TRATAMIENTO TERAPÉUTICO
Campo de la Invención La presente invención se refiere a una combinación que comprende candesartan y rosuvastatina. La presente invención se refiere además a composiciones farmacéuticas que comprenden la combinación mencionada anteriormente. La presente invención también se refiere al uso de una combinación mencionada anteriormente en la prevención o tratamiento de la aterosclerosis. Antecedentes de la Invención La aterosclerosis es un padecimiento portado por procesos patológicos complejos los cuales dan como resultado un depósito de lípidos distribuidos de manera irregular en las arterias y es un factor contribuyente mayor para la enfermedad coronaria del corazón. Por lo tanto, una reducción en la aterosclerosis es un objetivo principal para reducir el número de eventos cardiovasculares, por ejemplo, infartos al miocardio, agravación de la angina, paro cardiaco, ataques, falla congestiva del corazón y la muerte cardiovascular. La dislipidemia, particularmente el nivel en la sangre aumentado de la lipoproteína de baja densidad (LDL) es uno de los factores de riesgo principales de la aterosclerosis. Los estudios clínicos han demostrado que reduciendo el nivel LDL con inhibidores de reductasa de la coenzima A 3-hidroxi-3-metilglutaril (HMG CoA), generalmente conocidos como estatinas, se tiene como resultado un riesgo más bajo de los eventos cardiovasculares. La activación del sistema de angiotensina-renina (RAS) puede ser considerada otro factor de riesgo importante en la aterosclerosis. La activación del RAS con la formación de angiotensina (II) (A (II)) y la activación de los receptores A (II) ha estado implicada en la aterogénesis, la ruptura de las placas, la disfunción isquémica del miocardio y la falla congestiva del corazón (Singh y Menta, Arch Intern Med, 2003, vol 163, páginas 1296 a 1304). La Solicitud de Patente Internacional WO 95/26188 describe el tratamiento de la aterosclerosis con bloqueadores del receptor A ( 11 ) , opcionalmente en combinación con inhibidores de reductasa HMGCoA. La Solicitud de Patente Internacional WO 01/76573 describe el uso de una combinación de por lo menos dos antagonistas de A(ll), un inhibidor de ACE (enzima de conversión de angiotensina) y un inhibidor de reductasa HMGCoA para la prevención o demora del progreso de una lista de padecimientos, entre los cuales se encuentra la aterosclerosis. Hemos descubierto sorpresivamente que la combinación de candesartan antagonista A(ll) y la rosuvastatina inhibidor de reductasa HMGCoA tiene un efecto sinérgico en la reducción de la aterosclerosis. El efecto sinérgico parece originarse de la inhibición sinérgica de la expresión de un número de portadores inflamatorios comprendidos en el RAS (por ejemplo, CD40, metaloproteinasas (MMPs)) y/o la inhibición de la expresión del receptor LOX-1 (el cual es un receptor para el LDL oxidado en las células del endotelio). El efecto sinérgico proporciona una evidencia fuerte para el diálogo cruzado entre el RAS y la dislipidemia en la aterogénesis. Se podrá apreciar que la actividad de los MMPs puede ser regulada in-vivo por sus inhibidores de tejidos (TlMPs). También hemos mostrado que la expresión del TIMP-1 y TIMP-2 es activada por una dieta alta en colesterol y atenuada de manera importante, por la combinación de candesartan y rosuvastatina. Estos datos le dan crédito al concepto de que el resto entre los MMPs y TlMPs es alterado por una dieta alta en colesterol y que este desequilibrio puede ser "normalizado" mediante una combinación de un antagonista ( 11 ) y un agente de disminución de lípidos. Sumario de la Invención En un aspecto de la presente invención se proporciona una combinación que comprende candesartan o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y rosuvastatina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, para la prevención o tratamiento de la aterosclerosis.
En un aspecto de la presente invención se proporciona una combinación que comprende candesartan o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y rosuvastatina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, para la prevención de eventos cardiovasculares. Dicha combinación también puede ser útil en el tratamiento o prevención de otras enfermedades asociadas con estos portadores, por ejemplo, en enfermedades o padecimientos inflamatorios, tales como lesión por reperfusión isquémica (al corazón, cerebro, ríñones, pulmones e hígado), lesión inducida por radiación, lesión de quemaduras y una enfermedad vascular periférica. El candesartan puede estar de manera adecuada en la forma de candesartan o como un profármaco de candesartan cilexetil. Estas formas pueden ser formuladas con un agente adicional tal como un diurético, tal como hidroclorotiazida (por ejemplo, comercializada como Atacand Plus™). En la presente descripción en donde nos referimos al candesartan, este incluye tanto el candesartan como el candesartan cilexetil. De preferencia, la sal de calcio de rosuvastatina, a la cual nos podemos referir como calcio de rosuvastatina, es utilizada en diferentes aspectos de la presente invención. En general, las sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales de adición ácida, tales como metanosulfonato, tosilato, a-glicerof osfato, fumarato, clorhidrato, citrato, maleato, tartrato y (menos preferentemente) hidrobromuro. Las sales farmacéuticamente aceptables en general también incluyen sales formadas con ácido fosfórico y sulfúrico. Las sales farmacéuticamente aceptables generalmente incluyen sales básicas, tales como sal de metal alcalino, por ejemplo, sodio, sal de metal de tierra alcalina, por ejemplo, calcio o magnesio, una sal de amina orgánica, por ejemplo, trietilamina, morfolina, N-metilpiperidina, N-etilpiperidina, procaina, dibencilamina, ?,?-dibenciletilamina, tris-(2-hidroxiet¡l)amina, tris(h¡droximet¡l)metilamonio, N-metil d-glucamina y aminoácidos, tales como lisina. Pueden existir más de un catión o anión dependiendo del número de funciones cargadas y la valencia de los cationes o aniones. En la presente descripción, en donde se utiliza el término "combinación" deberá quedar entendido que se refiere a la administración simultánea, separada o consecutiva. En un aspecto de la presente invención "combinación" se refiere a la administración simultánea. En otro aspecto de la presente invención, la palabra "combinación" se refiere a la administración separada. En un aspecto adicional de la presente invención, la palabra "combinación" se refiere a la administración consecutiva. Donde la administración es consecutiva o separada, la demora en la administración del segundo componente debe ser tal que ambos agentes estén presentes en el cuerpo como para producir el efecto sinérgico de la combinación. En un aspecto adicional de la presente invención se proporciona una composición farmacéutica la cual comprende candesartan o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y rosuvastatina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, en asociación con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable para uso en la prevención o tratamiento de la aterosclerosis. En un aspecto adicional de la presente invención se proporciona una composición farmacéutica la cual comprende candesartan o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y rosuvastatina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, en asociación con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable para utilizarlo en la prevención o reducción del riesgo de eventos cardiovasculares. Las composiciones aquí descritas pueden ser en una forma adecuada para la administración oral, por ejemplo, como una tableta o cápsula, para la inyección parenteral (incluyendo inyección intravenosa, subcutánea, intramuscular, ¡ntravascular o infusión), por ejemplo, como una solución estéril, suspensión o emulsión, para la administración tópica, por ejemplo, como un ungüento o crema, para la administración rectal, por ejemplo, en la forma de un supositorio o la ruta de administración puede ser mediante la inyección directa dentro del tumor o mediante la administración regional o administración local. En otras modalidades de la presente invención los compuestos del tratamiento de combinación pueden ser administrados endoscópicamente, intra-raquídeamente, intralesionalmente, percutáneamente, intravenosamente, subcutáneamente, intraperitonealmente o intratumoralmente. En general las composiciones aquí descritas pueden ser preparadas de una manera convencional utilizando excipientes o vehículos convencionales que son bien conocidos en la técnica. Los excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables para una formulación de tabletas incluyen, por ejemplo, excipientes inertes, tales como lactosa, carbonato de sodio, fosfato de calcio o carbonato de calcio, agentes de granulación y desintegración, tales como almidón de maíz o ácido algínico; agentes de enlace, tales como gelatina o almidón; agentes lubricantes, tales como estearato de magnesio, ácido esteárico o talco; agentes conservadores, tales como etil o propil 4-hidroxibenzoato y anti-oxidantes, tales como ácido ascórbico. Las formulaciones de tabletas pueden no ser recubiertas o ser recubiertas, ya sea para modificar su desintegración y la absorción posterior del ingrediente activo dentro del aparato gastrointestinal o para mejorar su estabilidad y/o apariencia y en cualquier caso, utilizando agentes de recubrimiento convencionales y procedimientos bien conocidos en la técnica. Las. composiciones para uso oral pueden ser en la forma de cápsulas de gelatina dura en las cuales es mezclado el ingrediente activo con un excipiente sólido inerte, por ejemplo, carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolina, o como cápsulas de gelatina suave en las cuales el ingrediente activo es mezclado con agua y un aceite, tal como aceite de cacahuate, parafina líquida o aceite de oliva. El candesartan está disponible comercialmente como
"Atacand™" y "Atacand Plus™". El calcio de rosuvastatina se consigue comercialmente como "Crestor™". Las formulaciones adecuadas para la presente invención incluyen aquellas que se pueden conseguir en el mercado. Las dosis adecuadas de cada componente de la combinación son aquellas de los productos comercializados. Alternativamente, la sinergia entre los componentes puede permitir una dosificación menor de uno o ambos componentes que van a ser utilizados. Por ejemplo, puede ser utilizada una dosis de 4mg, 8mg, 16mg, 32mg, o hasta 160mg de candesartan en combinación con una dosis de 80mg, 40mg, 20mg, 10mg, 5mg, ó 2.5mg de rosuvastatina. Deberá quedar entendido que cualquiera de las dosis de candesartan pueden ser combinadas con cualquier dosis adecuada de rosuvastatina.
En un aspecto, se utilizan 80mg de rosuvastatina. En otro aspecto, se utilizan 40mg de rosuvastatina. En un aspecto adicional, se utilizan 20mg de rosuvastatina. En un aspecto todavía adicional, se utilizan 10mg de rosuvastatina. En un aspecto adicional, se utilizan 5mg de rosuvastatina. En un aspecto adicional, se utilizan 2.5mg de rosuvastatina. En un aspecto, se utilizan entre 32mg y 160mg, tal como aproximadamente de 64 a 128mg, por ejemplo, de 64 a 112mg, tal como aproximadamente de 64 a 96mg de candesartan. De manera conveniente, se utilizan aproximadamente de 72mg de candesartan. En otro aspecto, se utilizan 32mg de candesartan. En un aspecto adicional se utilizan 16mg de candesartan. En un aspecto adicional, se utilizan 8mg de candesartan. En un aspecto adicional, se utilizan 4mg de candesartan. Se podrá apreciar que la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención incluye una composición que comprende candesartan o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y rosuvastatina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma y un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Dicha composición, por ejemplo, en una sola formulación oral proporciona de manera conveniente un producto terapéutico de combinación de la presente invención para la administración simultánea en la prevención o tratamiento de la aterosclerosis.
Preferentemente los dos componentes de la combinación son administrados ambos por la ruta oral. Preferentemente los dos componentes de la combinación son administrados como una sola formulación oral. Preferentemente la combinación es formulada para una dosis de una vez al día. Convenientemente, la combinación es formulada como una sola tableta o cápsula. Las dosificaciones y programas descritos anteriormente pueden ser variados de acuerdo con la condición particular de la enfermedad y el padecimiento general del paciente. Por ejemplo, puede ser necesario o deseable reducir la dosis mencionada anteriormente de los componentes del tratamiento de combinación con el objeto de reducir la toxicidad. Las dosificaciones y programas también pueden variar si, además de un tratamiento de combinación de la presente invención, se están utilizando uno o más agentes quimioterapéuticos adicionales. La programación puede ser determinada por el doctor quien está tratando al paciente particular utilizando su capacidad y conocimiento profesional.
Una composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención también incluye composiciones separadas que comprenden una primera composición que comprende candesartan o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable, y una segunda composición que comprende rosuvastatina o una sal farmacéuticamente aceptable y un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Dicha composición proporciona de manera conveniente la combinación terapéutica de la presente invención para la administración consecutiva o separada en la prevención o tratamiento sinérgico de la aterosclerosis, pero también pueden ser administradas las composiciones separadas de manera simultánea. En otro aspecto de la presente invención se proporciona una combinación que comprende candesartan o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y rosuvastatina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, para utilizarse como un medicamento para la prevención o tratamiento de la aterosclerosis. En otro aspecto de la presente invención se proporciona una combinación que comprende candesartan o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y rosuvastatina, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, para utilizarse como un medicamento para la prevención de eventos cardiovasculares. En otro aspecto de la presente invención se proporciona una combinación que comprende candesartan o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y rosuvastatina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, para utilizarse en la manufactura de un medicamento. En otro aspecto de la presente invención se proporciona una combinación que comprende candesartan o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y rosuvastatina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, para utilizarse en la manufactura de un medicamento para la prevención o tratamiento de la aterosclerosis. En otro aspecto de la presente invención se proporciona una combinación que comprende candesartan o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y rosuvastatina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, para utilizarse en la manufactura de un medicamento para la prevención de eventos cardiovasculares. En un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un método para prevenir o tratar la aterosclerosis en animales de sangre caliente, tales como el hombre, el cual comprende la administración de una combinación de candesartan o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y rosuvastatina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma. En un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un método para la prevención de eventos cardiovasculares en un animal de sangre caliente, tal como el hombre, el cual comprende la administración de una combinación de candesartan o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y rosuvastatina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma. De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un equipo que comprende una combinación de candesartan o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y rosuvastatina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, opcionalmente con instrucciones para utilizarse en la prevención o tratamiento de la aterosclerosis. De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un equipo, el cual comprende: a) candesartan en una primera forma de dosis unitaria; b) rosuvastatina en una segunda forma de dosis unitaria; y c) medios de un contenedor para contener dicha primera y segunda dosificaciones; y opcionalmente, d) con instrucciones para utilizarse en la prevención o tratamiento de la aterosclerosis. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona un método para inhibir la expresión del CD40 y/o metaloproteinasas (MMPs) administrando una combinación de candesartan o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y rosuvastatina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma. Las metaloproteinasas particulares son MMP-1, MMP-2 y MMP-9. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona un método de tratamiento de los pacientes ateroscleróticos mediante la inhibición de la expresión del CD40 y/o metaloproteinasas (MMPs) administrando una cantidad de una combinación de candesartan o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y rosuvastatina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, para la inhibición de expresión del CD40 y/o metaloproteinasas (MMPs). De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un método para normalizar el equilibrio entre los MMPs y TIMPS mediante la administración de una cantidad de una combinación de candesartan o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y rosuvastatina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona un método para la Inhibición de la expresión del LOX-1 mediante la administración de una combinación de candesartan o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y rosuvastatina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma. De acuerdo con otro aspecto de la presente Invención se proporciona un método de tratamiento para pacientes ateroscleróticos mediante la inhibición de la expresión de LOX- administrando una cantidad de una combinación de candesartan o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y rosuvastatina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma adecuada para la inhibición de la expresión del LOX-1. Descripción Detallada de la Invención Materiales y Métodos Modelo de Animales Cinco pares de ratones C57BL/6J y tres pares de ratones homozigos de bloqueo apo-E (en un fondo C57BL/6J) se obtuvieron de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Ellos fueron reproducidos mediante el acoplamiento de hermana-hermano y alojados en una habitación alumbrada de la 6:00 AM a las 6:00 PM y mantenidos a una temperatura de 21°C. Los ratones C57BL/6J (n = 10) continuaron una dieta regular por el período del estudio completo. Los ratones de bloqueo de apo-E fueron divididos en cuatro grupos. En el Grupo 1 (n = 10) a los animales se les proporcionó una dieta alta en colesterol (1% de colesterol) solo durante 12 semanas desde una edad de 6 semanas; en el Grupo 2 (n = 10) a los animales se les administró una dieta alta en colesterol con candesartan (1mg/kg/d) durante 12 semanas desde la edad de 6 semanas; en el Grupo 3 (n = 10) a los animales se les administró una dieta alta en colesterol con rosuvastatina (1mg/kg/d) durante 12 semanas desde una edad de 6 semanas; en el Grupo 4 (n = 10) a los ratones se les administró una dieta alta en colesterol con candesartan (1mg/kg/d) y rosuvastatina (1mg/kg/d) durante 12 semanas desde la edad de 6 semanas. Al final del tratamiento de 12 semanas, los ratones fueron sacrificados y sometidos a los estudios que se describen más adelante. Todos los procedimientos del experimento se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado de Animales y Uso de la Universidad de Arkansas para Ciencias Médicas. Análisis Cuantitativo de Placas Ateroscleróticas Al final del tratamiento de 12 semanas, 5 ratones de cada grupo fueron sacrificados y se separaron las aortas de los tejidos que las rodean. Después de la remoción de tejido graso adventicio, las aortas fueron abiertas longitudinalmente desde el arco de la aorta a la bifurcación ilíaca y fijadas en 10% de formalina durante 24 horas. Luego fueron enjuagadas brevemente las aortas en 70% de alcohol, teñidas con una solución de Sudan IV durante 15 minutos, diferenciadas en 80% en alcohol durante 20 minutos y lavadas en agua corriente durante 1 hora (Técnicas de Russell L. para estudiar la lesión aterosclerótica, Lab Inves. 1958; 7: páginas 42 a 47). Las aortas fueron montadas y fueron tomadas sus fotos con una cámara conectada al microscopio de disección. Las imágenes fueron analizadas por medio del software (Image Pro Plus, Media Cybernetics). Preparación del ARN v Análisis mediante RT-PCR AI final del tratamiento de 12 semanas, 5 ratones de cada grupo fueron sacrificados y las aortas fueron separadas (del arco de la aorta a la bifurcación ilíaca) de los tejidos que las rodean y almacenadas en hielo seco. Cada una de las aortas fue cortada en cuatro segmentos y dos de los cuales fueron utilizados para extraer el ARN total con un método de un solo paso de cloroformo ácido-guanidinio tiocianato-fenol, tal y como se describió anteriormente (27). Un microgramo del ARN total fue transcrito de manera inversa en cADN con oligo-dT (Promega, Madison, Wl, E.U.A.) y la transcripción inversa del virus de leucemia Maloney múrida (M-MLV) (Promega) a una temperatura de 42°C durante 1 hora. Dos microlitros del material de la transcripción inversa (RT) fueron amplificados con polimerasa de Taq ADN (Promega) y el par cebador específico para ratón LOX-1, CD40 ó MMPs (MMP-1, -2, -9). Para el LOX-1 del ratón, fueron utilizados el cebador directo: 5'-TTACTCTCCATGGTGGTGCC-3', el cebador inverso: 5'-AGCTTCTTCTGCTTGTTGCC-3'. Se realizaron 30 ciclos de reacción de cadena de polimerasa (PCR) a una temperatura de 94°C durante 40 segundos (desnaturalización), 55°C durante 1 minuto (recocido) y 72°C durante 1 minuto (extensión). El tamaño del producto de reacción de la cadena de polimerasa (PCR) tenía 193 pares básicos. Para el CD40 de ratón, fueron utilizados el cebador directo 5'-GTTTAAAGTCCCGGATGCGA-3" y el cebador inverso 5'-CTCAAGGCTATGCTGTCTGT-3'. Se realizaron 35 ciclos de reacción de cadena de polimerasa (PCR) a una temperatura de 94°C durante 1 minuto (desnaturalización), 55°C durante 1 minuto (recocido) y 72°C durante 1 minuto (extensión). El tamaño del producto PCR fue de 408 pares básicos. Para el MMP-1 de ratón, se utilizaron el cebador directo 5'-GGACTCTCCCATTCTTAATGA T-3' y el cebador inverso 5'-CCTCTTTCTGGATAACATCATCA AC-3'. Para el MP-2 de ratón, se utilizaron el cebador directo 5'-ATCAAGGGATCCAGGAGC-3' y el cebador inverso 5'-GCAGCGATGAAGATGATAG-3'. Para el MMP-9 de ratón, se utilizaron el cebador directo 5'-AGTTTGGTGTCGCGGAGCAC-3' y el cebador inverso 5'-TACATGAGCGCTTCCGGCAC-3'. Para todos los MMPs, se realizaron 35 ciclos de PCR a una temperatura de 94°C durante 1 minuto (desnaturalización), 58°C durante 1 minuto (recocido) y 75°C durante 1 minuto (extensión). Los tamaños del producto PCR fueron de 627, 718 y 753 pares básicos, respectivamente. Se utilizó un par de cebadores específico para la ß-actina como el gen de mantenimiento (cebador delantero: 5'- TTCTACAATGAGCTGCGTTG-3', cebador inverso: 5'-CACTGTGTTGGCATAGAGGTC-3'). Se utilizaron 30 ciclos en una temperatura de 94°C durante 30 segundos (desnaturalización), 55°C durante 1 minuto (recocido) y 72°C durante 1 minuto (extensión). El producto PCR tenía 560 pares básicos. La muestra del PCR de transcripción inversa (RT-PCR) amplificada fue visualizada en gel de agarosa al 1.5% utilizando bromuro de etidio. Preparación de la Proteína y Análisis mediante Western Blot Cada aorta de ratón fue cortada en cuatro segmentos. Dos de ellos fueron utilizados para extraer el ARN y los dos restantes fueron utilizados para extraer la proteína, tal y como se describió anteriormente (14). Brevemente, los tejidos de la aorta fueron homogenizados y Usados en regulador de lisis, luego centrifugados a 4000 rpm durante 10 minutos a una temperatura de 4°C. Las proteínas del lisato de las aortas (20 µ/carril) fueron separadas mediante SDS-PAGE al 10% y transferidas a membranas de nitrocelulosa. Después de la incubación en la solución de bloqueo (5% de leche sin grasa, Sigma), se incubaron las membranas con una dilución 1:750 de anticuerpo monoclonal para el LOX-1 de ratón, una dilución 1:500 del anticuerpo policlonal para el CD40 de ratón (Santa Cruz), una dilución de /\µg/m\ para el anticuerpo monoclonal para el MP-1 de ratón (Oncogen), una dilución de ^g/ml para el anticuerpo monoclonal del MMP-2 de ratón (Oncogen), una dilución de ^\µg/m para el anticuerpo monoclonal para el MMP-9 de ratón (Oncogen), una dilución de 1:500 del anticuerpo policlonal para el TIMP-1 de ratón (Santa Cruz), una dilución de 1:500 para el anticuerpo policlonal para el TIMP-2 de ratón (Santa Cruz), o una dilución de 1:5000 del anticuerpo monoclonal para la ß-actina de ratón (Sigma) durante toda la noche a una temperatura de 4°C. Las membranas fueron lavadas e incubadas con una dilución de 1:5000 del anticuerpo secundario específico (Amersham Life Science) durante 2 horas a temperatura ambiente y las membranas fueron lavadas y detectadas con un sistema ECL (Amersham Life Science). Las intensidades relativas de las bandas de proteína fueron analizadas mediante el software Scan-gel-it (Li DY, Zhang YC, Sawamura T, Mehta JL.'Circ Res. 1999; 84: páginas 1043 a 1049). Análisis de los Datos Todos los datos representan el promedio de muestras duplicadas. Los datos son presentados como promedio ± SD. La importancia estadística fue determinada mediante comparaciones múltiples entre grupos independientes de datos en los cuales la prueba ANOVA y la prueba F indicaron la presencia de diferencias importantes. El valor A P <0.05 se consideró importante. Resultados Efecto sinérqico anti-aterosclerótico del candesartan y rosuvastatina Comparados con los ratones de control (ratones C57BL/6J alimentados con dieta normal), los ratones de bloqueo de apo-E alimentados con una dieta alta en colesterol desarrollaron una aterosclerosis extensa (P<0.01 contra los ratones de control). Aunque tanto el candesartan como la rosuvastatina solos disminuyeron el grado de aterosclerosis (p<0.05 contra la dieta alta en colesterol sola), la combinación redujo la aterosclerosis a un grado mucho mayor (P<0.05 contra candesartan o rosuvastatina solo más una dieta alta en colesterol). La figura 1 muestra los resultados de los experimentos representativos y el grado de aterosclerosis (promedio ± SD) en diferentes grupos de animales. El candesartan o rosuvastatina solos disminuyeron la aterosclerosis en aproximadamente 35% y 25%, respectivamente. La combinación redujo la aterosclerosis en 70%, demostrando el efecto sinérgico. Este efecto se ilustra gráficamente en la figura 2. El efecto sinérgico del candesartan y rosuvastatina en la expresión LOX- En los ratones C57BL/6J de control, la expresión del LOX-1 (mA N y proteína) fue baja. En contraste, la expresión de LOX-1 (mARN y proteína) aumentó de manera importante mediante la dieta alta en colesterol en los ratones de bloqueo de apo-E (P<0.01 contra los ratones de control). Tanto el candesartan como la rosuvastatina solos disminuyeron la expresión de LOX-1 (mARN y proteína), aunque de manera modesta (P<0.05 contra la dieta alta en colesterol solo). La combinación de candesartan y rosuvastatina tuvo un efecto inhibitorio dramático en la activación de LOX-1 (mARN y proteína) en los ratones de bloqueo de apo-E (P<0.01 contra la dieta alta en colesterol sola). El efecto sinérgico de candesartan y rosuvastatina en la expresión de CD40 Comparados con la expresión en los ratones C57BL/6J de control, la expresión CD40 (mARN y proteína) aumentó de manera importante en los ratones de bloqueo de apo-E alimentados con una dieta alta en colesterol en (P<0.01 contra los ratones de control). Aunque el tratamiento de candesartan y rosuvastatina solos disminuyó ligeramente la expresión de CD40 (P<0.05 contra la dieta alta en colesterol sola), la combinación de candesartan y rosuvastatina tuvo un efecto inhibitorio dramático en la activación del CD40 (mARN y proteína) en los ratones de bloqueo de apo-E (P<0.01 contra la dieta alta en colesterol sola). El efecto sinérgico de candesartan y rosuvastatina en la expresión de MMPs Comparados con la expresión de los ratones C57BL/6J de control, la expresión del MMP-1,-2 y -9 (mARN y proteínas) aumentó de manera importante en los ratones de bloqueo de apo-E alimentados con una dieta alta en colesterol (P<0.01 contra los ratones de control). Ambos el candesartan y la rosuvastatina solos disminuyeron la expresión MMP-1,-2 y -9 de (mARN y proteína), aunque de manera modesta (P<0.05 contra la dieta alta en colesterol sola). La combinación de candesartan y rosuvastatina tuvo un efecto inhibitorio dramático en su expresión (P<0.01 contra la dieta alta en colesterol sola). El efecto de candesartan v rosuvastatina en la expresión de TIMPs La expresión de la proteína TIMP-1 y TIMP-2 también aumentó en los ratones de bloqueo de apo-E mediante la dieta alta en colesterol (P<0.01 contra los ratones de control), pero el aumento fue menor que el de los MMPs. Ambos el candesartan y la rosuvastatina solos redujeron la expresión del TIMP-1 y TIMP-2 en un grado pequeño (P<0.05 contra la dieta alta en colesterol sola), pero la combinación de candesartan y rosuvastatina tuvo un efecto inhibitorio mayor en su expresión (P<0.01 contra una dieta alta en colesterol sola, P<0.05 contra la dieta alta en colesterol con candesartan o rosuvastatina).