MXPA06001622A - Plantas resistentes a hongos y sus usos. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se relaciona a un metodo novedoso para incrementar la resistencia de una planta, en particular de una Solanaceae, de preferencia de papa y tomate, a patogenos de plantas del phylum Oomycetra que comprende incrementar la actividad del polipeptido de la presente invencion. La invencion se relaciona ademas a polinucleotidos y vectores que comprenden estos polinucleotidos. La invencion se relaciona ademas a vectores correspondientes, celulas, plantas transgenicas y material de propagacion transgenico derivado de estos, metodos para producirlos y a su uso para la produccion de forrajes, provisiones, semillas, farmaceuticos o quimicos refinados.

Description

PLANTAS RESISTENTES A HONGOS Y SUS USOS La presente invención se relaciona a un método novedoso para incrementar la resistencia de una planta, en particular de una solanácea, de preferencia de papa y de tomate, a patógenos de plantas del phylum Oomycetes que comprende incrementar la actividad del polipéptido de la presente invención. La invención se relaciona además a polinucleótidos y vectores que comprenden estos polinucleótidos . La invención se relaciona además a vectores correspondientes, células, plantas transgénicas y material de propagación transgénico derivado de éstas, métodos para producir éstas y a su uso para la producción de provisiones, forraje, semillas, farmacéuticos de químicos refinados. El propósito del trabajo de biotecnología de plantas es la generación de plantas con propiedades novedosas ventajosas, por ejemplo, incrementando la productividad agrícola, incrementando la calidad en el caso de provisiones, o para producir químicos específicos o farmacéuticos (Dunwell JM (2000) J Exp Bot 51 Spec NO. : 487-96) . Los mecanismos de defensas naturales de la planta contra patógenos son frecuentemente insuficientes. Las enfermedades fúngicas resultan sólo en pérdidas de rendimiento anual de muchos billones de dólares. La introducción de genes extraños a partir de plantas, animales o fuentes microbianas puede incrementar las defensas. Ejemplos son la protección del tabaco contra daño por ingestión por insectos que expresan endotoxinas Bacillus thuringiensis bajo el control del promotor 35S CaMV (Vaeck et al. (1987) Nature 328:33-37) o la protección del tabaco contra infección fúngica expresando una quitinasa del frijol bajo el control del promotor CaMV (Broglie et al. (1991) Science 254:1194-1197). Sin embargo, la mayoría de los métodos descritos, ofrecen solamente resistencia a un solo patógeno o un espectro estrecho de patógenos . A pesar de la notoria escasez de la papa irlandesa en la mitad del siglo 19, el añublo tardío aún continúa siendo una de las enfermedades más devastadoras en plantas forrajeras. El añublo tardío es provocado por el hongo oomycete Phytophthora infestans, un patógeno especializado, provocando principalmente una enfermedad en el follaje y los frutos de un rango de especie Solanácea, especialmente papa y tomate. Los hongos se observaron primero en México y por varias razones se cree que México es el centro del origen del hongo. Ambos los tipos de apareamiento Al y A2 se presentan permanentemente en por ejemplo, el área de Toluca. También, la P. infestans se reporta en especies de solanáceas nativas en áreas remotas de México. Además, muchas especies de solanáceas que se originan en tubérculos con un alto nivel de resistencia al añublo tardío se encuentran en México. Las medidas imperantes para prevenir fallas de cultivos o rendimientos reducidos implican la aplicación de fungicidas que evitan o curan la P. infestans. En lugar del uso masivo de pesticidas químicos un método alternativo para controlar añublo tardío podría ser ventajoso: el uso de cultivos, que hospedan resistencia parcial o completa al añublo tardío. Para obtener resistencia a añublo tardío, los criadores han enfocado en el pasado en la introgresión de genes R dominantes a partir de la Solanum demissum una especie de papa silvestre originaria de México. Se han identificado once genes , varios de los cuales se han mapeado a lugar específico en el mapa genético de la papa (revisado en Gebhardt y Valkonen, 2001) y recientemente el gen Rl se ha clonado . Rl y R2 se ubican en los cromosomas 5 y 4, respectivamente. R3 , R6 y R7 se ubican en el cromosoma 11. Los genes R desconocidos que confieren resistencia específica de especie a añublo tardío se han descrito también en S. tuberosum ssp. andígena y S. berthaultii y S. pinnatisectum. La resistencia inducida por estos genes R fue (casi) completa pero parece no ser durable en ningún caso. Debido al alto nivel de resistencia y facilidad de transferencia, muchos cultivos contienen resistencia derivada de S. demissum. Desafortunadamente, la resistencia específica de especie derivada de S. demissum, aunque casi completa, no es durable. Una vez que cultivos de papa recientemente reproducidos se cultivaron en escala mayor en campos comerciales, nuevas virulencias emergieron en P. infestans, que crearon el patógeno capaz de superar la resistencia de introgresión. La resistencia de campo más durable al añublo tardío, con frecuencia cuantitativa en la naturaleza y se presume que no es especifica de especie, puede encontrarse en varias especies de solanáceas Mexicanas y de Centro y Sudamérica. Sin embargo, este tipo de resistencia es difícil de transferir en cultivos de papa a través del cruce y la selección fenotípica. La S. bulbocastanum diploide de México y Guatemala es una de las especies que se originan en los tubérculos que se conoce desde hace tiempo por sus niveles elevados de resistencia al añublo tardío. Desafortunadamente, la transferencia de resistencia clásica a partir de especies de solanácea silvestres a papa cultivada se evita f ecuentemente debido a diferencias en ploidia y el Número de Equilibrio de Endosperma (EBN) . A pesar de estos problemas, la introgresión del rasgo de resistencia de S. bulbocastanum ha sido exitosa. Recientemente, híbridos somáticos de S. bulbocastanum y S. tuberosum y plasma germinal cruzado con un híbrido se encontró que son altamente resistentes a añublo tardío, aún bajo presión de enfermedad extrema (Helgeson et al., 1998) . A pesar de los reportes de supresión de la recombinación, la resistencia en el material cruzado con un híbrido parece estar en el cromosoma 8 dentro de un intervalo de aproximadamente 6 cM entre los marcadores CP53 y CT64 de RFLP . Un marcador CAPS derivado de la sonda CT88 de RFLP del tomate se co-segregó con resistencia. Por consiguiente, en años recientes, el desarrollo de plantas resistentes a patógenos de la phylum Oomyceta sigue avanzando. Sin embargo, 40 años de intensos y continuos esfuerzos de investigación y reproducción con plasmas germinales disponibles no ha resultado todavía en introducción al mercado de cultivos resistentes. El número prevaleciente de genes identificados en años recientes confiere simplemente resistencia específica de especies. Además, la resistencia lograda no fue durable. Además, la aplicación de protectores de cultivos se considera ampliamente para ser una carga para el ambiente. De este modo, en varios países occidentales, la legislación llega a ser más restrictiva y parcialmente prohibitiva a la aplicación de fungicidas específicos, haciendo más difícil el control químico de la enfermedad. Además, el control químico es caro. Finalmente, otra restricción es el desarrollo de resistencia por el hongo a fungicidas específicos tales como metalaxilo, que se ha reportado en muchos países en el mundo. Por consiguiente, el problema fundamental de la presente invención es proporcionar medios y métodos novedosos para una protección eficiente de plantas contra añublo tardío y enfermedades relacionadas . La solución del problema técnico se logra proporcionando las modalidades caracterizadas en las reivindicaciones . Por consiguiente, la presente invención se relaciona a un método para generar o incrementar la resistencia de una planta a un patógeno de planta de la phylum Oomycetes que comprende incrementar la actividad de la proteína Rpi-blb2 en la planta o un tejido, un órgano o una célula de la planta o una parte de la misma. Rpi-blb2 es un tipo LZ-NBS-LRR del gen R y muestra homología de secuencia al gen Mi-1 del tomate, que confiere resistencia a tres especies de nemátodos de agalla radicular (Meloidogyne spp.) así como a Macrosiphum euphorbiae de áfidos de papa (Vos et al., 1998; Rossi et al., 1998; Milligan et al., 1998) y a ambos biotipos B y Q de la mosca blanca Bemisia tabaci (Nombela et al., 2003) . Ya que se encontró para Rpi-blb, Rpi-blb2 también confiere resistencia total a un rango de P. infestans aislados que transportan múltiples factores de virulencia y no se ha demostrado aún especificidad de especie . El término "Rpi-blb2" se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la actividad de proteína Rpi-blb2 mencionada en la presente o un polipéptido que tiene tal actividad de proteína Rpi-blb2. Si en lo siguiente, el término "Rpi~blb2" se relaciona a un polipéptido o un polinucleótido , es claro a partir del contexto de su uso . Por el término "generar1' o "incrementar" o "estimular" "la resistencia de una planta" se quiere decir que la resistencia de una planta o una parte de la misma se incrementa o se genera o se estimula en comparación a una referencia . "Conferir", "existir", "generar", "estimular" o "incrementar" una resistencia a patógeno significa que los mecanismos de defensa de una especie o variedad de planta especifica es incrementadámente resistente a uno o más patógenos debido al uso del método de acuerdo con la invención en comparación con el tipo silvestre de la planta, a la cual el método de acuerdo con la invención no se ha aplicado, bajo condiciones de otra manera idénticas (tales como por ejemplo, condiciones climáticas, condiciones de crecimiento, especies patogénicas y similares) . La resistencia incrementada manifiesta por sí misma de preferencia en una manifestación reducida de los síntomas de la enfermedad, síntomas de la enfermedad que comprenden - además de los efectos adversos antes mencionados - por ejemplo, también la eficiencia de penetración de un patógeno dentro de la planta o las células de la planta o la eficiencia de proliferación en o sobre la misma. En este contexto, los síntomas de la enfermedad se reducen de preferencia por al menos 10% o al menos 20%, especialmente de preferencia por al menos 40% o 60%, muy especialmente de preferencia por al menos 70% u 80% y más preferiblemente por al menos 90% o 95%. Por el término "incrementado" se quiere decir por la presente que una actividad de un producto genético es más elevada que en una referencia . De este modo el término "incrementado" incluye que una actividad, por ejemplo, la actividad del producto genético Rpi-blb2 o de otro producto genético, se genera de novo, si esa actividad, por ejemplo, la actividad Rpi-blb2 descrita en la presente no se encontró en la referencia. El término "incrementado" se relaciona también a la estimulación de la actividad de un producto genético. Una expresión incrementada de un gen, es decir su activación puede estimularse en varias formas, por ejemplo, aplicando químicos o por tensión biótica a un organismo. Por ejemplo, una resistencia para infectar genes mediante parásitos puede activarse por infección con un parásito, por ejemplo, con P. infestans y confiere que una resistencia incrementada al mismo y/u otros patógenos. De este modo, en lo siguiente, el término "incrementar" comprende también el término "estimular" y "generar" . "Resistencia patogénica" significa la reducción o debilitamiento de síntomas de la enfermedad de una planta después de la infección por un patógeno. Los síntomas pueden ser muchos, pero de preferencia abarcan aquellos que tienen directa o indirectamente un efecto adverso en la calidad de la planta, la cantidad de cosecha, la aplicabilidad para uso como un forraje o una provisión, u otro el cual realiza la siembra, la plantación, la cosecha o procesamiento del cultivo difícil. El "patógeno" dentro del alcance de la invención significa a modo de ejemplo, pero no de limitación, virus o viroides, bacterias, hongos, plagas animales tales como por ejemplo, insectos o nemátodos . El término "proteína Rpi-blb2" se relaciona a una proteína o un polipéptido cuya expresión en una planta o una parte confiere resistencia de la planta o una parte de la planta a uno de los patógenos descritos en la presente en comparación a una cepa no resistente . La planta o un tejido, un órgano o una célula de la planta o una parte de la misma que comprende actividad incrementada de la proteína Rpi-blb2 es menos susceptible a una infección por un patógeno, en particular al patógeno del phylum Oomycetes, de preferencia a P. infestans, que una planta o una parte de la misma la cual tiene el antecedente genético idéntico, pero no los elementos genéticos necesarios para permitir una expresión de Rpi-blb2 (en la presente llamado como "tipo silvestre" o "referencia"). Los ensayos para la prueba de la resistencia de una planta o una parte de la misma son bien conocidos por una persona experta en la técnica. La resistencia a P. infestans puede definirse como índice de esporulacion de acuerdo a Flier, 2001. Flier describe el índice de esporulacion como un nivel de esporulacion por 1 cm2. De este modo, una reducción de esporulacion por 1 cm2 de 20% comparado a un tipo silvestre se define en la presente como una resistencia. En los ejemplos que ilustran la presente invención, el índice de esporulacion se definió como el nivel de esporulacion por lesión. De este modo, por el término ^resistencia" puede significar alternativamente una reducción de esporulacion por lesión de 20% comparado a un tipo silvestre. Se prefiere la última definición. En modalidades preferidas, la esporulacion en un ensayo se reduce por 30%, más preferida es una reducción del 50%, aún más preferidas son 70%, aún más preferidas son más del 80%, más preferidas son 85% y 90%. Más preferida es una reducción del 95% o más. Por consiguiente, en la presente invención, "actividad" de una proteína pi-blb2 se quiere decir, que la expresión de la proteína confiere tal reducción en el índice de esporulacion. Además, se observó, que una respuesta típica para plantas que contienen Rpi-blb2 a infección por P. infestans es la presencia de pequeñas lesiones, sin ninguna esporulación clara, en el final de la estación de crecimiento. De este modo, en una modalidad, la actividad de Rpi-blb2 se define como la presencia de pequeñas lesiones sin ninguna clara esporulación en experimentos como se describe. La resistencia de Rpi-blb2 muestra regiones necróticas que contienen un nivel bajo de esporulación. Un experimento realizado con hojas desprendidas ejemplifica la actividad de Rpiblb2. El experimento se describe en el ejemplo 17 y la figura 18. La diferencia entre Rpi-blb2 y otros genes resistentes a P. infestans es que Rpi-blb2 permite un bajo nivel de esporulación (Figura 18) . Un ensayo de hoj s desprendidas en el cual las lesiones presentes en el genotipo Rpi-blb2 (ARD 92-1197-16) muestran un nivel bajo de esporangios en relación a la ausencia completa de esporangios o un genotipo que contiene el gen R2 S. demissum. El Indice de esporulación es sólo 1.1% de un fenotipo susceptible (cv. Bintje) (Tabla 7 y Figura 18) . Los experimentos de campo han demostrado también que Rpi-blb2 permite un bajo nivel de infección. Los síntomas de añublo tardío se desarrollaron en un nivel bajo durante la estación de crecimiento (Figura 3, ARF87-801) o en el final de la estación de crecimiento (Figura 2, ARF87-601 Figura 3, ARF87-507 y ARF87-601) . De este modo, en una modalidad, la actividad de pi-blb2 se define además como resultante después de la expresión en una planta en regiones necróticas que contienen un bajo nivel de esporulación en experimentos como se describe . De este modo, en una modalidad, el método de la presente invención produce plantas que muestran regiones necróticas que contienen un nivel bajo de esporulación o menor . El término "referencia" se relaciona a un organismo o un parte del mismo, por ejemplo, una célula la cual es esencialmente tan idéntica como sea posible en el genoma, el proteoma y/o el metaboloma al organismo relevante o parte del mismo, por ejemplo, una célula, por ejemplo a la planta de la presente invención. De este modo, el término "referencia" se relaciona por ejemplo, a un organismo o una parte del mismo, por ejemplo, una célula, la cual es esencialmente genética, proteómica y/o metabólicamente idéntica al organismo de la presente invención o una parte de la misma, pero una actividad de un producto genético específico, por ejemplo, Rpi-blb2, no puede observarse ya que existe una diferencia relevante en el genoma, el proteoma o el metaboloma de referencia. De este modo, la referencia puede ser una planta o una parte de la misma, la cual no expresa o expresa muy poco de un producto genético activo relevante, por ejemplo, no codifica una Rpi-blb2 o no transcribe un gen que codifica Rpi-blb2 o no traduce un ARNm de Rpi-blb2 activa. De este modo, la referencia no proporciona la modificación que crea un producto genético activo en suficiente cantidad para resultar en un fenotipo como se describe. Si dos plantas son de manera esencial genéticamente idénticas, pueden probarse con ensayos conocidos por una persona experta en la técnica, por ejemplo, a través de análisis de huella dactilar, por ejemplo, como se describe en Roldan-Ruiz, Theor, Ap l . Genet., 2001, 1138-1150. El patrón de expresión de las proteínas puede probarse como se describe en la técnica por ejemplo, a través de electroforesis en gel (ID, 2D, 3D) , análisis de espectrometría de masa y otros métodos como se describe por ejemplo en www. aters . com, www . roteine . org . au . , www. Proteomesci . com, www .

Sdu . dk/Nat/CPA . El metaboloma puede analizarse por el experto como se describe en la técnica, por ejemplo, a través de HPLC, GC, OPEC, LC-MS, GC-MS, LC-MS-MS y otros métodos como se describe por ejemplo en www. Metabolic-explorer.com, www. Ki . se/icsb2002/pdf,/lCSB_209.pdf , www.genomics .rug.nl/technologies .htm, Fiehn et al., Nature Biotech, 18 (2000), 1157, Raamsdonk et al., Nature Biotech, 19 (2991), 45-50, Buchholz, Anal. Biochem, 295 (2001) 129-137, Soga et al., Anal Chem. 74 (2002) 2233-2239. Con el fin de incrementar la resistencia a un patógeno el organismo de referencia o la parte del mismo es susceptible a la infección con el patógeno, por ejemplo un patógeno de una planta, por ejemplo. P. infestans. De preferencia, la referencia es un clon de ese organismo en donde por ejemplo, un polinucleótido relevante, por ejemplo, el polinucleótido de la invención, o un activador, por ejemplo un activador de un producto genético relevante que media la actividad, por ejemplo un activador que incrementa la expresión de un polinucleótido relevante o un derivado del polinucleótido, o un activador de un polipéptido relevante, por ejemplo, se ha introducido el polipéptido de la presente invención, y/o un vector que codifica el producto genético relevante correspondiente. Por ejemplo, una referencia preferida en el método de la presente invención es un organismo o una parte del mismo, el cual es un clon del organismo o una parte del mismo, por ejemplo, una célula la cual se ha transfectado o transformado con el polinucleótido o vector de la invención. Si el clon como se describe puede no identificarse, su estado de la técnica para desdoblarse, para expulsar o para desconectar aquellos elementos los cuales median esencialmente la actividad relevante, por ejemplo, mediando una actividad de pi-blb2 incrementada, por ejemplo mediante una expresión incrementada en el organismo, por ejemplo, en la planta. Se sabe bien, por un experto en la técnica, cómo reducir o inhibir la actividad de un producto genético relevante, por ejemplo, reduciendo o inhibiendo la expresión de por ejemplo, Rpi-blb2. Tal clon puede compararse con un organismo producido de acuerdo al método de la presente invención, por ejemplo, un genotipo que expresa Rpi-blb2, resistente a P. infestans. El término "planta" como se utiliza en la presente, se refiere a todos los géneros y especies de plantas más superiores o inferiores del Reino de las Plantas . El término incluye las plantas maduras, semillas, brotes y plántulas y sus partes derivadas, el material de propagación, órganos de plantas, tejido, protoplastos , callos y otros cultivos, por ejemplo, cultivos celulares, y cualquier otro tipo de células de planta que agrupan a cinco unidades funcionales o estructurales. "Planta madura" se refiere a una planta en cualquier etapa de desarrollo deseada más allá de la plántula. Plántula se refiere a una planta inmadura joven en una etapa de desarrollo temprana. "Planta" abarca todas las plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas anuales y perennes. Preferidas dentro del alcance de la invención son aquellas plantas que se emplean como forraje o provisiones, por ejemplo, del género monocotiledóneas o dicotiledóneas, en particular especies similares a las descritas anteriormente, por ejemplo, especies o miembros de los cereales de la familia de las solanáceas, respectivamente, más preferiblemente papa y tomate . Como lo conoce un experto en la técnica, el método de la presente invención comprende seleccionar además aquellas plantas en donde, cuando se confronta o cuando se compara con la planta de referencia, la resistencia al menos a un patógeno existe o se incrementa. La "selección" con respecto a las plantas en donde - cuando se confronta o cuando se compara con la planta de referencia - la resistencia a al menos un patógeno existe o se incrementa, significa que todos los métodos que son adecuados para reconocer una resistencia existente o incrementada a patógenos. Estos pueden ser síntomas de infección patogénica, pero pueden conprender también los síntomas descritos en la presente, los cuales se relacionan a la calidad de la planta, la cantidad del rendimiento, la aplicabilidad para uso como forraje o como provisión y similares . Por consiguiente, en una modalidad del método de la presente invención, la proteína pi-blb2 se codifica por un polinucleótido que comprende una molécula de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo que consiste de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican al menos la forma madura del polipéptido descrito en la SEC. DE IDEN . NO.: 2 ó 4; b) moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de codificación como se describe en la SEC. DE IDENT. NO.: 1 Ó 3 Ó 5 Ó 6 que codifica al menos la forma madura del polipéptido ; c) moléculas de ácido nucleico, la secuencia de nucleótido la cual se degenera como un resultado del código genético a una secuencia de nucleótido de (a) o (b) ; d) moléculas de ácido nucleico que codifica un polipéptido derivado a partir de un polipéptido codificado por un polinucleótido de (a) a (c) a modo de sustitución, eliminación y/o adición de uno a varios aminoácidos de la secuencia de aminoácido del polipéptido codificado por un polinucleótido de (a) a (c) ; e) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido, la secuencia de la cual tiene una identidad del 70% o más de la secuencia de aminoácido del polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de (a) o (b) ; f) moléculas de ácido nucleico que comprenden un fragmento o una porción que soporta un epítope de un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico por cualquiera de (a) a (e) ; g) moléculas del ácido nucleico que comprenden un polinucleótido que tiene una secuenciación de una molécula de ácido nucleico amplificada a partir de una biblioteca de ácido nucleico que utiliza los cebadores como se listan en la Tabla 3b( en particular ARFIF y ARFIR; h) moléculas de ácido nucleico que codifican un fragmento que inicia con el aminoácido: 1, 30, 50, 100, 200, 300, 500 ó 1000 y se detiene con el aminoácido 1276, 1000, 500, 300, 200, 5G, 30 ó 1 de un polipéptido codificado por cualquiera de (a) a (g) ; i) moléculas de ácido nucleico que comprenden al menos 20 nucleótidos de un polinucleótido de cualquiera de (a) o (d) ; j ) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que se reconoce por un anticuerpo monoclonal que se ha incrementado contra un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de cualquiera de (a) a (h) ; k) moléculas de ácido nucleico obtenibles al seleccionar una biblioteca apropiada bajo condiciones de severidad con una sonda que tiene la secuencia de la molécula del ácido nucleico de cualquiera de (a) a (j) o de un fragmento del mismo de al menos 15, de preferencia 30, 60, 100 o más nucleótidos; y 1) moléculas de ácido nucleico, la hebra complementaria de la cual hibridiza bajo condiciones de severidad con una molécula de ácido nucleico de cualquiera de (a) o (k) ; o la hebra complementaria de cualquiera de (a) a (1) ; o expresar un polipéptido codificado por un segmento o un grupo 6 de enlace de Solanum bulbocastanum, el cual se co-segrega con un marcador seleccionado a partir de la tabla 3A y el cual media la resistencia a patógenos, en particular a patógenos seleccionados a partir del grupo que consiste de phylum Oomycetes; En una modalidad, el polinucleótido del método de la invención no consiste de la secuencia descrita en la SEC. DE IDENT. NO. : 7 y/o 9 y/o no consiste de la secuencia de una molécula del ácido nucleico que codifica una proteína descrita en la SEC. DE IDENT. NO.: 8 y/o 10. En una modalidad, el polinucleótido del método de la invención no consiste de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de Mil.l o Mil.2 y/o de una molécula del ácido nucleico que codifica una proteína Mil.l o Mil.2. De este modo, en una modalidad, el polinucleótido del método de la presente invención puede no consistir de las secuencias mostradas en Rossi et al. 1998, PNAS USA 95:9750-9754, Milligan et al., 1998, Plant Cell 10:1307-1319; y/o O 9806750. Una comparación de las secuencias de Rpi-blb2, Mil.l y Mil.2 se muestra en las Figuras 15 a 17. El término "grupo de enlace" como se utiliza en la presente se relaciona a dos o más rasgos y/o lugares y/o genes y/o marcadores que tienden a heredarse juntos como una consecuencia de una asociación entre tales rasgos y/o lugares y/o genes y/o marcadores. Entre más cercanos están los rasgos y/o lugares y/o genes y/o marcadores, más baja la probabilidad de que se separaren durante la reparación del ADN o los procesos de replicación tales como mitosis o meiosis en eucariotes, y por lo tanto es mayor la probabilidad de que se hereden. Existen muchos grupos de enlace ya que existen pares homólogos de los cromosomas. El término "grupo 6 de enlace" se relaciona a un grupo de enlace de la papa o el tomate, el cual se afilia al cromosoma 6, tal como la afiliación establecida al identificar marcadores de la posición cromosomal conocida con base en el trabajo publicado por Bernatzky y Tanksley (1986) y Tanksley et al. (1992) . Los grupos de enlace soportan el mismo número como sus respectivos cromosomas. En el tomate, los cromosomas se enumeran de acuerdo a su longitud medida en paquiteno. Tales números se han aplicado por Barton (1950) ,-el cromosoma 1 es el más largo, el cromosoma 12, es el más corto. Además de la longitud, tales características como las posiciones del centrómero y la cantidad y distribución de la heterocromatina sirve para identificar cada cromosoma. Los brazos cortos se simbolizan por "S", los largos por "L" , de este modo "1S" designa el brazo corto del cromosoma 1; como por ejemplo, en Barton, D.W. (1950) American Journal of Botany, 37, 639-643, Bernatzky, R. y Tanksley, S.D. (1986) Genetics 112, 887-898, Tanksley, S.D. et al., (1992) Genetics 132, 1141-1160.

El término "co-segregación" como se utiliza en la presente, se relaciona a la tendencia de dos o más rasgos y/o lugares y/o genes y/o marcadores estrechamente enlazados para ser heredados . Por ejemplo, la región más concreta del cromosoma 6 que co-segrega con Rpi-blb2 es el brazo corto, que en el tomate soporta el marcador Mi morfológico. Por consiguiente, en una modalidad, la presente invención se relaciona al método de la presente invención, en donde la proteína Rpi-blb2 se codifica por el polinucleótido de la presente invención, por ejemplo, codificado por un polinucleótido mostrado en la Secuencia de ID. 1 Ó 3 Ó 5 Ó 6 o un fragmento de la misma. En la base de una investigación BLASTX los genes con la homología más elevada identificados a las secuencias Rpí-blb2 identificadas fueron los genes y proteínas Mil.l y Mil.2; véanse las figuras 15 a 17. Ambos genes tienen una identidad elevada a la secuencia descrita en la SEC. DE IDEN . NO.: 1 ó 3 ó 5 ó 6, pero no confiere resistencia al patógeno de planta del phylum Oomycetes . Por lo tanto, la actividad de Mil.l y Mil.2 es otra actividad como la actividad del polipéptido de la presente invención. La secuencia de Mil.l y Mil.2 ORF y proteínas codificadas se muestra en la presente en la SEC. DE IDENT. NO.-. 7 a 10. Además, la solicitud EP 401764.4 se relaciona a los genes Mi.

La secuencia de los genes Mil.l y Mil.2 de la técnica anterior se excluye a partir del polinucleótido de la presente invención, en particular las SEC. DE IDENT. NOS.: 7 y 9 se excluyen. También incluidas pueden ser las secuencias de polinucleotidos que codifican el polipéptido de la SEC. DE IDENT. NO.: 8 ó 10. De este modo, en una modalidad, las secuencias que codifican también la proteína Mil.l y Mil.2 se excluyen. Las proteínas con una homología inferior al polipéptido codificado por el polinucleótido de la presente invención son proteínas 1 y 2 de resistencia Hero (Genbank No. De Acceso: gi26190252 y gi26190254) , proteínas de resistencia a Toposvirus A, B, C y E [Genbank Nos. De Acceso: gil5418709, gil5418710, gil5418712, gi!5418713, gil5418714] ; l [Genbank No. De Acceso: gil7432423] y Prf [Genbank No. De Acceso: gi8547237] cuyas secuencias o secuencias codificadas se excluyen también a partir de las secuencias de la presente invención . Los términos "el o los genes" , "polinucleótido" , "secuencia del ácido nucleico" , "secuencia de nucleótido" o "la o las moléculas del ácido nucleico" como se utilizan en la presente, se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxirribonucleótídos . Este término se refiere sólo a la estructura primaria de la molécula. De este modo, este término incluye ADN de doble o de una sola hebra, y ARN. Se incluyen también tipos conocidos de modificaciones, por ejemplo, metilación, sustitución de "tapas" de uno o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo. De preferencia, la secuencia de ADN de la invención comprende una secuencia de codificación que codifica el polipéptido definido en la presente. Una "secuencia de codificación" es una secuencia de nucleótido la cual se transcribe dentro del ARNm y/o se traduce dentro de un polipéptido cuando se coloca bajo el control de la secuencia reguladora apropiada. Los límites de la secuencia de codificación se determinan por un codón de inicio de traducción en el término 5' y un codón de detención de traducción en el término 3 ' . Una secuencia de codificación puede incluir, pero sin limitarse a ARNm, ADNc, secuencias de nucleótidos recombinantes o ADN genómicc, aunque los intrones pueden presentarse también bajo ciertas circunstancias. Por "hibridizar" se requiere decir que tales moléculas del ácido nucleico hibridizan bajo condiciones de hibridización convencionales, de preferencia bajo condiciones de severidad tales como se describen por ejemplo por Sambrook (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)). Un ejemplo de tal condición de hibridización de severidad es la hibridización a 4XSSC a 65°C, seguida por un lavado en 0.1XSSG a 65°C durante una hora. Alternativamente, una condición de hibridización de severidad ejemplar está en 50% de formamida, 4XSSC a 42°C. Además, las condiciones durante la etapa de lavado pueden seleccionarse a partir del rango de condiciones delimitado por condiciones de severidad bajas (aproximadamente 2x SSC a 50°C) y condiciones de severidad elevadas (aproximadamente 0.2 X SSC a 50 °C, de preferencia a 65°C) (20X SSC: 0.3 M de citrato de sodio, 3M de NaCl, pH 7.0) . Además, la temperatura durante la cual la etapa de lavado puede originarse a partir de las condiciones de severidad bajas a temperatura ambiente, aproximadamente 22 °C a condiciones de severidad más elevadas a aproximadamente 65 °C. Tanto la concentración como la temperatura de sal de los parámetros pueden variar simultáneamente, o además uno de los dos parámetros puede mantenerse constante mientras únicamente el otro se varía. Los desnaturalizantes, por ejemplo, formamida o SDS, pueden emplearse durante la hibridización. En la presencia de 50% de formamida, la hibridización se efectúa de preferencia a 42°C. Algunos ejemplos adicionales de condiciones para hibridización y etapa de lavado se muestran en la presente posteriormente : (1) Pueden seleccionarse condiciones de hibridización, por ejemplo, a partir de las siguientes condiciones : a) 4X de SSC a 65°C, b) 6X de SSC a 45°C, c) 6X de SSC, 100 mg/ml de ADN de esperma de pescado fragmentado desnaturalizado a 68°C, d) 6X de SSC , 0.5% de SDS, 100 mg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado a 68°C, e) 6X de SSC , 0.5% de SDS , 100 mg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado, desnaturalizado, 50% de formamida a 42 °C, f) 50% de formamida, 4X SSC a 42°C, g) 50% (volumen/volumen) de formamida, 0.1% de albúmina de suero de bovino, 0.1% de Ficoll, 0.1% de polivinilpirrolidona, 50 mM de tampón de fosfato de sodio pH 6.5, 750 mM de NaCl , 75 mM de citrato de sodio a 42°C, h) 2X o 4X SSC a 50°C (condición de severidad baja) . i) 30 a 40% de formamida, 2X o 4X SSC a 42 °C (condición de severidad baja) (2) Pueden seleccionarse etapas de lavado, por ejemplo, a partir de las siguientes condiciones: a) 0.015 M de NaCl/0.0015 M de citrato de sodio/0.1% de SDS a 50°C. b) 0.IX de SSC a 65°C. c) 0.1X de SSC, 0.5% de SDS a 68°C. d) 0.1X de SSC, 0.5% de SDS , 50% de formamida a 42°C. e) 0.2X de SSC, 0.1% de SDS a 42°C. f) 2X de SSC a 65 °C (condición de severidad baja) . En una modalidad de la presente invención, el polinucleotido de la invención comprende un polinucleotido el cual hibridiza a una molécula de ácido nucleico que comprende o consiste de una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia mostrada en la SEC. DE IDENT. NO. : .1 ó 3 ó 5 ó 6 o un fragmento de la misma. El fragmento comprende o consiste de preferencia de 15, 20, 30, 40, 70, 100, 300, 500, 700, 1000 o más residuos de la SEC. DE IDENT. NO .: 1 ó 3 ó 5 ó 6. En una modalidad preferida, el polinucleotido de la presente invención comprende un polinucleotido que hibridiza bajo condiciones de hibridizacion "severas" con una molécula del ácido nucleico que comprende o que consiste de una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia mostrada en la SEC. DE IDENT. NO.: l ó 3 ó 5 ó 6 o un fragmento de la misma . El término "bajo condiciones de hibridizacion severas" como se utiliza en la presente, se refiere a cualquiera de las condiciones de hibr dizac on severas mencionadas en la presente. En una modalidad adicional, el término "bajo condiciones de hibridizacion severas" se refiere a las condiciones de hibridizacion mencionadas en los ejemplos o utilizadas en Sambrook (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) . En una modalidad preferida, el término "bajo condiciones de hibridización severas" como se utiliza en la presente, se refiere a todas condiciones de hibridización severas mencionadas en la presente, significando que un polinucleótido hibridiza bajo todas las condiciones severas mencionadas . Rpi-blb2 derivada de otros organismos, puede codificarse por otras secuencias de ADN las cuales hibridizan a las secuencias mostradas en la SEC. DE IDEN . NO.: 1 6 3 ó 5 ó 6 bajo condiciones de hibridización relajadas y las cuales codifican en la expresión de los péptidos que tienen la actividad de Rpi-blb2. Además, algunas aplicaciones tienen que realizarse en condiciones de hibridización de severidad baja, sin ninguna consecuencia para la especificidad de la hibridización. Por ejemplo, un análisis de transferencia Southern del ADN total podría analizarse con un polinucleótido de la presente invención y lavarse a severidad baja (55°C en 2xSSPE, 0.1% de SDS) . El análisis de hibridización podría revelar un simple patrón de genes que codifican solamente Rpi-blb2. Un ejemplo adicional de tales condiciones de hibridización de severidad baja son 4XSSC a 50°C o la hibridización con 30 a 40% de formamida a 42 °C. Tales moléculas comprenden aquellas que son fragmentos, análogos o derivados de Rpi-blb2 de la invención y difieren por ejemplo, a modo de la o las eliminaciones, la o las inserciones, la o las sustituciones, la o las adiciones y/o la o las recombinaciones o cualesquier otra de la o las modificaciones del aminoácido y/o el nucleótido conocidas en la técnica ya sea sólo o en combinación a partir de las secuencias del aminoácido descritas anteriormente o su o sus secuencias de nucleótido subyacentes. Sin embargo, se prefiere utilizar condiciones de hibridización de severidad elevada. El término "homología" significa que las moléculas de ácido nucleico respectivas o proteínas codificadas son funcional y/o estructuralmente equivalentes. Las moléculas de ácido nucleico que son homologas a las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente y que se derivan de las moléculas del ácido nucleico son por ejemplo, variaciones de las moléculas del ácido nucleico las cuales representan modificaciones que tienen la misma función biológica, en particular codificando proteínas con la misma o sustancialmente la misma función biológica. Éstas pueden ser variaciones de origen natural, tales como secuencias de otras variedades o especies, o mutaciones de plantas. Estas mutaciones pueden ser de origen natural, o pueden obtenerse por técnicas de mutagénesis. Las variaciones alélicas pueden ser variantes alélicas de origen natural así como variantes producidas sintéticamente o diseñadas genét camente. Estructuralmente, los equivalentes pueden por ejemplo, identificarse al probar la unión del polipéptido a los anticuerpos. Estructuralmente, los equivalentes tienen la misma característica inmunológica, por ejemplo, comprenden epítopes similares. Los términos "fragmento" "fragmento de una secuencia" o "parte de una secuencia" significan una secuencia truncada de la secuencia original que se refiere. La secuencia truncada (secuencia del ácido nucleico o de la proteína) puede variar ampliamente de longitud; el tamaño mínimo es una secuencia de suficiente tamaño para proporcionar una secuencia con al menos una función y/o actividad comparable de la secuencia original referida, aunque el tamaño máximo no es crítico. En algunas aplicaciones, el tamaño máximo usualmente no es sustancialmente mayor que aquel requerido para proporcionar la actividad y/o la o las funciones deseadas de la secuencia original . Normalmente, la secuencia de aminoácidos truncada variará desde aproximadamente 5 a aproximadamente 1260 aminoácidos de longitud. Más normalmente, sin embargo, la secuencia será de un máximo de aproximadamente 1000 aminoácidos de longitud, de preferencia un máximo de aproximadamente 500 ó 100 aminoácidos. Es usualmente deseable seleccionar secuencias de al menos aproximadamente 10, 12 ó 15 aminoácidos, hasta un máximo de aproximadamente 20 ó 25 aminoácidos . El término "epítope" se relaciona a sitios inmunorreactivos específicos dentro de un antígeno, también conocido como determinados antigénicos. Estos epítopes pueden ser una disposición lineal de monómercs en una composición polimérica - tal como aminoácidos en una proteína - o consiste de o comprende de una estructura secundaria o terciaria más compleja. Aquellos con experiencia reconocerán que todos los inmunógenos (es decir, las sustancias capaces de producir una respuesta inmune) son antígenos; sin embargo, algún antígeno, tal como haptenos, no son inmunógenos, pero pueden hacerse inmunogénicos acoplándose a una molécula portador. El término "antígeno" incluye referencias a una sustancia a la cual un anticuerpo puede generarse y/o a la cual el anticuerpo es específicamente inraunorreactiva . En una modalidad, la presente invención se relaciona a un epítope de Rpi-blb2. El término "uno o varios aminoácidos" se relaciona a al menos un aminoácido, pero no más de ese número de aminoácidos que resultaría en una homología por debajo de 70% de identidad. De preferencia, la identidad es más del 75% u 80%, más preferidos son 85%, 90% o 95%, aún más preferidas son 96%, 97%, 98% o 99% de identidad.

Los términos "polinucleótidos" y "molécula del cido nucleico" se relacionan también a polinucleótidos "aislados" o moléculas del ácido nucleico. Una molécula del ácido nucleico "aislada" es aquella la cual se separa de otras moléculas del ácido nucleico las cuales se presentan en la fuente natural del ácido nucleico. De preferencia, un ácido nucleico "aislado" está libre de secuencias que flanquean naturalmente el ácido nucleico (es decir, secuencias ubicadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo a partir del cual se deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en varias modalidades, el polinucleótido de la presente invención puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb o 0.1 kb o menos de las secuencias del nucleótido que flanquean naturalmente la molécula del ácido nucleico en el ADN genómico de la célula a partir de la cual se deriva el ácido nucleico. Además, los polinucleótidos de la presente invención, en particular una molécula del ácido nucleico "aislada" tal como una molécula de ADNc, puede estar sustancialmente libre de otro material celular, o medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes , o precursores químicos u otros químicos cuando se sintetizan químicamente . Además, el polinucleótido de la invención comprende una molécula de ácido nucleico la cual es un complemento de una de las secuencias del nucleótido de los polinucleótidos mencionados anteriormente o una porción de los mismos. Una molécula del ácido nucleico que es complementaria a una de las secuencias del nucleótido mostrado en la SEC. DE IDENT. NO. : I ó 3 ó 5 ó 6 es aquella la cual es suficientemente complementaria a una de las secuencias de nucleótido mostradas en la SEC. DE IDENT. NO.: I ó 3 ó 5 ó 6 de manera que puede hibridizarse a una de las secuencias de nucleótido mostradas en la SEC. DE IDENT. NO.: l ó 3 ó 5 ó 6, por lo que se forma un dúplex estable. El polinucleótido de la invención comprende una secuencia de nucleótido la cual es al menos aproximadamente 70%, de preferencia al menos aproximadamente 75%, más preferiblemente al menos aproximadamente 80%, 90% o 95% y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, 99% o más homólogo a una secuencia de nucleótido mostrada en la SEC. DE IDENT. NO.: 1 ó 3 ó 5 ó 6, o una porción de la misma. El polinucleótido de la invención comprende una secuencia de nucleótido la cual hibridiza, de preferencia hibridiza bajo condiciones severas como se define en la presente, a una de las secuencias de nucleótido mostradas en la SEC. DE IDENT. NO.: 1 ó 3 ó 5 ó 6, o una porción de las mismas . Además, el polinucleótido de la invención puede comprender sólo una porción de la región de codificación de la secuencia en la SEC. DE IDENT. NO.: 1 ó 3 ó 5 ó 6 , por ejemplo un fragmento el cual puede utilizarse como una sonda o cebador o un fragmento que codifica una porción biológicamente activa del gen de codificación de proteína Rpi-blb2. Las secuencias del nucleótido determinadas a partir de la clonación del presente gen de codificación de proteína Rpi-blb2 permite la generación de sondas y cebadores diseñados para uso para identificar y/o clonar sus homólogos en otros tipos y organismos celulares. La sonda/cebador comprende normalmente oligonucleótidos sustancialmente purificados. El oligonucleótido comprende normalmente una región de la secuencia de nucleótido que hibridiza bajo condiciones severas a al menos aproximadamente 12 , 15 , de preferencia aproximadamente 20 ó 25, más preferiblemente alrededor de 40, 50 ó 75 nucleótidos consecutivos de una hebra sentido de una de las secuencias establecidas, por ejemplo, en la SEC. DE IDENT. NO.: 1 ó 3 ó 5 ó 6, una secuencia antisentido de una de las secuencias, por ejemplo, establecida en la SEC. DE IDENT. NO.: 1 ó 3 ó 5 ó 6, o mutantes de origen natural de las mismas. Los cebadores basados en un nucleótido de la invención pueden utilizarse en reacciones de PCR para clonar homólogos Rpi-blb2, por ejemplo, como los cebadores descritos en los ejemplos de la presente invención, por ejemplo, como se muestran en la tabla 3a ó 3b, se utilizan de preferencia los cebadores ARF1F y ARF1 . Un PCR con los cebadores univ2R4 y univl4L resultará en un fragmento de Rpi-blb2 el cual puede utilizarse como se describe en la presente. Los conjuntos cebadores son intercambiables. La persona experta en la técnica reconoce que combinar cebadores resulta en el producto deseado, por ejemplo, en un clon de longitud total o una secuencia parcial . Las sondas basadas en las secuencias de nucleótido Rpi-blb2 pueden utilizarse para detectar transcripciones o secuencias genómicas que codifican las mismas o proteínas homologas . La sonda puede comprender además un grupo de etiqueta unido a la misma, por ejemplo, el grupo de etiqueta puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un co-factor de enzima. Tales sondas pueden utilizarse como una parte de un equipo de prueba de marcador genómico para identificar células que expresan un Rpi-blb2, tal como midiendo un nivel de molécula de ácido nucleico que codifica Rpi-blb2 en una muestra de células, por ejemplo, detectando niveles de ARNm Rpi-blb2 o determinando si un gen Rpi-blb2 genómico se ha mutado o eliminado. El polinucleótido de la invención codifica un polipéptido o porción del mismo, el cual incluye una secuencia de aminoácido la cual es suficientemente homologa a la secuencia de aminoácido de la SEC. DE IDENT. NO . : 2 ó 4, de manera que la proteína o la porción de la misma mantiene la capacidad para participar en la resistencia a los patógenos, en particular a una actividad de la proteína Rpi-blb2 como se describe en los ejemplos en las plantas. Como se utiliza en la presente, el lenguaje "suficientemente homólogo" se refiere a proteínas o porciones de las mismas que tienen secuencias de aminoácidos las cuales incluyen un número mínimo o idéntico o equivalente (por ejemplo, un residuo de aminoácido el cual tiene una cadena lateral similar como un residuo de aminoácido en una de las secuencias del polipéptido de la presente invención) , los residuos de aminoácido a una secuencia de aminoácido de la SEC. DE IDENT. NO . : 2 ó 4 de manera que la proteína o porción de la misma es capaz de participar en la resistencia de plantas a los patógenos. Ejemplos de la actividad de la proteína Rpi-blb2 se describen en la presente. De este modo, la función de la proteína Rpi-blb2 contribuye ya sea directa o indirectamente a la resistencia de plantas a los patógenos, de preferencia a los patógenos mencionados en la presente, más preferidos a P. infestans. La proteína es al menos aproximadamente 70%, de preferencia al menos aproximadamente 75%, y más preferiblemente al menos aproximadamente 80%, 90%, 95% y más preferiblemente al menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, 99% o más homólogos a una secuencia de aminoácido completa de la SEC . DE IDENT . NO.: 2 ó 4. Las porciones de las proteínas codificadas por el polinucleotido de la invención son de preferencia biológicamente activas. Como se menciona en la presente, el término "porción biológicamente activa" se pretende para incluir una porción, por ejemplo, un dominio/motivo, que confiere resistencia a un patógeno de planta oomycete y/o Bemisia tabaci y/o áfidos o tiene una actividad inmunológica de manera que se une a una unión de anticuerpo específicamente a la proteína Rpi-blb2 o tiene una actividad como se establece en los Ejemplos o como se describe en la presente. Los fragmentos del ácido nucleico que codifican porciones biológicamente activas del polipéptido de la presente invención pueden prepararse aislando una porción de una de las secuencias de la SEC. DE IDENT. NO.: 1 ó 3 ó 5 ó 6, que expresa la porción codificada de la proteína o péptido pi-blb2 (por ejemplo, por expresión recombinante in vitro) y evaluando la actividad de la porción codificada de la proteína . La invención abarca además polinucleótidos que difieren de una de las secuencias de nucleótido mostradas en la SEC. DE IDENT. NO. : 1 ó 3 ó 5 ó 6 (y porciones de la misma) debido a la degeneración del código genético y de este modo codifica un polipéptido de Rpi-blb2 como aquel codificado por las secuencias mostradas en la SEC. DE IDENT. NO.: 2 ó 4. Además, el polinucleotido de la invención tiene una secuencia de nucleótido que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácido mostrada en la SEC. DE IDENT. NO.: 2 ó 4. En aún otra modalidad, el polinucleó ido de la invención codifica una proteína de longitud total la cual es sustancialmente homologa a una secuencia de aminoácido de la SEC . DE IDENT. NO.: 2 ó 4. Además, se apreciará por aquellos expertos en la técnica que los polimorfismos de secuencia de ADN que conducen a cambios en las secuencias de aminoácidos pueden existir dentro de una población (por ejemplo, la población S. bulbocastanum) . Tal polimorfismo genético en el gen Rpi-blb2 puede existir entre individuos dentro de una población debido a la variación natural . Como se utiliza en la presente, los términos "gen" y "gen recombinante" se refieren a moléculas de ácido nucleico que comprenden un marco de lectura abierto que codifica una Rpi-blb2, de preferencia una Spi-blb2 de S. bulbocastanum. Tales variaciones naturales pueden resultar normalmente en 1-5% de varianza en la secuencia de nucleótido del gen Rpi-blb2. Cualesquiera y todas las variaciones de nucleótido y los polimorfismos del aminoácido resultante en Rpi-blb2 que son el resultado de variación natural y que no alteran la actividad funcional de Rpi-blb2 se pretenden para estar dentro del alcance de la invención. Los polinucleótidos que corresponden a variantes naturales y homólogos sin S. bulbocastanum del ADNc de Rpi-blb2 de la invención pueden aislarse con base en su homología a polinucleótidos de Rpi-blb2 de S. bulbocastanum descritos en la presente utilizando el polinucleotido de la invención, o una porción del mismo, como una sonda de hibridización de acuerdo a técnicas de hibridización estándares, bajo condiciones de hibridización severas. Por consiguiente, en otra modalidad, un polinucleotido de la invención es al menos 20 nucleótidos de longitud. De preferencia, hibridiza bajo condiciones severas a la molécula del ácido nucleico que comprende una secuenci de nucleótido del polinucleotido de la presente invención, por ejemplo, la SEC. DE IDENT. NO. : 1 ó 3 ó 5 ó 6. En otras modalidades, el ácido nucleico es al menos 20, 30, 50, 100, 250 o más nucleótidos de longitud. El término "hibridiza bajo condiciones severas" se define anteriormente y se pretende para describir condiciones para hibridización y lavado bajo las cuales las secuencias del nucleótido al menos 65% idénticas entre sí permanecen hibridizadas normalmente entre sí. De preferencia, las condiciones son secuencias de manera que al menos aproximadamente 70%, más preferiblemente al menos aproximadamente 75% u 80%, y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 85%, 90% o 95% o más idénticas entre sí permanecen hibridizadas normalmente entre sí. De preferencia, el polinucleotido de la invención que hibridiza bajo condiciones severas a una secuencia de la SEC. DE IDENT. NO.: 1 ó 3 ó 5 ó 6 corresponde a una molécula del ácido nucleico de origen natural . Como se utiliza en la presente, una molécula del ácido nucleico "de origen natural" se refiere a una molécula de ARN o de ADN que tiene una secuencia de nucleótido que ocurre en la naturaleza (por ejemplo, codifica una proteína natural) . De preferencia, el polinucleótido codifica una Rpi-blb2 de S . bulbocastanum natural . Además de las variantes de origen natural de la secuencia Rpi-blb2 que pueden existir en la población, el obrero calificado apreciará además que pueden introducirse cambios por mutación dentro de una secuencia de nucleótido del polinucleótido que codifica Rpi-blb2, por lo que se conduce a cambios en la secuencia de aminoácidos de la Rpi-blb2 codificada, sin alterar la capacidad funcional de la Rpi-blb2. Por ejemplo, las sustituciones de nucleótido que conducen a sustituciones de aminoácido en residuos de aminoácidos "no esenciales" pueden hacerse en una secuencia el polinucleótido que codifica Rpi-blb2, por ejemplo, la SEC. DE IDENT. NO. : 1 ó 3 ó 5 ó 6. Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que puede alterarse a partir de la secuencia de tipo silvestre de la proteína Rpi-blb2 sin alterar la actividad de la proteína Rpi-blb2, mientras que un residuo de aminoácido "esencial" se requiere para la actividad de la proteína Rpi-blb2. Otros residuos de aminoácidos, sin embargo (por ejemplo, aquellos que no se conservan o se semi-conservan solamente en el dominio que tiene actividad Rpi-blb2) no pueden ser esenciales para la actividad y de este modo son probables de ser sensible para alteración sin alterar la actividad de Rpi-blb2. Por consiguiente, una persona experta en la técnica sabe que puede diferir el uso del codón entre los organismos. Por lo tanto, se adaptará al uso del codón en el polinucleótido de la presente invención al uso del organismo en donde el polinucleótido o el polipéptido se expresa. Por consiguiente, la invención se relaciona a polinucleótídos que codifican Rpi-blb2 que contienen cambios en residuos de aminoácidos que no son esenciales para actividad de Rpi-blb2. Tales Rpi-blb2 difieren en secuencia de aminoácidos a partir de una secuencia contenida en la SEC . DE IDENT. NO. : 2 ó 4 aún retiene la actividad de Rpi-blb2 descrita en la presente. El polinucleótido puede comprender una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido, en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácido al menos aproximadamente 70% idéntica a una secuencia de aminoácido de la SEC. DE IDENT. NO.: 2 ó 4 y es capaz de participación en la resistencia a un patógeno de planta. De preferencia, la proteína codificada por la molécula de ácido nucleico es al menos aproximadamente 70% idéntica a la secuencia en la SEC. DE IDENT . NO . : 2 ó 4, más preferiblemente al menos aproximadamente 75% idéntica a una de las secuencias en la SEC. DE IDENT. NO. : 2 ó 4, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 80%, 90%, 95% homologa a la secuencia en la SEC. DE IDENT. NO.: 2 ó 4, y más preferiblemente al menos aproximadamente 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia en la SEC. DE IDENT. NO.: 2 6 4. Para determinar el porcentaje de homología de dos secuencias de aminoácido (por ejemplo, una de las secuencias de la SEC. DE IDENT. NO . : 2 ó 4 y una forma mutante de la misma) o dos ácidos nucleicos, las secuencias se alinean para propósitos de comparación óptimos (por ejemplo, las aberturas pueden introducirse en la secuencia de una proteina o un ácido nucleico para alineamiento óptimo con la otra proteína o el ácido nucleico) . Los residuos o nucleótidos del ácido nucleico en las posiciones de aminoácido correspondientes o posiciones de nucleótido se comparan entonces. Cuando una posición en una secuencia (por ejemplo, una de las secuencias de la SEC. DE IDENT. NO.: 2 ó 4) se ocupa por el mismo residuo o nucleótido de aminoácidos como la posición correspondiente en la otra secuencia (por ejemplo, una forma mutante de la secuencia seleccionada) , entonces las moléculas son homologas a esa posición (es decir, ya que la "homología" del aminoácido o el ácido nucleico utilizado en la presente es equivalente a una "identidad" de aminoácido o ácido nucleico) . El porcentaje de homología entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de homología = números de posiciones idénticas/números totales de posiciones x 100) . La homología puede calcularse en comparación con la ayuda del algoritmo del programa GAP (Wisconsin Package Versión 10.0, Universidad de Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG) , Madison, USA; Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 et seq.), estableciendo los siguientes parámetros : Peso de abertura: 50 Peso de longitud: 3 Equivalencia promedio: 10 Incompatibilidad promedio: 0 Por ejemplo, una secuencia la cual tiene al menos 80% de homología con la secuencia de SEC . DE IDEN . NO.: 1 en el nivel de ácido nucleico se entiende como queriendo decir una secuencia la cual, hasta la comparación con la secuencia SEC. DE IDENT. NO. : 1 por el algoritmo del programa anterior con el conjunto de parámetro anterior, tiene al menos 80% de homología. La homología entre dos polipéptidos se entiende como queriendo decir la identidad de la secuencia de aminoácidos sobre en cada caso la longitud de secuencia completa que se calcula en comparación con la ayuda del algoritmo del programa GAP (Wisconsin Package Versión 10.0, Universidad de isconsin, Genetics Computer Group (GCG) , adison, USA), estableciendo los siguientes parámetros: Peso de abertura: 8 Peso de longitud: 2 Equivalencia promedio : 2 , 912 Incompatibilidad promedio: -2,003 Por ejemplo, una secuencia la cual tiene al menos 80% de homología con la secuencia de SEC. DE IDENT. NO. : 2, en el nivel de proteína se entiende como queriendo decir una secuencia la cual hasta la comparación con la secuencia SEC. DE IDENT. NO. : 2 por el algoritmo de programa anterior con el conjunto de parámetro anterior, tiene al menos 80% de homología . En la presente solicitud, la homología se determinó con el programa clustalW que puede encontrarse en www.ebi.ac.uk/tools, análisis de secuencia elegida y clustalW de opción elegida (alineamientos de secuencia múltiple) . Todas las opciones se realizaron bajo condiciones estándares, como sigue: Alineamiento: total, formato de salida; aln w/números; orden de salida; alineado; alineamiento de color: no; ktup (tamaño de palabra); def; longitud de ventana; def; tipo de puntuación; por ciento; topdiag; def; par de abertura; def; matriz: def; abertura abierta; def; aberturas finales; def; extensión de abertura; def; distancias de abertura; def; modo cpu; solo; gráfico/tipo de árbol; cladograma; gráfico/distancias de árbol; piel; árbol filogenético/tipo de árbol; ninguno; árbol filogenético/dist . Correcta: fuera; árbol filogenético/aberturas Ignoradas: fuera. Por lo tanto un cálculo de homología de acuerdo a ClustalW se prefiere . Los equivalentes funcionales derivados de uno de los polipéptidos como se muestra en la SEC. DE IDEN . NO.: 2 ó 4 de acuerdo con la invención por sustitución, inserción o eliminación tienen al menos 70%, de preferencia al menos 80%, de preferencia al menos 90%, especialmente de preferencia al menos 95%, muy especialmente de preferencia al menos 98%, de homología con uno de los polipéptidos como se muestra en la SEC. DE IDENT. NO . : 2 ó 4 de acuerdo con la invención y se distinguen por esencialmente las mismas propiedades como el polipéptido como se muestra en la SEC. DE IDENT. NO.: 2 ó 4. Los equivalentes funcionales derivados a partir de la secuencia del ácido nucleico como se muestra en la SEC. DE IDENT. NO. : I ó 3 ó 5 ó 6 de acuerdo con la invención por sustitución, inserción o eliminación tienen al menos 70%, de preferencia al menos 80%, de preferencia al menos 90%, especialmente de preferencia al menos 95%, muy especialmente de preferencia al menos 98%, de homología con uno de los polipéptidos como se muestra en la SEC. DE IDENT. NO.: 2 ó 4 de acuerdo con la invención y polipéptidos codificados que tienen esencialmente las mismas propiedades como el polipéptido como se muestra en la SEC. DE IDENT. NO.: 2 ó 4.

"Esencialmente las mismas propiedades" de un equivalente funcional es sobretodo entendido como significando que se atribuye a un fenotipo resistente a patógenos o se atribuye o incrementa la resistencia a al menos un patógeno mientras se incrementa la cantidad de la proteína, la actividad o función de tal equivalente Rpi-blb2 en una planta o en un tejido, parte o células de la misma. La esporulación y el fenotipo de lesión después de la infección en combinación con el incremento de la cantidad de la proteína, la actividad o función del equivalente funcional se entiende además como una propiedad esencial . Una molécula de ácido nucleico que codifica un homólogo Rpi-blb2 a una secuencia de proteínas de la SEC. DE IDENT. NO.: 2 ó 4 puede crearse introduciendo una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones del nucleótido dentro de una secuencia del nucleótido del polinucleótido de la presente invención, en particular de la SEC. DE IDENT. NO. : I ó 3 ó 5 ó 6 de manera que una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones del aminoácido se introducen dentro de la proteína codificada. Las mutaciones pueden introducirse dentro de las secuencias de por ejemplo, la SEC. DE IDENT. NO.: 1 ó 3 ó 5 ó 6 por técnicas estándares, tales como la mutagénesis sitio dirigida y la mutagénesis mediada por PCR. De preferencia, las sustituciones de aminoácido conservadora se hacen en uno o más residuos de aminoácido no esenciales previstos. Una "sustitución de aminoácido conservadora" es aquella en donde el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de los residuos de aminoácido que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales acídicas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína) , cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano) , cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina) . De este modo, un residuo aminoácido no esencial previsto en un pi-blb2 se reemplaza de preferencia con otro residuo aminoácido a partir de la misma familia. Alternativamente, en otra modalidad, las mutaciones pueden introducirse aleatoriamente a lo largo de toda o parte de la secuencia de codificación Rpi-blb2, tal como por mutagénesis por saturación, y los mutantes resultantes pueden seleccionarse para una actividad Rpi-blb2 descrita en la presente para identificar mutantes que retienen actividad Rpi-blb2. Siguiendo la mutagénesis de una de las secuencias de la SEC.

DE IDENT. NO.: 1 ó 3 ó 5 ó 6, la proteína codificada puede expresarse recom inantemente y la actividad de la proteína puede determinarse utilizando, por ejemplo, ensayos descritos en la presente (véanse Ejemplos) . En una modalidad, en el método de la presente invención, la actividad de la proteína pi-blb2 y de una proteína de resistencia adicional se incrementa. Se espera, que bajo condiciones de campo, la presencia de más de un gen de resistencia sea benéfica, en particular genes que confieren resistencia al mismo patógeno. En el caso en donde un patógeno aislado, por ejemplo, una especie de P. infestans, se presenta que es capaz de superar la resistencia de uno de los genes R, el otro o más genes R es/se hacen todavía funcionales, es imposible infectar la planta. Los dos genes presentes invictos reducen fuertemente la oportunidad de que un patógeno, en particular una especie de P. infestans, sea capaz de mutar dentro de una especie que puede superar dos o más genes R. En lo siguiente, el "polipéptido de resistencia" o "proteína de resistencia" se relaciona a un polipéptido cuya actividad (incrementada) conferirá resistencia a un genotipo susceptible ("tipo silvestre" o "referencia"). Por consiguiente, Rpi-blb2 es una proteína de resistencia así como por ejemplo Rpi-blb (o RB o Sbul) . Una "proteína de resistencia adicional" se relaciona a una proteína de resistencia distinta de la proteína de la presente invención, mientras que el término "proteína de resistencia" comprende el polipéptido de la presente invención así como una o más proteínas de resistencia adicionales. Se entiende además que el término . "y una proteína de resistencia adicional" se relaciona a una o más proteínas de resistencia adicional. De este modo, la actividad de una o más proteínas de resistencia puede incrementarse. Las proteínas de resistencia adicionales se describen posteriormente. Sin embargo, generalmente otras proteínas de resistencia conocidas pueden co-expresarse con el polipéptido de la presente invención o su actividad puede incrementarse por cualquiera de los métodos descritos en la presente para Rpi-blb2. En una modalidad preferida, la proteína de resistencia adicional comprende un dominio LRR y un bucle P. La clonación y la caracterización molecular de más de 30 genes (R) de resistencia a enfermedades de plantas confiere resistencia a bacterias, hongos, oomicetes, virus, nemátodos o insectos ha permitido su clasificación en clases estructurales independientemente de la especificidad de los patógenos (revisado en Dangl y Jones, 2001) . La clase más abundante de genes R caracterizados, que comprende aproximadamente 0.5 por ciento de los genes previstos en el genoma Arabidopsis, se predice codificar las proteínas intracelulares que portan dominios de repeticiones ricas en leucina (LRR) y sitios de unión de nucleótido ( BS) , los motivos se encuentran también en otras proteínas receptoras y de transducción de señal. Las proteínas NBS-LRR R difieren principalmente en el término N ya que exhiben similaridad de secuencia a la proteína Drosophila toll y el dominio receptor de interleucina-1 de mamífero (TIR-NBS-LRR) , o el código para la estructura de espirales-unidos (CC-NBS-LRRL) , algunas veces en la forma de cierre de leucina (LZ-NBS-LRR) . Aunque puede ser una membrana asociada, las proteínas NBS-LRR se predicen para ser citoplásmicas . En contraste, dos diferentes clases de proteínas R que portan LRRs se predicen para abarcar la membrana celular, con un dominio LRR extracelular : las proteínas Cf de LRR- ransmembrana (LRR-TM) y la proteína Xa21 de LRR-TM-cinasa . Las proteínas R caracterizadas que carecen de LRRs son el gen Pto del tomate, el gen Hsl^0"1 de remolacha, el gen mío de cebada, los genes Rpw8 de Arabidopsis y el gen Rpgl de cebada. De acuerdo a la hipótesis de gen para gen, la resistencia a la enfermedad sigue la percepción por las proteínas R de plantas de las moléculas efectoras patogénicas con función de avirulencia (Avr) , por lo que se inicia a través de alguna clase del complejo de reconocimiento descubridor, las trayectorias de transducción de señal que conduce a respuesta hipersensible (HR) . En común con otros receptores, se considera generalmente que las proteínas NBS-LRR R tienen una estructura modular con reconocimiento separado y dominios de señalización, por lo que la LRR es el dominio de reconocimiento candidato y la región N-terminal que incluye NBS, el mayor dominio de señalización. El análisis funcional de las proteínas R recombinantes indica que la especificidad de reconocimiento reside ciertamente en la LRR. Además, la LRR es la región más variable en las proteínas NBS-LRR estrechamente relacionadas y está bajo selección para divergir. Sin embargo, se acumula evidencia de que las LRRs contribuyen también a señalización a través de regulación negativa que implica interacciones intramoleculares putativas. Actualmente, cinco genes R se han clonado a partir de papa, incluyendo dos genes R que confieren resistencia a añublo tardío, y pertenecen todos a la clase de CC/LZ-NBS-LRR de genes R de plantas. Aunque el S. demissum derivado del gen Rl confiere resistencia específica de especie a añublo tardío, el S. bulbocastanum recientemente clonado derivado del gen Rpi-blb (o RB o Sbul) confiere resistencia total a un rango de aislados P. infestans que portan factores de virulencia múltiples y no se ha demostrado todavía la especificidad de especie. Además, como se describe anteriormente, las plantas progenie de híbridos somáticos que contienen Rpi-blb no se afectaron por añublo tardío en experimentos de campo en México, en donde casi cada especie de los hongos se encuentra. A través de la complementación del fenotipo susceptible en papa y tomate cultivado, el potencial de transferencia interespecífica de la resistencia de añublo tardío de espectro amplio a solanáceas cultivadas a partir de especies huéspedes sexualmente incompatibles por la transformación con genes R clonados sencillos se demostró. US 6,127,607 describe proteínas de resistencia con dominios LRR y bucles P. El contenido de US 6,127,607 se incorpora aquí para referencia. En particular, las columnas 6 a 8 y columna 11 describen dominios LRR y bucles P. Además, Song, 2003, PNAS 100 (16) , 9128-9133 muestra una comparación de motivos Rpi-blb LRR en la Figura 4 y da en las páginas 9132 en la visión general acerca de los dominios LRR. Los dominios del polipéptido de la presente invención se muestran en la Figura 14 así como en la Figura 15. De preferencia, la actividad de una o más proteínas de resistencia seleccionada a partir del grupo que consiste de Rpi-blb (sinónimo RB o Sbul) , Rpi-ABPTl, Rpi-blb3, Rpi-mcd, Rl, R-ber (sinónimo R12), Rpil, R2 , R3a, R3b, R4 , R5 , R6, R7, R8, R9, R19, Rll, Ph-1, Ph-2 y Ph-3 se incrementa. Se prefiere que además de Rpi-blb2 al menos también se incremente la actividad de Rpi-blb. En una modalidad de la presente invención, la expresión de por ejemplo, una proteína de Rpi-blb2 transgénica se incrementa y la expresión del gen de resistencia transgénica se incrementa. La proteína de resistencia co-expresada con la Rpi-blb2 (o RB o Sbul) es de preferencia una de las proteínas de resistencia mencionadas en la presente, en particular Rpi-blb, Rpi-ABPTl, Rpi-blb3 , Rl, Rpil, R-ber, Rpi-mcd, R2 , R3a, R3b, R6, R7, P -1, Ph-2 o Ph-3, pero pueden también ser uno de las resistencias a patógenos de plantas que confieren proteínas conocidas por una persona experta en la técnica. Como se menciona, el término "expresión incrementada" de acuerdo a esta invención incluye también una Expresión de novo de un polinucleótido o un polipéptido. Más preferido es un incremento de resistencia a través de la co-expresión del polipéptido de la presente invención junto con Rpi-blb. Rpi-blb y Rpi-blb2 proporciona la resistencia total tanto en ensayos de hojas separadas a aislados de P. infestans como se describe en los ejemplos, como en Song 2003, PNAS 100 (16), 9128. Los genes que confieren resistencia se describen por ej emplo en RB or Sbul (synonym of Rpi-blb) : ??336128 [gi : 32693280], (Song et al., 2003) . BAC clones 177 013 and CB3A14 comprising the Rpi-blb gene nave been deposited in GenBank with accessíon nos AY303171 and AY303170. Rl: AF447489 [gi : 9117432422], (Ballvora et al., 2002) Rpil: Kuhl, J.C., Hanneman, R.E., and Havey, M.J., (2201) Characterization and mapping of Rpil, a late blight resistance locus from diploid (1 EBN) Mexican Solanum pinna isectum. Molecular gene . Genomics 265: 977-985. R-ber: Ewing, E.E., Simko, I., Smart , C.D., Bonierbale, M.W., Mizubuti, E.S.G., May, G.D., and Fry, W.E., (2000) Genetic mapping from field tests of qualitative and quantitative resistance to Phytophthora infestans in a population derived from Solanum tuberosum and Solanum berthaultii . Molecular breeding 6:25-36. R2 : Li, X., vanEck, H.J., vanderVoort, J.N.A.M., Huigen, D.J., Stam, P., and Jacobsen, E. (1998) Autotetraploids and genetic mapping using common AFLP markers : the R2 alíele conferring resistance to Phytophthora infestans mapped on potato chromosome 4. Theoretical and Applied Genetics 96 (8): 1121-112. R3 , R6, R7 : Elkharbotly, A. , Palomínosanchez, C. , Salamini, F. , Jacobsen, E., and Gebhardt , C. (1996) R6 and R7 alíeles of potato conferring race-specific resistance to Phytophthora infestans (Mont) de Bary identified genetic loci clustering with the R3 locus on chromosome XI. Theoretical and Applied. Genetics 92 (7): 880-884. Ph-1: Bonde and Murphy (1952) Main Agrie. Exp. Stn. Bull. No 497 Ph-2 : Moreau, P., Thoquet, P., Olivier, J. , Laterrot, H . , and Grimsley, N.H. (1998) Genetic mapping of Ph-2, a single locus controlling partial resistance to Phytophthora infestans in tomato. Molecular Plant Microbe Interactions 11 (4) : 259-269. Ph-3 : Chunwongse, J. , Chunwongse, C., Black, L., and Hanson, P. (2002) Molecular mapping of the Ph-3 gene for late blight resistance in tomato. Journal of Horticultural Science & Biotechnology 77 (3): 281-286. Rpi-blb3, Rpi-ABPTl and Rpi-racd: Park, T.H., Van der Vossen, E . , Vleeshouwers , V.G.A.A. , Tan, A., Visser, R.G.F. and Van Eck, H.J. 2004. Maj or resistance genes for tuber and leaf resistance to Phytophthora infestans in potato: An outline of a PhD project. Crop Functional Genomics 2004, July 2004, Jeju, Korea, page 93. R3a and R3b: Huang, S., Vleeshouwers, V.G.A.A., Werij , J.S., Hutten, R.C.B., Van Eck, H.J., Visser, R.G.F, and Jacobsen, E. (2004) . The R3 resistance to Phytophthora infestans in potato is conferred by two closely linked R genes with distinct specificities . MPMI 17 (4), 428-435. En una modalidad, la actividad de Rpi-blb2 se incrementa de acuerdo con la presente invención, por ejemplo, el polinucleótido de la expresión de la invención se incrementa y la expresión de al menos una molécula de ácido nucleico se incrementa codificando Rpi-blb, rpi-ABPTl, Rpi-blb3, Rpi-mcd Rl , R-ber, Rpil, R2 , R3a, R3b, R6 , R7 , Ph-1, Ph-2 y/o Ph-3 por lo que la molécula del ácido nucleico se selecciona a partir del grupo que consiste de: a) molécula de ácido nucleico que codifica al menos una forma madura de al menos a Rpi-bib (or RB- or Sbul-) polypeptide, preferably as encoded by the sequence shown in GenBank Accession no.: AY336128 [gi : 32693280]; a Rl polypeptide, preferably as encoded by the sequence shown ín GenBank Accession no.: AF447489 [gi 9117432422] ; a Rpi-bib3, Rpi-ABPTl and/or Rpi-mcd polypeptide, preferably encoded by the sequence shown in or derivable by the information given in Park, T.H., Van der Vossen, E . , Vleeshouwers , V.G.A.A., Tan, A., Visser, R.G.F. and Van Eck, H.J. 2004. Major resistance genes for tuber and leaf resistance to Phytophthora infestans in potato: An outline of a PhD project. Crop Functional Genomics 2004, July 2004, Jeju, Korea, page 93; a R3a and/or R3b polypeptide, preferably encoded by the sequence shown in or derivable by the information given in Huang, S., Vleeshouwers, V.G.A.A., Weri , J.S., Hutten, R.C.B., Van Eck, · H.J., Visser, R.G.F, and Jacobsen, E. (2004) . The R3 resistance to Phytophthora infestans in potato is conferred by two closely linked R genes with distinct specificities . MPMI 17 (4), 428-435 and/or un patógeno, de preferencia P. infestans, una proteína que confiere resistencia mapeada y caracterizada como se describe por ejemplo para for pil in uhl, J.C., Hanneman, R.E., and Havey, M.J., (2001) Characterization and mapping of Rpil, a late blig t resistance locus from diploid (1EBN) Mexican Solanum pinnatisectum. Molecular genet . Genomics 265: 977-985; for R-ber in Ewing, E.E., Simko, I., Smart , C.D., Bonierbale, M.W. , Mizubuti, E.S.G., May, G.D., and Fry, W.E., (2000) Genetic mapping from field tests of qualitative and quantitative resistance to Phytophthora infestans in a population derived from Solanum tuberosum and Solanum berthaultii . Molecular breeding 6: 25-36; for R2 in Li, X., vanEck, H.J., vanderVoort , J.N.A.M., Huigen, D.J., Stam, P. , and Jacobsen, E. (1998) Autotetraploids and genetic mapping using common AFLP markers : the R2 alíele conferring resistance to Phytophthora infestans mapped on potato chromosome 4. Theoretical and Applied Genetics 96 (8): 1121-1128; for R3 , R6 , R7 in Elkharbotly, A., Palominosanchez , C., Salamini, F . , Jacobsen, E . , and Gebhardt, C. (1996) R6 and R7 alíeles of potato conferring race-specific resistance to Phytophthora infestans (Mont) de Bary identified genetic loci clustering ith the R3 locus on chromosome XI . Theoretical and Applied. Genetics 92 (7) : 880-884; for Ph-1 in Bonde and Murphy (1952) Main Agrie. Exp. Stn. Bull. No 497; or for Ph-2 in Moreau, P., Thoquet , P., Olivier, J. , Laterrot, H . , and Grimsley, N.H. (1998) Genetic mapping of Ph-2, a single locus controlling partial resistance to Phytophthora infestans in tomato. Molecular Plant Microbe Interactions 11 (4) : 259-269; and/or for Ph-3 in Chunwongse, J. , Chunwongse, C. , Black, L . , and Hanson, P. (2002) Molecular mapping of the Ph-3 gene for late blight resistance in tomato. Journal of Horticultural Science & Biotechnology 77 (3) : 281-286; o un polipéptido que confiere resistencia a patógenos, de preferencia resistencia de P. infestans que confiere un polipéptido derivado de tales publicaciones; b) una molécula del ácido nucleico, la secuencia del nucleótido de la cual se degenera como un resultado del código genético a una secuencia del nucleótido de (a) ; c) una molécula del ácido nucleico que codifica un polipéptido derivado del polipéptido codificado por un polinucleótido de (a) o (b) a modo de sustitución, eliminación y/o adhesión de uno o varios aminoácidos de la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por un polinucleótido de (a) o (b) ; d) una molécula del ácido nucleico que codifica un polipéptido, la secuencia de la cual tiene una identidad del 70% o más a la secuencia del aminoácido del polipéptido codificado por una molécula del ácido nucleico de (a) ; e) moléculas del ácido nucleico que comprenden un fragmento o una porción que soporta la epítope de un polipéptido codificado por una molécula del ácido nucleico de cualquiera de (a) a (d) ; f) la molécula del ácido nucleico que codifica un fragmento que inicia con el aminoácido: 1, 30, 50, 100, 200, 500 ó 1000, y se detiene con el aminoácido 1267, 1000, 500, 300, 200, 50, 30 ó 1 de un polipéptido codificado por cualquiera de (a) a (e) y con una de tales actividades; g) la molécula del ácido nucleico que comprende al menos 20 nucleótidos de un polinucleótido de cualquiera de (a) o (b) ; h) la molécula del ácido nucleico que codifica un polipéptido que se reconoce por un anticuerpo monoclonal que se ha producido contra un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de cualquiera de (a) a (f) ; i) la molécula del ácido nucleico obtenible al seleccionar una biblioteca apropiada bajo condiciones severas con una sonda que tiene la secuencia de la molécula del ácido nucleico de cualquiera de (a) a (h) o de un fragmento del mismo de al menos 20, de preferencia 30 o más nucleótidos; y j) la molécula del ácido nucleico, la hebra complementaria de la cual hibridiza bajo condiciones severas con una molécula de ácido nucleico de cualquiera de (a) o (i) ; o la hebra complementaria de cualquiera de (a) a (j) · Por consiguiente, el método de la presente invención confiere resistencia a una de las plantas, un tejido de planta o células de planta de la presente invención a un patógeno de planta de un phylum Oomycetes, de preferencia a un patógeno del orden de Phythiales o Peronosperales , más preferido a la familia Pythiaceae o Peronosporaceae , más preferido del género Phytophthora o Bremia o Peronospera o Plasmopara, más preferido en donde el patógeno es de la especie Phytophthora parasítica var. Nicotianae (provocando, entre otras cosas, el tallo negro en el tabaco) , Phytophthora sojae (provocando putrefacción de raíz de Phytophthora en soya) , Phytophthora capsici (provocando putrefacción en pimiento y calabazas y tomate) , Phytophthora erythroseptica (provocando putrefacción rosa en papa) , Plasmopara vitícola (provocando roya suave en la vid) , Bremia lactuca (provocando roya suave en lechuga) o Peronospora tabaco (provocando moho azul en tabaco) . La actividad de Rpi-blb2 en una planta, una célula de planta, un tejido de planta, un órgano de planta o parte de las mismas de acuerdo con la presente invención puede incrementarse, generarse o estimularse a través de métodos que son bien conocidos por una persona experta en la técnica y por ej emplo se describen en Sambrook et al . , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Y, 1989.

De este modo, en una modalidad preferida, la presente invención se relaciona al método de la invención, en donde la expresión es una expresión de novo. El término "Expresión de novo" en una célula, un tejido o en un organismo o en una parte del mismo como se entiende en la presente se relaciona a la expresión de un producto genético después de una no detectabilidad previa del producto genético o una actividad del producto genético, en particular de un polipéptido o un polínucleótido correspondiente en una célula, un tejido o un organismo o una parte del mismo. Se prefiere que el gen que codifica un polipéptido o un polínucleótido en una célula, un tejido o en un organismo o en partes del mismo y que debe de ser expresado de novo no se presenta en el genoma en una célula, un tejido o en un organismo o en parte del mismo. Si la expresión de un producto genético no puede detectarse en una célula, un tejido o en un organismo o en partes del mismo, se asume generalmente que no ocurre ninguna expresión en una célula, un te ido o en un organismo o en partes del mismo. Por consiguiente, si la actividad no puede detectarse, se asume generalmente que no existe actividad correspondiente. Una persona experta en la técnica, sin embargo, sabe que los métodos y medios de detección desarrollan sensibilidad más elevada. De este modo, en una modalidad preferida, el término "Expresión de novo" se relaciona a una expresión novedosa o adicional en sistemas, en donde el nivel de la actividad, por ejemplo debido a un nivel de expresión bajo o a la expresión de un producto genético (casi) inactivo es muy bajo para conferir cualquier resistencia a un patógeno de la planta, particular a P. infestans. Una comparación de una cepa expulsada y un fenotipo-cepa de expresión elevada y/o baja puede mostrar,- ya sea cualquier diferencia en la resistencia a cualquiera de los patógenos mencionados en la presente es observable . Por consiguiente, en otra modalidad de la presente invención, la actividad endógena de una Rpi-blb2 y/o una proteína de resistencia adicional se incrementa. El nivel de expresión en una célula puede incrementarse por métodos conocidos por una persona experta en la técnica. Varias técnicas se describen en la presente, por ejemplo la expresión transgénica del polinucleótido o el polipéptido de la presente invención. El polinucleótido o polipéptido puede ser de origen extraño. Se prefiere que un polinucleótido del mismo origen genético como la célula huésped, la célula de planta, el tejido de planta o la planta se introduzca. La actividad, en particular una actividad endógena, pero también la actividad de una Rpi-blb2 expresada transgénica puede incrementarse por varios métodos. Por consiguiente, en una modalidad preferida, la actividad de las proteínas resistentes descritas en la presente se incrementa por una o más de las siguientes etapas a) estabilizar la proteína de resistencia; b) estabilizar la proteína de resistencia que codifica ARNm; c) incrementar la actividad específica de la proteína de resistencia; d) expresar o incrementar la expresión de un factor de transcripción homólogo o artificial para expresión de resistencia; e) estimular la actividad de proteína de resistencia a través de factores de inducción exógena; f) expresar un gen de resistencia transgénico; y/o g) incrementar el número de copias del gen que codifica resistencia. En general, una actividad en un organismo, en particular en una célula de planta, una planta, o un tejido de planta puede incrementarse incrementando la cantidad de la proteína específica, es decir de la proteína de resistencia, en tal organismo. "Cantidad de proteínas" se entiende como queriendo decir la cantidad de un polipéptido, de preferencia Rpi-blb2, en un organismo, un tejido, una célula o un compartimiento celular. "Incremento" de la cantidad de la proteína significa el incremento cuantitativo de la cantidad de una proteína en un organismo, un tejido, una célula o un compartimiento celular - por ejemplo por uno de los métodos descritos en la presente posteriormente - en comparación con el tipo silvestre del mismo género y especie, al cual este método no se ha aplicado, bajo condiciones de otra manera idénticas (tal como, por ejemplo condiciones de cultivo, edad de la planta y similares) . El incremento llega a ser al menos 10%, de preferencia al menos 20%, al menos 50%, especialmente de preferencia al menos 7Q% o 90%, muy especialmente de preferencia al menos de 100%, más preferiblemente al menos 200% o más. "Incremento" de la actividad se entiende como queriendo decir el incremento de la actividad total de una proteína en un organismo, un tejido, una célula o un compartimiento celular en comparación con el tipo silvestre del mismo género y especie, al cual este método no se ha aplicado, bajo condiciones de otra manera idénticas (tales como por ejemplo, condiciones de cultivo, edad de la planta y similares) . El incremento llega a ser al menos 10%, de preferencia al menos 20% o al menos 50%, especialmente de preferencia al menos 70% o 90%, muy especialmente de preferencia al menos 100%, más preferiblemen e al menos 200% o más . En este contexto, la eficacia de la resistencia a patógenos puede desviarse tanto ascendente como decendentemente en comparación con un valor obtenido cuando se incrementa una de las proteínas Rpi-blb2 como se muestra en la SEC . DE IDENT. NO.: 2 ó 4. Los equivalentes funcionales preferidos son aquellos en donde la eficacia de la resistencia al patógeno-medida , por ejemplo, por la eficacia de penetración de un patógeno o como se describe en la presente "difiere por no más del 50%, de preferencia 25%, especialmente de preferencia 10% de un valor comparativo obtenido al reducir una proteína Rpi-blb2 como se muestra en la SEC. DE IDENT. NO.: 2 ó 4. Especialmente preferidas son aquellas secuencias en donde el incremento incrementa la eficacia de resistencia a patógenos cuantitativamente por más de 50%, de preferencia 100%, especialmente de preferencia 500%, muy especialmente de preferencia 1000% con base en el valor comparativo obtenido al reducir una de las proteínas Rpi-blb2 como se muestra en la SEC . DE IDENT. NO.: 2 ó 4. Cualquier comparación se lleva a cabo de preferencia bajo condiciones análogas. "Condiciones análogas" significa que todas las condiciones tales como por ejemplo, condiciones de cultivo o crecimiento, condiciones de ensayo (tales como tampón, temperatura, sustratos, concentración de patógenos y similares) se mantienen idénticas entre los experimentos que se comparan y que las disposiciones difieren sólo por la secuencia de los polipéptidos Rpi-blb2 que se comparan, sus organismos de origen y si es apropiado el patógeno. Cuando se elige el patógeno, cada comparación requiere que se elija el patógeno el cual es más similar al otro equivalente, tomando en consideración la especificidad de especie. Debido a la actividad de Rpi-blb2 incrementada, la resistencia de una planta o parte de la misma se incrementa. En una modalidad preferida, el método de la presente invención resulta en la reducción en el índice de esporulación de al menos 30% después de la infección con P. infestans comparada al tipo silvestre, más preferida es una reducción de 50%, aún más preferida son 70%, aún más preferida son más del 80%, más preferidas son 85% y 90%. Más preferida es 95% ó más. Por consiguiente, la presente invención se relaciona también al polinucleotido de la invención, como se define anteriormente codificando una proteina de Rpi-blb2 que comprende una molécula de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo que consiste de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican al menos la forma madura del polipéptido descrito en la SEC. DE IDENT. NO. : 2 Ó 4; b) moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de codificación como se describe en la SEC. DE IDENT. NO. : 1 ó 3 ó 5 ó 6 que codifica al menos la forma madura del polipéptido; c) moléculas de ácido nucleico, la secuencia de nucleótido la cual se degenera como un resultado del código genético a una secuencia de nucleótido de (a) o (b) ; d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido derivado a partir de un polipéptido codificado por un polinucleótido de (a) a (c) a modo de sustitución, eliminación y/o adición de uno a varios aminoácidos de la secuencia de aminoácido del polipéptido codificado por un polinucleótido de (a) a (c) ; e) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido, la secuencia de la cual tiene una identidad del 70% o más de la secuencia de aminoácido del polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de (a) o (b) ; f) moléculas de ácido nucleico que comprenden un fragmento o una porción que soporta un epítope de un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico por cualquiera de (a) a (e) ; g) moléculas del ácido nucleico que comprenden un polinucleótido que tiene una secuenciación de una molécula de ácido nucleico amplificada a partir de una biblioteca de ácido nucleico que utiliza los cebadores como se listan en la Tabla 3b, de preferencia ARFIF y ARFIR; h) moléculas de ácido nucleico que codifican un fragmento que inicia con el aminoácido: 1, 30, 50, 100, 200, 300, 500 ó 1000 y se detiene con el aminoácido 1276, 1000, 500, 300, 200, 50, 30 ó 1 de un polipéptido codificado por cualquiera de (a) a (g) i) moléculas de ácido nucleico que comprenden al menos 20 nucleótidos de un polinucleótido de cualquiera de (a) o (d) ; j ) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que se reconoce por un anticuerpo monoclonal que se ha incrementado contra un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de cualquiera de (a) a (h) ; k) moléculas de ácido nucleico obtenibles al seleccionar una biblioteca apropiada bajo condiciones de severidad con una sonda que tiene la secuencia de la molécula del ácido nucleico de cualquiera de (a) a (j) o de un fragmento del mismo de al menos 15 , de preferencia 30, 60, 90 ó más nucleótidos; y 1) moléculas de ácido nucleico, la hebra complementaria de la cual hibridiza bajo condiciones de severidad con una molécula de ácido nucleico de cualquiera de (a) o (k) ; o la hebra complement ria de cualquiera de (a) a (i) ; o codificando un polipéptido codificado con un segmento del cromosoma 6 o al grupo de enlace 6 de Solanum bulbocastanum, el cual se co-segrega con un marcador seleccionado a partir de la tabla 3a o 3b y el cual media resistencia a patógenos de plantas, de preferencia del phylum Oomycetes ; En una modalidad, el polinucleotido de la invención no consiste de la secuencia descrita en la SEC . DE IDENT. NO. : 7 y/o 9 y/o no consiste de la secuencia de una molécula de ácido nucleico que codifica una proteina descrita en la SEC . DE IDENT. NO.: 8 y/o 10. En una modalidad, el polinucleotido de la presente invención no consiste de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de Mi1.1 o Mil.2 y/o de una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de Mil.l o Mil .2. De este modo, en una modalidad, el polinucleotido de la presente invención puede no consistir de las secuencias mostradas en Rossi et al. 1998, PNAS USA 95:9750-9754, Milligan et al., 1998. Plant Cell 10:1307-1319; y/o WO 9806750. En una modalidad adicional, el polinucleotido de la presente invención se deriva o aisla a partir del genoma de un organismo seleccionado a partir del grupo que consiste de Menyanthaceae , Solanaceae, Sclerophylacaceae , Duckeodendraceae , Goetzeaceae, Convolvulaceae, Custucaceae, Polemoniaceae e Hydrophyllaceae de acuerdo al Sistema Naturae 2000, Brands, S.J., Ámsterdam o tiene su origen del mismo, más preferiblemente se selecciona a partir del grupo que consiste de Atropa, Browallia, Brunfelsia, Capsicum, Cestrum, Cyphomandra, Datura, Fabiana, Franciscea, Hyoscyamus, Lycium, Mandrágora, Nicandra, Nicotiana, Petunia, Physalis, Schizanthus y Solanum de acuerdo a Sistema Naturae 2000, Brands, S.J., Ámsterdam o tiene su origen del mismo, aún más preferida es una selección fuera del grupo que consiste de la familia de la solanaceae, de preferencia S. bulbocastanum, papa (S. tuberosum) , tomate (S. lycopersicum) , petunia, planta del tomate (S. betaceum) , melocotón (S. muricatum) y berenjenas (S. melongena) . Aún más preferidos son el tomate y la papa o S. bulbocastanum como fuente para el polinucleotido de la presente invención. Más preferido es S. bulbocastanum como fuente . Rpi-blb2 se ha aislado a partir del material S.tuberosum derivado a partir de ABPT. De este modo, a partir de una perspectiva taxonómica la Rpi-blb2 descrita también se deriva de S. tuberosum. Sin embargo, el gen se presentó en un fragmento de intxogresión presumiblemente derivado a partir de S. bulbocastanum. Muchas de las variedades de S. tuberosum contienen fragmentos de introgresión de especies Solanum relacionadas, pero todavían son S. tuberosum. Por lo tanto, S . tuberosum puede de acuerdo al sistema taxonómico ser también una fuente para el polinucleotido de la presente invención, en particular S. tuberosum derivado de ABPE, así como otras variedades de otras variedades de la especie Solanum derivadas en una manera similar. Por consiguiente, en otra modalidad, el polinucleótido de la presente invención se deriva a partir de S. tuberosum. Un polinucleótido de la presente invención, por ejemplo, una molécula del ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótido de la SEC. DE IEENT . NO . : 1 ó 3 ó 5 ó 6 o una porción de la misma, puede aislarse utilizando técnicas de biología molecular estándar y la información de secuencia provista en la presente. Por ejemplo, el ADNc de Rpi-blb2 puede aislarse a partir de una biblioteca utilizando todo o una porción de una de las secuencias del polinucleótido de la presente invención como una sonda de hibridización y técnicas de hibridización estándares (por ejemplo, como se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) . Además, un polinucleótido que abarca todo o una porción de una de las secuencias del polinucleótido de la presente invención puede aislarse por la reacción de cadena de polimerasa utilizando cebadores de oligonucleotido diseñados con base en esta secuencia (por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que abarca todo o una porción de una de las secuencias de polinucleótido de la presente invención) . Por ejemplo, el ARNm puede aislarse a partir de células, por ejemplo, S. bulbocastanum u otra planta (por ejemplo, por el procedimiento de extracción de guanidinio-tiocianato de Chirgwin et al. (1979) Biochemistry 18: 5294-5299) y ADNc puede prepararse utilizando transcriptasa inversa (por ejemplo, transcriptasa inversa Moloney MLV, disponible de Gibco/BRL, Bethesda, MD; o transcriptasa inversa AMV, disponible de Seikagaku America, Inc., St . Petersburg, FL) . Los cebadores de oligonucleótidos sintéticos para la amplificación de reacción de cadena de polimerasa pueden diseñarse con base en las secuencias de nucleótido mostradas en la SEC. DE IDENT. NO.: 1 ó 3 ó 5 ó 6. Un polinucleótido de la invención puede amplificarse utilizando ADNc o alternativamente el ADN genómico, como una plantilla y cebadores de oligonucleótidos apropiados de acuerdo a técnicas de amplificación de PCR estándar. El polinucleótido así amplificado puede clonarse dentro de un vector apropiado y caracterizarse por un análisis de secuencia de ADN. Además, los oligonucleótidos gue corresponden a una secuencia de nucleótido Rpi-blb2 pueden prepararse por técnicas estándares sintéticas, por ejemplo, utilizando un sintetizador de ADN automatizado . En una modalidad de la- presente invención, la proteína Rpi-blb2 se codifica por un segmento del cromosoma 6 o un grupo 6 de enlace de Solanum bulbocastanum o S . tuberosum. Además, la presente invención comprende un segmento del cromosoma 6 o un grupo 6 de enlace de S. bulbocastanum o S. tuberosum. En una modalidad preferida en el método de la presente invención, la proteína Rpi-blb2 expresada se codifica por un polinucleotido que comprende un segmento del cromosoma 6 o un grupo 6 de enlace de S. bulbocastanum. De preferencia, el segmento del grupo comprende además un elemento de acción cis, por ejemplo, promotores, mej oradores, sitios de unión, etc., o elementos de acción trans, como co-factores, activadores u otras proteínas de resistencia, que confieren una resistencia incrementada. Los fragmentos genómicos que comprenden el gen Rpi-blb2 y los elementos reguladores adicionales se describen en la SEC. DE IDENT. NO . : 5j 6. Un experto en la técnica sabe cómo obtener un segmento del cromosoma, por ejemplo, clonando fragmentos del cromosoma en BACs, como por ejemplo, Song, 2003, PNAS 100 (16) , 9128 o como se describe en la presente y en las referencias citadas en la presente . Por consiguiente, en una modalidad adicional, el polinucleotido de la presente invención o un polinucleotido que codifica la proteína Rpi-blb2 se co- segrega con un marcador seleccionado a partir de la tabla 3a o comprende un sitio de replicación o sitio de hibridización del marcador. Como se describe en detalle en los ejemplos, la resistencia a P. infestans podría mapearse con los marcadores descritos en la tabla 3a o 3b. Entre más cercano se ubica un marcador a un gen, más elevado es el porcentaje de líneas, es decir, clones de descendencia, en donde el gen se co- segrega con el marcador. Por lo tanto, en una modalidad preferida, el polinucleótido de la presente invención se co-segrega con el Marcador E40M58, CT119 y/o CT216. En una modalidad adicional, la presente invención se relaciona a un método para hacer un vector recombinante que comprende insertar el polinucleótido de la presente invención en un vector o insertar el polinucleótido y una proteina de resistencia adicional en un vector. Por consiguiente, en una modalidad adicional, la presente invención se relaciona a un vector que contiene el polinucleótido de la presente invención del polinucleótido y un gen de resistencia adicional producido por el método de la presente invención. Como se utiliza en la presente, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar un polinucleótido al cual se ha enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido" , el cual se refiere a un bucle de ADN de doble hebra, circular dentro del cual los segmentos de ADN adicionales pueden ligarse. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde los segmentos de ADN o ARN adicionales pueden ligarse dentro del genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped dentro de la cual se introducen (por ejemplo, vectores bacteriales que tienen un origen bacterial de replicación y vectores de mamíferos episomales) . Otros vectores (por e emplo, vectores mamíferos no episomales) se integran dentro del genoma de una célula huésped en la introducción en la célula huésped, y por lo que se replica junto con el genoma huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales se enlazan operativamente. Tales vectores se refieren en la presente como "vectores de expresión" . En general, los vectores de expresión de la utilidad en las técnicas de ADN recombinantes , están con frecuencia en la forma de plásmidos . En la presente especificación, "plásmido" y "vector" pueden utilizarse intercambiablemente ya que el plásmido es la forma más comúnmente utilizada del vector. Sin embargo, la invención se pretende para incluir tales otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus defectuosos de replicación, adenovirus y virus adeno-asociados) , que sirven funciones equivalentes . La presente invención se relacionan también a cósmidos, virus, bacteriófagos y otros vectores utilizados convencionalmente en el diseño genético que contiene una molécula del ácido nucleico de acuerdo con la invención. Los métodos que son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica pueden utilizarse para construir diversos plásmidos y vectores; véase por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring HArbor Laboratory (1989) ?.?: y Ausubel , Current Protocols en Molecular Biology, Green Publishing Associates y Wiley Interscience , N.Y. (1989) . Alternativamente, las moléculas del ácido nucleico y los vectores de la invención pueden reconstituirse dentro de liposomas para el suministro de células objetivo. En otra modalidad, el vector de la presente invención o el método de la presente invención se caracteriza en la presente, ya que el polinucleótido que codifica la proteína Rpi-blb2 o una proteína de resistencia adicional se enlaza operativamente a las secuencias de control de expresión y/o una enlazada a una secuencia del ácido nucleico que codifica una señal de regulación de expresión transgénica que permite la expresión en células huéspedes procarióticas o eucarióticas . En una modalidad preferida, la presente invención se relaciona a un vector de la presente invención o el método de la presente invención en donde el polinucleótido que codifica la proteína Rpi-blb2 y/o la proteína de resistencia adicional se enlaza operativamente a secuencias de control de expresión del mismo origen de especies ya que el polinucleótido codifica la proteína Rpi-blb2 y/o la proteína de resistencia adicional. En el caso en donde una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención se expresa en una célula, ésta está en un principio posible que modifica la secuencia de codificación de tal manera que la proteína se ubica en cualquier compartimiento deseado de la célula de planta. Estas incluyen el núcleo, el retículo endoplasmático, la vacuola, la mitocondria, los plástidos como amiloplastos , cloroplastos , cromoplastos , el apoplasto, el citoplasma, el espacio extracelular, cuerpos oleosos, peroxisomas y otros compartimientos de las células de planta (para revisión véase Kermode, Crit . Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996), 285-423 y referencias citadas en la presente) . El polinucleotido puede combinarse entonces operativamente a un polinucleotido, por ejemplo un vector que codifica una señal para el transporte dentro del compartimiento deseado. En otra modalidad preferida de la presente invención, se relaciona a un vector en donde el polinucleotido de la presente invención se enlaza operativamente a secuencias de control de expresión que permite la expresión en células huéspedes procariótícas o eucarióticas . La naturaleza de tales secuencias control difiere dependiendo del organismo huésped. En procariotes, las secuencias control generalmente incluyen el promotor, el sitio de unión ribosomal, y los terminadores . En eucariotes, las secuencias generalmente control incluyen promotores, terminadores y en algunos casos, mej oradores, transactivadores ; o factores de transcripción. El término "secuencia control" se pretende para incluir, en un mínimo, componentes de la presencia de la cual son necesarios para la expresión, y pueden también incluir componentes ventajosos adicionales. El término "operativamente enlazado" se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes así descritos están en una relación que les permite funcionar en su manera pretendida. Una secuencia control "enlazada operativamente" a una secuencia de codificación se liga de tal manera que la expresión de la secuencia de codificación se logra bajo condiciones compatibles con las secuencias control . En caso de que la secuencia control sea un promotor, es obvio para una persona experta que se utilice el ácido nucleido de doble hebra . El enlace operable se entenderá como midiendo por ejemplo, la disposición secuencial de un promotor con la secuencia del ácido nucleico que se expresa y, si es apropiado, los elementos reguladores adicionales pueden cumplir su función cuando la secuencia de ácido nucleico se expresa recombinantemente, dependiendo de la disposición de las secuencias de ácido nucleico en relación al AR sentido o antisentido. Con este fin, el enlace directo en el sentido químico no se requiere necesariamente. Las secuencias de control genético tales como por ejemplo, secuencias mej oradoras , pueden ejercer también su función en la secuencia objetivo a partir de las posiciones las cuales son extrañas, o realmente a partir de otras moléculas de ADN. Las disposiciones preferidas son aquellas en donde la secuencia de ácido nucleico que se expresa recombinantemente se coloca detrás de la secuencia que actúa como un promotor, de manera que las dos secuencias se enlazan covalentemente entre sí. La distancia entre la secuencia promotora y la secuencia de ácido nucleico que se expresa recombinantemente es menos preferiblemente que 200 pares de bases, especialmente de preferencia menos de 100 pares de bases, muy especialmente de preferencia menos de 50 pares de bases. El enlace operable y un cásete de expresión, puede generarse por medio de técnicas de recombinación y clonación convencionales como se describen por ejemplo, en Maniatis T, Fritsoh EF y Sambrook J (1989) Molecular Cloning-. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY) , en Silhavy TJ, Berman ML y Enquist LW (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY) , en Ausubel FM et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc . y Wiley Interscience y en Gelvin et al. (1990) en: Plant Molecular Biology Manual. Sin embargo, secuencias adicionales que, por ejemplo, actúan como un enlazador con sitios de desdoblamiento específicos para enzimas de restricción, o como un péptido de señal, pueden colocarse también entre las dos secuencias. La inserción de secuencias puede conducir también a la expresión de proteínas de fusión. De preferencia, el cásete de expresión, que consiste de un enlace del promotor y la secuencia del ácido nucleico que se expresa, puede existir en una forma integrada por un vector y se inserta dentro de un genoma de planta, por ejemplo por la transformación . Tales secuencias reguladoras se describen por ejemplo, en Goeddel; Gene Expresión Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) o véase: Gruber y Crosby, en: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolog , CRC Press, Boca Ratón, Florida, eds . : Glick y Thompson, Capítulo 7, 89-108 incluyendo las referencias en la presente. Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de célula huésped y aquellas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótido sólo en ciertas células huéspedes o bajo ciertas condiciones. Se apreciará por aquellos expertos en la técnica que el diseño del vector de expresión puede depender de tales factores como la elección de la célula huésped que se transforma, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Los vectores de expresión de la invención pueden introducirse en las células huéspedes por lo que se producen proteínas o péptidos, incluyendo proteínas o péptidos de fusión, codificados por los polinucleótidos como se describe en la presente. Los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden diseñarse para la expresión de las proteínas de resistencia, de preferencia Rpi-blb2, en células procarióticas o eucarióticas . Por ejemplo, los genes que codifican el polinucleotido de la invención pueden expresarse en células bacterianas tales como E. coli, C. glutamicum, Agrobacterium tumefaciens, células de insectos (utilizando vectores de expresión de baculovirus) , levaduras y otras células fúngicas (véase Romanos, (1992), Yeast 8: 423-488; van den Hondel, (1991) J. W. Bennet & L.L. Lasure, eds . , p. 396-428: Academic Press. San Diego; y van den Hondel, (1991) en: Applied Molecular Genetics of Fungí, Peberdy, eds., p. 1-28, Cambridge Uníversity Press: Cambridge), algas (Falciatore et al., 1999, marine Biotechnolog . 1, 3:239-251), y células de planta multicelulares (véase Schmidt , R. (1988), Plant Cell Rep. : 583-586) ; Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Ratón, Florida, capítulo 6/7, S. 71-119 (1993); F. F. White, B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, en: Trasngenic Plants, Vol . 1, Engineering and Utilization, eds.: King und R. Wu, Academic Press (1993), 128-43; Potrykus , Annu. Rev. Plant Physiol . Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225 (y referencias citadas en la presente) o células de mamíferos. Las células huéspedes adecuadas se discuten además en Goeddel, Gene Expression Technology: ethods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) . Alternativamente, el vector de expresión recombinante puede transcribirse y traducirse in vitro, por ejemplo, utilizando las secuencias reguladoras del promotor T7 y la polimerasa T7. La expresión de proteínas en procariotes se lleva a cabo más frecuentemente con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de cualesquiera proteínas de fusión o sin fusión. Los vectores de fusión agregan un número de aminoácidos a una proteína codificada en la presente, usualmente al término amino de la proteína recombinante, pero también al término C o combinado dentro de regiones adecuadas en las proteínas. Tales vectores de fusión ofrecen normalmente tres propósitos: 1) incrementar la expresión de la proteína recombinante; 2) incrementar la solubilidad de la proteína recombinante; y 3) auxiliar en la purificación de la proteína recombinante actuando como un ligando en la purificación de afinidad. Además, el vector de fusión puede codificar también las proteínas adicionales, cuya expresión soporta un incremento de la actividad de Rpi-blb2 o de la resistencia de una planta contra los patógenos de plantas, por ejemplo, otras proteínas de resistencia. Con frecuencia, en los vectores de expresión de fusión, un sitio de desdoblamiento proteolítico se introduce en el enlace de la porción de fusión y la proteína recombinante que permite la separación de la proteína recombinante a partir de la porción de fusión subsecuente para la purificación de la proteína de fusión. Tales enzimas, y sus secuencias de reconocimiento de cognado, incluyen el Factor Xa, la trombina y la enterocinasa . Los vectores de expresión de fusión típicos incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. y Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) . Ejemplos de vectores de expresión de E. coli sin fusión inducibles adecuados incluyen pTrc (Amann (1988) Gene 69:301-315) y pET lid (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89. Una estrategia para maximizar la expresión de proteína recombinante es expresar la proteína en una bacteria huésped con una capacidad mejorada para desdoblar proteolíticamente la proteína recombinante (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San niego, California (1990) 119-128). Otra estrategia es alterar la secuencia de ácido nucleico del ácido nucleico que se inserta dentro de un vector de expresión de manera que los codones individuales para cada aminoácido son aquellos utilizados de preferencia en la bacteria elegida para la expresión, tal como E. coli o C. glutamicum (Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118) . Tal alteración de las secuencias del ácido nucleico de la invención pueden llevarse a cabo por técnicas de síntesis del ADN estándar. Además, el vector puede ser un vector de expresión de levadura. Ejemplos de vectores para expresión en levadura S. cerivisae incluyen pYepSecl (Baldara, et al. (1987) Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54:113-123) y pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) . De preferencia, el polinucleó ido de la presente invención o descrito en la presente se enlaza operablemente a una secuencia de control de expresión de planta, por ejemplo, un cásete de expresión. Un cásete de expresión de planta contiene de preferencia secuencias reguladoras capaces de conducir la expresión genética en células de planta y las cuales se enlazan operativamente de manera que cada secuencia pueda cumplir su función tal como la terminación de la transcripción tal como señales de poliadenilación. Las señales de poliadenilación preferidas son aquellas que se originan del t-ADN de Agrobacterium tu efaciens tal como el gen 3 conocido como octopina sintasa del pTiACH5 Ti-plásmido (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835 ff) o equivalentes funcionales del mismo, pero también otros terminadores funcionalmente activos en plantas son adecuados . Ya que la expresión genéticas de las plantas no se limita muy frecuentemente en los niveles transcripcionales ya que el cásete de expresión de planta contiene de preferencia otras secuencias operativamente enlazadas como mej oradores transcripcionales tales como la secuencia superdirecta que contienen la secuencia líder 5' no traducida a partir del virus del mosaico de tabaco que mejora la proteína por la relación de ARN (Gallie et al 1987, Nucí. Acids Research 15 : 8693-8711) . Por consiguiente, el polinucleótido descrito en la presente puede enlazarse operativamente a un promotor apropiado que confiere expresión genética en una manera específica de tejido o célula oportuna. Se prefieren promotores que conducen la expresión constitutiva (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989) 2195-2202) como aquellos derivados del virus de plantas como el 35S CAMV (Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294) , el 19S CaMV (véase también US53552605 y 08402913) o promotores de plantas similares a aquellos de la subunidad pequeña Rubisco descrita en la US 4962028. El término promotores específicos de planta se entiende como significando en principio, cualquier promotor que sea capaz de gobernar la expresión de genes, en particular genes extraños, en plantas o partes de las plantas, células de las plantas, tejidos de planta o cultivos de planta. En este contexto, la expresión puede ser por ejemplo, constitutiva, inducible o dependiente de desarrollo. Se prefieren los siguientes: a) Promotores constitutivos Los vectores preferidos son aquellos que hacen posible la expresión constitutiva en plantas (Benfey et al . (1989) EMBO J 8:2195-2202). El promotor "constitutivo" se entiende como significando aquellos promotores que aseguran la expresión en un gran número de, preferiblemente todos los tejidos durante un periodo sustancial de un desarrollo de planta, de preferencia en todas las etapas del desarrollo de plantas. En particular, un promotor de plantas o un promotor derivado a partir de un virus de planta se utilizan de preferencia. Preferido particularmente es el promotor de la transcripción 35S del virus del mosaico de coliflor CaMV (Franck et al. (1980) Cell 21:285-294; Odell et al. (1985) nature 313:810-812; Shewmaker et al. (1985) Virology 140:281-288; Gardner et al. (1986) Plant Mol Biol 6:221-228) o el promotor 19S CaMV (US 5,352,605; WO 84/02913; Benfey et al. (1989) EMBO J 8:2195-2202). Otro promotor constitutivo adecuado es el promotor de la "subunidad pequeña ubisco" (SSU)" (US 4,962,028), el promotor de leguminosa B (GenBank Acceso No. X03677) , el promotor de nopalina sintasa del Agrobacterium, el promotor dual de TR, el promotor de OCS Agrobacterium (octopina sintasa) , el promotor de ubiquitina (Holtorf S et al . (1995) Plant Mol Biol 29: 637-649), el promotor de ubiquitina 1 (Christensen et al . (1992) Plant Mol Biol 18:675-689; Bruce et al. (1989) Proc Nati Acad Sci USA 86:9692-9696), el promotor Smas , el promotor de deshidrogenasa del alcohol cinamílico (US 5,683,439), los promotores de las subunidades ATPasa de la vacuola o el promotor de la proteína rica en prolina a partir del trigo (WO 91/13991) y los promotores adicionales de genes cuya expresión constitutiva en plantas se conoce por aquellos técnicos expertos. b) Promotores específicos de tejido Se prefieren promotores adicionales con especificidad para las anteras, los ovarios, las flores, las hojas, los tallos, las raíces y las semillas. Los promotores específicos de semillas tales como por ejemplo, el promotor de faseolina (US 5,504,200; Bustos MM et al. (1989) Plant Cell 1 (9) : 839-53 ) , el promotor genético de albúmina 2S (Joseffson LG et al. (1987) J Biol Chem 262:12196-12201), el promotor de leguminosa (Shirsat A et al. (1989) Mol Gen Genet 215 (2) : 326-331) , el promotor de USP (proteína de semilla desconocida) (Báumlein H et al . (1991) Mol Gen Genet 225(3) :459-67), el promotor de gen napin (US 5,608,152; Stalberg K et al. (1996) L Planta 199:515- 519) , el promotor de proteína de unión de sacarosa (WO 00/26388) o el promotor de leguminosa B4 (LeB4 ; Báumlein H et al. (1991) Mol Gen Genet 225: 121-128; Baeumlein et al. (1992) Plant Journal 2(2):233-9; Fiedler U et al. (1995) Biotechnology (NY) 13(10): 1090f) , el promotor de Arabidopsis oleosin (WO 98/45461) el promotor de Brassica Bce4 ( O 91/13980) . Los promotores específicos de semillas adecuados adicionales, son aquellos de los genes que codifican la glutenina de peso molecular elevado (HMWG) , la gliadina, la enzima de ramificación, la glucosa pirofosfatasa ADP (AGPasa) o el almidón sintasa. Además, se prefieren promotores que permiten la expresión específica de semillas en monocotiledóneas tales como maíz, cebada, trigo, arroz, centeno y similares. Lo siguiente puede emplearse venta osamente: el promotor del gen Ipt2 o Iptl (WO 95/15389, WO 95/23230) o los promotores descritos' en WO 99/16890 (promotores del gen hordeina, el gen de gluteina, el gen de oryzina, el gen de prolamina, el gen de gliadina, el gen de gluteina, el gen de zeína, el gen de kasirina o el gen de secalina) . Los promotores específicos de raíz o de almacenamiento de raíz - tubérculos tales como por ejemplo, el promotor de patatina clase I (B33) , el promotor del inhibidor de catepsina D de papa. Los promotores específicos de hoja tales como el promotor FBPasa citosólico de papa (WO 97/05900), el promotor Rubísco (ribulosa-1 , 5-bisfosfato carboxilasa) SSU (subunidad pequeña) o el promotor ST-LSI a partir de papa (Stockhaus et al. (1989) EMBO J 8:2445-2451). Muy especialmente preferidos son promotores específicos de epidermis tales como por ejemplo, el promotor del gen OXLP (proteína similar a oxalato oxidasa) (Wei et al. (1998) Plant Mol. Biol. 36:101-112). Promotores específicos de flores tales como por ejemplo, el promotor de fitoeno sintasa ( O 92/16635) o el promotor del gen P-rr ( O 98/22593) . Promotores específicos de anteras tales como el promotor 5126 (US 5,689,049, US 5,689,051), el promotor glob-I y el promotor ?-zeina. c) Promotores químicamente inducibles Los casetes de expresión pueden comprender también un promotor químicamente indusible (artículo revisado: Gatz et al. (1997) Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48:89-108) por lo cual la expresión del gen exógeno en la planta en un punto de tiempo particular puede controlarse . Tales promotores tales como por ejemplo, el promotor PRP1 ( ard et al. (1993) Plant Mol Biol 22:361-366) un promotor inducible de ácido salicílico (WO 95/19443) , un promotor inducible de bencensulfonamida (EP 0 388 186) , un promotor inducible de tetraciclina (Gatz et al. (1992) Plant J 2:397-404), un promotor inducible de ácido abscísico (EP 0 335 528) o un promotor inducible de ciclohexanona o etanol (WO 93/211334) puede asi mismo utilizarse. d) Promotores inducibles de tensión o patógenos Los promotores preferidos adicionales son aquellos los cuales se inducen por tensión biótica o abiótica tal como por ejemplo, el promotor inducible de patógenos del gen PRPl (Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22:361-365), el promotor hsp70 o hsp80 inducible de alta temperatura del tomate (US 5,187,267) el promotor de alfa-amilasa inducible de temperatura baja de la papa (WO 96/12814) , el promotor de PPD inducible de luz, o el promotor de pinilo inducido por lesión (EP375091) . Los promotores inducibles de patógenos abarcan aquellos genes que son inducidos como una consecuencia de infección por patógenos, tales como por ejemplo, genes de las proteínas PR, proteínas SAR, ß-1 , 3-glucanasa, quitinasa y similares (por ejemplo, Redolfi et al. (1983) Neth J Plant Pathol 89: 245-254; Uknes, et al. (1992) The Plant Cell 4: 645-656; Van Loon (1985) Plant Mol Virol 4: 111-116; Marineau et al. (1987) Plant Mol Biol 9: 335-342; Matton et al. (1987) Molecular Plant-Microbe Interactions 2: 325-342; Somssich et al. (1986) Proc Nati Acad Sci USA 83:2427-2430; Somssich et al (1988) Mol Gen Genetics 2:93-98; Chen et al., (1996) Plant J 10:955-966; Zhang and Sing (1994) Proc Nati Acad Sci USA 91:2507-2511; Warner, et al., (1993) Plant J 3:191-201; Siebetz et al., (1989) Plant Cell 1: 961-968 (1989). Se abarcan también promotores inducibles de lesiones tales como aquel del gen pinilo (Ryan (1990) Ann Rev Phytopath 28: 425-449; Duan et al. (1996) Nat Biotech 14: 494-498), del gen wunl and wun2 (US 5,428,148), del gen winl and win2 (Stanford et al. (1989) Mol Gen Genet 215: 200-208), de la sistemina (McGurl et al. (1992) Science 225:1570-1573), del gen WIP1 (Rohmeier et al. (1993) Plant Mol Biol 22:783-792; Eckelkamp et al. (1993) FEBS Letters 323: 73-76), del gen MPI (Corderok et al. (1994) The Plant J 6 (2): 141-150) and simlares . e) Promotores dependientes de desarrollo Los promotores adecuados adicionales son por ejemplo, promotores específicos de maduración de frutas tales como por ejemplo, el promotor específico de maduración de frutas del tomate (WO 94/21794, EP 409 625) . Loa promotores dependientes de desarrollo comprenden parcialmente los promotores específicos de tejido, ya que los tejidos individuales se desarrollan por naturaleza en una forma dependiente de desarrollo. Puede ventajosamente ser que el polipéptido de la presente invención sea sólo activo o tenga sólo una actividad incrementada en el tejido, lo cual se transfiere o penetra por el patógeno mencionado en la presente. Especialmente preferidos son los promotores constitutivos y son promotores específicos de epidermis e inducibles de patógenos, específicos de hojas y/o de tallo, con promotores inducibles de patógenos, y promotores específicos de epidermis que son más preferidos . También se prefiere el promotor natural , el cual por ejemplo, está comprendido en el fragmento genómico descrito en la SEC. DE IDENT. NO.: 5 y 6. Además, los promotores adicionales pueden enlazarse operativamente a la secuencia del ácido nucleico que se expresa, cuyos promotores hacen posibles la expresión en tejidos de planta adicionales en otros organismos, tales como por ejemplo, bacterias de E. coli. Los promotores de plantas adecuados son en principio, todos los promotores descritos anteriores . El término "secuencias de control genético" se entiende en el sentido amplio y se refiere también a todas aquellas secuencias las cuales tienen un efecto en la materialización o la función del cásete de expresión de acuerdo con la invención. Por ejemplo, las secuencias de control genético modifican la transcripción y la traducción en organismos procarióticos o eucarióticos . De preferencia, los casetes de expresión de acuerdo con 1 a invención abarcan el promotor con especificidad para la epidermis embriónica y/o la 5' -corriente arriba de flores de la secuencia del ácido nucleico en cuestión que se expresa recombinantemente , y 3' -corriente abajo una secuencia terminadora como secuencia de control genético adicional y, si es apropiado, los elementos reguladores habituales adicionales, en cada caso enlazados operativamente a la secuencia del ácido nucleico que se expresa recombinantemente . Las secuencias de control genético abarcan también promotores adicionales, elementos promotores, o promotores mínimos, todos los cuales pueden modificar propiedades que gobiernan la expresión. De este modo, por ejemplo, la expresión especifica de tejido puede depender adicionalmente de ciertos tensores, debido a las secuencias de control genético. Tales elementos se han descrito por ejemplo, para tensión de agua, ácido abscisico (Lam E and Chua NH, J Biol Chem 1991; 266 (26) : 17131-17135) and heat stress (Schoffl F et al., Molecular & General Genetics 217 (2-3) : 246-53, 1989) . Las secuencias de control ventajoso adicional, son por ejemplo, los promotores Gram-positivos amy y SP02 , y los promotores de levadura u hongos ADC1 , MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH. En principio, todos los promotores naturales con sus secuencias reguladoras como aquellas mencionadas anteriores pueden utilizarse para el método de acuerdo con la invención. Además, los promotores sintéticos pueden utilizarse también ventajosamente. Las secuencias de control genético abarcan también las regiones 5'- no traducidas, intrones o la 3 '-región sin codificación de genes, tales como por ejemplo, la actina-1 intrón, o los intrones 1, 2 y 6 Adh l-S (referencia general: The Maize Handbook, Capítulo 116, Freeling y Walbot , Eds . , Springer, New York (1994) ) . Se ha demostrado que estos pueden jugar un papel significativo en la regulación de la expresión genética. De este modo, se ha demostrado que las secuencias 5 '-no traducidas pueden mejorar la expresión transitoria de genes heterólogos . Ejemplos de mejoradores de traducción que pueden mencionarse son la secuencia 5' líder del virus del mosaico de tabaco (Gallie et al. (1987) Nucí Acids Res 15: 8693-8711) y similares. Además, estos pueden promover especificidad de tejido (Rouster J et al. (1998) Plant J 15: 435-440) . El cásete de expresión puede comprender ventajosamente una o más de lo que se conoce como secuencias mej oradoras, enlazadas operativamente al promotor, el cual hace posible una expresión recombinante incrementada de la secuencia del ácido nucleico. Las secuencias ventajosas adicionales, tales como elementos reguladores adicionales o terminadores , pueden insertarse también en el extremo 3' de las secuencias del ácido nucleico que se expresan recombinantemente . Una o más de las copias de las secuencias del ácido nucleico que se expresa recombinantemente pueden presentarse en la construcción genética.

En una modalidad, la secuencia terminadora natural comprendida en el fragmento genómico descrita en la SEC. DE IDENT. NO.: 5 y/o 6 se utiliza. Las señales de poliadenilación las cuales son adecuadas como secuencias control son señales de poliadenilación de plantas, de preferencia aquellas que corresponden esencialmente a señales de poliadenilación del T-ADN a partir de Agrobacterium tumefaciens, en particular el gen 3' del T-ADN (octopina sintasa) del plásmido Ti pTiACHS (Gielen et al. (1984) EMBO J3:835 et seq.) o equivalentes funcionales del mismo. Ejemplos de las secuencias terminadoras que son especialmente adecuadas son el terminador OCS (octopina sintasa) y el terminador NOS (nopalina sintasa) . Las secuencias control se entenderán además como aquellas que hacen posible la recombinación o inserción homologa dentro del genoma de un organismo huésped o' las cuales permiten la remoción del genoma. En el caso de la recombinación homologa, por ejemplo, el promotor natural de un gen particular puede intercambiarse para un promotor con especificidad de la epidermis embriónica y/o la flor. Los métodos tales como la tecnología cre/lox permiten un tejido específico, si es apropiado la remoción inducible del cásete de expresión a partir del genoma del organismo huésped (Sauer B (1998) Methods. 14 (4) : 381-92) . En este método, las secuencias de flanqueo específico (secuencias lox) , que permiten al final la remoción por medio de ere recombinasa, se unen al gen objetivo. Un cásete de expresión y los vectores derivados de éste pueden comprender elementos funcionales adicionales. El término elemento funcional se entenderá en el sentido amplio y se refiere a todos aquellos elementos que tienen un efecto en la generación, la amplificación o la función de los casetes de expresión, los vectores o los organismos transgénicos de acuerdo con la invención. Lo siguiente puede mencionarse a modo de ejemplo, pero sin limitación: a) Los marcadores de selección, los cuales confieren una resistencia a un inhibidor de metabolismo tales como 2-desoxiglucosa~6-fosfato (WO 98/45456) , antibióticos o biocidas, de preferencia herbicidas, tales como por ejemplo, canamicina, G 418, bleomicina o higromicina, o de otra manera fosfinotricina y similares. Los marcadores de selección especialmente preferidos son aquellos que confieren resistencia a herbicidas. Los ejemplos que pueden mencionarse son: secuencias de ADN que codifican la fosfinotricina acetil transferasa (???) y los cuales son inhibidores de glutamina sintasa inactivos (genes bar y pat) , genes 5-enolpiruvilshikimato-3 -fosfato sintasa (genes de EPSP sintasa) , que confieren resistencia a Gliphosater (N- (fosfonometil) glicina) , el gen gox, que codifica enzimas que degradan Glyphosater (Glifosato oxidoreductasa) , el gen den (que codifica una dehalogenasa que inactiva dalapon) , acetolactato sintasas que inactiva sulfonil-urea e imidazolinona, y genes bxn, que codifican enzimas nitrilasa que degradan bromoxinil, el gen aasa, que confieren resistencia al antibiótico apectinomicina, el gen de estreptomicina fosfotransferasa (SPT) , que permite resistencia a estreptomicina, el gen de neomicina fosfotransferasa (SPT) , que permite la resistencia a estreptomicina, la neomicina fosfotransferasa (NPTII) , que confiere resistencia a canamicina o geneticidina, el gen de higromicina fosfotransferasa (HPT) , que media resistencia a higromicina, el gen de acetolactato sintasa (ALS) , que confiere resistencia a herbicidas sulfonilurea (por ejemplo, variantes ALS mutados por ejemplo, la mutación S4 y/o Hra) . b) Genes reporteros que codifican proteínas fácilmente cuantificables y, a través de su color y su actividad enzimatica, hacen posible una evaluación de la eficacia de transformación, el sitio de expresión o el tiempo de expresión. Muy especialmente preferidos en este contexto son genes que codifican proteínas reporteras (Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13 (1) : 29-44) tales como la proteína fluorescente verde (GFP) (Sheen et al. (1995) Plant Journal 8 (5) : 777-784 ; Haseloff et al. (1997) Proc Nati Acad Sci USA 94 (6) : 2122-2127; Reichel et al. (1996) Proc Nati Acad Sci USA 93 (12): 5838-5893; Tian et al. (1997) Plant Cell Rep 16: 267-271; WO 97/41228; Chui WL et al. (1996) Curr Biol 6: 325-330; Leffel SM et al. (1997) Biotechniques . 23 (5): 912-8), cloranfenicol transferasa, una luciferasa (Ow et al. (1986) Science 234: 856-859; Millar et al. (1992) Plant Mol Biol Rep 10: 324-414), el gen aecuorina (Prasher et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126 (3) : 1259-1268) , ß-galactosidasa , el gen de lugar R (que codifica una proteína que regula la producción de pigmentos antocianina (de color rojo) en tejido de planta y de este modo hace posible el análisis directo de la actividad promotora sin la adición de sustancias auxiliares adicionales o sustratos cromogénicos ; Dellaporta et al., In : Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium, 11: 263-282, 1988), con ß-glucuronidasa que se prefiere muy especialmente (Jefferson et al., EMBO J. 1987, 6, 3901-3907) . c) Los orígenes de replicación que aseguran amplificación de los casetes o vectores de presión de acuerdo con la invención en, por ejemplo, Ejemplos E. coli que pueden mencionarse son ORI (origen de la replicación del ADN) , el pBR322 ori o el P15A ori (Sambrook et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) . d) Elementos que son necesarios para transformación de plantas mediadas por Agrobacterium, tales como por ejemplo, el borde derecho e izquierdo del T-ADN o la región vir . Para seleccionar células que han experimentado exitosamente recombinación homologa, o además seleccionar células transformadas, es necesario además, como una regla introducir un marcador seleccionable, el cual confiere resistencia a biocida (por ejemplo, un herbicida) un inhibidor de metabolismo tal como 2 -desoxiglucosa-6-fosfato (WO 98/45456) o un antibiótico a las células que han experimentado exitosamente recombinación. El marcador de selección permite la selección de las células transformadas a partir de las no transformadas (McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84). La introducción de un cásete de expresión de acuerdo con la invención en un organismo o células, te idos, órganos, partes o semillas de la misma (de preferencia en plantas o células de planta, tejido, órganos, partes o semillas) pueden efectuarse venta osamente utilizando vectores que comprenden los casetes de expresión. El cásete de expresión puede introducirse en el vector (por ejemplo, un plásmido) a través de un sitio de desdoblamiento de restricción adecuado. El plásmido realizado se introduce primero en E. coli. Se seleccionan E. coli correctamente transformado, crecimiento, y el plásmido recombinante se obtiene por los métodos familiares al técnico experto. El análisis de restricción y la secuenciación puede servir para verificar la etapa de clonación. Los promotores adicionales para expresión en partes de plantas específicas son por ejemplo, el promotor de gen napin a partir de semillas de colza (US5608152) , el promotor USP a partir de Vicia faba (Baeumlein et al., Mol. Gen Genet , 1991, 225 (3):459-67), el promotor de oleosina a partir de Arabidopsis (W09845461) , el promotor de faseolina a partir de Phaseolus vulgaris (US5504200) , el promotor Bce4 de Brassica (WO9113980) o el promotor de leguminosa B4 (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2 (2):233-9), así como promotores que confieren expresión específica de semilla en plantas monocotiledóneas como maíz, cebada, trigo, centeno, arroz, etc. Los promotores adecuados para observar son el promotor de gen Ipt2 o Iptl a partir de cebada ( 09515389 y WO9523230) o aquellos descritos en WO9916890 (promotores del gen hordein de cebada, el gen de gluteína de arroz, el gen orizina de arroz, el gen prolamina de arroz, el gen gliadina de trigo, el gen glutelina de trigo, el gen de zeína de maíz, el gen glutelina de avena, el gen kasirina de sorgo, el gen secalina de centeno) . Además, el polinucleótido de la invención puede clonarse dentro del vector de expresión en una orientación antisentido. Es decir, la molécula de ADN se enlaza operativamente a una secuencia reguladora en una manera que permite la expresión (por transcripción de la molécula de ADN) de una molécula de ARN que es antisentido al ARNm codificdo por el polinucleótido de la presente invención. Pueden elegirse secuencias reguladoras que se enlazan operativamente a un ácido nucleico clonado en la orientación antisentido las cuales dirigen la expresión continua de la molécula del ARN antisentido en una variedad de tipos de células, por ejemplo promotores y/o me oradores virales, o pueden elegirse secuencias reguladoras que dirigen la expresión específica de tejido o del tipo celular, constitutiva del ARN antisentido. El vector de expresión antisentido puede estar en la forma de un plásmido recombinante , fagémico o virus atenuado en donde las moléculas del ácido nucleico antisentido se producen bajo el control de una región reguladora de eficiencia elevada, la actividad de la cual puede determinarse por el tipo celular en el cual el vector se introduce. Para una discusión de la regulación de la expresión genética utilizando genes antisentido véase Weintraub, H. et al., ARN antisentido como una herramienta molecular para análisis genético. Revisiones - Trends in Genetics, Vol . 1 (1) 19SS y Mol et al., 1990, FEBS Letters 268: 427-430. En una modalidad, la presente invención se relaciona a un método para crear una célula huésped recombinante que comprende introducir el vector o el polinucleótido de la presente invención o el vector o el polinucleótido y un vector para expresar una proteína de resistencia adicional en una célula huésped. El ADN vector puede introducirse en células procarióticas o eucarióticas a través de técnicas de transformación o transfección convencionales. Como se utiliza en la presente, los términos "transformación" y "transfección", conjugación y transducción se pretenden para referirse a una variedad de técnicas reconocidas en el arte para la introducción del ácido nucleico extraño (por ejemplo, ADN) en una célula huésped, incluyendo la co-precipitación del fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediadas por DEAE-dextrano, lipofección, competencia natural, transferencia mediada por químicos o electroporación. Los métodos adecuados para transformar o transfectar células huéspedes que incluyen células de planta pueden encontrarse en Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) y otros manuales de laboratorio tales como Methods in Molecular Biology, 1995, Vol . 44, Agrobacterium protocols, ed: Gartland y Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey. Para transfección estable de células eucarióticas, se sabe que, dependiendo del vector de expresión y la técnica de transfección utilizada, sólo una fracción pequeña de células puede integrar el ADN extraño en su genoma. Con el fin de identificar y seleccionar estos integrantes, un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia a antibióticos) se introduce generalmente en las células huéspedes junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen aquellos que confieren resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina y metotrexato o en plantas que confieren resistencia hacia un herbicida tal como glifosato o glufosinato. El ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable puede introducirse en una célula huésped en el mismo vector como aquel que codifica el polipéptido de la presente invención o puede introducirse en un vector separado. Las células establemente transfectadas con el ácido nucleico introducido puede identificarse por ejemplo por selección de fármaco (por ejemplo, las células que han incorporado el gen marcador seleccionable sobrevivirán, aunque las otras células morirán) . Pueden producirse células huéspedes las cuales contienen sistemas de selección que permiten la expresión regulada del gen introducido. Por ejemplo, la inclusión del polinucleótido de la invención en un vector colocándolo bajo control de la operación lac permite la expresión del polinucleótido sólo en la presencia del IPTG. Tales sistemas reguladores son bien conocidos en la técnica.

De preferencia, la molécula del ácido nucleico introducido es extraña a la célula huésped. Por "extraño" se quiere decir que la molécula del ácido nucleico es ya sea heteróloga con, respecto a la célula huésped, esto quiere decir deriva a partir de una célula o un organismo con un diferente fondo genómico, o es homólogo con respecto a la célula huésped pero ubicado en un diferente ambiente genómico que la contraparte de origen natural de la molécula del ácido nucleico. Esto quiere decir que, si la molécula del ácido nucleico es homologa con respecto a la célula huésped, no se ubica en su ubicación natural en el genoma de la célula huésped, en particular se rodea por diferentes genes. En este caso, la molécula del ácido nucleico puede ser cualquiera bajo el control de su propio promotor o bajo el control de un promotor heterólogo. El vector o la molécula del ácido nucleico de acuerdo con la invención que se presenta en la célula huésped puede integrarse ya sea en el genoma de la célula huésped o puede mantenerse en alguna forma extracromosomalmente . En este aspecto, se entenderá también que la molécula del ácido nucleico de la invención puede utilizarse para restaurar o crear un gen mutante a través de recombinación homologa (Paszkowski (ed.), Homologous Recombination and Gene Silencing in Plants. Kluwer Academic Publishers (1994)). Por consiguiente, en otra modalidad, la presente invención se relaciona a una célula huésped genéticamente diseñada con el polinucleótido de la invención o el vector de la invención, o el vector o el polinucleótido y un vector o un polinucleótido para expresar una proteína de resistencia adicional . Los términos "célula huésped" y "célula huésped recombinante" se utilizan intercambiablemente en la presente. Se entiende que tales términos se refieren no sólo a la célula objeto particular, sino también a la progenie o la progenie potencial de tal célula. Debido a que ciertas modificaciones pueden ocurrir en generaciones exitosas, debido a sus influencias de mutación o ambientales, tal progenie puede no ser de hecho idéntica a la célula progen tora, pero se incluyen además dentro del alcance del término como se utiliza en la presente. Por ejemplo, un polinucleótido de la presente invención puede introducirse en células bacteriales, células de insectos, células de hongos o células de mamíferos (tales como las células de ovario de hámster Chino (CHO) o células COS), algas, ciliatos, células de planta u hongos. Las células huéspedes adecuadas se conocen por aquellos expertos en la técnica. Las preferidas son E. coli, baculovirus, Agrobacterium o células de planta. Además, las células huéspedes pueden transformarse también de manera que las enzimas adicionales y las proteínas se (sobre) expresan, cuya expresión soporta un incremento de resistencia de una planta a patógenos. De preferencia, un gen de resistencia adicional se expresa también, de preferencia uno o más genes de resistencia, de preferencia los genes como se mencionan en la presente, es/se expresan también. Más preferida es la co-expresión de Rpi-blb2 y Rpi-blb. Preferidas además son las células de una de las plantas mencionadas en la presente, en particular, de una de las solanáceas mencionadas anteriormente, más preferidas son la papa, el tomate, la petunia, la planta de tomate, el melocotón, o la berenjena. En otra modalidad, la presente invención se relaciona a un proceso para la producción del polipéptido de la presente invención, en particular de una proteína que tiene actividad de Rpi-blb2 que comprende cultivar la célula huésped de la invención y recuperar el polipéptido codificado por el polinucleótido y expresado por la célula huésped a partir del cultivo o las células. El término "expresión" significa la producción de una proteína o una secuencia de nucleótido en la célula. Sin embargo, tal término incluye también la expresión de la proteína en un sistema libre de células. Éste incluye la transcripción en un producto de ARN, la modificación y/o la traducción post-transcripcional o un producto de proteína o polipéptido a partir de un ADN que codifica ese producto, así como las posibles modificaciones post -translacionales . Dependiendo de las construcciones y condiciones específicas utilizadas, la proteína puede recuperarse a partir de las células, a partir del medio de cultivo o a partir de ambos. Para la persona experta en la técnica se sabe bien que no es sólo posible expresar una proteína nativa, sino también expresar la proteína como polipéptidos de fusión o agregar secuencias de señal que dirigen la proteína a compartimientos específicos de la célula huésped, por ejemplo, asegurando secreción de la proteína en el medio de cultivo, etc. Además, tal proteína y fragmentos de la misma pueden sintetizarse y/o modificarse químicamente de acuerdo a métodos estándares descritos por ejemplo en la presente posteriormente. Una célula huésped de la invención, tal como una célula huésped procariótica o eucariótica en el cultivo, puede utilizarse para producir (es decir, expresar) el polipéptido codificado por el polinucleótido de la invención, de preferencia un polipéptido que tiene actividad Rpi-blb2. Un método alternativo puede aplicarse además en plantas por la transferencia directa del ADN en flores en desarrollo a través de electroporación o Agrobacterium mediado por transferencia genética. Por consiguiente, la invención proporciona además métodos para producir Rpi-blb2 utilizando las células huéspedes de la invención. En una modalidad, el método comprende cultivar la célula huésped de la invención en un medio adecuado de manera que el polipéptido de la presente invención se produce. Además, el método comprende aislar y/o recuperar el polipéptido a partir del medio o la célula huésped. El polipéptido de la presente · invención se produce de preferencia por técnicas de ADN recombinantes . Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína se clona dentro de un vector de expresión (como se describe anteriormente) , el vector de expresión se introduce dentro de una célula huésped (como se describe anteriormente) y el polipéptido se expresa en la célula huésped. El polipéptido puede entonces aislarse a partir de las células por un esquema de purificación apropiado utilizando técnicas de purificación de proteína es ándares. Alternativo a la expresión recombinante , el polipéptido o el péptido de la presente invención puede sintetizarse químicamente utilizando técnicas de síntesis de péptido estándares. Además, la pi-blb2 nativa puede aislarse a partir de células (por ejemplo, células endoteliales) , por ejemplo, utilizando el anticuerpo de la presente invención como se describe posteriormente, en particular, un anticuerpo anti-Rpi-blb2 , el cual puede producirse por técnicas estándares utilizando el polipéptido de la presente invención o fragmento del mismo, es decir, el polipéptido de esta invención.

En una modalidad, la presente invención se relaciona a una proteina Rpi-blb2 o una proteina que tiene actividad Rpi-blb2. En una modalidad, la presente invención se relaciona a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido codificada por un polinucleótido de la invención o es obtenible por un proceso de la invención. En una modalidad, el polipéptido no consiste de la secuencia descrita en la SEC . DE IDENT. NO. : 8 y/o 10 y no consiste de la secuencia codificada por una molécula de ácido nucleico descrita en la SEC. DE IDENT. NO.: 7 y/o 9. En una modalidad, el polipéptido de la presente invención no consiste de la secuencia de la proteína Mil.l o Mil.2 y/o de una proteína codificada por una molécula de ácido nucleico que codifica una proteina Mil.l o Mil.2. De este modo, en una modalidad, el polipéptido de la presente invención puede no consistir de las secuencias mostradas en Rossi et al. 1998, PNAS USA 95: 9750-9754, Milligan et al., 1998. Plant Cell 10: 1307-1319; y/o WO 9806750. Los términos "proteína" y "polipéptido" utilizados en esta solicitud son intercambiables. "Polipéptido" se refiere a un polímero de aminoácidos (secuencia de aminoácidos) y no se refiere a una longitud específica de la molécula. De este modo, los péptidos y oligopéptidos se incluyen dentro de la definición del polipéptido. Este término se refiere también a, o incluye modificaciones post-traslacionales del polipéptido, por ejemplo, glicosilaciones , acetilaciones , fosforilaciones y similares. Incluidos dentro de la definición son por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), polipéptidos con conexiones sustituidas, así como otras modificaciones conocidas en la técnica, ambos de origen natural y no natural. De preferencia, el polipéptido se aisla. Una proteína "aislada" o "purificada" o una porción biológicamente activa de la misma está sustancialmente libre del material celular cuando se produce por técnicas de ADN recombinantes , o precursores químicos u otros químicos cuando se sintetizan químicamente. El lenguaje "sustancialmente libre de material celular" incluye las preparaciones del polipéptido de la invención en donde la proteína se separa a partir de componentes celulares de las células en donde se produce natural o recombinantemente . En una modalidad, el lenguaje "sustancialmente libre del material celular" incluye preparaciones que tiene menos de aproximadamente 30% (en peso seco) de la "proteína contaminante" , más preferiblemente menos de aproximadamente 20% de la "proteína contaminante", aún más preferiblemente menos de aproximadamente 10% de la "proteína contaminante" y más preferiblemente menos de aproximadamente 5% de la "proteína contaminante" . El término "proteína contaminante" se relaciona a polipéptidos que no son polipéptidos de la presente invención. Cuando el polipéptido de la presente invención o la porción biológicamente activa de la misma se produce recombinantemente , es de preferencia también sustancialmente libre del medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 20%, más preferiblemente menos de aproximadamente 10% y más preferiblemente menos de aproximadamente 5% del volumen de la preparación de la proteína. El lenguaje "sustancialmente libre de los precursores químicos u otros químicos" incluye preparaciones en donde el sujeto de la presente invención, por ejemplo, el polipéptido de la presente invención se separa a partir de precursores químicos u otros químicos que están implicados en la síntesis de la proteína. El lenguaje "sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos" incluye preparaciones que tienen menos de aproximadamente 30% (en peso seco) de precursores químicos o químicos sin Rpi-blb2, más preferiblemente menos de aproximadamente 20% de precursores químicos o químicos sin Rpí-blb2, aún más preferiblemente menos de aproximadamente 10% de precursores químicos o químicos sin Rpi-blb2, y más preferiblemente menos de aproximadamente 5% de precursores químicos y químicos sin Rpi-blb2. En · las modalidades preferidas, las proteínas aisladas o porciones biológicamente activas de las mismas, carecen de proteínas contaminantes del mismo organismo a partir del cual el polipéptido de la presente invención se deriva. Normalmente, tales proteínas se producen por técnicas de ADN recombinantes . Un polipéptido de la invención puede participar en el polipéptido o la porción del mismo comprende de preferencia una secuencia de aminoácido la cual es suficientemen e homologa a una secuencia de aminoácido de la SEC. DE IDENT. NO. : 2 ó 4 de manera que la proteína o porción de la misma mantiene la capacidad para conferir la resistencia de la presente invención. La porción de la proteína es de preferencia una porción biológicamente activa como se describe, en la presente. De preferencia, el polipéptido de la presente invención tiene una secuencia de aminoácido idéntica como se muestra en la SEC. DE IDENT. NO.: 2 ó 4. Además, el polipéptido puede tener una secuencia de aminoácido la cual se codifica por una secuencia de nucleótido la cual hibridiza, de preferencia hibridiza bajo condiciones severas como se describe anteriormente, a una secuencia de nucleótido del polinucleótido de la presente invención. Por consiguiente, el polipéptido tiene una secuencia de aminoácido la cual se codifica por una secuencia de nucleótido, es decir al menos aproximadamente 70%, de' preferencia al menos aproximadamente 75%, más preferiblemente al menos aproximadamente 80%, 90%, 95% y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, 99% o más homólogos a una de las secuencias de aminoácido de la SEC. DE IDENT. NO.: 2 ó 4. El polipéptido preferido de la presente invención posee de preferencia al menos una de las actividades de la proteina Rpi-blb2 descritas en la presente, por ejemplo, su resistencia o actividades inmunológicas . Un polipéptido preferido de la presente invención incluye una secuencia de aminoácido codificada por una secuencia de nucleótido la cual hibridiza, de preferencia hibridiza bajo condiciones severas, a una secuencia de nucleótido de la SEC. DE IDENT. NO.: l ó 3 ó 5 ó 6 o la cual es homologa a la misma, como se define anteriormente. Por consiguiente, el polipéptido de la presente invención puede variar desde la SEC. DE IDENT. NO . : 2 ó 4, en la secuencia de aminoácido debido a la variación natural o mutagénesis, como se describe en detalle en la presente. Por consiguiente, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácido la cual es al menos aproximadamente 70%, de preferencia al menos aproximadamente 75% y más preferiblemente al menos aproximadamente 80, 90, 95% y más preferiblemente al menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, 99% o más homólogos a una secuencia de aminoácido completa de la SEC. DE IDENT. NO.: 1 ó 3 ó 5 ó 6.

Porciones biológicamente activas de un polipéptido de la presente invención incluyen péptidos que comprenden secuencias de aminoácido derivadas a partir de la secuencia de aminoácido de una proteina Rpi-blb2, por ejemplo, la secuencia de aminoácido mostrada en la SEC . DE IDENT. NO.: 2 ó 4 o la secuencia de aminoácido de una proteína homologa a la misma, la cual incluye menos aminoácidos que una proteína Rpi-blb2 de longitud total o la proteína de longitud total la cual es homologa a una proteína Rpi-blb2 descrita en la presente, y exhibe al menos una actividad de la proteína Rpi-blb2. Normalmente, porciones activas biológica (o inmunológicas) , es decir péptidos, por ejemplo, péptidos por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 o más aminoácidos de longitud comprenden un dominio o motivo con al menos una actividad o epítope de una proteína Rpi-blb2. Además, otras porciones biológicamente activas, en donde otras regiones del polipéptido se eliminan, pueden prepararse por técnicas recombinantes y se evalúan para una o más de las actividades descritas en la presente. La manipulación del polinucleótido Rpi-blb2 de la invención puede resultar en la producción de Rpi-blb2 que tiene diferencias funcionales a partir de la proteína Rpi-blb2 de tipo silvestre. Estas proteínas pueden mejorarse en eficiencia o actividad, pueden presentarse en números mayores en la célula que es usual, o pueden disminuirse en eficiencia o actividad. Cualesquiera estrategias de rautagénesis para Rpi-blb2 que resulta en resistencia incrementada o una resistencia a otra especie de patógenos de plantas o a otra cepa de una especie de patógenos de plantas antes mencionada, del compuesto no significa que es limitante; variaciones en estas estrategias serán fácilmente aparentes para un experto en la técnica. Al utilizar tales estrategias , e incorporar los mecanismos descritos en la presente, el polinucleótido y el polipéptido de la invención pueden utilizarse para generar plantas o partes de la misma, que expresan moléculas del polinucleótido o la proteína Rpi-blb2 de tipo silvestre o Rpi-blb2 mutada de manera que el rendimiento, la producción y/o la eficiencia de producción de un compuesto deseado se mejora. Este compuesto deseado puede ser cualquier producto natural de plantas, el cual incluye los producios finales de trayectorias de biosíntesis e intermediarios de trayectorias metabólicas de origen natural, así como moléculas no naturales en el metabolismo de las células, pero que se producen por las células de la invención. La invención proporciona también proteínas quiméricas o de fusión. Como se utiliza en la presente una "proteína quimérica" o "proteína de fusión" comprende un polipéptido enlazado operativamente a un polipéptido sin Rpi-blb2.

Un "polipéptido Rpi-blb2" se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido que corresponde al polipéptido que tiene una actividad de Rpi-blb2 , mientras que un "polipéptido sin Rpi-blb2" se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido que corresponde a una proteína, la cual no es sustancialmente homologa al Rpi-blb2, por ejemplo, una proteina la cual no confiere la resistencia descrita en la presente, en particular no confiere resistencia a P. infestants y la cual se deriva a partir del mismo o diferente organismo. Dentro de la proteína de fusión, el término "operativamente enlazado" se pretende para indicar que el polipéptido Rpi-blb2 y el polipéptido sin Rpi-blb2 se fusionan entre sí de manera que ambas secuencias cumplen la función propuesta habituada a la secuencia utilizada. El polipéptido sin Rpi-blb2 puede combinarse al término N o el término C del polipéptido Rpi-blb2. Por ejemplo, en una modalidad de la proteína de fusión es una proteina de fusión GST-LMRP en donde las secuencias de Rpi-blb2 se fusionan al término C de las secuencias GST. Tales proteínas de fusión pueden facilitar la purificación de la Rpi-blb2 recombinante . En otra modalidad, la proteína de fusión es una Rpi-blb2 que contiene una secuencia de señal heteróloga en su término N. En ciertas células huéspedes (por ejemplo, células de huésped mamífero) , la expresión y/o la secreción de la Rpi-blb2 pueden incrementarse a través del uso de una secuencia de señal heteróloga. De preferencia, una proteína quimérica o de fusión de Rpi-blb2 de la invención se produce por técnicas de ADN recombinantes estándares. Por ejemplo, los fragmentos de ADN que codifican para las diferentes secuencias de polipéptido se ligan juntos en la estructura de acuerdo con las técnicas convencionales, por ejemplo, empleando términos de terminado brusco o terminado tambaleante para ligación, digestión de enzimas de restricción provistas para términos apropiados, la completación de extremos cohesivos cuando sea apropiado, el tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar unión indeseable, y la ligación enzimática. El gen de fusión puede sintetizarse por técnicas convencionales, incluyendo sintetizadores de ADN automatizados. Alternativamente, la amplificación de PCR de los fragmentos genéticos puede llevarse a cabo utilizando cebadores de ancla que Ge originan de salientes complementarias entre dos fragmentos genéticos consecutivos los cuales pueden recocerse subsecuentemente y volverse a amplificar para generar una secuencia genética quimérica (véase por ejemplo, Currrent Protocols in Molecular Biology, eds . Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992). Además, muchos vectores de expresión están comercialmente disponibles ya que codifican una porción de fusión (por ejemplo, un polipéptido GST) . El polinucleótido de la invención puede clonarse en tal vector de expresión de manera que la porción de fusión se enlaza en la estructura a la proteína codificada. Además, simulaciones de plegado y rediseño de computadora de motivos estructurales de la proteína de la invención pueden realizarse utilizando programas de computadora apropiados (Olszewski, Proteins 25 (1996), 286-299; Hoffman, Comput . Appl . Biosci . 11 (1995), 675-679) . La modelación por computadora de plegado de proteínas puede utilizarse para el análisis conformacional y energético de modelos de proteína y péptido detallados (Monge, J. Mol. Biol. 247 (1995), 995-1012; Renouf , Adv. Exp . Med. Biol . 376 (1995) , 37-45) . En particular, los programas apropiados pueden utilizarse para la identificación de sitios interactivos de ciplina mitogénica y su receptor, su ligando u otras proteínas de interacción para investigaciones de asistente por computadora para secuencias de péptido complementarias (Fassina, Immunomethods (1994), 114-120. Sistemas de computadora apropiados adicionales para el diseño de proteínas y péptidos se describen en la técnica anterior, por ejemplo, en Berry, Biochem. Soc . Trans . 22 (1994), 1033-1036; Wodak, Ann. N. Y. Acad. Sci . 501 (1987), 1-13; Pabo, Biochemistry 25 (1986), 5987-5991. Los resultados obtenidos a partir del análisis por computadora descrito anteriormente pueden utilizarse, por ejemplo, para la preparación de peptidomiméticos de la proteína de la invención o fragmentos de la misma. Tales análogos pseudopeptldicos de la secuencia de aminoácidos naturales de la proteína pueden imitar muy eficientemente la proteína progenitora (Benkirane, J. Biol . Chem. 271 (1996) , 33218-33224) . Por ejemplo, la incorporación de residuos de aminoácido Q aquerales en una proteína de la invención o un fragmento de la misma resulta en la sustitución de uniones amida por unidades de polimetileno de una cadena alifática, por lo que se proporciona una estrategia conveniente para construir un peptidomimético (Banerjee, Biopolymers 39 (1996) , 769-777) . Los análogos peptidomiméticos superactivos de pequeñas hormonas peptídicas en otros sistemas se describen en la técnica anterior (Zhang, Biochem. Biophys . Res. Commun. 224 (1996) , 327-331) . Los peptidomiméticos apropiados de la proteína de la presente invención pueden identificarse también por la síntesis de las bibliotecas combinatoriales peptidomiméticas a través de alquilación de amida sucesiva y probar los compuestos resultantes, por ejemplo, para sus propiedades de unión e inmunológicas . Los métodos para la generación y el uso de bibliotecas combinatoriales peptidomiméticas se describen en la técnica anterior, por ejemplo en Ostresh, Methods in Enzymology 267 (1996) , 220-234 and Dorner, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 709-715. Además, una estructura tridimensional y/o cristalográfica de la proteína de la invención puede utilizarse para el diseño de inhibidores peptidomiméticos de la actividad biológica de la proteína de la invención (Rose, Biochemistry 35 (1996), 12933-12944; Rutenber, Bioorg . Med. Chem. 4 (1996) , 1545-1558) . En una modalidad adicional, la presente invención se relaciona a un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de la presente invención o a partes, es decir a fragmentos específicos o epítopes de tal proteína. Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse para identificar y aislar Rpi-blb2 y genes en cualquier organismo, de preferencia plantas, preparados en plantas descritas en la presente. Estos anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales , anticuerpos policlonales o anticuerpos sintéticos así como fragmentos de anticuerpos, tales como fragmentos Fab, Fv o scFv, etc. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse por ejemplo, por técnicas como se describe originalmente en Kóhler and Milstein, Nature 256 (1975), 495, and Galfr6, Meth. Enzymol . 73 (1981), 3, que comprende la fusión de las células mieloma de ratón a células del bazo derivadas de mamíferos inmunizados. Además, los anticuerpos o fragmentos de los mismos a los péptidos antes mencionados pueden obtenerse utilizando métodos los cuales se describen en por ejemplo, Harlow and Lañe "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988. Estos anticuerpos pueden utilizarse por ejemplo para la ínmunoprecipítación e inmunolocalización de proteínas de acuerdo con la invención así como para el monitoreo de la sínstesis de tales proteínas, por ejemplo, en organismos recom inantes , y para la identificación de compuestos que interactúan con la proteína de acuerdo con la invención. Por ejemplo, resonancia de plasmón de superficie como se emplea en el sistema BIAcore pueden utilizarse para incrementar la eficiencia de las selecciones de anticuerpos de fago, produciendo un incremento elevado de afinidad a partir de una biblioteca sencilla de anticuerpos de fago que se unen a un epítope de la proteína de la invención (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol . Methods 183 (1995), 7-13). En muchos casos, los fenómenos de unión de los anticuerpos a los antígenos es equivalente a otra unión de ligando/anti-ligando . En una modalidad, la presente invención se relaciona a una molécula de ácido nucleico antisentido que comprende la secuencia complementaria del polipéptido de la presente invención. Los métodos para modificar los niveles y/o actividad de expresión se conocen por personas expertas en la técnica e incluyen por ejemplo, la sobreexpresión, la co-supresión, el uso de ribozimas, estrategias sentido y antisentido, métodos de silenciación genética. "Hebra genética" se refiere a la hebra de una molécula de ADN' de doble hebra que es homologa a una transcripción de AR m de la misma. La "hebra antisentido" contiene una secuencia invertida la cual es complementaria a aquella de la "hebra sentido" . Una molécula de ácido nucleico "antisentido" comprende una secuencia de nucieótido la cual es complementaria a una molécula de ácido nucleico "sentido" que codifica una proteína, por ejemplo, complementaria a la hebra de codificación de una molécula de ADNc de doble hebra o complementaria a una secuencia de ARNm. Por consiguiente, una molécula de ácido nucleico antisentido puede hidrogenar la unión a una molécula de ácido nucleico sentido. La molécula de ácido nucleico antisentido puede ser complementaria a una hebra de codificación Rpi-blb2 completa o a sólo una porción de la misma. Por consiguiente, una molécula de ácido nucleico ant.i sentido puede ser antisentido a una "región de codificación" de la hebra de codificación de una secuencia de nucieótido de un polinucleotido de la presente invención. El término "región de codificación" se refiere a la región de la secuencia del nucieótido que comprende codones que se traducen en residuos aminoácidos. Además, la molécula del ácido nucleico antisentido es antisentido a una "región sin codificación" de la hebra de codificación de la secuencia de nucieótido que codifica Rpi-blb2. El término "región sin codificación" se refiere a las secuencias 5' y 3' que flanquean la región de codificación que no se traduce en un polipéptido, es decir, también se refiere a regiones 5' y 3' sin traducir (5'-UTR o 3'-UTR). Dadas las secuencias de hebra de codificación que codifican Rpi-blb2 descrita en la presente, las moléculas del acido nucleico antisentido de la invención pueden diseñarse de acuerdo a las reglas del apareamiento de bases de Watson y Crick. La molécula del ácido nucleico antisentido pueden ser complementarias a la región de codificación completa del AR m de Rpi-blb2, pero pueden ser un oligonucleótido el cual es antisentido a sólo una porción de la región de codificación o sin codificación del ARNm de Rpi-blb2. Por ejemplo, el oligonucleótido antisentido puede ser complementario a la región que rodea el sitio de partida de traducción del ARNm de Rpi-blb2. Un oligonucleótido antisentido puede ser por ejemplo, de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 nucleótidos de longitud. Una molécula del ácido nucleico antisentido de la invención puede construirse utilizando reacciones de síntesis química y de ligación enzimática que utilizan procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico antisentido (por ejemplo, un oligonucleótido antisentido) puede sintetizarse químicamente para incrementar la estabilidad biológica de las moléculas o para incrementar la estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos nucleicos antisentido y sentido por ejemplo, derivados de fosforotioato y n cleótidos sustituidos con acridina pueden utilizarse. Ejemplos de nucleótidos modificados que pueden utilizarse para generar el ácido nucleico antisentido incuyen 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo , 5-clorouracilo, 5-yiodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5- (carboxihidroxilmetil) uracilo, 5-carboximetil-aminoraetil-2 -1iouridina , 5 -carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilaqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metil-inosina, 2 , 2 -dimetilguanina, 2-metiladenina, 2 -metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina; 7-metilguanina, 5-meti1aminometiluracilo , 5-met-oxiaminome i1-2 -1iouraci1o , beta-D-mannosilcueosina, 5 ' -metoxicarboximetil-uracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6~isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético- (v) , wibutoxosina, pseudouracilo , cueosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2 -tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo , metiléster del ácido uracil-5-oxiácetico, ácido uracil-5-oxi-acético (v) , 5-metil-2-tiouracilo, 3 - (3 -amino-3 -?-2-carboxipropil ) uracilo , (acp3)w, y 2 , 6 -diaminopurina . Alternativamente, el ácido nucleico antisentido puede producirse biológicamente utilizando un vector de expresión en donde un polinucleótido se ha subclonado en una orientación antisentido (por ejemplo, ARN transcrito a partir del polinucleótido insertado será de una orientación antisentido a un poliilucleótido objetivo de interés, descrito además en la siguiente subsección). Las moléculas de ácido nucleico antisentido de la invención se administran normalmente a una célula o se generan in situ de manera que hibridizan con o se unen a un A Mn celular y/o el ADN genómico que codifica una Rpi-blb2 por lo que inhibe la expresión de la proteína, por ejemplo, inhibiendo la transcripción y/o la traducción. La hibridización puede ser una complementar!edad de nucleótido convencional que forma un dúplex estable, o, por ejemplo, en el caso de una molécula de ácido nucleico antisentido que se une a los dúplex de ADN, a través de interacciones específicas en la ranura mayor de la doble hélice. La molécula antisentido puede modificarse de manera que se une específicamente a un receptor o a un antígeno expresado en una superficie de célula seleccionado, por ejemplo, uniendo la molécula del ácido nucleico antisentido a un péptido o a un anticuerpo que se une a un receptor de superficie celular o a un antígeno. La molécula del ácido nucleico antisentido puede suministrarse también a células que utilizan vectores descritos en la presente. Para lograr suficientes concentraciones intracelulares de las moléculas antisentido, las construcciones de vector en donde, la molécula del ácido nucleico antisentido se coloca bajo el control de un procariótico fuerte, viral o eucariótico incluyendo los promotores de planta se prefieren. En una modalidad adicional, la molécula de ácido nucleico antisentido de la invención puede ser una molécula de ácido nucleico anomérica. Una molécula de ácido nucleico a-anomérica forma híbridos de doble hebra específicos con ARN complementario en donde, contrario a las unidades usuales, las hebras corren en paralelo entre si (Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids . Res. 15: 6625-6641). La molécula del ácido nucleico antisentido puede comprender también un 2'-o-metil-ribonucleótido (Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 6131-6148) o un análogo de ARN-ADN quimérico (Inoue et al. (1987) FEBS Lett . 215: 327-330) . Además, la molécula del ácido nucleico antisentido de la invención puede ser una ribozima. Las ribozimas son moléculas de ARN catalíticas con actividad de ribonucleasa que son capaces de desdoblar un ácido nucleico de una sola hebra, tal como un ARNm, al cual tienen una región complementaria. De este modo, las ribozimas (por ejemplo, ribozimas de cabeza de martillo (descritas en Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334:585-591)) pueden utilizarse para desdoblar catalíticamente transcripciones de ARNm Rpi-blb2 por lo que se inhibe la traducción del ARNm. Una ribozima que tiene especificidad para una molécula de ácido nucleico que codifica Rpi-blb2 puede diseñarse con base en la secuencia del nucleotido de un ADNc de Rpi-blb2 descrito en la presente o en la base de una secuencia heteróloga que se aisla de acuerdo a los métodos enseñados en esta invención. Por ejemplo, un derivado de un ARN Tetrahymena L-19 IVS puede construirse en donde la secuencia del nucleótido del sitio activo es complementaria a la secuencia del nucleótido que se desdobla en el ARNm de codificación. Véase por ejemplo, Cech et al. Patente Norteamericana No. 4,987,071 y Cech et al. Patente Norteamericana No. 5,116,742. Alternativamente, el ARNm Rpi-blb2 puede utilizarse para seleccionar un ARN catalítico que tiene una actividad de ribonucleasa específica a partir de un grupo de moléculas de ARN. Véase por ejemplo, Bartel, D. and Szostak, J. W. (1993) Science 261: 1411-1418. La molécula antisentido de la presente invención puede comprender también secuencias de polinucleótido complementarias a la región reguladora de una secuencia de nucleótido Rpi-blb2, por ejemplo, su promotor y/o mej oradores, por ejemplo, que forman estructuras de triple hélice que evitan la transcripción del gen en las células objetivo. Véase generalmente, Helene, C. (1991) Anticancer Drug Des. 6 (6) : 569-84; Helene, C. et al. (1992) Ann. N. Y. Acad. Sci. 660: 27-36; and Maher, L. J. (1992) Bioassays 14 (12) : 807-15. Además, en una modalidad, la presente invención se relaciona a un método para la producción de plantas transgénicas , células de planta o tejidos de planta que comprenden la introducción del polinucleótido o el vector de la presente invención dentro del genoma de la planta, el tejido de la planta o la célula de la planta. En una modalidad preferida, el vector o el polinucleótido y un vector o un polinucleótido para la expresión de un gen de resistencia adicional, en particular para Rpi-blb, se introduce también dentro del genoma de la planta, el tejido de la planta o la célula de planta antes, después o juntas. Para la expresión de las moléculas del ácido nucleico de acuerdo con la invención en la orientación sentido o antisentido en las células de planta, las moléculas se colocan bajo el control de elementos reguladores que aseguran la expresión en las células de planta. Estos elementos reguladores pueden ser heterólogos u homólogos con respecto a la molécula del ácido nucleico que se expresa así como con respecto a las especies de plantas que se transforman y se describen anteriormente en detalle. En general, tales elementos reguladores comprenden un promotor activo en las células de planta. Para obtener la expresión en todos los tejidos de una planta transgénica, por ejemplo se utilizan promotores constitutivos tales como el promotor 35 S de CaMV (Odell, Nature 313 (1985), 810-812) o promotores de los genes de poliubiquitina del maíz (Christensen, Plant Mol. Biol . 18 (1982), 675-689). Con el fin de lograr la expresión en los tejidos específicos de una planta transgénica, es posible utilizar promotores específicos de tejido (véase por ejemplo, Stockhaus, EMBO J. 8 (1989) , 2245-2251) . Se conocen también promotores los cuales son específicamente activos en tubérculos de papas o en semillas de diferentes especies de plantas, tales como maíz, Vicia, trigo, cebada, etc. Los promotores inducibles pueden utilizarse para ser capaces de controlar exactamente la expresión. Los promotores inducibles comprenden también promotores, los cuales se inducen por infecciones de plantas. Modalidades adicionales se describen anteriormente. En una modalidad, la presente invención se relaciona a un método para producir una planta o una parte de la misma resistente a un patógeno del phylum Oomycetes que comprende las etapas: de expresar en la planta o una parte de la misma el polipéptido de la presente invención y una proteína resistente adicional. Por consiguiente, en una modalidad adicional, la presente invención se relaciona a una planta transgénica a un tejido de planta de la invención o producido de acuerdo al método de la invención, el cual en la presencia del polinucleótido o el vector es resistente a los patógenos. La generación de un organismo transformado (o de una célula o tejido transformado) requiere introducir el ADN, ARN, o una proteína bajo discusión dentro de la célula huésped relevante. Una multiplicidad de métodos están disponibles por este procedimiento, los cuales se llaman transformación (o transducción o transfección) (Keown et al. (1990) Methods in Enzymology 185:527-537). Por ejemplo, el ADN o el ARN pueden introducirse directamente por microinyección o por bombardeo con micropartículas recubiertas con ADN. También, la célula puede permeabilizarse químicamente, por ejemplo utilizando polietilenglicol de manera que el ADN puede entrar a la célula por difusión. El ADN puede también introducirse por fusión de protoplasto con otras unidades que contienen ADN tales como minicélulas, células, lisosomas, o liposomas . Otro método adecuado para introducir el ADN es electroporacion, en donde las células se permeabilizan reversiblemente por un pulso eléctrico. Métodos adecuados se han descrito (por ejemplo por Bilang et al. (1991) Gene 100: 247-250; Scheid et al. (1991) Mol Gen Genet 228: 104-112; Guerche et al. (1987) Plant Science 52: 111-116; Neuhause et al. (1987) Theor Appl Genet 75: 30-36; Klein et al. (1987) Nature 327: 70-73; Howell et al. (1980) Science 208: 1265; Horsch et al. (1985) Science 227: 1229-1231; DeBlock et al. (1989) Plant Physiology 91: 694-701; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds . ) Academic Press Inc. (1988); y Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds.) Academic Press Inc. (1989) ) . En las plantas, los métodos descritos anteriormente para transformar y regenerar plantas a partir de tejidos de planta o células de planta se explotan por transformación transitoria o estable. Los métodos adecuados son especialmente la transformación de protoplastos por el consumo de ADN inducido por polietilenglicol , el método balístico con la pistola genética, lo que se conoce como el método de bombardeo de partículas, la electroporación, la incubación de embriones secos en una solución que contienen ADN y la microinyección. Además de estas técnicas de transformación "directas" , la transformación puede también ser efectuada por inyección bacterial por medio de Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes. La transformación mediada por Agrobacterium se adapta mejor a células de planta dicotiledóneas. Los métodos se describen por ejemplo por Horsh B et al. (1985) Science 225: 1229f. Cuando se utilizan agrobacterias , el cásete de expresión debe integrarse en plásmidos específicos, ya sea dentro de un vector de plataforma o intermediario, o dentro de un vector binario. Si un plásmido Ti o Ri va a utilizarse para la transformación, al menos el borde derecho, pero en la mayoría de los casos el borde derecho e izquierdo, del T-ADN de plásmido Ti o Ri se enlaza al cásete de expresión que se introduce en la forma de una región de flanqueo. Los vectores binarios se utilizan de preferencia.

Los vectores binarios son capaces de duplicación tanto en E. coli como en Agrobacterium. Como una regla, estos comprenden un gen marcador de selección y un enlazador o un polienlazador flanqueado por la secuencia de borde de T-ADN izquierda y derecha. Estos pueden transferirse directamente dentro del Agrobacterium (Holsters et al. (1978) Mol Gen Genet 163:181-187) . El gen marcador de selección permite la selección de agrobacterias transformadas y es por e emplo, el gen npt II, el cual confiere resistencia a la canamicina. El Agrobacterium el cual actúa como un organismo huésped en este caso debe contener ya un plásmido con la región vir. El último se requiere para transferir el T-ADN a la célula de planta . Un Agrobacterium transformado de esta manera puede utilizarse para transformar células de planta. El uso del T-ADN para transformar células de planta se ha estudiado y descrito intensamente. EP 120 516; Hoekema, en: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B. V. , Alblasserdam, Capítulo V; An et al. (1985) EMBO J 4: 277-287) . Varios vectores binarios se conocen, algunos de los cuales están comercialmente disponibles tales como por ejemplo, pBI101.2 or pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. USA) . Los promotores adicionales que son adecuados para expresión en plantas se han descrito (Rogers et al. (1987) Meth in Enzymol 153: 253-277; Schardl et al. (1987) Gene 61: 1-11; Berger et al. (1989) Proc Nati Acad Sci USA 86:8402-8406) . Las técnicas de transformación directa son adecuadas para cualquier organismo y tipo celular. Los plásmidos utilizados necesarios no cumplen ningún requerimiento particular en el caso de la inyección o electroporación del ADN o ARN en las células de planta. Los plásmidos simples tales como aquellos de la serie pUC pueden utilizarse. Si las plantas completas van a regenerarse a partir de las células transformadas, es necesario para un gen marcador seleccxonable adicional ubicarse en el plásmido. Las células establemente transformadas, es decir, aquellas que contienen el ADN introducido integrado dentro del ADN de la célula huésped, pueden seleccionarse a partir de células no transformadas cuando un marcador seleccxonable es parte del ADN introducido. Ejemplos de genes que pueden actuar como marcadores son todos aquellos que son capaces de conferir resistencia a antibióticos o herbicidas (tales como canamicina, G418, bleomicina, higromicina o fosfinotricina) (véase anteriormente) . Las células transformadas las cuales expresan tales genes marcadores son capaces de sobrevivir en la presencia de concentraciones de un antibiótico o herbicida correspondiente el cual elimina un tipo silvestre no transformado. Ejemplos se mencionan anteriormente y de preferencia comprenden el gen bar, el cual confiere resistencia al herbicida fosfinotricina (Rathore KS et al. (1993) Plant Mol Biol 21 (5) : 871-884) , el gen npt II, el cual confiere resistencia a la canamicina, el gen hpt, el cual confiere resistencia a la higromicina, o el gen EPSP, el cual confiere resistencia al herbicida Glifosato. El marcador de selección permite la selección de células transformadas a partir de células no transformadas (McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84). Las plantas resultantes pueden reproducirse e hibridizarse en la forma habitual. Dos o más generaciones deben cultivarse con el fin de asegurar que la integración genómica sea estable y hereditaria. Los métodos antes mencionados se describen por ejemplo en Jenes B et al. (1993) Techniques for Gene Transfer, en: Transgenic Plants, Vol . 1, Engineering and Utilization, editado por SD Kung and R u, Academic Press, pp. 128-143 y en Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42: 205-225) . La construcción que se expresa se clona de preferencia dentro de un vector el cual es adecuado para la transformación de Agrobacterium tumefaciens, por ejemplo pBinl9 (Bevan et al. (1984) Nucí Acids Res 12: 8711f) . La construcción que se expresa se clona de preferencia dentro de un vector el cual es adecuado para la transformación de Agrobacterium tumefaciens, por ejemplo pBinl9 (Bevan et al., (1984) Nucí Acids Res 12:8711f). Tan pronto como se ha generado una célula de planta transformada, una planta completa puede obtenerse utilizando métodos conocidos por el técnico experto. Por ejemplo, los cultivos de callos se utilizan como un material de partida. El desarrollo de brotes y raíces puede inducirse en esto como una biomasa celular aún no diferenciada en una forma conocida. Los brotes obtenidos pueden plantarse y reproducirse . El técnico experto está familiarizado con tales métodos para regenerar plantas intactas a partir de células de planta y partes de plantas. Los métodos para hacer esto se describen por ejemplo por Fennell et al. (1992) Plant Cell Rep. 11: 567-570; Stoeger et al (1995) Plant Cell Rep. 14: 273-278; Jahne et al. (1994) Theor Appl Genet 89: 525-533. El método de acuerdo con la invención puede combinarse ventajosamente con métodos adicionales que provocan resistencia patogénica (por ejemplo a insectos, hongos, bacterias, nemátodos y similares), resistencia a la tensión u otra mejora de las propiedades de la planta. Se mencionan ejemplos ínter alia, por Dunwell JM, Transgenic approaches to crop improvement, J Exp Bo . 2000; 51 Spec No; páginas 487-96. Las cepas adecuadas del Agrobacterium tumefaciens y los vectores así como la transformación de las agrobacterias y el crecimiento apropiado y los medios de selección se conocen bien por aquellos expertos en la técnica y se describen en la técnica anterior GV31 01 (pMK90RK) , oncz, Mol. Gen. Genet . 204 (1386), 383-396; C58C1 (pGV 3850kan) , Deblaere, Nucí. Acid Res. 13 (1985), 4777; Bevan, Nucleic. Acid Res. 12 (1984), 8711; Koncz, Proc. Nati. Acad. Sci . USA 86 (1989), 8467-8471; Koncz, Plant Mol. Biol . 20 (1992), 963-976; Koncz, vectores especializados para estudios de etiquetación y expresión genética. en: Plant Molecular Biology Manual Vol 2, Gelvin and Schilperoort (Eds . ) , Dordrecht, The Netherlands : Kluwer Academic Publ . (1994), 1-22; EP-A-120 516; Hoekema : The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B. V., Alblasserdam (1985), Capítulo V, Fraley, Crit . Rev. Plant. Sci., 4,1-46; An, EMBO J. 4 (1985) , 277-287) . Aunque el uso de Agrobacterium tumefaciens se prefiere en el método de la invención, otras cepas de Agrobacterium, tales como Agrobacterium rhizogencs, pueden utilizarse, por ejemplo si un fenotipo conferido para cepas se desea. La transformación de la mayoría de las plantas dicotiledóneas es posible con los métodos descritos anteriormente. Pero también para transformación de plantas monocotiledóneas varias técnicas de transformación exitosas se han desarrollado. Éstas incluyen la transformación utilizando métodos balísticos, por ejemplo descritos anteriormente así como la transformación de protoplastos , electroporación de células parcialmente permeabilizadas , la introducción del ADN que utiliza fibras de vidrio, etc. El término , transformación" como se utiliza en la presente, se refiere a la transferencia de un polinucleótido hexógeno dentro de una célula huésped, irrespectivo del método utilizado para la transferencia. El polinucleótido puede introducirse transitoria o establemente dentro de la célula huésped y puede mantenerse no integrado, por ejemplo como un plásmido o como conexiones quiméricas, o alternativamente, puede xntegrarse dentro del genoma huésped. La célula de planta transformada resultante puede utilizarse entonces para regenerar una planta transformada en una manera conocida por una persona experta. Por consiguiente, en una modalidad, la presente invención se relaciona a una célula de planta que comprende el polinucleótido, el vector de la presente invención u obtenible por el método de la presente invención. De preferencia, la célula comprende un polinucleótido o un vector que confiere resistencia adicional, más preferido es un vector o polinucleótido que codifica Rpi-blb. De este modo, la presente invención se relaciona también a células de planta transgénicas que contienen (de preferencia de manera estable integradas dentro del genoma) un polinucleótido de acuerdo con la invención enlazado a elementos reguladores que permiten la expresión del polinucleótido en células de planta y en donde el polinucleótido es extraño a las células de planta transgénicas . Para el significado de extraño; véase supra. De este modo, la presente invención se relaciona también a plantas transgénicas y tejidos de planta que comprenden células de planta transgénicas de acuerdo con la invención. Debido a la (sobre) expresión de un polipéptido de la invención, la planta o los tejidos de' planta son resistentes a patógenos de plantas, en particular a Oomyctes . De preferencia, las plantas son también resistentes a otros patógenos, por ejemplo a patógenos de plantas sorbedoras . Los patógenos adicionales se describen en la presente. Se prefiere que las plantas o tejido de planta sean resistente a especies de Phytophthora, más preferido a P. infestans. Por ejemplo, para obtener plantas transgénicas que expresan el gen Rpi-blb2, su región de codificación puede clonarse, por ejemplo dentro del vector pBinAR (Hófgen und illmitzer, Plant-Science, 66, 1990, 221-230) . Por ejemplo, siguiendo una tecnología de reacción de cadena de polimerasa (PCR) la región de codificación de la Rpi-blb2 puede amplificarse utilizando Cebadores como se muestra en los ejemplos y figuras, por ejemplo, en la Tabla 3b en particular ARF1F y ARF1R. El fragmento de PCR obtenido puede purificarse y subsecuentemente el fragmento puede clonarse dentro de un vector. El vector resultante puede transferirse dentro de Agrobacterium tumefaciens. Éste puede utilizarse para la transformación y las plantas transgénicas pueden seleccionarse entonces. En otra modalidad, la presente invención se relaciona a una planta transgénica o un tejido de planta que comprende la célula de la planta de la presente invención . "Transgénico" , por ejemplo con respecto a la secuencia de ácido nucleico, un cásete de expresión o un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico o un organismo transformado con la secuencia del ácido nucleico, el cásete de expresión o un vector, se refiere a todas aquellas construcciones que se originan por los métodos recombinantes en donde, ya sea a) la secuencia de ácido nucleico Rpi-blb2, o b) una secuencia de control genético se enlaza operablemente a la secuencia de ácido nucleico Rpi-blb2, por ejemplo un promotor, o c) (a) y (b) no se ubican en su ambiente genético natural o se han modificado por métodos recombinantes, un ejemplo de una modificación que es una sustitución, adición, eliminación, inversión o inserción de uno o más residuos nucleótidos . El ambiente genético natural se refiere a la posición cromosomal natural en el organismo de origen, o en la presencia en una biblioteca genómica. En el caso de una biblioteca genómica, el ambiente genético natural de la secuencia de ácido nucleico se retiene de preferencia, al menos en parte. El ambiente flanquea el ácido nucleico al menos en un lado y tiene una secuencia de al menos 50 pb, de preferencia al menos 500 pb, especialmente de preferencia al menos 1000 pb, muy especialmente de preferencia al menos 5000 pb, de longitud. Un cásete de expresión de origen natural - por ejemplo la combinación de origen natural del promotor Rpi-blb2 con el gen Rpi~blb2 correspondiente - llega a ser un cásete de expresión transgénico cuando se modifica por métodos "artificiales" no naturales sintéticos tales como por ejemplo mutagenización . Tales métodos se han descrito (US 5,565,350; WO 00/15815; véanse también anteriormente). Además, la célula de planta, el tejido de planta o la planta pueden también transformarse de manera que enzimas adicionales y proteínas se (sobre) expresan, cuya expresión soporta un incremento de la resistencia de la planta o del tejido de la planta, por ejemplo Rpi-blb (sinónimos Rpi-blbl, RB or Sbul) , Rl , Rpi-mcd, R-ber (sinónimo R12) , proteínas Rpil, Rpi-blb3, Rpi-ABPTl, R2 , R3a o R3b, R4 , R5 , R6, R7, R8, R9, RIO, Rll, Ph-1, Ph-2 y/o Ph-3. Se prefiere la co-expresión de Rpi-blb y Rpi-blb2. La presente invención se relaciona también a tejidos de planta cultivadas que comprenden células de planta transgénicas como se describe anteriormente, las cuales muestran la expresión de una proteína de acuerdo con la invención . Los organismos huéspedes o de partida los cuales se prefieren como organismos transgénicos son principalmente plantas de acuerdo con la definición anterior. Incluidos dentro del alcance de la invención, están todos los géneros y especies de plantas inferiores y elevadas del Reino Vegetal . Además incluidas son las plantas maduras, semillas, brotes y plántulas, y partes, material de propagación y cultivos derivados de las mismas, por ejemplo cultivos celulares que tienen una actividad de Rpi-blb2 incrementada. Las plantas maduras se refieren a plantas en cualquier etapa de desarrollo más allá de aquellas de las plántulas . El término plántula se refiere a una planta inmadura joven en una etapa de desarrollo temprano. Cualquier planta transformada obtenida de acuerdo con la invención puede utilizarse en un esquema de reproducción convencional o en propagación de plantas in vitro para producir más plantas transformadas con las mismas característica y/o pueden utilizarse para introducir la misma característica en otras variedades de la misma especie o relacionada. Tales plantas son también parte de la invención. Las semillas obtenidas a partir de las plantas transformadas genéticamente contienen también la misma característica y son parte de la invención. Como se menciona anteriormente, la presente invención es en principio aplicable a cualquier planta y cultivo que puede transformarse con cualquiera del método de transformación conocido por aquellos expertos en la técnica . En general, las plantas que pueden modificarse de acuerdo con la invención y las cuales muestran ya sea sobre-expresión de una proteína de acuerdo con la invención o una reducción de la síntesis de tal proteína pueden derivarse a partir de cualquier especie de planta deseada. Éstas pueden ser plantas monocotiledóneas o plantas dicotiledóneas, de preferencia pertenecen a especies de plantas de interés en agricultura, cultivos madereros o intereses de horticultura, tales como plantas de granos (por ejemplo maíz, arroz, cebada, trigo, centeno, avena, etc) , papas, plantas que producen aceites (por ejemplo colza de semilla de aceite, girasol, cacahuate, soya, etc), algodón, remolacha azucarera, caña de azúcar, plantas leguminosas (por ejemplo frijoles, chícharos, etc), plantas que producen madera, de preferencia árboles, etc. Sin embargo, las plantas que pueden infectarse por especies de Phytophthora se prefieren. Por consiguiente, en una modalidad, la planta, célula de planta o tejidos de planta de la invención o producidos de acuerdo al método de la invención se seleccionan a partir del grupo que consiste de Menyanthaceae , Solanaceae, Sclerophylacaceae , Duckeodendraceae, Goetzeaceae, Convolvulaceae, Cuscutaceae, Polemoniaceae , e Hydrophyllaceae de acuerdo al Systema Naturae 2000, Brands, S. J. , Amsterdam o tiene su origen en el mismo. De preferencia, tal planta, célula de planta o tejido de planta de la invención o se producen de acuerdo al método de la invención es una Solanaceae, seleccionada de preferencia a partir del grupo de Atropa, Browallia, Brunfelsia, Capsicum, Cestrum, Cyphomandra, Datura, Fabiana, Franciscea, Hyoscyamus, Lycium, Mandragora, Nicandra, Nicotiana, Petunia, Physalis, Schizanthus and Solanum de acuerdo a Systema Naturae 2000, Brands, S. J. , Amsterdam o tiene su origen en el mismo. Más preferido, la planta, la célula de planta o el tejido de planta de la invención o producida de acuerdo al método de la presente invención es una S. bulbocastanum, S. tuberosum (papa), S. lycopersicum (tomate), petunia, S. betaceum (planta del tomate) , S.. muricatum (melocotón) o S. melongena (berenjena) . Aún más preferida, la planta, el tejido de planta o la célula de planta es una S. tuberosum o S. lycopersicum. Más preferida es la S. tuberosum. En otros sitemas, la clasificación será simlar. La persona experta en la técnica sabe las diferenc as, por ejemplo, más común el tomate se llamará Lycopersicon sistemáticamente lycipersicum (L.) Karsten ex Fárwell . En aún otro aspecto, la invención se relaciona también a partes cosechables y al material de propagación de las plantas transgénicas de acuerdo con la invención, que contienen ya sea células de planta transgénicas que expresan una molécula de ácido nucleico y/o el polipéptido de acuerdo con la invención o que contienen células que muestran un nivel incrementado del polipéptido de la invención. Las partes cosechables pueden ser en principio cualesquiera partes útiles de una planta, por ejemplo, las flores, el polen, las plántulas, los tubérculos, las hojas, los tallos, los frutos, las semillas, las raíces, etc. El material de propagación incluye por ejemplo, semillas, frutos, cortes, plántulas, tubérculos, rizomas, etc. Se prefieren papas, tomates, berenjenas o melocotones como material cosechable o de propagación. En este caso, la planta de la invención es petunia, la presente invención se relaciona en una modalidad a las flores de la petunia como parte cosechable. La invención se relaciona además al uso de organismos transgénicos de acuerdo con la invención y de las células, cultivos celulares, las partes - tales como por ejemplo las raíces, las hojas y similares en el caso de los organismos de plantas transgénicas - derivados de las mismas, y al material de propagación transgenico tal como semillas o frutos, para la producción de forrajes o provisiones, farmacéuticos o químicos refinados. En particular, las papas pueden servir para la producción de químicos refinados.

Por consiguiente en otra modalidad, la presente invención se relaciona al uso del polinucleótido , la planta, la célula de planta o el tejido de planta, el vector, o el polipéptido de la presente invención para crear ácidos grasos, carotenoides , isoprenoides , vitaminas, lípidos, ésteres cerosos (poli) sacáridos y/o polihidroxialcanoatos , y/o sus productos de metabolismo, en particular, hormonas esteroidales , colesterol, prostagíandina (triacilgliceroles , ácidos biliares y/o células que producen cuerpos de cetona, tejidos y/o plantas. Existen un número de mecanismos por los cuales el rendimiento, la producción y/o la eficiencia de producción de ácidos grasos, carotenoides, isoprenoides, vitaminas, ésteres cerosos, lípidos, (poli) sacáridos y/o polihidroxialcanoatos, y/o sus productos de metabolismo, en particular, hormonas esferoidales, colesterol, triacilgliceroles, prostaglandina , ácidos biliares y/o cuerpos de cetona o además de los químicos refinados definidos anteriormente que incorporan tal proteína alterada, puede afectar. En el caso de las plantas, por ejemplo, incrementando la expresión del acetii-CoA que es la base de muchos productos, por ejemplo, ácidos grasos, carotenoides, isoprenoides, vitaminas, lípidos, (poli) sacáridos , ésteres cerosos, y/o polihidroxialcanoatos y/o sus productos de metabolismo, en particular, prostaglandina, hormonas esferoidales, colesterol, triacilgliceroles, ácidos biliares y/o cuerpos de cetonas en una célula, puede ser posible incrementar la cantidad de los compuestos producidos permitiendo así mayor facilidad de cosecha y purificación o en el caso de división de plantas más eficiente. Además, uno o más de los productos de metabolismo, cantidades incrementadas de los co-factores, moléculas precursoras y compuestos intermediarios para las trayectorias biosintéticas apropiadas pueden requerirse. Por lo tanto, incrementar el número y/o actividad de las proteínas transportadoras implicadas en el importe de nutrientes, tales como fuentes de carbono (es decir, azúcares) , fuentes de nitrógeno (es decir aminoácidos, sales de amonio) , fosfatos y azufre, puede ser posible mejorar la producción del acetil CoA y sus productos de metabolismo como se menciona anteriormente, debido a la remoción de cualesquiera limitaciones de suministro de nutrientes en el proceso biosintético . En particular, puede ser posible incrementar el rendimiento, la producción, y/o la eficiencia de producción de los compuestos, por ejemplo ácidos grasos, carotenoides , isoprenoides , vitaminas, esteres cerosos, lípidos, (poli) sacáridos , y/o polihidroxialcanoatos, y/o supbroductos de metabolismo, en particular, hormonas esferoidales, colesterol, prostaglandina, triacilgliceroles , ácidos biliares, y/o moléculas de cuerpos de cetona, etc., en las plantas. Se prefiere además un método para la producción recombinante de farmacéuticos o químicos refinados en organismos huéspedes, en donde un organismo huésped se transforma con uno de los casetes de expresión descritos anteriormente y este cásete de expresión comprende uno o más genes estructurales el cual codifica el químico refinado deseado o cataliza la biosíntesis del químico refinado deseado, el organismo huésped transformado se cultiva, y el químico refinado deseado se aisla a partir del medio de cultivo. Este método puede aplicarse ampliamente a químico refinados tales como enzimas, vitaminas, aminoácidos, azúcares, ácidos grasos y saborizantes naturales y sintéticos, sustancias de aromas y colorantes. Especialmente preferida es la producción de tocoferoles y tocotrienoles y carotenoides . Los organismos huéspedes transformados se cultivan y los productos se aislan a partir de los organismos huéspedes o el medio de cultivo por métodos conocidos por el técnico experto. La producción de farmacéuticos, tales como por ejemplo anticuerpos o vacunas se describe por Hood EE, Jilka JM. Curr Opin Biotechnol . 1999 Aug; 10 (4): 382-6; Ma JK, Vine ND . Curr Top Microbiol Immunol . 1999; 236:275-92. En una modalidad, la presente invención se relaciona también al uso del polinucleótido, vector, o el polipéptido de la presente invención para producir una planta o un tejido de planta, un órgano de planta o una célula de planta o una parte de la misma resistente a ésta.

Además, en una modalidad, la presente invención se relaciona a un método para la identificación de un compuesto que estimula la resistencia al patógeno de planta que comprende : a) poner en contacto células que expresan el polipéptido de la presente invención o su ARNm con un compuesto candidato bajo condiciones de cultivo celular; b) evaluar un incremento de expresión del polipéptido o el ARNm; c) comparar el nivel de expresión a una respuesta estándar hecha en la ausencia del compuesto candidato; por lo que una expresión incrementada sobre el estándar indica que el compuesto está estimulando resistencia. Tal compuesto puede sintetizarse químicamente o producirse microbiológicamente y/o estar comprendido en por ejemplo, muestras, por ejemplo extractos celulares a partir de por ejemplo, plantas, animales o microorganismos, por ejemplo patógenos. Además, los compuestos pueden conocerse en la técnica, pero hasta ahora no se conocen que sean capaces de suprimir o activar Rpi-blb2. La mezcla de reacción puede ser un extracto libre de células o puede comprender una célula o un cultivo de tejido. Estructuras adecuadas para el método de la invención se conocen por la persona experimentada en la técnica y son por ejemplo generalmente descritos en Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, tercera edición (1994), en particular el capítulo 17. Los compuestos pueden ser por ejemplo agregados a la mezcla de reacción, en un medio de cultivo, inyectados en la célula o rociados sobre la planta. Si una muestra que contiene un compuesto se identifica en el método de la invención, entonces es posible ya sea aislar el compuesto a partir de la muestra original identificada como conteniendo el compuesto capaz de activar e incrementar resistencia a los patógenos, o se puede subdividir además la muestra original, por ejemplo si ésta consiste de una pluralidad de diferentes compuestos, de manera que reduce el número de diferentes sustancias por muestra y repite el método con las subdivisiones de la muestra original. Dependiendo de la complejidad de las muestras, las etapas descritas anteriormente pueden realizarse varias veces, de preferencia hasta que la muestra identificada de acuerdo al método de la invención sólo comprende un número limitado de sólo una sustancia o sustancias. De preferencia, la muestra comprende sustancias de propiedades químicas y/o físicas similares, y más preferiblemente las sustancias son idénticas. De preferencia, el compuesto identificado de acuerdo al método descrito anteriormente o sus derivados se formulan además en una forma adecuada para la aplicación en la reproducción de plantas o célula de planta y cultivo de tejidos.

Los compuestos que pueden probarse e identificarse de acuerdo a un método de la invención pueden ser bibliotecas de expresión, por ejemplo, bibliotecas de expresión de ADNc, péptidos, proteínas, ácidos nucleicos, anticuerpos, compuestos orgánicos pequeños, hormonas, peptidomiméticos , PNAS o similares (Milner, Nature Medicine 1 (1995), 879-880; Hupp, Cell 83 (1995), 237-245; Gibbs , Cell 79 (1994), 193-198 y referencias citadas supra) . Tales compuestos pueden ser también derivados o análogos funcionales de inhibidores o activadores conocidos. Los métodos para la preparción de derivados o análogos químicos son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica y se describen en por ejemplo, Beilstein, Handbook of Organic Chemistry, Springer edition New York Inc., 175 Fifth Avenue, New York, N. Y. 10010 U.S.A. and Organic Synthesis, Wiley, New York, USA. Además, tales derivados y análogos pueden probarse para sus efectos de acuerdo a métodos conocidos en la técnica. Además, los peptidomiméticos y/o el diseño auxiliado por computadora de derivados y análogos apropiados pueden utilizarse, por ejemplo, de acuerdo a los métodos descritos anteriormente. La célula o tejido que puede emplearse en el método de la invención es de preferencia una célula huésped, una célula de planta o un tejido de planta de la invención descrita en las modalidades anteriormente. Determinar si un compuesto es capaz de suprimir o activar la resistencia puede hacerse, como se describe en los ejemplos, en particular a través del índice de la determinación del índice de esporulación . El activador identificado por el método descrito anteriormente puede confirmar ser útil como un fungicida o un protector de cultivo. De este modo, en una modalidad adicional, la invención se relaciona a un compuesto obtenido identificado de acuerdo al método de la invención, el compuesto es un agonista de Rpi-blb2. Por consiguiente, en una modalidad, la presente invención se relaciona además a un compuesto identificado por el método de la presente invención. Tal compuesto es por ejemplo, un homólogo de Rpi-blb2. Los homólogos del polipéptido de la presente invención pueden generarse por mutagénesis, por ejemplo mutagénesis de punto discreto o truncamiento de Rpi-blb2. Como se utiliza en la presente, el término "homólogo" se refiere a una forma variante de la proteína que actúa como un agonista de la actividad del Rpi-blb2. Un agonista de la proteína puede retener sustancialmente lo mismo o un subconjunto de las actividades biológicas de Rpi-blb2. En una modalidad, la invención se relaciona a un anticuerpo que reconoce específicamente el compuesto de la presente invención. La invención se relaciona también a una composición de diagnóstico que comprende al menos uno de los polinucleótidos antes mencionados, moléculas de ácido nucleico, vectores, proteínas, anticuerpos o compuestos de la invención y medios opcionalmente adecuados para detección. La composición de diagnóstico de la presente invención es adecuada para el aislamiento de ARNm a partir de una célula y poniendo en contacto el ARNm así obtenido con una sonda que comprende una sonda de ácido nucleico como se describe anteriormente o a condiciones de hibridización, detectando la presencia del ARNm hibridizado a la sonda, por lo que se detecta la expresión de la proteína en la célula. Métodos adicionales para detectar la presencia de una proteína de acuerdo con la presente invención comprenden inmunotécnicas bien conocidas en la técnica, por ejemplo ensayo inmunosorbente enlazado con enzima. Además, es posible utilizar las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención en particular los marcadores descritos en los ejemplos, por ejemplo en la Tabla 3a o 3b como marcadores moleculares o cebador en la reproducción de plantas. - Medios adecuados para la detección son bien conocidos por una persona experta en la técnica, por ejemplo tampones y soluciones para ensayos de hibridización, por ejemplo las soluciones y tampones antes mencionados, además y medios para transferencias Southern, Western, Norhern, como de describe por ejemplo en Sambrook et al., se conocen.

En otra modalidad, la presente invención se relaciona a un equipo que comprende el polinucleótido , el vector, la célula huésped, el polipéptido, el ácido nucleico antisentido, el anticuerpo, la célula de planta, la planta o el tejido de planta, la parte cosechable, el material de propagación o el compuesto de la invención. Los compuestos del equipo de la presente invención pueden empacarse en recipientes tales como frascos, opcionalmente con/en tampones y/o una solución. Si es apropiado, uno o más de los componentes puede empacarse en uno y el mismo recipiente. Adicional o alternativamente, uno o más de los componentes puede absorberse a un soporte sólido como por ejemplo un filtro de nitrocelulosa, una placa de vidrio, un chip, o una membrana de nylon o el pozo de una placa microtituladora . El equipo puede utilizarse para cualquiera de los métodos descritos en la presente y modalidades, por ejemplo para la producción de las células huésped, las plantas transgénicas , las composiciones farmacéuticas, la detección de secuencias homologas, la identificación de antagonistas o agonista, etc. Además , el equipo puede comprender instrucciones para el uso del equipo para cualquiera de las modalidades, en particular para su uso para incrementar la resistencia a uno o más de los patógenos de una célula de planta, un tejido de planta o una planta.

En una modalidad preferida el equipo comprende además un polinucleótido que codifica una o más de las proteínas de resistencia anteriormente mencionadas, de preferencia Rpi-blb, y/o un anticuerpo, un vector, una célula huésped, un ácido nucleico antisentido, una célula de planta, o un tejido de planta y/o una planta relacionada a la o las proteínas de resistencia, de preferencia a Rpi-blb. En una modalidad adicional, la presente invención se relaciona a un método para la producción de un protector de cultivos que proporciona el polinucleótido, el vector o el polipéptido de la invención o que comprende las etapas del método de la invención; y formular el polinucleótido, el vector o el polipéptido de la invención o el compuesto identificado en la etapa (c) del método de una forma aplicable como una composición agrícola: de plantas. En otra modalidad, la presente invención se relaciona a un método para la producción de una composición protectora de cultivo que comprende la etapa del método de la presente invención; y (a) formular el compuesto identificado en la etapa (c) en una forma aceptable, como composición agrícola. Por "aceptable como una composición agrícola" se entiende, que tal composición está de acuerdo con las leyes que regulan el contenido de fungicidas, nutrientes de plantas, herbicidas, etc. De preferencia, tal composición es sin ningún daño para las plantas protegidas y los animales (incluidos los seres humanos) que se alimentan con éstas. La presente invención se relaciona también a varias modalidades que se relacionan a usos y métodos adicionales. El polinucleótido, el polipéptido, los homólogos de proteínas, las proteínas de fusión, los cebadores, los vectores, las células huéspedes descritas en la presente pueden utilizarse en uno o más de los siguientes métodos: la identificación de plantas resistentes a patógenos de plantas como organismos mencionados ? relacionados; el mapeo de genomas; la identificación y la ubicación de secuencias de interés; los estudios de evolución; la determinación de regiones requeridas para la función; o la modulación de una actividad . Por consiguiente, los polinucleótidos de la presente invención tienen una variedad de usos. En primer lugar, pueden utilizarse para identificar un organismo que es S. bulbocastanum o un pariente cercano del mismo. También, pueden utilizarse para identificar la presencia de S. bulbocastanum o un pariente del mismo en una población mezclada de plantas. Al examinar el ADN genómico extraído de un cultivo de una población única o mezclada de plantas bajo condiciones severas con una sonda que abarca una región del gen de la presente invención, la cual es única a esta S. bulbocastanum, se puede verificar si la presente invención se ha utilizado o si S . bulbocastanum o un pariente, por ejemplo un pariente cercano se presenta. Además, el polinucleotido de la invención puede ser suficientemente homólogo a las secuencias de especies parientes de manera que estas moléculas de ácido nucleico pueden servir como marcadores para la construcción de un mapa genómico en organismos. Los polinucleótidos de la invención son también útiles para estudios estructurales evolutivos y de proteínas. Al comparar las secuencias de Rpi-blb2 de la presente invención a aquellos que codifican enzimas similares a partir de otros organismos, la relevancia evolutiva de los organismos puede evaluarse. De manera similar, tal comparación permite una evaluación de cuales regiones de la secuencias se conservan y cuales no, las cuales pueden ayudar a determinar aquellas regiones de la proteína que son esenciales para el funcionamiento de la enzima. Este tipo de determinación es de valor para estudios de ingeniería de proteínas y puede dar una indicación de lo que la proteína puede tolerar en términos de mutagénesis sin perder la función . Éstas y otras modalidades se describen y abarcan por la descripción y ejemplos de la presente invención. La literatura adicional relacionanda con cualquiera de los métodos, usos y compuestos que se emplean de acuerdo con la presente invención puede recuperarse a partir de bibliotecas públicas, utilizando por ejemplo dispositivos electrónicos. Por ejemplo, la base de datos pública "Medline" puede utilizarse, la cual está disponible en la internet, por ejemplo bajo hftp: //www. ncbi .nlm.nih.gov/PubMed/medline.html . Bases de datos adicionales y direcciones, tales como hft : //www . ncbi . nlm . nih . gov/ , hftp : //www . infobiogen. fr/ , hftp : //www. fmi . ch/biology/research-tools . html , hftp : //www. tigr. org/ , se conocen por la persona experta en la técnica y pueden obtenerse también utilizando por ejemplo, hft : //www. lycos . com. Una visión general de la información de la patente en la biotecnología y una sobrevivencia de fuentes relevantes de la información de la patente útiles para la búsqueda retrospectiva y para apreciación se da en Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364.

Tablas : Tabla 1: Secuencias : Tabla 2. La segregación de resistencia en 2851 clones de progenie de poblaciones de mapeo BC4 ARG 95-3 y ARP 96-11 en la prueba de campo de 2000 en Marknesse, The Netherlands . Los números de clones clasificados como teniendo un fenotipo resistente, susceptible o desconocido se presenta con porcentajes en paréntesis.

Mapeo de Sin clones Sin clones Sin clones Totales población con el con el con el fenotipo fenotipo fenotipo susceptible resistente desconocido A G 95-3 846 (37) 886 (39) 551 (24) 2283 ARP 96-11 256 (45) 170 (30) 142 (25) 568 Totales 1102 (39) 1056 (37) 693 (24) 2851 Tabla 3A. Visión general de marcadores utilizados para mapear Rpiblb2 Marcador Orl1) Secuencia Temperatura Enzima2> de de recocido °C Restricción E46 52 F TTGTGGTTATCGATGAGAAT 56,5 SCAR (b) R GAAACAACAGCAGGATÁGTGAG SCAR ?46?52T F TTGTGGTTATCGATGAGAAT 61 (a,b);Mbol (c) R GAAACAACAGCAGGATAGTGAG ?40 5T F GAATTCAGCACAAATACCAA 50 Ddel (a) R TTAACGTTTACTATCACGAG ?40?58T F GTAGAAACAGCAGCCTCATAAGC 55 SCAR (a) R TTCTGCCTAATTGCCCTGTG S1 E00 F GGGGTTGGGAAGACAACGACAC 50 AFLP R AATTCCAAGATACAGTCAAATAC 41 L F AGGCAGGATTAACAGTAGAAG 58 Taql (a) R CATGCTTTTAGGAAGAAGCTC 36L F TTGAGACAAAGCAGCTCCAC 59 Apol (a,b) R ACGTTTCTC ACACCTACAG G Taql (a,b);HpalÍ 69L F TGATGGCACGTTTGATCGTG 61 (c) R TAAGATCCAAACCAGCCACC Rsal( a,b); Apol 69R F CCTTATCACACATGTGGCTAC 58 (c) R ATTGAAACGGAGGAAGTACAAC Rsal (a,b); Ddel 141 F TTCTTCATATGGCAGACCAAC 60 (c) R CTACTCTG CTG AC ATG C AG G 24L F G AGATTCTCAAAG GTGTCTTCC 60 SCAR (a,b,c) R AACCTGTGCTTTCCCATTCG 24R F CTTTCACAAGCGTCACTTTGG 58 SCAR (a,b) R TAAAAAGAATCAACAGGGCAAC 14L F ACGACTGCTCAAAGTTGGCC 58 SCAR (a,b,c) R CCAAGAAGCCAGTTGAGAGC 123L F GTAGATTACACTATGGATATGG 60 SCAR (a,b) R CAGTTAGCAGCAATGTCAGC SCAR (a,b); 123L2 F CATTCAACTAGGCCAAAAGTGG 59 Dral (c) R CCAG GTAGGTGTTTTCTTCC 123R F GTTCTAAGTCAGATGCCACC 62 SCAR (a,b) R AAGTGCTCCAACACGAGCC 133R F TGAGTTCTCTTACCCTGCG 60 SCAR (a,b) R GGATATCCAGCATCAATGCC 133R2 F GGTGAGCCTCCTTGCATTCC 60 SCAR (a,b) R CCTGAGGGAAGATGTCACG 99L F CCTAGTTTAGAGTGAGTAGAC 58 SCAR (a,b) R GTGATATATTGCTCAAGGATCC 113R F GTTGCTGGCTGTCACTGATC 59 SCAR (a,b) R GTGATGTGCAGGGTTCAAGG 67L F GATTAGTGTAGATCTTAGCTTG 62 Mbol (a,b) R AAATCTCTCTCACAATTATCCC Haelll (a); Hinfl 112L F CTATTGACTGAACCTGCTGAG 56 (c) R TGAAGTCATTTAGTCCACAGC CT216 (RFLP) F AGATCGGAGTGTGAACATGG 56 R CTTCTACTTCTAGTCGACTGC CT216 F CGTAGTCCATCTGAAGCTCC 65 SCAR (a,b) R TCTTCTTCTGCTAGTCGTCG CT119 F ACTATTCTCACGTAAGGGGACAC 60 Hindlll (a,b) R GTGTACATGTATGAAACTCTAGC CT119N F GTTCCTTTCAATCAGAAAGTAG 55 SCAR (a) R CTTTGGATGAGTCAAAAGG CT 14L24L F univ14L 60 Cfol (C) • R univ24L SPB30L F CAAGTTACGGCAACCAAGAG 57 Hpall (c) R CTTTGACACAGTGTTAGAATGC SPB39L F CGTGATCTAGGAGTTACGAC 52 SCAR (c) R CTTATTTTAAATACAAGACATCTGG 24L9spec F univ. 14L 56 Hhal (c) R CAGAGGAAAGTCAACCAACG 24Lspec F univ. 14L 60 Cfol (c) R CAGAGGAAAGTCAACCAACG Nptll F TCGGCTATGACTGGGCACAACAGA 70 R AAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCG 13 F TGTAAAACGACGGCCAGT 55 R GGAAACAGCTATGACCATG 1) Ori: orientación del cebador: F: cebador delantero; R: cebadores inversos 2) a: ARG95-3, b: ARP96-11 , c:B6a Tabla 3B: Visión general de cebadores utilizados para mapear Rpi-blb2 cebador Ori Secuencia1 ) ARO 73 F TTCAGCACAAATACCAAT ARO 74 R GATGTTCCCCTTC 1 1 1 Í A ARO 77 R TTGTGGTTATCGATGAGAAT ARO 79 R ACCTGGCGTTCCTTA I I I í i ARO 94 NGTCASWGANAWGAA ARO 128 F GATGGAGCGGAAAAGCCGGTG ARO 129 F GGTG I 1 1 1 GTAGCATCTCCAG ARO 295 CCATGATTACGCCAAGCTGG ARO 296 GG 1 1 1 1 CCCAGTCACGACGT univ14L F AGAAAGCTCACCAGTGGACC univ24L R ATTTATGGCTGCAGAGGACC 123MÍ R AAGTCCAATTGCTCATCCATC 14L2 R TGCACCATGCACGAAGGTC 24L2 F CAAT TTGGTTCCCGAAA.TTGG ARF1F F ATGGAAAAACGAAAAGATAATGAAG ARF1 R R CTACTTAAATAACGGGATATCCTTC ARO 602 F CCCATGACTCCTTGAG 1 1 I G S1 GGTGGGGTTGGGAAGACAACG EcoR1 +0 GTAGACTGCGTACCAATTC Msel+0 GATGAGTCCTGAGTAA ARO 769 GTGCTTCATTCAAACTCAAGGAG ARO 770 CTGAACTAGAAAAACTCACTGTAGA ARO 771 GTTTGAAAAGATTGCAATTGCATG ARO 772 CTCAGCCATCAGTTGAAACAGAGA ARO 774 GAGAGAGATTCAAGAGGAGGAAGC " N=A+T+G+C, S=G+C,W=A+T en o ? Tabla 4. Complementación de susceptibilidad de añublo temprano en papa cv Impala cv Kondor Plantas/ Plantas R/ Plantas/ Plantas R/ transformantes plantas que transformantes plantas que Fuente que contienen contienen que contienen contienen Biblioteca ABC BAC Genotipo1 RGC RGC RGC RGC ARD 1197-16 24 RD (RGC1) 12/15a 0/12 8/10" 0/8 24 Ro (RGC2) 8/11a 0/8 5/6 0/5 24 Ro (RGC3) 11/13" 0/ 1 5/7b 0/5 211 Ro(RGC4) 5/7a 0/5 10/12" 0/10 242 Ro (RGC ) 5/7a 0/5 8/8a 0/8 211 Ro(RGC5) 5/7a 4/5 12713a 12/12 211 R0 (RGC6) - - _ 211 Ro (RGC24L) - - - Blb 2002 SPB39 Ro (RGC4) 5/6a 0/5 3/3a 0/3 SPB39 R0 (RGC5) 11/15a 1/11 8/8" 7/8 SPB39 Ro{RGC6) 3/3a 0/3 ß/?3 0/6 SPB30 Ro(RGC7) 3/4" 0/3 9/9" 0/9 SPB30 Ro (RGC8) 1/1" 0/1 - SPB39 Ro (24L) - - Ro (pBINPLUS) 3/3 0/3 8/10 0/8 1 genotipos Ro son transformantes primarios obtenidos a partir de la transformación de cultivos de papa susceptibles Impala o Kondor con construcciones T-ADN que contienen los candidatos RGC1 a RGC8 y RGC24L del gen Rpi-blb2 o un vector pBINPLUS vacío. Las cepas Agrobacterium lumefaciens UIA143a o AGLOb se utilizaron para la transformación de los cultivos de papa susceptibles a P. infestants Impala y Kondor.

Tabla 5. Condiciones de ciclización utilizadas para TAIL-PCR Reacción no. de ciclo Condición térmica Primario 1 92°C (2 min), 95°C (1 min) 5 94°C (15s), 63°C (1 min), 72"C (2 min) 94eC (15s), 30°C (3 min), nivelación a 72°C durante 3 min, 72°C 1 (2 min) 10 94°C (5a), 44°C (1 min),72°C (2 min) 12a 94°C (5s), 63"C (1 min), 72°C (2 min) 94°C (5s), 63°C (1 min), 72°C (2 min) 94°C (5s), 44°C (1 .min), 72°C (2 min) 1 72°C (5 min) Secundaria 10a 94° C (5e), 63°C (1 min), 72°C (2 min) 94°C (58), 63°C (1 min), 72°C (2 min) 94°C (5s) 44°C (1 min), 72°C (2 min) 1 72°C (5 min) Terciaria 20 94°C (10s), 44°C (1 min), 72°C (2 min) 1 72°C (5 min) a estos son ciclos de nueve segmentos cada uno consistiendo de dos ciclos de resistencia severa y uno de resistencia reducida.

Tabla 6: Complementacion de susceptibilidad del añublo temprano en cultivo de tomate oney aker por Rpi-blb2 Plantas/ Plantas Rl Fuente transformantes plantas que .

Biblioteca Bac Bac genotipo que contienen RGC contienen RGC Blb 2002 SPB39 R0 (RGC5) 24/25 22/24 Los genotipos Ro son transformantes primarios obtenidos a partir de la transformación del cultivo de tomate susceptible Moneymaker con la construcción de T-ADN que contiene el gen RGC5 del gen Rpi-blb2. Las cepas de Agrobacterium tumefaciens UIA1433 se utilizó para la transformación del cultivo de tomate susceptible a P. infestants.

Las figuras muestran: Figura 1: La representación esquemática del desarrollo de los clones híbridos interespecíficos complejos designados como 1ABP ' (la) y las poblaciones de mapeo S. tuberosum que se derivaron de dos de estos clones: el clon 55 de ???? y el clon 60 de ABPT (Ib a d) . A; Solanum acaule, B; S. bulbocastanum, P; S. pureja, T; S. tubersosum, 2x; diploide (2n=2x=24) , 3x; triploide 4x; tetraploide, 6x; hexaploide, cv; cultivo. Los códigos en cursivas indican poblaciones de mapeo. Figura 2. Las curvas de progreso de enfermedad para el clon ARF 87-601 y los cultivos de control susceptibles (cv) Bildstar, Eersteling y el cultivo de control resistente parcial Pimpernel en una prueba de campo para resistencia de la hoja a añublo temprano en el Valle de Toluca, México en 1991. En ocho puntos de tiempo después de la siembra, el porcentaje de follaje infestado debido a una infección por añublo temprano natural se clasificó en una escala de 1 a 9 CIP (Estrada-Ramos, 1983) . Figura 3. Las curvas del progreso de la enfermedad para el clon ARF 87-507, ARF 87-601, ARF 87-801, el cultivo de control susceptible (cv) Granóla y el clon AR 85-96-13 de reproducción resistente parcial en una prueba de campo para resistencia de hoja al añublo temprano en Benguet Province, Philippines en 1992. En los seis puntos de tiempo entre el 25 de agosto al 24 de noviembre, el porcentaje de follaje infestado debido a infección por añublo temprano natural se clasificó en la escala de 1 a 9 CIP (Estrada-Ramos, 1983) . Figura 4. Los fenotipos típicos en clones padres susceptibles y resistentes a tetraploides y clones de progenie que segregan resistencia mediada por Rpi-blb2 a añublo temprano en el ensayo de campo anual a Marknesse, The Netherlands, aproximadamente 6 semanas después de la inoculación con IPO82001 aislado de P. infestans. Seis esquemas de plantas con un clon que muestra el fenotipo resistente (dentro de la línea sólida negra) que no muestra o muestra apenas algunas lesiones de esporulacion y con un clon que muestra el fenotipo susceptible (dentro de la línea punteada blanca) que muestra completamente el follaje infestado . Figura 5. El mapa genético basado en 109 clones de progenie de población de mapeo de S. tuberosum ARG 95-15 que muestra marcadores 7 AFLP que se encontraron para co-segregase con el lugar Rpi-blb2. Los números a la izquierda de la línea vertical indican la distancia genética entre los marcadores de flanqueo o el lugar Rpi-blb2 en centimorgan (cM) . Figura 5. El mapa genético basado en 137 clones de progenie de población de mapeo de S. tuberosum ARG 95-3 que muestra marcadores 15 AFLP y el marcador RGA S1E00 que se encontraron para co-segregarse con el lugar Rpi-blb2. Los fenotipos de los clones de progenie se obtuvieron con ensayos de hojas desprendidas. Los números a la izquierda de la línea vertical indican la distancia genética entre los marcadores de flanqueo del lugar Rpi-blb2 en el centimorgan (cM) . Figura 7. El mapa genético basado en 178 clones de progenie de población de mapeo S. tuberosum ARG 95-3 que muestran 5 marcadores que se encontraron para co-segregarse con el lugar Rpi-blb2 en el grupo 6 de conexión de S. tuberosum. Los fenotipos de los clones de progenie se determinaron en el ensayo de campe en Marknesse, the Netherlands en 1998. Los marcadores E40M58 y E46M52 se clasificaron ya sea como AFLP, CAPS, SCAR o un marcador extendido (sufijo: 3) (tabla 3A) . Parcialmente, el marcador CT119 se clasificó como el marcador CT119N (tabla 3a) . El marcador CT216 se clasificó como el marcador SCAR. El número a la izquierda de la línea vertical indica la distancia genética entre los marcadores de flanqueo o el lugar Rpi-blb2 en centimorgan (cM) . Para cada marcador, el número de recombinantes entre el marcador y el fenotipo y el número total de clones progenie clasificados se dan en paréntesis . Figura 8. Los mapas genéticos basados en 886 clones progenie de la población de mapeo S. tuberosum ARG 95-3 y en 170 clones progenie de la población de mapeo S. tuberosum ARP 96-11, que muestran marcadores que se encontraron para co-segregarse con el lugar Rpi-blb2 en el grupo 6 de conexión de S. tuberosum. Los fenotipos de los clones progenie se determinaron en el ensayo de campo en Marknesse, the Netherlands en 2000. El número a la izquierda en la línea vertical indica la distancia genética entre los marcadores de flanqueo en centimorgan (cM) . El intervalo marcador, el cual delimita la posición del gen Rpi-blb2, basado en los episodios de recombinación detectados en clones progenie, se indica por lineas directas de doble flecha. Figura 9. El mapa físico de la región genómica que contiene Rpi-blb2 en S. tuberosum (línea horizontal superior) y S. bulbocastanum (línea horizontal inferior). Las líneas verticales indican la posición relativa de marcadores enlazados a resistencia. Los números sobre las líneas horizontales son el número de recombinantes identificados entre los marcadores de flanqueo en 1056 y 1899 plantas progenie de S. tuberosum, derivados de híbridos de especie compleja "ABPT" (Figura 1), y plantas de progenie S. bulbocastanum respectivamente. La progenie derivada de ABPE comprende clones a partir de poblaciones de mapeo ARG 95-3 y ARP 96-11. Los rectángulos representan clones de cromosomas artificiales bacteriales (BAC) a partir de la biblioteca ARD 1197-16 BAC excepto para los clones BAC con el prefijo "Blb" que existen a partir de la biblioteca Blb 2002 BAC de S. bulbocastanum. El intervalo marcador el cual delimita la posición del gen Rpi-blb2, basado en los episodios de recombinación detectados en clones progenie, se indica por lineas directas de doble flecha. Flechas pequeñas indican posiciones de Candidatos Genéticos de Resistencia (los R6C) . Figura 10. La representación esquemática del desarrollo de diploide, población de mapeo intraespec fica B6 de S. bulbocastanum. Los códigos en cursivas indican poblaciones de mapeo. Figura 11. El mapa genético basado en 1899 clones progenie de población de mapeo S. bulbocastanum B6, que muestran marcadores que se encontraron para co-segregarse con el lugar Rpi-blb2 en el cromosoma 6 de S . bulbocastanum. Los fenotipos de los clones progenie se determinaron por ensayos de hojas desprendidas. El número a la izquierda de la linea vertical indica la distancia genética entre los marcadores de flanqueo en centimorgan (cM) . El intervalo marcador el cual delimita la posición del gen Rpi-blb2, basado en los episodios de recombinación detectados en clones progenie, se indica por una línea directa de doble flecha. Figura 12. La complementación genética para susceptibilidad de añublo temprano. Los fenotipos de enfermedades típicos de los brotes de papa (S. tuberosum) , 6 días después de la inoculación con suspensiones de esporangiospora del extracto 655 -2A de P. infestants. El follaje derivado de plantas Kondor cv resistentes a canamicina transformadas con pBINPLUS (control; A), las hojas derivadas de plantas Kondor cv que albergan BAC SPB39 derivado de (B) o BAC 211 derivado RGC5 (C) , follaje derivado de plantas Impala cv resistentes a canamicina transformadas con pBINPLUS (control; D) , follajes derivados de plantas Impala cv que albergan BAC SPB39 derivado de (E) o BAC 211 derivado de RGC5 (F) . Los paneles A y D describen respuestas susceptibles típicas con lesiones de esporulación extensas de P. infestants. Los paneles B, C, E y F describen reacciones de resistencia típica observadas en los sitios de inoculación de plantas de papa transgénica que albergan Rpi-blb2. Figura 13. Las secuencias de ácido nucleico codifican el gen Rpi-blb2. A. Se codifica una secuencia de ácido nucleico del gen Rpi-blb2. B. Se codifica la secuencia del ácido nucleico del gen Rpi-blb2 que incluye la secuencia intron (posición 43-128) . C. La secuencia del fragmento de ADN genómico Sau3Al de 7967 pb de ARD 1197-16 BAC 211 presente en p211F-C12, una de las dos construcciones genéticas utilizadas para complementación genética para resistencia de añublo temprano. El fragmento genómico alberga el gen Rpi-blb2 que incluye los elementos reguladores naturales necesarios para expresión correcta del gen. El codón de inicio (posición ATG 1546-1548) y el codón de terminación (posición TAG 5433-5435) se subrayan. D. La secuencia del fragmento de ADN genómico Sau3Al de 9949 pb de S. bulbocastanum 2002 BAC BlbSP39 presente en pSP39-20, una de las dos construcciones genéticas utilizadas para complementación genética para resistencia a añublo temprano. El fragmento genómico alberga el gen Rpi-blb2 que incluye elementos reguladores naturales necesarios para expresión correcta del gen. El codón de inicio (posición aTG 1413-1415) y el codón de terminación (posición TAG 5300-5303) se subrayan . Figura 14. La estructura del gen Rpi-blb2 putativa y la secuencia de proteína Rpi-blb2 deducida. A. La representación esquemática de la estructura del gen Rpi-blb2. Las lineas horizontales indican exones . Las cajas abiertas representan la secuencia de codificación. Las líneas en ángulos descendentes indican las posiciones de las secuencias intron. B. Secuencia de proteína Rpi-blb2 deducida. La secuencia de aminoácido deducida de la secuencia de ADM de Rpi-blb2 se divide en tres dominios (LZ, NBS y LRR) . Los residuos hidrofóbicos en el domino A que forman el primer residuo de siete repeticiones del dominio de cierre de leucina potencial (LZ) se subrayan. Los motivos conservados en proteínas R se escriben en minúsculas y en cursivas en el dominio NBS . Los residuos que corresponden el consenso de la LRR citoplásmíca se indican en negritas en el dominio LRR. Los puntos en la secuencia se han introducido para alinear la secuencia a la secuencia LRR consenso de las LRR citoplásmicas . Figura 15. El alineamiento de los productos de proteínas deducidos codificados por Rpi-blb2, Mi-1.1 y Mi-1.2. Se muestra la secuencia de aminoácido completa de Rpi-blb2 y los residuos de aminoácidos de Mi-1.1 y Mi-1.2 que difieren a partir del residuo correspondiente en Rpi-blb2. Las rayas indican aberturas insertadas para mantener el alineamiento óptimo. Los residuos aminoácidos que son específicos para Rpi-blb2, cuando se comparan con aquellos en posiciones correspondientes en Mi-1.1 y Mi-1.2 se enfatizan en negro y rojo. Las regiones de las LRR que corresponden al motivo hebra-ß/giro ß xxLxLxxxx se subrayan. Los motivos conservados en el dominio NBS se indican en minúsculas. Una linea vertical indica la división entre la región CC-NBS y LRR. La posición del motivo VLDL el cual se conserva en la tercera LRR de muchas proteínas de plantas pero no en Rpi-blb2 se indica por el rectángulo sombreado. Figura 16. Alineamientos de Secuencia Múltiple CLUSTAL (1.82) de ácidos nucleicos Mil.l, Mil.2 y Rpi-blb2. Figura 17. Alineamientos de Secuencia Múltiple CLUSTAL W (1.82) de proteínas Mil.l, Mil.2 y Rpi-blb2. Figura 18. Los fenotipos típicos de los genes de resistencia R2 (A) y Rpi-blb2 (B) comparados a un fenotipo susceptible de cv. Bintje (C) . El panel A describe una reacción hipersensible típica con manchas necróticas muy pequeñas, aunque el panel B muestra regiones necróticas grandes que contienen un nivel bajo de esporulacion. El panel C describe una reacción susceptible típica con esporulacion clara . Esta invención se ilustra además por los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como limitantes.

Ej emplos Ejemplo 1: Evaluación de resistencia en ABPT derivada de clones y poblaciones hibridizadas Se seleccionaron clones BC2 ARF 87-507 y ARF 87-801 a partir de la progenie BC2 obtenida después de dos ciclos de hibridización en el clon ABPE de híbrido de especies complejas número 55 (Figura la) con cultivo de S. tuberosum susceptible a añublo temprano (LB) Oberambacher Frühe como primer progenitor y cultivoo de S . tuberosum Arkula (Figura Ib) y Blanka (Figura 1c) respectivamente como segundos progenitores. De manera similar, el clon BC2 ARF 87-601 se obtuvo por cruce sucesivo en el clon 60 ABPT con cultivos de S. tuberosum susceptibles a LB Alcmaria y Blanka (Figura Id) . Se probó el clon ARF 87-601 como parte de una prueba de campo para la selección de resistencia de LB en el área de Toluca en México en 1991. Una gráfica del clon ARF 87-601 con siete plantas se evalúo en comparación con las gráficas con nueve plantas cada uno de los cultivos control Bildstar, Eersteling y Pimpernel . De acuerdo con las evaluaciones de resistencia a añublo temprano en la lista Ducht Nacional de cultivos de papa recomendados de 1988, estos cultivos control obtuvieron 3, 3 y 8 respectivamente en una escala de 3 a 8 de resistencia de incremento. El cultivo Pimpernel se considera como una fuente de resistencia parcial (Colon et al., 1985) . Aproximadamente cuarenta días después de la plantación, la infección natural por P. infestants se estabilizó. El desarrollo de LB en el follaje se monitoreo entonces ocho veces durante el periodo del 16 de julio al 2 de septiembre (Figura 2) . Hubo una clara diferencia entre las curvas del progreso de la enfermedad para ARF 87-601 en comparación con los cultivos control . En 74 días después de la plantación, el follaje de los cultivos control se arruinaron completamente o casi complementamenté mientras que el clon ARF 87-601 no mostró síntomas visibles (Figura 2) . Los clones ARF 87-507, ARF 87-801 y de nuevo el clon ARF 87-601 mostraron resultados comparables en una prueba de campo APRA la selección de resistencia a LB en la Provincia Benguet de Filipinas en 1992 (Figura 3) . Diez plantas en cada uno de los tres clones BC , el cultivo control de Granóla y el clon AR 85-96-13 de reproducción resistente a LB moderadamente, el cual se utilizó como un progenitor hembra para obtener AR 92-1197 (Figura Id) se plantaron el 25 de agosto. El porcentaje de follaje infestados se evalúo seis veces después del suceso de infección natural por P. infestante. Las curvas de progreso de la enfermedad de clones BC2 derivados de ABPE fueron marcadamente diferentes cuando se compararon al cultivo de Granóla y el clon AR 85-96-13 (Figura 13) . Los clones BC2 no mostraron o mostraron pocos síntomas de LB y ningún progreso de enfermedad clara durante el periodo de evaluación mientras que los cultivos de Granóla habían infestado casi completamente el follaje en la tercera fecha de evaluación. Los clones ARF 87-601, ARF 87-507 y ARF 87-801 se utilizaron para hibridizarse además con cultivos susceptibles a LB y clones de reproducción de S. tuberosu (Figura Ib a Id) . Este trabajo de reproducción resultó en cuatro diferentes poblaciones de mapeo, población de tetraploide BC3 AG 95-15, poblaciones de tetraploide BC4 ARG 95-3, y ARP 96-11 y población DPI de diploide BC4. Durante las etapas sucesivas de estos clones ARF 87-507, ARF 87-601, ARF 87-801, AR 91-1263, AR 91-1292 y AR 92-1197 resistentes a trabajo de reproducción se seleccionaron con base en el rendimiento agronómico en evaluaciones de reproducción de práctica común así como seleccionando sus progenitores y progenies relevantes en un ensayo de campo en Marknesse, the Netherlands, que se inoculó con el aislado complejo IPO82001 de P. infestante . El clon ARD 1197-16 diploide (2n=2x=24) se seleccionó entre la progenie del cruce AR 92-1197 x Phu 81-101 (Figura Id) , el clon progenitor final que se conoce por su capacidad para inducir semillas partenogénicas establecidas en el progenitor hembra [Hermsen y Verdenius, 1973) . Inicialmente , la resistencia a LB en A D 1197-16 se encontró después de ensayos de follaje desprendido repetidos utilizando aislados IPO82001, IP0655-2A e IP0428-2 de P. infestants y se verificaron en un ensayo de campo en 1998 en Marknesse. El estado diploide del clon ARD 1197-16 se confirmó por citometría de flujo (Plant cytometry services, Schijndel, the Netherlands) . La clara segregación para el ensayo resistente a LB en poblaciones de mapeo y de progenie derivadas de ABPE se observó durante años sucesivos de la prueba de campo en el sitio del ensayo de Marknesse, aproximadamente 6 semanas después de la inoculación con aislado IPO82001 de P. infestants. Normalmente, los clones resistentes no mostraron o apenas mostraron algunas lesiones esporulantes mientras que los clones susceptibles mostraron follaje completamente infestado (Figura 4) En el 2000, un total de 2851 clones de poblaciones de mapeo ARG 95-3 y ARP 96-11 se seleccionaron como esquemas de plantas sencillos. En promedio, 24 por ciento de los clones mostraron fenotipos que no pudieron clasificarse sin ambigüedades como resistentes o susceptibles. Los clones que pudieron clasificarse como tales mostraron relaciones de segregación de fenotipos resistentes a susceptibles de l a l y de l a l.5 para poblaciones ARG 95-3 y ARP 96-11, respectivamente (Tabla 2) . Los ensayos de follaje desprendido con progenie derivada de ABPT y poblaciones de mapeo se encontró que son menos exactos para el fenotipo que la selección bajo condiciones de campo. No obstante, los resultados de ensayos de follaje desprendido se consideraron adecuados para la determinación inicial del fenotipo de clones individuales y de este modo, para la construcción de poblaciones de mapeo.

Ejemplo 2: El mapeo genético del lugar de resistencia Rpi-blb2 en poblaciones de ibridizacion derivadas de ABPT. En todas las cuatro poblaciones de mapeo (Figura 1) , se segregó la resistencia como se espera para un rasgo monogénico, sugiriendo la presencia de un alelo de resistencia dominante en un solo lugar (Tabla 2) . Este lugar se designó el lugar Rpi-blb2. Con el fin de identificar marcadores enlazados a Rpi-blb2, un análisis de AFLP inicial con 14 combinaciones del cebador (pe) se llevo a cabo en ADN de plantas de progenie ARG 95-15 10 resistentes y 10 susceptibles, basadas en ensayo de follaje desprendido, incluyendo los clones progenitores. La prueba de 21 marcadores potencialmente enlazados en 8S plantas adicionales identificaran varios marcadores enlazados a resistencia (Figura 5) . El análisis segregante considerable subsecuente (BSA) con 160 pcs en 2 grupos de ADN resistentes y 2 susceptibles, cada uno conteniendo el AEN genómico de 8 plantas . progenie ARG 95-15 resistentes o susceptibles, respectivamente, identificaron un total de 58 marcadores de AFLP potencialmente enlazados a la resistencia (Figura 5) . Cuando un número de estos marcadores se probaron en 137 plantas progenie de ARG 95-3, éstos se enlazaron también a · la resistencia en esta población, sugiriendo que la resistencia en las dos poblaciones se determinó por el mismo lugar (Figura 6) . Estos marcadores de co-segregación mapearon 3 a 28 centimorgan (cM) y 1 a 7.2 cM en un lado del lugar en ARG 95-15 y ARG 95-3 respectivamente, sugiriendo que la Rpi-blb2 podría situarse en una posición distal en un cromosoma. Para determinai" la posición del Rpi-blb2 en el mapa genético de la papa, los dos marcadores E40M58 y E46M52 de AFLP de co-segregación (Figura 6) se clonaron en el vector pGEM-T (Promega, the Netherlands) y se secuenciaron. Los cebadores diseñados en los extremos de las secuencias de los fragmentos AFLP clonados (Tabla 3) se titilizaron para desarrollar un marcador E40M58 de secuencia polimórfica amplificada desdoblada (CAPS) que se encontró se co-segrega con el rasgo de resistencia en 25 clones resistentes y 25 susceptibles de ARG 95-3. El marcador E40M58 CAPS se probó subsecuentemente en 46 plantas progenie de la población de mapeo CxE (van Eck et al., 1995) . Estos datos se agregaron a los resultados del marcador existente de la población CxE. El análisis de enlace de Joinmap (Stam, 1993) mapeo E40M58 cM distal a GP79 (Gebhardt et al., 1991), situando Rpi-blb2 en el brazo corto del cromosoma 6. En 178 plantas progenie de población ARG 95-3 sin recombinación entre Rpi-blb2 y marcadores E40 58, E40M60 AFLP y el marcador CT119 CAPS se observó. El marcador E46M52'AFLP y el marcador CT215 de la región amplificada caracterizada por secuencia (SCAR) mapeó 2.2 cM próximo al gen (Figura 7) .

Ejemplo 3: Identificación de un marcador RGA enlazado a Rpi-blb2. En un intento para identificar marcadores funcionalmente relevantes a resistencia, cebadores designados en los motivos conservados del dominio NBS de genes de plantas R (Leister et al., 1996) se utilizaron en el protocolo AFLP adaptado (RGA-AFLP) para identificar marcadores específicos del análogo del gen de resistencia (RGA) . Al utilizar el cebador SI basado en el bucle P de Leister et al. (1996) en combinación con el cebador EcoOO AFLP, un marcador específico RGA, se desarrolló S1E00 el cual se co- segrega con la resistencia y los marcadores E40M58 y CT119 en la población de mapeo ARG 95.3 (Figuras 6 y 7) .

Ejemplo 4: Desarrollo de marcadores SCAR E40M58e y E46M52e para selección recombinante . Utilizar ADN genómico de AR 91-1263 como plantilla, el fragmento clonado del marcador E46M52 AFLP se extendió por TAIL-PCR. El TAIL-PCR primario se realizó utilizando cebadores ARO 77 (spl) y ARO 94 (AD) subsecuentemente, el PCR secundario se realizó utilizando ARO 128 (sp2) y el PCR terciario utilizando ARO 129 (sp3) ambos en combinación con el cebador AD. Esto resulta en un fragmento E46M52e que se extendió en el extremo 5' con aproximadamente 500 pb. El fragmento E46M52e se clonó en pGEM-T y se secuenció. Un nuevo cebador delantero se diseñó en esta secuencia y el PCR en combinación con el cebador ARO 77 resultó en un marcador E46M52e SCAR que se co-segregó con el fenotipo resistente en las cuatro poblaciones de mapeo de S. tuberosum y como marcador CAPS también en la población B6. Al utilizar el ADN genómico de ARD 1197-16 como plantilla, el fragmento clonado del marcador E40M58 AFLP se extendió también por TAIL-PCR. El TAIL-PCR primario se realizó en ambas direcciones 5' y 3' utilizando cebadores ARO 73 spl (3') y 74 (5') en combinación con el cebador AD. Subsecuentemente, el PCR secundario se realizó utilizando como sp2 ARO 82 ó 79, respectivamente. Los fragmentos obtenidos a partir del PCR secundario, 750 pb del extremo 3' y 400 pb del extremo 5' se clonaron en pGEM-T y se secuenciaron. En la base de ambas secuencias, dos nuevos cebadores se diseñaron resultando en un marcador SCAR que se co-segrega con resistencia en la población de mapeo ARG 95-3 y DPI (Tabla 3) . El fragmento del marcador E40M58e SCAR pudo amplificarse en los progenitores resistentes de poblaciones de mapeo ARG 95-3 y DPI , que se derivaron del clon 55 ABPT (Figura 1) , pero la amplificación de PCR en los progenitores de los clones progenie de poblaciones de mapeo ARP 96-11 y ARG 95-15, que se derivaron del clon 60 ABPT, no dieron ningún producto detectable. Se asumió que esto podría haber sido causado por diferencias menores en la secuencia genómica y por lo tanto, el fragmento AFLP se extendió por TAIL-PCR utilizando el ADN genómico del clon AR 91-1292 como plantilla. Un fragmento E40M58e2 de aproximadamente 300 pb se obtuvo, se clonó y se secuenció. La comparación de la secuencia con el fragmento original del, marcador E40M58 AFLP mostró que sólo las primeras 37 pb del fragmento extendido fueron idénticas. PCR con cebadores designados en la secuencia de E40M58e2 no resultaron en un marcador polimórfico. Ambos de los marcadores E40M48e y E40M58e2 extendidos se probaron en cinco clones resistentes y susceptibles de S. bulbocastanum (BGRC 8005 y 8006). Sólo el fragmento del marcador E40M58e SCAR pudo amplificarse en cuatro clones S. bulbocastanum, indicando que parte de la secuencia de E40M58e2 no se derivó de S. bulbocastanum. Esta observación sugirió que E40M58e se ubicó en el borde del fragmento de introgresión S. bulbocastanum en el clon AR 91-1292 y que la posición del lugar Rpi-blb2 estuvo próxima al marcador E40M58e.

Ejemplo 5: Mapeo de Rpi-blb2 en una población de mapeo diploide derivada del material ABPE Un total de 149 clones progenie de la población DPI de mapeo diploide se seleccionaron con marcadores E40M58e y E46M52e. No se encontró ninguna recombinación entre estos marcadores sugiriendo recombinación suprimida en la región genómica estudiada cuando se compara con la población ARG 95-3 de mapeo tetraploide (Figura 7) . Un subconjunto de 112 clones se seleccionó para resistencia a aislados IP82001, ??0655-2? y IP0428-2 de P. infestants en un ensayo de follaje desprendido parcialmente repetido. Once de los clones (11%) mostraron reacciones intermedias y se clasificaron como teniendo fenotipos desconocidos. Otros 51 y 50 clones se clasificaron como resistentes y susceptibles respectivamente. Tres clones progenie DP1-28, DP1-79 y DP1-81 se identificaron, los cuales se recombinaron putativamente entre el lugar Rpi-blb2 y los marcadores E40M58e y E46M52e. En el 2000, un subconjunto de 50 hasta 112 clones de fenotipo se probaron para la resistencia a LB en el campo en el sitio de ensayo de Marknesse. Resultados decisivos en el fenotipo para la resistencia a LB se obtuvieron para 33 hasta 50 clones. El fenotipo de los clones 28 y 81 como se determina con el ensayo de follaje desprendido es erróneo. De este modo, se concluyó que estos clones no representaron episodios de recombinación entre Rpi-blb2 y los marcadores utilizados. El fenotipo del clon DP1-79 no pudo verificarse conclusivamente bajo condiciones de campo y este clon puede representar sólo el episodio de recombinación entre el lugar Rpi-blb2 y los marcadores E40M58e y E46M52e en 101 clones progenie de DPI (1 cM) . Ya que se mostró que dos marcadores, enlazados al ensayo de resistencia en ARG 95-15, ARG 95-3 y ARP 96-11, se co-segregaron con el mismo lugar para resistencia a LB en DPI, se concluyó que el clon ARD 1197-16 progenitor DPI fue adecuado como una fuente para el aislamiento del gen Rpi-blb2 en un mapa basado en un método de clonación.

Ejemplo 6: Mapeo Físico del lugar Rpi-blb2 derivado de ABPE El clon ARD 1197-16 resistente, heterocigoso para el lugar Rpi-blb2, se utilizó como el ADN de origen para la construcción de la biblioteca BAC (más adelante referido como la biblioteca ARD 1197-16 BAC) . La preparación del ADN de peso molecular elevado y la construcción de la biblioteca BAC se llevaron a cabo como se describe en Rouppe van der Voort et al. (1999) . Inicialmente , un total de 67988 clones con un tamaño de inserción promedio de 100 kb, que corresponde a aproximadamente 7 equivalentes del genoma, se almacenaron individualmente en 177 placas microtituladoras de 384 pozos a -80°C. La selección de marcadores de la biblioteca de BACA RD 1197-16 se llevó a cabo como se describe en Rouppe van der Voort et al. (1999) . Esencialmente, los grupos de ADN generados para cada placa de 384 pozos se seleccionó por PCR con marcadores SCAR o CAPS enlazados al lugar Rpi-blb2 con el fin de construir ¦ un mapa cromosomal BAC a través del lugar Rpi-blb2. La selección de la biblioteca ARD 119-16 con marcadores E40M58e, S1E00 y CT119 identificó varios clones BAC positivos, los cuales sirven como los BAC de las semillas a partir de las cuales un cromosoma transita a través del lugar Rpi-blb2 se inició. El marcador E40M58e se utilizó para aislar los clones 69 y 141 BAC mientras que los clones 14, 24, 123 y 133 BAC fueron positivos para el marcador S1E00. El marcador CT119 se utilizó para aislar BAC 67. Después de secuenciar los bordes izquierdo (L) y derecho (R) de estos clones BAC, un nuevo conjunto de marcadores se desarrolló; 14L, 24L, 24R, 69L, 69R, 141R, 123L, 123R, 133R y 67L. La selección de los clones BAC aislados con estos marcadores mostraron que los siguientes pares de clones BAC comparten el traslape: el lado derecho de 123 y el lado izquierdo de 133, 14 completamente con 24 y el lado izquierdo de 69 con el lado derecho de 141. BAC 67 no compartió el traslape con los otros clones BAC. El hallazgo de que los clones 14, 24, 124 y 133 BAC positivos S1E00 no formaron un mapa cromosomal sencillo indicó que S1E00 fue una secuencia repetitiva. Esto, junto con el hallazgo de que las secuencias de extremo BAC derecho de los clones 24 y 123 BAC mostraron alta homología a diferentes regiones del gen de resistencia Mil de tomate (Milligan et al., 1998, Simons et al., 1998), sugirió que el lugar Rpi-blb2 albergó más de un RGA. La selección de la biblioteca ARD 1197-16 BAC con marcadores 141R, 24L, 24R y 123L no condujeron a extensión de mapa cromosomal. Sin embargo, la selección de la biblioteca con marcadores 123R y 133R resultó en el aislamiento de clones 99 y 113 BAC, por lo que se extiende el mapa cromosomal BAC 123/133 en una dirección. La secuencia de extremo BAC de estos dos clones BAC conduce al desarrollo de dos nuevos marcadores, 99L y 113R. La selección de la biblioteca ARD 1197-16 BAC con 69R conduce a la extensión del mapa cromosomal 141/69. La selección consecutiva de la biblioteca BAC con marcadores derivados de clones BAC que extiende además este mapa cromosomal conduce al aislamiento de clones 36, 41 y 112 de BAC y al desarrollo de marcadores 36L, 41L y 112L. En un intento por completar el mapa cromosomal BAC a través del lugar Rpi-blb2, la biblioteca ARD 1197-16 BAC se agrandó con 38864 clones de ~ 100 kb BAC (placas números 178-273 de 384 pozos) . Esta segunda biblioteca se seleccionó con marcadores 24L, 24 , 123L y 141R, conduciendo a la identificación de clones BAC positivos para 24R y 123L (por ejemplo 191) y clones BAC positivos para 24L (211, 242) . De esta manera, la abertura entre BAC 24 y 123 se cerró y el mapa cromosomal 24/14 se extendió hacia el clon 141 BAC. No hubieron nuevos clones en la biblioteca ARD 1197-16 extendida que fueran positivos para el marcador 141R.

Ejemplo 7: Construcción de marcadores adicionales en la región BAC 123/133. En un intento para desarrollar marcadores polimórficos adicionales BAC 123 y 133, una biblioteca de sub-clones de 10 kb se construyó tanto en BAC 123 como 133. El ADN BAC se desdobló parcialmente con Sau3AI y fragmentos de aproximadamente 10 kbp se clonaron en el sitio BamHI del vector pBINPLUS . Con el fin de seleccionar clones que contienen la secuencia de extremo BAC original, 288 subclones de BAC 123 y 192 del BAC 133 se seleccionaron con los marcadores 123L o 133R de extremo BAC. En total 14 subclones fueron positivos para el marcador 123L y 11 para el marcador 133R. Subsecuentemente, la orientación de los clones positivos de extremo BAC se determinó por varios PCR, utilizando ya sea el cebador delantero o inverso del marcador de extremo BAC relevante en combinación con los cebadores M13F o M13R (Tabla 3) . Para el marcador 123L tres subclones y dos subclones para el marcador 133R se seleccionaron y los extremos que no contienen el marcador 123L o 133R se secuenciaron (aproximadamente 500 pb) . Con base en la nueva secuencia dos nuevos cebadores se diseñaron para el subclón 123 resultando en el marcador 123L2 y dos nuevos cebadores se diseñaron para el subclón 133 resultando en el marcador 123R. El marcador 123L2 SCAR, el cual se ubicó 10 kbp próximo al marcador 123L, pareció ser polimórfico en poblaciones de mapeo ARG 95-3, ARP 96-11 y como CAPS en B6. El marcador 133R2 SCAR, el cual se ubicó 10 kbp distal al marcador 133R, fue sólo polimórfico en poblaciones de mapeo ARG 95-3 y ARP 96-11.

Ejemplo 8: Mapeo fino del lugar Rpi-blb2 en ABPE derivado de poblaciones de mapeo. Con el fin del mapeo fino del lugar Rpi-blb2 en ABPE derivado de poblaciones de mapeo un total de 2283 nuevos clones progenie de población de mapeo ARG 95-3 y 598 clones de la población de mapeo ARP 96-11 se probaron para resistencia a LB en el campo en el sitio de ensayo de Marknesse en el 2000 (Tabla 2) . En la población ARG 95-3 846 clones (37%) se clasificaron susceptibles y 886 clones resistentes (39%) . Los fenotipos de los 551 clones restantes fueron poco claros. En la población 256 clones ARP 96-11 (45%) se clasificaron susceptibles y 170 clones (30%) resistentes. Los fenotipos de los 142 (25%) restantes fueron poco claros (Tabla 2) . 846 y 170 clones resistentes a partir de poblaciones de mapeo ARG 95-3 y ARP 96-11 se seleccionaron para selección recombinante con el marcador CT216 SCAR y el marcador 41L o 36L CAPS, respectivamente. En total 85 (9.6 cM) y 22 (12.9 cM) recombinantes se obtuvieron en poblaciones de mapeo ARG 95-3 y A RP 96-11 respectivamente, que se seleccionaron subsecuentemente con el marcador 67L CAPS , reduciendo el número de recombinantes a 5 (0.56 cM) en el intervalo 67L - 36L marcador en el caso de la población de mapeo ARG 95-3 y a 4 recombinantes (2.35 cM) en el intervalo 67L - 41L marcador en el caso de la población de mapeo ARP 96-11 (Figura 8) . Estos 9 recombinantes estantes se analizaron entonces con marcadores 113R, 99L, 133R, 133R2, 123R, 123L, 24R, 14L, 24L, 141R, 69L, E40M58e y 69R SCAR y CAPS. Los últimos dos marcadores se clasificaron sólo en la población de mapeo ARG 95-3. En la población ARG 95-3 dos clones mostraron recombinación entre marcadores E40M58e y 69L, colocando el gen Rpi-blb2 0.23 cM próximo al marcador E40M58e. Dos diferentes clones se recombinaron entre los marcadores 113R y 67L y uno se recombinó entre los marcadores 133R2 y 133R, colocando el gen Rpi-blb2 0.11 cM distal al marcador 133R.

En la población ARP 96-11, sin recombinación se detectó entre los marcadores 41L y 69L, colocando el gen Rpi-blb2 0.58 cM próximo al marcador 36L. Dos clones progenie se recombinaron entre los marcadores 113R y 67L, y un clon se recombinó entre los marcadores 99L y 133R, colocando el gen Rpi-blb2 0.58 cM distal al marcador 99L (Figura 8; Figura 9) .

Ejemplo 9: Evaluación y mapeo genético de resistencia a añublo tardío en una población de mapeo intraespecífica de S. bulbocastanum. Con el fin de desarrollar una población de mapeo intraespecífica de S. bulbocastanum, un clon Blb 2002 resistente se obtuvo a partir de un cruce de ínter acceso (Figura 10) : Este clon se cruzó al mismo tiempo con el clon Blb 48-5 susceptible que se seleccionó también en la progenie a partir de un cruce de inter acceso (Figura 10) . La población resultante se designó B6 con los sinónimos B6a, Blb 99-229, Blb 00-7 y Blb 00-8. Inicialmente un pequeño grupo de 47 plantas progenie de la población B6 se seleccionó para resistencia a P. infestans en un ensayo de follaje desprendido parcialmente repetido utilizando una solución esporangioespora del aislado ??0655-2? de P. infestante como inoculo. Las plantas con hojas que mostraron claramente lesiones de esporulacion 6 a 9 días después de la inoculación se consideró que tenían un fenotipo susceptible mientras que las plantas con hojas que no demostraron síntomas visibles o necrosis en el lado de la inoculación en la ausencia de esporulacion clara se consideró que eran resistentes. De las 47 plántulas, 23 se clasificaron resistentes y 24 susceptibles. Estos datos indicaron que la progenie de la población B6 de mapeo dio clara segregación a un solo gen dominante o un grupo de genes estrechamente enlazados. Con el fin de determinar la posición del cromosoma de este lugar, 46 plántulas se analizaron con marcadores 112L y E48M52e. El marcador 112L se encontró para enlazarse en repulsión con el fenotipo resistente, ya que sólo dos recombinantes se obtuvieron entre este marcador y el fenotipo de las 46 plántulas (4 c ) . También, el marcador E48M52e se encontró para enlazarse en repulsión con el fenotipo resistente. Aquí, cinco recombinantes se obtuvieron entre el marcador E48 52e y el fenotipo (11 cM) . Además, los marcadores 69R, 69L y 141R se utilizaron para análisis de los siete recombinantes entre los marcadores 112L y E40M58e con un grupo adicional de 6, 15 y 14 sin plántulas recombinantes respectivamente, y se encontró que se enlazaron completamente en cualquier acoplamiento (marcador 69R) o fase de repulsión (marcadores 69L y 141R) para resistencia, indicando que el gen de resistencia se ubicó en el mismo lugar, es decir, Rpi-blb2, como en las poblaciones de mapeo derivadas de ???? .

Con el fin de determinar la posición de Rpi-blb2 más precisamente con relación a los marcadores disponibles, otras 849 plántulas de la población de raapeo B6 y 1054 plántulas del cruce recíproco (Figura 10) se cultivaron y se analizaron para recombinación entre los marcadores E46M52e y 112L. De este modo, además de las 47 plántulas adicionales, un total de 1903 clones de descendencia individual de la población B6 se seleccionaron. La recombinación entre los marcadores E48M52e y 112L se detectó en un total de 138 de estas plántulas (7,25 cM) . El mapeo fino del lugar Rpi-blb2 se llevó a cabo en dos etapas. En primer lugar, el grupo de 138 recombinantes se redujo a 19 por selección adicional con marcadores 14Lb, 113R, 123L2, 24L, 141R y 69L (Tabla 3), derivados de las secuencias de borde izquierdo (L) y derecho (R) de clones BAC aislados a partir de la biblioteca RD 1197-16 BAC y la selección subsecuente de todas las plántulas que se recombinaron entre los marcadores 113R y 69L. Posiblemente debido a una doble recombinación, 4 recombinantes dieron patrones para los marcadores clasificados que se desvían desde los resultados esperados en el caso de episodios de una sola recombinación en el intervalo genético estudiado y cuando se asume la co-linearidad de marcadores. Estos se retiraron del análisis adicional. En segundo lugar, los 15 recombinantes restantes se analizaron con marcadores a partir de secuencias de borde de los clones BAC aislados a partir de la biblioteca Blb 2002, SPB39L y SPB30L o con marcadores 24L9spec, 24Lspec y 141L24L MiGA (Tabla 3) . Los resultados de análisis de marcadores de estos 15 recombinantes restantes, que dieron resultados de marcadores claramente interpretables y fenotipos, colocan el lugar Rpi-blb2 entre los marcadores 69L y 24L en un intervalo genético 0.11 cM (n=1899) (Figura 11) - Ejemplo 10: Marcadores MiGA El análisis southern de clones 14, 24, 123 y 133 BAC utilizando marcadores 123R, 14L o 24L como sondas mostraron que estos clones BAC contuvieron varios análogos de genes de resistencia (los RGA) . En vista de la homología eritre las secuencias de los marcadores 14L, 24L y 123R con el gen Mil a partir del tomate, los RGA dentro de la región Rpi-blb2 se refieren más adelante como análogos del gen Mi (los MiGA) . En un intento para desarrollar marcadores polimorficos adicionales dentro del intervalo Rpi-blb2, fragmentos PCR generador a partir de clones 24 y 123 BAC con la combinación cebadora 14LR y 24LF se clonaron en el vector pGEM-T (Promega, the Wetherlands) y se secuenciaron parcialmente. Con base en el alineamiento de estas secuencias parciales, un conjunto de cebadores universales se diseñaron, univl4L y univ24L (Tabla 3) , con el propósito de amplificar la región correspondiente de los MiGA tantas como sea posible dentro del intervalo Rpi-blb2. Este conjunto de cebador universal se utilizó subsecuentemente para desarrollar marcadores SCAR/CAPS específicos de MiGa enlazados a Rpi-blb2 (por ejemplo, marcadores 14L24L, 24Lspec, 24L9spec; Figura 9) .

Ejemplo 11: Mapeo físico del lugar Rpi-blb2 derivado de S. bulbocastanum. El clon Blb2002 resistente heterocigoso para el lugar Rpi-blb2, se utilizó como el ADN de origen para la construcción de la biblioteca BAC de S. bulbocastanum, más adelante referida como la biblioteca Blb 2002 BAC. La preparación de ADN de peso molecular elevado y la construcción de biblioteca BAC se llevaron a cabo como se describe previamente. Un total de aproximadamente 100,000 clones se generaron y almacenaron como 50 grupos bacteriales que contienen aproximadamente 2000 colonias blancas. Estos grupos bacteriales se generaron raspando las colonias a partir de placas de agar en un medio de Caldo Luria que contiene 18% de glicerol y 12.5 ^g/ml de cloranfenicol utilizando un esparcidor de vidrio estéril. Para la selección de la biblioteca Blb 2002 BAC , el ADN plásmido se aisló a partir de cada grupo de clones utilizando el protocolo de lisis alcalina estándar y el PCR se llevó a cabo para identificar grupos positivos. Las bacterias que corresponden a grupos positivos se diluyeron y se formaron en placas en placas de agar de Caldo Luria que contiene cloranfenicol (12.5 9 t?1) . Las colonias blancas individuales se seleccionaron subsecuentemente en placas mitrotituladoras de 384 pozos y los clones BAC positivos sencillos se identificaron subsecuentemente como se describe previamente. Los nombres de los clones BAC aislados a partir de la biblioteca Blb 2002 BAC transportan el BlbSP fijo. Con el fin de construir un mapa cromosomal BAC derivado de Blb 2002 a través del intervalo marcador genético Rpi-blb2 (69L-24L) la biblioteca BAC blb 2002 se seleccionó con marcadores 141R y 24L. Esto condujo al aislamiento de clones BlbSP39 y BlbSP30 BAC, que traslapan entre sí y abarcan el intervalo marcador 141R-24L. Las secuencias de extremo BAC de ambos clones BAC se utilizaron para desarrollar los marcadores SPB30L y SPB39L (Figura 9) .

Ejemplo 12: Análisis de complementacion Para propósitos de complementacion, todos los candidatos genéticos Rpi-blb2, es decir todos los MiGA presentes en clones BlbSP30, BlbSP39, 24, 242 y 211 BAC, se dirigieron para subclonación dentro del vector binario pBINPLUS (van Engelen et al., 1996) . Esto se hizo como sigue. Alícuotas de aproximadamente 1 /xg del ADN BAC se digirieron con 1U, 0.1U o 0.01U de la enzima de restricción Sau3AI durante 30 minutos. El ADN BAC parcialmente digerido se sometió a electroforesis de campo eléctrico homogéneo de perfil sujetado (CHEF) a 4°C en 0.5 X TBE utilizando un tiempo de pulso de incremento lineal de 1-10 segundos y resistencia de campo de 6 V/cm durante 16 horas. Después de la electroforesis, el gel de azarosa se tiñó con bromuro de etidio para ubicar la región de los fragmentos de ADN que contienen gel de aproximadamente 10 kbp en tamaño. Esta región se removió a partir del gel y se trató con GELASE (Epicentre Technologies, USA) de acuerdo al fabricante. El ADN de tamaño seleccionado se ligó al BamHI-digerido y el vector pBINPLUS binario desfosforilado (van Engelen et al., 1995) seguido por la transformación de células competentes DH10B de E. coli ElectroMAX (Life Technologies, UK) . Para cada clon BAC un total de 384 clones se seleccionaron por PCR para la presencia de secuencias MiGA utilizando los cebadores univ24L y univl4L (Tabla 3) . Los clones positivos se seleccionaron para caracterización adicional. Con base en el patrón de restricción de los fragmentos 14L24L digeridos con las enzimas Rsal, Taql , AluI , Dpnll o Msel, los diferentes grupos de los MiGa se identificaron. El iGa que alberga el marcador 24L, el cual se presentó completamente en clones BlbSP39, 211 y 242 BAC no se detectó con los cebadores universales univl4L y univ24L. La posición relativa de las secuencias MiGa en los subclones 10 kbp se determinó por PCR utilizando cebadores 123Mi y 14L2 internos para el extremo 5' y univl4L y 24L2 para el extremo 3' en combinación con los cebadores derivados de las secuencias del vector pBINPLUS (ARO 295 y 296; Tabla 3) . Dos subclones para cada RGA de cada biblioteca BAC se seleccionaron para transformación. Para análisis de complementación, los subclones seleccionados se transfirieron a los cultivos de papa susceptibles Impala y Kondor a través de transformación medida por Agrobacterium utilizando el aislado UIA143 (Farrand et al., 1989) o AGLO (Lazo et al., 1991). Los transformantes primarios que albergan los transgenes de interés se probaron para resistencia a P. infestante en ensayos de follaje desprendido utilizando el aislado IP0655-2A e IPO82001 (Tabla 4) . Sólo las construcciones genéticas que albergan RGC5 , ambas derivadas de S. tuberosum y S. bulbocastanum, fueron capaces de complementar el fenotipo susceptible tanto en cultivo Impala como en Kondor; en total 18 de entre 19 RGC5 que contienen transformantes primarias fueron resistentes (Tabla 4, Figura 12) mientras que todos los genes RGC1, RGG2 , RGC3 , RGC4 , RGC6, RGC7 o RGC8 que contienen las transformantes primarias fueron susceptibles a P. infestants. Ya que las transformantes RGC5 mostraron fenotipos de resistencia similar como el progenitor S . bulbocastanum resistente de la población de mapeo B6, RGC5 se diseñó el gen Rpi-blb2. El RGC24L homólogo puede transferirse también a los cultivos de papa susceptibles y se probaron para resistencia a P. infestants en un ensayo de follaje desprendido . Una selección de transformantes primarios que contienen RGC5 se analizó para número de copias del análisis Southern. El ADN genómico digerido con EcoRI se hibridizó con una sonda nptll (Tabla 3) . Con base en la presencia del número de fragmentos de hibridización nptll, los transformantes primarios contenían al menos 1 a 11 insertos de transgen. En total, se observaron 4 integraciones de copias sencillas en cultivos Impala y 6 cultivos Kondor de los cuales un transformante de cultivo Kondor pareció tener un fenotipo susceptible a P. infestants. Para investigar si Rpí-blb2 puede ser también complemento al fenotipo susceptible en el tomate, las transformantes primarias del cultivo de Moneymaker que alberga la construcción del gen Rpi-blb2 se produjeron y probaron con aislados IPO82001 e IP0655-2A derivados de papa. El ensayo de resistencia a la enfermedad reveló que RGC5 es también capaz de complementar un fenotipo de tomate susceptible (Tabla 6) .

Ejemplo 13: Estructura del gen Rpi-blb2 y secuencia de aminoácido putativa Los insertos de los clones binarios 211F/C12 y SP39-20 que contienen RGC5 se secuenciaron por una estrategia de transito de cebador por lo que ciclos consecutivos de secuenciación se llevaron a cabo utilizando un conjunto de cebadores anidados los cuales se diseñaron cuando la secuencia continua se extendió. El primer conjunto de secuencias se generó utilizando los cebadores M13F y M13R. Las secuencias completas de los insertos de los clones 211F/C12 y SP39-20 consistieron de 7967 y 9949 nucleótidos (nt) , respectivamente (Figura 13) . La secuencia del clon 211F/C12 fue idéntica a la secuencia correspondiente dentro del clon SP39-20. La posición y la estructura putativa de Rpi-blb2 se predijo utilizando GEN-SC7A (Burge and Karlin, 1997) , GeneMark (Lukashin and Borodvsky 1998) y a través del alineamiento a las secuencias genéticas de Mil.l y Mil.2. La longitud exacta y la estructura de la secuencia de codificación se determinaron a través de la amplificación rápida 5' y 3' de los extremos de ADNc (RACE) utilizando el equipo GeneRacer™ (Invitrogen™, Groningen, the Netherlands) . RACE identificó fragmentos de ADNc específico de Rpi-blb2 5' y 3' que comprenden regiones no traducidas 5' y 3' (UTRs) de 767 y 201 nucleótidos (nt) , respectivamente. El gen Rpi-blb2 contiene dos intrones . El intrón 1 es 626 nt de largo y se coloca dentro de los 32 nucleótidos de extremo 5' UTR corriente arriba del codón de inicio ATG. El intrón 2 es 88 nt de largo iniciando con 43 nucleótidos corriente abajo del codón de inicio ATG del gen. La secuencia de codificación de la transcripción rpi-blb2 es 3804 nucleótidos . El marco de lectura abierto deducido del gen Rpi-blb2 codifica un polipéptido previsto de 1267 aminoácidos con un peso molecular estimado de 148 kD (Figura 14) . Varios motivos funcionales presentes en los genes R de la clase NBS-LRR de genes de plantas R son aparentes en la proteína codificada. Como se ilustra en la Figura 14, la proteína Rpi-blb2 pertenece al subconjunto de cierre de leucina (LZ) de las proteínas de resistencia NBS-LRR. La mitad N-terminal de la proteína Rpi-blb2 contiene una región LZ potencial entre los aminoácidos 413 y 434 y seis motivos conservados indicativos del sitio de unión de nucleótido (van der Biezen and Jones, 1998) . La mitad C-terminal de Rpi-blb comprende una serie de 15 LRR irregulares que pueden alinearse de acuerdo con la secuencia consenso hxxhxxLxxLxLxxC/N/Sx (x) LxxLPxx observada en otras proteínas R citoplásmicas , por lo que h puede ser L, I, M, V o F y x cualquier residuo aminoácido (Jones and Jones, 1997) .

Ejemplo 14: Homología al estado conocido de las secuencias del gen R de la técnica. Para identificar el gen Rpi-blb2 en homólogos de sílice, las investigaciones BLAST (Altschul et al., 1990) se llevaron a cabo con la secuencia de codificación del gen Rpi-blb2. Las investigaciones BLASTN identificaron un número de secuencias con homología significativa al gen Rpi-blb2. Al utilizar el programa de alineamiento ClustalW (disposiciones estándares) en el paquete de software DNAStar, se determinó que la secuencia de codificación Rpi-blb2 comparte la homología más elevada a Mi-1.1 (89.8%) y Mi-1.2 (89.7%) (números de acceso Genbank AF039681 y AF039682, respectivamente) . La última secuencia corresponde al gen Mi de tomate que. confiere resistencia a tres de las especies más dañinas de los nemátodos de nudosidad de la raíz (Meloidogyne spp.) (Milligan et al., 1998). Además, los nucleótidos 2410-3461 de la secuencia de codificación Rpi-blb2 comparten 87.8% de homología de secuencia a una secuencia NBS-LRR parcial a partir de Solanum nigrum (número de acceso Genbank ??055116.1) . En el nivel del aminoácido, la secuencia de proteína Rpi-blb2 putativa comparte la homología más elevada a Mi-1.1 (82% de identidad) y Mi-1.2 (81% de identidad) (Números de acceso Genbank AF039681 y AF039682) . A través del alineamiento ClustalW de la secuencia de aminoácidos deducidas de Rpi-blb2, Mi-1.1 y Mi-1.2 se han identificados 200 residuos de aminoácidos (aa) que son únicos para Rpi-blb2 (Figura 15) . De estos, 31 se encuentran en las posiciones hipervariables , es decir, el residuo en esta posición es diferente en todas las tres secuencias y 11 se codifican por inserciones pequeñas (una inserción del residuo 3aa y una inserción del residuo 8 aa) . El resto son Rpi-blb2 específicos en donde los residuos aa se encuentran en las posiciones correspondientes en Mi-1.1 y M-1.2 son diferentes del residuo Rpi-blb2 pero se conservan en las dos secuencias de proteína Mi (Figura 15) . De manera interesante, el motivo VLDL que se conserva en el tercer LRR de muchas proteínas NBS-LRR incluyendo Mi (Axtell et al., 2001; Banerjee et al., 2001) no se conserva en Rpi-blb2 (Figura 15) .

Ejemplo 15: Extracción de alelo Rpi-blb2 en especies de solanáceas silvestres. Se utilizan los cebadores ARFIF y ARFIR (Tabla 3B) , diseñados alrededor del codón de inicio y de detención del gen Rpi-blb2, es posible amplificar por PCR, alelos de Rpi-blb2 a partir de la especie de solanácea. Los productos de amplificación pueden clonarse entre secuencias reguladoras transcripcionales en un plásmido binario y transferidos a S. tuberosum a través de Agrobacterium mediados por transformación o cualquier método conocido por aquellos expertos en la técnica. Las transformantes primarias resultantes pueden analizarse subsecuentemente para resistencia a P. infestans o a cualquier patógeno para lo cual la papa es una planta huésped.

Ejemplo 16: Material y Métodos El material de planta y el desarrollo de poblaciones de mapeo en (1) Solanura tuberosum. Los clones híbridos interspecífieos complejos, designados ABPT, se hicieron por Hermsen y colaboradores (Hermsen, 1966; Hermsen and Ramanna, 1969; Ramanna and Hermsen, 1971; Hermsen and Ramanna, 1973; Hermsen, 1983; Hermsen, 1994) (Figura la). La etapa de duplicación de cromosoma con colcicinas se describió por Hermsen (1966) y Hermsen and De Boer (1971) . La resistencia en algunos de los clones ABPT a P. infestans se cree que se deriva de cualquiera o ambas de los acceso a partir de S. bulbocastanum BGRC 8007 (CGN 21306; Pi 275196) y BGRC 8008 (CGN 17693; Pi 275198) que se utilizaron en el cruce inicial para producir híbridos entre S. acaule y S. bulbocastanum, ya que todos los otros progenitores que se utilizaron en el esquema de reproducción para clones ABPT fueron susceptibles o sólo parcialmente resistentes a P. infestans en ensayos de follaje desprendido (Hermsen and Ramanna, 1973) . Los tubérculos a partir de 19 clones de población [ (número de clon 55 ABPT x cultivo (cv) Oberarnbacher Frühe) x cv Arkula] , de 7 clones de población [ (número de clon ABPT 55 x cv Oberarnbacher Frühe) x cv Blanka] y desde 5 clones de población [ (número de clon ABPT 60 x cv Alcmaria) x cv Blanka] se recibieron en 1988 a partir del Departamento de Reproducción de Plantas formadoras de la Universidad de Agricultura de Wageningen (Wageningen, the Netherlands) . Los clones ARF 87507, ARF 87-801 y ARF 87-601 se seleccionaron a partir de estas poblaciones respectivamente. Estos representan la descendencia de una segunda hibridización (BC2) con los clones ABPE inter-específicos complejos y se utilizaron para hibridización adicional que resulta en una población BC3 de tetraploide, dos poblaciones BC4 de tetraploide y una población BC4 diploide que se utilizaron para mapeo genético del gen Rpi-blb2 (Figura 1) . La población de mapeo de Solanum tuberosum tetraploide ARG 95-15 se produjo cruzando el clon ARF 87-507 resistente a P. infestants con el cultivo susceptible Alkon. La población ARG 95-3 tetraploide se produjo cruzando el clon AR 91-1263 de resistencia a P. infestants con el cultivo susceptible Cosmos. La población ARP 96-11 de tetraploide se produjo cruzando el clon AR 92-1292 de resistencia con el cultivo susceptible Celeste. La población DPI diploide se obtuvo cruzando el clon ARD 1197-16 resistente con el clon ARD 93-2090 susceptible (Figura 1) .

Material de planta, y desarrollo de poblaciones de mapeo en (2) Solanum bulbocastanum. La población de mapeo de S. bulbocastanum diploide, designada B6 (sinónimo B6a, Blb 99-229, Blb 00-7 y Blb 00-8), se desarrolló cruzando un clon Blb 2002 resistente a P. infestants (sinónimo M94-81-C) con un clon Blb 48-5 susceptible. Los resultados a partir de los cruces recíprocos de población B6 se combinaron. El clon parental resistente de población B6 se obtuvo a partir del cruce entre el clon Blb 93-D26-3 de S. bulbocastanum (acceso BGRC 8002; CGN 17690; Pi 275187) como progenitor hembra y clon Blb 93-60-10 de S. bulbocastanum (acceso BGRC 8006; Pi 275194) como progenitor macho. El clon progenitor susceptible de la población B6 se obtuvo a partir de un cruce entre los clones S. bulbocastanum a partir de los accesos BGRC 8005 (CGN 17692, PI 275193) y BGRC 8006 (Figura 2) .

Ensayos de enfermedad; (1) aislados de Phytophthora infestants Tres diferentes aislados de P. infestants se obtuvieron a partir de Plant Research International B.V. (Wageningen, the Netherlands) . Los aislados tuvieron diferentes estructuras de especie y tipos de acoplamientos como sigue: IPO82001: estructura de especie 1.2.3.4.5.7.10.11, tipo de acoplamiento A2 ; IP0655-2A: estructura de especie 1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11, tipo de acoplamiento ?1 ; IP0428-2: estructura de especie 1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11, tipo de acoplamiento A2 (Flier et al . , 2003) .

Ensayos de enfermedades: (2) Pruebas de campo Los tubérculos de plántulas crecidas en invernadero o las papas de semillas crecidas en el campo se plantaron como sitios de ensayos en Marknesse, the Netherlands de 1985 al 2002, en el área de Toluca en México, en 1991 o en un sitio en la Provincia Benguet en las Filipinas en 1992. Para clones individuales, las gráficas se plantaron consistiendo de 1 a 10 tubérculos. Aproximadamente 8 semanas después del plantado, el campo a Marknesse se inoculó con una solución de esporangióspora del aislado P. infestante IPO82001 y los resultados de las enfermedades se recolectaron 3 a 6 semanas después de la inoculación. Los clones que fueron libres o casi libres de añublo tardío se clasificaron como teniendo un fenotipo resistente mientras que los clones con un follaje arruinado completo o casi completo se clasificaron con susceptibles . Los clones con reacciones intermediarias a añublo tardío se clasificaron como teniendo un fenotipo desconocido. En las pruebas de campo en México y las Filipinas, la infección natural había ocurrido. Una vez que esta infección natural por P. infestants establecida, el porcentaje de follaje arruinado en cada gráfica se clasificó en 8 y 6 días respectivamente en una escala de 1-9 se estimaron porcentajes de follaje arruinado a partir de 1 a 9 fueron: 0, 3, 10, 25, 50, 75, 90, 97 y 100 (Estrada-Ramos et al. 1983) .

Ensayos de enfermedades; (3) hojas desprendidas Para el ensayo de follaje desprendido, las hojas a partir de plantas crecidas durante 6 a 12 semanas en el invernadero se colocaron en piezas de espuma para flores saturadas con agua, aproximadamente 35x4x4 cm, y se colocan en bandejas (40 cm de ancho, 60 cm de longitud y 6 cm de altura) con un botón perforado. Cada hoja se inoculó con dos gotas (25 µ.1 cada una) de solución de esporangióspora en el lado abaxial . Subsecuentemente, la bandeja se colocó en una bolsa de plástico en la parte superior de una bandeja, en donde un papel filtro saturado con agua se colocó, e incubó en un clima ambiente a 17°C y un fotoperiodo de 16 horas/8 horas de día/noche con luz fluorescente (Philips TLD50W/84HF y OSRAM L58W/21-840) . Después de 6 a 9 días, las hojas se evaluaron para el desarrollo de síntomas de enfermedad P. infestante .

Evaluación : Las plantas con hojas que mostraron claramente lesiones de esporulacion 6 a 9 días después de la inoculación se consideró que tienen un fenotipo susceptible, mientras que las plantas con hojas que no muestran síntomas visibles o necrosis en el lado de la inoculación en la ausencia de esporulacion clara se consideró que son resistentes.

Selección del marcador de ADN de la planta El ADN genómico se extrajo a partir de hojas jóvenes de acuerdo a Bendahmane et al. (1997) . Para el análisis de PCR, se prepararon mezclas de reacción de 15 µ? conteniendo 0.5 µg de ADN, 15 ng de cada cebador, 0.2 mM de cada dNTP, 0.6 unidades de Taq-polimerasa (15 U/µ?, SphaeroQ, Leiden, the Netherlands) , 10 mM de Tris-HCl pH 9, 1.5 mM de MgCl2, 50 mM de KCl , 0.1% de Tritón X-100 y 0.01% de gelatina (p/v) . Los PCR se realizaron utilizando el siguiente perfil de ciclo: 25 segundos de desnaturalización de ADN a 94°C, 30 segundos de recocido y 40 segundos de alargamiento a 72 °C. En una primera etapa en el ADN de amplificación PCR se desnaturalizó durante 5 minutos a 9 °C y se finalizó por una etapa de alargamiento extra de 5 minutos a 72 °C. Las reacciones de amplificación se realizaron en un T-Gradiente Biometra® o un termociclador Bíometra® Uno-II ( estburg, Leusden, the Netherlands) . Dependiendo del marcador, el producto PCR se digirió con una enzima de restricción apropiada. Una visión general de los marcadores incluyendo secuencias cebadoras, temperatura de recocido y las enzimas de restricción si es apropiado, se da en la Tabla 3. Subsecuentemente, los productos de PCR (desdoblado) se analizaron por electroforesis en azarosa en geles de acrilamida. Para el análisis de gel de acrilamida, el Equipo de Análisis de ADN CleanGel y El Equipo de Tinción Silves ADN (Amersham Pharmacia Biotech Benelux, oosendaal, the Netherlands) se utilizaron.

Alargamiento de fragmentos AFLP por (TAIL) -PCR entrecruzado asimétrico Térmico El alargamiento de la secuencia de un fragmento AFLP se realizó por TAIL-PCR de acuerdo a Liu y Whittier (1995) . En breve, el alargamiento de fragmentos APLP se realizaron utilizando 2 ó 3 cebadores específicos anidados (sp) en combinación con un cebador degenerado arbitrario (AD) . El primer PCR se realizó con cebadores spl y AD, el segundo con sp2 y AD y el tercero con sp3 y AD de acuerdo al esquema descrito en la Tabla 5. El PCR se realizó en reacciones de 25 µ? que contiene la mezcla de PCR estándar como se describe anteriormente, excepto que 30 ng del cebador AD se utilizó. Los fragmentos alagados se clonaron en pGEM-T (Promega, the Netherlands) y se secuenciaron.

Construcción y Selección de la biblioteca BAC El clon ARD 1197-16 resistente, el heterocigoso para el lugar Rpi-blb2 se util zó como el ADN de origen para la construcción de la biblioteca BAC de S. tuberosum. El clon Blb 2002 resistente heterocigoso para el lugar Rpi-blb2, se utilizó como un ADN de origen para la construcción de la biblioteca BAC de S. bulbocastanum . La preparación del ADN de peso molecular elevado y la construcción de la biblioteca BAC se llevaron a cabo como se describe en Rouppe van der Voort et al. (1999). Para la biblioteca BAC S. tuberosum, aproximadamente 120,000 clones con un tamaño de inserto promedio de 100 kb, que corresponde de 8 a 10 equivalentes de genoma se obtuvieron finalmente. Un total de aproximadamente 70,000 clones se almacenaron individualmente en 177 placas de microtítulo de 334 pozos a -80°C. Otros 50,000 clones se almacenaron como 14 grupos bacteriales que contienen aproximadamente 4000 colonias blancas. Éstas se generaron raspando las colonias a partir de placas de agar en un medio de Caldo Luria que contiene 18% de glicerol y 12.5 µ9/?t?1 de cloranfenicol utilizando un esparcidor de vidrio estéril. Éstos super grupos así llamados se almacenaron también a -80°C. Finalmente, otros 37,000 clones se agregaron a la-biblioteca de BAC S. tuberosum. La biblioteca BAC de S. bulbocastanum consistió de 48 super grupos de aproximadamente 2,000 colonias. La selección de marcadores de la biblioteca de BAC que alberga los clones BAC individualmente almacenados se llevó a cabo como se describe en Rouppe van der Voort et al . (1999) . Para la selección de la biblioteca BAC almacenada como super grupos, el ADN plásmido se aisló a partir de cada grupo de clones utilizando el protocolo de lisis alcalina estándar y el PCR se llevó a cabo para identificar grupos positivos . Las bacterias que corresponden a grupos positivos se diluyeron y formaron en placas en placas de agar de Caldo Luria conteniendo cloranfenicol (12.5 ¿g/ml) . Las colonias blancas individuales se eligieron subsecuentemente en placas microtituladoras de 384 pozos y clones BAC positivos sencillos identificados subsecuentemente como se describe anteriormente. Los nombres de los clones BAC aislados a partir de los super grupos transportan el prefijo SP (por e emplo, SP39) .

Subclonacion de genes candidatos Los RGA candidatos se subclonaron a partir del clon 24 BAC, 211, 242, BLBSP39 y BLBSP30 como sigue. Las alícuotas de aproximadamente 1 µg de ADM BAC se digirieron con 1U, 0.1U o 0.01U de la enzima de restricción Sau3AI durante 30 minutos. El ADN BAC parcialmente desdoblado se sometió a electroforesis CHEF a 4°C en 0.5 X TBE utilizando un tiempo de pulso incrementado de 1-10 segundos y una resistencia de campo de 6 V/cm durante 16 horas. Después de electroforesis , el gel de azarosa se tiñó con bromuro de etidio para ubicar la región de los fragmentos ADN que contiene gel de aproximadamente 10 kbp en tamaño. Esta región se extirpó a partir del gel y se trató con GELASE (Epicentre Technologies, USA) de acuerdo al fabricante . El tamaño del ADN seleccionado se ligó al vector pBINPLUS binario desfosforilado y desdoblado a BamHI (van Engelen et al., 1995) seguido por la transformación a células competentes ElectroMAX E. coli DH10B (Life Technologies, UK) . Un total de 192 clones fueron PCR seleccionado para la presencia de secuencias RGC utilizando los cebadores del marcador 24L14L (Tabla 3) . Los clones positivos se seleccionaron para caracterización adicional. La identificación de clones que albergan RGC1, RGC2 , RGC3 , RGC4 , RGC5, RGC6 , RGC7 , RGC8 y RGC24L se llevó a cabo secuenciando fragmentos PCR 14L24L derivados de clones positivos. La posición relativa de los RGA dentro de un subclon se determinó por análisis de PCR utilizando los cebadores internos (24L2, 123MÍ) en combinación con cebadores específicos pBIN-PLUS (Tabla 3) .

Transformación mediada por Agrobacterium tuiiiefacíens de la papa Los plásmidos binarios que albergan los genes candidatos se transformaron a cepas de A. tumefaciens AGLO (Lazo et al., 1991) o UIA143 (Farrand et al., 1989), la última conteniendo el plásmido auxiliador pCH32 (Hamilton et al., 1996) . Los cultivos durante la noche de las cepas de A. tumefaciens transformadas se utilizaron para transformar discos de tubérculos de papa (cvs Impala y Kondor) de acuerdo a los protocolos estándares (Hoekema et al., 1989; Fillati et al., 1987). En breve, las papas de semillas certificadas de cultivos Impala y Kondor se pelaron y se esterilizó la superficie durante 30 minutos en una solución de hipoclorito de sodio al 1% conteniendo 0.1% de Tween-20. Los tubérculos se lavaron entonces completamente en volúmenes grandes de agua destilada estéril (4 veces, 10 minutos) . Los discos de aproximadamente 2 mm de espesor y 7 mm de diámetro se cortaron a partir de cilindros de tejido de tubérculos preparados con un corkbore . Los discos de tubérculos se transfirieron dentro del medio MS30 líquido conteniendo A. tumefaciens y se incubaron durante 15 minutos. Después de la remoción la solución de A. tumefaciens, los discos de tubérculos se transfirieron a un medio de regeneración conteniendo MS30, 0.9 mg/lAA, 3.6 ml/1 de zeatina ribosida y 8 g/1 de agar (Hoekema et al., 1989) . Las placas se incubaron a 24°C, un periodo de 16 horas al día (Philips TLD50W/84HF) . Después de 48 horas de co-cultivo, los discos de tubérculos se enjuagaron durante 5 minutos en un medio MS líquido incluyendo antibióticos, 200 mg/1 de vancomicina, 250 mg/1 de cefotaxima y 75 mg/1 de canamicina, y se transfieren a un medio de regeneración suplementado con los mismos antibióticos. Las placas se incubaron a 24°C, un periodo en el día de 16 horas (Philips TLD50W/84HF) . Cada tres semanas, los discos de tubérculos se transfirieron a un medio fresco. Los brotes de regeneración se transfirieron a un medio MS30 conteniendo 75 mg/1 de canamicina. Los brotes de plantas se propagaron in vitro y se probaron para ausencia de células A. tumefaciens incubando una pieza del tallo en 3 mi de un medio de Caldo Luria (3 semanas, 37°C, 400 rpm) . Una planta de cada regenerante transformado se transfirió al invernadero .

Transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens del tomate Se enjuagaron semillas de la linea de tomate Moneymaker susceptible en 70% de etanol para disolver la semilla recubierta y se lavaron con agua estéril . Subsecuentemente, las semillas se esterilizaron en una superficie en 1.5% de hipoclorito de sodio durante 15 minutos, se enjugaron tres veces en agua estéril y se colocaron en recipientes conteniendo 140 mi de medio MS de pH 6.0 (Murashige y Skoog, 1962) suplementado con 10 g/1 de sacarosa ( S10) y 160 mi de vermiculita. Las semillas se dejaron germinar durante 8 días a 25°C y 0.5 /M2 de luz. Se pre-cultivaron explantas cotiledóneas de ocho días durante 24 horas en platos petri conteniendo una capa alimentadora de dos semanas de células de suspensión de tabaco en placas en un medio de co-cultivo (MS30 pH 5.8 suplementado con vitaminas Nitsch (Duchefa Biochemie BV, Haarlem, the Netherlands) , 0.5 g/1 de tampón MES y 8 g/1 de agar Daichin) . Los cultivos durante la noche de A. tumefaciens se centrifugaron .y el gránulo se volvió a suspender en un medio de suspensión celular (MS30 pH 5.8 suplementado con vitaminas Nitsch, 0.5 g/1 de tampón MES, pH 5.8) conteniendo 200 µ? de acetosiringona a un O.DSoo final de 0.25. Las explantas se infectaron entonces con el cultivo diluido durante la noche de A. tumefaciens UIA143 conteniendo pBINRGC5 durante 25 minutos, teñido en seco en papel filtro estéril y se co-cultivo durante 48 horas en las placas de capa alimentadora original . Las condiciones de cultivo fueron como se describe anteriormente. Después de la co-cultivación, las explantas cotiledóneas se transfirieron a platos Petri con un medio de inducción de brote selectivo (MS pH 5.8, suplementado con 10 g/1 de glucosa, incluyendo vitaminas Nitsch, 0.5 g/ml de tampón MES, 5 g/1 de agar-gel, 2 mg/1 de zeatina ribosida, 400 mg/1 de carbenicilina, 100 mg/1 de canamicina, 0.1 mg/1 de XAA) y se cultivó a 25°C con 3-5 W/m2 de luz. Las explantas se subcultivaron cada 3 semanas sobre un medio fresco. Los brotes emergentes se disecaron a partir de los callos subyacentes y se transfirieron a recipientes con un medio de inducción de raíz selectiva (MS10 pH 5.8 suplementado con vitaminas Nitsch, 0.5 g/1 de tampón MES, 5 g/1 de agar-gel, 0.25 mg/1 de IBA, 200 mg/1 de carbenicilina y 100 mg/1 de canamicina) .

Extracción de ARN El ARN total se aisló utilizando Trizol® de acuerdo al protocolo suminitrado por el fabricante (Invitrogen™, Groningen, the Netherlands) con modificaciones menores. En breve, 0.5 g de tejido de hojas jóvenes se molieron en nitrógeno líquido y el polvo se suspendió en 5 mi de Trizol®. Después de una incubación de 5 minutos a temperatura ambiente (RT) , 0.5 mi de cloroformo se agregó, la suspensión se llevó a vortex y se incubaron durante 2 minutos . Después de la centrifugación (15 minutos, 11404 x g, 4°C) el sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo y 2.5 mi de isopropanol se agregó. Después de 10 minutos a temperatura ambiente, los ácidos nucleicos se precipitaron (10 minutos, 11404 x g 4°C) . El gránulo se lavó con 5 mi de 70% de etanol (5 minutos, a temperatura ambiente) y después de la centrifugación (5 minutos, 6415 x g, 4°C), el gránulo se secó y se volvió a suspender en 100 µ.1 de agua destilada estéril. Se extrajo polyA + ARN a partir del ARN total utilizando el equipo midi de ARNm Oligotex™ (Qiagen, GMBH, Germany) .

Amplificación rápida de los extremos de ADNc Los extremos 5' y 3' del ADNc Rpi-blb2 y la confirmación de posiciones intron putativos se determinó por amplificación rápida de los extremos de ADNc (RACE) utilizando el equipo GeneRacer™ (Invitrogen™, Groningen, the Netherlands) . Se llevó a cabo 5' RACE en ADNc sintetizado con el cebador GSP4 (ARO 772) . Subsecuentemente, el cebador GSP6 (ARO 774) se utilizó en combinación con el cebador GeneRacer™ 5' y la amplificación final se llevó a cabo con GSP6 en combinación con el cebador anidado GeneRacer™ 5' . Se llevó a cabo 3' RACE con los cebadores anidados (ARO 769) y GSP2 (ARO 770) en combinación con el cebador GeneRacer 3'. La amplificación final se llevó a cabo con GSP3 (ARO 771) en combinación con el cebador 3' anidado GeneRacer. Ambas etapas de amplificación 3' y 5' RACE se llevaron a cabo utilizando Accuprime (Invitrogen™, Groningen, the Netherlands) en lugar de la polimerasa Taq suministrada por el equipo GeneRacer™.

Toma de impresiones digitales y clonación AFLP de fragmentos AFLP La preparación de la plantilla y la toma de impresiones digitales AFLP se realizaron esencialmente como se describe en Vos et al. (1995) . Con el fin de clonar fragmentos específicos, los fragmentos AFLP etiquetados 33P se extirparon fuera del gel de acrilamida traslapando los geles de poliacrilamida, se secaron en papel Whatmann 3MM, con imágenes de autoradiograma . Las piezas de gel/papel por debajo de la banda de interés, se cortaron y se transfirieron a 200 µ? de TE y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Cinco microfiltros de sobrenadante se utilizaron para volver a amplificar el fragmento, utilizando un PCR en donde el EcoRI+0 en combinación con Msel+O se utilizaron como cebadores. El fragmento AFLP re-amplificado se clonó subsecuentemente en el vector de clonación pGEM-T (Promega, the Netherlands) y los insertos de varios clones se secuenciaro . La secuencia de ADN de la banda de AFLP extirpada se utilizó para diseñar cebadores específicos de lugar. El producto de amplificación obtenido con tales cebadores se seleccionó para polimorfismos internos con enzimas de restricción. Después de la restricción, los fragmentos se separaron en un gel de agarosa 2-3% incluyendo bromuro de etildio .

Análisis de RGA-AFT.P La preparación de plantilla se realizó esencialmente como se describe en Vos et al. (1995) . Sin embargo, la segunda etapa de amplificación se llevó a cabo con el cebador basado en bucle P SI a partir de Leister et al. (1996) en combinación con cebador EcoRI+0 AFLP. Una mezcla de reacción 10 µ? [0.5 µ? cebador SI etiquetado 33P (10 ng/µ?) ; 0.5µ1 de cebador EcoRl+0 (10 ng/µ?) ; 0.8 µ? de dNTPs (5 mM) ; 2 µ? de tampón PCR lOxGoldstar™ (Eurogenetc, Belgium) ; 1.2 µ? de MgCl2 (25 mM) ; 0.06 µ? de ADN polimerasa Goldsta (5?/µ1) (Eurogentec, Belgium) ; 14.94 µ? de agua Q] se agregó a 10 µ? de plantilla diluida (20 x diluido en agua MQ) y una reacción de PCR realizada utilizando el siguiente perfil de ciclo: 45 segundos de desnaturalización de ADN a 94°C, 45 segundos de recocido de cebador a 49°C y 2 minutos de etapa de alargamiento a 72 °C (35 ciclos) . Antes del ciclo del ADN de plantilla se desnaturalizó durante 2 minutos a 94°C y el PCR se finalizó aplicando una etapa de alargamiento de 5 minutos a 72 °C. Las reacciones de amplificación se realizaron en un termociclador Perkin Elmer 9600. Los fragmentos de productos de PCR etiquetadas se separaron en un gel de poliacrilamida al 6% y las bandas individuales visualizadas por autoradiografía de acuerdo a procedimientos estándares .

Ejemplo 17: Fenotipo de expresión Rpi-blb2 Material y Métodos Cuatro lesiones (6 días después de la inoculación a condiciones estándares) de ho illas infectadas (IPO82001) se enjugaron en 3 mi de H20. La concentración se determinó utilizando un haemocitómetro Fuchs-Rosenthal (W. Schreck Hofheim/Ts. ) Definición: El índice de esporulación es la cantidad de esporangio por mi detectado en lesiones de hoj illas infectadas . Tabla 7. El índice de esporulación de diferentes genotipos después de la infección con P. infestasits en un ensayo de hojas desprendidas.

Genotipo índice de esporulación esporangio/ml cv. Bintje 1.840.000 ARD 92-1197-156 20.000 R2-diferencial 0 La diferencia entre Rpi-blb2 y otros genes de resistencia P. infestante es que Rpi-blb2 permite un bajo nivel de esporulación (Figura 18) . Esto se demuestra por un ensayo de follaje desprendido en donde las lesiones presentes en genotipo Rpi-blb2 (ARD 92-1197-16) muestran un nivel bajo de esporangio en relación a la ausencia completa de esporangio en un genotipo que contiene el gen R2 S. demissum. Sin embargo, el índice de esporulación es sólo 1.1% de un fenotipo susceptible (cv. Bintje) (Tabla 7 y la Figura 18. Experimentos de campo han demostrado también que Rpi-blb2 permite un bajo nivel de infección. Los síntomas de añublo tardío se desarrollaron en un nivel bajo durante la estación de crecimiento (Figura 3, ARF87-81) o en final de la estación de crecimiento (Figura 2, ARF87-601,- Figura 3, ARF87-507 y ARF87-601) .

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Claims (43)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para generar o incrementar la resistencia de una planta a un patógeno de la planta de la phylum Oomiyceta que comprende incrementar la actividad de la proteína Rpí-blb2 en la planta o un tejido, un órgano o una célula de una planta o una parte de la misma. 2. El método de la reivindicación 1, en donde la proteína Rpi-blb2 se codifica por un polinucleótido que comprende una molécula de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo que consiste de: (a) una molécula de ácido nucleico que codifica al menos la forma madura del polipéptido descrito en la SEC. DE IDENT NO . : 2 ó 4 ; (b) una molécula de ácido nucleico que comprende la - secuencia de codificación como se describe en la SEC. DE
2. IDENT NO. : 1 ó 3 ó 5 ó 6 que codifican al menos la forma madura del polipéptido; (c) moléculas 'de ácido nucleico, la secuencia del nucleótido de la cual se degenera como resultado del código genético a una secuencia de nucleótido de (a) o (b) ; (d) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido derivado a partir del polipéptido codificado por un polinucleótido del (a) a (c) a modo de sustitución, eliminación y/o adición de uno o varios aminoácidos de la secuencia de aminoácido del polipéptido codificado por un polinucleótido de (a) a (c) ; (e) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido, la secuencia de la cual tiene una identidad de 70% o más a la secuencia de aminoácido del polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de (a) o (b) ; (f) una molécula de ácido nucleico que comprende un fragmento o una porción que soporta un epítope de un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de cualquiera de (a) a (e) ; (g) una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de una molécula de ácido nucleico amplificada a partir de una biblioteca de ácido nucleico utilizando un cebador como se lista en la Tabla 3b; (h) una molécula de ácido nucleico que codifica un fragmento que empieza con el aminoácido: 1, 30, 50, 100, 200, 300, 500 ó 1000 y se detiene con el aminoácido 1276, 1000, 500, 300, 200, 50 ó 1 de un polipéptido codificado por cualquiera de (a) a (g) ; (i) una molécula de ácido nucleico que comprende al menos 20 nucleótidos de un polinucleótido de cualquiera de (a) o (d) ; (j) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que se reconoce por un anticuerpo monoclonal que se ha incrementado contra un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de cualquiera de (a) a (h) ; (k) una molécula de ácido nucleico obtenible al seleccionar una biblioteca apropiada bajo condiciones severas con una sonda que tiene la secuencia de la molécula de ácido nucleico de cualquiera de (a) a ( ) o de un fragmento de la misma de al menos 20; y (1) una molécula de ácido nucleico, la hebra complementaria de la cual hibridiza bajo condiciones severas con una molécula de ácido nucleico en cualquiera de (a) a (k) ; o la hebra complementaria de cualquiera de (a) a (1) ; o expresa un polipéptido codificado por un segmento del cromosoma o un grupo 6 de conexión de Solanum bulbocastanum o Solanum tuberosum, la cual se co-segrega con un marcador seleccionado a partir de la Tabla 3a o 3b y el cual media resistencia a un patógeno del phylum Oomyceta y por lo que el polinucleótido no tiene la secuencia de Mil.l o Mil .2 como se describe en la SEC. DE IDENT NO . : 7 Ó 9.
3. 3. El método de la reivindicación 1 ó 2, en donde la actividad de una proteina de resistencia adicional se incrementa .
4. 4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 , en donde la actividad se incrementa debido a una expresión de novo.
5. 5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la actividad endógena de una Rpi-blb2 y/o la proteína de resistencia adicional se incrementa.
6. 6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende una o más de las siguientes etapas (a) estabilizar la proteína de resistencia; (b) estabilizar la proteína de resistencia que codifica ARNm; (c) incrementar la actividad específica de la protelna de resistencia; (d) expresar o incrementar la expresión de un factor de transcripción homólogo o artificial para la expresión de proteína de resistencia; (e) estimular la actividad de proteína de resistencia a través de los factores de inducción de exógeno; (f) expresar el gen de codificación de proteína de resistencia transgénica; y/o (g) incrementar el número de copias del gen de codificación de proteínas de resistencia.
7. 7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el cual resulta en la reducción en el índice de esporulación de al menos 30% después de la infección con P. infestans comparada a un tipo silvestre.
8. 8. Un polinucleótído que codifica una proteína de Rpi-blb2 que comprende una molécula de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo que consiste de: (a) una molécula de ácido nucleico que codifica al menos la forma madura del polipéptido descrito en la SEC. DE IDENT NO . : 2 Ó 4 ; (b) moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de codificación como se describe en la SEC. DE IDENT NO. : 1 ó 3, ó 5 ó 6 que codifica al menos la forma madura del polipéptido; (c) una molécula de ácido nucleico, la secuencia de nucleótido la cual se degenera como un resultado del código genético a una secuencia de nucleótido de (a) o (b) ; (d) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido derivado a partir de un polipéptido codificado por un polinucleótido de (a) a (c) a modo de sustitución, eliminación y/o adición de uno a varios aminoácidos de la secuencia de aminoácido del polipéptido codificado por un polinucleótido de (a) a (c) ,· (e) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido, la secuencia de la cual tiene una identidad del 70% o más de la secuencia de aminoácido del polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de (a) o (b) ; (f) moléculas de ácido nucleico que comprenden un fragmento o una porción que soporta un epítope de un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico por cualquiera de (a) a (e) ; (g) una molécula del ácido nucleico que comprende un polinucleótido que tiene una secuenciacion de una molécula de ácido nucleico amplificada a partir de una biblioteca de ácido nucleico que utiliza los cebadores como se listan en la Tabla 3b (h) una molécula de ácido nucleico que codifica un fragmento de polipéptido que inicia con el aminoácido: 1, 30, 50, 100, 200, 300, 500 ó 1000 y se detiene con el aminoácido 1276, 1000, 500, 300, 200, 50, 30 ó 1 de un polipéptido codificado por cualquiera de (a) a (g) · (i) una molécula de ácido nucleico que comprenden al menos 20 nucleótidos de un polinucleótido de cualquiera de (a) o (d) ; ( ) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que se reconoce por un anticuerpo monoclonal que se ha incrementado contra un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de cualquiera de (a) a (h) ; (k) una molécula de ácido nucleico obtenible al seleccionar una biblioteca apropiada bajo condiciones de severidad con una sonda que tiene la secuencia de la molécula del ácido nucleico de cualquiera de (a) a (j) o de un fragmento del mismo de al menos 20; y (1) una molécula de ácido nucleico, la hebra complementaria de la cual hibridiza bajo condiciones de severidad con una molécula de ácido nucleico de cualquiera de (a) o (k) ; o la hebra complementaria de cualquiera de (a) a (1) ; o que codifica un polipéptido codificado por un segmento del cromosoma o un grupo 6 de enlace de Solanum bulbocastanum o Solanum tuberosum que se co- segrega con un marcador seleccionado a partir de la tabla 3a o 3b o comprende un sitio de replicación o sitio de hibridización para tal marcador y el cual media resistencia a patógenos del phylum Oomyceta; y por lo que el polinucleotido no consiste de la secuencia mostrada en ossi et al. 1998, PNAS USA 95:9750-9754, Milligan et al., 1998, Plant Cell 10: 1307-1319, o WO 98/06750.
9. 9. El polinucleotido de la reivindicación 8 o el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el marcador es E40 M58, CT119 o CT216.
10. 10. El polinucleotido de la reivindicación 8 ó 9, el cual es 7ADN o ARN.
11. 11. Un método para realizar un vector recombinante, que comprende insertar el polinucleotido de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 dentro de un vector o insertar al polinucleotido y una proteína de resistencia adicional.
12. 12. Un vector que contiene el polinucleotido de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, o que comprende el polinucleótido y un gen de resistencia adicional o que se produce por el método de la reivindicación 11.
13. 13. El vector de la reivindicación 12 o el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde un polinucleótido que codifica la proteína Rpi-blb2 o que codifica la proteína de resistencia adicional se enlaza operativamente a las secuencias de control de expresión y/o se enlaza operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica una expresión transgénica que regula la señal para permitir la expresión en células huéspedes procarióticas o eucarióticas .
14. 14. El vector de la reivindicación 12 ó 13 o el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el polinucleótido que codifica la proteína Rpi-blb2 o que codifica una protelna de resistencia adicional enlaza operativamente las secuencias de control de expresión del mismo origen de especie como la proteína Rpi-blb2 de codificación del polinucleótido a la proteína de resistencia adicional.
15. 15. Un método para crear una célula huésped recombinante que comprende introducir el vector de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14 o introducir tal vector y un vector para expresar una proteína de resistencia adicional en una célula huésped.
16. 16. Una célula huésped producida de acuerdo al método de la reivindicación 15 o diseñada genéticamente con el polinucleotido de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, o el vector de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, o diseñada genéticamente con tal vector o polinucleotido y un vector o un polinucleotido para expresar una proteína de resistencia adicional .
17. 17. La célula huésped de la reivindicación 16, la cual es E. coli, Baculovirus, Agrobacterium, o una célula de plantas.
18. 18. Un proceso para la producción de un polipéptido pi-blb2 que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 16 ó 17 o recuperar el polipéptido codificado por tal polinucleotido y expresado por la célula huésped a partir del cultivo o las células huéspedes.
19. 19. Un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido codificada por un polinucleotido de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 u obtenible por el proceso de la reivindicación 18.
20. 20. Un polipéptido que tiene una actividad Rpi-blb2.
21. 21. Un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de la reivindicación 19 ó 20.
22. 22. Una molécula de ácido nucleico antisentido que comprende la secuencia complementaria del polinucleotido de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10.
23. 23. Un método para la producción de una planta transgénica, una célula de planta o un tejido de planta o una parte de la misma que comprende la introducción del polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 o tal polinucleótido y un polinucleótido que codifica una proteina de resistencia adicional, o el vector de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14 dentro del genoma de tal planta, el tejido de planta o la célula de planta o una parte de la misma.
24. 24. Una célula de planta que comprende el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, el vector de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14 u obtenible por el método de la reivindicación 23.
25. 25. Una planta transgénica o un tejido de planta o una parte de la misma que comprende la célula de planta de la reivindicación 24.
26. 26. Un método para producir una planta o una parte de la misma resistente a un patógeno de planta del phylum Oomyceta que comprende la etapa: de expresar en la planta o una parte de la misma el polipéptido de la reivindicación 19 a 20 y una proteína de resistencia adicional.
27. 27. Un método para producir una planta o una parte de la misma con una resistencia durable a una Phytophthora s . que comprende co-expresar en la planta o una parte de la misma la proteína Rpi-blb y Rpi-blb2 o el polipéptido de la reivindicación 19 6 20.
28. 28. La planta transgénica o un tejido de planta de la reivindicación 25 o producido de acuerdo a la reivindicación 26 ó 27, que hasta la presencia del polinucleotido el vector es resistente a un patógeno de planta del phylum Oomyceta.
29. 29. Partes cosechables de la planta transgénica o el tejido de planta de la reivindicación 25, que comprende la célula de la planta de la reivindicación 2 .
30. 30. El material de propagación de la planta transgénica o el tejido de planta de la reivindicación 25, que comprende la célula de planta de la reivindicación 24.
31. 31. El uso del polinucleotido de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, el vector de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, o el polipéptido de la reivindicación 19 ó 20 para producir una planta o un tejido de planta, un órgano de planta, o una célula de planta o una parte de la misma resistente a un patógeno de planta del phylum Oomyceta.
32. 32. Un método para la identificación de un compuesto que estimula resistencia a un patógeno de planta del phylum Oomycta que comprende : (a) poner en contacto células que expresan el polipéptido de la reivindicación 19 a 20 o su ARNm con un compuesto candidato bajo condiciones de cultivo celular; (b) evaluar un incremento en expresión de tal polipéptido o tal ARNm; (c) comparar el nivel de expresión a una respuesta estándar hecha en la ausencia del compuesto candidato; por lo que una expresión de incremento sobre el estándar indica que el compuesto está estimulando resistencia.
33. 33. El uso del polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, el vector de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, el polipéptido de la reivindicación 19 ó 20 o el anticuerpo de la reivindicación 21, para identificar y/o producir compuestos que activan o estimulan resistencia de las plantas a un patógeno de planta del phylum Oomyceta .
34. 34. Una composición de diagnóstico, que comprende el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, el vector de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, el anticuerpo de la reivindicación 21, o el ácido nucleico antisentido de la reivindicación 22 y opcionalmente medios adecuados para detección.
35. 35. Un equipo que comprende el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 12, el vector de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, la célula huésped de la reivindicación 16 ó 17, el polipéptido de la reivindicación 19 ó 20, el ácido nucleico antisentido de la reivindicación 22, el anticuerpo de la reivindicación 21, la célula de planta de la reivindicación 24, la planta o el tejido de planta de la reivindicación 25, la parte cosechable de la reivindicación 29 o el material de propagación de la reivindicación 30 y opcionalmente un polinucleotido que codifica Rpi-blb, la proteína Rpi-blb o un anticuerpo contra Rpi-blb.
36. 36. Un método para la producción de un protector de cultivo de plantas que proporcionan el polinucleotido de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, el vector de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14 o el polipéptido de la reivindicación 19 ó 20 o que comprende las etapas del método de la reivindicación 32; y formular el polinucleotido de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, el vector de las reivindicaciones 12 ó 14 o el polipéptido de la reivindicación 19 ó 20 o el compuesto identificado en la etapa (c) de la reivindicación 32 en una forma aplicable como la composición agrícola.
37. 37. El vector, la célula huésped, una célula de planta, el tejido de planta, la planta, el uso, el equipo o el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 36, en donde el patógeno de planta es del orden de Pythiales o Peronosperales .
38. 38. El vector, la célula huésped, la célula de 23? planta, el tejido de planta, la planta, el uso, el equipo o el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 37, en donde el patógeno de planta es de la especie de P. infestants, Phytopht ora eryt roseptica, Phytophthora capsici, Phytophthora sojae, Phytophthora parasitica var. Nicotinae, Bremia lactuca, Peronospera tabaci ó Plasmopara vitícola .
39. 39. El vector, la célula huésped, la célula de planta, el tejido de planta, la planta, el uso, el equipo o el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 38, en donde la protelna de resistencia se caracteriza por un bucle P y un dominio NBS .
40. 40. El vector, la célula huésped, la célula de planta, el tejido de planta, la planta, el uso, el equipo o el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 39, en donde el gen de resistencia adicional es un gen que codifica Rpi-blb, Rl, R-ber, Rpil, R2 , R3 , R4 , R5 , R6 , R7 , R8 , R9 , RIO, Rll, Ph-1, Ph-2 y/o Ph.-3.
41. 41. El vector, la célula huésped, la célula de planta, el tejido de planta, la planta, el uso, el equipo o el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 40, en donde la proteína de resistencia adicional es la proteína Rpi-blb.
42. 42. El vector, la célula huésped, la célula de planta, el tejido de planta, la planta, el uso, el equipo o el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 41, en donde la planta, la célula de planta o el tejido de planta se selecciona a partir del grupo que consiste de Menyanthaceae , Solanaceae, Sclerophylacaceae , Duckeodendraceae, Goetzeaceae, Convolvulaceae , Cuscutaceae, Polemoniaceae e Hydrophyllaceae de acuerdo a Systema Naturae 2000, Brands, S.J., Amsterdam o tiene su origen en el mismo.
43. 43. El vector, la célula huésped, la célula de planta, el tejido de planta, la planta el uso, el equipo o el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 42, en donde el polinucleótido, el polipéptido, la célula de planta, la célula huésped, el tejido de planta o la planta se deriva de la familia de la Solanaceae, de preferencia S. bulbocastanum, papa (S. tuberosum) , tomate (S. lycopersicum o Lycopersicon lycopersicum (L.) Karsten ex Farwell) , petunia, planta del tomate (S. betaceum) , melocotón (S. muricatum) o berenjena (S . melongena) .