MXPA06003504A - Metodo de fermentacion para la preparacion de testolactona por especies de fusarium. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a un metodo microbiano para la deshidrogenacion y oxidacion simultaneas de 4-androsten-3,17-diona para producir 17a-oxo-D-homo-1,4-androstadien-3,17-diona, con rendimiento elevado y concentraciones elevadas de sustrato mediante medios de filamentos por especies de Fusarium.

Description

MÉTODO DE FERMENTACIÓN PARA LA PREPARACIÓN DE TESTOLACTONA POR ESPECIES DE FUSARIUM ANTECEDENTES DEL INVENTO Campo del invento El presente invento se refiere a un método microbiano para la deshidrogenación y oxidación simultáneas de 4-androsten-3,17-diona, de Fórmula I, para producir 17ot-oxo-D-homo-.1 ,4-androstadien-3,17-diona, de Fórmula II, con elevado rendimiento.

Antecedentes del invento La testolactona es un agente antineoplásico usado para tratar el cáncer de mama, Las Patentes de EE.UU. números 2.744.120 y 2.823.171 se refieren a procedimientos microbianos para la conversión de una diversidad de sustratos en testolactona, a la que también se hace referencia como 1-deshidrotestolactona y 17a-oxo-D-homo-1 ,4-androstadien-3, 7-diona, usando especies de Cylindrocarpon y Fusarium. Cuando la especie de Fusarium se usa con progesterona como sustrato, se producen muchos productos, incluyendo testolactona y 11a-hidroxi-testolactona. En los ejemplos se discuten reacciones en que la concentración de sustrato es 0,5 g/l o inferior. La Patente de Gran Bretaña n° 1.220.829 se refiere al uso de especies de Fusarium para la preparación microbiana de testolactona utilizando 16-deshidropregnenolona y acetato de 16-deshidropregnenolona como sustratos. En los ejemplos de esta patente se usan concentraciones de sustrato de 0,5 g/l o inferiores. H. Socic et al., Z. Anal. Chem. 1.968, 243, 291, se refieren a la separación e identificación de esteroides por oxidación fermentativa de progesterona usando diversas especies de Fusarium. Se identificaron múltiples productos. A pesar de las comunicaciones anteriores, aún queda la necesidad de un método mejorado para la preparación de testolactona.

DESCRIPCIÓN DEL INVENTO La testolactona (17 -oxo-D-homo-1,4-androstadien-3,17-diona) es un agente antineoplásico usado para tratar ciertos casos de cáncer de mama en hembras. Los revelados métodos de transformación microbiana aquí descritos se utilizan para convertir el esferoide comercial de bajo coste 4- androsten-3,17-diona (I) en 17a-oxo-D-homo-1 ,4-androstadien-3,17-diona (II) con rendimientos superiores al 85 % y usando concentraciones de sustrato tan elevadas como 80 g/litro. En el procedimiento del invento puede usarse cualquier hongo filamentoso del género Fusarium capaz de la deshidrogenaron y la oxidación simultáneas de 4-androsten-3,17-diona (I) para producir 17a-oxo-D-homo-1 ,4- androstadien-3, 17-diona (II) con rendimiento elevado. Los métodos descritos en los ejemplos pueden ser usados para determinar la idoneidad del hongo filamentoso del género Fusarium. Preferiblemente, se usa Fusarium solani. Más preferiblemente, se usa Fusarium solani ATCC 46829. Las enzimas fúngicas pueden ser utilizadas en forma de un cultivo en crecimiento activo o de un concentrado de células completas. La conversión se lleva a cabo en un medio para bioconversión adecuado. Si la conversión se lleva a cabo usando un concentrado de células completas, el medio para bioconversión es similar a un medio de cultivo, quedando suprimidas las fuentes de carbono y nitrógeno. El esteroide que se va a convertir es añadido del mismo modo que se añadiría a un cultivo sumergido. Preferiblemente, el hongo se desarrolla en cultivo sumergido, en el que el medio de cultivo sirve como medio para bioconversión, bajo condiciones aerobias usando cualquier procedimiento reconocido en la técnica, y la transformación se lleva a cabo in situ. Más preferiblemente, el hongo deseado se desarrolla en cultivo sumergido bajo unas condiciones aerobias como las expuestas más adelante y, más específicamente, como las expuestas en los EJEMPLOS 1 y 2 usando los ingredientes especificados u otras fuentes de carbono y nitrógeno adecuadas, como bien conocen los expertos en la técnica. Ejemplos no restrictivos de fuentes de carbono adecuadas incluyen monosacáridos, disacáridos, trisacáridos, y alcoholes de azúcar tales como glicerol y glucitol. Ejemplos no restrictivos de fuentes de nitrógeno orgánico adecuadas incluyen caseína, extracto de germen de maíz, extracto de carne, harina de pescado, y producto de hidrólisis de proteínas de soja. Ejemplos no restrictivos de fuentes de nitrógeno inorgánico adecuadas incluyen nitrato potásico, cloruro amónico, nitrito sódico y similares. Generalmente, se usa un procedimiento de gérmenes vegetativos primarios y secundarios en la preparación para la transformación fúngica de 4-androsten-3,17-diona (I) en 17a-oxo-D-homo-1 ,4-androstadien-3,17-diona . (II). Alternativamente, puede utilizarse directamente un germen vegetativo primario para su inoculación a los medios para bioconversión. Los cultivos de gérmenes vegetativos primarios pueden ser incubados durante un periodo de 24 a 96 horas (preferiblemente 48 horas) a una temperatura de entre 20° y 37° (preferiblemente 28°) y en un pH inicial de entre 3,0 y 8,0. El medio para gérmenes vegetativos secundarios es inoculado con el cultivo de gérmenes vegetativos primarios en una concentración de 0,006 % a 0,1 % [volumen/volumen (v/v)], pero típicamente de 0,012 % (v/v), y es incubado durante un periodo de 36 a 72 horas (preferiblemente 48-60 horas) a una temperatura de entre 20° y 37° (preferiblemente 28°). El pH del medio para gérmenes secundarios puede ser entre 3,0 y 8,0, pero es preferiblemente entre 3,0 y 5,0. El medio para bioconversión, que puede ser igual o similar al medio para gérmenes vegetativos secundarios, es inoculado con el cultivo de gérmenes vegetativos secundarios en una concentración de 1 % a 10 % (v/v) (preferiblemente de 3 % a 5 %), Las condiciones de la fermentación para bioconversión pueden ser iguales a las usadas para el cultivo del cultivo de gérmenes vegetativos secundarios. Después de un periodo inicial de incubación de cero a 72 horas (preferiblemente de 12 a 24 horas), se añade 4-androsten-3,17-diona (I), preferiblemente micronizada, al cultivo de bioconversión. La 4-androsten-3,17-diona (I) micronizada puede ser añadida en forma de polvo seco o de suspensión acuosa, sea como una sola adición, una serie de adiciones o una alimentación continua. La 4-androsten-3,17-diona (I) micronizada puede ser usada en concentraciones de entre 1 g/l y 80 g/l, entre 10 g/l y 80 g/l, entre 20 g/l y 80 g/l, y entre 40 g/l y 80 g/l. También pueden usarse otros intervalos de concentración, tales como entre 10 g/l y 20 g/l, entre 20 g/l y 40 g/l, y entre 40 g/l y 60 g/l. Un intervalo de concentración preferido para la 4-androsten-3,17-diona (I) micronizada es entre 50 g/l y 70 g/l. Se deja que la bioconversión de 4-androsten-3,17-diona (I) para formar 17cc-oxo-D-homo-1 ,4-androstadien-3,17-diona (II) tenga lugar durante un periodo de entre 1 y 7 días. La velocidad y el grado de conversión de 4-androsten-3,17-diona (I) en 17a-oxo-D-homo-1 ,4-androstadien-3,17-diona (II) pueden ser muy mejorados: (i) cultivando el hongo seleccionado, y llevando la bioconversión a cabo, en presencia de un detergente; el detergente puede ser seleccionado del grupo que consiste en detergentes no iónicos, pero preferiblemente de los subgrupos que consisten en alquilfenoles etoxilados y ésteres de polioxietilen- sorbitán, más preferiblemente, se utiliza octilfenoxi-polietoxi-etanol; (ii) cultivando el hongo seleccionado, y llevando la bioconversión a cabo, en presencia de un aceite natural; ejemplos no restrictivos de aceites naturales incluyen aceite de ricino, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, aceite de manteca de cerdo, aceite de linaza, aceite de oliva, aceite de cacahuete, aceite de semilla de colza, aceite de semilla de cártamo, aceite de soja, aceite de semilla de girasol, sebo de vaca, aceite de palma, aceite de hígado de bacalao, aceite de ballena, aceite de tiburón, aceite de patas de ganado vacuno y aceite de germen de trigo; preferiblemente, se usa aceite de soja; y (iii) usando una combinación de las metodologías identificadas en (i) y (ii). Una vez que se ha completado la conversión de 4-androsten- 3,17-diona (I) en 17a-oxo-D-homo-1,4-androstadien-3,17-diona (II), la 17a-oxo-D-homo-1,4-androstadien-3,17-diona (II) puede ser aislada usando cualquiera de los diversos procedimientos reconocidos en la técnica. Preferiblemente, los sólidos de cerveza separados por filtración o centrifugación son sometidos a extracción usando un disolvente orgánico, tal como metanol, acetona, acetato de butilo o cloruro de metileno, y la 17a-oxo-D-homo-1 ,4-androstadien-3,17-diona (II) es aislada por cristalización. Los disolventes para cristalización incluyen un disolvente seleccionado de, pero no limitado a, el grupo que consiste en agua, metanol, acetona, acetato de butilo, cloruro de metileno y combinaciones de los mismos. El disolvente para extracción preferido es cloruro de metileno y el disolvente para cristalización preferido es acetato de n-butilo.

DEFINICIONES Las definiciones y explicaciones que vienen a continuación son para los términos y expresiones usados a lo largo de este documento completo, incluyendo tanto la memoria descriptiva como las reivindicaciones. Todas las temperaturas son en grados Celsius; rpm se refiere a revoluciones por minuto; TLC (del inglés, thin-layer chromatography) se refiere a cromatografía en capa fina; . HPLC (del inglés, high-pressure liquid chromatography) se refiere a cromatografía a alta presión en fase líquida; DO (del inglés, dissolved oxigen) se refiere a oxígeno disuelto; RO (del inglés, reverse osmosis) se refiere a osmosis inversa; SLM (del inglés, standard jiters per minute) se refiere a litros estándares por minuto; WM se refiere a volumen por minuto; y OUR (del inglés, oxigen uptake rate) se refiere a la velocidad de consumo de oxígeno. Cuando se usan mezclas de disolventes, las relaciones de los disolventes utilizados son en volumen/volumen (v/v). Cuando se usa la solubilidad de un sólido en un disolvente, la relación del sólido con respecto al disolvente es en peso/volumen (p/v).

EJEMPLOS Sin entrar en más detalles, se piensa que un experto en la técnica, usando las descripciones precedentes, puede llevar a la práctica el presente invento en su totalidad. Mediante los ejemplos detallados siguientes se describe cómo preparar los diversos compuestos y/o llevar a cabo los diversos procedimientos del invento, ejemplos que han de ser considerados meramente ilustrativos y de ningún modo limitaciones de la descripción precedente. Los expertos en la técnica reconocerán en seguida variaciones apropiadas de los procedimientos, tanto en lo relativo a reaccionantes como en lo relativo a técnicas y condiciones de reacción.

Ejemplo 1 Bioconversión de 4-androsten-3,17-diona (I) en 17 -oxo-D-homo-1 ,4-androstadien-3,17-diona (II) usando un cultivo sumergido de Fusarium solani ATCC46829 a escala de fermentación de 10 I. (A) Fase de gérmenes primarios Células vegetativas congeladas de Fusarium solani ATCC46829 fueron descongeladas, transferidas a placas de patata-dextrosa-agar (PDA) e incubadas a 28° durante 72 horas. Se usaron tacos individuales de micelios (6- 7 mm de diámetro) para su inoculación a matraces para sacudimiento flameados y siliconados, de 500 mi de capacidad, que contenían 100 mi de medio para gérmenes primarios. El medio para gérmenes primarios consiste en (por litro de agua RO): dextrina, 50 g; harina de soja, 35 g; cerelosa, 5 g; cloruro de cobalto hexahidratado, 2 mg; agente antiespumante de silicona (SAG 471), 0,5 mi; preesterilización en un pH de 7,0-7,2, ajustado con hidróxido sódico (2 N). Se incubó Fusaríum solani ATCC46829 durante 48 horas a 28° usando un incubador-sacudidor con ambiente controlado, ajustado a 270 rpm (recorrido orbital de 50,8 mm). (B) Fase de gérmenes secundarios Se realizaron inoculaciones a fermentaciones para gérmenes secundarios de diez litros, usando 1,2 mi del cultivo de gérmenes primarios vegetativos [índice de inoculación de 0,012 % (v/v)]. El medio para gérmenes secundarios contiene (por litro de agua RO): cerelosa, 60 g; harina de soja, 25 g; aceite de soja, 5 mi; heptahidrato de magnesio, 1 g; dihidrogenofosfato de potasio, 0,74 g; octilfenoxi-polietoxi-etanol, 0,25 mi; agente antiespumante de silicona (SAG 471), 0,5 mi; preesterilización en un pH de 3,95-4,00, ajustado con ácido sulfúrico concentrado. Los fermentadores, que contenían medio para gérmenes secundarios, fueron esterilizados durante 20 minutos a 121° usando vapor de agua tanto de camisa exterior como de inyección. La velocidad de agitación durante la esterilización fue 200 rpm. Después de la esterilización, el pH del medio fue ajustado a 4,0 usando ácido sulfúrico estéril (5 %). Se incubó Fusaríum so/an/' ATCC46829 a 28° usando los parámetros iniciales siguientes: agitación: 100 rpm; contrapresión = 135,5 kPa; caudal de aire = 2,5 SLM (0,25 WM); punto establecido de DO bajo: 50 %; control de pH: ninguno. Cuando el DO cae por vez primera a 50 %, se aumenta el caudal de aire a 5 SLM (0,5 WM). Cuando el cultivo alcanza de nuevo un DO bajo, se mantiene un DO de 50 % usando control de la agitación. Los cultivos de gérmenes secundarios fue recolectados aproximadamente 52 horas después de la inoculación, cuando la OUR era entre 15 y 25 milimoles/l/h. (C) Bioconversión de esteroides Se realizaron inoculaciones a fermentaciones para bioconversión de esteroides de diez litros, usando 300 mi del cultivo de gérmenes secundarios vegetativos [índice de inoculación de 3 % (v/v)]. El medio para bioconversión de esteroides era esencialmente igual al medio para gérmenes secundarios con la excepción de que la cantidad de octilfenoxi-polietoxi-etanol estaba aumentada de 0,25 ml/l a 2,0 m\l\. Las condiciones de esterilización y el ajuste del pH fueron como se describieron para el medio para gérmenes secundarios. Se incubó Fusaríum solani ATCC46829 a 28° usando esencialmente los mismos parámetros iniciales que los usados para el cultivo de gérmenes secundarios con la excepción de que la agitación inicial fue a 200 rpm. 15 horas después de la inoculación, se añadieron 200 g de 4-androsten-3, 7-diona (I) micronizada, suspendida en un volumen mínimo de octilfenoxi-polietoxi-etanol al 0,2 %, a la fermentación de 10 I. Los cultivos de bioconversión fueron analizados diariamente en cuanto a 17 -oxo-D-homo-1,4-androstadien-3,17-diona (II) usando HPLC. Se sometió un mililitro de cerveza completa a extracción con 10 mi de acetonitrilo tibio. Se separaron las células de la mezcla de fase acuosa-acetonitrilo por centrifugación (3.000 x g durante 10 minutos) y se inyectaron 5 µ? del extracto en una columna para HPLC. Las condiciones de la HPLC eran las siguientes: cromatógrafo Spectra-Physics provisto de una columna de fase inversa C18 (150 x 4,6 mm); temperatura de la columna: 30°; fase móvil: acetonitrilo/ácido fosfórico al 0,25 % (45/55, v/v); caudal = 1 ml/min; detección: 240 nm; tiempo de análisis = 12 minutos. La bioconversión de 4-androsten-3,17-diona (I) en 17a-oxo-D- homo-1 ,4-androstadien-3,17-diona (II) se completó en aproximadamente 2 días. (D) Procedimiento de aislamiento Se centrifugó la cerveza completa en el momento de la cosecha, procedente de una fermentación de 10 I, y se recuperaron los abundantes sólidos por centrifugación. Los abundantes sólidos fueron sometidos a extracción con 10 litros de cloruro de metileno. El abundante extracto orgánico se separó de los sólidos por sedimentación. El extracto en cloruro de metileno fue filtrado a través de diatomita y fue concentrado hasta 500 mi por destilación. Se añadieron 500 mi de acetato de n-butilo. Esta mezcla fue concentrada hasta 500 mi y fue enfriada a 4°C hasta una completa cristalización del producto. Los cristales fueron recuperados por filtración, lavados con acetato de butilo frío para eliminar el color, y secados para obtener 165 g de 17a-oxo-D-homo-1 ,4-androstadien-3,17-diona (II) cristalina.

La eliminación de impurezas, cuando fue necesario, se llevó a cabo por disolución en cloruro de metileno y sustitución con acetato de n-butilo para recristalizar el producto (véase el EJEMPLO 2).

Ejemplo 2 La bioconversión de 4-androsten-3,17-diona (I) en 17a-oxo-D- homo-1 ,4-androstadien-3,17-diona (|l) fue llevada a cabo utilizando un cultivo sumergido de Fusarium solani ATCC46829 a escala de fermentación de 100 mi. (A) Fase de gérmenes primarios Los cultivos de gérmenes primarios se prepararon del modo descrito en el EJEMPLO 1. (B) Fase de gérmenes sécundarios Se realizó una inoculación a cien mililitros de medio para gérmenes secundarios, en un matraz para sacudimiento flameado y siliconado de 500 mi de capacidad, usando una sola gota del cultivo de gérmenes primarios vegetativos. El medio para gérmenes secundarios contiene (por litro de agua RO): cerelosa: 60 g; harina de soja: 25 g; aceite de soja: 5 mi; heptahidrato de magnesio: 1 g; dihidrogenofosfato de potasio: 0,74 g; octilfenoxi-polietoxi-etanol: 0,25 mi; agente antiespumante de silicona (SAG 471): 0,5 mi; preesterilización en un pH de 3,95-4,00, ajustado con ácido sulfúrico concentrado. Los matraces para sacudimiento, que contenían medio para gérmenes secundarios, fueron esterilizados durante 30 minutos a 121 ° usando un autoclave. Se incubó Fusaríum solani ATCC46829 durante 48 horas a 28° usando un incubador-sacudidor con ambiente controlado, ajustado a 270 rpm (recorrido orbital de 50,8 mm). (C) Bioconversión de esteroides Se realizó una inoculación a cien mililitros de medio para bioconversión de esteroides, en un matraz para sacudimiento flameado y siliconado de 500 mi de capacidad, usando 3 mi del cultivo de gérmenes secundarios vegetativos [índice de inoculación de 3 % (v/v)]. El medio para bioconversión de esteroides era esencialmente igual al medio para gérmenes secundarios con la excepción de que la cantidad de octilfenoxi-polietoxi-etanol estaba aumentada de 0,25 ml/l a 2,5 ml/l. 17 horas después de la inoculación, se añadieron 6 g de 4-androsten-3,17-diona (I) micronizada, suspendida en un volumen mínimo de octilfenoxi-polietoxi-etanol al 0,2 %, a la fermentación de 100 mi. 24 horas y 48 horas después de la inoculación, se añadieron 2,5 g de cerelosa adicional por 00 mi de cultivo. Los cultivos de bioconversión fueron analizados diariamente en cuanto a 17a-oxo-D-homo-1,4-androstadien-3,17-diona (II) usando HPLC del modo descrito en el EJEMPLO 1, con la excepción de que un mililitro de cerveza completa fue sometido a extracción con 30 mi de acetonitrilo tibio. La bioconversión de 4-androsten-3, 7-diona (I) en 17a-oxo-D-homo-1 ,4-androstadien-3,17-diona (II) se completó en aproximadamente 7 días. (D) Procedimiento de aislamiento Se centrifugó la cerveza completa en el momento de la cosecha, procedente de dos fermentaciones de 100 mi, y se recuperaron los abundantes sólidos por centrifugación. Los sólidos fueron sometidos a extracción usando un litro de cloruro de metileno. Después de la sedimentación, los sólidos de la cerveza fueron sometidos de nuevo a extracción con otro litro de cloruro de metileno. Los sólidos fueron desechados, y los extractos en cloruro de metileno fueron lavados con agua, reunidos, limpiados, y concentrados hasta 50 mi por destilación. Después de la adición de 100 mi de acetato de n-butilo, la mezcla fue concentrada hasta 50 mi por destilación y fue enfriada a 4°C. Los cristales obtenidos fueron recuperados por filtración, lavados con acetato de n-butilo para eliminar el color, y secados para obtener 10,9 g de 17a-oxo-D-homo-1 ,4-androstadien-3,17-diona (II) cristalina. Como en el EJEMPLO 1 , la eliminación de impurezas (para alcanzar una pureza > 99 %) puede ser llevada a cabo mediante recristalización. Se disolvieron los 10,9 g en 60 mi de cloruro de metileno y luego se añadieron 100 mi de acetato de n-butilo. Esta mezcla fue concentrada hasta 50 mi y fue enfriada a 4°C. Los cristales obtenidos fueron recuperados por filtración, lavados con 15 mi de acetato de n-butilo, y secados para obtener 10,4 g de 17a-oxo-D-homo-1 ,4-androstadien-3,17-diona (II) cristalina y purificada.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1.- Un método para la transformación de 4-androsten-3,17-diona, de Fórmula I, Fórmula I en 17a-oxo-D-homo-1 ,4-androstadien-3,17-diona, de Fórmula II, Fórmula II que comprende poner un compuesto de Fórmula I, en un medio para bioconversión, en contacto con una especie filamentosa de Fusaríum capaz de llevar a cabo la transformación.

2. - Un método para producir 17a-oxo-D-homo-1 ,4-androstadien-3,17-diona de acuerdo con la Reivindicación 1 , en el que la especie de Fusaríum es Fusaríum solani.

3. - Un método para producir 17a-oxo-D-homo-1 ,4-androstad¡en-3,17-diona de acuerdo con la Reivindicación 1 , en el que la especie de Fusarium es la cepa ATCC 46829 de Fusarium solani.

4. - Un método para producir 17a-oxo-D-homo- ,4-androstadien- 3,17-diona de acuerdo con la Reivindicación 3, en el que la concentración de sustrato es entre 1 g/l y 80 g/l.

5. - Un método para producir 17a-oxo-D-homo-1,4-androstadien- 3,17-diona de acuerdo con la Reivindicación 3, en el que la concentración de sustrato es entre 10 g/l y 80 g/l.

6. - Un método para producir 17a-oxo-D-homo-1 ,4-androstadien- 3,17-diona de acuerdo con la Reivindicación 3, en el que la concentración de sustrato es entre 20 g/l y 80 g/l.

7. - Un método para producir 17oc-oxo-D-homo-1,4-androstadien-3,17-diona de acuerdo con la Reivindicación 3, en el que la concentración de sustrato es entre 40 g/l y 80 g/l.

8. - Un método para producir 17a-oxó-D-homo-1 ,4-androstadien-3,17-diona de acuerdo con la Reivindicación 3, en el que la concentración de sustrato es entre 50 g/l y 70 g/l. 9 - Un método para producir 17a-oxo-D-homo-1 ,4-androstadien-3,17-diona de acuerdo con la Reivindicación 3, que comprende además las operaciones: a) preparar un cultivo de gérmenes primarios de Fusarium solani ATCC4682

9. b) preparar un cultivo de gérmenes secundarios a partir del cultivo de la operación a); c) inocular el cultivo de la operación b) a un medio para bioconversión; d) añadir 4-androsten-3,17-diona micronizada al medio para bioconversión; e) verificar la compleción de la biotransformación; f) recoger los sólidos del medio para bioconversión; g) someter los sólidos a extracción; y h) aislar la 17a-oxo-D-homo-1 ,4-androstadien-3,17-diona.

10. - Un método de acuerdo con las Reivindicaciones 1-9, en el que el medio para bioconversión contiene un detergente y un aceite natural.

11. - Un método de acuerdo con la Reivindicación 10, en el que el detergente es octilfenoxi-polietoxi-etanol y el aceite natural es aceite de soja.