MXPA06003377A - Metodo para producir l-aminoacido mediante fermentacion. - Google Patents

Abstract

L-treonina o L-isoleucina se produce mediante el cultivo de una bacteria que pertenece al genero Escherichia y que tiene una capacidad para producir L-treonina o L-isoleucina, y que tiene un operon de treonina cuya expresion se dirige por su promotor nativo y a partir del cual se remueven al menos una secuencia lider y un atenuador de manera que se libera la atenuacion, en un medio y recolectar la L-treonina o L-isoleucina a partir del medio.

Description

MK. MN, MW. MX. MZ, NA, NI, NO, NZ, OM. PG, PH, Piihlislie : Pl.. PT. RO. RU, SC, SD, SE, SG, SK. SL, Y. TJ, TM. TN, with itiieniaíional search repon TR, ?. TZ. UA. UG, US, UZ. VC, VN, Y ZA, ZM, ZW. — befare ¡he expiralion of the. time lima for amemimg the. claúns and lo be republislied in the. eve.nl of rece.ipt of (84) Designated Stales (unless oihemisr indicaird for every amendmenis kntd of regional proie.eñoti available : ARÍPO (BW. GH, GM . KE. LS. MW. MZ. NA. SD. SL. SZ. TZ, UG. ZM. ZW ). Eurasian (??. AZ. BY, KG. KZ, ??. RU, TJ, TM ), For two-lette.r codes and otlier abbreviations. referió ¡lie "Guid European <AT. BE. BG. CH. CY, CZ. DE. DK, EE, ES, FI. a e Notes on Codas and Abbrexialions" appearing al ¡he begm FR. GB. GR, HIJ, G?, IS, IT, LU, MC. NL. PL, PT, RO, SE. ning of ea h regular iss e ftlic PCT Gazctie. SI. SK. TR). OAPI (BE BJ. CF, CG, CI. CM. GA, GN. GQ, GW. ML. MR, ??. SN, TD. TG).

METODO PARA PRODUCIR L-AMINOACIDO MEDIANTE FERMENTACION CAMPO DE LA TECNICA La presente invención se refiere a un método para la producción de un L-aminoácido utilizando una bacteria que pertenece al género Escherichia. Específicamente, la presente invención se refiere a un método para la producción de L-treonina o L-lsoleucina. L-treonina y L-isoleucina son ambos aminoácidos esenciales, y se utiliza L-treonína como un componente de diversas formulaciones nutricionales para usos médicos, o como un forraje animal. L-isoleucina no solamente es útil como un fármaco, tal como para preparaciones nutricionales, sino también como un aditivo para forraje.

TECNICA ANTERIOR RELACIONADA Los L-aminoácidos tales como L-treonina y L-isoleucina se producen ¡ndustrialmente mediante fermentación utilizando bacterias productoras de aminoácidos tales como bacterias corineformes y bacterias que pertenecen al género Escherichia, en donde dichas bacterias tienen la capacidad de producir estos L-aminoácidos. Las bacterias productoras de L-aminoácidos incluyendo cepas separadas a partir de cepas naturales o cepas artificialmente mutadas de las mismas, cepas recombinantes las cuales tienen una actividad mejorada de una enzima biosintética de L-aminoácido, y así sucesivamente, se utilizan para mejorar la producción de estos L- aminoácidos. Se han reportado los métodos para la producción de L-treonina utilizando una cepa muíante de la bacteria Escherichla, e incluyen un método para la utilización de una cepa resistente a 6-dimetilaminopurina (Patente Japonesa abierta al público (Kokai) No. 5-304969), y un método de utilización de una cepa resistente a borrelidina (Publicación de Patente Internacional WO 98/04715). Se han reportado los métodos para la producción de L-treonina utilizando una cepa recombinante de la bacteria Escheríchia, e incluyen un método para la utilización de una cepa en la cual el operón de treonina se amplifica con un plásmido (Patente Japonesa abierta al público No. 05-227977), y un método de utilización de una cepa en la cual se amplifica un gen de fosfoenolpiruvato carboxilasa o un gen de aspartasa con un plásmido (Solicitud de Patente de E.U.A. abierta al público No.2002/0110876). Se han reportado los métodos para la producción de L-isoleucina utilizando una cepa muíante de la bacteria Escheríchia, e incluyen un método para la uíilización de una cepa resistente a 6-dimetilaminopurina (Patente Japonesa abierta al público No. 5-304969), un método para la utilización de una cepa resistente a hidroxamato de L-isoleucina (Paíeníe Japonesa abierta al público No. 5-130882), y un méíodo para la uíilización de una cepa resisíeníe a íiaisoleucina (Paíeníe Japonesa abierta al público No. 5-130882). Se han reportado los métodos para la producción de L-isoleucina utilizando bacterias Escheríchia recombinantes, e incluyen un método para la uíilización de una cepa en la cual se amplifica el gen de la treonina deaminasa o el gen de la treonina acetohidroxi ácido sintasa se amplifica con un plásmido (Patente Japonesa abierta al público No. 2-458, Patente Europea No. 0593729). Se ha reportado un método para la producción de L-treonina o L- isoleucina utilizando una bacteria que pertenece al género Escheríchia en el cual se amplifica la expresión de un gen que codifica para una enzima implicada en la biosíntesis de L-treonina o L-isoleucina. Se han reportado los genes que codifican para enzimas implicadas en la biosíntesis de L-treonina en Escheríchia coli, e incluyen el gen de aspartocinasa III (lysC), el gen de aspartato semialdehído deshidrogenasa (asd), el gen de la aspartocinasa l-homoserina deshidrogenase (thrA), el gen de homoserina cinasa (thrB), el gen de treonina sintasa (thrC), y así sucesivamente. La secuencia thrABC, una parte de la ruta biosintética de treonina de Escheríchia coli, forma un operan denominado el operan de treonina. La expresión del operan de treonina se regula mediante una disminución en la transcripción por las concentraciones intraceiulares de L-treonina y L-isoleucina, denominada "atenuación". Además, se ha reportado que, entre otros, la expresión del operan de treonina en Escheríchia coli se regula vía una secuencia reguladora localizada entre el promotor de treonina y thrA, la cual es un gen estructural de un operón de treonina (Lynn S. P et al., "Journal of Molecular Biology (J. Mol. Biol)", Academic Press, vol. 183 (1985) pp. 529-541). Además, también se ha reportado que esta secuencia reguladora contiene una secuencia líder que comprende varias decenas de nucleótidos y un atenuador localizado entre la región del promotor y el codón del inicio. Muchos codones de treonina e isoleucina se incluyen en la secuencia líder, y cuando existe treonina o isoleucina en el medio, la traducción de la secuencia líder procede llanamente. Esto permite que el atenuador forme una estructura tridimensional, disminuyendo de esta manera la transcripción, y disminuyendo así la expresión de los genes de la ruta biosintética de la treonina. Cuando no existe treonina e isoleucina en el medio, se hace más lento el movimiento del ribosoma sobre la secuencia líder, y se incrementa la expresión de los genes de la ruta biosintética de los treonina debido al cambio en la estructura tridimensional del ARNm. La producción eficiente de la L-treonina en la presencia de altas concentraciones de isoleucina y treonina se ha intentado mediante la liberación de la atenuación para permitir la alta expresión del operón de treonina. Se ha reportado que el operón de treonina se regula ligeramente por la atenuación, y su expresión se incrementa cuando un operón de treonina que carece del atenuador se liga con un promotor heterogéneo potente que permite una alta expresión del operan. También se ha reportado que una bacteria que contiene este operón de treonina tiene una capacidad incrementada para la producción de L-treonina (Patente Japonesa abierta al público No. 05-227977). Además, se ha descrito que al conferir resistencia a borrelidin a una bacterium cambia la actividad de la treoninil-ARNt sintasa, y por lo tanto el operón de treonina llegará a ser ligeramente regulado por la atenuación. Por lo tanto, se puede mejorar la capacidad de producción de L-treonina (Publicación de Patente Internacional WO 98/04715). No obstante, cuando se remueve solamente el atenuador, se presenta la reducción de la transcripción por la adición de L-isoleucina o L-treonina al medio, y la expresión del operón de treonina aún es insuficiente a pesar de la liberación de la atenuación. Por lo tanto, en la fermentación de L-treonina y L-isoleucina que tiene concentraciones incrementadas de L-treonina y L-isoleucina en el medio, es deseable un incremento adicional en la expresión del operón de treonina. Contrariamente, cuando se utiliza un promotor heterólogo para dirigir la expresión del operón de treonina, la expresión se afecta significativamente por dichos factores tales como la distancia entre el promotor y el sitio de inicio de la transcripción, la distancia entre la secuencia SD y el codón del inicio, y la secuencia del codón del inicio. Por lo tanto, es difícil obtener una expresión máxima y estable. Por lo tanto, desde largo tiempo se ha deseado la creación de una cepa que tiene una capacidad estable de producción de L-isoleucina o L-treonina (Dalboge H. et al., "DNA", New York Ny ary Ann Liebert, julio y agosto, 1988, Vol. 7, No. 6, pp. 399-405).

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Un objetivo de la presente invención es mejorar una capacidad de una bacteria que pertenece al género Escherichia para producir un L- aminoácido, especialmente, L-treonina y L-isoleucina, al mejorar la ruta biosintética de la treonina en la bacteria. Los inventores de la presente invención han estudiado de manera asidua con el objeto de lograr el objetivo anteriormente mencionado, y como un resultado, tuvieron éxito en la construcción de un operón de treonina que no se somete a la regulación por atenuación mediada por isoleucina y treonina en un medio, mediante la remoción de al menos la secuencia líder y el atenuador en la región de atenuación. Ellos también encontraron que una cepa que tiene dicho operón de treonina exhibió propiedades superiores en la producción de L-treonina o L-isoleucina mediante experimentación, y así se logró la presente invención. Es un objetivo de la presente invención proveer una bacteria que pertenece al género Escherichia y que tiene una capacidad para producir L-treonina o L-isoleucina, en donde la expresión de dicho operón se dirige por un promotor nativo, y en donde al menos una secuencia líder y un atenuador se han removido a partir de dicho operón, de manera que se libera la regulación por atenuación.

Un objetivo adicional de la presente invención es proveer la bacteria Escherichia como se describió anteriormente, en donde dicho operón de treonina se encuentra en un plásmido. Es un objetivo adicional de la presente invención proveer la bacteria Escherichia como se describió anteriormente, en donde dicho operón de treonina se encuentra en un cromosoma. Es un objetivo adicional de la presente invención proveer la bacteria Escherichia como se describió anteriormente la cual tiene la capacidad de producir L-isoleucina, y en donde se mejora una actividad de una enzima biosintética de L-isoleucina. Es un objetivo adicional de la presente invención proveer un operón de treonina que comprende una región implicada en la atenuación, un promotor nativo, y genes estructurales de thrABC, en donde al menos la secuencia líder y el atenuador se removieron a partir de la región implicada en la atenuación. Es un objetivo adicional de la presente invención proveer el operón de treonina como se describió anteriormente que comprende la secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 1 , a partir de la cual se ha deletado al menos la secuencia que corresponde a los nucleótidos números 188 a 310. Es un objetivo adicional de la presente invención proveer el operón de treonina como se describió anteriormente que comprende la secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 1 , a partir de la cual se ha deletado al menos la secuencia que corresponde a los nucleótidos números 68 a 310.

Es un objetivo adicional de la presente invención proveer el operón de treonina como se describió anteriormente, que comprende la secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 1 , a partir de la cual se ha deletado al menos la secuencia que corresponde a los nucleótidos números 148 a 310. Es un objetivo adicional de la presente invención proveer un método para la producción de L-treonina o L-isoIeucina que comprende el cultivo de la bacteria como se describió anteriormente en un medio, y recolectar la L-treonina o L-isoleucina acumulada a partir del medio.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra un esquema de construcción de un plásmido para la amplificación del operón de treonina que carece del atenuador. La figura 2 muestra un esquema de construcción de un plásmido para la amplificación del operón de treonina que carece de la región implicada en la atenuación. La figura 3 muestra un esquema de construcción de un plásmido sensible a la temperatura para la introducción dentro de un cromosoma de un operón de treonina que carece de la región implicada en la atenuación.

DESCRIPCION DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS En adelante, la presente invención se explicará en detalle. < 1 > Bacteria de la presente invención La bacteria de la presente invención es una bacteria que pertenece al género Escherichia, tiene una capacidad para producir L-treonina o L-isoleucina, y tiene un operón de treonina modificado, por medio del cual se regula la expresión por un promotor nativo de este operón de treonina. A este operón de treonina se le ha removido al menos una secuencia líder y un atenuador de manera que se libera la regulación mediante atenuación. En adelante, este operón de treonina se refiere como el "operón de treonina de la presente invención". La bacteria de la presente invención puede tener tanto capacidades para la producción de L-treonina como de L-isoleucina. La bacteria de la presente invención se puede obtener ya sea mediante la introducción del operón de treonina de la presente invención dentro de una bacteria que pertenece al género Escherichia y la cual tiene capacidad productora de L-treonina o de L-isoleucina, o al impartir capacidad productora de L-treonina o de L-isoleucina a una bacteria que tiene el operón de treonina de la presente invención. Además, la bacteria de la presente invención también puede ser una bacteria que tiene la capacidad productora de L-treonina o de L-isoleucina debido a que ha sido modificada para que tenga el operón de treonina de la presente invención.

Aunque la cepa parental de la bacteria que pertenece al género Escheríchia utilizada para obtener la bacteria de la presente invención no se limita particularmente, se pueden utilizar aquellas descritas en Neidhardt et al. (Neidhardt, F. C. et al., Escheríchia coli y Salmonella Typhimuríum, American Society for Microbiology, Washington D. C, 1029, cuadro 1). Esas incluyen, por ejemplo, Escheríchia coli. Los ejemplos específicos de Escheríchia coli incluyen Escheríchia coli W3110 cepa (ATCC 27325) derivada a partir de la cepa K12, la cual es una cepa de tipo silvestre prototipo, y Escheríchia coli MG1655 (ATCC 47076). Estas cepas están disponibles a partir de the American Type Culture Collection (Dirección: 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, Estados Unidos de America). A cada cepa se le da un número de registro único el cual está listado en el catálogo de the American Type Culture Collection. Las cepas se pueden ordenar mediante el uso de este número de registro. < 1 > -1. Impartiendo capacidad productora de L-treonina o de L-isoleucina En adelante, se describirá un método para impartir la capacidad productora de L-treonina o de L-isoleucina a una bacteria que pertenece al género Escheríchia. En la presente invención, el término "capacidad productora de L-treonina (capacidad para producir L-treonina)" significa una capacidad de la bacteria de la presente invención para producir y ocasionar la acumulación de L-treonina en un medio cuando ésta se cultiva en el medio.

En la presente Invención, el término "capacidad productora de L-isoleucina (capacidad para producir L-isoleucina)" significa una capacidad de la bacteria de la presente invención para producir y ocasionar la acumulación de L- isoleucina en un medio cuando ésta se cultiva en el medio. Con el objeto de impartir capacidad productora de L-treonina o de L-isoleucina, se pueden utilizar los métodos convencionalmente utilizados para producir una bacteria productora de L-treonina o de L-isoleucina que pertenece al género Escherichia o una bacteria Corineforme. Por ejemplo, se pueden utilizar los métodos para la obtención de una cepa mutante auxotrófica, una cepa resistente análoga, o una cepa mutante para regulación metabólica que tiene capacidad productora de L-treonina o de L-isoleucina, métodos para la creación de una cepa recombinante en la cual la actividad de una enzima biosintética de L-treonina o de una enzima biosintética de L-isoleucina está mejorada. Cuando se producen bacterias productoras de L-treonina o de L-isoleucina utilizando estos métodos, se pueden impartir propiedades particulares o múltiples de auxotrofía, resistencia a análogo y mutación para regulación metabólica. Cuando se crea una cepa recombinante, se puede mejorar la actividad de enzima biosintética de L-treonina o de L-isoleucina particular o múltiple. Además, se pueden combinar los métodos para impartir propiedades de auxotrofía, resistencia al análogo y mutación para regulación metabólica con los métodos que mejoran una actividad de la enzima biosintética de L-treonina o de L-isoleucina.

A continuación se ejemplificará un método para impartir capacidad productora de L-treonina o de L-isoleucina a una bacteria que pertenecen al género Escherichia al mejorar una actividad de una enzima biosintética de L-treonina o de L-isoleucina. La mejoría en una actividad en una enzima se puede lograr mediante, por ejemplo, la introducción de una mutación dentro de un gen que codifica para la enzima de manera que se incrementa la actividad intracelular de la enzima, o al utilizar una técnica de recombinación genética. Los genes que codifican para las enzimas biosintéticas de L-treonina incluyen el gen de aspartocinasa III (lysC), el gen de aspartato semialdehído deshidrogenasa (asd), y así sucesivamente. Los nombres de los genes que codifican para las enzimas respectivas se muestran en los paréntesis después de los nombres de las enzimas. Se pueden introducir dos o más tipos de estos genes dentro de una bacteria que pertenece al género Escherichia. Estos genes que codifican para las enzimas biosintéticas de L-treonina se pueden introducir dentro de una bacteria que pertenece al género Escherichia en la cual la ruta de degradación de treonina está suprimida. Los ejemplos de bacterias en las cuales la ruta de degradación de treonina está suprimida incluyen la cepa TDH6, la cual es deficiente en actividad de treonina deshidrogenasa (Patente Japonesa abierta al público No. 2001-346578). Los ejemplos de genes que codifican las enzimas biosintéticas de L-isoleucina incluyen el gen de treonina deaminasa (ilvA), el gen de cetol-ácido reducto isomerasa (ilvC), el gen de acetolactato sintasa (ilvl), el gen de dihidroxi-ácido dehidratasa (dad), y el gen de aminotransferasa (ilvE). Los nombres de los genes que codifican para sus enzimas respectivas se muestran en los paréntesis después de los nombres de las enzimas. Se pueden introducir dos o más tipos de estos genes. Los genes anteriormente mencionados ilvA e ilvE están contenidos en el operón ilvGMEDA (Patente Japonesa abierta al público No. 2002-051787), y por lo tanto éstos se pueden introducir en la forma del operón ilvGMEDA. Además, la L-treonina es un precursor de la L-isoleucina. Por lo tanto, con el objeto de incrementar la capacidad productora de la L-isoleucina, es preferible incrementar el abastecimiento de L-treonina. Por lo tanto, el incremento en la capacidad productora de la L-isoleucina se puede obtener mediante la mejoría tanto de la ruta biosintética de la L-treonina como de la ruta biosintética de la L-isoleucina, así como mejorando solamente la ruta biosintética de la L-isoleucina. Los ejemplos de bacterias a las que se les imparte capacidad productora de la L-treonina de dicha manera incluyen aquellas descritas en la Patente Japonesa abierta al público Nos. 2002-51787 y 9-12 872. Las actividades de cualesquiera de las enzimas codificadas por los genes anteriormente mencionados se pueden mejorar por, por ejemplo, la amplificación del gen utilizando un plásmido replicable de manera autónoma en la bacteria que pertenece al género Escherichia. Además, el gen que codifica la enzima biosintética también se puede introducir dentro del cromosoma. Además, las actividades también se pueden mejorar mediante la introducción dentro de una bacteria de un gen que contiene una mutación que resulta en la mejoría de la actividad intrace!ular de la enzima codificada por el gen. Los ejemplos de dichas mutaciones incluyen una mutación de la secuencia promotora que incrementa la cantidad de transcripción del gen, y una mutación en la región codificante que incrementa la actividad específica de una enzima codificada por el gen. La expresión del gen también se puede mejorar al remplazar una secuencia reguiadora de la expresión, tal como un promotor, en un ADN cromosomal o plásmido con uno más fuerte (Publicación de Patente Internacional WO 00/18935). Los ejemplos de dichos promotores incluyen, pero no se limitan a, el promotor lac, promotor trp, promotor trc y promotor P derivado a partir del fago lambda, y así sucesivamente. Los métodos para la modificación del promotor se pueden combinar con los métodos para incrementar el número de copias de un gen. Los ejemplos específicos de bacterias que pertenecen al género Escheríchia a las cuales se les imparte capacidad productora de L-treonina o de L-isoleucina y que se pueden utilizar en la presente invención serán ejemplificados a continuación. No obstante, las bacterias no se limitan a los ejemplos, pero abarcan cualesquiera bacterias las cuales tienen capacidad productora de L-treonina o de L-isoleucina. Los ejemplos de las bacterias a las que se imparte con capacidad productora de L-treonina incluyen la cepa resistente a 6-dimetilaminopurina (Patente Japonesa abierta al público No. 5-304969), una cepa en la cual un gen mutado de la enzima biosintética de treonina el cual ocasiona la sobreproducción de la enzima se amplifica con un plásmido (Publicación de Patente Japonesa (Kokoku) No. 1-29559 y Patente Japonesa abierta al público Nos. 5-2227977), y una cepa en la cual están amplificados un gen que codifica para la piruvato carboxilasa y un gen que codifica para la nicotinamida nucleótido transhidrogenasa (Patente Japonesa abierta al público No. 2002-51787). Además, también se pueden utilizar la Escherichia coli VKPMB- 3996 (cf. Patente de E.U.A. No. 5,175,107). La Escherichia coli VKPM B-3996 se depositó en the Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM GNU Genetika Dirección: Dorozhny proezd 1 , Moscú 1 3545, Rusia) el 7 de abril de 1987 con un número de registro de VKPM B-3996. La cepa VKPM B-3996 contiene el plásmido pVIC40 (Publicación de Patente Internacional WO 90/04636) el cual se obtuvo mediante la introducción de un gen del operan de treonina (thrABC) dentro de un plásmido pAYC32 que tiene un gen marcador de resistencia a estreptomicina (consultar Chistorerdov, A. Y, Tsygankov, YD., Plasmid, 1986, 16, 161-167). En pVIC40, se libera la inhibición por retroalimentación mediada por L-treonina de la aspartocinasa 1-homoserina deshidrogenasa I codificada por thrA. Los ejemplos de bacterias que pertenecen al género Escherichia a las que se les imparte capacidad productora de L-isoleucina incluyen la cepa resistente a 6-dimetilaminopurina (Patente Japonesa abierta al público No. 5-304969), la cepa resistente a L-isoleucina hidroxamato (Patente Japonesa abierta al público No. 5-130882), una cepa resistente a tiaisoieucina (Patente Japonesa abierta al público No.5-130882), una cepa resistente a DL-etionina (Patente Japonesa abierta al público No. 5-130882), una cepa resistente a arginina hidroxamato (Patente Japonesa abierta al público No. 5-130882), así como cepas en las cuales un gen que codifica para treonina deaminasa o acetohidroxi ácido sintasa, la cual es un enzima para la biosíntesis de L- isoleucina, se amplifica con un plásmido (Patente Japonesa abierta al público Nos. 2-458, 2-42988, 8-47397). < 1 > -2. Operón de treonina de la presente invención Se sabe que la transcripción del operón de treonina disminuye por la regulación transcripcional denominada "atenuación" en la presencia de concentraciones altas de isoleucina o treonina (J. Mol. Biol. ( 985) 183, 529-541 ). La liberación de esta atenuación es importante para la producción incrementada de estos aminoácidos. El operón de treonina contiene genes estructurales de thrABC, un promotor nativo hacia el extremo 5' del gen estructural, y una región implicada en la atenuación la cual incluye una secuencia y una secuencia específica denominada "atenuador" la cual regula la expresión del gen estructural thrABC. Los ejemplos de la secuencia líder incluyen, pero no se limitan a, una secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 6. Esta secuencia codifica un péptido líder que consiste de 21 residuos de aminoácidos que se muestran en SEQ ID NO: 2, y consiste de una región que codifica para 8 codones de treonina y 4 codones de isoleucina y una región que contiene un codón de terminación. Los ejemplos del atenuador incluyen, pero no se limitan a, la región que tiene la secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 7. Esta secuencia contiene dos secuencias que son complementarias entre sí de manera que pueden hibridar en la molécula de ADN (J. Mol. Biol. (1985) 183, 529-541). El atenuador tiene una estructura similar a aquella de un terminador, el cual termina la transcripción. Las secuencias complementarias en el atenuador se hibridan entre sí para formar una estructura tridimensional denominada "una estructura en tallo asa", y la transcripción se termina en esta región. La reducción de la transcripción por la atenuación en la presencia de altas concentraciones de treonina e isoleucina se presenta de conformidad con el siguiente mecanismo. Cuando las concentraciones intracelulares de isoleucina e treonina son altas, se incrementan las concentraciones de treoninil-ARNt e isoleucil-ARNt en medio de cultivo. Por lo tanto, los complejos de ARNt-aminoácido están presentes en las células en una cantidad adecuada para la traducción de una secuencia líder que codifica para muchos codones de treonina y de isoleucina. Por lo tanto, la secuencia líder se transcribe y se traduce llanamente, y la traducción se termina en el codón de terminación de la secuencia líder misma. Posteriormente, las secuencias complementarias dentro del atenuador hibridan entre sí para formar una estructura tallo asa, y la estructura tallo asa funciona para terminar la transcripción. Por lo tanto, es difícil para la transcripción proceder hasta los genes estructurales del operón de treonina, y así disminuye la expresión de genes que codifican las enzimas biosintéticas de treonina. Contrariamente, cuando las concentraciones intracelulares de treonina y de isoleucina son bajas, disminuyen las concentraciones intracelulares de treoninil-ARNt e ¡soleucll-ARNt. Por lo tanto, los complejos de ARNt-aminoácido no se presentan en una cantidad adecuada para la traducción de una región de la secuencia líder, y así un ribosoma se detiene en un codón de treonina o isoleucina en la secuencia líder. Como un resultado, una secuencia líder no se traduce llanamente, y una región inmediatamente hacia el extremo 5' del codón de término y una región inmediatamente hacia el extremo 5' del atenuador forman un par para inhibir la hibridación de las secuencias complementarias en el atenuador. Así, no se puede formar un terminador, y la transcripción no se termina. Por lo tanto, la transcripción procede a los genes estructurales thrABC del operón, resultando en la transcripción máxima de los genes estructurales del operón de treonina y la producción máxima de las enzimas biosintéticas de la treonina. Cuando se incrementa la producción de L-treonina y de L-isoleucina, se elevan las concentraciones intracelulares de L-treonina y de L-isoleucina, y la regulación por atenuación funciona para disminuir la expresión de los genes estructurales del operón de treonina. Como un resultado, se reducen las actividades de las enzimas biosintéticas de treonina, y así no se puede ejercer la capacidad para producir L-treonina o L-isoleucina al grado máximo. Si se puede liberar dicha regulación mediante atenuación, se podría expresar el operan de treonina a un nivel elevado. Además, la liberación de la atenuación se puede combinar con la mejoría de la capacidad productora de L-treonina o L-isoleucina como se describió anteriormente para mejorar adicionalmente la capacidad para producir L-treonina o L-isoleucina. El operón de treonina de la presente invención es "un operón de treonina que incluye una región implicada en la atenuación, un promotor nativo al operón de treonina, y los genes estructurales de thrABC en donde al menos una secuencia líder y el atenuador se deletan a partir de la región implicada en la atenuación." El término "atenuación" utilizado en la presente invención significa la reducción de la transcripción de los genes estructurales del operón de treonina debido al incremento de las concentraciones intracelulares de treonina e isoleucina. El "atenuador" significa una región que tiene una secuencia que puede formar una estructura tallo asa entre las secuencias complementarias en la molécula para terminar la transcripción de los genes estructurales. Los ejemplo de dicha secuencia derivada a partir de una bacteria que pertenece al género Escherichia incluyen la secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 7. La "secuencia líder" se refiere a una secuencia que contiene un número elevado de codones de isoleucina y codones de treonina, y los ejemplos de dicha secuencia derivada a partir de una bacteria que pertenece al género Escherichia incluyen la secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 6, la cual codifica el péptido líder que contiene 4 residuos de isoleucina y 8 residuos de treonina que se muestra en SEQ ID NO: 2 (J. Mol. Biol. (1985) 183, 529-541 ). El "promotor nativo" se refiere a un promotor del operón de treonina mismo, y los ejemplos de dicho promotor derivado a partir de una bacteria que pertenecen al género Escherichia que incluyen el promotor que tiene una secuencia de nucleótidos números 71 a 99, y/o una secuencia de nucleótidos números 104 a 132 de SEQ ID NO: 1. Además, la frase "genes estructurales de thrABC" significa un policistrón que contiene el gen estructural que codifica la aspartocinasa l-homoserina deshidrogenase (thrA), el gen estructural que codifica la homoserina cinasa (thrB), y el gen estructural que codifica la treonina sintasa (thrC). Los ejemplos de genes estructurales de thrABC derivados a partir de una bacteria que pertenece al género Escherichia incluyen una secuencia de los nucleótidos números 337 a 5020 de SEQ ID NO: 1. Los "genes estructurales de thrABC" se pueden modificar, siempre y cuando codifiquen proteínas las cuales tienen actividades de aspartocinasa l-homoserina deshidrogenasa, homoserina cinasa y treonina sintasa. Por ejemplo, como el gen thrABC contenido en pVIC40 como se describió anteriormente, los genes estructurales de thrABC se pueden modificar de manera que se elimina la inhibición por retroalimentación mediada por L-treonina. En la presente invención, la frase "región implicada en la atenuación" significa una región la. cual se localiza entre el promotor y el codón del inicio thrA, y contiene al menos una secuencia líder y un atenuador. También se refiere como una "región de atenuación" y los ejemplos de dicha región derivada a partir de una bacteria que pertenece al género Escherichia incluyen una región que tiene los nucleótidos números 148 a 310 en SEQ ID NO: 1 (J. Mol. Biol. (1985) 183, 529-541 ). En la presente invención, la frase "se libera la regulación por atenuación" significa que, debido a la remoción de al menos la secuencia líder y el atenuador a partir del operón de treonina, el atenuador se vuelve incapaz de formar una estructura tallo asa, y por lo tanto se incrementa la expresión de los genes estructurales del operón de treonina en la presencia de concentraciones elevadas de isoleucina o treonina en comparación con una cepa de tipo silvestre o una cepa no mutada. Además, la frase "operón de treonina en el cual se remueven al menos la secuencia líder y el atenuador a partir de la región implicada en la atenuación", significa que el operón de treonina tiene una secuencia que carece al menos de la secuencia líder y del atenuador. Mientras que se libere la atenuación, la secuencia puede ser una secuencia la cual también carece de la secuencia hacia el extremo 5' de la secuencia líder y/o la secuencia entre la secuencia líder y el atenuador. Por ejemplo, se puede remover la secuencia líder, el atenuador, una secuencia entre la secuencia líder y el atenuador, y una secuencia en el extremo 5' (hacia el extremo 5') de la secuencia líder. Los ejemplos de la secuencia entre la secuencia líder y el atenuador incluyen la secuencia de los números de los nucleótidos 256 a 272 en la secuencia de SEQ ID NO: 1 , y así sucesivamente. Los ejemplos de la secuencia en el extremo 5' de la secuencia líder incluyen la secuencia a partir de los nucleotidos 168° a 189° de SEQ ID NO: 1 , la secuencia a partir de los nucleotidos 148° a 189° de SEQ ID NO: 1 , y así sucesivamente. Mientras que se libere la atenuación, se puede remover una secuencia en el extremo 5' de estas secuencias. Un operón de treonina obtenida mediante la modificación del operón de treonina derivado a partir de una bacteria que pertenecen al género Escheríchia se prefiere como el "operón de treonina" de la presente invención. Los ejemplos del operón de treonina de la presente invención incluyen un operón de treonina que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 1 a partir del cual se deletan al menos las secuencias de SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7, y un homólogo de las mismas. Específicamente, se prefiere la secuencia de SEQ ID NO: 1 , por medio de la cual se deletó ai menos la secuencia de los números de los nucleotidos 188 a 310; se prefiere más la secuencia de SEQ 1 D NO: 1 , por medio de la cual se deletó al menos la secuencia de los números de los nucleotidos 168 a 310; y se prefiere particularmente la secuencia de SEQ ID NO: 1 , por medio de la cual se deletó al menos la secuencia de los números de los nucleotidos 148 a 310. El homólogo del operón de treonina utilizado en la presente invención puede ser un operón de treonina que tiene una secuencia la cual incluye la sustitución, deleción o inserción de uno o varios nucleotidos a partir de SEQ ID NO: 1 , a partir del cual se deletan al menos las secuencias de SEQ 1 D NO: 6 y SEQ ID NO: 7, siempre y cuando el operón de treonina no sea regulado por la atenuación y exprese proteínas thrA, B y C enzimáticamente activas. El término "varios" como se utiliza en la presente invención se pretende que signifique de 2 a 50, preferiblemente de 2 a 10, más preferiblemente de 2 a 5. Además, el homólogo del operón de treonina utilizado en la presente invención también puede ser un operón de treonina el cual se híbrida con un ADN que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, a partir de la cual se deletan al menos las secuencias de SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7, bajo condiciones severas, siempre y cuando el operón de treonina no sea regulado por la atenuación y exprese las proteínas ThrA, B y C enzimáticamente activas. Los ejemplos de las condiciones severas incluyen, por ejemplo, lavado en una ocasión, preferiblemente dos o tres veces, a una concentración salina de SSC 1 x y 0.1% de SDS, preferiblemente SSC 0.1 x y 0.1% de SDS, a 60°C después de la hibridación. Además, las secuencias anteriormente mencionadas pueden contener una secuencia que no puede funcionar como una secuencia líder o atenuador en el sitio de la región deletada. Los ejemplos de la secuencia que no puede funcionar como una secuencia líder o atenuador incluyen una secuencia líder en la cual toda o una parte de los codones de treonina o de los codones de ¡soleucina se reemplazan con codones de otros aminoácidos o un codón de término, un atenuador modificado de manera que no puede formar una estructura tallo asa, y así sucesivamente.

En la presente invención, la frase "el incremento de la expresión del genes estructurales de operan de treonina" significa que la transcripción del ARNm de los genes estructurales se incrementa debido a la liberación de la atenuación, y por lo tanto se incrementa la cantidad de proteína thrABC traducida. En la presente invención, la frase "se incrementan las actividades específicas de enzimas biosintéticas de treonina codificadas por el operón de treonina" significa que debido al incremento de la expresión de los genes estructurales del operón de treonina, se incrementan las actividades específicas de la aspartocinasa l-homoserina deshidrogenasa (thrA), homoserina cinasa (thrB) o treonina sintasa (thrC) codificadas por los genes estructurales, es decir, el gen thrABC, se incrementa en comparación con aquel de una cepa de tipo silvestre o una cepa parental. Un ejemplo de la cepa de tipo silvestre de Escheríchia coli que sirve como la cepa para comparación incluye Escheríchia co//' W3110 (ATCC 27325), MG1655 (ATCC 47076). Una bacteria que pertenece al género Escheríchia la cual contiene el operón de treonina de la presente invención como se describió anteriormente se puede obtener mediante la preparación de un ADN que contiene una "región implicada en la atenuación a partir de la cual se han removido al menos la secuencia líder y el atenuador" mediante mutagénesis sitio-dirigida, o los similares, y la introducción del ADN resultante dentro de una región implicada en la atenuación del operón cromosomal de treonina, de conformidad con un método descrito en la presente invención. Además, dicha bacteria también se puede obtener mediante la amplificación de un vector de ADN que porta el operón de treonina de la presente invención en una bacteria que pertenece al género Escherlchla. Los ejemplos del vector de ADN útiles para este propósito incluyen plásmidos autónomamente replicables en una bacteria que pertenece al género Escherichia, como se describe en la presente invención. La introducción de una mutación para deleclón se puede lograr mediante, por ejemplo, el uso de un equipo para mutagénesis genética comercialmente disponible, enzimas de restricción, PCR, y así sucesivamente, en combinación. La región implicada en la atenuación del operón de treonina también se puede modificar para someter a una bacteria que pertenece al género Escherichia y que tiene una capacidad para producir L-treonina o L-isoleucina a un tratamiento para mutagénesis tal como irradiación ultravioleta, irradiación de rayos X, exposición a radiación, o tratamiento con un agente para mutagénesis tal como N-metil-N'-nitrosoguanidina (NTG) o EMS (etilmetansulfonato), y seleccionar una bacteria en la cual se libera la atenuación. El incremento de la expresión de los genes estructurales del operón de treonina debido a la liberación de la atenuación en la bacteria de la presente invención se puede confirmar al medir una actividad enzimática de una o más enzimas biosintéticas de treonina codificadas por el gen thrABC en la bacteria cultivada en la presencia de concentraciones elevadas de L-treonina o L-isoleucina. En este procedimiento, la comparación se realiza preferiblemente al medir la actividad enzimática en la bacteria de la presente invención la cual ha sido cultivada en medio sin L-treonina y L-isoleucina, puesto que la atenuación no se presenta en este ambiente. La actividad enzimática de la homoserina deshidrogenasa se puede medir mediante el método descrito en Truffa-Bachi P., Le Bras G, Cohén GN., Biochem. Biophys. Acta., 128: 450 (1966), y las actividades enzimáticas de la homoserina cinasa y de la treonina sintasa se pueden medir mediante el método descrito en Parsot C, EMBO J. 1986 Nov., 5 (11): 3013-9. Además, las proteínas celulares se pueden cuantificar con el Ensayo para Proteína (Bio-Rad) utilizando, por ejemplo, albúmina de suero de bovino como un estándar. Cuando la bacteria de la presente invención se evalúa en términos de la actividad de la homoserina deshidrogenasa (en adelante referida como HD), por ejemplo, se prefiere la bacteria que muestre una actividad HD de 25 nanomoles/minuto/mg de proteína celular o mayor en la presencia de concentraciones elevadas de treonina o isoleucina, la bacteria que muestra una actividad HD de 2 a 3 veces mayor que una bacteria de tipo silvestre en la presencia de concentraciones elevadas de treonina o isoleucina, o la bacteria la cual cuando se cultiva en la presencia de concentraciones elevadas de treonina o isoleucina, exhibe actividad de HD no menor de un tercio de la actividad de HD que la misma bacteria cultivada en la ausencia de treonina o isoleucina. No obstante, la bacteria de la presente invención no se limita a éstas. Cuando la bacteria se cultiva en la presencia de concentraciones elevadas de treonina o isoleucina, L-isoleucina o L-treonina ésta se añade preferiblemente a una concentración de 50 mg/L o mayor. Como el vector del ADN utilizado para la introducción del operón de treonina de la presente invención dentro de una bacteria que pertenece al género Escheríchia, se utiliza preferiblemente un plásmido de ADN, y los ejemplos de plásmidos para Escheríchia coli incluyen pSTV29 (Takara Bio), RSF1010 (Gene, vol. 75 (2), pp. 271-288, 1989), pUC19, pBR322, pMW119. Además, también se pueden utilizar los vectores del ADN del fago. Los ejemplos de plásmidos que portan el operón de treonina de la presente invención incluyen un plásmido el cual se obtiene mediante la remoción de la región implicada en la atenuación a partir de plásmido pVIC40 (Publicación de Patente Internacional en Japonés No. 3-501682), el cual porta el operón de treonina de tipo resistente a la inhibición por retroalimentación y es albergado por el microorganismo productor de L-treonina VKPM B-3996. La introducción del operón de treonina de la presente invención dentro de un cromosoma de una bacteria se puede obtener mediante, por ejemplo, la recombinación homologa utilizando una técnica de recombinación genética (Experimente in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1972); Matsuyama, S. y Mizushima, S., J. Bacteriol., 162, 1196 (1985)). Por ejemplo, la introducción se puede lograr mediante el reemplazo de una región que incluye la región de atenuación de un operón de treonina de tipo silvestre en un cromosoma con el fragmento que tiene una secuencia tipo liberación de atenuación. La frase "secuencia tipo liberación de atenuación" como se utiliza en la presente invención significa una secuencia de la región implicada en la atenuación a partir de la cual se remueven al menos la secuencia líder y el atenuador. El mecanismo de recombinación homologa es como sigue. Cuando un plásmido que tiene una secuencia que muestra homología a una secuencia cromosomal se introduce dentro de una célula, éste ocasiona la recombinación en el sitio de la secuencia homologa a cierta frecuencia, y el plásmido introducido como un todo se incorpora dentro del cromosoma. Si adicionalmente se ocasiona recombinación en el sitio de la secuencia homologa, el plásmido se remueve de nuevo a partir del cromosoma. Posteriormente, en ciertos lugares en donde se ocasiona recombinación, el gen introducido se puede incorporar dentro del cromosoma y el gen cromosomal original se puede escindir a partir del cromosoma con el plásmido. Mediante la elección de dicha cepa, se puede obtener una cepa en la cual la región de atenuación de tipo silvestre en un cromosoma se reemplaza con un fragmento que tiene la secuencia tipo liberación de la atenuación. Dicho método de recombinación genética basado en la recombinación homologa ya ha sido establecido, y se pueden utilizar los métodos de uso de un ADN lineal, plásmido sensible a la temperatura, y así sucesivamente. Los ejemplos del plásmido sensible a la temperatura que pueden funcionar en una bacteria que pertenece al género Escherichia incluyen pMAN997 (Publicación de Patente Internacional WO 99/03998), pMAN031 (Yasueda, H. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 36, 21 1 (1991 )), pHSG415, pHSG422 (Hashimoto, Gotoh, T. et al, 16, 227-235 (1981 )), y así sucesivamente. La sustitución del gen blanco se puede confirmar mediante análisis de los genes en un cromosoma con Southern blot o PCR. Los métodos para la preparación de genes, hibridación, PCR, preparación de ADN plasmídico, digestión y ligación de ADN y transformación utilizados en la presente invención se describen en Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1.21 (1989). Cuando se introduce el operón de treonina de la presente invención, el número de copias del operón de treonina se puede incrementar mediante la introducción de múltiples operones dentro del cromosoma. Por ejemplo, el operón de treonina de la presente invención se puede introducir dentro del cromosoma utilizando el fago Mu (Patente Japonesa abierta al público No. 2-109985), transposón (Berg, D. E. y Berg, C. M., Bio/Technol., 1-147), o los similares. < 2 > Método para la producción de L-treonina o L-isoleucina La L-treonina o L-isoleucina se puede producir mediante el cultivo de una bacteria la cual pertenece al género Escherichia y tiene una capacidad para producir L-treonina o L-isoleucina, en la cual se incrementa la expresión de los genes estructurales del operón de treonina mediante la remoción de la región de atenuación o mediante la introducción de una mutación dentro de la región como se describió anteriormente, en un medio para producir y ocasionar la acumulación de L-treonina o L-isoleucina en el medio, y recolectar la L-treonina o L-isoleucina a partir del medio. La L-treonina y L-isoleucina se pueden producir simultáneamente. Si se requiere, la L-treonina o L-isoleucina se puede producir utilizando la bacteria de la presente invención de manera convencional con un medio típico que contiene una fuente de carbono, fuente de nitrógeno, sales inorgánicas, y otros nutrientes traza orgánicos. Se puede utilizar ya sea un medio sintético y/o un medio natural. Cualquier fuente de carbono y fuente de nitrógeno se puede utilizar en el medio siempre y cuando éstos se puedan utilizar por la cepa a ser cultivada. Como la fuente de carbono, se pueden utilizar azúcares tales como glucosa, glicerol, fructosa, sacarosa, maltosa, mannosa, galactosa, almidón hidrolizado y molassas, y también se pueden utilizar de manera particular o en combinación ácidos orgánicos tales como ácido acético y ácido cítrico y alcoholes tales como etanol. Se pueden utilizar como la fuente de nitrógeno amoniaco, sales de amonio tales como sulfato de amonio, carbonato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio y acetato de amonio, sales de ácido nítrico y así sucesivamente. Los aminoácidos, vitaminas, ácidos alifáticos, ácidos nucleicos, sustancias que contienen éstos, tales como peptona, casaminoácido y productos de descomposición de la proteína de soya, y así sucesivamente, se pueden utilizar como la cantidad traza de nutrientes orgánicos. Cuando se utiliza una cepa muíante auxotrófica que requiere un aminoácido o los similares para crecimiento, preferiblemente se abastece el nutriente requerido. En particular, una bacteria productora de treonina mostró auxotrofía a isoleucina se cultivó de manera deseable con abastecimiento de isoleucina la cual se requiere para crecimiento. Los fosfatos, sales de magnesio, sales de calcio, sales de hierro, sales de manganeso, y así sucesivamente se pueden utilizar como la cantidad traza de nutrientes orgánicos. Preferiblemente el cultivo se lleva a cabo bajo condiciones aeróbicas de 25°C a 45°C, y a un pH de 5 a 9. Cuando el valor de pH disminuye durante el cultivo, se puede añadir carbonato de calcio, o el medio se puede neutralizar con una sustancia alcalina tal como gas amoniaco. Bajo dichas condiciones, se acumula una marcada cantidad de L-treonina o L-isoleucina en el medio después de cultivar por, preferiblemente, aproximadamente 10 a 120 horas. La recolección de la L-treonina o L-isoleucina acumulada a partir del medio después del cultivo se puede lograr mediante cualquier método de recolección convencional. Por ejemplo, los aminoácidos se pueden recolectar mediante la remoción de las células a partir del medio mediante centrifugación y subsecuentemente cristalización por concentración.

EJEMPLOS La presente invención se explicará más específicamente con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLO 1 Construcción y evaluación de una cepa que alberga un plásmido para amplificación del operón de treonina a partir del cual se remueve el atenuador < 1 > preparación de un plásmido para la remoción del atenuador El plásmido pVIC40 el cual es autónomamente replicable en Escherichia coli y porta el operón de treonina (Publicación de Patente Internacional en Japonés No. 3-501682) se digirió con las enzimas de restricción Hindlll y BamHI para obtener un fragmento de aproximadamente 6 kbp que contenía el operón de treonina. Posteriormente, se digirió el pBR322 (obtenido a partir de Takara Bio) con las enzimas de restricción Hindlll y BamHI, y el fragmento anteriormente mencionado de aproximadamente 6 kbp que contenía el operón de treonina se insertó dentro del pBR322 digerido para obtener pBRT3240A. Este pBRT3240A se trató con Mlul, y un adaptador que tenía el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción Xbal, el cual se obtuvo mediante la hibridación del oligonucleótido que se muestra en SEQ ID NO: 8 y se insertó una cadena complementaria al mismo, dentro del sitio Mlul de pBRT3240A para obtener un plásmido pBR3240A. Posteriormente, se amplificó un fragmento que contenía tanto el promotor de treonina como el gen de thrA, el cual codifica para homoserina deshidrogenase, mediante PCR utilizando pVIC40 como un molde. El fragmento obtenido se insertó dentro del sitio Hincll de pHSG399 (obtenido a partir de Takara Bio) para obtener pHSGthrA. Un fragmento obtenido mediante la digestión de pBRT3240A con las enzimas de restricción Xbal y SnaBI y un fragmento que codifica para la región thrA obtenido mediante la digestión de pHSGthrA con Xbal y SnaBI se ligaron para obtener un plásmido pBRAT3. Posteriormente, un fragmento que contenía thrABC obtenido mediante el tratamiento de pBRAT3 con PstI y BamHI se introdujo dentro de un fragmento digerido con PstI y BamHI de pVIC40 para obtener el plásmido pVICAT3. El plásmido pVlCAT3 es autónomamente replicable en Escherichia coli y tiene un operón de treonina incluyendo la región implicada en la atenuación, a partir del cual se remueve solamente el atenuador (figura 1 ). El plásmido pVICAT3, anteriormente descrito, y un plásmido control pVIC40, el cual tiene un atenuador de tipo silvestre, se utilizan para transformar la E. coli cepa Gif33 la cual es deficiente en homoserina deshidrogenasa (AK-I, Theze J., Saint-Girons I., J. Bacteriol., 118 (3): 990 (1974)) de conformidad con el método de C. T. Chung (C. T. Chung, S. L.

Niemela, R. H. Miiler, Proc. Nati. Acad. Sci. ( 989) vol. 86, pp. 2172-2175). Un transformante amplificado pVICAT3 y transformante control amplificado por el un operón de treonina de tipo silvestre se seleccionaron para resistencia a estreptomicina. El transformante obtenido mediante la introducción de pVICAT3 se designó Gif33/pVICAT3, y el transformante obtenido mediante la introducción de pVIC40 se designó Gif33/pVIC40. Los plásmidos se extrajeron a partir de las cepas Gif33/pVICAT y Gif33/pVIC40 seleccionadas como se describió anteriormente, y se confirmó que los plásmidos objetivos se amplificaron respectivamente en cada cepa. <2> Cultivo de una cepa que alberga un plásmido para amplificación del operón de treonina a partir del cual se removió el atenuador y medición de la actividad de homoserina deshidrogenasa Se amplificó el transformante Gif33/pVICAT3 en el cual el plásmido pVICAT3 que contenía un operón de treonina sin el atenuador y el transformante Gif33/pVIC40 en el cual pVIC40 que contenía un atenuador de tipo silvestre se amplificó se cultivaron respectivamente como se describe a continuación, y se midieron las actividades de homoserina deshidrogenasa (en adelante referida como HD) en cada cepa. Las células de Gif33/pVIC40 y Gif33/pVICAT3 pre-cultivadas en el medio LB que contenía 20 g/ml de estreptomicina se cultivaron respectiva'mente en un medio para producción que contenía 40 g de glucosa, 16 g de sulfato de amonio, 1 g de monofosfato de potasio, 0.01 g de sulfato ferroso heptahidratado, 0.01 g de cloruro de manganeso tetrahidratado, 2 g de extracto de levadura, 1 g de sulfato de magnesio hepíahidratado, 50 mg o 250 mg de isoleucina y 30 g de carbonato de calcio por 1 L de agua pura (ajustado a pH 7.0 con KOH) a 37°C por 22 a 27 horas con agitación a aproximadamente 115 rpm. Después del término del cultivo, las células se recolectaron a partir del medio, y la actividad HD se midió de conformidad con el método descrito en Truffa-Bachi P., Le Bras G, Cohén GN., Biochem. Biophys. Acta., 128: 450 (1966), en el cual la solución de enzima sin purificar se añadió a la mezcla de reacción que contenía Tris-HCI 200 mM (pH 9.0), KCI 500 mM, L-homoserina 25 mM y NADP 0.8 mM, y se midió el incremento de absorbancia a 340 nm. Como un control, se utilizó la solución de reacción que contenía agua en lugar de homoserina. La solución de enzima sin purificar se preparó mediante la separación de las células a partir del medio anteriormente mencionado por centrifugación, lavado de las células con regulador de pH KP 0.1 M (DTT 0.01 M, pH 7.0), luego fragmentando las células mediante ultrasonicación, y luego removiendo las células no fragmentadas mediante centrifugación. Las proteínas en la solución de enzima sin purificar se cuantificaron con Ensayo de Proteína (Bio-Rad) utilizando albúmina de suero de bovino como un estándar. Los resultados se muestran en el cuadro 1.

CUADRO 1 Como un resultado, no se observó diferencia en la actividad enzimática de HD entre las cepas Gif33/pVICAT y Gif33/pVIC40. Este resultado demuestra que la expresión del operón de treonina no se incrementó solamente como un resultado de la remoción del atenuador.

EJEMPLO 2 Construcción y evaluación de una cepa que tiene un operón de treonina a partir del cual se remueve un segmento diferente de la secuencia que incluye el atenuador y la secuencia líder <1> Construcción de un plásmido para la remoción del atenuador y la secuencia líder Como se describió anteriormente, la atenuación ocasionada mediante la adición de ¡soleucina no pudo ser liberada como un resultado de la remoción del atenuador. Por lo tanto, se intentó la remoción de no solamente el atenuador, sino también de la secuencia líder. Primero, la PCR se llevó a cabo mediante el uso de pVIC40 como un molde para obtener un fragmento que tenía un promotor y la región subsecuente. La PCR se llevó a cabo mediante el uso del oligonucleótido que se muestra en SEQ ID NO: 9, el cual es complementario a una secuencia localizada en una región hacia el extremo 5' del promotor, y cualesquiera de los oligonucleótidos que tienen las secuencias de SEQ ID NOS: 10 a 14. Cada uno de los fragmentos de ADN obtenidos se purificaron de manera convencional y se ligaron a pHSG398 (Takara Bio), el cual había sido digerido con Hincll. Por lo tanto, se obtuvieron un plásmido pHPBthr el cual contiene un fragmento amplificado con los oligonucleótidos de SEQ ID NOS: 9 y 10, un plásmido pHPCthr el cual contiene un fragmento amplificado con los oligonucleótidos de SEQ ID NOS: 9 y 11 , un plásmido pHPDthr el cual contiene un fragmento amplificado con los oligonucleótidos de SEQ ID NOS: 9 y 12, un plásmido pHPEthr el cual contiene un fragmento amplificado con los oligonucleótidos de SEQ ID NOS: 9 y 13, y un plásmido pHPFthr el cual contiene un fragmento amplificado con los oligonucleótidos de SEQ ID NOS: 9 y 14. Posteriormente, estos cinco plásmidos se digirieron con las enzimas de restricción Hindlll y BamHI, y los fragmentos obtenidos que contenían la región hacia el extremo 5' de thrA se introdujeron dentro de un pBR322 digerido con HindIII-BamHI (Nippon Gene) para obtener los plásmidos pBRBthr, pBRCthr, pBRDthr, pBREthr y pBRFthr. Posteriormente, el plásmido anteriormente mencionado pBRAT3, el cual es para amplificación del operón de treonina que carece del atenuador, se digirió con Xbal y BamHI, y el fragmento obtenido que contenía thrABC se introdujo dentro de un pBRBthr, pBRCthr, pBRDthr, pBREthr y pBRFthr digerido con Xbal-BamHI para obtener los plásmidos pBAT3, pCAT3, pDAT3, pEAT3 y pFAT3, cada uno de los cuales porta el operón de treonina a partir del cual se removió un segmento diferente de una secuencia incluyendo las secuencias líderes y el atenuador. Los fragmentos obtenidos mediante la digestión de los plásmidos pBAT3, pCAT3, pDAT3, pEAT3 y pFAT3 con PstI y BamHI se introdujeron cada uno dentro del sitio Pstl-BamHI de pVIC40, resultando en los plásmidos pBAT3, pCAT3, pDAT3, pEAT3 y pFAT3 (figura 2). Los plásmidos obtenidos pBAT3, pCAT3, pDAT3, pEAT3 y pFAT3 son autónomamente replicables en Escherichia col¡, y se removieron completamente el atenuador y la secuencia líder de la región de atenuación, mientras que se removió en diferentes grados una secuencia hacia el extremo 5' de la secuencia líder. Es decir, la secuencia que tiene los nucleótidos números 188 a 310 de SEQ ID NO: 1 se removió en pBAT3, la secuencia que tiene los números del secuencia de nucleótidos 178 a 310 se removió en pCAT3, la secuencia que tiene los números del secuencia de nucleótidos 168 a 310 se removió en pDAT3, ia secuencia que tiene los números del secuencia de nucleótidos 158 a 310 se removió en pEAT3, y la secuencia que tiene los números del secuencia de nucleótidos 148 a 310 se removió en pFAT3. < 2 > Construcción y evaluación de las cepas introducidas con cada plásmido para la remoción de la región de atenuación Para algunos de los plásmidos obtenidos, se evaluó la efectividad de la remoción de la secuencia líder y del atenuador. Los piásmidos pDAT3 y pFAT3 cada uno careciendo de una longitud de secuencia diferente incluyendo la secuencia líder y el atenuador y el plásmido control pVIC40 se introdujeron respectivamente dentro de una cepa G¡f33 deficiente en HD, y los transformantes se seleccionaron para resistencia a estreptomicina. Las cepas introducidas con los piásmidos pDAT3 o pFAT3 se designaron Gif33/pDAT3 o Gif33/pFAT3, respectivamente. Los piásmidos se extrajeron a partir de Gif33/pDAT3, Gif33/pFAT3, y el control Gif33/pVIC40 y se confirmó que los piásmidos obtenidos se amplificaron en cada cepa. Estos transformantes se cultivaron mediante el método descrito en <2> del ejemplo 1 , y se midió la actividad HD. Los resultados se muestran en el cuadro 2.

CUADRO 2 La actividad HD disminuyó a aproximadamente un sexto en la presencia de isoleucina en la cepa Gif33/pVIC40, la cual contiene un operón de treonina amplificado con una región de atenuación de tipo silvestre. En las cepas Gif33/pDAT3 y Gif33/pFAT3, las cuales tienen el operón de treonina amplificado que carece del atenuador y del la secuencia líder, la actividad HD no disminuyó en la presencia de cepas de isoleucina. A partir de los resultados del ejemplo 1 y del ejemplo 2, las cepas Gif33/pDAT3 y Gif33/pFAT3 que albergan un plásmido para amplificación del operón de treonina que carece del atenuador así como de la secuencia líder no se afectaron por la atenuación ocasionada mediante la adición de isoleucina. La actividad HD de la cepa Gif33/pDAT3 fue de 17.7 nanomoles/minuto/mg en la ausencia de isoleucina, la cual fue más baja que la actividad de HD, 20.0 nanomoles/minuto/mg, de la cepa control Gif33/pVIC40. No obstante, se piensa que esto se debe a la curación del plásmido durante el cultivo. Posteriormente, la cepa TDH6 (Patente Japonesa No. 3239903) obtenida mediante la curación de pVIC40 a partir de VKPMB-3996 productora de L-treonina se transformó con cada uno de los plásmidos pBAT3, pCAT3, pDAT3, pEAT3, pFAT3 el cual porta un operón de treonina con secuencia para liberación de atenuación o con el plásmido control pVIC40, y los transformantes se seleccionaron para la resistencia a estreptomicina. La cepa TDH6 ha sido modificada de manera que es deficiente en la actividad de la treonina deshidrogenasa mediante inserción del transposón Tn5 (Patente Japonesa abierta al público No. 2001-346578). La cepa TDH6 se depositó en the Research Institute of Genetics and Selection of Industrial Microorganism (VNII Genetika, Dirección: Dorozhny proezd 1, Moscú 113545, Rusia) el 15 de agosto de 1987 con un número de registro de VKPM B-3420. Las cepas introducidas con los plásmidos pBAT3, pCAT3, pDAT3, pEAT3, pFAT3 o pVIC40 se designaron cepa TDH6/pBAT3, cepa TDH6/pCAT3, cepa TDH6/pDAT3, cepa TDH6/pEAT3, cepa TDH6/pFAT3 o cepa TDH6/pVIC40, respectivamente. Los plásmidos se extrajeron a partir de los transformantes seleccionados como se describió anteriormente y se confirmó que los plásmidos objetivos se amplificaron en cada cepa. Estos transformantes se cultivaron mediante el método descrito en <2> de ejemplo 1 , y se midieron sus capacidades productoras de L-treonina en la presencia o ausencia de isoleucina. Después del término del cultivo, la cantidad de L-treonina acumulada en cada caldo de cultivo se analizó mediante cromatografía líquida para diluir apropiadamente e! caldo de cultivo. Estos resultados se muestran en el cuadro 3. Para cada transformante, la cantidad de L-treonina producida se representa como valores relativos con respecto a la cantidad de L-treonina producida en la ausencia de isoleucina, la cual se tomó como 100. CUADRO 3 Mientras que la producción de treonina disminuyó a 55% en la presencia de L-isoleucina en comparación con la producción obtenida en la ausencia de isoleucina en la cepa TDH6/pVIC40, las producciones obtenidas con la cepa TDH6/pDAT3, cepa TDH6/pEAT3 y cepa TDH6/pFAT3 en la presencia de isoleucina en el medio fueron de 76%, 320% y 79%, respectivamente. Es decir, la cantidad de L-treonina producida en la presencia de isoleucina disminuyó ligeramente, o incluso se incrementó. Por lo tanto, se demostró que con la secuencia que carece del atenuador y la secuencia líder de la región de atenuación, no se presenta la atenuación del operón de treonina, y se mejoró la producción de L-treonina, en la presencia de concentraciones elevadas de L-isoleucina. Como se muestra en el cuadro 3 para la cepa TDH6/pCAT3, la cantidad de L-treonina producida en la presencia de L-isoleucina fue de 39%, en relación con la cantidad producida en la ausencia de isoleucina, la cual fue menor que el valor de la cepa control TDH6/pVIC40. No obstante, se piensa que este valor menor fue un resultado del la curación del plásmido, y que la cantidad de L-treonina producida realmente se Incrementa en esta cepa debido a la eliminación de la atenuación.

EJEMPLO 3 Construcción de una cepa en la cual se remueven el atenuador y la secuencia líder a partir de su operón cromosomal de treonina y evaluación de la producción de treonina de la cepa <1 > Construcción del gen thrC introducido en la cepa TDH6 La secuencia tipo liberación de atenuación derivada a partir del plásmido pDAT3 se introdujo dentro de un cromosoma, y se determinó el efecto de la misma. La cepa TDH6, una cepa productora de L-treonina, carece de este gen, el cual codifica a la treonina sintasa. Por lo tanto, la cepa TDH6 que tiene un thrC de tipo silvestre se obtuvo mediante un método convencional utilizando transduccion de Pl mediante el uso de una cepa de Escherichia coli de tipo silvestre W31 10 (ATCC 27325) como una bacteria dominante. Específicamente, esta cepa se obtuvo como sigue. Un cultivo de Escherichia coli cepa W31 10 y una dilución del fago Pl se añadieron juntos a un medio de agar suave mantenido a una cierta temperatura, y el medio se extendió sobre una placa de LB. Después de que el medio se solidificó, las células se cultivaron a 37°C por 6 a 7 horas para permitir que el fago forme placas, y luego se recolectaron los fagos. Los fagos recolectados se añadieron a la cepa receptora TDH6, y las células se dejaron reposar a 37°C por aproximadamente 20 minutos en la presencia de CaCI2 2.5 mM para permitir la adsorción de los fagos, luego se hicieron reaccionar con citrato de Na 10 mM a 37°C por aproximadamente 30 minutos para terminar la reacción de adsorción. La cepa TDH6 que carece de thrC no puede crecer en un medio mínimo sin treonina, mientras que una cepa introducida con thrC mediante transducción de Pl puede crecer en el medio mínimo. Posteriormente, la solución de reacción anteriormente mencionada se inoculo dentro de un medio mínimo que contenía 0.5 g de glucosa, sulfato de magnesio 2 mM, 3 g de monofosfato de potasio, 0.5 g de cloruro de sodio, 1 g de cloruro de amonio y 6 g de fosfato disódico por 1 L de agua pura. Se seleccionó una cepa a partir de una colonia crecida en el medio mínimo después de 24 horas como una cepa a la que se le introdujo un thrC y se designó como W13. < 2 > Construcción de un plásmido para la introducción de un operan de treonina que tiene una secuencia tipo atenuación de liberación dentro de un cromosoma El plásmido pDAT3 que porta un operón de treonina que carece del atenuador y de la secuencia líder de la región de atenuación (que carece de la región que tiene los número de nucleótidos 168 a 310 en SEQ ID NO: 1) se digirió con Hindlll y Pvull, y el fragmento obtenido que contenía el promotor, región de atenuación truncada, y thrA se introdujo dentro de un plásmido pUC18 digerido con Hindlll-Hincll (obtenido a partir de Takara Bio) para construir un plásmido pUC18D.

Luego, para llevar a cabo la recombinación homologa, la secuencia hacia el extremo 5' del promotor del operón cromosomal de treonina se clonó mediante PCR como se muestra en la figura 3. Específicamente, se clonó el ADN que tiene los nucleótidos números 4454 a 6127 en la secuencia del número de registro GENBANK AE000510. De manera que se utilizó el iniciador hacia 5', un oligonucleótido que corresponde a una región que abarca tanto el 4458° A como el 4469° C, y reemplazando el 4458° A con T, y el 4469° C con T para la introducción de sitios HindIII y EcoRi. Como el iniciador hacia 3', se utiliza un oligonucleótido complementario a una región en el extremo de 3' del sitio HindIII (nucleótidos números 6122 a 6127) en la secuencia del número de registro GENBANK AE000510. Mediante el uso de estos iniciadores, se obtuvo un fragmento de la región hacia el extremo 5' del promotor del operón de treonina. Este fragmento se digirió con HindIII y se insertó dentro del sitio HindIII de pUC18D para construir un plásmido pUC18DD. Posteriormente, se construyó un plásmido sensible a la temperatura para la introducción de una mutación dentro de un cromosoma. pBR322 (obtenido a partir de Nippon Gene) se digirió con HindIII y Pstl y el fragmento obtenido se introdujo entre el sitio HindIII y el sitio Pstl de pMAN031 (Yasueda, H. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 36, 211 (1991 )) para construir un pTSI sensible a la temperatura. Luego, se construyó el plásmido pTS2 que tenía reemplazado el gen de resistencia al antibiótico. Es decir, el GenBlock de tetraciclina (obtenido a partir de Amersham) se insertó dentro del sitio Seal dentro del gen para resistencia a ampicilina de pTSI para construir un plásmido sensible a la temperatura pTS2. Posteriormente, se construyó un plásmido sensible a la temperatura para la introducción de un operón de treonina que tiene una secuencia tipo liberación de atenuación dentro de un cromosoma como sigue. El pUC18DD se digirió con EcoRI, y se introdujo el fragmento obtenido que tiene una secuencia que abarca el extremo 5' y el extremo 3' de la región de atenuación del operón de treonina dentro del sitio EcoRI de pTS2 para construir un plásmido pTS2DD para recombinación homologa. <3> Construcción de una cepa que tiene un operón de treonina que tiene una secuencia tipo liberación de atenuación en un cromosoma El plásmido sensible a la temperatura pTS2DD se introdujo dentro de la cepa W13, es decir, la cepa TDH6 a la que se le introdujo thrC. La cepa W13 se transformó con el plásmido sensible a la temperatura pTS2DD, y las colonias se seleccionaron a 30°C en una placa de LB + tetraciclina. La clona seleccionada se cultivó durante la noche a 30°C, y el caldo de cultivo se diluyó 103 veces y se inoculó en una placa de LB + tetraciclina para seleccionar colonias a 42°C. La clona seleccionada se sembró en una placa de LB + tetraciclina, cultivada a 30°C, posteriormente se transfirió dentro de un medio líquido y se cultivó a 42°C por 4 a 5 horas con agitación. El caldo de cultivo se diluyó de manera adecuada y se inoculó en una placa de LB. Se seleccionaron varios cientos de colonias entre las colonias obtenidas y se inocularon en una placa de LB así como una placa de LB + tetraciclina, y se seleccionaron las cepas sensibles a tetraciclina. Se llevó a cabo la PCR de la colonia para varias cepas sensibles a tetraciclina para confirmar si había sido introducido el operón de treonina que tiene una secuencia tipo liberación de atenuación. De esta manera, se construyó la cepa W13112, la cual es una cepa obtenida mediante la introducción de thrC y el operón de treonina tipo atenuación de la liberación dentro de TDH6. En la operación anteriormente mencionada, también se obtuvo la cepa W1325 que tenía una región de atenuación de tipo silvestre en cromosoma, excepto que se introdujo thrC. < 4 > Evaluación de la producción de L-treonina por la cepa introducida con un operón de treonina que tiene una secuencia tipo liberación de atenuación en el cromosoma La cepa W13112 que carece de la secuencia líder y del atenuador en la región de atenuación del operón de treonina cromosomal, y la cepa W1325 control que tiene un operón de treonina con una región de atenuación de tipo silvestre se cultivaron respectivamente mediante el método descrito en el ejemplo <2> de 1. La concentración de L-treonina producida se midió mediante el método descrito en el ejemplo <2> de 2. Para cada transformante, la cantidad de L-treonina producida en la presencia de isoleucina se indica como relativa con respecto a la cantidad de L-treonina producida en la ausencia de isoleucina, la cual se tomó como 100. Los resultados se muestran en el cuadro 4. CUADRO 4 En la cepa W13112 en la cual un operón de treonina cromosomal tiene una secuencia tipo liberación de atenuación, la cantidad de L-treonina acumulada en la presencia de isoleucina fue elevada en comparación con la cepa control, y por lo tanto se demostró que la producción de L-treonina fue escasamente afectada por la isoleucina añadida al medio en la cepa que tiene un operón de treonina cromosomal con un tipo de secuencia relacionada con la atenuación.

EJEMPLO 4 Construcción y evaluación de la cepa en la cual se introduce un operón de treonina que tiene una secuencia tipo liberación de atenuación en un cromosoma y el cual también alberga un plásmido que contiene un operón de treonina de tipo silvestre Como se muestra en el ejemplo 3, en la cepa en la cual se reemplazó el operón de treonina cromosomal por aquel con una secuencia tipo liberación de atenuación, la cantidad de L-treonina acumulada no disminuyó incluso en la presencia de concentraciones elevadas de isoleucina. Posteriormente, el plásmido pVIC40 que contenía un operón de treonina que tiene una región de atenuación de tipo silvestre se introdujo dentro de una cepa W13112 con el objeto de confirmar el efecto de la remoción de la región de atenuación a partir de un operón de treonina cromosomal. W13112 se transformó con pVIC40, y los transformantes se seleccionaron para resistencia a estreptomicina. Un transformante seleccionado como una cepa amplificada de pVIC40 se designó W13112/pVIC40, y se extrajeron los plásmidos. Se confirmó que el plásmido objetivos se amplificó en la cepa. De conformidad con el método descrito en el ejemplo <2> de 1 , se midió la capacidad productora de L-treonina de la cepa W13112/pVIC40 y se comparó con aquella de la cepa control TDH6/pVIC40 que contenía el operón de treonina cromosomal de tipo silvestre. Para cada transformante, la cantidad de L-treonina producida se representa como relativa con respecto a la cantidad de L-treonina producida en la ausencia de isoleucina, la cual se toma como 100. Los resultados se muestran en el cuadro 5.

CUADRO 5 En la cepa TDH6/pVIC40 que tiene una región de atenuación de tipo silvestre del operón de treonina cromosomal, la cantidad de treonina producida se redujo marcadamente con la adición de isoleucina. Contrariamente, en la cepa W13112/pVIC40 en la cual el operón de treonina cromosomal fue del tipo de liberación de atenuación, la reducción en la cantidad de treonina producida en la presencia de isoleucina fue menos significativa en comparación con la cepa TDH6/pVIC40.

EJEMPLO 5 Medición de la capacidad productora de L-isoleucina de un operón de treonina introducido en una cepa que tiene una secuencia tipo liberación de atenuación en el cromosoma <1> Establecimiento de una cepa productora de L-isoleucina a partir de la cepa W13112/pVIC40 y evaluación de la misma La L-isoleucina se produce vía L-treonina como un precursor, y por lo tanto, se puede obtener una cepa productora de L-isoleucina mediante la mejoría de las actividades de las enzimas biosintéticas de L-isoleucina en una bacteria productora de L-treonina (Patente Japonesa abierta al público Nos. 09-121872 y 2002-051787). 'Por lo tanto, con el objeto de mejorar las actividades de las enzimas biosintéticas de L-isoleucina, se introdujo el plásmido pMWD5 para la modificación de genes para las enzimas biosintéticas de la L-isoleucina dentro de la cepa TDH6/pVIC40 y de la cepa W13112/pVIC40 utilizada en el ejemplo 5, respectivamente. El plásmido pMWD5 contiene un operón de isoleucina en el cual está deletada la región requerida para la atenuación del mismo operón de isoleucina (Patente Japonesa abierta al público No. 09-121872). El plásmido pMWD5 se introdujo dentro de cada una de las cepas de TDH6/pVIC40 y W13112/pVIC40 mediante transformación como se describe en el ejemplo 5, y los transformantes se seleccionaron para resistencia a ampicilina. La cepa TDH6/pVIC40 que tenía pMWD5 se designó TDH6/pVIC40 pMWD5, y la cepa W13112/pVIC40 que tenía pMWD5 se designó W31112/pVIC40 pMWD5. <2> Evaluación de la capacidad productora de L-isoleucina de la cepa a la que se le introdujo un operón de treonina que tiene una secuencia tipo liberación de atenuación en un cromosoma Los plásmidos se extrajeron a partir de la cepa TDH6/pVIC40 pMWD5 y de la cepa W31112/pVIC40 pMWD5 y se confirmó que los plásmidos objetivos se amplificaron en cada cepa. Las células de la cepa TDH6/pVIC40 pMWD5 y de la cepa W31112/pVIC40 p WD5 se pre-cultivaron en el medio LB que contenía 20 µ?/??? de estreptomicina se cultivaron respectivamente en medio para producción de L-isoleucina que contenía 40 g de glucosa, 16 g de sulfato de amonio, 1 g de monofosfato de potasio, 0.01 g de sulfato ferroso heptahidratado, 0.01 g de cloruro de manganeso tetrahidratado, 2 g de extracto de levadura, 1 g de sulfato de magnesio heptahidratado y 30 g de carbonato de calcio por 1 L de agua pura (ajustado a pH 7.0 con KOH) a 37°C por 22 a 27 horas con agitación a aproximadamente 115 rpm. Después del término del cultivo, se analizó la cantidad de L-treonina la cual se acumuló en cada caldo de cultivo para diluir apropiadamente el caldo de cultivo mediante cromatografía líquida. Los resultados se muestran en el cuadro 6. La producción de L-isoleucina obtenida con la cepa W13112/pVIC40 pMWD5, la cual fue una cepa introducida con un operón de treonina que tenía una secuencia tipo liberación de atenuación en un cromosoma, se mejoró en comparación con la cepa control TDH6/pVIC40 pMWD5, y por lo tanto se demostró que la remoción de la región de atenuación a partir del operón de treonina también fue efectiva para la producción de L-isoleucina.

CUADRO 6 Aplicabilidad industrial De conformidad con la presente invención, la producción de L-treonina y/o L-isoleucina se pueden mejorar durante la fermentación utilizando una bacteria que pertenece al género Escheríchia. Además, ia presente invención provee un método para la producción de una bacteria novedosa productora de L-treonina y/o L-isoleucina.

Claims (9)

54 NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Una bacteria que pertenece al género Escherichia y que tiene una capacidad para producir L-treonina o L-isoleucina, en donde dicha bacteria tiene un operón de treonina, y en donde la expresión de dicho operón se dirige por un promotor nativo, y en donde al menos una secuencia líder y un atenuador han sido removidos a partir de dicho operón, de manera que se libera la atenuación.

2. - La bacteria de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicho operón de treonina se encuentra en un plásmido.

3. - La bacteria de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicho operón de treonina se encuentra en un cromosoma.

4. - La bacteria de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la cual tiene una capacidad para producir L-isoleucina, y en donde se mejora una actividad de una enzima biosintética de L-isoleucina.

5. - Un operón de treonina que comprende una región implicada en la atenuación, un promotor nativo, y genes estructurales de thrABC, en 55 donde al menos la secuencia líder y la secuencia del atenuador se remueven a partir de la región implicada en la atenuación.

6. - El operón de treonina de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, a partir de la cual se ha deletado al menos la secuencia que corresponde a los nucleótidos números 188 a 310.

7. - El operón de treonina de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, a partir de la cual se ha deletado al menos la secuencia que corresponde a los nucleótidos números 168 a 310.

8. - El operón de treonina de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 1 , a partir de la cual se ha deletado al menos la secuencia que corresponde a los nucleótidos números 148 a 310.

9.- Un método para producir L-treonina o L-isoleucina que comprende cultivar la bacteria que se define en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en un medio, y recolectar la L-treonina o L-isoleucina acumulada a partir del medio.