MXPA06003827A - Uso de polimorfismos geneticos para predecir hepatotoxicidad inducida por farmaco. - Google Patents

Abstract

El IL1A o un gen localizado cerca de IL1A sobre el cromosoma 2q14, puede contribuir a la hepatotoxicidad, medida por mayores niveles en suero de transaminasa de aspartato, durante el tratamiento con N-benzoil-estaurosporina para edema macular. De acuerdo con lo anterior, los polimorfismos geneticos en el gen IL1A son utiles como biomarcadores para predecir la hepatotoxicidad mediada por un derivado de estaurosporina.

Description

USO DE POLIMORFISMOS GENÉTICOS PARA PREDECIR HEPATOTOXICIDAD INDUCIDA POR FÁRMACO CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere en general a la prueba analítica de muestras de tejido in vitro, y más particularmente al análisis de los polimorfismos genéticos como biomarcadores para predecir la presentación de hepatotoxicidad inducida por fármaco.

DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA RELACIONADA Entre los trastornos que se presentan por la disfunción de la mlcrovasculatura de los pacientes diabéticos, está la retinopatía, que se manifiesta clínicamente como deterioro de la visión, y puede dar como resultado ceguera. La retinopatía diabética se caracteriza por microaneurismas, permeabilidad vascular excesiva, áreas de no perfusión retinal, y neovascularización retinal. Mucha evidencia sugiere un enlace causal entre los altos niveles de glucosa en sangre y el desarrollo de las lesiones subyacentes responsables de los déficits en la función de los órganos. Para una revisión, ver Way K. J. y colaboradores, Dlabeíic Medicine 18:945-59 (2001). Entre los efectos de la hiperglicemia está la sobre-activación de la senda de transducción de señal del diacil- glicerol (DAG) - quinasa C de proteína (PKC). Tanto los experimentos de cultivos celulares en caldo como los modelos animales de diabetes, demuestran niveles excesivos y actividad del diacil-glicerol y de la quinasa C de proteína en las células endoteliales vasculares. Koya D. y King G. L., Diabetes 47:859-866 (1998); Ishü H. y colaboradores, J. Mol. Med. 76:21-31 (1998) y Way K. J. y colaboradores, Trends Pharmacol. Sci. 21 :181 -7 (2000). La activación de muchas de las isoformas de las quinasas de serina-treonina de quinasa C de proteína, depende del diacil-glicerol, un producto de la disociación de los fosfolí pidos de membrana. Entre las isoformas activadas de las quinasas de serina-treonina de quinasa C de proteína, está la ¡soforma predominante ???ß, que está asociada con la retinopatía diabética. El diacil-glicerol normalmente es generado por la hidrólisis estimulada por el agonista de los fosfolípidos de membrana, pero también se puede sintetizar de novo mediante el metabolismo directo de la glucosa. Dunlop ME y Larkins RG, Biochem Biophys Res. Commun. 132:467-73 (1985); Ishü H. y colaboradores, J. Mol. Med. 76:21-31 (1998). En respuesta a la hiperglicemia, la síntesis de novo del diacil-glicerol aumenta sustancialmente, dando como resultado la activación de ???ß. Ishü H. y colaboradores, J. Mol. Med. 76:21-31 (1998). Como una consecuencia de la activación continua de la n senda de d ¡a ci l-g I i cero l-q u i n a sa C de proteína, se afectan muchos aspectos de la función vascular. Se estimulan la activación de citoquinas y la adhesión de leucocitos; se alteran el flujo sanguíneo y la contractilidad de los micro-vasos; y aumenta la síntesis de matriz extracelular, dando como resultado el engrosamiento de las membranas de basamento. El micro-ambiente retinal se hace isquémico como un resultado de los cam ios anteriormente mencionados. La expresión del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), u potente estimulante de la neovascularización, aumenta en respuesta a la isquemia, y mediante otros mecanismos dependientes de ???ß. A i e 11 o L. P. y colaboradores, Diabetes 46:1473-80 (1997). La N-benzoil-estaurosporina (PKC412) es un inhibidor tanto de la quinasa C de proteína como de un receptor esencial del factor de crecimiento endotelial vascular, el KDR (Receptor que contiene Dominio de Inserto de Quinasa, también conocido como VEGF-R2). La N-benzoil-estauros orina se está desarrollando para varias indicaciones, incluyendo el tratamiento de edema macular diabético. Ver la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,214,819. Ver también las Solicitudes de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Números 20030119812, 20030125343 y 20030153551. Aunque es una medicación prometedora, el tratamiento con N-benzoil- esíaurosporina puede dar como resultado efectos secundarios conocidos, incluyendo toxicidad hepática. Por consiguiente, existe una necesidad en la técnica de reducir los efectos secundarios de la N-benzoil-estaurosporina.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La invención proporciona métodos para determinar a los sujetos que estén en riesgo de desarrollar hepatotoxicidad inducida por fármaco. En una modalidad, la invención proporciona el uso del análisis genómico para identificar a los pacientes que estén en riesgo de experimentar hepatotoxicidad durante la terapia con estaurosporina. En una modal/dad particular, la terapia con esíaurosporina involucra la administración de N-benzoil-estaurosporina para el írafamienío de edema macular diabético. La predicción de hepatotoxicidad involucra la determinación de los niveles de transaminasa de aspartato (AST) en suero. En otra modalidad, la invención proporciona métodos para determinar las estrategias de tratamiento óptimas para estos pacientes. La invención también proporciona ensayos clínicos, estuches, y reactivos para predecir la hepatotoxicidad antes de tomar un fármaco. En una modalidad, el estuche contiene reactivos para determinar los polimorfismos genéticos en el gen IL1A. En una modalidad particular, el polimorfismo genético está en el locus PG ID 279 del gen IL1A. En los ensayos de los polimorfismos genéticos del locus PG ID 279, el genotipo CC (SEQ ID NO:1) es un biomarcador para las predicciones de riesgo más alto de epatotoxicidad, mientras que el genotipo CT (SEQ ID NOs:1 y 2) y el genotipo TT (SEQ ID NO:2), son biomarcadores para un riesgo más bajo de hepatotoxicidad. En otra modalidad, los estuches contienen reactivos para determinar los polimorfismos genéticos en el gen IL1A. En una modalidad particular, el polimorfismo genético está en el locus PG ID 302 del gen IL1A. En los ensayos del polimorfismo genético del locus PG ID 302, el genotipo GG (SEQ ID NO:3) es un biomarcador para las predicciones de riesgo más alto de hepatotoxicidad, mientras que el genotipo GT (SEQ ID NOs:3 y 4) y el genotipo TT (SEQ ID NO:4) son biomarcadores para un riesgo más bajo de hepatotoxicidad .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra los niveles máximos de AST/ALT (amino-transferasa de aspartato/amino-transferasa de alanina) contra IL1A (interleucina 1-alfa; locus PG ID 279). Las gráficas dispersadas muestran: (A) los máximos niveles de amino-transferasa de aspartato, (B) la proporción de ASTMAX y el límite superior del normal (ULN), (C) los máximos niveles de amino-transferasa de alanina, y (D) la proporción de ALT MAX y ULN para los sujetos en el estudio clínico con genotipos CC ó T (CT ó TT) para el locus PG ID 279 del gen IL1A. El límite superior del normal para la amino-transferasa de aspartato es de 42 Unidades/litro para los 3 a 64 años de edad, y de 55 Unidades/litro para mayores de 65 años de edad, y para la amino-transferasa de alanina es de 48 Unidades/litro para todas las edades. El límite superior del normal se indica por una línea.

La Figura 2 muestra los máximos niveles de AST/ALT (amino-transferasa de aspartato/am ino-transferasa de alanina) contra IL1A (interleucina 1-alfa; locus PG ID 302). Las gráficas dispersadas muestran las gráficas de: (A) los máximos niveles de amino-íransferasa de alanina, (B) la proporción de ASTMAX y ULN, (C) los máximos niveles de ALT, y (D) la proporción de AST MAX y ULN para los sujetos en el estudio clínico con genotipos G ó T (GT ó TT) para el locus PG ID 302 del gen IL1A. El límite superior del normal para la amino-transferasa de aspartato es de 42 Unidades/litro para los 3 a 64 años de edad, y de 55 Unidades/litro para mayores de 65 años de edad, y para la a ino-transferasa de alanina es de 48 Unidades/litro para todas las edades. Los límites superiores del normal se indican por una línea.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención proporciona convenientemente una manera de determinar si un paciente experimentará hepatotoxicidad durante el tratamiento con el fármaco, antes de tomar realmente el fármaco. De esta manera, la invención proporciona regímenes de tratamiento más seguros para los pacientes, ayudando a los clínicos ya sea a: (1) alterar la dosis del fármaco, (2) proporcionar un medicamento concomitante adicional o alternativo, o (3) elegir no prescribir ese fármaco para ese paciente. Se identificaron polimorfismos genéticos relevantes en un estudio en fase II de descubrimiento de dosis controlado por placebo, doblemente enmascarado, de múltiples centros y de selección aleatoria de la N-benzoil-estaurosporina, que se condujo en sujetos con edema macular diabético. Se evaluó la seguridad de la N-benzoil-estaurosporina en los sujetos, y se recopiló información farmacocinética adicional. Aunque la N-benzoil-estaurosporina mostró un buen perfil de seguridad, 9 de los 140 sujetos que se inscribieron en el estudio clínico experimentaron hepatotoxicidad, como se define por los aumentos en las transam ¡nasas hepáticas sobre el límite superior del normal (ULN). Se marcó a los sujetos por haber experimentado hepatotoxicidad si ya sea la amino-transferasa de aspartato (AST) o bien la amino-transferasa de alanina (ALT) tuvieron elevaciones múltiples sobre el límite superior del normal en la cita 3, 4, ó 5. De los 18 polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) de siete genes que se genotipificaron, dos en el gen de interleucina 1-alfa (IL1A) estuvieron asociados con el máximo nivel de transaminasa de aspartato en suero registrado en las citas 3, 4, ó 5. IL1A codifica una citoquina inflamatoria que tiene un papel pivotal en la mediación de las respuestas en fase aguda. Un polimorfismo de IL1A se localiza en la región promotora de IL1A, y el otro da como resultado una sustitución de serina a alanina en la posición del aminoácido 114. Estos resultados sugieren que los polimorfismos en IL1A o en un gen localizado cerca de él sobre 2q14, pueden estar directamente involucrados con el establecimiento de toxicidad hepática en seguida de la administración de N -benzoil-estaurosporina. Como se utiliza en la presente, un polimorfismo en el locus genético IL1A es "predictivo" de un "alto" riesgo de hepatotoxicidad cuando el polimorfismo genético se correlaciona de una manera significativa con el desarrollo de hepatotoxicidad inducida por fármaco, o con niveles elevados de transaminasa de aspartato en suero. Ver, por ejemplo, más adelante, en donde el genotipo CC en el locus ID 279 y el genotipo GG en el locus PG ID 302 son predictivos de un alto riesgo de hepatotoxicidad. Como se utiliza en la presente, un polimorfismo en el locus genético IL1A es "predictivo" de un "bajo" riesgo de hepatotoxicidad cuando el polimorfismo genético se correlaciona de una manera significat/va con la falta de desarrollo de hepatotoxicidad. Ver, por ejemplo, más adelante, en donde el genotipo CT ó TT en el locus PG ID 279 y el genotipo GT ó TT en el locus PG ID 302 son predictivos de un bajo riesgo de hepatotoxicidad. Las determinaciones de significado (valores P) se pueden determinar mediante el análisis de variación (ANOVA) o pruebas Exactas de Fisher. Las determinaciones de un polimorfismo de un solo nucleótido en cierto sitio genético IL1A por tener un alto riesgo de desarrollar hepatotoxicidad, y otro polimorfismo de un solo nucleótido en ese sitio genético IL1A por tener un bajo riesgo de desarrollar hepatotoxicidad, se pueden combinar para tener una mayor precisión de la determinación. Para el locus PG IDs 279 y 302, las asociaciones entre los polimorfismos de IL1A y los niveles de transaminasa de aspartato en suero tuvieron valores P de 0.0089 y 0.0097. Estos resultados se pueden extrapolar razonablemente para la producción de hepatotoxicidad en los pacientes en seguida de la administración de cualesquiera derivados de esta u ros po r¡ n a , basándose en la similitud estructural y en los modos de acción en el hígado de los derivados de est a u ros po ri n a . Entre los derivados de estaurosporina están los descritos en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,093,330. Los compuestos preferidos son N-acil-estaurosporinas y sus sales farmacéuticamente aceptables, incluyendo: N-(2-amino-acetil)-estaurosporina; N-(3,5-dinitro-benzoil)-estaurosporina; N-(3-carboxi-propionii)-estaurosporina; N-(3-fluoro-benzoil)-estaurosporina; N-(3-nitro-benzoil)-estaurosporina; N-(4-carboxi-benzoil)-estaurosporina; N-[(terbutoxi-carbonil-amino)-acetil]-estaurosporina; N - a I a n i 1 -estaurosporina; N-benzoil-estaurosporina¡ N-carboxi-metil-estaurospori na; N-etil-estaurosporina; N-metil-amino-tiocarbonil-estaurosporina; N-fenil-carbamoil-estaurosporina; N-terbutoxi-carbonil-estaurosporina; y N-trifluoro-acetil-estaurosporina. Más aún, los resultados se pueden extrapolar para la predicción de hepatotoxicidad en los pacientes que estén siendo tratados por enfermedades diferentes de edema macular diabético. El método de la invención es aplicable a los sujetos vertebrados, en particular a los sujetos mamíferos, más particularmente a los sujetos humanos. La invención es particularmente aplicable a los sujetos diabéticos. El diagnóstico de hepatotoxicidad se puede llevar a cabo empleando ensayos de los niveles de enzima en suero. Los ensayos de enzima en suero que indican la disfunción hepática, son bien conocidos por los expertos en la técnica médica y en la rutina en los laboratorios de hospital. Para una definición de la hepatotoxicidad, basándose en los niveles en suero de la transaminasa de aspartato (AST), y utilizada en el Ejemplo: la definición de hepatotoxicidad utilizada en este análisis se basó en los aumentos múltiples en la transaminasa de aspartato o en la amino-transferasa de alanina en suero sobre el límite superior del normal (ULN) en las citas 3, 4, ó 5. El límite superior del normal para la transaminasa de aspartato en suero es de 42 Unidades/litro para los 3 a 64 años de edad, y de 55 Unidades/litro para mayores de 65 años de edad; para la amino-transferasa de alanina en suero, el límite superior del normal es de 48 Unidades/litro (Intervalos de Alerta de Referencia de Smithkline Beecham Clinical Laboratorie) . Aunque una elevación de cualquier enzima en la cita 3, 4, ó 5 constituyó hepatotoxicidad, no se consideraron las elevaciones de transaminasa durante las siguientes citas cuando no se estaba administrando el fármaco. Adicionalmente, los sujetos que tuvieron pruebas de función hepática elevada en la línea base (cita 2) no se marcaron por haber experimentado hepatotoxicidad, independientemente de la elevación en sus niveles de enzimas en seguida de la administración del fármaco. Nueve sujetos se marcaron por haber experimentado hepatotoxicidad. De éstos, seis consistieron al análisis f a rm a co g e n é t i co clínico.

Los individuos que llevan los alelos polimórficos se pueden detectar al nivel del ADN, del ARN, o de la proteína, utilizando una variedad de técnicas que son bien conocidas en este campo. Las estrategias para la identificación y detección se describen, por ejemplo, en las Patentes Números EP 730,663; EP 717, 113, y PCT US97/02102. Los métodos de la invención pueden involucrar la detección de polimorfismos previamente caracterizados. Es decir, ya se han determinado la localización de la genotipificación y la naturaleza de las formas polimórficas presentes en un sitio (ver la discusión anterior con respecto a los genes interrogados). La disponibilidad de esta información permite diseñar conjuntos de sondas para una identificación específica de las formas polimórficas conocidas. La identificación de los alelos que contengan polimorfismos de nucleótidos individuales pueden involucrar la identificación del ADN a partir de muestras objetivas. Esto se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante reacción en cadena de la polimerasa. Ver en general PCR Technology: Principies and Applications for DNA Amplification, (Editor Erlich, Freeman Press, Nueva York, Nueva York, 1992); PCR Protocols: A Guide to fvlethods and Applications (editores Innis, y colaboradores, Academic Press, San Diego, Calif., 1990). La detección de polimorfismos en secuencias específicas de ADN se puede llevar a cabo mediante una variedad de métodos, incluyendo, pero no limitándose a, detección de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción basándose en la disociación de la endonucleasa de restricción específica del alelo (Kan y Dozy, Lancet 11:910-912 (1978)), hibridación con sondas de o I ig o n u el e ó t i d o s específicas del alelo (Wallace y colaboradores, Nucí. Acids Res. 6:3543-3557 (1978)), incluyendo oligonucleótidos inmovilizados (Saiki y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. E. U. A., 86:6230-6234 (1969)) o arreglos de oligonucleótidos (Maskos y Southern, Nucí. Acids Res. 21:2269-2270 (1993)), reacción en cadena de la polimerasa específica del alelo (Newton y colaboradores, Nucí. Acids Res. 17:2503-2516 (1989)), detección de reparación de mal emparejamiento (MRD) (Faham y Cox, Genome Res. 5:474-482 (1995)), enlace de proteína MutS (Wagner y colaboradores, Nucí. Acids Res. 23:3944-3948 (1995)), e I e ct rof o re s i s en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE) (Fisher y Lerman, Proc. Nati. Acad. Sci. EAU. 80:1579-1583 (1983)), detección de polimorfismo de conformación de una sola cadena (Orita y colaboradores, Genomics 5:874-879 (1983)), disociación de ARNsa en los pares de bases mal emparejados (Myers y colaboradores, Science 230:1242 (1985)), disociación química (Cotton y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. E. A. U., 8Z:4397-4401 (1988)) o enzimática (Youil y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. E. U. A. 92:87-91 (1995)) del ADN h et e r o d ú p I ex , métodos basados en la extensión del cebador específica del alelo (Syvanen y colaboradores, Genomics 8:684-692 (1990)), análisis de bits genéticos (GBA) (Nikiforov y colaboradores, Nucí. Acicís Res. 22:4167-4175 (1994)), el ensayo de ligamiento de oligonucleótidos (OLA) (Landegren y colaboradores, Science 241:1077 (1988)), la reacción en cadena de ligamiento específica del alelo (LCR) (Barrany, Proc. Nati. Acaü. Sci. E. U. A. 88:189-193 (1991)), LCR-huevos (Abravaya y colaboradores, Nucí. Acids Res. 23:675-682 (1995)), secuenciación de ADN radioactiva y/o fluorescente empleando procedimientos convencionales bien conocidos en este campo, y ensayos de ácidos nucleicos peptídicos (PNA) (Orum y colaboradores, Nucí. Acids Res. 21:5332-5336 (1993); Thiede y cola oradores, Nucí. Acids Res. 24:983-984 (1996)). Se proporciona una guía adicional en Sambrook J. y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Tercera Edición (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 2000). La guía para el uso de la N-benzoil-estaurosporina y los derivados de estaurosporina relacionados, se proporciona en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,744,460; 5,827,846; 6,018,042; 6,153,599, y 6,214,819, cada una de las cuales se incorpora como referencia. Se proporciona una guía adicional para el uso de la N-benzoil-estaurosporina y los derivados de estaurosporina relacionados, para el tratamiento de enfermedades neovasculares oculares y para reducir la permeabilidad capilar en ia retina, en las Solicitudes de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Números 20030119812, 20030125343, y 20030153551 , cada una de las cuales se incorpora como referencia. Poli orfismos de Un Solo N ucieótido. La variación de secuencia en el genoma humano consiste prim ord ialmente en polimorfismos de un solo nucleótido ("SNPs"), siendo el resto de las variaciones de secuencia repeticiones cortas en hilera (incluyendo micro-satélites), repeticiones largas en hilera (mini-satélite), y otras inserciones y supresiones. Un polimorfismo de un solo nucleótido es una posición en donde se presentan dos bases alternadas a una frecuencia apreciable (es decir, > 1 por ciento) en la población humana. Se dice que un polimorfismo de un solo nucleótido es "al él ico" porque, debido a la existencia del polimorfismo, algunos miembros de una especie pueden tener la secuencia no mutada (es decir, el "alelo" original), mientras que otros miembros pueden tener una secuencia mutada (es decir, el alelo variante o muíante). En el caso más simple, solamente puede existir una secuencia mutada, y se dice que el polimorfismo es dialélico. La presentación de mutaciones alternadas puede dar lugar a polimorfismo trialélicos, etc. Los polimorfismos de un solo nucleótido están ampliamente extendidos a través de todo el genoma, y los polimorfismos de un solo nucleótido que alteran la función de un gen pueden dirigir contribuyentes a la variación genotípica. Debido a su prevalencla y a su naturaleza ampliamente extendida, los polimorfismos de un solo nucleótido tienen el potencial para ser importantes herramientas para la localización de genes que estén involucrados en las condiciones de enfermedades humanas, ver, por ejemplo, Wang y colaboradores, Science 280:1077-1082 (1998), que da a conocer un estudio piloto en donde se mapearon 2,227 polimorfismos de un solo nucleótido sobre una región de 2.3 megabases del ADN. Una asociación entre un polimorfismo de un solo nucleótido y un fenotipo particular no indica ni requiere que el polimorfismo de un solo nucleótido sea causativo del fenotipo. En lugar de eso, esta asociación puede indicar solamente que el polimorfismo de un solo nucleótido se localiza cerca del sitio sobre el genoma en donde existen factores determinantes para el fenotipo, y por consiguiente, es más probable que se encuentren en asociación con estos factores determinantes, y por consiguiente, con el fenotipo de interés. Por lo tanto, un polimorfismo de un solo nucleótido puede estar en desequilibrio de enlace (LD) con la variante funcional "verdadera". El desequilibrio de enlace, también conocido como asociación alélica, existe cuando los alelos en dos localizaciones distintas del genoma están más altamente asociados que lo esperado. Por consiguiente, un polimorfismo de un solo nucleotido puede servir también como un marcador que tiene valor en virtud de su proximidad a una mutación que causa un fenotipo particular. Los polimorfismos de un solo nucleotido que están asociados con la enfermedad, también pueden tener un efecto directo sobre la función del gen en donde se localizan. Una variante de secuencia puede dar como resultado un cambio de aminoácidos, o puede alterar el empalme de exones-intrones, modificando de esta manera directamente la proteína pertinente, o puede existir en una región reguladora, alterando el ciclo de expresión o la estabilidad del ARNm, ver Nowotny P. Current Opinions in Neurobiology 11:637-641 (2001 ). Crecientemente está más claro que el riesgo de desarrollar muchos trastornos comunes, y el metabolismo de los medicamentos utilizados para tratar estas condiciones, son sustancialmente influenciados por las variaciones genómicas subyacentes, aunque los efectos de cualquier variante podrían ser pequeños. Por consiguiente, una asociación entre un polimorfismo de un solo nucleotido y un fenotipo clínico sugiere: (1) que el polimorfismo de un solo nucleotido es funcionalmente responsable del fenotipo, ó (2) que existen otras mutaciones cerca de la localización del polimorfismo de un solo nucleótido sobre el genoma que causan el fenotipo. La segunda posibilidad se basa en la biología de la herencia. Se heredan pedazos grandes de ADN, y los marcadores en estrecha proximidad unos a otros pueden no haberse recombinado en los individuos que no estén relacionados por muchas generaciones, es decir, los marcadores están en desequilibrio de enlace (LD). Identificación y Caracterización de Polimorfismos de un Solo Nucleótido. Se han empleado muchas técnicas diferentes para identificar y caracterizar los polimorfismos de un solo nucleótido, incluyendo el análisis del polimorfismo de la conformación de una sola cadena, el análisis heterodúplex mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento con desnaturalización (DHPLC), secuenciación directa del ADN, y métodos de computación, ver Shi M. M . , Clin. Chem. 47:164-172 (2001). Gracias a la gran cantidad de información de secuencia que existen en las bases de datos públicas, se pueden utilizar las herramientas de computación para identificar los polimorfismos de un solo nucleótido in silico, mediante la alineación de secuencias independientemente sometidas para un gen dado (ya sea secuencias de ADNc ó genómicas). La comparación de los polimorfismos de un solo nucleótido obtenidos experimentalmente y mediante métodos in silico, demostró que el 55 por ciento de los polimorfismos de un solo nucleótido candidatos encontrados por SNPFinder ( http : //I p g ws . n ci . n i h . g o v: 82/p e rl/s n p/sn p_cg i . p I) , también se han descubierto experimentalmente, ver Cox y colaboradores, Hum. Mutat. 17:141-150 (2001 ). Sin embargo, estos métodos in silico solamente podrían encontrar el 27 por ciento de los verdaderos polimorfismos de un solo nucleótido. Los métodos de tipificación más comunes de polimorfismos de un solo nucleótido incluyen en la actualidad hibridación, extensión de cebador, y métodos de disociación. Cada uno de estos métodos se debe conectar con un sistema de detección apropiado. Las tecnologías de detección incluyen polarización fluorescente (ver Chan X. y colaboradores, Genome Res. 9:492-499 (1999)), detección luminométrica de liberación de pirofosfato (piro-secuenciación), (ver Ahmadiian A. y colaboradores, Anal. Biochem. 280:103-10 (2000)), ensayos de disociación basados en la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET), DHPLC, y espectrometría de masas (ver Shi M. M . , Clin. Chem. 47:164-172 (2001) y la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,300,076 B1). Otros métodos para detectar y caracterizar los polimorfismos de un solo nucleótido son los que se dan a conocer en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 6,297,018 B1 y 6,300,063 B1. Las divulgaciones de las referencias anteriores se incorporan a la presente como referencia en su totalidad. En una modalidad particularmente preferida, la detección del polimorfismo se puede llevar a cabo por medio de la denominada tecnología I VADER R (disponible en T ird Wave Technologies Inc., Madison, Wisconsin, E.U.A.). En este ensayo, un oligonucleótido "invasor" corriente arriba específico, y una sonda corriente abajo parcialmente traslapada, forman juntos una estructura específica cuando se enlazan a la plantilla de ADN complementaria. Esta estructura es reconocida y cortada en un sitio específico por la enzima Cleavasa, y esto da como resultado la liberación de la aleta 5' del oligonucleótido de sonda. Entonces este fragmento sirve como el oligonucleótido "invasor" con respecto a los objetivos secundarios sintéticos y a las sondas de señales secundarias fluorescentemente marcadas contenidas en la mezcla de reacción. Esto da como resultado una disociación específica de las sondas de señales secundarias mediante la enzima Cleavasa. La señal de fluorescencia se genera cuando se disocia esta sonda secundaria, marcada con moléculas de tinte capaces de tener transferencia de energía de resonancia de fluorescencia, las Cleavasas tienen requerimientos estrictos en relación con la estructura formada por las secuencias o aletas de ADN traslapadas, y por consiguiente, se pueden utilizar para detectar específicamente malos emparejamientos de pares de bases individuales inmediatamente corriente arriba del sitio de disociación sobre la cadena de ADN corriente abajo. Ver Ryan D. y colaboradores, Molecular Diagnosis 4(2):135-144 (1999) y Lyamichev V. y colaboradores, Nature Biotechnology 17:292-296 (1999), ver también las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,846,717 y 6,001 ,567 (las divulgaciones de las cuales se incorporan a la presente como referencia en su totalidad). En algunas modalidades, una composición contiene dos o más oligonucleótidos de genotipificación diferentemente marcados para el sondeo simultáneo de la identidad de los nucleótidos en dos o más sitios polimórficos. También se contempla que las composiciones de los cebadores puedan contener dos o más conjuntos de pares de cebadores específicos del alelo para permitir la dirección y amplificación simultánea de dos o más regiones que contengan un sitio polimórfico. Los oligonucleótidos de genotipificación de la invención también se pueden inmovilizar sobre, o se pueden sintetizar sobre, una superficie sólida, tal como un microchip, una perla, o un portaobjetos de vidrio (ver, por ejemplo, las Publicaciones Internacionales Números WO 98/20020 y WO 98/20019). Estos oligonucleótidos de genotipificación inmovilizados se pueden utilizar en una variedad de ensayos de detección de polimorfismos, incluyendo, pero no se limitándose a, ensayos de hibridación de sonda y de extensión de polimerasa. Los oligonucleótidos de genotipificación inmovilizados de la invención pueden comprender un arreglo ordenado de oligonucleótidos diseñados para rastrear rápidamente una muestra de ADN para determinar los polimorfismos en múltiples genes al mismo tiempo. Un cebador de oligonucleótido específico del alelo de la invención tiene un nucleótido 3'-term¡nal, o de preferencia un nucleótido 3'-penúltimo, que es complementario para solamente un nucleótido de un polimorfismo de un solo nucleótido particular, actuando de esta manera como un cebador para la extensión mediada por polimerasa solamente si está presente el alelo que contenga a este nucleótido. La invención contempla cebadores de oligonucleótidos específicos del alelo que se hibriden ya sea a la cadena codificante o a la no codificante. Se podría desarrollar un cebador de ASO para detectar los polimorfismos genéticos empleando técnicas conocidas por los expertos en este campo. Otros oligonucleótidos de genotipificación de la invención se hibridan a una región objetiva localizada a uno a varios nucleótidos corriente abajo de uno de los sitios polimórficos novedosos identificados en la presente. Estos oligonucleótídos son útiles en los métodos de extensión del cebador mediada por polimerasa para detectar uno de los polimorfismos novedosos descritos en la presente, y por consiguiente, estos oligonucleótídos de genotipificación son referidos en la presente como "oligonucleótídos de extensión del cebador". En una modalidad preferida, el término 3' de un oligonucleótido de extensión del cebador es un desoxi-nucleótido complementario para el nucleótido localizado inmediatamente adyacente al sitio polimórfíco. En otra modalidad, la invención proporciona un estuche que comprende cuando menos dos oligonucleótídos de genotipificación empacados en recipientes separados. El estuche también puede contener otros componentes, tales como un regulador de hibridación (en donde los oligonucleótídos se van a utilizar como una sonda) empacado en un recipiente separado. De una manera alternativa, cuando los oligonucleótídos se van a utilizar para amplificar una región objetiva, el estuche puede contener, empacados en recipientes separados, una polimerasa y un regulador de reacción optimizado para la extensión del cebador mediada por la polimerasa, tal como reacción en cadena de la polimerasa. Las composiciones de oligonucleótídos anterior-mente descritas y los estuches son útiles en los métodos para genotipif icar y haplotipíficar el gen en un individuo. Como se utilizan en la presente, los términos "genotipo" y "haploti o" significan el genotipo o el haplotipo que contiene el par de nucleótidos o al nucleótido, respectivamente, que está presente en uno o más de los sitios polimórficos novedosos descritos en la presente, y opcionalmente también puede incluir al par de nucleótidos o al nucleótido presentes en uno o más sitios polimórficos adicionales del gen. Los sitios polimórficos adicionales pueden ser sitios polimórficos actualmente conocidos, o sitios que se descubran subsecuentemente. Una modalidad del método de genotipificación involucra aislar a partir del individuo, una mezcla de ácido nucleico que comprenda las dos copias del gen, o un fragmento del mismo, que estén presentes en el individuo, y determinar la identidad del par de nucleótidos en uno o más de los sitios polimórficos en las dos copias, para asignar un genotipo al individuo. Como será fácilmente entendido por el experto, las dos "copias" de un gen en un individuo pueden ser el mismo alelo o pueden ser alelos diferentes. En una modalidad particularmente preferida, el método de genotipificación comprende determinar la identidad del par de nucleótidos en cada sitio polimórfico. Típicamente, la mezcla de ácidos nucleicos se aisla a partir de una muestra biológica tomada del individuo, tal como una muestra de sangre o una muestra de tejido. Las muestras de tejido adecuadas incluyen sangre entera, semen, saliva, lágrimas, orina, materia fecal, sudor, exudado bucal, piel, y pelo. La mezcla de ácidos nucleicos puede estar comprendida de ADN genómico, ARNm, ó ADNc, y en los últimos dos casos, la muestra biológica se debe obtener de un órgano en donde se exprese el gen. Además, será entendido por el experto, que no se utilizarían preparaciones de ARNm ó de ADNc para detectar polimorfismos localizados en intrones o en las regiones no transcritas 5' y 3'. Si se aisla un fragmento genético, debe contener Jos sitios polimórficos que se vayan a genotipificar. Una modalidad del método de haplotipificación comprende aislar del individuo una molécula de ácido nucleico que contenga solamente una de las dos copias del gen, o un fragmento del mismo, que esté presente en el individuo, y determinar en esa copia la identidad del nucleótido en uno o más sitios polimórficos de esa copia, para asignar un haplotipo al individuo. El ácido nucleico se puede aislar empleando cualquier método capaz de separar las dos copias del gen o fragmento, incluyendo, pero no limitándose a, uno de los métodos descritos anteriormente para la preparación de isogenes, siendo el planteamiento preferido la clonación dirigida in vivo. Como será fácilmente apreciado por los expertos en la materia, cualquier clon individual solamente proporcionará la información del haplotipo sobre una de las dos copias del gen presentes en un individuo. Si se desea la información del haplotipo para la otra copia del individuo, se necesitará examinar clones adicionales. Típicamente, se deben examinar cuando menos cinco clones para tener una probabilidad mayor del 90 por ciento de h a p I ot i p if i caci ó n de ambas copias del gen en un individuo. En una modalidad particularmente preferida, se identifica el nucleótido en cada uno de los sitios polimórficos. En una modalidad preferida, se determina un par de haplotipos para un individuo mediante la identificación de la secuencia en fase de nucleótidos en uno o más de los sitios polimórficos de cada copia del gen que esté presente en el individuo. En una modalidad particularmente preferida, el método de haplotipificación comprende identificar la secuencia en fase de nucleótidos en cada sitio polimórfico de cada copia del gen. Cuando se haplotipifican ambas copias del gen, el paso de identificación de preferencia se lleva a cabo colocando con cada copia del gen en recipientes separados. Sin embargo, también se prevé que, si las dos copias se van a marcar con diferentes marcas, o van a ser de otra manera distinguibles o identificables por separado, sería posible en algunos casos llevar a cabo el método en el mismo recipiente. Por ejemplo, si se marcan las primera y segunda copias del gen con diferentes primero y segundo tintes fluorescentes, respectivamente, y se marca un oligonucleótido específico del alelo con todavía un tercer tinte fluorescente diferente, para ensayar los sitios polimórficos, entonces la detección de una combinación de los primero y tercer tintes identificaría el polimorfismo en la primera copia del gen, mientras que la detección de una combinación de los segundo y tercer tintes identificaría el polimorfismo en la segunda copia del gen. En ambos métodos de genotipificación y haplo-tipificación, se puede determinar la identidad de un nucleótido (o par de nucleótidos) en un sitio polimórfico mediante la amplificación de una región objetiva que contenga al sitio polimórfico directamente a partir de una o ambas copias del gen, o fragmento del mismo, y se determina la secuencia de las regiones amplificadas mediante métodos convencionales. Será fácilmente apreciado por el experto que solamente se detectará un nucleótido en un sitio polimórfico en los individuos que sean homocigóticos en ese sitio, mientras que se detectarán dos nucleótidos diferentes si el individuo es heterocigótico para ese sitio. El polimorfismo se puede identificar directamente, conocido como identificación de tipo positivo, o por inferencia, referido como identificación de tipo negativo. Por ejemplo, cuando se sabe que un polimorfismo de un solo nucleótido es guanina y citosina en una población de referencia, se puede determinar positivamente un sitio como de guanina o citosina para un individuo homoc i gótico en ese sitio, o para tanto guanina como citosina si el individuo es heterocigótico en ese sitio. De una manera alternativa, el sitio se puede determinar negativamente como que no es guanina (y por lo tanto citosina/citosina) o no es citosina (y por lo tanto guanina/ guanina). En adición, la identidad de los alelos presentes en cualquiera de los sitios polimórficos novedosos descritos en la presente se puede determinar de una manera indirecta mediante la genotipificacion de un sitio polimórfico no dado a conocer en la presente, es decir, en desequilibrio de enlace con el sitio polimórfico que sea de interés. Se dice que dos sitios están en desequilibrio de enlace si la presencia de una variante particular en un sitio mejora la posibilidad de predicción de otra variante en el segundo sitio (ver Stevens J. C, Mol. Diag. 4:309-317 (1999)). Los sitios polimórficos en desequilibrio de enlace con los sitios polimórficos actualmente dados a conocer se pueden localizar en las regiones del gen, o en otras regiones genómicas no examinadas en la presente. La genotipificacion de un sitio polimórfico en desequilibrio de enlace con los sitios polimórficos novedosos descritos en la presente, se puede llevar a cabo mediante, pero no limitándose a, cualquiera de los métodos anteriormente mencionados para la detección de la identidad del alelo en un sitio polimórfico. Las regiones objetivas se pueden amplificar empleando cualquier método de amplificación dirigida al oligonucleótido, incluyendo, pero no limitándose a, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,965,188), reacción en cadena de la ligasa (LCR) (Barany y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. E. U. A. 88: 189-193 (1991 ); Solicitud de Patente del TCP Número WO 90/01069), y ensayo de ligamiento de oligonucleótido (OLA) (Landegren y colaboradores, Science 241 : 1077-1080 (1988)). Los o I i g o n u el e ót i d o s útiles como cebadores o sondas en estos métodos deben hibridarse de una manera específica a una región del ácido nucleico que contenga o esté adyacente al sitio polimórfico. Típicamente, los oligonucleótidos son de entre 10 y 35 núcleo ti dos de longitud, y de preferencia, de entre 15 y 30 nucleótidos de longitud. De una manera más preferible, los oligonucleótidos son de 20 a 25 nucleótidos de largo. La longitud exacta del oligonucleótido dependerá de muchos factores que son considerados y practicados rutinariamente por el experto. Se pueden emplear otros procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos conocidos para amplificar la región objetiva, incluyendo los sistemas de amplificación basada en la transcripción (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,130,238; Patente Europea Número EP 329,822; Patente de los Estados Unidos de orteamérica Número 5,169,766; Publicación Internacional Número WO 89/06700), y los métodos isotérmicos (Walker y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 89:392-396 (1992)). También se puede ensayar un polimorfismo en la región objetiva antes o después de la amplificación, empleando uno de varios métodos basados en la hibridación conocidos en la técnica. Tí icamente, se utilizan oligonucleótidos específicos del alelo en la realización de estos métodos. Los oligonucleótidos específicos del alelo se pueden utilizar como pares de sondas diferentemente marcadas, mostrando un miembro del par un em arejamiento perfecto con una variante de una secuencia objetiva, y mostrando el otro miembro un emparejamiento perfecto con una variante diferente. En algunas modalidades, se puede detectar más de un sitio polimórfico a la vez, utilizando un conjunto de oligonucleótidos o pares de oligonucleótidos específicos del alelo. De preferencia, los miembros del conjunto tienen temperaturas de fusión dentro de 5°C, y más preferiblemente dentro de 2°C, uno del otro, cuando se h i bridan a cada uno de los sitios poiimórficos que se estén detectando. La hibridación de un oligonucleótido específico del alelo a un polinucleótido objetivo se puede llevar a cabo con ambas entidades en solución, o esta hibridación se puede llevar a cabo con ya sea el oligonucleótido o bien el polinucleótido objetivo covaientemente o no covalentemente fijado a un soporte sólido. La unión puede ser mediada, por ejemplo, por interacciones de anticuerpo-antígeno, poli-L-Lys, estreptavidina o avidina-biotina, puentes de sal, interacciones hldrofóbicas, enlaces químicos, horneo reticulante con ultravioleta, etc. Los oligonucleótidos específicos del alelo se pueden sintetizar directamente sobre el soporte sólido, o se pueden unir al soporte sólido subsecuentemente a la síntesis. Los soportes sólidos adecuados para utilizarse en los métodos de detección de la invención incluyen sustratos hechos de silicio, vidrio, plástico, papel, y similares, los cuales se pueden formar, por ejemplo, en pozos (como en las placas de 96 pozos), portaobjetos, hojas, membranas, fibras, chips, platos, y perlas. El soporte sólido se puede tratar, recubrir, o derivar para facilitar la inmovilización del oligonucleótido específico del alelo o del ácido nucleico objetivo. También se puede determinar el genotipo o haplotipo para el gen de un individuo mediante la hibridación de una muestra nucleica que contenga una o ambas copias del gen, a arreglos y sub-arreglos de ácido nucleico, tales como se describen en la Publicación Internacional Número WO 95/11995. Los arreglos contendrían una batería de oligonucleótidos específicos del alelo que representen cada uno de los sitios polimórficos que se vayan a incluir en el genotipo o hapiotipo. La identidad de los polimorfismos también se puede determinar utilizando una técnica de detección de mal emparejamiento, incluyendo, pero no limitándose a, el método de protección de ARNsa utilizando ribo-sondas (Winter y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. E. U. A. 82:7575 (1985); Meyers y colaboradores, Science 230:1242 (1985)), y proteínas que reconozcan los malos emparejamientos de nucleótidos, tales como la proteína mutS de E. col i (Modrich P. Am. Rev. Genet. 25:229-253 (1991)). De una manera alternativa, se pueden identificar los alelos variantes mediante el análisis de polimorfismo de conformación de una sola cadena (SSCP) (Orita y colaboradores, Genomics 5:874-879 (1989); Humphries y colaboradores, en Molecular Diagnosis of Genetic Diseases, . Elles, editor, páginas 321-340 (1996)), o electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE) (Wartell y colaboradores, Nucí. Acids Res. 18:2699-2706 (1990); Sheffield y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. E. U. A. 86:232-236 (1989)). También se puede emplear un método de extensión del cebador mediada por polimerasa, con el fin de identificar los polimorfismos. Se han descrito varios de estos métodos en la literatura de patente y científica, e incluyen el método de "Análisis de Bit Genético" (Publicación Internacional Número WO 92/15712), y el análisis de bit genético mediado por ligasa/polimerasa (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,679,524). Se dan a conocer métodos relacionados en las Publicaciones Números WO 9 H 02087 , WO 90/09455, y WO 95/17676; y en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,302,509 y 5,945,283. Se pueden detectar los cebadores extendidos que contengan un polimorfismo mediante espectrometría de masas, como se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,605,798. Otro método de extensión del cebador es la reacción en cadena de la polimerasa específica del alelo (Ruafio y colaboradores, Nucí. Aclds Res. 17:8392 (1989); Ruafio y colaboradores, Nucí. Acids Res. 19:6877-6882 (1991); Publicación Internacional Número WO 93/22456; Turki y colaboradores, J. Clin. Invest. 95:1635-1641 (1995)). En adición, se pueden investigar múltiples sitios polimórficos mediante la amplificación simultánea de múltiples regiones del ácido nucleico utilizando conjuntos de cebadores específicos del alelo, como se describen en la Publicación Internacional Número WO 89/10414. En una modalidad preferida, se examinan los datos de frecuencia de haplotipo para cada grupo etnogeográfico, con el fin de determinar si son consistentes con el equilibrio de Hardy-Weinberg . El equilibrio de Hardy-Weinberg (D. L. Hard y colaboradores, Principies of Population Genomics, 3a Edición (Sinaucr Asociates, Sunderland, MA, 1997)), postula que la frecuencia de encontrar el par de haplotipos H /H2 es igual a PH.W (?,/?,) = 2p(H1)p(H2) si H1 ? H2 y PH.W (H1/H2) = p(H ) (H2) si H = H2. Una diferencia estadísticamente significativa entre las frecuencias de haplotipos observadas y esperadas, se podría deber a uno o más factores, incluyendo la endogamia significativa en el grupo de población, una fuerte presión selectiva sobre el gen, inclinación del muestreo, y/o errores en el proceso de genotipificación. Si se observan grandes desviaciones del equilibrio de Hardy-Weinberg en un grupo etnogeográfico, se puede aumentar el número de individuos en ese grupo para ver si la desviación se debe a una inclinación del muestreo. Si un tamaño de muestra más grande no reduce la diferencia entre las frecuencias de pares de haplotipos observadas y esperadas, entonces se podría desear considerar hacer la haplotipificación del individuo utilizando un método de haplotipificación directa, tal como, por ejemplo, la tecnología CLASPER System R (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,866,404), S D , o reacción en cadena de la polimerasa de intervalo largo específica del alelo (Michalotos-Beloin y colaboradores, Nucí. Acids Res. 24:4841 -4843 (1996)). En una modalidad de este método para predecir un par de haplotipos, el paso de asignación involucra llevar a cabo el siguiente análisis. Primero, se compara cada uno de los posibles pares de haplotipos con los pares de aplotipos de la población de referencia. En general, solamente uno de los pares de haplotipos de la población de referencia se empareja con un posible par de haplotipos, y se asigna ese par al individuo. Ocasionalmente, solamente un haplotipo representado en los pares de haplotipos de referencia es consistente con un posible par de haplotipos para un individuo, y en esos casos, se asigna al individuo un par de haplotipos que contiene este haplotipo conocido y un nuevo haplotipo deri ado mediante la sustracción del haplotipo conocido del par de haplotipos posible. En raros casos, ningún haplotipo de la población de referencia es consistente con los posibles pares de haplotipos, o de una manera alternativa, múltiples pares de haplotipos de referencia son consistentes con los posibles pares de haplotipos. En estos casos, el individuo de preferencia se haplotipifica utilizando un método de haplotipificación molecular directa, tal como, por ejemplo, la tecnología CLASPER SystemMR (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,866,404), S D, o reacción en cadena de la polimerasa de intervalo largo específica del alelo ( ichalotos-Beloin y colaboradores, Nucí. Acids Res. 24:4841-4843 (1996)). La invención también proporciona un método para determinar la frecuencia de un genotipo o haplotipo en una población. El método comprende determinar el genotipo o el par de haplotipos para el gen que esté presente en cada miembro de la población, en donde el genotipo o haplotipo comprende al par de nucleótidos o al nucleótido detectado en uno o más de los sitios polimórficos del gen, y calcular la frecuencia en que se encuentra cualquier genotipo o haplotipo particular en la población. La población puede ser una población de referencia, una población de familia, una población del mismo sexo, un grupo de población, una población de rasgo (por ejemplo, un grupo de individuos que exhiben un rasgo de interés tal como una condición médica o una respuesta a un tratamiento terapéutico). En otro aspecto de la invención, se utilizan los datos de frecuencia para los genotipos y/o haplotipos encontrados en una población de referencia, en un método para identificar una asociación entre un rasgo y un genotipo o un haplotipo. El rasgo puede ser cualquier fenotipo detectable, incluyendo, pero no limitándose a, la suscepti ilidad a una enfermedad o la respuesta a un tratamiento. El método involucra obtener datos sobre la frecuencia de los genotipos o haploti os de interés en una población de referencia, así como en una población que exhiba el rasgo. Los datos de frecuencia para una o ambas poblaciones de referencia y de rasgo, se pueden obtener mediante la genotipificación o haplotipificación de cada individuo de las poblaciones, empleando uno de los métodos descritos anteriormente. Los haplotipos para la población de rasgo se pueden determinar directamente, o de una manera alternativa, mediante el planteamiento de genotipo predictivo para el haplotipo descrito anteriormente.

En otra modalidad, los datos de frecuencia de las poblaciones de referencia y/o de rasgo, se obtienen accesando a datos de frecuencia previamente determinados, los cuales pueden estar en una forma escrita o electrónica. Por ejemplo, los datos de frecuencia pueden estar presentes en una base de datos que sea accesible mediante una computadora. Una vez que se obtienen los datos de frecuencia, se comparan las frecuencias de los genotipos o haplotipos de interés en las poblaciones de referencia y de rasgo. En una modalidad preferida, se comparan las frecuencias de todos los genotipos y/o haplotipos observados en las poblaciones. Si un genotipo o haplotipo particular para el gen es más frecuente en la población de rasgo que en la población de referencia por una cantidad estadísticamente significativa, entonces se predice que el rasgo está asociado con ese genotipo o haplotipo. En una modalidad preferida, se lleva a cabo un análisis estadístico mediante la utilización de las pruebas ANOVA convencionales, con una corrección de Bonferroni y/o un método de determinación propia que simula la correlación del genotipo/fenotipo muchas veces, y calcula un valor de significado. Cuando se están analizando muchos polimorfismos, se puede llevar a cabo una corrección para el factor, con el fin de corregir una asociación significativa que se pudiera encontrar por azar. Para utilizar los métodos estadísticos en los métodos de esta invención, ver: Statistical Methods in Biology, 3a Edición, Bailey NTJ, (Cambridge Univ. Press, 1997); I ntroduction to Computational Biology, Waterman MS (CRC Press, 2000) y Bioinformatics, Baxevanis AD & Ouellette BFF editores (John Wiley & Sons, Inc., 2001 ). En una modalidad preferida del método, el rasgo de interés es una respuesta clínica exhibida por un paciente a algún tratamiento terapéutico, por ejemplo, la respuesta a una dirección de fármaco, o la respuesta a un tratamiento terapéutico para una condición médica. En otra modalidad de la invención, se puede utilizar un genotipo o haplotipo detectable que esté en desequilibrio de enlace con el genotipo o haplotipo de interés, como un marcador subrogado. Se puede descubrir un genotipo que esté en desequilibrio de enlace con un genotipo mediante la determinación de si un genotipo o haplotipo particular para el gen es más frecuente en la población que también demuestre el genotipo marcador subrogado potencial, que en la población de referencia, por una cantidad estadísticamente significativa, y luego se predice que el genotipo marcador está asociado con ese genotipo o haplotipo, y entonces se puede utilizar como un marcador subrogado en lugar del genoti o. Definiciones. Como se utiliza en la presente, "condición médica" incluye, pero no se limita a, cualquier condición o enfermedad manifestada como uno o más síntomas físicos y/o psicológicos para los que sea deseable el tratamiento, e incluye las enfermedades previamente y recién identificadas, y otros trastornos. Como se utiliza en la presente, el término "respuesta clínica" significa cualquiera o todos los siguientes: una medida cuantitativa de la respuesta, ninguna respuesta, y una respuesta adversa (es decir, efectos secundarios). Con el objeto de deducir una correlación entre la respuesta clínica a un tratamiento y un genotipo o haplotipo, se obtienen datos sobre las respuestas clínicas exhi idas por una población de individuos que recibieron el tratamiento, denominada posteriormente en la presente como la "población clínica". Estos datos clínicos se pueden obtener mediante el análisis de los resultados de un estudio clínico que ya se haya ejecutado, y lo los datos clínicos se pueden obtener diseñando y llevando a cabo uno o más estudios clínicos nuevos. Como se utiliza en la presente, el término "estudio clínico" significa cualquier estudio de investigación diseñado para recopilar datos clínicos sobre las respuestas a un tratamiento particular, e incluye, pero no se limita a, estudios clínicos en fase I, en fase II, y en fase II!. Se emplean métodos convencionales para definir la población de pacientes y para inscribir a los sujetos. Se prefiere que los individuos incluidos en la población clínica se hayan calificado para determinar la existencia de la condición médica de interés. Esta calificación de los pacientes potenciales podría emplear un examen físico estándar, o una o más pruebas de laboratorio. De una manera alternativa, la calificación de los pacientes podría utilizar la haplotipificación para situaciones en donde haya una fuerte correlación entre el par de haplotipos y la susceptibilidad o severidad de la enfermedad. El tratamiento terapéutico de interés se administra a cada individuo de la población de estudio, y se mide la respuesta al tratamiento de cada individuo empleando uno o más criterios previamente determinados. Se contempla que, en muchos casos, la población de estudio exhibirá un número de respuestas, y que el investigador elegirá el número de grupos respondentes (por ejemplo, bajo, medio, alto) formado por las diferentes respuestas. En adición, el gen para cada individuo de la población de estudio se genotipifica y/o haplotipifica, lo cual se puede hacer antes o después de administrar el tratamiento.

Después de que se han obtenido tanto los datos clínicos como de! polimorfismo, se crean correlaciones entre la respuesta del individuo y el contenido de genotipo o haplotipo. Las correlaciones se pueden producir de varias maneras. En un método, se agrupan los individuos por su genotipo o haplotipo (o par de haplotipos) (también referido como un grupo de polimorfismo), y luego se calculan los promedios y las desviaciones estándares de las respuestas clínicas exhibidas por los miembros de cada grupo de polimorfismo. Estos resultados se analizan luego para determinar si cualquier variación observada en la respuesta clínica entre los grupos de polimorfismo es estadísticamente significativa. Los métodos de análisis estadístico que se pueden emplear se describen en L. D. Fisher y G. vanBelle, Biostatistics: A M ethodol ogy . for the Health Sciences (Wiley-lnterscience, Nueva York, 1993). Este análisis también puede incluir un cálculo de regresión en donde los sitios polimórficos del gen dan la contribución más significativa a las diferencias en el fenotipo. Un segundo método para encontrar correlaciones entre el contenido de haplotipo y las respuestas clínicas, utiliza modelos predictivos basados en algoritmos de optimización con minimización de errores. Uno de los muchos posibles algoritmos de optimización es un algoritmo genético (R.

Judson, "Genetic Algorithms and Their Uses in Chemistry" en Reviews in Computational Chemistry, Volumen 10, páginas 1-73, K. ?. Lipkowitz & D. ?. Boyd, editores (VCH Publishers, Nueva York, 1997). También se podrían utilizar templado simulado (Press y colaboradores, "Numérica! Recipes in C: The Art of Scientific Computing", Cambridge University Press (Cambridge) 1992, Capítulo 10), redes neurales (E. Rich y K. Knight, "Artificial Intelligence", 2a Edición (McG raw-H i 11 , Nueva York, 1991 , Capítulo 18)), métodos descendientes de gradiente convencionales (Press y colaboradores, supra Capítulo 10), u otros planteamientos de optimización global o local (ver la descripción en Judson, supra). Las correlaciones también se pueden analizar empleando técnicas de análisis de variación (ANOVA), con ei fin de determinar cuánto de la variación en los datos clínicos es explicado por diferentes subconjuntos de los sitios polimórficos del gen. Se utiliza el ANOVA para probar hipótesis acerca de si una variable de respuesta es causada por, o está correlacionada con, uno o más rasgos o variables que se puedan medir (Fisher y vanBelie, supra, Capítulo 10).

A partir de los análisis descritos anteriormente, el experto que prediga la respuesta clínica como una función del contenido de genotipo o haplotipo, puede construir fácilmente un modelo matemático. La identificación de una asociación entre una respuesta clínica y un genotipo o haplotipo (o par de aplotipos) para el gen, puede ser la base para diseñar un método de diagnóstico para determinar los individuos que responderán o no al tratamiento, o de una manera alternativa, que responderán en un nivel más bajo, y por lo tanto, puedan requerir más tratamiento, es decir, una mayor dosis de un fármaco. El método de diagnóstico puede tomar una de varias formas: por ejemplo, una prueba de ADN directa (es decir, genotipificación o haplotipificación de uno o más de los sitios polimórficos del gen), una prueba serológica, o una medición de examen físico. El único requerimiento es que haya una buena correlación entre los resultados de la prueba de diagnóstico y el genotipo o haplotipo subyacente, a su vez está correlacionado con la respuesta clínica. En una modalidad preferida, este método de diagnóstico emplea el método de haplotipificación predictiva descrito anteriormente. Una computadora puede implementar cualquiera o todas las operaciones analíticas y matemáticas involucradas en la práctica de los métodos de ia presente invención. En adición, la computadora puede ejecutar un programa que genere vistas (o pantallas) exhibidas en un dispositivo de despliegue visual, y con las cuales pueda interactuar el usuario para ver y analizar grandes cantidades de información en relación con el gen y su variación genómica, incluyendo localización del cromosoma, estructura del gen, y familia genética, datos de expresión del gen, datos de polimorfismo, datos de secuencia genética, y datos de población de datos clínicos (por ejemplo, datos sobre el origen etnogeográfico, respuestas clínicas, genotipos, y haplotipos para una o más poblaciones). Los datos de polimorfismo descritos en la presente se pueden almacenar como parte de una base de datos de relación (por ejemplo, una instancia de una base de datos Oracle, o un conjunto de archivos llanos en ASCII). Estos datos de polimorfismo se pueden almacenar en el disco duro de la computadora, o, por ejemplo, se pueden almacenar en una CD-ROM, o en uno o más dispositivos de almacenamiento diferentes accesibles mediante la computadora. Por ejemplo, los datos se pueden almacenar en una o más bases de datos en comunicación con la computadora por medio de una red. En otras modalidades, la invención proporciona métodos, composiciones, y estuches para haplotipificar y/o genotipificar el gen en un individuo. La composición contiene sondas de oligonucleótidos y cebadores diseñados para h i bridarse específicamente a una o más regiones objetivas que contengan, o que estén adyacentes a, un sitio polimórfico. Los métodos y composiciones para establecer el genotipo o haplotipo de un individuo en los sitios polimórficos novedosos descritos en la presente, son útiles para estudiar ei efecto de los polimorfismos en la etiología de las enfermedades afectadas por la expresión y función de la proteína, para estudiar la eficacia de la dirección de fármacos, para predecir ia susceptibilidad individual a las enfermedades afectadas por la expresión y función de la proteína, y para predecir la respuesta individual a los fármacos que se dirigen al producto genético. En todavía otra modalidad, la Invención proporciona un método para identificar una asociación entre un genotipo o haplotipo y un rasgo. En las modalidades preferidas, el rasgo es la susceptibilidad a una enfermedad, la severidad de una enfermedad, la etapa de una enfermedad, o la respuesta a un fármaco. Estos métodos tienen aplicabilidad en el desarrollo de pruebas de diagnóstico y tratamientos terapéuticos para todas las aplicaciones f arm acogenéticas en donde exista el potencial de una asociación entre un genotipo y un resultado de tratamiento, incluyendo mediciones de eficacia, mediciones de quinasa de proteína, y mediciones de efectos secundarios. La invención también proporciona un sistema de computación para almacenar y exhibir los datos de polimorfismo determinados para el gen. El sistema de computación comprende una unidad de procesamiento de computadora; un despliegue visual; y una base de datos que contiene los datos de polimorfismo. Los datos de poli- morfismo incluyen los polimorfismos, los genotipos, y los haplotipos identificados para el gen en una población de referencia. En una modalidad preferida, el sistema de computación es capaz de producir un despliegue visual que muestre los haplotipos organizados de acuerdo con sus relaciones de evolución. En otro aspecto, la invención proporciona sondas de polimorfismos de un solo nucleótido, las cuales son útiles en la clasificación de las personas de acuerdo con sus tipos de variación genética. Las sondas de polimorfismos de un solo nucleótido de conformidad con la invención son oligonucieótidos, los cuales pueden discriminar entre los alelos de un ácido nucleico de un polimorfismo de un solo nucleótido en ensayos de discriminación alélica convencionales. Como se utiliza en la presente, un "ácido nucleico de polimorfismo de un solo nucleótido" es una secuencia de ácido nucleico, la cual comprende un nucleótido que es variable dentro de una secuencia de nucieótidos de otra manera idéntica entre individuos o grupos de individuos, y por lo tanto, que existen como alelos. Estos ácidos nucleicos de olimorfismos de un solo nucleótido pueden ser parte de un cromosoma, o pueden ser una copia exacta de una parte de un cromosoma, por ejemplo mediante la amplificación de esta parte de un cromosoma mediante reacción en cadena de la polimerasa, o mediante clonación. Los ácidos nucleicos de polimorfismos de un solo nucleótido son referidos posteriormente en la presente simplemente como "SNPs" (polimorfismos de un solo nucleótido). Las sondas de polimorfismos de un solo nucleótido de acuerdo con la invención, son oligonucleótidos que son complementarios para un ácido nucleico de un polimorfismo de un solo nucleótido. Como se utiliza en la presente, el término "complementario" significa exactamente complementario a través de toda la longitud del oligonucleótido en el sentido de la palabra de Watson y Crick. En ciertas modalidades preferidas, los oligonucleótidos de conformidad con este aspecto de la invención, son complementarios para un alelo del ácido nucleico del polimorfismo de un solo nucleótido, pero no para cualquier otro alelo del ácido nucleico del polimorfismo de un solo nucleótido. Los oligonucleótidos de acuerdo con esta modalidad de la invención, pueden discriminar entre los alelos del ácido nucleico del polimorfismo de un solo nucleótido de diferentes maneras. Por ejemplo, bajo condiciones de hibridación restringente, un oligonucleótido de la longitud apropiada se hibridará a un alelo del ácido nucleico del polimorfismo de un solo nucleótido, pero no a cualquier otro alelo del ácido nucleico del polimorfismo de un solo nucleótido. El oligonucleótido se puede marcar mediante una radiomarca o una marca fluorescente. De una manera alternativa, se puede utilizar un oligonucleótido de la longitud apropiada como un cebador para la reacción en cadena de la polimerasa, en donde el nucleótido 3'-terminal es complementario para un alelo del ácido nucleico del polimorfismo de un solo nucleótido, pero no para cualquier otro alelo. En esta modalidad, la presencia o ausencia de amplificación mediante reacción en cadena de la polimerasa, determina el haplotipo del ácido nucleico del polimorfismo de un solo nucleótido. Los fragmentos genómicos y de ADNc de la invención comprenden cuando menos un sitio poümórfico novedoso identificado en la presente, y tienen una longitud de cuando menos 10 nucleotidos, y pueden abarcar la longitud completa del gen. De preferencia, un fragmento de acuerdo con la presente invención es de entre 100 y 3,000 nucleotidos de longitud, y más preferiblemente de entre 200 y 2,000 nucleotidos de longitud, y de una manera muy preferible de entre 500 y 1000 nucleotidos de longitud. En la desc ipción de los sitios polimórficos identificados en la presente, se hace referencia a la cadena en sentido del gen para mayor conveniencia. Sin embargo, como es reconocido por el experto, las moléculas de ácidos nucleicos que contengan al gen pueden ser complementarias para las moléculas de doble cadena, y por lo tanto, la referencia a un sitio particular en la cadena en sentido se refiere también al sitio correspondiente en la cadena anti-sentido complementaria. Por consiguiente, se puede hacer referencia al mismo sitio polimórfico en cualquier cadena, y se puede diseñar un o I i g o n u el e ó t i d o para hibridarse específicamente a cualquier cadena en una región objetiva que contenga el sitio polimórfico. Por lo tanto, la invención también incluye polín ucleótidos de una sola cadena que son complementarios para la cadena en sentido de las variantes genómicas descritas en la presente. En una modalidad preferida, este estuche puede comprender además un elemento de recolección de muestras de ADN. En particular, la composición cebadora de geno-tipificación puede comprender cuando menos dos conjuntos de pares de cebadores específicos del alelo. De preferencia, los dos oligonucleótidos de genotipificación se empacan en recipientes separados. Se debe entender que los métodos de la invención descritos en la presente pueden comprender además en general el uso de un estuche de acuerdo con la invención. En términos generales, los métodos de la invención se pueden llevar a cabo ex vivo, y estos métodos ex vivo están específicamente contemplados por la presente invención.

También, donde un método de la invención pueda incluir pasos que se puedan practicar en el cuerpo humano o animal, la presente invención contempla específicamente los métodos que solamente comprendan los pasos que no sean practicados en el cuerpo humano o animal. Se pueden investigar los efectos de los polimorfismos identificados en la presente sobre la expresión, mediante la preparación de células y/u organismos recorrí binantes , de preferencia animales recombinantes, que contengan una variante polimórfica del gen. Como se utiliza en la presente, "expresión" incluye, pero no se limita a, una o más de las siguientes: transcripción del gen en un ARNm precursor; empalme y otro procesamiento del ARNm precursor para producir el ARNm maduro; estabilidad del ARNm; traducción del ARNm maduro en proteína (incluyendo uso de codones y disponibilidad del ARNt); y glicosilación y/u otras modificaciones del producto de traducción, si se requiere, para una expresión y función apropiadas. Con el fin de preparar una célula recombinante de la invención, se puede introducir el isogén deseado en la célula en un vector, de tal manera que el isogén siga siendo extracromosómico. En esta situación, el gen será expresado por la célula a partir de la localización extracromosómica. En una modalidad preferida, el isogén se introduce en una célula de tal manera que se recombine con el gen endógeno presente en la célula. Esta recombinación requiere de la presentación de un evento de recombinación doble, dando como resultado de esta manera el polimorfismo genético deseado. Los vectores para la introducción de genes tanto para la recombinación como para el mantenimiento extracromosómico son conocidos en la técnica, y se puede utilizar en la invención cualquier vector o construcción de vector adecuado. En este campo se conocen los métodos, tales como electroporación, bombardeo de partículas, co-precipitación con fosfato de calcio, y transducción viral, para introducir ADN en las células; por consiguiente, la elección del método puede quedar dentro de la competencia y preferencia del experto. Se preparan organismos reco m b i n a ntes , es decir, animales t r a n s g é n i c o s , que expresen un gen variante, empleando procedimientos convencionales conocidos en la materia. De preferencia, se introduce una construcción que comprenda al gen variante en un animal no humano o en un ancestro del animal en una etapa embrionaria, es decir, la etapa de una célula, o en general no más tarde de a roximadamente la etapa de 8 células. Se pueden hacer animales transgénicos que lleven las construcciones de la invención mediante varios métodos conocidos por los expertos en este campo. Un método involucra transfectar en el embrión un retrovirus construido para contener uno o más elementos aislantes, un gen o genes de interés, y otros componentes conocidos por el experto para proporcionar un vector de lanzamiento completo que aloje a los genes aislados como un transgén, ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,610,053. Otro método involucra la inyección directa de un transgén en el embrión. Un tercer método involucra el uso de células totipotentes embrionarias. Los ejemplos de los animales en los que se pueden introducir isogenes incluyen, pero no se limitan a, ratones, ratas, otros roedores, y primates no humanos (ver "The Introduction of Foreign Genes into Mice", y las referencias citadas en el mismo, en: Recombinant DNA, Editores, J . D. Watson, M. Gilman, J. Witkowski, y M . Zoller; W. H. Freeman and Company, Nueva York, páginas 254-272). Se pueden utilizar animales transgénicos que expresen establemente un isogén humano, y que produzcan la proteína humana, como los modelos biológicos para estudiar las enfermedades relacionadas con la expresión y/o actividad anormal, y para rastrear y ensayar diferentes fármacos candidatos, compuestos, y regímenes de tratamiento para reducir los síntomas o efectos de estas enfermedades. En la práctica de la presente invención, se emplean muchas técnicas convencionales en biología molecular, microbiología, y ADN recombinante. Estas técnicas son bien conocidas, y se explican, por ejemplo, en "Current Protocole in Molecular Biology", Volúmenes I - 111 , Ausubel Editor (1997); Sambrook y cola oradores, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2a Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Y (1989); "DNA Cloning: A Practical Approach" , Volúmenes I y I I , Glover, Editor (1985); "Oligonucleotide Synthesis", Gait, Editor (1984); "Nucleic Acid Hybridization" , Hames y Higgins, Editores (1985); " Tran scription and Tra n s I a tío n" , Hames y Higgins, Editores (1984); "Animal Cell Culture", Freshney, Editor (1986); "Immobilized Cells and Enzymes", IRL Press (1986); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning"; la serie, Methods in Enzymol., Academic Press, Inc. (1984); "Gene Transfer Vectors Mammalian Cells", Miller y Calos, Editores, Cold Spring Harbor Laboratory, N Y (1987); y Methods in Enzymology, Volúmenes 154 y 155, Wu y Grossman, y Wu, Editores, respectivamente. Entonces se compararían los niveles de control estándar del producto de expresión genética determinados de esta manera en los diferentes grupos de control, con el nivel medido de un producto de expresión genética en un paciente dado. Este producto de expresión genética podría ser el ARNm característico asociado con este grupo de genotipo particular, o el producto de expresión genética del polipéptido de ese grupo de genotipo. Entonces se podría clasificar o asignar al paciente a un grupo de genotipo particular basándose en la similitud de los niveles medidos, al compararse con los niveles de control para un grupo dado.

Como lo entenderá un experto en la materia, habrá cierto grado de i n ce rti d u m b re involucrada al hacer esta determinación. Por consiguiente, se utilizarían desviaciones estándares de los niveles del grupo de control para hacer una determinación probabilística, y serían aplicables los métodos de esta invención sobre un amplio número de determinaciones de grupos de genotipos basadas en la proba ilidad. Por lo tanto, por ejemplo, y no a manera de limitación, en una modalidad, si el nivel medido del producto de expresión genética cae dentro de 2.5 desviaciones estándares del promedio de cualquiera de los grupos de control, entonces ese individuo se puede asignar a ese grupo de genoti o. En otra modalidad, si el nivel medido del producto de expresión genética cae dentro de 2.0 desviaciones estándares del promedio de cualquiera de los grupos de control, entonces ese individuo se puede asignar a ese grupo de genotipo. En todavía otra modalidad, si el nivel medido del producto de expresión genética cae dentro de 1.5 desviaciones estándares del promedio de cualquiera de los grupos de control, entonces ese individuo se puede asignar a ese grupo de genotipo. En todavía otra modalidad, si el nivel medido del producto de expresión genética es de 1.0 ó menos desviaciones estándares del promedio de cualquiera de los niveles de los grupos de control, entonces ese individuo se puede asignar a ese grupo de genotipo. Por consiguiente, este proceso permitirá hacer la determinación, con diferentes grados de probabilidad, de en cuál grupo se debe colocar un paciente específico, y esta asignación a un grupo de genotipo determinaría entonces la categoría de riesgo en donde se debe poner al individuo. Los métodos para detectar y medir los niveles de ARNm y los niveles de productos de expresión genética de polipéptidos son bien conocidos en la materia, e incluyen el uso de micro-arreglos de nucleótidos y métodos de detección de polipéptidos que involucran espectrómetros de masas y/o técnicas de detección y cuantificación de anticuerpos. Ver también, Human Molecular Genetics, 2a Edición, Tom Strachan y Andrew, Read (John Wiley and Sons, Inc. Publication, NY, 1999). A d i ci o n a I m e n te , se puede emplear la detección de la concentración del producto de expresión del polipéptido (proteína) del gen en los fluidos o tejidos corporales, para determinar la presencia o ausencia del polimorfismo, y se puede utilizar el nivel relativo del producto de expresión del polipéptido para determinar si está presente el polimorfismo en un estado homocigótico o heterocigótico, y por consiguiente, la categoría de riesgo del individuo.

Como se utiliza en la presente, "condición médica" incluye, pero no se limita a, cualquier condición o enfermedad manifestada como uno o más síntomas físicos y/o psicológicos para los cuales sea deseable el tratamiento, e incluye las enfermedades previamente y recién identificadas, y otros trastornos. Como se utiliza en la presente, el término "polimorfismo" significará cualquier variante de secuencia presente a una frecuencia de >1 por ciento en una población. La variante de secuencia puede estar presente a una frecuencia significativamente mayor que el 1 por ciento, tal como el 5 por ciento ó el 10 por ciento o más. También, el término se puede utilizar para referirse a la variación de secuencia observada en un individuo en un sitio polimórfico. Los polimorfismos incluyen sustituciones de nucleótidos, inserciones, supresiones, y microsatélites, y pueden, pero no necesitan, dar como resultado diferencias detectables en la expresión genética o en la función de la proteína. Como se utiliza en la presente, el término "respuesta clínica" significa cualquiera o todas las siguientes: una medida cuantitativa de la respuesta, ninguna respuesta, y una respuesta adversa, es decir, efectos secundarios. Como se utiliza en la presente, el término "alelo" significará una forma particular de un gen o secuencia de ADN en una localización cromosómica específica {locus).

Como se utiliza en la presente, el término "genotipo" significará una secuencia 5' a 3' fuera de fase de pares de nucleótidos encontrada en uno o más sitios polimórficos en un locus sobre un par de cromosomas homólogos de un individuo. Como se utiliza en la presente, el genotipo incluye un genoti o completo y/o un sub-genotipo. Como se utiliza en la presente, el término "polinucleótido" significará cualquier ARN ó ADN, que puede ser ARN ó ADN no modificado o modificado. Los polinucleótidos incluyen, sin limitación, ADN de una sola cadena y de doble cadena, ADN que sea una mezcla de regiones de una sola cadena y de doble cadena, ARN de una sola cadena y de doble cadena, y ARN que sea una mezcla de regiones de una sola cadena y de doble cadena, moléculas híbridas que comprendan ADN y ARN que pueden ser de una sola cadena, o más típicamente de doble cadena, o una mezcla de regiones de una sola cadena y de doble cadena. En adición, el polinucleótido se refiere a las regiones de triple cadena que comprenden ARN ó ADN, o tanto ARN como ADN. El término "polinucleótido" también incluye ADNs ó ARNs que contengan una o más bases modificadas, y ADN ó ARNc con estructuras base modificadas para la estabilidad o por otras razones. Como se utiliza en la presente, el término "gen" significará un segmento de ADN que contenga toda la información para la biosíntesis regulada de un producto de ARN, incluyendo promotores, exones, intrones, y otras regiones no traducidas que controlen la expresión. Como se utiliza en la presente, el término "polipéptido" significará cualquier polipéptido que comprenda dos o más aminoácidos unidos unos a otros por enlaces peptídícos o por enlaces peptídicos modificados, es decir, isoésteres peptídícos. El polipéptido se refiere a ambas cadenas cortas, comúnmente referidas como péptidos, glícopéptidos, u oligómeros, y a cadenas más largas, generalmente referidas como proteínas. Los polipéptidos pueden contener aminoácidos diferentes de los 20 aminoácidos codificados por el gen. Los polipéptidos incluyen secuencias de aminoácidos modificadas ya sea mediante procesos naturales, tales como procesamiento posterior a la traducción, o bien mediante técnicas de modificación química que son bien conocidas en este campo. Estas modificaciones se describen bien en los textos básicos, y en las monografías más detalladas, así como en la literatura de investigación voluminosa. Como se utiliza en la presente, el término "sitio polimórfico" significará una posición dentro de un locus en donde se encuentren cuando menos dos secuencias alternadas en una población, la más frecuente de las cuales tiene una frecuencia no mayor del 99 por ciento. Como se utiliza en la presente, el término "par de nucleótidos" significará los nucleótidos que se encuentran en un sitio polimórfico sobre las dos copias de un cromosoma de un individuo. Como se utiliza en la presente, el término "en fase" significa, cuando se aplica a una secuencia de pares de nucleótidos para dos o más sitios polimórficos en un íocus, que se conoce la combinación de nucleótidos presentes en esos sitios polimórficos sobre una sola copia del Iocus. Con el objeto de deducir una correlación entre la respuesta clínica a un tratamiento, y un genotipo o haplotipo, es necesario obtener los datos sobre las respuestas clínicas exhibidas por una población de individuos que recibieron al tratamiento, denominada posteriormente en la presente como la "población clínica". Estos datos clínicos se pueden obtener mediante el análisis de los resultados de un estudio clínico que ya se haya ejecutado, y/o se pueden obtener los datos clínicos mediante el diseño y la realización de uno o más estudios clínicos nuevos. Como se utiliza en la presente, el término "estudio clínico" significa cualquier estudio de investigación diseñado para recopilar datos clínicos sobre las respuestas a un tratamiento particular, e incluye, pero no se limita a, estudios clínicos en fase I, II, y III. Se utilizan métodos convencionales para definir la población de pacientes, y para inscribir a los sujetos.

Como se utiliza en la presente, el término "locus" significará una localización sobre un cromosoma o molécula de ADN correspondiente a un gen o a una característica física o fenotípica. El tratamiento terapéutico de interés se administra a cada individuo de la población de estudio, y se mide la respuesta al tratamiento de cada individuo empleando uno o más criterios previamente determinados. Se contempla que, en muchos casos, la población en estudio exhibirá un número de respuestas, y que el investigador elegirá el número de grupos respondentes, por ejemplo, bajo, medio, y alto, formados por las diferentes respuestas. En adición, se genotipifica y/o haplotipifica el gen para cada individuo de la población en estudio, lo cual puede hacer antes o después de administrar el tratamiento. La Detección de Ácidos Nucleicos y Proteínas como Marcadores. En una modalidad particular, se puede determinar el nivel de ARNm correspondiente al marcador, tanto en un formato in situ como in vitro, en una muestra biológica, empleando los métodos conocidos en este campo. El término "muestra biológica" pretende incluir tejidos, células, fluidos biológicos, y aislados de los mismos, aislados de un sujeto, así como tejidos, células, y fluidos presentes adentro de un sujeto. Muchos métodos de detección de expresión utilizan ARN aislado. Para los métodos in vitrc, se puede utilizar cualquier técnica de aislamiento de ARN que no seleccione contra el aislamiento del ARNm para la purificación del ARN a partir de las células. Ver, por ejemplo, Ausubel y colaboradores, Curr. Prot. Mol. Biol., John Wlley & Sons, N Y (1987-1999). Adicionalmente, se pueden procesar fácilmente grandes números de muestra de tejido empleando técnicas bien conocidas por los expertos en la materia, tales como, por ejemplo, el proceso de aislamiento de ARN de un solo paso de la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,843,155. El ARNm aislado se puede utilizar en ensayos de hibridación o de amplificación que incluyen, pero no se limitan a, análisis Southern o Northern, análisis de reacción en cadena de la polimerasa, y arreglos de sondas. Un método de diagnóstico preferido para la detección de los niveles de ARNm involucra poner en contacto el ARNm aislado con una molécula de ácido nucleico (sonda) que pueda h i bridarse al ARNm codificado por el gen que se esté detectando. La sonda de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, un ADNc de longitud completa, o una porción del mismo, tal como un oligonucleótido de cuando menos 7, 15, 30, 50, 100, 250, ó 500 nucleótidos de longitud, y suficientes para h i bridarse específicamente bajo condiciones restringentes a un ARNm ó a un ADN genómico que codifique un marcador de la presente invención. Otras sondas adecuadas para utilizarse en los ensayos de diagnóstico de la invención se describen en la presente. La hibridación de un ARNm con la sonda, indica que se está expresando el marcador en cuestión. En un formato, se inmoviliza el ARNm sobre una superficie sólida, y se pone en contacto con una sonda, por ejemplo, pasando el ARNm aislado sobre un gel de agarosa, y transfiriendo el ARNm desde el gel hasta una membrana, tal como nitrocelulosa. En un formato alternativo, las sondas se inmovilizan sobre una superficie sólida, y se pone en contacto el ARNm con las sondas, por ejemplo, en un arreglo de chip genético Affymetrix. Un experto puede adaptar fácilmente los métodos de detección de ARNm conocidos para utilizarse en la detección del nivel de ARNm codificado por los marcadores de la presente invención. Un método alternativo para determinar el nivel de ARNm correspondiente a un marcador de la presente invención en una muestra, involucra el proceso de amplificación del ácido nucleico, por ejemplo, mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (la modalidad experimental estipulada en Mullís, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,683,202 (1987); reacción en cadena de la ligasa, Barany (1991), supra; réplica de secuencia auto-sostenida, Guatelli y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. E. U. A., Volumen 87, páginas 1874-1878 (1990); sistema de amplificación de transcripción, Kwoh y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. E. U. A . , Volumen 86, páginas 1173-1177 (1989); replicada Q - beta, Lizardi y colaboradores, Biol. Technology, Volumen 6, página 1197 (1988); réplica de círculo rodante, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,854,033 (1988); o cualquier otro método de amplificación de ácidos nucleicos, seguido por la detección de las moléculas amplificadas empleando técnicas bien conocidas por los expertos en la materia. Estos esquemas de detección son especialmente útiles para la detección de las moléculas de ácidos nucleicos, si estas moléculas están presentes en números muy bajos. Como se utilizan en la presente, los cebadores de amplificación se definen como un par de moléculas de ácidos nucleicos que pueden templarse a las regiones 5' o 3' de un gen (cadenas más y menos, respectivamente, o viceversa) , y contienen una región corta entre las mismas. En general, los cebadores de amplificación son de aproximadamente 10 a 30 nucleótidos de longitud, y flanquean una región de aproximadamente 50 a 200 nucleótidos de longitud. Bajo condiciones apropiadas y con los reactivos apropiados, estos cebadores permiten la amplificación de una molécula de ácido nucleico que comprenda la secuencia de nucleótidos flanqueada por los cebadores.

Para los métodos in situ, no se necesita aislar el ARNm de las células antes de la detección. En estos métodos, se prepara/procesa una muestra de células o tejido, empleando métodos histológicos conocidos. Luego se inmoviliza la muestra sobre un soporte, típicamente un portaobjetos de vidrio, y entonces se pone en contacto con una sonda, que puede hibridarse al ARNm que codifique el m arcador. Como una alternativa a hacer las determinaciones basándose en el nivel de expresión absoluto del marcador, las determinaciones se pueden basar en el nivel de expresión normalizado del marcador. Los niveles de expresión se normalizan corrigiendo el nivel de expresión absoluto de un marcador, comparando su expresión con la expresión de un gen que no sea un marcador, por ejemplo un gen de mantenimiento que se exprese de una manera constitutiva. Los genes adecuados para la normalización incluyen los genes de mantenimiento, tales como el gen de actina o los genes específicos de las células epiteliales. Esta normalización permite hacer la comparación del nivel de expresión en una muestra, por ejemplo una muestra de pacientes, con otra muestra, o entre muestras de diferentes fuentes. De una manera alternativa, el nivel de expresión se puede proporcionar como un nivel de expresión relativo. Con el fin de determinar un nivel de expresión relativo de un marcador, se determina el nivel de expresión del marcador para 10 ó más muestras biológicas normales contra muestras biológicas de enfermedad, de preferencia 50 ó más muestras, antes de la determinación del nivel de expresión para la muestra en cuestión. Se determina el nivel de expresión promedio de cada uno de los genes ensayados en el número más grande de muestras, y se utiliza como un nivel de expresión de la línea base para el marcador. Entonces se divide el nivel de expresión del marcador determinado para la muestra de prueba (nivel de expresión absoluto) entre el valor de expresión promedio obtenido para ese marcador. Esto proporciona un nivel de expresión relativo. De preferencia, las muestras utilizadas en la determinación de la línea base serán de pacientes que no tengan el polimorfismo. La elección de la fuente de células depende del uso del nivel de expresión relativo. El uso de la expresión encontrada en tejidos normales como un puntaje de expresión promedio ayuda a validar si el marcador ensayado es específico (contra las células normales). En adición, a medida que se acumulan más datos, se puede revisar el valor de expresión promedio, proporcionando valores de expresión relativos mejorados, basándose en los datos acumulados. Detección de Polipéptidos. En otra modalidad de la · presente invención, se detecta un polipéptido que corresponda a un marcador. Un agente preferido para detectar un polipéptido de la invención es un anticuerpo capaz de enlazarse a un polipéptido correspondiente a un marcador de la invención, de preferencia un anticuerpo con una marca detectable. Los anticuerpos pueden ser policlonales, o más preferiblemente son monoclonales. Se puede utilizar un anticuerpo intacto, o un fragmento del mismo, por ejemplo Fab ó F ( a b ' ) 2. El término "marcado", con respecto a la sonda o al anticuerpo, pretende abarcar el marcado directo de la sonda o del anticuerpo mediante acoplamiento, es decir, enlace físico, de una sustancia detectable a la sonda o anticuerpo, así como el marcado indirecto de la sonda o anticuerpo mediante reactividad con otro reactivo que sea directamente marcado. Los ejemplos del marcado indirecto incluyen la detección de un anticuerpo primario utilizando un anticuerpo secundario fluorescentemente marcado, y un marcado de extremo de una sonda de ADN con biotina, de tal manera que se pueda detectar con la estreptavidina fluorescentemente marcada. Se pueden aislar proteínas de individuos empleando técnicas que son bien conocidas por los expertos en este campo. Los métodos de aislamiento de proteínas empleados, por ejemplo, pueden ser tales como los descritos en Harlow y Lañe (1988), supra. Se pueden emplear una variedad de formatos para determinar si una muestra contiene una proteína que se enlace con un anticuerpo dado. Los ejemplos de estos formatos incluyen, pero no se limitan a, EIA; radioinmunoensayo (RIA), análisis Western blot, y ELISA. Un experto puede adaptar fácilmente los métodos conocidos de detección de proteínas/anticuerpos para utilizarse en la determinación de las células que expresen un marcador de la presente invención y la concentración relativa de ese producto de expresión de polipéptido específico en la sangre o en otros tejidos corporales. En un formato, se pueden utilizar anticuerpos o fragmentos de anticuerpos en los métodos, tales como Western blots o técnicas de inmunofluorescencia, para detectar las proteínas expresadas. En tales usos, en general es preferible inmovilizar ya sea el anticuerpo o las proteínas sobre un soporte sólido. Los soportes o portadores en fase sólida adecuados incluyen cualquier soporte capaz de enlazarse a un antígeno o a un anticuerpo. Los soportes o portadores bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nylon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, gabbros, y magnetita. Un experto en la materia conocerá muchos otros portadores adecuados para enlazar el anticuerpo o el antígeno, y será capaz de adaptar este soporte para utilizarse con la presente invención. Por ejemplo, la proteína aislada de las células del paciente se puede pasar sobre el ectrof o res is en gel de p o I i acri I a m i d a , y se puede inmovilizar sobre un soporte en fase sólida, tal como nitrocelulosa. Luego se puede lavar el soporte con reguladores adecuados, seguido por el tratamiento con un anticuerpo detectablemente marcado. El soporte en fase sólida se puede lavar entonces con el regulador una segunda vez para remover el anticuerpo no enlazado. Luego se puede detectar la cantidad de marca enlazada sobre el soporte sólido por medios convencionales, y esta medición se traduce hasta un nivel o concentración de proteína en sangre o en otro tejido corporal . La invención también abarca estuches para detectar la presencia de un polipéptido o ácido nucleico correspondiente a un marcador de la invención en una muestra biológica, por ejemplo, cualquier fluido corporal, incluyendo, pero no limitándose a, suero, plasma, linfa, fluido quístico, orina, heces, csf, fluido ascítico, o sangre, e incluyendo muestras de biopsia del tejido corporal. Por ejemplo, el estuche puede comprender un compuesto marcado o agente capaz de detectar un polipéptido o un ARNm que codifique un polipéptido correspondiente a un marcador de la invención en una muestra biológica, y elementos para determinar la cantidad del polipéptido ó ARNm en la muestra, por ejemplo, un anticuerpo que se enlace con el polipéptido, o una sonda de oligonucleótido que se enlace con el ADN ó el ARNm que codifique el polipéptido. Los estuches también pueden incluir instrucciones para interpretar los resultados obtenidos utilizando el estuche. Para los estuches basados en anticuerpos, el estuche puede comprender, por ejemplo, 1) un primer anticuerpo, por ejemplo unido a un soporte sólido, que se enlace a un polipéptido correspondiente a un marcador de ia invención; y opcionalmente 2) un segundo anticuerpo diferente que se enlace ya sea al polipéptido o bien al primer anticuerpo, y que se conjugue a una marca detectable. Para los estuches basados en oligonucleótido, el estuche puede comprender, por ejemplo, 1) un oligonucleótido, por ejemplo un oligonucleótido detectable-mente marcado, que se hibride a una secuencia de ácido nucleico que codifique un polipéptido correspondiente a un marcador de ia invención; o 2) un par de cebadores útiles para amplificar una molécula de ácido nucleico que corresponda a un marcador de la invención. El estuche también puede comprender, por ejemplo, un agente regulador del pH, un conservador, o un agente estabilizante de proteína. El estuche puede comprender además los componentes necesarios para detectar la marca detectable, por ejemplo una enzima o un sustrato. El estuche también puede contener una muestra de control o una serie de muestras de control, que se pueden ensayar y comparar con la muestra de control. Cada componente del estuche se puede encerrar dentro de un recipiente individual, y todos los diferentes recipientes pueden estar dentro de un solo paquete, junto con instrucciones para interpretar los ensayos llevados a cabo utilizando el estuche. Estuches. Los estuches de la invención pueden contener un producto escrito sobre o dentro del recipiente del estuche. El producto escrito describe la manera de utilizar los reacti os contenidos en el estuche para determinar si un paciente experimentará hepatotoxicidad durante ei tratamiento con el fármaco. En varias modalidades, el uso de los reactivos puede ser de acuerdo con los métodos de la invención. En una modalidad, los reactivos son pares de cebadores para llevar a cabo el análisis con reacción en cadena de la polimerasa de los polimorfismos genéticos de IL1A.

EJEMPLO ANÁLISIS FARMACOGENETICO CLÍNICO DE HEPATOTOXICIDAD EN EL ESTUDIO CLÍNICO. Demografía de los participantes en el análisis farmacogenético clínico. De los 139 sujetos inscritos en el estudio clínico, 83 consintieron a la participación en la porción farmacogenética clínica del estudio clínico. Esto representa aproximadamente el 60 por ciento de la población total que participó en el estudio clínico. La población del análisis farm acogenéti co clínico fue representativa del grupo de estudio clínico en términos de edad, raza, y género. Además, el índice de consentimiento fue comparable para cada grupo del estudio (placebo, 50, 100, y 150 miligramos/día), de tal manera que el análisis farmacogenético clínico no se inclinó hacia un grupo de dosificación. No se observaron diferentes estadísticamente significativas entre la demografía de la población farmacogenética clínica, comparándose con la población de estudio total. TABLA 1 Distribución de muestras farmacoqenéticas clínicas, comparándose con las muestras del estudio clínico total Muestras Muestras farmacogenéticas clínicas del estudio EDAD (promedio, años)3 58.8 59.3 RAZAb Caucásica (70) 84% (117) 84% Negra (5) 6% (9) 6.4% Oriental (1) 1.2% (2) 1.4% Hispana (7) 8.4% (9) 7% ap<0.7748 (ANOVA). p<0.9112 (Exacta de Fisher). cp<0.6698 (Exacta de Fisher). dp<0.9342 (Exacta de Fisher). ep<1.000 (Exacta de Fisher).

Se recolectaron muestras de sangre de cada paciente en los sitios de estudio individuales, y se embarcaron a Covance (Ginebra, Suiza), en donde se extrajo el ADN genómico utilizando el Estuche de Aislamiento de ADN PUREGENEMR (D-50K) (Gentra, Minneapolis, MN). G enotipificación . Se genotipificaron un total de 18 loci en siete genes. Los ensayos de polimorfismos de un solo nucleótido se diseñaron utilizando la información de las bases de datos públicas, tales como O IM, el SNP Consortium, Locus Link, y dbSNP, y la información de Third Wave Technologies, Inc. (TWT, Madison, Wl). No se analizaron adicionalmente cualesquiera loe i que no fueran polimórficos en esta población de estudio. La genotipificación se llevó a cabo con 40 a 60 nanogramos de ADN genómico utilizando el ensayo Invader® desarrollado por Third Wave Technologies, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Lyamichev V. y colaboradores, Nat. Biotechnol. 17:292-6 (1999); Ryan D. y colaboradores, Mol. Diagn. 4:135-44 9 (1999). A cada polimorfismo de un solo nucleótido interrogado en este estudio, se le asignó un identificador farm acogenético clínico (CPG), referido como el locus PG ID. Ver la Tabla 2 para una lista de todos los polimorfismos de un solo nucleótido ensayados en este estudio, junto con su locus PG IDs, y los detalles acerca de la localización del polimorfismo dentro del gen de interés.

TABLA 2 Lista de gen es exam inad os en el análisis farm acoqenético clínico Símbolo Nombre del Locus REF ACC Frec. Frec. Posición Localización del gen gen CPG del del ID alelo alelo 1 2 ABCB1 Cásete de 181 M29445 0.47 0.53 176 Exón 26 enlace de ATP, ILE1144IL E sub-familia B (MDR/TAP), miembro 1 ABCB1 Cásete de 1006 AC005068.1 0.63 0.37 83646 Desconocido enlace de ATP, sub-familia B (MDR/TAP), miembro 1 ABCB1 Cásete de 1045 AC002457.1 0.48 0.52 19981202 Desconocido enlace de ATP, sub-familia B (MDR/TAP), miembro 1 CD14 Antígeno CD14 1708 U00699 0.56 0.44 312 Promotor CYP2D6 Citocromo 31 M33388 0.86* 0.14* 3465 Intrón P450, sub- familia IID (debrisoquina, asparteína, etc., -metabolizante), polipéptido 6 CYP2D6 Citocromo 211 M33388 0.60* 0.40* 4469 ???? d P450, subARG269CYS familia IID (debrisoquina, asparteína, etc., -metabolizante), polipéptido 6 CYP2D6 Citocromo 212 M33388 0.52 0.48 5799 Exón 9 P450, subTHR486SER familia IID (debrisoquina, asparteína, etc., -metabolizante), polipéptido 6 CYP2D6 Citocromo 213 M33388 0.83 0.17 1719 Exón 1 P450, subPR034SER familia IID (debrisoquina, asparteína, etc., -metabolizante), polipéptido 6 CYP3A4 Citocromo 2325 AF209389 0.84* 0.16* 20338 Intrón 10 P450, subfamilia IIIA (oxidasa de nifeditina), polipéptido 4 IL1A Interleucina 1, 279 X03833 0,72* 0.28* 549 Promotor alfa ¡L1A Interleucina 1 , 302 X03833 0.72* 0.28* 6282 Exón 5 alfa IL1A+ Interleucina 1 , 303 X03833 1.00 0.00 4282 Exón4 alfa NR1I2 Receptor 2641 AC069444 0.62* 0.38* 42813 Promotor nuclear, subfamilia 1 , grupo I, miembro 2 NR1I2 Receptor 2642 AF061056 0.60 0.40 252 Intrón nuclear, subfamilia 1 , grupo I, miembro 2 NR1I2 Receptor 2643 AF061056 0.80 0.20 156 3' UTR nuclear, subfamilia 1 , grupo I, miembro 2 0RM1 Orosomucoide 1831 NT_031830 0.57* 0.43* 191 Exón 1 1 (glicoproteína de aIfa-1 -ácido) 0RM1 Orosomucoide 1832 NT 031830 0.97 0.03 2077 Exón5 1 (glicoproteína de alfa-1 -ácido) 0RM1 Orosomucoide 1833 NT_031830 0.96 0.04 5041 Intrón 1 (glicoproteína de alfa-1 -ácido) *Este polimorfismo de un solo nucleótido no está en equilibrio de H ardy-Weinberg en esta población de pacientes. + Este locus no es polimórfico en estas poblaciones de pacientes, y no se utilizó en el análisis.

Los loci en ABCB1, CD14, IL1A, y OMR1 se interrogaron mediante el ensayo directo del ADN genómico utilizando tecnología de Third Wave Technologies. Debido a la alta homología de secuencias dentro de la familia de genes CYP450, el CYP2D6 se amplificó con reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tres fragmentos, antes de genotipif ¡car con el ensayo Invader® para asegurar la especificidad. Las secuencias de cebadores para cada segmento se enlistan en la Tabla 3, junto con la región del gen extendido por cada conjunto de cebadores. Cada amplicón se generó en una reacción de 25 microlitros conteniendo de 20 a 60 nanogramos de ADN genómico, 0.5 microlitros de dNTPs 10 m M , 2.5 microlitros de Regulador de PCR I 10X con MgCI2 15 m (Applied Biosystems, Foster City, CA), 2.5 microlitros de sulfóxido de dimetilo, 0.5 microlitros de cebador hacia adelante-CYP2D6 20 µ?, 0.5 microlitros de cebador en reversa de CYP2D6 20 µ M , y 1.25 unidades de polimerasa de ADN Taq (Applied Biosystems). Se llevaron a cabo 35 ciclos de amplificación empleando las siguientes condiciones: 94°C, 30 segundos; 65°C, 1 minuto; 72°C, 2 minutos. La amplificación del producto apropiado se confirmó en cinco muestras aleatorias mediante fraccionamiento sobre un gel de agarosa al 1 por ciento conteniendo bromuro de etidio. Los amplicones se diluyeron a 1:10 en TE (pH de 8.0) antes de la genotipificación.

TABLA 3 Cebadores utilizados para amplificar CYP2D6 Se llevó a cabo la reacción en cadena de la polimerasa para el gen CYP3A4 en una reacción de 25 microlitros conteniendo de 15 a 30 nanogramos de ADN genómíco, 0.4 microlitros de dNTPs 10 mM, 2.5 microlitros de Regulador de PCR I 10X con MgCI2 15 m M (Applied Biosystems), 0.75 microlitros de cebador hacia adelante de CYP3A4 20 µ M , 0.75 microlitros de cebador en reversa de CYP3A4 20 µ?, y 0.75 unidades de polimerasa de ADN Taq (Applied Biosystems). Se llevaron a cabo 30 ciclos de amplificación empleando las siguientes condiciones: 94°C, 30 segundos; 58°C, 30 segundos; 72°C, 30 segundos. Con el fin de confirmar que se generara el producto apropiado, se fraccionaron cinco muestras sobre un gel de agarosa al 1 por ciento conteniendo bromuro de etidio, y se visualizó el tamaño del fragmento. Las secuencias de los cebadores son como sigue: CYP3A4Exón10F-(5'-TGGATGGCCCACATTCTCG-3"; SEQ ID NO: 11 ), y CYP3A4Exón10R-(5'-CTTCCTACATAGAGTCAGTG-3'; SEQ ID NO:12). Se pasó una dilución de 1:20 del producto de reacción en cadena de la polimerasa en TE (pH de 8.0) contra el locus PG ID 2325, utilizando una placa biplex de 384 pozos para el ADN amplificado. Se utilizó el análisis de Polimorfismo de Longitud de Fragmento de Restricción (RFLP) para genotipificar tres loci polimórficos en el NR1I2. Las secuencias de NR1I2 se amplificaron primero con reacción en cadena de la polimerasa en reacciones de 25 microlitros conteniendo de 15 a 3Q nanogramos de ADN genómico, 0.4 microlitros de dNTPs 10 mM, 10.5 microlitros de Regulador de PCR I 10X con gCI2 15 mM (Applied Biosystems), 0.50 microlitros de cebador hacia adelante de NR1I2 20 µ , 0.50 microlitros de cebador en reversa de NR1I2 20 µ M , y 0.75 unidades de polimerasa de ADN Taq (Applied Biosystems). Las secuencias para los conjuntos de cebadores utilizados para cada ensayo se enlistan en la Tabla 4. Se llevaron a cabo 35 ciclos de amplificación empleando las siguientes condiciones: 94°C, 30 segundos; 60°C, 30 segundos; 72°C, 30 segundos. Los amplicones se fraccionaron sobre un gel de agarosa al 3 por ciento conteniendo bromuro de etidio.

TABLA 4 Análisis de RFLP de polimorfismos de NR1I2 Las enzimas de restricción utilizadas para el análisis de RFLP de los productos de reacción en cadena de la polimerasa, se enlistan en la Tabla 4, junto con el tamaño de fragmento que produjeron y el nombre de alelo resultante. Todas las enzimas de restricción se adquirieron en New England Biolabs, Beverly, A. Las condiciones de reacción fueron como sigue: (1) se llevaron a cabo digestiones con BMSB1 en una reacción de 20 microlitros, utilizando 2 microlitros del Regulador 3 10X (New England Biolabs), 8 microlitros de ADN amplificado, y 2 unidades de enzima BSMB1. Las mezclas de reacción se incubaron durante 4.5 horas a 55°C; (2) se llevaron a cabo digestiones con Ddel en una reacción de 20 microlitros utilizando 2 microlitros de Regulador 3 10X (New England Biolabs), 8 microlitros de ADN amplificado, y 4 unidades de enzima Ddel. Las reacciones se incubaron durante 17 horas a 37°C; (3) las digestiones con Hphl fueron como las digestiones con Ddel, excepto que se utilizó el Regulador 4 10X (New England Biolabs) en lugar del Regulador 3 10X. El ADN digerido se fraccionó (10 microlitros) sobre un gel de agarosa al 3 por ciento conteniendo bromuro de etidio, y se visualizó el tamaño de banda. Análisis Estadístico. Se emplearon pruebas de análisis de variación (ANOVA) y Exacta de Fisher, para el análisis del efecto del genotipo y la hepatotoxicidad. Todos los análisis estadísticos se llevaron a cabo utilizando el software SAS 8.02. Con el fin de corregir la prueba múltiple, se llevó a cabo el método de corrección de Bonferroni (ver más adelante). Hepatotoxicidad y metabolismo de N-benzoil-estaurosporina. Se examinó la relación entre la presentación de hepatotoxicidad en el estudio clínico y la dosis de N-benzoil-estaurosporina administrada. El porcentaje de sujetos por grupo de dosis que experimentaron hepatotoxicidad es como sigue: 3 por ciento para 50 miligramos/día, 8 por ciento para 100 miligramos/día, y 14 por ciento de aquéllos que tomaron 150 miligramos/día. Aunque la mayoría de los sujetos que experimentaron toxicidad hepática tomaron la dosis más alta de N-benzoil-estaurosporina, no es significativa la asociación entre la dosis de N-benzoil-estaurosporina y la hepatotoxicidad (p = 0.09; Exacta de Fisher). Se hicieron evaluaciones farmacocinéticas en el estudio clínico, pero no se pudieron detectar los dos principales metabolitos de la N-benzoil-estaurosporina en la sangre de la mayoría de los sujetos, debido a que estaban fuertemente enlazados a la proteina en suero glicoproteína de ácido-Ch (AGP). La AGP es una proteína fuertemente glicosilada que se sintetiza primordialmente en el hígado, y funciona como una proteína de respuesta en fase aguda. Hochepied T. y colaboradores, Cytokine Growth Factor Rev. 14:25-34 (2003); Israili ZH y Dayton PG, Drug Met. Rev. 33:161 -235 (2001). Se hizo un análisis para ver si los niveles de AGP se correlacionaban con la presentación de h epat ot oxi c¡ d a d . Se utilizó el máximo nivel de AGP de las citas 3 a 5 para este análisis, y se incluyeron todos los participantes en el estudio clínico, y no solamente los que consintieron al análisis farmacocinético. La máxima concentración promedio de AGP entre aquéllos que experimentaron hepatotoxicidad fue de 109.7 miligramos/ decilitro, la cual fue significativamente más alta que 87.8 miligramos/decilitro, la concentración máxima promedio para aquéllos que no experimentaron hepatotoxicidad (p = 0.06, ANOVA). La AGP es codificada por dos genes, ORM1 y ORM2, que están estrechamente enlazados sobre el cromosoma 9q31-34.1. Webb G. C. y colaboradores, Cytogenet Cell Genet. 47:18-21 (1998). ORM1 es altamente polimórfico (Yuasa I. y colaboradores, Hum. Genet. 99:393-8 (1997)), y se interrogaron tres polimorfismos de un solo nucleótido en 0RM1 en este estudio {locus PG IDs 1831 , 1832, y 1833). No se vio asociación alguna entre los genotipos en los tres loci ORM1 examinados, y los niveles de AGP detectados en el suero. Ver la Tabla 5.

TABLA 5 Los poMmorfismos de un solo nucleotido de ORM1 no se asocian con los máximos niveles de AGP Adicionalmente, los polimorfismos de un solo nucleotido de ORM1 interrogados en este análisis no se asociaron con la hepatotoxicidad. Ver la Tabla 6 más adelante. Con el fin de examinar las posibles asociaciones entre la presentación de hepatotoxicidad y los polimorfismos de un solo nucleotido en CYP2D6, CYP3A4, ABCB1, y NR1I2 más completamente, se examinó cada enzima hepática de una manera independiente. Se analizaron los valores máximos de amino-transferasa de alanina y transaminasa de aspartato registrados en las citas 3 a 5, utilizando ANOVAs. No se encontraron asociaciones entre los polimorfismos de un solo nucleótido en los genes que contribuyen al metabolismo y distribución de la N-benzoil-estaurosporina, y la máxima elevación de amino-transferasa de alanina o bien de transaminasa de aspartato. No se encontró una asociación significativa entre los niveles máximos de amino-transferasa de alanina o de transaminasa de aspartato y los polimorfismos de ORM1.

TABLA 6 Asociación entre la hepatotoxicidad, ALT Max, v AST Max, y 17 polimorfismos de un solo nucleótido localizados en 6 genes diferentes Gen Locus Hepatotoxicidad global ALT Max AST Max PG ID (valor p; Exacta de (valor p; (valor p; Fisher) ANOVA) ANOVA) ABCB1 181 0.59 0.55 0.32 ABCB1 006 1.00 0.63 0.24 ABCB1 1045 0.50 0.35 0.09 CD14 1708 1.00 0.87 0.90 CYP2D6 , 31 1.00 0.99 0.63 CYP2D6 211 1.00 0.85 0.66 CYP2D6 212 0.46 0.16 0.52 CYP2D6 213 0.22 0.17 0.59 CYP3A4 2325 0.72 0.38 0.49 IL1A 279 . 0.23 0.37 0.031 IL1A 302 0.29 0.38 0.029 NR1I2 2641 0.82 0.56 0.21 NR1I2 2642 0.84 0.28 0.86 NR1I2 2643 1.00 0.57 0.73 0RM1 1831 0.61 0.72 0.76 0RM1 1832 0.24 0.80 0.82 0RM1 1833 1.00 0.96 0.64 En resumen, los datos de las Tablas 5 y 6 no proporcionaron evidencia de que la hepatotoxicidad observada en el estudio clínico fuera el resultado de una exposición variable a la N - b e nz o i I -es t a u r o s p o r i n a . Sin embargo, la N-benzoil-estaurosporina es metabolizada por CYP3A4 y CYP2D6, y es un sustrato de la bomba de g I i co p rot e í n a - , codificada por ABCB1. CYP3A4 no es muy polimórfico, y las variantes genéticas raramente cuentan por las diferencias que se ven en la función de la proteína. Spurdie A. B. y colaboradores, Pharmacogenetics 12:355-66 (julio de 2002), y análisis interno. También, la transcripción de CYP3A4 es regulada por el receptor de pregnano X, PXR (Goodwin B. y colaboradores, Annu. Rev. Pharmacol . Toxlcol. 42:1-23 (2002)), que es codificado por un gen polimórfico denominado NR1I2. De conformidad con lo anterior, se examinaron los polimorfismos en los siguientes genes que contribuyen al metabolismo de la N-benzoil- estaurosporina: CYP2D6 (locus PG IDs 31, 211, 212, 213); CYP3A4 (¡ocus PG ID 2325); NR1I2 (locus PG IDs 2641, 2642, 2643); y ABCB1 (¡ocus PG IDs 181 , 1006, 1045). No se encontró que la presentación de hepatotoxicidad en el estudio clínico estuviera asociada con cualquiera de los polimorfismos interrogados en estos cuatro genes. Hepatotoxicidad y genes asociados con los mecanismos idiosincráticos de lesión hepática. La hepatotoxicidad observada durante las etapas clínicas de desarrollo del fármaco con frecuencia está asociada con los niveles de exposición al fármaco. Sin embargo, algunos sujetos pueden experimentar elevaciones en las enzimas hepáticas debido a algo acerca de su actividad intrahepática (niveles de citoquinas o enzimas que neutralizan los radicales libres, por ejemplo) que promueve toxicidad del compuesto. Estos mecanismos de toxicidad hepática son referidos como "idiosincráticos". No es muy probable el descubrimiento de una asociación entre los polimorfismos genéticos y la hepatotoxicidad que se presenta por los mecanismos idiosincráticos, debido a que la hepatotoxicidad es un evento relativamente raro que puede ser influenciado por múltiples sendas de señalización. Hepatotoxicidad y genes asociados con la respuesta inflamatoria. Se examinaron en este estudio los polimorfismos en dos genes que podrían contribuir a las respuestas en fase aguda en el hígado, CD14 e ÍL1A. CD14 regula la liberación de las citoquinas inflamatorias desde las células de Kuppfer (Jarvelainen H. A. y colaboradores, Hepatology 33:1148-53 (2001 )), e IL1A es un mediador importante de respuestas a los agentes que dañan el tejido. Ramadori G . y Christ B., Semin. Liver Dis. 19:141-55 (1999). Se interrogaron dos loci polimórficos en IL1A en este estudio {locus PG IDs 279 y 302), y se investigaron tres loci en CD14 (locus PG IDs 2641, 2642, y 2643). No se encontraron asociaciones entre los loci que estudiamos, y la hepatotoxicidad global en el estudio clínico. Ver la Tabla 5. En seguida, se analizaron los polimorfismos de un solo nucleótido en IL1A y CD14, por su posible asociación con las elevaciones en cada enzima hepática independientemente. El valor máximo de transaminasa de aspartato o amino-transferasa de alanina en suero registrado entre las citas 3 y 5 estuvo asociado con los genotipos en los loci de interés en IL1A y CD14, utilizando un ANOVA. No se encontraron asociaciones entre la amino-transferasa de alanina y los polimorfismos de un solo nucleótido en IL1A ó CD14. Sin embargo, ambos polimorfismos de un solo nucleótido de IL1A, locus PG IDs 279 y 302, estuvieron asociados con el valor máximo de transaminasa de aspartato en suero registrado en las citas 3, 4, ó 5 (p = 0.031 y 0.029, respectivamente). Se ha reportado que el locus PG ID 279, una transición de C?T en el promotor de IL1A (posición 549 en el número de acceso GenBank X03833) está en desequilibrio de enlace con el locus PG ID 302. Jouvene P. y colaboradores, Eur. Cytokine Netw. 10:33-6 (1999). Nuestros descubrimientos apoyan un fuerte enlace entre estos dos loci (99.99 por ciento). El locus PG ID 302 es una cadena de bases G?T en el exón 5 (posición 6282 en el número de acceso GenBank X03833) que da como resultado una sustitución de aminoácido de alanina hasta ser i na. Para cada uno de estos polimorfismos de un solo nucleótido, el genotipo TT es raro; solamente dos individuos son TT para el locus PG ID 279 y 302. Por esta razón, analizamos a los individuos homoc i góticos TT junto con los heterocigóticos GT (locus PG ID 302) ó CT (locus PG ID 279). Por consiguiente, para el locus PG ID 279, se compararon los sujetos con un genotipo CC, con los sujetos con un T en ese locus (ya sea CT ó TT). Para el locus PG ID 279, el valor máximo promedio de transaminasa de aspartato en suero para los individuos CC fue de 31.1 Unidades/litro, mientras que los individuos T (CT y TT) tuvieron un valor máximo promedio de transaminasa de aspartato en suero significativamente más bajo de 23.1 Unidades/litro (p = 0.0089, ANOVA). De la misma manera, para el locus PG ID 302, se compararon los sujetos que eran GG con los T (los sujetos que eran GT ó TT). Cuando se agruparon los datos empleando este planteamiento, se vio una asociación mucho más fuerte entre el genotipo en cada locus y la presentación de hepatotoxicidad . Para el locus PG ID 302, los individuos GG tuvieron un nivel máximo promedio de transaminasa de aspartato en suero de 36.6 Unidades/ litro, que fue significativamente más alto que 22.9 Unidades/ litro, el nivel máximo promedio de transaminasa de aspartato en suero para los individuos T (CT y TT) (p = 0.0097, ANOVA). Las gráficas de la Figura 1 y de la Figura 2 muestran que los sujetos con los valores máximos más altos de transaminasa de aspartato en suero, mientras tomaban N-benzoil-estaurosporina, eran CC en el locus PG ID 279, y GG en el locus PG ID 302. Debido que se probaron múltiples polimorfismos de un solo nucleótido para determinar su asociación con la hepatotoxicidad en el estudio clínico, se aplicó un factor de corrección a los resultados. El método de corrección de Bonferroni requiere que se ajusten los valores p por un factor de 17 (el número de polimorfismos de un solo nucleótido polímórficos interrogados en este estudio). Bonferroni = 0.05 = 0.05 = 0.0029, ? 17 en donde ? = PCK412_número_de_pruebas. Utilizando este factor de corrección, ningún polimorfismo de un solo nucleótido con una asociación con p >_0.0029 es significativo. Las asociaciones entre los polimorfismos de I L1 A y los niveles de transaminasa de aspartato en suero tuvieron valores p de 0.0089 y 0.0097. En resumen, los sujetos que son CC en el locus PG 279, y GG en el ¡ocus PG 302, dentro del gen IL1A, tienen más probabilidades de experimentar niveles elevados de transaminasa de aspartato en suero después de tomar N-benzoil-estaurosporina. Aunque el máximo promedio de transaminasa de aspartato para los sujetos CC no estuvo sobre el límite superior del normal, una gráfica de los datos demuestra que todos salvo uno de los sujetos que tenían niveles de transaminasa de aspartato en suero sobre el límite superior del normal, eran CC para el locus PG ID 279 (Figura 1), y GG para el ¡ocus PG ID 302 (Figura 2). La toxicidad hepática inducida por fármaco con frecuencia se caracteriza por inflamación. Jaeschke H. y colaboradores, Toxicol Sci. 65: 166-76 (2002). Se sabe que la familia de proteínas de interleucina 1 tienen múltiples actividades - biológicas y son reguladores clave de la respuesta a la infección y a la lesión. Como otras citoquinas pro-inflamatorias, IL1A induce la actividad de NF- B, aumentando de esta manera la transcripción de los genes inducibles por citoquina. Los efectos de IL1A son mediados por la inducción de otras citoquinas, incluyendo el factor estimulante de colonias de g r a n u I o ci t o s , el factor de necrosis tumoral alfa (TNF), interleucina 6, interleucina 8, y el factor de crecimiento derivado de plaquetas. Paul WE, Fundamental immunology, Cuarta Edición (Lippingcott-Raven Publishers, Filadelfia, PA, 1999). Notoriamente en los modelos de ratón, se ha demostrado que IL1A actúa sinérgicamente con el factor de necrosis tumoral para inducir la lesión hepática. Nagakawa J.y colaboradores, Immunopharmacol Immunotoxicol 13:485-98 (1991 ). En adición a estas asociadas con la hepatotoxicidad , la familia de proteínas de interleucina 1 han sido implicadas en la inducción de la secreción de insulina y el estímulo de apoptosis en las células ß pancreáticas. Paul WE, Fundamental Immunology, Cuarta Edición (Lippingcott-Raven Publishers, Filadelfia, PA, 1999). Esto es relevante para este estudio, debido a que los participantes en el estudio clínico tenían diabetes ya sea tipo I ó bien tipo II. La producción de IL1 por las células inflamatorias locales durante el proceso autoinmune en la diabetes mellitus dependiente de insulina (diabetes tipo I) puede contribuir a la destrucción de las células ß pancreáticas. Mandrup-Poulsen T. y colaboradores, Cytokine 5:185-81 (1993). Se ha demostrado que los miembros de la familia de interleucina 1 inducen la producción de óxido nítrico (NO) por parte de los islotes pancreáticos, y los reportes en la literatura apoyan un papel para el óxido nítrico en el desarrollo de diabetes. Además, el tratamiento de la línea tipo células-ß pancreáticas RIN-5AH con 1L1A dio como resultado apoptosis y necrosis dentro de 4 horas después del tratamiento. Vassiliadis S. y colaboradores, Mediators Inflamm. 8:85-91 (1999). Es interesante que se demostró que IL1A induce la expresión de la quinasa C de proteína en las células R1N-5AH por el 30 por ciento. Por consiguiente, en adición a tener influencia sobre la hepatotoxicidad, IL1 A puede tener influencia sobre la eficacia de la N-benzoil-estaurosporina en los pacientes diabéticos. Todas las referencias citadas en la presente se incorporan a la presente como referencia en su totalidad y para todos los propósitos hasta el mismo grado como si cada publicación o patente o solicitud de patente individual fuera específica o individualmente indicada como incorporada por referencia en su totalidad para todos los propósitos. En adición, todos los números de acceso Genbank, números Unigene Cluster, y números de acceso de proteínas citados en la presente, se incorporan a la presente como referencia en su totalidad y para todos los propósitos, hasta el mismo grado como si cada uno de estos números fuera específica e individualmente indicado como incorporado por referencia en su totalidad para todos los propósitos. La presente invención no debe limitarse en términos de las modalidades particulares descritas en esta solicitud, las cuales pretenden ser solamente ilustraciones de los aspectos individuales de la invención. Se pueden hacer muchas modificaciones y variaciones de esta invención sin apartarse de su espíritu y alcance, como será aparente para los expertos en la materia. Los métodos y aparatos f uncionalmente equivalentes dentro del alcance de la invención, en adición a aquéllos enumerados en la presente, serán aparentes para los expertos en este campo, a partir de la descripción anterior y de los dibujos acompañantes. Se pretende que estas modificaciones y variaciones caigan dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. La presente invención se debe limitar solamente por los términos de las reivindicaciones adjuntas, junto con el alcance completo de los equivalentes a los que tienen derecho tales reivindicaciones.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. El uso de N-benzoil-estaurosporina en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de retinopatía diabética con hepatotoxicidad reducida en una población de pacientes seleccionada, en donde la población de pacientes se selecciona con base en el genotipo de los pacientes en un locus genético IL1A que predice hepatotoxicidad .

2. Un método para predecir hepatotoxicidad en un sujeto, el cual comprende los pasos de: (a) obtener el genotipo de un sujeto en un locus genético IL1A que predice hepatotoxicidad, en seguida de la administración de un derivado de estaurosporina; y (b) determinar si el sujeto está en riesgo de hepatotoxicidad en seguida de la administración del derivado de estaurosporina.

3. El método de la reivindicación 2, en donde el locus genético IL1A es el locus PG ID 279.

4. El método de la reivindicación 3, en donde un genotipo CC en el locus PG ID 279 predice un alto riesgo de hepatotoxicidad.

5. El método de la reivindicación 3, en donde un genotipo CT ó TT en el locus PG ID 279 predice un riesgo bajo o promedio de hepatotoxicidad .

6. El método de la reivindicación 2, en donde el locus genético IL1A es el locus PG ID 302.

7. El método de la reivindicación 6, en donde un genotipo GG en el locus PG ID 302 predice un alto riesgo de hepatotoxicidad.

8. El método de la reivindicación 6, en donde un genotipo GT ó TT en el locus PG ID 302 predice un riesgo bajo o promedio de hepatotoxicidad.

9. Un método mejorado para el tratamiento de una condición diabética con un derivado de estaurosporina, el cual comprende los pasos de: (a) obtener el genotipo de un sujeto que se vaya a tratar en un locus genético I L1 A que prediga hepatotoxicidad en seguida de la administración del derivado de estaurosporina; (b) administrar el derivado de estaurosporina al sujeto.

10. Un método para elegir un sujeto para incluirse en un estudio clínico para determinar la eficacia del tratamiento con un derivado de estaurosporina, el cual comprende los pasos de: (a) obtener el genotipo de un sujeto en un locus genético IL1A que prediga la hepatotoxicidad en seguida de la administración de un derivado de estaurosporina; y (b) luego: (i) incluir a) sujeto en el estudio si el genotipo indica un riesgo bajo o promedio de hepatotoxicidad; o (ii) excluir al sujeto del estudio si el genotipo indica un riesgo alto de hepatotoxicidad.

11. Un estuche para utilizarse en la predicción de hepatotoxicidad, el cual comprende: (a) un reactivo para detectar un polimorfismo genético en el gen IL1A que sea un biomarcador de la hepatotoxicidad mediada por el derivado de estaurosporina; (b) un recipiente para el reactivo; y (c) un producto escrito sobre o dentro del recipiente, que describa el uso del biomarcador para predecir la hepatotoxicidad mediada por el derivado de estaurosporina en los sujetos.

12. El estuche de la reivindicación 11, en donde el locus genético IL1A es el locus PG ID 279.

13. El estuche de la reivindicación 11 , en donde el locus genético IL1A es el locus PG ID 302.

14. El estuche de la reivindicación 11, en donde el reactivo es un conjunto de pares de cebadores que se h i b ri d a n a un polinucleótido sobre el lado del polimorfismo genético, y que definen una región de nucleótidos que se extiende en el polimorfismo genético.