándulas pituitarias humanas u orina post-menopáusica humana. El proceso utiliza cromatografía de afinidad de colorante. Se dice que el proceso da como resultado FSH de pituitaria humana que tiene una afinidad específica de 7,066 Ul (inmunoensayo/mg y menos de 1 Ul (inmunoensayo) /mg de LH, y una FSH urinaria que tiene una actividad específica de 6,298 Ul (inmunoensayo) /mg y menos de 3 Ul (inmunoensayo) /mg de LH. El contenido de proteína fue determinado mediante absorción a 280 nm (asumiendo que A280lcm para 1 g/litro es igual a l). Chiba et al [Isolation and partial characterisation of LH, FSH y TSH from canine pituitary gland; Endocrinol, J. , 1997, 44, 205-218] describen una técnica para purificar gonadotropinas de pituitaria canina, incluyendo FSH, utilizando la cromatografía de afinidad de Concanavalina A (CON) A, cromatografía de interacción cromofóbica (HIC) y cromatografía de ion metálico inmovilizado con Cu++. Se reporta que la FSH resultante tiene una actividad específica de 2.17 Ul/g de proteína, utilizando un ensayo de radiorreceptor para FSH para la medición de la actividad biológica, y el equipo de ensayo de proteína BioRad (BioRad Laboratorios CA EUA) para determinar el contenido de proteína. El documento WO 88/10270 (Instituto di Ricerca Cesare Serono SPA) describe un método para purificar FSH humana de orina. El proceso involucra la inmunocromatografía con anticuerpos onoclonales inmovilizados específicos de FSH enlazados a Sepharose 4B por divinilsulfona, seguido por HPLC de fase inversa. La FSH resultante está libre de LH y otras proteínas urinarias, y tienen una actividad específica de 6,200 Ul/mg de polvo liofilizado (método de Steelman-Pohley) . La preparación fue la primera preparación de FSH que es adecuada para la administración subcutánea, debido a su gran pureza. Sigue existiendo una necesidad creciente para nuevos métodos para purificar FSH.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Un objetivo de la invención es proporcionar un nuevo método para purificar FSH recombinante o una variante de FSH. En un primer aspecto, la invención proporciona un método para purificar FSH humana recombinante o una variante de FSH, que comprende los pasos de: (1) cromatografía de intercambio iónico; (2) cromatografía de ion metálico inmovilizado; (3) cromatografía de interacción cromofóbica (HIC) ; que pueden ser llevados a cabo en cualquier orden.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra un diagrama de flujo que muestra la purificación de la rhFSH. La figura 2 muestra el perfil de elución de la cromatografía de rhFSH cruda sobre Q Sepharose FF como se detecta mediante densidad óptica (OD, por sus siglas en inglés) a 280 nm. La figura 3 muestra el perfil de elución para la cromatografía IMAC de rhFSH parcialmente purificada como se detecta por OD a 280 n . La figura 4 muestra el perfil de elución para la cromatograf a de DEAE Sepharose rhFSH parcialmente purificada como se detecta por OD a 280 nm. La figura 5 muestra el perfil de elución para la cromatografía de fenil-Sepharose rhFSH parcialmente purificada como se detecta por OD a 280 nm. La figura 6 muestra el perfil de elución del paso de RPC utilizando una columna Source 30 RPC.

Abreviaturas Se utilizan las siguientes abreviaturas en la descripción de la invención: FSH: hormona estimulante de folículo; rFSH: FSH recombinante; hFSH: FSH humana rhFSH: FSH humana recombinante; BV: volumen de lecho; DEAE: dietila inoetilo; IMAC: cromatografía de afinidad de ion metálico inmovilizado ; OD: densidad óptica; HIC: cromatografía de interacción hidrofóbica; HPLC: cromatografía líquida de alta resolución; IRMA: ensayo inmunorradiométrico; KD o kD: kiloDalton; HCP: proteína de célula hospedera, proteínas que surgen de la célula hospedera utilizada para la expresión de FSH; IPC: controles en proceso; RP-HPLC: cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa; QFF: intercambio aniónico sobre Q Sepharose FF.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención proporciona un método para purificar la FSH humana recombinante o una variante de FSH, que comprende los pasos de : (1) cromatografía de intercambio iónico; (2) cromatografía de ion metálico inmovilizado; (3) cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) ; que pueden ser llevados a cabo en cualquier orden. El método de purificación de la invención permite obtener una FSH purificada de una pureza comparable a los productos de FSH conocidos, tales como Gonal-F (Serono) y Metrodin-HP (Serono) . El material inicial para la purificación es FSH recombinante.

Modalidades preferidas de la invención El método de purificación de la invención involucra un paso de cromatografía de intercambio iónico. En una modalidad preferida, el paso de cromatografía de intercambio iónico es llevado a cabo con una resina de intercambio aniónico fuerte, particularmente y de manera preferida una resina de amonio cuaternario tal como Q Sepharose FF (Amersham Biosciences) , o una resina que tiene características similares como sigue: Tipo de intercambio iónico: anión fuerte Capacidad total (mmol/mi) : 0.18-0.25 Límite de exclusión (proteínas globulares) : 4 x 106 Forma de la esfera: Esférica, diámetro 45-165 µm Estructura de la esfera: agarosa reticulada, 6% Estabilidad de pH operacional : 2-12 Estabilidad de pH de limpieza: 1-14 Velocidad de flujo lineal a 25 °C, 1 bar, lecho de 15 cm de altura, columna xk 50/30: 400-700 cm/h En el paso de cromatografía de intercambio iónico, la elución es preferentemente llevada a cabo utilizando un amortiguador que tiene un pH levemente alcalino (por ejemplo, de o aproximadamente 7.2 hasta o aproximadamente 9.0, o en o de aproximadamente 8.0, o en o de aproximadamente 9.0, más preferentemente en o aproximadamente 8.5) . Los amortiguadores adecuados incluyen, por ejemplo, amortiguador de borato, trietanolamina/ácido iminodiacético. Es más preferido el amortiguador de borato, a un pH de o de aproximadamente 8.5. La concentración de la especie amortiguadora de elución está preferentemente dentro del intervalo de o de aproximadamente 10 hasta o aproximadamente 10 mM, más preferentemente hasta o aproximadamente 25 o hasta o aproximadamente 75 mM, lo más preferentemente en o aproximadamente 50 mM. Antes del paso de cromatografía de intercambio iónica, puede ser deseable llevar a cabo un paso de ultrafiltración, con el fin de concentrar la FSH cruda. La ultrafiltración (o diafiltración) es preferentemente llevada a cabo utilizando una membrana que tiene un corte de o de aproximadamente 3-10 kD, más preferentemente de o de aproximadamente 5 kD . El método de la invención también involucra un paso de cromatografía de ion metálico inmovilizado. En una modalidad preferida, el paso de cromatografía de ion metálico inmovilizado es llevado a cabo utilizando una resina que tiene grupos quelatos tridentados, tales como por ejemplo, ácido iminodiacético (IDA) , y un ion metálico divalente, M2+, tal como Cu2+, Zn2+, Ni2+, Ca2+, Mg2+ y Co2+, preferentemente Cu++. El grupo quelante de iones metálicos es enlazado a un soporte sólido adecuado, tal como, por ejemplo, Sepharose. Una resina particularmente preferida es Sepharose FF quelante (Amersham Biosciences) , u otras resinas que tienen características similares, como sigue: Composición agarosa al 6% altamente reticulada Tamaño de partícula: 45-165 µ Ligando : grupos ácidos iminodiacético sobre el espaciador Química de acoplamiento : epoxi Capacidad de ion metálico : 30 - 37 µmol Cu2+/ml estabilidad de pH (operacional) : 3-13 Estabilidad de pH (corto plazo) : 2-14 Presión/espec de flujo: matriz base 200-400 cm/h, 1 bar (100 kPa) , columna XK 50/60, altura del lecho 25 cm La elución en el paso de cromatografía de ion metálico inmovilizado debe ser llevada a cabo utilizando un amortiguador de imidazol, fosfato o acetato, particularmente y de manera preferida, acetato, tal como acetato de amonio. El pH del eluyente debe estar preferentemente en o aproximadamente 7.5 hasta o aproximadamente 10, más preferentemente hasta o aproximadamente 8.0, o en o aproximadamente 9.5, particularmente de manera preferida en o aproximadamente . La concentración de la especie amortiguadora en el eluyente debe estar preferentemente en o aproximadamente 0.1, hasta o aproximadamente 2 M, más preferentemente hasta o aproximadamente 0.5 M o hasta o aproximadamente 1 M, más preferentemente en o aproximadamente 0.75 M. El método también involucra un paso de cromatografía de interacción hidrofóbica. En una modalidad preferida, la cromatografía de interacción hídrofóbica es llevada a cabo con una resina tal como fenil-Sepharose FF HS (Amersham Biosciences) , o una resina que tiene características similares como sigue: Matriz : agarosa esférica altamente reticulada al 6% Tamaño medio de partícula: 90 µm Ligando hidrofóbico: fenilo Densidad del ligando: 40 Estabilidad de pH (corto plazo) : 2-14 Estabilidad del pH (largo plazo e intervalo de trabajo) : 3-13 La elución en el paso de cromatografía de interacción hidrofóbica es pref rentemente llevada a cabo utilizando un amortiguador que tiene un pH ligeramente alcalino (por ejemplo, de o aproximadamente 7.2 hasta o aproximadamente 9 , más preferentemente hasta o aproximadamente 7.5 hasta o aproximadamente 8.5, más preferentemente hasta o aproximadamente 8.25) . Un eluyente particularmente preferido es acetato de amonio (50 mM) /sulfato de amonio (0.25 M) , preferentemente a un pH de o de aproximadamente 8.25. Después del paso de cromatografía de interacción hidrofóbica, es podible también llevar a cabo un paso de cromatografía de fase inversa (RPC) . La RPC es preferentemente llevada a cabo utilizando una resina tal como SOURCE 30 RPC (Amersham Biosciences) . La elución es preferentemente llevada a cabo utilizando un amortiguador tal como acetato de amonio, preferentemente a pH ligeramente alcalina, por ejemplo a o aproximadamente pH 7-8.5, más preferentemente en o de aproximadamente 7.5 ó 7.6. La solución amortiguadora contiene preferentemente hasta o aproximadamente 5-25% (volumen/volumen) , preferentemente hasta o aproximadamente 10-20%, de un solvente orgánico miscible en agua, preferentemente un alcohol de 1 a 3 átomos de carbono, más preferentemente 2 -propanol (iso-propanol) . Los pasos de cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de ion metálico inmovilizado, y cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) , pueden ser llevados a cabo en cualquier orden, aunque se prefiere llevar a cabo el paso de cromatografía de intercambio iónico primeramente . Los pasos remanentes de la cromatografía de ion metálico inmovilizado, y cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) , pueden ser llevados a cabo en cualquier orden, aunque se prefiere seguir el orden mostrado en seguida: (1) cromatografía de intercambio iónico, (2) cromatografía de ion metálico inmovilizado, y (3) cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) . En una modalidad preferida adicional, entre el paso (2) y el paso (3) , es llevado a cabo un paso adicional (2a) de cromatografía de intercambio iónico, particularmente y de manera preferida con una resina de intercambio aniónico débil, tal como por ejemplo una resina de intercambio que posee grupos diaminoetilo, particularmente DEAE Sepharose FF. En una modalidad particularmente preferida, son llevados a cabo los pasos en el orden mostrado en seguida: (1) cromatografí de intercambio iónico, (2) cromatografía de ion metálico inmovilizado, (2a) es el segundo paso de cromatografía de intercambio iónico, y (3) cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) . En una modalidad particularmente preferida, el método de la invención comprende los pasos caracterizados como sigue: (1) cromatografía de intercambio iónico, (preferentemente con una resina de intercambio aniónico fuerte, tal como Q Sepharose FF) ; (2) cromatografía de ion metálico inmovilizado, (preferentemente con Sepharose FF quelante, utilizando Cu++ como el ion metálico) ; (2a) cromatografía de intercambio iónico (preferentemente con una resina de intercambio aniónico débil, tal como DEAE Sepharose FF) (3) cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) (preferentemente con fenil-Sepharose FF HS) . El segundo paso de cromatografía de intercambio iónico (2a) es preferentemente llevado a cabo utilizando un amortiguador de acetato de amonio como eluyente, preferentemente a un pH de o de aproximadamente 8.5.

Preferentemente, el amortiguador de acetato de amonio es de o de aproximadamente 0.05 hasta o aproximadamente 0.5 M, más preferentemente en o de aproximadamente 0.11 M. En una modalidad preferida adicional, después de cualquiera de los pasos de cromatografía (particularmente de manera preferida de un paso de cromatografía de fase inversa) , la muestra de FSH es sometida a concentración mediante ultrafiltración. La ultrafiltración (o diafiltración) es preferentemente llevada a cabo utilizando una membrana que tiene un corte de o de aproximadamente 3-10 kD, más preferentemente de o de aproximadamente 5 kD. En una modalidad particularmente preferida, son llevados a cabo los siguientes pasos en el orden mostrado en seguida: (0) ultrafiltración (preferentemente con una membrana que tiene un corte de o de aproximadamente 5 kD) , (1) cromatografía de intercambio iónico (preferentemente con Q Sepharose FF) , (2) cromatografía de ion metálico inmovilizado (preferentemente con Sepharose FF quelante y Cu++) , (2a) el segundo paso de cromatografía de intercambio iónico (preferentemente DEAE Sepharose FF) , (3) cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) (preferentemente con fenil-Sepharose FF HS) , (4) cromatografía de fase inversa (RPC) (preferentemente con Source 30 RPC) , y (5) ultrafiltración (preferentemente con una membrana que tiene un corte de 5 kD) . Puede ser deseable someter la muestra de FSH a un paso de nanofiltración, con el fin de asegurar que la preparación de FSH purificada esté libre de virus. La nanofiltración puede ser realizada en cualquier etapa del proceso de purificación, sin embargo, se prefiere particularmente llevar a cabo la nanofiltración después del segundo paso de la cromatografía de intercambio iónico, o después de la cromatografía de fase inversa o después de la ' cromatografía de interacción hidrofóbica. La nanofiltración puede ser llevada a cabo más de una vez, por ejemplo, ésta puede ser llevada a cabo dos veces . En una modalidad particularmente preferida, el método de la invención comprende los siguientes pasos: (0) ultrafiltración (preferentemente con una membrana que tiene un corte de o de aproximadamente 5 kD) , (1) cromatografía de intercambio iónico (preferentemente con Q Sepharose FF) , (2) cromatografía de ion metálico inmovilizado (preferentemente con Sepharose FF quelante y Cu++) , (2a) el segundo paso de cromatografía de intercambio iónico (preferentemente DEAE Sepharose FF) , (3) cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) (preferentemente con fenil- Sepharose FF HS) , (4) cromatografía de fase inversa (RPC) (preferentemente con Source 30 RPC) , y (5) ultrafiltración (preferentemente con una membrana que tiene un corte de 5 kD) , (6) nanofiltración.

Almacenamiento/liofilización La composición líquida que resulta del proceso de purificación como se describe anteriormente y que contiene la FSH purificada, puede ser congelada para el almacenamiento como tal, o después de la purificación, el eluido puede ser sometido a liofilización ("secado por congelamiento) para eliminar el solvente. El líquido o producto liofilizado resultante es denominado "FSH a granel" .

Formulaciones FSH Las FSH o una variante de FSH de la invención o purificada de acuerdo al método de la invención, debe ser formulada para inyección, ya sea intramuscular, subcutánea, preferentemente subcutánea. La formulación de FSH puede ser liofilizada, en cuyo caso ésta es disuelta en agua para la inyección justo antes de la inyección. La formulación de FSH puede ser también una formulación líquida, en cuyo caso ésta puede ser inyectada directamente, sin disolución previa. La formulación de FSH puede ser una dosis simple o una dosis múltiple. Si ésta es de dosis múltiple, debe contener preferentemente un agente bacterioestático, tal como, por ejemplo, alcohol bencílico, meta-cresol, timol o fenol, preferentemente, alcohol bencílico o metacresol . Las formulaciones de dosis simple pueden también comprender un agente bacterioestático. La FSH de la invención puede ser formulada con excipientes y estabilizadores conocidos, por ejemplo, sucrosa y manitol. Esta puede comprender también un antioxidante, tal como metionina. Esta puede comprender además un surfactante, tal como TWEEN (preferentemente TWEEN 20) , o Pluronic (preferentemente Pluronic F68) . En una formulación de dosis múltiples particularmente preferidas, la FSH producida mediante el método de la invención es formulada al disolverla en agua para inyección con sucrosa, amortiguador de fosfato (pH 7) , Pluronic F68, metionina y metal-cresol o alcohol bencílico.

Indicaciones La FSH de la invención es adecuada para el uso en todos los tratamientos donde es indicada la FSH. Esta es particularmente adecuada para la administración subcutánea en inducción de la ovulación y para estimulación controlada de los ovarios para tecnologías reproductivas asistidas, y en el tratamiento de la oligospermia. Esta puede ser utilizada en conjunto con otras gonadotropinas , tales como LH y hCG. Esta puede ser también utilizada con compuestos que aumentan la respuesta a FSH, tal como el citrato de clomifeno, inhibidores de la aromatasa, tales como Anastrozol, Letrozol, Fadrozol e YM-511.

Secuencias SEQ ID No. : 1: subunidad a de la glucoproteína humana; SEQ ID No.: 2: subunidad ß de hFSH; SEQ ID No. : 3: variante 1 de la subunidad ß de hFSH; SEQ ID No. : 4: variante 2 de la subunidad ß de hFSH; SEQ ID No. : 5: variante 3 de la subunidad ß de hFSH. La hormona estimulante del folículo, o FSH, como se utiliza en la presente, se refiere a la FSH humana (hFSH) producida como una proteína madura de longitud completa. La FSH es un dímero compuesto de la subunidad alfa de la glucoproteína humana y la subunidad beta de la FSH humana. La secuencia de proteínas de la subunidad alfa de la glucoproteína humana es proporcionada en la SEQ ID No.: 1, y la secuencia proteica de la subunidad beta de FSH humana es dada en la SEQ ID No. : 2. El uso del término "recombinante" se refiere a las preparaciones de FSH que son producidas a través del uso de la tecnología de ADN recombinante (ver por ejemplo WO 85/01958) . Un ejemplo de un método para expresar FSH utilizando la tecnología recombinante es mediante transfección de las células eucarióticas con secuencias de ADN que codifican para una subunidad alfa y beta de FSH, ya sea proporcionadas sobre un vector o sobre dos vectores, con cada subunidad que tiene un promotor separado, como se describe en las patentes Europeas nos. EP 0 211 894 y EP 0 487 512. El ADN que codifica para FSH puede ser un ADNc o éste puede contener intrones . Otro ejemplo más del uso de la tecnología recombinante para producir FSH, es mediante el uso de la recombinación homologa para insertar un segmento regulatorio heterólogo en conexión operativa a las secuencias endógenas que codifican para una o ambas de las subunidades de FSH, como se describe en la Patente Europea No. 0 505 500 (Applied Research Systems ARS Holding NV) . Son también contemplados los métodos tales como aquellos descritos en WO 99/57263 (Transkaryolic Therapies) , en donde una de las subunidades es insertada heterólogamente dentro de una célula, y la otra subunidad es expresada por activación de las secuencias genómicas por inserción de un segmento regulatorio heterólogo mediante recombinación homologa. El método de la invención puede ser utilizado para purificar FSH expresado utilizando cualquiera de estos métodos . La expresión "célula recombinante" se refiere a una célula producida mediante la inserción de ADN heterólogo, incluyendo cualquiera de los métodos anteriormente mencionados de manipulación genética. Preferentemente, la FSH es producida recombinantemente en células de ovario de hámster Chino (CHO) transfectadas sobre un vector o vectores que comprenden ADN que codifica para la subunidad alfa de la glucoproteína humana y la subunidad beta de FSH. El ADN que codifica para las subunidades alfa y beta puede estar presente sobre el mismo o sobre diferentes vectores. La expresión "variante de FSH" se entiende que abarca aquellas moléculas que difieren en la secuencia de aminoácidos, en un patrón de glucosilación o en enlace inter-subunidades proveniente de la FSH humana, pero que muestra actividad de FSH. Los ejemplos incluyen CTP-FSH, una FSH recombinante modificada de acción prolongada, que consiste de la subunidad alfa de tipo silvestre y una subunidad beta híbrida en la cual el péptido carboxilo-terminal de hSG ha sido fusionado al extremo C de la subunidad ß de FSH, como se describe en LaPolt et al.; Endocrinology; 1992, 131, 2514-2520; o Klein et al.; Development and characterization of a long-acting recombinant hFSH agonist; Human Reprod. 2003, 18, 50-56] . También se incluye CTP-FSH de cadena simple, una molécula de cadena simple, que consiste de la siguiente secuencia (del extremo N al extremo C) : en donde ßFSH significa la subunidad ß de FSH, ßhCG CTP (113- 145) significa el péptido carboxilo-terminal de hCG y aFSH significa la subunidad a de FSH, como se describe por Klein et al. [Pharmacokinetics and pharmacodyna ics of single-chain recombinant human follicle- stimulating hormone containing the human chorionic gonadotrophin carboxiterminal peptide in the rhesus onkey, Fertility & Sterility; 2002, 77, 1248-155] . Otros ejemplos de las variantes de FSH incluyen moléculas de FSH que tienen los sitios de glucosilación adicionales incorporados en la subunidad a y/o ß, como se describe en WO J)l/58493 (Maxygen) , y las moléculas de FSH con los enlaces S- S intersubunitarios, como se describe en WO 98/58957. Los ejemplos adicionales de variantes de FSH incluyen moléculas quiméricas que comprenden secuencias de FSH y secuencias de hCG o LH, tales como aquellas descritas en WO 91/16922 y WO 92/22568. Las variantes de FSH referidas en la presente, también incluyen las supresiones carboxilo-terminales de la subunidad beta que son más cortas que la proteína madura de longitud completa de la SEQ ID No.: 2. Las supresiones carboxilo-terminales de la subunidad beta humana son proporcionadas en las SEQ ID Nos . : 3 , 4 y 5. Se entiende que las variantes carboxilo-terminales de la cadena beta forman dímeros con una subunidad alfa conocida para formar un heterodímero variante de FSH. En una modalidad preferida, la FSH es producida recombinante en células CHO.

En una modalidad preferida, la FSH purificada producida de acuerdo al método de la invención, es adecuada para la administración subcutánea, permitiendo la autoadministración por el paciente. La expresión "FSH recombinante cruda" se refiere sobre el nadante de cultivos celular provenientes de la células recombinantes que expresan FSH, antes de que haya surgido cualquier paso cromatográfico. La expresión abarca la forma bruta del sobrenadante (como es aislado a partir de las células) así como el sobrenadante concentrado y/o filtrado y/o ultra filtrado. El término "actividad biológica" en relación a la FSH, se refiere a la habilidad de una formulación de FSH para promover respuestas biológicas asociadas con FSH, tales como la ganancia de peso ovárica en el ensayo de Steelman-Pohley [Assay of the follicle stimulating hormone base on the augmentation with human chorionic gonadotrophin; Endocrinology; 1953, 53, 604-616], o el crecimiento folicular en un paciente femenino. El crecimiento folicular en un paciente femenino puede ser evaluado por ultrasonido, por ejemplo, en términos en número de folículos que tienen un diámetro medio de o de aproximadamente 16 mm en el día 8 de la estimulación. La actividad biológica es evaluada con respecto a un estándar aceptado para FSH. El contenido de LH en una preparación de FSH puede ser, por ejemplo, utilizando un inmunoensayo específico de LH, tal como Delfia hLH Spec (Wallac Oy, Turku, Finlandia) . El término "actividad específica" en referencia a FSH, significa la actividad biológica en unidades internacionales (Ul) de la preparación de un ensayo biológico reconocido para FSH, tal como el bioensayo de Steelman Pohley, dividido entre la cantidad de proteína, como es determinada por un ensayo para el contenido de proteína total, tal como el ensayo de Lowry [O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farry R.J. Randall (1951) J. Biol. Chem. 183: 265; Hartree E.E. (1972). Anal. Biochem. 48:422: J.R. Dulley y P.A. Grieve (1975) Anal. Biochem. 64: 136], el ensayo de Bradford [Bradford, M.M. (1976) Anal. Biochem. 72, 248] , o mediante absorbancia a 280 nm. Preferentemente, el FSH de la invención tiene una afinidad específica mayor que o de aproximadamente 4000 Ul/mg, más preferentemente mayor que o aproximadamente 6000 Ul/mg, aún más preferentemente mayor que o aproximadamente 7000 Ul/mg, aún más preferentemente mayor que o aproximadamente 8000 Ul/mg, en donde la actividad biológica es medida por el bioensayo de Steelman-Pohley y el contenido de proteína es medido por la OD a 280 nm.

Ejemplos Purificación El siguiente ejemplo proporciona la r-hFSH purificada, comenzando a partir de la r-hFSH cruda, concentrada, producida en biorreactores de 15 y 75 litros. En la figura 1 se presenta un diagrama de flujo del proceso de purificación descrito en los detalles en las siguientes secciones . La rhFSH purificada resultante es denominada "rhFSH a granel" . Para todos los amortiguadores , los valores de pH y conductividad fueron referidos a +25 °C; por ejemplo, la determinación del valor de conductividad fue realizada mediante el uso de un instrumento equipado con sonda de temperatura y el valor obtenido fue automáticamente compensado para la diferencia de la temperatura y referido a +25°C. Respecto a las mediciones de conductividad, el coeficiente de temperatura de correlación fue siempre ajustado a 2.

Paso 0: Diafiltración de la rhFSH cruda concentrada Equipo • Sistema de ultrafiltración tipo Pellicon Mini (Millipore o equivalente) • Membrana de ultrafiltración a corte 5 kD en polietersulfona tipo BIOMAX (Millipore o equivalente), 0.1 m . • Bomba peristáltica tipo Masterflex o equivalente Materiales • r-hFSH cruda concentrada • cantidad inicial: 200-400 mg de FSH determinada por el inmunoensayo de DELFIA para FSH (del biorreactor de 75 litros) pellas de hidróxido de sodio - (Merck) agua purificada (Modulab o equivalente) ácido bórico tetraborato de sodio decahidratato • hidróxido de sodio (pellas) amortiguador de borato (borato de sodio 50 mM pH 8.5 ± 0.1) : 3.06 g de ácido bórico y 10 g de tetraborato de sodio di-hidratado se agregaron a 900 mi de agua purificada mediante filtración, y se aforó hasta 1 litro.

PROCEDIMIENTO DE ULTRAFILTRACIÓN Todas las operaciones fueron realizadas en condiciones refrigeradas (3-8cC). La r-hFSH cruda concentrada (1-1.5 litros) fue ultrafiltrada bajo las siguientes condiciones: • amortiguador: borato de sodio 50 mM pH 8.5 ± 0.1, conductividad 1.9 + 0.2 mS/cm • flujo de permeado: 15-25 ml/minuto • presión de entrada: 1.5-2.2 bar • presión de transmembrana: 1.5-1.8 barias donde : La presión de la transmembrana (TMP) = (presión de entrada + presión de salida) /2 La solución de rhFSH fue concentrada hasta un volumen de 1 litro. • La fracción retenida fue diluida con un volumen de agua purificada y concentrada nuevamente hasta 1 litro (lavado) : • el paso de lavado fue repetido dos veces más ; • la conductividad del permeado fue verificada, y si es menor de 1.5 mS/cm la muestra progresó al siguiente paso, de otro modo el paso de lavado fue repetido .

Conductividad de permeado < 1.5 mS/cm • un volumen de fracción del retenido se diluyó a 2 volúmenes con el amortiguador de equilibrio y se concentró nuevamente hasta el volumen original . • la operación fue repetida dos veces. • el pH y la conductividad del permeado fue modificado y si el pH y la conductividad de la fracción perneada eran de 8.5 ± 0.1 y 1.9 ± 90.2 mS/cm, respectivamente, el permeado progresó al siguiente paso, de otro modo el paso de lavado fue repetido. pH del permeado = 8.5 ± 0.1 Conductividad de permeado: 1.9 ± 0.2 mS/cm • la fracción del retenido fue recolectada y el ultrafiltro fue lavado con tres alícuotas de amortiguador de equilibrio, recolectando y combinando los lavados con la fracción retenida de una manera tal como para tener un volumen final recolectado de alrededor 0.6 - 1.2 litros.

Volumen recolectado: 0.6 - 1.2 litros • esta fracción fue marcada como: <<Start Q>> • 5 muestras de 0.5 mi cada una fueron almacenadas a -20 °C por IPC. • el volumen de la fracción fue medida (ésta puede ser almacenada a +5 ± 3°C por no más de dos días) • las muestras fueron analizadas como sigue: DO a 280 nm, pH, conductividad y contenido y r-hFSH mediante inmunoensayo (DELFIA) , y RP-HPLC.

Paso 1 : Intercambio aniónico sobre Q Sepharose FF Equipo • columna cromatográfica XK 50/20 • bomba peristáltica tipo Masterflex o equivalente • cuarto frío • monitor de UV (longitud de proyector de óptica de 2.5 mm) equipado con grabadora de dos canales (Amersham Biosciences o equivalente) • espectofotómetro de UV (Shimadzu o equivalente) • potenciómetro (Metrohm o equivalente) • conductímetro (Metrohm o equivalente) • balanza (MettlerToledo o equivalente) • bomba peristáltica tipo Masterflex o equivalente Materiales r-hFSH cruda concentrada del paso de ultrafiltración cantidad inicial: 200-400 mg de FSH por DELFIA pellas de hidróxido de sodio - (Merck) agua purificada (Modulab o equivalente) ácido bórico tetraborato de sodio decahidratado hidróxido de sodio (pellas) cloruro de sodio ácido acético glacial Amortiguadores Amortiguador de equilibrio: borato de sodio 50 mM pH 8.5 ± 0.1, conductividad 1.9 ± 0.2 mS/cm Amortiguador de equilibrio: borato de sodio 50 mM cloruro de sodio 0.13 mM, pH 8.5 ± 0.1, conductividad 16 ± 1.5 mS/cm Solución de regeneración: cloruro de sodio 1.5 M, Solución de sanitización 1: ácido acético 0.1 M Solución de sanitización 2 : NaOH 0.5 M Solución de almacenamiento: NaOH 0.01 M Empaquetamiento de la columna La columna fue empaquetada con la resina de flujo rápido Q Sepharose Flow siguiendo las instrucciones del fabricante . La columna empaquetada tuvo las siguientes dimensiones : Diámetro : 5 cm Altura del lecho: 11 cm ± 10% Volumen del lecho: 190 - 240 mi.

Procedimiento de purificación Todas las operaciones fueron realizadas a: • temperatura: 3-8°C • velocidad de flujo: 240-280 cm/hora Sanitización de la columna La columna fue lavada a chorro con al menos 1 BV de hidróxido de sodio al 0.5 M, luego enjuagada con 3 BV de agua purificada.

Equilibrio de la columna La columna fue lavada a chorro de lado a lado con 6-7 ó más BV de amortiguador de equilibrio, borato de sodio 50 mM, pH 8.5 ± 0.1, conductividad 1.9 ± 0.2 mS/cm.

El pH y la conductividad fueron verificadas y el lavado fue continuado hasta que los parámetros del efluente de la columna estaban fuera de los valores objetivo: pH 8.25 ± 0.1, conductividad 1.9 ± 0.2 mS/cm Preparación del material inicial La r-hFSH concentrada y diafiltrada obtenida del paso de ultrafiltración fue ajustada a la cantidad indicada en la sección del material. El pH y la conductividad fueron verificadas, y las muestras fueron conservadas para IPC (5 x 0.5 mi) .

Carga El material inicial fue cargado sobre la columna equilibrada como se describe anteriormente. Lavado Cuando la carga de la muestra fue completada, la columna fue lavada a chorro con 2-3 BV del amortiguador de equilibrio. El volumen recolectado fue registrado, y las muestras fueron conservadas por IPC 5 x 0.5 mi, y la fracción fue desechad .

Elución La elución fue iniciada con borato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 0.13 M, pH 8.5 ± 0.1, conductividad 16 ± 1.5 mS/cm, la r-hFSH comenzó a eluir después de 0.7-1.0 BV desde el inicio. 4-5 BV fueron recolectados de la fracción de elución, mostrando dos picos, de acuerdo con el perfil cromatográfico descrito en la figura 2. El volumen recolectado fue registrado, y las muestras para IPC fueron retiradas (5 x 05 mi) . La fracción podría ser almacenada a 4°C por no más de dos días . Esta fracción contenía la r-hFSH semipurificada.

Paso (2) : IMAC sobre Sepharose ff quelante Equipo • columna cromatográfica C10/40 (Amersham Biosciences) • bomba peristáltica tipo miniplus 2 Gylson o equivalente • monitor de UV (longitud de trayectoria óptica de 2.5 mm) equipado con registrador de dos canales (Amersham Biosciences o equivalente) cuarto frío • espectofotómetro de UV (Shimadzu o equivalente) potenciómetro (Metrohm o equivalente) conductímetro (Metrohm o equivalente) balanza (MetterToledo o equivalente) bomba peristáltica tipo Masterflex o equivalente Materiales Post Q Sepharose FF r-hFSH pellas de hidróxido de sodio - (Merck) agua purificada (Modulab o equivalente) ácido bórico tetraborato de sodio decahidratado hidróxido de sodio (pellas) cloruro de sodio EDTA • acetato de amonio sulfato de cobre solución amoniacal al 25% Amortiguadores Solución de carga metálica: sulfato de cobre 0.2 M. Agua acidificada: 1 mi de ácido acético glacial fue agregado a 1 litro de agua purificada bajo agitación. Amortiguador de equilibrio: borato de sodio 50 mM pH 8.25 ± 0.1, cloruro de sodio 0.5 M. Elución: acetato de amonio 0.75 m, pH 9.0 ± 0.1, conductividad ± 0.5 mS/cm. Solución de regeneración: cloruro de sodio 0.5 M, EDTA 50 mM. Solución de sanitización: NaOH 0.5 M Solución de almacenamiento: NaOH 0.01 M Empaquetamiento de la columna La columna fue empaquetada con la resina de flujo rápido Sepharose quelante siguiendo las instrucciones del fabricante . La columna empaquetada tuvo las siguientes dimensiones: Diámetro: 10 cm Altura del lecho: 22 ± 10% Volumen del lecho: 16-20 mi Procedimiento de purificación Todas las operaciones fueron realizadas a: • temperatura : 5 ± 3 ° C • velocidad de flujo: 240-300 cm/hora Sanitización de la columna La columna fue lavada a chorro con al menos 1 BV de hidróxido de sodio al 0.5 M, luego enjuagada con 3 BV de agua purificada.

Carga de la columna La columna fue lavada a chorro con 5-6 BV de agua acidificada hasta que el pH fue < 4.5 (con indicador de pH) . La columna fue luego lavada a chorro con 3 BV de sulfato de cobre 0.2 M y nuevamente con 4-5 BV de agua acidificada hasta que el valor de la absorbancia (280 nm) alcanzó la línea base.

Equilibrio de la columna La columna fue lavada a chorro de lado a lado con 6 ó más BV de amortiguador de equilibrio, fosfato de sodio 50 mM, pH 8.25 ± 0.1, cloruro de sodio 0.5 M, conductividad 50 ± 5 mS/cm. El pH y la conductividad fueron verificadas y el lavado fue continuado si los parámetros del efluente de la columna estaban fuera de los valores objetivo: pH 8.25 ± 0.1, conductividad 50 ± 5 mS/cm Preparación del material inicial La r-hFSH obtenida del paso de Q Sepharose FF fue ajustada a pH 8.25 ± 0.1 mediante la adición de ácido orto-fosfórico al 35%, y conductividad a 50 ± 5 mS/cm mediante la adición de cloruro de sodio. Las muestras fueron retiradas para IPC (5 x 0.5 mi) .

Carga El material inicial fue cargado sobre la columna equilibrada como se describe anteriormente .

Lavado Cuando la carga de la muestra . fue completada, la columna fue lavada a chorro con 5-10 BV del amortiguador de equilibrio fosfato de sodio 50 mM, pH 8.25 + 0.1, cloruro de sodio 0.5 M, conductividad 50 ± 5 mS/cm. Fueron retiradas muestras (5 x 0.5 mi) para IPC y la fracción fue desechada.

Elución La elución fue iniciada con acetato de amonio 0.075 M, pH 9.0 ± 0.1, conductividad 7.2 ± 0.5 mS/cm. La r-hFSH comenzó a eluir como un pico principal después de 0.5 BV desde el inicio. 5-7 BV fueron recolectados del pico principal, comenzando cuando la densidad óptica en línea, se incrementó gradualmente, aproximadamente después de que se desechó los primeros 0.5 BV. Fueron retiradas muestras para IPC (5 x 0.5' mi) y la fracción fue almacenada a 3°-8°C por no más de dos días. El perfil de elución para el IMAC se muestra en la figura 3. Esta fracción contenía la r-hFSH semipurificada.

Paso (2a) : Intercambio aniónico sobre DEAE Sepharose FF Equipo • columna cromatográfica Ventage L 22/40 • bomba peristáltica tipo miniplus 2 Gylson o equivalente • cuarto frío monitor de UV (longitud de trayectoria óptica 2.5 mm) equipada con registro de dos canales (Amersham Biosciences o equivalente) espectofotómetro de UV (Shimadzu o equivalente) potenciómetro (Metrohm o equivalente) conductimetro (Metrohm o equivalente) balanza (MetterToledo o equivalente) bomba peristáltica tipo Masterflex o equivalente Materiales Post IMAC r-hFSH pellas de hidróxido de sodio - (Merck) agua purificada (Modulab o equivalente) hidróxido de sodio (pellas) • cloruro de sodio acetato de amonio solución amoniacal al 25% Amortiguadores Amortiguador de equilibrio: acetato de amonio 0.11 M, pH 8.5 ± 0.1, conductividad ± 0.5 mS/cm. Solución de regeneración: cloruro de sodio 1.5 M. Solución de sanitización: NaOH 0.5 M Solución de almacenamiento: NaOH 0.01 M Empaquetamiento de la columna La columna fue empaquetada con resina de flujo rápido Sepharose siguiendo las instrucciones del fabricante. La columna empaquetada tuvo las siguientes dimensiones: Diámetro: 22 cm Altura del lecho: 16-17 cm Volumen del lecho: 65-70 mi.

Procedimiento de purificación Toda la operación fue realizada a: • temperatura : 5 ± 3 ° C • velocidad de flujo:- 240-300 cm/hora .

Sanitización de la columna La columna fue lavada a chorro con al menos 1 BV de hidróxido de sodio al 0.5 M, luego enjuagada con 3 BV de agua purificada.

Equilibrio de la columna La columna fue lavada a chorro con 6 ó más BV de amortiguador de equilibrio, acetato de amonio 0.11 M, pH 8.5 ± 0.1, conductividad 10.2 ± 0.5 mS/cm. El pH y la conductividad fueron verificados y el lavado fue continuado si los parámetros del efluente de la columna estaban fuera de los valores objetivo: pH 8.5 ± 0.1, conductividad 10.5 ± 0.5 mS/cm Preparación del material inicial La r-hFSH obtenida del paso de IMAC se llevó a pH 8.5 ± 0.1, mediante la adición de ácido acético glacial, y la conductividad se ajustó a 10.5 ± 0.5 mS/cm mediante la adición de agua purificada (un volumen de agua al menos es necesario para ajustar una conductividad al valor objetivo) . Fueron retiradas las muestras para IPC (5 x 0.5 mi) .

Carga El material inicial fue cargado sobre la columna equilibrada como se describe anteriormente.

Lavado Cuando la carga de la muestra fue completada, la columna fue lavada con 3-6 BV del amortiguador de equilibrio, acetato de amonio 0.11 M, conductividad 10.2 ± 0.5 mS/cm. Fueron retiradas muestras para IPC (5 x 0.5 mi) y la f acción fue almacenada a +5 ± 3 ° C por no más de dos días . El perfil de elución de la cromatografía en DEAE Sepharose FF se muestra en la figura 4.

Paso (3) : Interacción hidrofóbica sobre Fenil-Sepharose FF HS Equipo • columna cromatográfica XK 26/30 • bomba peristáltica tipo miniplus 2 Gylson o equivalente • monitor de UV (longitud de trayectoria óptica de 2.5 mm) equipado con registrador de dos canales (Amersham Biosciences o equivalente) cuarto frío espectofotómetro de UV (Shimadzu o equivalente) potenciómetro (Metrohm o equivalente) conductímetro (Metrohm o equivalente) balanza (MetterToledo o equivalente) bomba peristáltica tipo Masterflex o equivalente Materiales Post DEAE r-hFSH pellas de hidróxido de sodio - (Merck) agua purificada (Modulab o equivalente) hidróxido de sodio (pellas) • cloruro de sodio acetato de amonio sulfato de amonio solución amoniacal al 25% Amortiguadores Amortiguador de equilibrio: acetato de amonio 50 mM, sulfato de amonio 1M, pH 8.25 ± 0.1, conductividad 142 ± 8 mS/cm. Amortiguador de lavado: acetato de amonio 50 mM, sulfato de amonio 0.9 M, pH 8.25 ± 0.1, conductividad 130 ± 5 mS/cm. Amortiguador de elución: acetato de amonio 50 mM, sulfato de amonio 0.25 M, pH 8.25 ± 0.1, conductividad 50 ± 3 mS/cm. Solución de depuración: agua purificada Solución de sanitización: NaOH 0.5 M Solución de almacenamiento: NaOH 0.01 M Empaquetamiento de la columna La columna fue empaquetada con la resina Fenil-Sepharose Flow HS siguiendo las instrucciones del fabricante. La columna empaquetada tuvo las siguientes dimensiones: Diámetro: 34 cm Altura del lecho: 14-15 cm Volumen del lecho: 125-135 mi.

Procedimiento de purificación Todas las operaciones fueron realizadas a: • temperatura : 5 ± 3 °C • velocidad de flujo: 240-300 cm/hora Sanitización de la columna La columna fue lavada a chorro con al menos 1 BV de NaOH 0.5 M, luego enjuagada con 3-5 BV de agua purificada.

Equilibrio de la columna La columna fue lavada a chorro de lado a lado con 5-6 ó más BV de amortiguador de equilibrio: acetato de amonio 50 mM, sulfato de amonio 1 M, pH 8.25 ± 0.1, conductividad 140 ± 8 mS/cm. El pH y la conductividad fueron verificados y el lavado fue continuado si los parámetros del efluente de la columna estaban fuera de los valores objetivo: pH 8.25 + 0.1, conductividad 140 ± 8 mS/cm Preparación del material inicial La r-hFSH obtenida del paso de DEAE fue agregada con sulfato de amonio 1M y se llevó a pH 8.25 + 0.1, mediante la adición de solución amoniacal al 25%. Fueron retiradas las muestras para IPC (5 x 0.5 mi) y la fracción fue cargada sobre la columna de fenilo.

Carga El material inicial fue cargado sobre la columna equilibrada como se describe anteriormente.

Lavado post-carga Cuando la carga de las muestras se completó, la columna fue lavada a chorro con 3-6 BV de amortiguador de equilibrio: acetato de amonio 50 mM, sulfato de amonio 1M, pH 8.25 ± 0.1, conductividad 140 ± 5 mS/cm. Fueron retiradas muestras para IPC (5 x 0.5 mi) y la fracción fue desechada.

Lavado Cuando se completó la carga de las muestras, la columna fue lavada a choro con 3-6 BV del amortiguador de lavado: acetato de amonio 50 mM, sulfato de amonio 0.9 M, pH 8.25 ± 0.1, conductividad 130 ± 5 mS/cm. Fueron retiradas muestras para IPC (5 x 0.5 mi) y la fracción fue desechada.

Elución Se inició la elución con el amortiguador de elución. La r-hFSH comenzó a eluir como un pico principal después de 0.5-0.8 BV desde el inicio. 3-4 BV del pico principal, fueron recolectados comenzando cuando se incrementó el valor de absorbancia (280 nm) , de acuerdo al perfil cromatográfico descrito en la figura 5. Se mantuvieron muestras para IPC (5 x 05 mi) y se almacenaron a +5 ±3°C por no más de un día.

Paso (4) : Fase inversa sobre la Source 30 RPC Equipo • columna cromatográfica: Vantage L22/40 • monitor de UV (longitud de trayectoria óptica de 2.5 mm) equipado con registrador de dos canales (Amersham Biosciences o equivalente) bomba peristáltica (Minipulse 2 Gillson o equivalente) espectofotómetro de UV (Shimadzu o equivalente) • potenciómetro (Metrohm o equivalente) conductimetro (Metrohm o equivalente) balanza (Metter Toledo o equivalente) Materiales Intermediario de r-hFSH Post-HIC resina SOURCE 30 RPC (Amersham Bioscience) acetato de amonio - Merck ácido acético glacial - Merck pellas de hidróxido de sodio - Merck solución de NaOH al 50% - J.T. Baker • solución amoniacal al 25% - Merck • 2-propanol - Merck • pellas de hidróxido de sodio - Merck Amortiguadores Amortiguador base: acetato de amonio 50 M, pH 7.6 ± 0.2, conductividad 6.5 ± 05 mS . Amortiguador de equilibrio: acetato de amonio 50 mM, pH 7.6 ± 0.2, que contiene 13% de 2-propanol (V/V). Amortiguador de elución: acetato de amonio 50 M, 7.6 ± 0.2, que contiene 20% de 2-propanol (V/V). Solución de regeneración: acetato de amonio 50 mM, 7.6 ± 0.2, que contiene 35% de 2-propanol (V/V). Solución de sanitización: NaOH 0.5 M Solución de almacenamiento: NaOH 0.01 M Empaquetamiento de la columna La columna fue empaquetada con la resina SOURCE 30 RPC siguiendo las instrucciones del fabricante . La columna empaquetada tuvo las siguientes dimensiones : Diámetro: 22 cm Altura del lecho: 13-14 cm Volumen del lecho: 49.4-53.2 mi.

Procedimiento de purificación Preparación del material inicial El intermediario Post HIC fue cargado sobre la columna en 13% (v/v) de 2-propanol. Toda la operación fue realizada a: temperatura: temperatura ambiente (+20 ± 5CC) velocidad de flujo: .300-450 cm/hora Sanitización de la columna La columna fue lavada a chorro con al menos 1 BV de NaOH 0.5 M, y enjuagada con 6 BV de agua purificada.

Equilibrio de la columna La columna fue lavada a chorro con 7-10 ó más BV de amortiguador de equilibrio: acetato de amonio 50 mM, pH 7.6 ± 0.2, que contenía 13% de 2 -propanol (V/V) .

Carga El material inicial r-hFSH post HIC preparado como se describe anteriormente fue cargado sobre la columna.

Lavado post-carga Cuando la carga de la muestra fue completa, la columna fue lavada a chorro con 7-10 BV de amortiguador de equilibrio.

Fueron retiradas muestras para IPC (5 x 0.5 mi) y la fracción fue desechada.

Elución La elución fue iniciada con el amortiguador de elución. La r-hFSH comenzó a eluir como un pico principal después de 0.5-0.8 BV desde el inicio. 5-7 BV del pico principal, fueron recolectados comenzando cuando se incrementó el valor de absorbancia (280 nm) , de acuerdo al perfil cromatográfico descrito en la figura 6. Después de que se completó la colección, la solución se diluyó 1:2 con agua purificada para reducir el porcentaje de 2-propanol en contacto con r-hFSH. Las muestras fueron retiradas para IPC (5 x 0.5 mi) y se almacenaron a +5 ±3°C por no más de un día. Esta fracción contenía r-hFSH purificada.

Regeneración de la columna Después de que se completó la elución la columna fue lavada a chorro con al menos 3 BV del amortiguador de regeneració . Fueron retiradas muestras para IPC (5 x 0.5 mi) y la fracción fue desechada.

Sanitización La columna fue lavada a chorro con al menos 1-2 BV de agua, seguido por 3 BV de NaOH 0.5 M, el flujo fue detenido por 1 hora, y la columna fue luego enjuagada con 6 BV de agua purificada.

Almacenamiento La columna fue lavada a chorro con al menos 3 BV de solución de almacenamiento, NaOH 0.01 M, y se almacenó hasta el siguiente ciclo.

Paso (5) : ULTRAF I LTRAC ION A GRANEL Equipo • 1 Vivaflow 200 PES , RC o Hydrosart corte de 5 kD (Sartorius) • bomba peristáltica (tipo Materflex L/S ) • espectof otómetro de UV (tipo Shimadzu o equivalente) • potenciómetro (tipo Mettler Toledo o equivalente) • conductímetro ( tipo Metrohm o equivalente) Materiales • eluido de r-hFSH-HIC • pellas de hidróxido de sodio - Merck (NaOH) • agua purificada por Modulab o equivalente • nitrógeno (presión operativa : 3 barias ) - grado UPP Amortiguadores Solución de diafiltración: la ultrafiltración de la r-hFSH se llevó a cabo utilizando agua purificada. Solución de sanitización: NaOH 0.5 M Solución de almacenamiento: NaOH 0.05 M Procedimiento Todas las operaciones fueron realizadas en un cuarto frío (+5 ± 3°C) .

Ultrafiltración La solución de eluido r-hFSH-HIC fue recirculada en el sistema de Vivaflow y se concentró hasta un volumen < 20 mi. La fracción retenida fue diluida con 4 volúmenes de agua purificada y concentrada hasta < 20 mi. El paso de lavado fue repetido como se describe, 5-7 veces más . El pH y la conductividad de permeado fueron de 7.1 ± 0.2 y 6.2 ± 0.5 mS/cm, respectivamente. Si se estuvo fuera de estos valores, se repitió el paso de lavado. pH del permeado = 7.1 ± 0.2 - conductividad de permeado = 6.2 ± 0.5 mS/cm La fracción retenida fue recolectada en un volumen adecuado para obtener una concentración final de r- hFSH por DO (280 nm) de alrededor de 0.5 - 0.7 mg/ml. Fueron retiradas las muestras (10 x 0.5 mi) para el análisis. Las muestras y el gran volumen fueron almacenados a -20C.

Paso (6) : PASO de nanof iltración para eliminación de los virus Materiales y equipo • solución intermediaria de r-hFSH (post DEAE o post RPC ultraf iltrada) ; • pre-filtros de tamaño de 47 mm tipo Fluorodine II FTKDJL (Pall) o WLP 0.1 µ (Millipore); • filtros de tamaño de 47 mm tipo NFP (Millipore) o DV20 (Pall) ; • agua purificada; • indicadores de papel pH; • hidróxido de sodio; • fuente regulada de nitrógeno; • sistema de filtración completa de acero inoxidable (Millipore) ; • tubo de silicona y tygon.

Amortiguadores Solución de sanitización: NaOH 0.5 M Procedimiento Todas las operaciones fueron llevadas a cabo a temperatura ambiente (+23 ± 3°C) .

Nanofiltración El sistema fue rellenado con post DEAE y ultrafiltrado post RPC rFSH, pre-filtrado sobre filtros de 0.1 µ. Al comienzo de la filtración, el nitrógeno fue abierto hasta una presión inicial de 0.5 bar y la válvula de ventilación localizada sobre el porta-disco fue abierta con el fin de purgar el sistema. Tan pronto como la primera gota de solución apareció, la válvula de ventilación del porta-disco fue cerrada y la presión de nitrógeno fue elevada a 2.3 - 2.8 bar. La presión del nitrógeno fue mantenida a 2.3 - 2.8 bar y la solución fue filtrada. Las condiciones operativas se resumen en seguida: Actividad biológica de las muestras La actividad biológica de la rhFSH purificada se midió utilizando el método de ganancia de peso de ovario de Steelman-Pohley . La actividad específica fue calculada utilizando la actividad biológica dividido entre el contenido de proteína como se determinó por la absorbancia a 280 nm (asumiendo que e = 9.95 M"1 cm-1) , y también mediante el uso de la actividad biológica dividido en el contenido de proteína como se determinó por el método de Lowry. La actividad específica de la rhFSH a granel purificada se muestra en la tabla 1.

Tabla 1. Actividad específica de la rhFSH purificada a granel, de la invención Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (24)

1. REIVINDICACIONES
2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método para purificar FSH humana recombinante o una variante de FSH caracterizado porque comprende los pasos de someter la FSH a: (1) cromatografía de intercambio iónico; (2) cromatografía de ion metálico inmovilizado; y (3) cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) . 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la cromatografía de intercambio iónico es llevada a cabo con una resina de intercambio aniónico fuerte .
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la resina de intercambio aniónico es Q Sepharose FF, o una resina que tiene propiedades similares.
4. 4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la cromatografía de intercambio iónico es llevada a cabo utilizando amortiguador de borato como eluyente . 5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el amortiguador de borato está a un pH de o de aproximadamente 8.
5. 5.
6. 6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la cromatografía de ion metálico inmovilizado es llevada a cabo con una resina que tiene grupos quelantes tridentados .
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque los grupos quelantes son un ácido iminodiacético .
8. 8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la cromatografía de ion metálico inmovilizado es llevada a cabo con Sepharose FF quelante, o una resina que tiene propiedades similares.
9. 9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la cromatografía de ion metálico inmovilizado es llevada a cabo con un ion metálico seleccionado de Cu2+, Zn2+, Ni2+, Ca2+, Mg2+ y Co2+.
10. 10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la cromatografía de ion metálico inmovilizado se lleva a cabo con Cu2+.
11. 11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la cromatografía de ion metálico inmovilizado es llevada a cabo utilizando acetato de amonio como eluyente.
12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el amortiguador de acetato de amonio tiene un pH de o de aproximadamente 9.
13. 13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque la cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) es llevada a cabo utilizando Fenil-Sepharose FF HS, o una resina que tiene características similares.
14. 14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque la cromatografía de interacción hidrofóbica es llevada a cabo utilizando acetato de amonio (50 mM) , sulfato de amonio (0.25 m) como eluyente .
15. 15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque comprende un segundo paso de cromatografía de intercambio iónico (2a) , llevada a cabo después del paso de cromatografía de ion metálico inmovilizado, y antes del paso de cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) .
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el segundo paso de cromatografía de intercambio iónico es llevado a cabo utilizando una resina de intercambio aniónico débil .
17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la resina de intercambio aniónico débil es la resina DEAE Sepharose FF, o una resina que tiene propiedades similares.
18. 18. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 , caracterizado porque comprende además un paso de cromatografía de fase inversa (4) llevado a cabo después del paso de cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) .
19. 19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la cromatografía de fase inversa es llevada a cabo utilizando la resina Source 30 RPC, o una resina que tiene características similares .
20. 20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la cromatografía de fase inversa es llevada cabo utilizando acetato de amonio (50 mM, pH de o de aproximadamente 7.6), con 20% (v/v) de 2-propanol.
21. 21. El método de conformidad con la reivindicación 18, 19 ó 20, caracterizado porque comprende un paso de ultrafiltración (5) , llevada a cabo después del paso de cromatografía de fase inversa.
22. 22. Un método para purificar FSH recombinante humana, caracterizado porque contiene los pasos de someter la FSH a: (0) ultrafiltración; (1) cromatografía de ion metálico. sobre Q Sepharose FF con borato a o aproximadamente 50 nM, cloruro de sodio a o aproximadamente 0.13 M, pH a o aproximadamente 8.5 como eluyente; (2) someter el eluido del paso (1) a un paso de cromatografía de afinidad de ion metálico inmovilizado, sobre Sepharose FF quelante, con Cu++ como ion metálico, y acetato de amonio a o de aproximadamente 0.75 M, con pH a o aproximadamente 9 como eluyente; (2a) someter el eluido del paso (2) a un paso de cromatografía de intercambio aniónico sobre DEAE Sepharose FF, con acetato de amonio a o aproximadamente 0.11 M, pH a o aproximadamente 8.5 como eluyente; (3) someter el eluido del paso (2a) a un paso de cromatografía de interacción hidrofóbica sobre fenil-Sepharose FF HS con acetato de amonio a o aproximadamente 50 mM, sulfato de amonio a o aproximadamente 0.25 M, pH a o aproximadamente 8.25, como eluyente; (4) someter el eluido del paso (3) a un paso de cromatografía de fase inversa sobre Source 30 RPC con acetato de amonio a o aproximadamente 50 mM, pH a o aproximadamente 7.6, con 2-propanol a o aproximadamente 20% (v/v); (5) someter el eluido del paso (4) a un paso de ultrafiltración; y (6) someter el retenido del paso (5) a un paso de nanofiltración .
23. 23. Una FSH humana recombinante o variante de FSH purificada, caracterizada porque es obtenida mediante el proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22.
24. 24. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende la FSH humana o variante de FSH, de conformidad con la reivindicación 23.