MXPA06001358A

MXPA06001358A - Conjugados de hidroxialquil almidon y g-csf.

Info

Publication number: MXPA06001358A
Application number: MXPA06001358A
Authority: MX
Inventors: Eckart Grabenhorst
Original assignee: Fresenius Kabi Gmbh
Priority date: 2003-08-08
Filing date: 2004-08-06
Publication date: 2006-05-15
Also published as: WO2005014050A3; WO2005014050A2; PL1660134T3; AU2004262921B2; EP1660134B1; KR101154343B1; KR20060037431A; RU2006106926A; AU2004262921A1; RU2370281C2; EP1660134A2; CA2534418A1

Abstract

La presente invencion se refiere a conjugados de hidroxialquil almidon y una proteina factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), donde estos conjugados se forman por union covalente entre el hidroxialquil almidon o un derivado del hidroxialquil almidon y la proteina. La presente invencion tambien se refiere a los metodos para producir estos conjugados y al uso de estos conjugados.

Description

CONJUGADOS DE HIDROXIALQUIL ALMIDON Y G-CSF Descripción de la invención La presente invención se refiere a conjugados de hidroxialquil almidón y una proteína factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) , donde estos conjugados se forman por unión covalente entre el hidroxialquil almidón o un derivado del hidroxialquil almidón y la proteina. La presente invención también se refiere al método de producir estos conjugados y al uso de estos conjugados. En general se acepta que la estabilidad de las proteínas se puede mejorar y que la respuesta inmunológica contra estas proteínas se reduce cuando estas -proteínas se unen a moléculas poliméricas. La WO 94/28024 revela que en las proteínas fisiológicamente activas modificadas con polietilenglicol (PEG) se observa inmunogenicidad y antigenicidad reducidas y que en el torrente sanguíneo circulan mucho más tiempo que las proteínas no conjugadas, es decir tienen un índice de clearance reducido. El G-CSF es una glicoproteína de 21 kDa estabilizada por dos uniones disulfuro intracatenarias que contienen un único radical carbohidrato O-asociado. El G-CSF maduro tiene 174 aminoácidos. En el organismo animal, el G-CSF se sintetiza en las células estromales de la médula ósea, macrófagos y fibroblastos . Su función principal es ser un factor de Ref.:169516 crecimiento y diferenciación para los neutrófilos y sus células precursoras. Sin embargo, también es conocido en el arte que el G-CSF activa los neutrófilos maduros. Además, estimula el crecimiento/diferenciación de varias .otras células progenitoras hemopoyéticas (en sinergia con factores de crecimiento hemopoyético adicionales) y promueve la proliferación y migración de las células endoteliales . Clínicamente, el G-CSF se administra para el tratamiento de deficiencias en los niveles de neutrófilos (causados, por ej . , por anemia aplásica, mielodisplasia, SIDA o quimioterapia) . La O 02/09766 revela, entre otros, compuestos proteína-polímero biocompatibles que son producidos por conjugación de la proteína biológicamente activa con un derivado polimérico biocompatible . Los polímeros biocompatibles usados son polímeros ramificados altamente reactivos y los conjugados resultantes contienen un largo conector entre el derivado polimérico y la proteína. Como polímeros biocompatibles, se describen polímeros de fórmula (P-OCH2CO-NH-CHR-CO- ) n-L-Qk-A, en donde P y Q son residuos poliméricos y k puede ser 1 o 0. Para P y Q se mencionan el polietilenglicol , polipropilenglicol , polioxietileno, politrimetilenglicol , ácido poliláctico y sus derivados, ácido poliacrílico y sus derivados, poliaminoácidos , alcohol polivínilico, poliuretano, polifosfaceno, poli (L-lisina) , óxido de polialquileno, poliacrilamida y polímeros hidrosolubles tales como dextrano o polisacáridos . Entre las proteínas, entre otras se menciona a los interferones alfa, beta y gama, factores sanguíneos, citoquinas, tales como las interleuquinas, G-CSF, GM-CSF. Entre los ejemplos de WO 02/097S6, sólo se mencionan derivados de mono-, di- y tri-polietilenglicol que se acoplan exclusivamente al interferón y al factor de crecimiento epidérmico y a la hormona de crecimiento humana. La WO 94/01483 revela conjugados de polímeros biocompatibles que se forman por unión covalente de un polímero o derivado de polímero biológicamente inactivo a un polímero hidrofílico sintético farmacológicamente puro, a través de tipos específicos de uniones químicas. Como polímeros que se forman naturalmente y sus derivados se dan a conocer los polisacáridos, tales como el acido hialurónico; los proteoglicanos , tales como los condroitín sulfatos A, B y C, quitina, heparina, sulfato de heparina; dextranos, tales como el ciclodextrano, hidroxietil celulosa, éteres de celulosa y almidón; lípidos, tales como los triglicéridos y los fosfolípidos . Como polímeros sintéticos, se describen, entre otros, el polietileno y sus derivados que tienen un peso molecular promedio de aproximadamente entre 100 y 100.000. Como proteínas unidas al polímero o al derivado del polímero, se describen citoquinas y factores de crecimiento, incluyendo a los interferones; se dan a conocer los factores de necrosis tumoral, las interleuquinas , los factores estimulantes de colonias; factores de crecimiento, tales como el extracto del factor osteogénico, el factor de crecimiento epidérmico, el factor de crecimiento de transformación, el factor de crecimiento derivado de plaquetas, el factor de crecimiento de fibroblastos acídico y otros . En todos los ejemplos de trabajo de O 94/01483, se usan derivados de polietilenglicoles como polímeros. La WO 96/11953 revela compuestos a base de proteína modificada químicamente en su extremo N-terminal y sus métodos de producción. En particular, se describen las composiciones a base de G-CSF que resultan de la unión de un polímero hidrosoluble al extremo N-terminal de G-CSF. En el contexto de WO 96/11953, también se dan a conocer interferones de consenso acoplados en su extremo N-terminal a polímeros hidrosolubles . Aunque en WO 96/11953 se enumera una amplia variedad de polímeros hidrosolubles, por ej . copolímeros de etilenglicol y propilenglicol , carboximetil celulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinil pirrolidona, poli-l,3-dioxolano, poli-1, 3 , 6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (ya sea homopolímeros o copolímeros al azar) , poli (n-vinil pirrolidona) polietilenglicol , homopolímeros de polipropilenglicol , copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno o polioles polioxietilenados , sólo se describen composiciones PEGiladas de G-CSF o IFN de consenso en los ejemplos de trabajo de WO 96/11953. La US 6.555,660 B2 revela conjugados de polipéptidos que comprenden un polipéptido que exhiben actividad de G-CSF y que tienen una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos del G-CSF humano en, por lo menos, un residuo de aminoácido específico introducido y/o suprimido, en donde el conjugado comprende un grupo de unión para un radical no-polipeptídico y además comprende, por lo menos, un resto no-polipeptídico unido al grupo de unión del polipéptido. El resto no-polipeptidico puede ser un polímero, tal como polietilenglicol o un oligosacárido . En US 6,555,660 B2 , se establece en forma explícita e inequívoca que PEG es con mucho la molécula de polímero más preferida dado que sólo tiene pocos grupos reactivos susceptibles de entrecruzamiento, en comparación con polisacáridos tales como el dextrano . La WO 97/30148 se relaciona con conjugados de polipéptidos con efecto alergénico reducido que comprenden una molécula vehículo polimérica que tiene, por lo menos, dos moléculas de polipéptido acopladas a la misma. Estos conjugados son preferentemente parte de las composiciones usadas en el mercado de la salud personal. Los conjugados mencionados se producen activando una molécula vehículo polimerica, haciendo reaccionar, por lo menos, dos o más moléculas de polipéptido con la molécula vehículo polimérica activada, y bloqueando los grupos residuales activos en el conjugado. En WO 97/30148 se enumera una gran variedad de moléculas vehículo poliméricas, incluyendo grupos de compuestos tan diferentes como los homopolime os naturales y los sintéticos, tales como polioles, poliaminas, ácidos policarboxílicos y heteropolímeros que comprenden, por lo menos, dos grupos de unión diferentes. Entre los ejemplos se comprende los PEGs .estrella, PEGs ramificados, alcoholes polivinílicos , policarboxilatos , polivinilpirrolidonas y los poli-D,L-aminoácidos . Entre otros, se dan a conocer también dextranos, tales como carboximetil dextrano; celulosas, tales como la hidroxietil celulosa y la hidroxipropil celulosa, hidrolizados de quitosano, almidones, tales como hidroxietil almidones e hidroxipropil almidones, glucógeno, agarosa, goma guar, inulina, pululano, goma xántica, carragenina, pectina, ácido algínico, etc. Entre los polipéptidos, sólo se dan a conocer explícitamente algunas enzimas. Baldwin, J.E. et al., Tetrahedron, vol . 27 (1981), págs. 1723-1726 describen la modificación química del dextrano y el hidroxietil almidón para dar polímeros sustituidos con aldehido que pueden reaccionar con hemoglobina para dar hemoglobinas solubles unidas a polímeros. Se demostró que éstas son susceptibles de unirse al oxígeno, pero los experimentos de perfusión cardíaca indicaban claramente que las hemoglobinas unidas a polímeros no eran adecuadas para usarlas como sustitutos de la sangre. La WO 99/49897 describe conjugados de la hemoglobina formados haciendo reaccionar polisacáridos , tales como dextrano e hidroxietil almidón con grupos amino de la hemoglobina. Entre los grupos funcionales del polisacárido, se usan los grupos aldehido producidos por la apertura oxidativa del anillo del sacárido. Como agente reductor preferido usado, se menciona el borano dimetilamina . Asimismo, la WO 99/49897 se limita exclusivamente a la hemoglobina . La WO 03/074087 se refiere a un método para acoplar proteínas a un polisacárido modificado derivado del almidón. La actividad de unión entre la proteína y el polisacárido, hidroxialquil almidón, es una unión covalente que se forma entre el grupo aldehido terminal o un grupo funcional resultante de la modificación química del grupo aldehido terminal mencionado de la molécula de hidroxialquil almidón y un grupo funcional de la proteína. Como grupo reactivo de la proteína se menciona a los grupos amino, grupos tio y grupos carboxilo, mientras que no se mencionan los grupos aldehido de la proteína. Asimismo, aunque se presenta a una amplia variedad de posibilidades de diferentes ligaduras en forma de numerosas listas, incluyendo diferentes grupos funcionales, moléculas conectoras diferentes teóricamente adecuadas y diferentes procedimientos químicos, los ejemplos de trabajo describen sólo dos alternativas: primero, se usa un idroxietil almidón oxidado y acoplado directamente a proteínas usando activación con etildimetilaminopropil carbodiimida (EDC) o se usa un hidroxietil almidón no oxidado y acoplado directamente a una proteína formando una base de Schiff que se reduce posteriormente a la respectiva amina. De este modo, los ejemplos de trabajo de la WO 03/074087 ni dan a conocer un conjugado único acoplado a través de un grupo tio o un grupo carboxi de la protelna, ni describen ningún conjugado que comprenda hidroxietil almidón, la proteína y una o más moléculas conectoras. Por añadidura, no se usa ninguna molécula de G-CSF en los ejemplos de trabajo. Por consiguiente, fue un objetivo de la presente invención proveer conjugados de hidroxialquil almidón, preferentemente hidroxietil almidón y G-CSF que todavía no han sido descritos anteriormente en el arte. Otro objetivo más de la presente invención es proveer métodos para producir estos conjugados. Por consiguiente, la presente invención se refiere a un método para preparar un conjugado que comprende una proteína y un polímero o un derivado del mismo, donde el polímero es un hidroxialquil almidón (HAS) y la proteína es un factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) , comprendiendo el método hacer reaccionar, por lo menos, un grupo funcional. A del polímero o de uno de sus derivados con, por lo menos, un grupo funcional Z de la proteína y formando así una unión covalente, donde Z se selecciona del grupo que consiste en un grupo amino, un grupo tiol, un grupo aldehido y un grupo ceto, y donde , en caso de que Z sea un grupo aldehido o un grupo ceto, A comprende un grupo amino que forma dicha unión con Z, o - donde, en caso de que Z sea un grupo amino, A se selecciona del grupo que consiste en un grupo carboxi reactivo y un grupo aldehido, un grupo ceto o un grupo hemiacetal , donde, en caso de que A sea un grupo aldehido, un grupo ceto o un grupo hemiacetal, el método además comprende introducir A en el polímero para producir un derivado del polímero haciendo reaccionar el polímero, por lo menos, con un compuesto bifuncional, un grupo funcional que reacciona con el polímero y, por lo menos, otro grupo funcional que sea un grupo aldehido, un grupo ceto o un grupo hemiacetal, o es un grupo funcional que además está químicamente modificado para producir un grupo aldehido, un grupo ceto o un grupo hemiacetal , u oxidando el polímero para producir, por lo menos, uno, en particular por lo menos dos, grupos aldehido, o donde, en caso de que A sea un grupo carboxi reactivo, el método además comprende la introducción de A en el polímero para producir un derivado del polímero oxidando selectivamente el polímero en su extremo reductor y activando el grupo carboxi resultante, o haciendo reaccionar el polímero en su extremo reductor no-oxidado con un diéster carbónico, o donde, en caso de que Z sea un grupo tiol, A comprende -- un grupo maleimido o un grupo haloacetilo que forma dicha unión con Z. En consecuencia, la presente invención también se refiere a un conjugado que se puede obtener por el método descrito más arriba. El G-CSF se puede producir por procedimientos químicos de síntesis o puede ser de cualquier humano (ver por ej . Burgess, A.W. et al. 1977, "Stimulation by human placental conditioned médium hemopoietic colony formation by human marrow cells" , Blood 49 (1977), 573-583; Shan, R.G. et al. 1977, "Characterization of colony-stimulating activity produced by human monocytes and phytohemagglutinin-stimulated lymphocytes" , Blood 50 (1977), 811) u otra fuente de un mamífero y se puede obtener por purificación de fuentes naturales, tales como placenta humana, sangre humana u orina humana. Además, una cantidad de carcinomas epiteliales, células de leucemia mieloide aguda y varias líneas celulares tumorales (carcinomas de vejiga, meduloblastomas) , son susceptibles de expresar este factor. Además, la expresión de G-CSF también abarca una variante de G-CSF en donde, uno o más aminoácidos (por ej . 1 a 25, preferentemente 1 a 10, de mayor preferencia 1 a 5, y de máxima preferencia 1 o 2) se han intercambiado por otro aminoácido y que presenta actividad de G-CSF (ver por e . : Riedhaar-Olson, J.F. et al. 1996, Identification of residues critical to the activity of human granulocyte colony-stimulating factor, Biochemistry 35:9034-9041 1996; Patentes de estados Unidos. Nos. 5.581.476; 5.214.132; 5.362,853; 4.904.584). La medición de la actividad de G-CSF está descrita en el arte (para la medición de la actividad de G-CSF in vitro ver por ej . Shirafuji, N. et al.1989, "A new bioassay for human granulocyte colony-stimulating factor (hG-CSF) using murine myeloblastic NFS-60 células as targets and estimation of its levéis in sera between normal healthy persons and patients with infectious and hematological disorders" , Exp. Hematol . 1989, 17, 116-119; para la medición de la actividad de G-CSF in vivo ver por ej . : Tanaka, H. et al . , 1991 "Pharmacokinetics of human recombinant granulocyte colony-stimulating factor conjugated to polyethylene glycol in rats, Cáncer Research '51, 3710-3714,1991). Otras publicaciones donde figuran pruebas para la medición de la actividad de G-CSF son la Pat . De EE.UU. No. 6.555,660; Nohynek, G.J. et al.1997, "Comparison of the potency of glycosylated and nonglycosylated human recombinant granulocyte colony-stimulating factors in neutropenic and nonneutropenic CD rats" , Cáncer Chemoelr Pharmacol (1997) 39/259-266. Preferentemente, el G-CSF se produce en forma recombinante . Esto incluye la expresión en huéspedes procariotas o eucariotas de secuencias de ADN exógenas obtenidas por clonación genómica o de ADMc, o por síntesis de ADN. Entre los huéspedes procariotas adecuados, se incluyen varias bacterias, tales como E. coli . Entre los huéspedes eucariotas adecuados, se incluye a las levaduras, tales como la S. cerevisiae, y células de mamíferos, tales como las células de ovario de hámster chino y células de mono. La producción recombinante de una proteína es conocida en el arte.- En general, esto comprende la transfección de las células huésped con un vector de expresión apropiado, el cultivo de las células huésped en condiciones que permitan la producción de la proteína y la purificación de la proteína a partir de las células huésped. Para obtener información detallada, ver por ej . Souza, L. .et al. 1986, "Recombinant human granulocyte colony-stimulating factor: effects on normal and leukemic myeloid cells" , Science 1986 232:61-65,1986; Nagata, S. et . al . 1986, "Molecular cloning and expression of cDNA for human granulocyte colony-stimulating factor", Nature 319:415-418, 1986; Komatsu, ?. et al . 1987, "Cloning of granulocyte colony-stimulating factor cDNA from human macrophages and its expression in Escherichia coli, Jpn J Cáncer Res. 1987 78 (11) : 1179-1181. En una forma de realización preferida, el G-CSF tiene la secuencia de aminoácidos del G-CSF humano maduro (ver por ej . ; Nagata, S. et . al.1986, Molecular cloning and expression of cDNA for human granulocyte colony-stimulating factor, Nature 319:415-418, 1986), y además puede contener una metionxna en su extremo amino terminal, que luego produce una proteína de 175 aminoácidos. Además, en lugar de metionina, G-CSF puede contener un residuo de serina o treonina. El G-CSF que se usa en los métodos de la presente invención y los conjugados, de acuerdo con la presente invención, pueden comprender un carbohidrato de cadena lateral unido al G-CSF, por O-glicosilación en la posición Thr 133, es decir el G-CSF es glicosilado (V. Gervais et al.,Eur. J. Biochem. 1997, 247, 386-395) . La estructura del carbohidrato de cadena lateral puede ser NeüNAc(alfa2-3)Gal (betal-3) [NeuMAc (alfa2-6) ]GalNAc y (alfa2-3)Gal(betal-3)GalNAc (NeuNAc = ácido N-acetilneuramínico, GaUSLAc = N-acetilgalactosamina) . Se ha sugerido la modificación del G-CSF y de otros polipéptidos para introducir, por lo menos, una cadena de carbohidrato adicional, en comparación con el polipéptido nativo (Pat. de EE.UU No. 5.218.092). Según el huésped empleado, el producto de expresión G-CSF puede ser glicosilado con carbohidratos de mamífero u otros eucariotas. Por lo general, cuando G-CSF se produce en las células eucariotas, la proteína es glicosilada post-traduccionalmente. En consecuencia, el carbohidrato de cadena lateral puede haberse unido al G-CSF durante la biosíntesis en células de mamífero, especialmente humanas, de insecto o levadura. El G-CSF recombinante humano (rhG-CSF) , por lo general, se usa para tratar diferentes formas de leucopenia. Así, las preparaciones comerciales de rhG-CSF están disponibles bajo los nombres genéricos de filgrastim (Gran® y Neupogen®) , lenograstim (Neutrogin® y Granocyte®) y nartograstim (Neu-up®) . Gran® y Neupogen® son no glicosilados y se producen en células recombinantes de E. coli. Neutrogin® y Granocyte® son glicosilados y se producen en células de CHO recombinantes y Neu-up® es no glicosilado con cinco aminoácidos sustituidos en la región N-terminal del rhG-CSF intacto producido en células de E. coli recombinante. Como proteína glicosilada, se puede emplear cualquier G-CSF glicosilado, tal como Granocyte®. Como G-CSF no glicosilado, se puede emplear cualquier G-CSF no glicosilado, tal como Neupogen® en los métodos y el conjugado de acuerdo con la presente invención.

Además, en la posición 1, el G-CSF puede contener un residuo del aminoácido metionina, un residuo de serina o un residuo de treonina. En el contexto de la presente invención, el término "hidroxialquil almidón" (HAS) se refiere a un derivado de almidón que .ha sido sustituido por, al menos, un grupo hidroxialquilo . El hidroxialquil almidón preferido de la presente invención tiene una constitución de acuerdo con la ¦ fórmula (I) donde el extremo reductor de la molécula de almidón se muestra en forma no oxidada y la unidad del sacárido terminal se muestra en la forma acetálica que, dependiendo por ej . del solvente, puede estar en equilibrio con la forma aldehidica.

El término "hidroxialquil almidón" como se usa en la presente invención no se limita a compuestos donde el resto de carbohidrato terminal comprende los grupos hidroxialquilo i, R2 ylo R.3 como se representa, para abreviar, en la fórmula (I) , sino que también se refiere a compuestos en los cuales, por lo menos, un grupo hidroxi presente en cualquier, ya sea en el resto carbohidrato terminal y/o en la parte restante de la molécula de almidón, HAS', está sustituido con un grupo hidroxialquilo ¾, R2 o R3. También es posible un Mdroxialquil almidón que corrprende, por lo menos, dos grupos hidroxialquilo diferentes. El al menos un grupo hidroxialquilo comprendido en HAS puede contener dos o más grupos hidroxi . De acuerdo con una forma de realización preferida, el al menos un grupo hidroxialquilo comprendido en HAS contiene un grupo hidroxi . La expresión "hidroxialquil almidón" también incluye derivados en los cuales el grupo alquilo está mono- o polisustituido . En este contexto, es preferible que el grupo alquilo esté sustituido con un halógeno, especialmente flúor, o con un grupo arilo . Además, el grupo hidroxi de un grupo hidroxialquilo puede estar esterificado o eterificado. Además, en lugar de alquilo, se puede usar también grupos alqueno lineales o ramificados, sustituidos o no sustituidos . El hidroxialquil almidón es un éter derivado del almidón. En el contexto de la presente invención, además de dichos éteres derivados, también se pueden usar otros derivados del almidón. Por ejemplo, son útiles los derivados que comprenden grupos hidroxi esterificados . Estos derivados pueden ser, por ej . , derivados de ácidos no sustituidos mono-o dicarboxílieos con 2-12 átomos de carbono o de sus derivados sustituidos. Especialmente útiles son los derivados de ácidos monocarboxílicos no sustituidos con 2-6 átomos de carbono, especialmente derivados del ácido acético. ' En este contexto, los preferidos son el acetil almidón, butil almidón y propil almidón. Además, se prefieren los derivados de ácidos dicarboxxlicos no sustituidos con 2-6 átomos de carbono. En el caso de derivados de ácidos dicarboxílicos , es ventajoso que el segundo grupo carboxi del ácido dicarboxílico también esté esterificado. Además, en el contexto de la presente invención, también son adecuados los derivados de monoalquil esteres de los ácidos dicarboxxlicos.

Para los ácidos sustituidos mono- o dicarboxílicos, los grupos sustitutos pueden ser preferentemente los mismos mencionados arriba para los residuos alquilo sustituidos. Las técnicas para la esterificación del almidón son conocidas en el arte (ver por ej . lemm D. et al., Comprehensive Cellulose Chemistry Vol. 2, 1998, W iley-VCH, Weinheim, New York, especialmente el capítulo 4.4, Esterification of Cellulose (ISBN 3-527-29489-9) . De acuerdo con una forma de realización preferida de la presente invención, se emplea el hidroxialquil almidón, según la fórmula (I) . En la fórmula (I) , el anillo del sacárido descrito explícitamente, junto con el residuo señalado como HAS 1 representan la molécula de hidroxialquil almidón preferida. Las otras estructuras del anillo sacárido incluidas en HAS' pueden ser iguales o diferentes a las descritas explícitamente en el anillo sacárido. En lo que respecta a los residuos R2 y R3, de acuerdo con la fórmula (I) no existen limitaciones especificas. De acuerdo con una forma de realización preferida, Rlr R2 y R3 son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, un grupo hidroxiarilo, un grupo hidroxiaralquilo o un grupo hidroxialcarilo que tienen desde 2 hasta 10 átomos de carbono en el respectivo residuo alquilo. El hidrógeno y los grupos hidroxialquilos que tienen entre 2 y 10 son los preferidos. Se prefiere especialmente el grupo hidroxialquilo que tiene entre 2 y 6 átomos de carbono, pero es de mayor preferencia el que tiene entre 2 y 4 átomos de carbono, y aún de preferencia mayor el que tiene entre 2 y 4 átomos de carbono. Por consiguiente, el "hidroxialquil almidón" comprende preferentemente hidroxietil almidón, hidroxipropil almidón e hidroxibutil almidón, donde el hidroxietil almidón y el hidroxipropil almidón particularmente son los preferidos; si bien entre los dos se prefiere más el hidroxietil almidón. El grupo alquilo, arilo, aralquilo y/o alcarilo puede ser lineal o ramificado y adecuadamente sustituido. Por consiguiente, la presente invención también se refiere al método antes descrito en donde Ri, R2 y R3 son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo lineal o ramificado con entre 1 y 6 átomos de carbono.

Así, R-L, R2 y 3 preferentemente pueden ser hidroxihexilo, hidroxipentilo, hidroxibutilo, hidroxipropilo, tales corro 2-hidroxipropilo, 3-hidroxipropilo, 2-hidroxiisopropilo, hidroxietilo, tales como 2-hidroxietilo, prefiriéndose especialmente el drógeno y el grupo 2-hidroxietilo. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un método y un conjugado, según se describe arriba, donde Rlf R2 y R3 son independientemente hidrógeno o un grupo 2-hidroxietilo, prefiriéndose especialmente una forma de realización en la cual por lo menos un residuo i, R2 y R3 es 2-hidroxietilo. El hidroxietil almidón (HES) es el de mayor preferencia para todos las formas de realización de la presente invención. Por consiguiente, la presente invención se refiere al método y al conjugado según se describe arriba, donde el polímero es el hidroxietil almidón y el derivado de polímero es un derivado del hidroxietil almidón. El hidroxietil almidón (HES) es un derivado de la amilopectina natural y es degradado por la alfa-amilasa en el organismo. HES es un derivado sustituido del carbohidrato poli érico amilopectina, que está presente en el almidón de maíz en una concentración de hasta 95% en peso. HES muestra propiedades biológicas ventajosas y se usa como agente de reemplazo del volumen sanguíneo y en clínica médica en la terapia de hemodilución (Sommermeyer et al., 1987, rankenhauspharmazie, 8(8), 271-278; y eidler et al., 1991, Arzneim. -Fóschung/Drug Res., 41, 494-498) .

La amilopectina está formada por restos de glucosa, donde en la cadena principal están presentes los enlaces alfa-1, 4-glicosídicos y en los sitios de ramificación se encuentran los enlaces alfa-1, 6-glicosídicos . Las propiedades físico-guímicas de esta molécula están determinadas principalmente por el tipo de enlace glicosxdico. Debido al enlace alfa-1 , -glicos£dico mellado, se producen estructuras helicoidales con aproximadamente seis monómeros de glucosa por vuelta. Tanto las propiedades fisico-químicas como las bioquímicas del polímero se pueden modificar mediante sustitución. La introducción de un grupo hidroxietilo se puede lograr mediante la hidroxietilación alcalina. Adaptando las condiciones de reactividad se puede aprovechar la diferente reactividad del respectivo grupo hidroxi en el monómero de glucosa no sustituido, con respecto a la hidroxietilación. Por tal razón, los expertos son capaces de influir sobre el patrón de sustitución en forma limitada. HES se caracteriza principalmente por la distribución del peso molecular y el grado de sustitución. Existen dos formas de describir el grado de sustitución: 1. El grado se puede describir en relación a la porción de monómeros de glucosa sustituidos con respecto a todos los restos de glucosa. 2. El grado de sustitución se puede describir como la sustitución molar, donde se describe la cantidad de grupos hidroxietilo por resto de glucosa.

En el contexto de la presente invención, el grado de sustitución, señalado como GS, se relaciona con la sustitución molar, como se describe arriba. Las soluciones de HES están presentes como composiciones polidispersas , donde cada molécula difiere de la otra con respecto al grado de polimerización, la cantidad y patrón de los sitios de ramificación y el patrón de sustitución. Por lo tanto, HES es una mezcla de compuestos con diferente peso molecular. En consecuencia, una solución de HES en particular, se determina por el peso molecular promedio con la ayuda de medios estadísticos. En este contexto, Mn se calcula como la media aritmética, según la cantidad de moléculas. Alternativamente, Mw (ó MW) , el promedio másico, representa una unidad que depende de la masa del HES . En el contexto de la presente invención, el hidroxietil almidón preferentemente puede tener un peso molecular promedio (promedio másico) entre 1 y 300 kD. El hidroxietil almidón además puede exhibir, preferentemente, un grado molar de sustitución entre 0,1 y 0,8, y una relación preferida de sustitución C2:C6 que oscila entre 2 y 20, con respecto a los grupos hidroxietilo. El término "peso molecular promedio" que se usa en el contexto de la presente invención, se refiere al peso determinado de acuerdo con Sommermeyer et al., 1987, Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278; y Weidler et al., 1991, Arzneim. -Forschung/Drug Res., 41, 494-498.

De acuerdo con una forma de realización preferida de la presente invención, el peso molecular promedio del hidroxietil almidón empleado está entre 1 y 300 kD, preferentemente más bien entre 2 y 200 kD, de mayor preferencia entre 4 y 130 kD, de mayor preferencia aún entre 4 y 70 kD. Un ejemplo para HES con un peso molecular promedio de aproximadamente 130 kD es Voluven® de Fresenius . Voluven® es un coloide artificial empleado, por ej . , para reemplazo de volumen que se usa en indicaciones terapéuticas para el tratamiento y la profilaxis de la ipovolemia . Las características de Voluven® son: un peso molecular promedio de 130.000 +/- 20.000 D, una sustitución molar de 0,4 y una relación C2-.C6 de aproximadamente 9:1. Por consiguiente, la presente invención también se refiere al método y los conjugados como se describen arriba, donde el hidroxialquil almidón es un hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio entre 4 y 70 kD. Las escalas preferidas de peso molecular promedio son, por ej . , 4 y 70 kD o 10 y 70 kD o 12 y 70 kp o.18 y 70 kD o 50 y 70 kD o 4 y 50 kD o 10 y 50 kD o 12 y 50 kD o 18 y 50 kD o 4 y 18 kD o 10 y 18 kD o 2 y 18 kD o 4 y 12 kD o 10 yl2 kD o 4 y 10 kD. • Particularmente, de acuerdo con formas de realización preferidas de la presente invención, el peso molecular promedio de hidroxietil almidón empleado se ubica en el rango de mayor que 4 kD y menor que 70 kD, tales como aproximadamente 10 kD, o en el rango entre 9 y 10 kD o entre 10 y 11 kD o entre 9 y 11 kD, o aproximadamente 12 kD, o en el rango entre 11 y 12 kD o entre 12 y 13 kD o entre 11 y 13 kD, o aproximadamente 18 kD, o en el rango entre 17 y 18 kD o entre 18 y 19 kD o entre 17 y 19 kD, o aproximadamente 50 kD, o en el rango entre 49 y 50 kD o entre 50 y 51 kD o entre 49 y 51 kD. En lo que respecta al grado de sustitución (GS) , GS es preferentemente, por lo menos, 0,1, de mayor preferencia, por lo menos, 0,2, y de mayor preferencia, por lo menos, 0.4. Los rangos preferidos de GS se ubican entre 0,1 y 0,8, de mayor preferencia entre 0,2 y 0,8, de mayor preferencia entre 0,3 y 0,8 y aún de mayor preferencia entre 0,4 y 0,8, todavía de mayor preferencia entre 0,1 y 0,7, de mayor preferencia entre 0,2 y 0,7, de mayor preferencia entre 0,3 y 0,7 y de mayor preferencia entre 0,4 y 0,7. Los valores preferidos de GS particularmente son, por ej . , 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 o 0,8; con 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 o 0,8; los de mayor preferencia son, 0.3, 0.4, 0.5, 0,6, 0,7 o 0,8; los de preferencia aún mayor son, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 o 0,8 todavía son mas preferidos y, por ej . 0,4 y 0,7 son los particularmente preferidos. Particularmente, las combinaciones preferidas de peso molecular del hidroxialquil almidón, preferentemente el hidroxietil almidón, y sus grados de sustitución GS son, por ej . , 10 kD y 0,4 o 10 kD y 0,7 o 12 kD y 0,4 o 12 kD y 0,7 o 18 kD y 0,4 o 18 kD y 0,7 o 50 kD y 0,4 o 50 kD y 0,7.

En otro forma de realización preferida de la presente invención, el hidroxietil almidón (empleado asi como contenido en los conjugados descritos aquí) tiene un peso molecular de entre aproximadamente 20 kD y aproximadamente 130 kD (es decir aproximadamente 40 kD, aproximadamente 50 kD, aproximadamente 60 kD, aproximadamente 70 kD, aproximadamente 80 kD, aproximadamente 90 kD, aproximadamente 100 kD, aproximadamente 110 kD, aproximadamente 120 kD, aproximadamente 130 kD) , preferentemente un peso molecular promedio de aproximadamente 30 kD to aproximadamente 100 kD, de mayor preferencia entre aproximadamente 40 y aproximadamente 70 kD y un grado de sustitución entre 0,4 y 0,8, más preferido entre 0,5 y 0,8. En este contexto, el término "aproximadamente 30 kD" se entiende que se relaciona con un peso molecular promedio en el rango entre 25 kD y 34 kD, es decir incluyendo también a los almidones que tienen un peso molecular promedio de 26, 27, 28, 29, 31, 32, 33 o 34 kD . En este contexto el término "aproximadamente 40kD" se entiende que se relaciona con un peso molecular promedio en el rango entre 35 kD y 44 kD, es decir incluyendo también a los almidones que tienen un peso molecular promedio de 36, 37, 38, 39, 41, 42, 43 o 44 kD. En este contexto el término "aproximadamente 50kD" se entiende que se relaciona con un peso molecular promedio en el rango entre 45 kD y 54 kD, es decir incluyendo también a los almidones que tienen un peso molecular promedio de 46, 47, 48, 49, 51, 52, 53 o 54 kD . En este contexto el término "aproximadamente 60kD" se entiende que se relaciona con un peso molecular promedio en el rango entre 55 kD y 64 kD, es decir incluyendo también a los almidones que tienen un peso molecular promedio de 56, 57, 58, 59, 61, 62, 63 o 64 kD. En este contexto el término "aproximadamente 70kD" se entiende que se relaciona con un peso molecular promedio en el rango entre 65 kD y 74 kD, es decir incluyendo también a los almidones que tienen un peso molecular promedio de 66, 67, 68, 69, 71, 72, 73 o 74 kD . En este contexto el término "aproximadamente 80kD" se entiende que se relaciona con un peso molecular promedio en el rango entre 75 kD y 84 kD, es decir incluyendo también a los almidones que tienen un peso molecular promedio de 76, 77, 78, 79, 81, 82, 83 o 84 kD . En este contexto el término "aproximadamente 90kD" se entiende que se relaciona con un peso molecular promedio en el rango entre 85 kD y 94 kD, es decir incluyendo también a los almidones que tienen un peso molecular promedio de 86, 87, 88, 89, 91, 92, 93 o 94 kD . En este contexto el término "aproximadamente lOOkD" se entiende que se relaciona con un peso molecular promedio en el rango entre 95 kD y 104 kD, es decir incluyendo también a los almidones que tienen un peso molecular promedio de 96, 97, 98, 99, 101, 102, 103 o 104 kD. En este contexto el término "aproximadamente HOkD" se entiende que se relaciona con un peso molecular promedio en el rango entre 105 kD y 114 kD, es decir incluyendo también a los almidones que tienen un peso molecular promedio de 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113 o 114 kD. En este contexto el término "aproximadamente 120kD" se entiende que se relaciona con un peso molecular promedio en el rango entre 115 kD y 124 kD, es decir incluyendo también a los almidones que tienen un peso molecular promedio de 116, 117, 118, 119, 121, 122, 123 o 124 kD. En este contexto el término "aproximadamente 130kD" se entiende que se relaciona con un peso molecular promedio en el rango entre 125 kD y 134 kD, es decir incluyendo también a los almidones que tienen un peso molecular promedio de 126, 127, 128, 129, 131, 132, 133 o 134 kD. En consecuencia, la forma de realización previamente descrita también comprende un hidroxietil almidón (y los conjugados descritos aquí comprenden el hidroxietil almidón como así también los métodos descritos aquí que emplean hidroxietil almidón) que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 30 kD y un grado de sustitución de 0,4. o 0,5 o 0,6 o 0,7 o 0,8, preferentemente 0,6, 0,7 o 0,8.

En consecuencia, la forma de realización previamente descrita también comprende un hidroxietil almidón (y los conjugados descritos aquí que comprenden el almidón hidroxilo etilo como así también los métodos descritos aquí emplean hidroxietil almidón) que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 40 kD y un grado de sustitución de 0,4 o 0.5 o 0,6 o 0,7 o 0,8, preferentemente 0,6, 0,7 o 0,8. En consecuencia, la forma de realización descrita arriba también comprende un hidroxietil almidón (y los conjugados descritos aquí que comprenden el almidón hidroxilo etilo como así también los métodos descritos aquí emplean hidroxietil almidón) que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 50 kD y un grado de sustitución de 0,4 o 0.5 o 0,6 o 0,7 o 0,8, preferentemente 0,6, 0,7 o 0,8. En consecuencia, la forma de realización previamente descrita también comprende un hidroxietil almidón (y los conjugados descritos aquí que comprenden el almidón hidroxilo etilo como así también los métodos descritos aquí emplean hidroxietil almidón) que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 60 kD y un grado de sustitución de 0,4 o 0.5 o 0,6 o 0,7 o 0,8, preferentemente 0,6, 0,7 o 0,8. En consecuencia, la forma de realización previamente descrita también comprende un hidroxietil almidón (y los conjugados descritos aquí que comprenden el almidón hidroxilo etilo como así también los métodos descritos aquí emplean hidroxietil almidón) que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 70 kD y un grado de sustitución de 0,4 o 0,5 o 0,6 o 0,7 o 0,8, preferentemente 0,6, 0,7 o 0,8. En consecuencia, la forma de realización previamente descrita también comprende un hidroxietil almidón (y los conjugados descritos aqui que comprenden el almidón hidroxilo etilo como así también los métodos descritos aquí emplean hidroxietil almidón) que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 80 kD y un grado de sustitución de 0,4 o 0,5 o 0,6 o 0,7 o 0,8, preferentemente 0,6, 0,7 o 0,8. En consecuencia, la forma de realización previamente descrita también comprende un hidroxietil almidón (y los conjugados descritos aquí que comprenden el almidón hidroxilo etilo como así también los métodos descritos aquí emplean hidroxietil almidón) que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 90 kD y un grado de sustitución de 0,4 o 0,5 o 0,6 o 0,7 o 0,8, preferentemente 0,6, 0,7 o 0,8. En consecuencia, la forma de realización previamente descrita también comprende un hidroxietil almidón (y los conjugados descritos aquí que comprenden el almidón hidroxilo etilo como así también los métodos descritos aquí emplean hidroxietil almidón) que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 100 kD y un grado de sustitución de 0,4 o 0,5 o 0,6 o 0,7 o 0,8, preferentemente 0,6, 0,7 o 0,8. En consecuencia, la forma de realización previamente descrita también comprende un hidroxietil almidón (y los conjugados descritos aquí que comprenden el almidón hidroxilo etilo como así también los métodos descritos aquí emplean hidroxietil almidón) que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 110 kD y un grado de sustitución de 0,4 o 0,5 o 0,6 o 0,7 o 0,8, preferentemente 0,6, 0,7 o 0,8. En consecuencia, la forma de realización previamente descrita comprende un hidroxietil almidón (y los conjugados descritos aquí que comprenden el almidón hidroxilo etilo como así también los métodos descritos aquí emplean hidroxietil almidón) que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 120 kD y un grado de sustitución de 0,4 o 0,5 o 0,6 o 0,7 o 0,8, preferentemente 0,6, 0,7 o 0,8. En consecuencia, la forma de realización previamente descrita comprende un hidroxietil almidón (y los conjugados descritos aquí que comprenden el almidón hidroxilo etilo como así también los métodos descritos aquí emplean hidroxietil almidón) que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 130 kD y un grado de sustitución de 0,4 o 0,5 o 0,6 o 0,7 o 0,8, preferentemente 0,6, 0,7 o 0,8. El ejemplo de HES que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 130 kD es un HES con un grado de sustitución entre 0,2 y 0,8, tales como 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, o 0,8, preferentemente de 0,4 y 0,7, tales como 0,4, 0,5, 0,6, o 0,7. En lo que respecta a la relación de sustitución C2:C6, dicha relación está preferentemente en el rango entre 2 y 20, de mayor preferencia en el rango entre 2 y 15, y aún de mayor preferencia en el rango entre 3 y 12. De acuerdo con otro forma de realización de la presente invención, también se pueden emplear las mezclas de hidroxietil almidones que tienen diferente peso molecular promedio y/o diferentes grados de sustitución y/o diferentes relaciones de sustitución C2:CS. Por consiguiente, se pueden emplear las mezclas de hidroxietil almidones que tienen diferente peso molecular promedio, diferentes grados de sustitución y diferentes relaciones de sustitución C2:CS, o que tienen diferente peso molecular promedio y diferentes grados de sustitución y el mismo o aproximadamente la misma relación de sustitución ^-. e, o que tienen diferente peso molecular promedio y el mismo o aproximadamente el mismo grado de sustitución y diferentes relaciones de sustitución C2:CS, o que tienen el mismo o aproximadamente el mismo peso molecular promedio y diferente grados de sustitución y diferentes relaciones de sustitución C2:C6, o que tienen diferente peso molecular promedio y el mismo o aproximadamente el mismo grado de sustitución y la misma o aproximadamente la misma relación de sustitución C2:C6, o que tienen el mismo o aproximadamente el mismo peso molecular promedio y diferentes grados de sustitución y la misma o aproximadamente la misma relación de sustitución C2:C6, o que tienen el mismo o aproximadamente el mismo peso molecular promedio y el mismo o aproximadamente el mismo grado de sustitución y diferentes relaciones de sustitución C2:CS, o que tienen aproximadamente el mismo peso molecular promedio y aproximadamente el mismo grado de sustitución y aproximadamente la misma relación de sustitución C2:C5. En diferentes conjugados y/o diferentes métodos de acuerdo con la presente invención, se puede emplear un hidroxialquil almidón diferente, preferentemente diferentes hidroxietil almidones y/o diferentes mezclas de hidroxialquil almidón, preferentemente diferentes mezclas de hidroxietil almidón. De acuerdo con un forma de realización de la presente invención, el grupo funcional Z de la proteína es un grupo aldehido o un grupo ceto. Por consiguiente, la presente invención se refiere a un método y los conjugados descritos arriba, en donde el grupo funcional Z de la proteína es un grupo aldehido o un grupo ceto. Si bien no existen restricciones generales en cuanto a la ubicación del grupo aldehido o del grupo ceto dentro de la proteina, de acuerdo con una forma de realización preferida de la presente invención, el grupo aldehido o el grupo ceto está ubicado en un carbohidrato de la cadena lateral de la proteína. Por consiguiente, en el contexto de este forma de realización, se emplea una proteína glicosilada. Como proteína glicosilada, se puede emplear cualquier G-CSF glicosilado, tal como Granocyte® .

En el contexto de la presente invención, el término "carbohidrato de cadena lateral" se refiere a los hidroxialdehídos o hidroxicetonas, como así también a sus modificaciones químicas (ver Rómpp Chemielexikon, Thieme Verlag Stuttgart , Alemania, 9na. edición 1990, Volumen 9, páginas 2281-2285 y la bibliografía citada allí) . Además, también se refiere a derivados de restos de carbohidrato naturales, tales como galactosa, ácido N-acetilneuramínico y N-acetil-galactosamina, etc. En caso de que se emplee un mutante de G-CSF M-glicosilado, el resto de carbohidrato puede ser mañosa. En un forma de realización aún más preferida, el grupo aldehido o el grupo ceto- forma parte de un residuo de galactosa del carbohidrato de cadena lateral . Este residuo de galactosa se puede hacer disponible para la reacción con el grupo funcional A, comprendido en el polímero o el derivado de polímero, mediante la eliminación de ácidos siálicos terminales, seguida de oxidación, según se describe a continuación. En una forma de realización todavía más preferida, el polímero o el derivado de polímero que comprenden un grupo funcional A se une a un residuo de ácido siálico de las cadenas laterales del carbohidrato, t preferentemente el residuo de ácido siálico terminal del carbohidrato de cadena lateral .

La oxidación de los restos de carbohidrato terminales se puede realizar química o enzimáticamente . Los métodos para la oxidación química de los restos de carbohidrato de los polipéptidos son conocidos en el arte e incluyen el tratamiento con peryodato (Chamow et al., 1992, J. Biol. Chem., 267, 15916-15922). En principio es posible oxidar cualquier radical carbohidrato, ya sea que esté o no en posición terminal, mediante oxidación química. Sin embargo, si se eligen condiciones de reacción suaves, es posible preferentemente la oxidación del ácido siálico terminal de un carbohidrato de cadena lateral, para producir el grupo aldehido o el grupo ceto . De acuerdo con una forma de realización de la presente invención, dichas condiciones de reacción suaves se refieren a hacer reaccionar la proteína con una solución acuosa de peryodato adecuada, que tiene una concentración de peryodato preferida, en un rango entre 1 y 50 mM, de mayor preferencia entre 1 y 25 mM y, especialmente, preferentemente entre 1 y 10 mM, tal como aproximadamente 1 mM, y a la temperatura de reacción preferida entre 0 y 40°C, y, especialmente, preferentemente entre 0 y 21°C, tal como aproximadamente 0°C, y un tiempo de reacción preferido entre 5 min y 5 h, de mayor preferencia entre 10 min y 2 h y, especialmente, preferentemente entre 10 min. y 1 h, tal como aproximadamente 1 h. La relación molar preferida peryodato : roteína está entre 1:200 y 1:1 y de mayor preferencia entre 1:50 y 1:5, tal como aproximadamente 15:1. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un método y un conjugado, según lo antes descrito, donde antes de la reacción entre la proteína y el polímero o el derivado de polímero, se hace reaccionar una proteína glicosilada con una solución de peryodato, para producir una proteína que tiene un grupo aldehido o un grupo ceto ubicado en la cadena lateral del carbohidrato oxidado. Alternativamente, el carbohidrato de cadena lateral se puede oxidar enzimáticamente . Las enzimas para la oxidación del carbohidrato de cadena lateral individual son conocidas en el arte, por ej . , en el caso de galactosa, la enzima es la galactosa oxidasa Si se tiene la intención de oxidar los restos de galactosa terminales, será necesario a la larga eliminar los ácidos siálicos terminales (parcial o completamente) si el polipéptido se ha producido en células capaces de unir ácidos siálicos a cadenas de carbohidrato, por ej . en células de mamífero o en células que han sido genéticamente modificadas para que puedan unir ácidos siálicos a cadenas de carbohidrato. Los métodos químicos o enzimáticos para la remoción de los ácidos siálicos son conocidos en el arte (Chaplin y Kennedy (eds.), 1996, Carbohydrate Analysis: a practical approach, especialmente el Capítulo 5 Montreuill, Glycoproteins, páginas 175-177; IR.L Press Practical approach series (ISBN 0-947946-44-3)). De acuerdo con otra forma de realización preferida de la presente invención, el grupo aldehido o el grupo ceto puede estar ubicado en el extremo N-terminal de la proteína y es accesible por oxidación adecuada. Especialmente en el caso de que el grupo hidroxi que contiene un aminoácido esté ubicado en el extremo N-terminal de la proteína, tales come treonina o serina, la oxidación de dicho aminoácido N-terminal se puede llevar a cabo en dirección al grupo ceto o al grupo aldehido mencionados. La treonina es el aminoácido N-terminal en el G-CSF de origen humano. Una serina o treonina N-terminal adicional se puede introducir en cualquier proteína que muestre actividad tipo G-CSF, mediante métodos de biología molecular. Esta proteína o la proteína que expresa la secuencia de aminoácidos humana se puede producir mediante su expresión en células procariotas o eucariotas, tales como células de bacterias, mamíferos, insectos o levaduras, y que pueden ser o no ser glicosiladas . Como método para la oxidación química del aminoácido N-terminal adecuado, puede aplicarse cualquier método posible, si bien el preferido es la oxidación con peryodato. De acuerdo con otra forma de realización preferida de la presente invención, dichas condiciones de reacción suaves se refieren a hacer reacciona la proteína con una solución acuosa de peryodato adecuada, que tiene una concentración de peryodato preferida en el rango entre 1 y 50 mM, de mayor preferencia entre 1 y 25 mM y especialmente preferentemente entre 1 y 10 mM, tal como aproximadamente 1 mM, y a una temperatura de reacción preferida entre 0 y 40°C y, especialmente, preferentemente entre 0 y 21°C, tal como aproximadamente 0°C,- y para un tiempo de reacción preferido entre 5 min y 5 h, de mayor preferencia entre 10 min y 2 h y, especialmente, preferentemente entre 10 min. y 1 h, tal como aproximadamente 1 h. La relación molar preferida peryodato :proteína está entre 1:200 y 1:1 y de mayor preferencia entre 1:50 y 1:5, tal como aproximadamente 15 : 1. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un método y a un conjugado antes descrito, en donde el grupo aldehido o el grupo ceto están ubicados en un carbohidrato de cadena lateral de la protelna y/o en el grupo N-terminal de la protelna. Habiéndose . glicosilado post-traduccionalmente el patrón oligosacárido de las proteínas producidas en células eucariotas, no son idénticas a las proteínas derivadas del ser humano. Asimismo, muchas proteínas glicosiladas no tienen la cantidad deseada de residuos de ácido siálico terminal, que además enmascara a otro resto de carbohidrato, tal como un residuo de la galactosa. Esos otros restos de carbohidrato, tal como un residuo de galactosa; sin embargo, si no se enmascaran, pueden ser responsables de desventajas tales como la reducción de la semivida plasmática de la proteína, en los posibles usos de la proteína como medicamento. Fue sorprendente descubrir que es posible resolver, al menos, la desventaja antes mencionada, proveyendo un conjugado de proteína formado por un polímero de hidroxialquil almidón, preferentemente un polímero de hidroxietil almidón, unido en forma covalente, por ej . a través de una unión oxima, según se revela más adelante, a un resto de carbohidrato del carbohidrato de la cadena lateral de la proteína, ya sea directamente o a través de, por lo menos, un compuesto conector tales como uno o dos compuestos conectores . En consecuencia, al parecer acoplando un polímero de hidroxialquil almidón o un derivado, preferentemente un polímero de hidroxietil almidón o un derivado, por lo menos a un carbohidrato de cadena lateral de una proteína glicosilada, se compensa la falta de residuos de carbohidrato terminales adecuados en una cadena lateral de carbohidrato. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, proporcionándole al conjugado respectivo un polímero de hidroxialquil almidón o un derivado, preferentemente un polímero de hidroxietil almidón o un derivado, unido al radical del carbohidrato oxidado, según lo antes descrito, no sólo compensa la desventaja en el campo de uso deseado, sino que también proporciona un conjugado de la proteína con mejores características que las correspondientes a la respectiva proteína natural. Por consiguiente, de acuerdo con la presente invención, los conjugados respectivos tienen un efecto compensatorio y hasta sinérgico sobre la proteína. También es posible que aun proteínas idénticas a las proteínas humanas o que son proteínas humanas no tengan la cantidad deseada de residuos adecuados que enmascaren los residuos terminales de carbohidrato, tales como residuos de ácido siálico en restos de carbohidrato naturales. En estos casos, al proporcionarle al conjugado respectivo un polímero de hidroxialquil almidón o un derivado, preferentemente un polímero de hidroxietil almidón o un derivado, unido al resto de carbohidrato oxidado, según lo antes descrito, no sólo se resuelve y compensa la desventaja de una proteína producida en forma artificial, sino que también mejora las características de la proteína natural . En cuanto al grupo funcional del hidroxialquil almidón, preferentemente hidroxietil almidón o un derivado, que está unido al grupo aldehido o al grupo ceto del resto de carbohidrato oxidado de la proteína, se hace referencia al grupo funcional A, que se da a conocer a más adelante. Este concepto general, no sólo se aplica al G-CSF glicosilado, sino también principalmente a todos los glicosilados que tienen la mencionada falta de residuos de carbohidrato terminales . Entre otros se puede mencionar a la eritropoyetina (EPO) , el interferón beta la (IFN beta la), ATIII, factor VII, factor VIII, factor IX, alfal-antitripsina (A1AT) , htPA, o GM-CSF. Por consiguiente, la presente invención también se refiere al uso de hidroxialquil almidón, preferentemente hidroxietil almidón o un derivado, para compensar la falta de residuos de carbohidrato terminales, preferentemente residuos de ácido siálico, en restos de carbohidrato naturales o unidos post-traduccionalmente de una proteina, acoplando en forma covalente el almidón o su derivado, por lo menos a un resto de carbohidrato oxidado de una proteína que tiene, por lo menos, un grupo ceto o aldehido. En consecuencia, la presente invención también se refiere a un método para compensar la falta de residuos de carbohidrato terminales, preferentemente residuos de ácido siálico, en restos de carbohidrato naturales o unidos post-traduccionalmente de una proteína, acoplando en forma covalente hidroxialquil almidón, con preferencia hidroxietil almidón, o un derivado del mismo por lo menos a un resto de carbohidrato oxidado de una proteína que tiene, por lo menos, un grupo ceto o aldehido, con preferencia mediante un enlace oxima. Asimismo, la presente invención también se refiere a un conjugado formado por una unión covalente de un hidroxialquil almidón, preferentemente hidroxietil almidón, o un derivado, por lo menos, a un resto de carbohidrato oxidado de una proteína, siendo dicha proteína aislada de fuentes naturales o producida por la expresión de células eucariotas, tales como células de mamíferos, insectos o levaduras; teniendo dicho resto de carbohidrato, por lo menos, un grupo ceto o aldehido, donde el conjugado tiene las mismas o mejores características que la proteína respectiva no modificada en el campo de uso deseado, preferentemente como medicamento. En caso de que el grupo funcional Z de la proteína sea un grupo aldehido o un grupo ceto, el grupo funcional A del polímero o de un derivado, comprende un grupo amino, de acuerdo con la estructura -NH- . Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un método y un conjugado, según se describe arriba, en donde el grupo funcional A que puede ser sometido a una reacción con el extremo reductor del polímero opcionalmente oxidado, comprende un grupo amino, de acuerdo con la estructura -NH- . De acuerdo con una forma de realización preferida de la presente invención, este grupo funcional A es un grupo que tiene la estructura R ' -NH- donde R ' es un hidrógeno o un residuo alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, arilocicloalquilo, alcarilo o cicloalquiloarilo; donde el residuo cicloalquilo, arilo, aralquilo, arilocicloalquilo, alcarilo o cicloalquiloarilo puede estar unido directamente al grupo H o, de acuerdo con otra forma de realización, puede estar unido por un puente oxígeno al grupo NH. Los residuos alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, arilocicloalquilo, alcarilo, o cicloalquiloarilo pueden estar sustituidos adecuadamente. Como sustituyentes preferidos, se puede mencionar a los halógenos, tales como F, Cl o Br. Los residuos R' especialmente preferidos son hidrógeno, los grupos alquilo y alquiloxi, y aún más preferidos son el hidrógeno y los grupos alquilo y alquiloxi no sustituidos . Entre los grupos alquilo y alquiloxi, los preferidos son los grupos con 1, 2, 3, 4, 5, o 6 átomos de C . Los de mayor preferencia son los grupos metilo, etilo, propilo, isopropilo, metoxi, etoxi, propoxi e isopropoxi. Especialmente preferidos son los grupos metilo, etilo, metoxi, etoxi y, en particular, la preferencia recae en metilo o metoxi . Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un método y un conjugado, según lo antes descrito, donde ,R' es hidrógeno o un grupo metilo o metoxi. De acuerdo con otra forma de realización preferida de la presente invención, el grupo funcional A tiene la estructura R'-NH-R"-, donde R" preferentemente comprende la unidad estructural -NH- y/o la unidad estructural -(C=G)-, donde G es O o S, y/o la unidad estructural -S02-. De acuerdo con las formas de realización más preferidas, el grupo funcional R" se selecciona entre el grupo que consiste en | donde, si G está presente dos veces, es independientemente 0 o S. Por consiguiente, los grupos funcionales A preferidos que comprenden un grupo amino -NH2, son, por ej . , donde G es 0 o S y, si está presente dos veces, independientemente 0 o S, y R' es metilo. Los grupos funcionales A especialmente preferidos que comprenden un grupo amino son los grupos aminooxi O H2N R1 H siendo H2N-0- el particularmente preferido, y el grupo hidrazido donde G es preferentemente 0 . Por consiguiente , la presente invención también se refiere a un método , según lo antes descrito, en donde el grupo funcional Z de la proteina es un grupo aldehido o un grupo ceto y el grupo funcional A es un grupo aminooxi o un grupo hidrazido. De acuerdo con un forma de realización especialmente preferida de la presente invención, A es un grupo aminooxi. , Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un conjugado, según lo antes descrito, en donde el grupo funcional Z de la proteína es un grupo aldehido o un grupo ceto y el grupo funcional A es un grupo aminooxi o un grupo hidrazido. De acuerdo con un forma de realización especialmente preferida de la presente invención, A es un grupo aminooxi . Cuando se lleva a cabo la reacción del grupo aminooxi del polímero o del derivado del polímero con el grupo aldehido o el grupo ceto de la proteína, se forma una unión oxima . Por consiguiente , la presente invención también se refiere a un conjugado, según lo antes descrito, en donde la unión covalente entre la proteína y el polímero o derivado del polímero es una unión oxima formada por reacción entre el grupo funcional Z de la proteína, siendo dicho grupo funcional Z un grupo aldehido o un grupo ceto y el grupo funcional A del polímero o del derivado del polímero, siendo dicho grupo funcional A un grupo aminooxi . Cuando se lleva a cabo la reacción del grupo hidrazido del polímero o derivado del polímero con el grupo aldehido o el grupo ceto de la proteína, se forma una unión hidrazona. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un conjugado, según lo antes descrito, en donde la unión covalente entre la proteína y el polímero o derivado del polímero es una unión hidrazona formada por reacción entre el grupo funcional Z de la proteína, siendo dicho grupo funcional Z un grupo aldehido o un grupo ceto y el grupo funcional A del polímero o derivado del polímero, siendo dicho grupo funcional A un grupo hidrazido. A fin de introducir un grupo funcional A en el polímero, no existen restricciones específicas dado que resulta un derivado polimérico que comprende el grupo funcional A. De acuerdo con una forma de realización preferida de la presente invención, el grupo funcional A se introduce en el polímero haciendo reaccionar el polímero con, por lo menos, un compuesto bifuncional, un grupo funcional del cual se puede hacer reaccionar, por lo menos, con un grupo funcional del polímero y, por lo menos, otro grupo funcional del por lo menos compuesto bifuncional que es el grupo funcional A o es uno que se puede modificar químicamente para producir el grupo funcional A. De acuerdo con una forma de realización de mayor preferencia aún, el polímero se hace reaccionar con el compuesto por lo menos bifuncional en su extremo reductor opcionalmente oxidado . En caso de que el polímero sea sometido a reacción con su extremo reductor no oxidado, el polímero tiene preferentemente la constitución en donde en la fórmula (I) , se incluye la forma aldehídica del extremo reductor no oxidado. En caso de que el polímero sea sometido a la reacción con su extremo reductor oxidado, el polímero tiene preferentemente la constitución de acuerdo con la fórmula (Ha) La oxidación del extremo reductor del polímero, preferentemente hidroxietil almidón, puede ser realizada de acuerdo con el método o la combinación de métodos que producen compuestos que tienen las estructuras arriba mencionadas (lia) y/o (Ilb) . Aunque la oxidación se puede realizar de acuerdo con todos los métodos adecuados o los métodos que den por resultado el extremo reductor oxidado del hidroxialquil almidón, se realiza preferentemente usando una solución alcalina de yodo, según lo descrito, por ej . , en DE 196 28 705 Al, cuyo respectivo contenido (ejemplo A, columna 9, líneas 6 a 24) se incorpora aquí como referencia. Como grupo funcional del compuesto bifuncional que, por lo menos, se puede hacer reaccionar con el extremo reductor del polímero opcionalmente oxidado, se puede usar cada grupo funcional que pueda formar una unión química con el extremo reductor oxidado opcionalmente del hidroxialquil almidón. De acuerdo con una forma de realización preferida de la presente invención, este grupo funcional comprende la estructura química -NH- . Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un método y a un conjugado según lo antes descrito, en donde el grupo funcional del compuesto por lo menos bifuncional, siendo dicho grupo funcional capaz de reaccionar con el extremo reductor opcionalmente oxidado del polímero, comprende la estructura -NH- . De acuerdo con una forma de realización preferida de la presente invención, este grupo funcional del compuesto por lo menos bifuncional es un grupo que tiene la estructura '-NH- donde R1 es hidrógeno o un residuo alquilo, cicloalquilo , arilo, aralquilo, arílocicloalquilo , alcarilo o cicloalquiloarilo , donde el residuo cicloalquilo, arilo, aralquilo, arilocicloalquilo, alcarilo o cicloalquiloarilo se puede unir directamente al grupo NH o, de acuerdo con otro forma de realización, se puede unir por un puente de oxígeno al grupo NH . Los residuos alquilo, cicloalquilo , arilo, aralquilo, arilocicloalquilo , alcarilo, o cicloalquiloarilo pueden estar sustituidos adecuadamente. Como sustitutos preferidos, se puede mencionar a los halógenos, tales como F, Cl o Br. Los residuos R' especialmente preferidos son hidrógeno, los grupos alquilo y alquiloxi, y aún más preferidos son el hidrógeno y los grupos alquilo y alquiloxi no sustituidos . Entre los grupos alquilo y alquiloxi, los grupos con 1, 2, 3, 4 , 5, o 6 átomos de C son los preferidos . Los de mayor preferencia son los grupos metilo, etilo, propilo, isopropilo, metoxi, etoxi, propoxi e isopropoxi . Los especialmente preferido son metilo, etilo, metoxi, etoxi y, en particular, la preferencia recae en metilo o metoxi . Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un método y un conjugado, según lo antes descrito, en donde R1 es hidrógeno o un grupo metilo o metoxi . De acuerdo con otra forma de realización preferida de la presente invención, el grupo funcional del compuesto por lo menos bifuncional tiene la estructura R'-NH-R"-, donde R" comprende preferentemente la unidad estructural -NH- y/o la unidad estructural -(C=G)-, donde G es O o S y/o la unidad estructural -SO2-. De acuerdo con las formas de realización más preferidas, el grupo funcional R" se selecciona entre el grupo que consiste en donde, si G está presente dos veces, es independientemente O o S. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un método y a un conjugado según lo antes descrito, en donde el grupo funcional del compuesto por lo menos bifuncional, siendo dicho grupo funcional capaz de reaccionar con el extremo reductor opcionalmente oxidado del polímero, se selecciona del grupo que consiste en donde G es O o S y si se presenta dos veces, independientemente O o S, y R' es metilo.

De acuerdo con un forma de realización de mayor preferencia aún de la presente invención, el grupo funcional del compuesto por lo menos bifuncional, siendo dicho grupo funcional capaz de reaccionar con el extremo reductor del polímero opcionalmente oxidado, y que comprende un grupo amino, es un grupo aminooxi H9N ^ R'^ N 2 H Prefiriéndose particularmente H2N-0-, o el grupo hidrazido H2N' donde G es preferentemente 0. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un método y un conjugado, según lo antes descrito, en donde ¦ el grupo funcional Z de la proteína es un grupo aldehido o un grupo ceto, y el grupo, funcional del compuesto por lo menos bifuncional, siendo dicho grupo funcional capaz de reaccionar con el extremo reductor del polímero opcionalmente oxidado, es un grupo aminooxi o un grupo hidrazido, preferentemente un grupo aminooxi. Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un conjugado, según lo antes descrito, en donde el grupo funcional Z de la proteína es un grupo aldehido o un grupo ceto, y el grupo funcional del compuesto por lo menos bifuncional, siendo dicho grupo funcional capaz de reaccionar con el extremo reductor del polímero opcionalmente oxidado, es un grupo aminooxi o un grupo hidrazido, preferentemente un grupo aminooxi . De acuerdo con una forma de realización aún de mayor preferencia de la presente invención el compuesto por lo menos bifuncional se hace reaccionar con el polímero en su extremo reductor no oxidado. De acuerdo con otra forma de realización más preferida aún de la presente invención, el compuesto por lo menos bifuncional que se hace reaccionar con el extremo reductor del polímero opcionalmente oxidado, comprende el grupo funcional A. El compuesto por lo menos bifuncional se puede someter primero a la reacción con el polímero para producir un derivado de polímero que posteriormente se hará reaccionar con la proteína a través del grupo funcional A. El compuesto por lo menos bifuncional puede hacerse reaccionar con el polímero primero para dar un derivado de polímero que se hace reaccionar posteriormente con la proteína a través del grupo funcional A. También es posible hacer reaccionar primero al compuesto por lo menos bifuncional a través del grupo funcional A con la proteína para producir un derivado de proteína que se hace reaccionar posteriormente con el polímero a través de, por lo menos, un grupo funcional ' del residuo del compuesto por lo menos bifuncional comprendido en el derivado de proteína. De acuerdo con una forma de realización preferida de la presente invención, el compuesto por lo menos bifuncional se hace reaccionar primero con el polímero. Por consiguiente, la presente invención se refiere a un método y un conjugado, según lo antes descrito, comprendiendo dicho método además hacer reaccionar el polímero en su extremo reductor no oxidado con un compuesto conector por lo menos bifuncional, que comprende un grupo funcional capaz de reaccionar con el extremo reductor no oxidado del polímero y un grupo A, antes de la reacción del derivado del polímero que comprende A con la proteína que comprende Z. El grupo funcional del compuesto conector por lo menos bifuncional que se hace reaccionar con el polímero y el grupo funcional A del compuesto conector por lo menos bifuncional que se hace reaccionar con el grupo funcional Z de la proteína se pueden separar mediante un espaciador adecuado. Entre otros , el espaciador puede ser un residuo hidrocarbonado lineal, ramificado y/o cíclico opcionalmente sustituido. Por lo general, el residuo hidrocarbonado tiene hasta 60, preferentemente hasta 40, de mayor preferencia hasta 20, de mayor preferencia hasta 10, de mayor preferencia hasta 6 y especialmente preferentemente hasta 4 átomos de carbono. Si están presentes heteroátomos , el grupo espaciador comprende, por lo general, entre 1 y 20, preferentemente entre 1 y 8, de mayor preferencia 1 y 6, de mayor preferencia 1 y 4 y especialmente preferentemente entre 1 y 2 lieteroátomos . Entre los heteroátomos , O es el preferido. El residuo hidrocarbonado puede incluir opcionalmente una cadena alquílica ramificada o un grupo arilo o un grupo cicloalquilo que tienen, por ej . , entre 5 y 7 átomos de carbono, o puede ser un grupo alquilo, un grupo alcarilo donde la parte del alquilo puede ser un grupo alquilo lineal y/o cíclico. De acuerdo con una forma de realización aún más preferida de la presente invención, los grupos funcionales se separan por una cadena hidrocarbonada lineal que tiene 4 átomos de carbono. De acuerdo con otra forma de realización preferida de la presente invención, los grupos funcionales se separan por una cadena hidrocarbonada lineal que tiene 4 átomos de carbono y, por lo menos, preferentemente un heteroátomo, en particular, preferentemente un átomo de oxígeno. De acuerdo con una forma de realización de mayor preferencia, por lo menos, el compuesto conector por lo menos bifuncional es un compuesto homobif ncional . Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un método de producir un conjugado, según lo antes descrito, donde el compuesto conector por lo menos bifuncional es un compuesto homobifuncional . De este modo, con referencia a los grupos funcionales preferidos del compuesto conector, dicho compuesto homobifuncional comprende, preferentemente, dos grupos aminooxi H2N-O- o dos grupos aminooxi R'-O-NH- o dos grupos hidrazido H2N-NH- (C=G) -, prefiriéndose los grupos aminooxi H2N-O- y los grupos hidrazido H2N-NH- (C=0) -, y prefiriéndose especialmente los grupos aminooxi H2N-0-. Entre todos los compuestos homobifuncionales concebibles que comprenden dos grupos hidrazido H2N-NH- (C=0) -, se prefieren las hidrazidas donde los dos grupos hidrazido están separados por un residuo hidrocarbonado que tiene hasta 60, preferentemente hasta 40, de mayor preferencia hasta 20, de mayor preferencia hasta 10, de mayor preferencia hasta 6 y especialmente preferentemente hasta 4 átomos de carbono. De mayor preferencia, el residuo hidrocarbonado tiene entre 1 y 4 átomos de carbono, por ejemplo 1, 2, 3, o 4 átomos de carbono. Sobre todo se prefiere el residuo hidrocarbonado que tiene 4 átomos de carbono. Por consiguiente, un compuesto homobifuncional de acuerdo con la fórmula es el preferido. De acuerdo con una forma de realización aún más preferida de la presente invención, el compuesto conector bifuncional es la carbohidrazida .

Según lo antes descrito, la presente invención también se refiere a un método y un conjugado, según lo antes descrito, en donde, por lo menos, el compuesto conector por lo menos bifuncional es un compuesto homobifuncional y comprende dos grupos aminooxi . En consecuencia, la presente invención también se refiere a un método y un conjugado, según lo antes descrito, en donde, por lo menos, el compuesto conector por lo menos bifuncional es un compuesto homobifuncional que comprende dos grupos aminooxi ¾?-0- . De acuerdo con lo antes descrito, el polímero se hace reaccionar preferentemente en su extremo reductor que no está oxidado antes de la reacción con el compuesto conector bifuncional. Por consiguiente, al someter a la reacción al compuesto homobifuncxonal preferido que comprende dos grupos aminooxi H2N-0- con el polímero se produce un derivado de polímero que comprende una unión oxima. Por consiguiente, dado que el grupo funcional Z de la proteína es un grupo aldehido o un grupo ceto que se hace reaccionar preferentemente con un grupo aminooxi del derivado polímero, la presente invención también se refiere a un conjugado, según lo antes descrito, comprendiendo dicho conjugado el polímero y la proteína, cada uno de ellos unido en forma covalente a un compuesto conector por una oxima o un enlace amino cíclico. Entre todos los compuestos homobifuncionales concebibles que comprenden dos grupos aminooxi H2N-0-, se prefieren los compuestos bifuncionales donde los dos grupos aminooxi está separados por un residuo hidrocarbonado que tiene entre 1 y 60, preferentemente entre 1 y 40, de mayor preferencia entre 1 y 20, de mayor preferencia entre 1 y 10, de mayor preferencia entre 1 y 6, y especialmente preferentemente 1 y 4 átomos de carbono. De mayor preferencia, el residuo hidrocarbonado tiene entre 1 y 4 átomos carbono, por ejemplo 1, 2, 3, o 4 átomos carbono. Sobre todo se prefiere, el residuo hidrocarbonado que tiene 4 átomos carbono. Aún de mayor preferencia, el residuo hidrocarbonado, tiene por lo menos un heteroátomo, de mayor preferencia un heteroátomo, sobre todo se prefiere un átomo de oxígeno. El compuesto O- [2- (2-aminooxi-etoxi) -etil] hidroxilamina de acuerdo con la fórmula es el preferido especialmente. Por consiguiente, la presente invención se refiere a un conjugado, según lo antes descrito, teniendo dicho conjugado una constitución de acuerdo con la fórmula HAS' preferentemente es HES ' . Los hidroxietil almidones particularmente preferidos, por ej . , son los hidroxietil almidones que tienen un peso molecular promedio de aproximadamente 10 kD y un GS de aproximadamente 0,4 o un hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 10 kD y un GS de aproximadamente 0,7 o un hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 12 kD y un GS de aproximadamente 0,4 o un hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 12 kD y un GS de aproximadamente 0,7 o un hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 18 kD y un GS de aproximadamente 0,4 o un hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 18 kD y un GS de aproximadamente 0,7 o un hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 50 kD y un GS de aproximadamente 0,4 o un hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 50 kD y un GS de aproximadamente 0,7. Preferentemente la reacción del polímero en su extremo reductor no-oxidado con el compuesto de unión debería llevarse a cabo en un sistema acuoso, especialmente en el caso de que el compuesto de unión mencionado sea un compuesto de unión hoirobifuncional que conprenden dos grupos aminooxi ¾N-0- En el contexto de la presente invención, el término "sistema acuoso" se usa para referirse a un solvente o mezcla de solventes que comprenden el agua, la escala está entre, por lo menos, 10% en peso, preferentemente, por lo menos, 50% en peso, de mayor preferencia, por lo menos, 80% en peso, aún de mayor preferencia, por lo menos, 90% en peso y hasta 100% en peso, sobre la base del peso correspondiente a los solventes. El medio preferido para la reacción es el agua. De acuerdo con otra forma de realización, se puede usar por lo menos otro solvente, en cuyo caso HAS, preferentemente HES, es soluble. Otros ejemplos de solventes son: DMF, dimetilacetamida y DMSO. No existen limitaciones específicas, en cuanto a las temperaturas que se pueden emplear durante la reacción, siempre que durante el proceso se obtenga el derivado polímero deseado. En caso de que el polímero se someta a la reacción con el compuesto de unión homobifuncional, ' que comprende dos grupos aminooxi H2N-0-, preferentemente O- [2- (2-aminooxi-etoxi) -etilo] hidroxilamina, la temperatura debe estar preferentemente en el rango entre 0 y 45°C, de mayor preferencia en el rango entre 4 y 30°C y especialmente preferentemente en el rango entre 15 y 25°C. El tiempo de reacción, para la reacción del polímero con el compuesto de unión homobifuncional que comprende dos grupos aminooxi H2N-0-, preferentemente O- [2- (2-aminooxi-etoxi) -etilo] hidroxilamina, puede ser adaptado a las necesidades especificas y, por lo general, está en el rango entre 1 h y 7 d, preferentemente en el rango entre 1 h y 3 d y de mayor preferencia entre 2 h y 48 h. El valor del pH para la reacción del polímero con el compuesto de unión homobifuncional que comprende dos grupos aminooxi ¾N-0-, preferentemente O- [2- (2-aminooxi-etoxi) -etilo] hidroxilamina, puede ser adaptado a las necesidades específicas, tales como, la naturaleza química de los reactivos. El valor del pH preferentemente está en el rango entre 4,5 y 9,5, de mayor preferencia en el rango entre 4,5 y 6,5. Los ejemplos específicos de condiciones de reactividad mencionados arriba, son, por ej . , una temperatura de reacción de aproximadamente 25°C y un pH de aproximadamente 5,5. El valor del pH adecuado para la reacción de la mezcla puede ser ajustado agregando, por lo menos, un buffer adecuado. Entre los buffers preferidos, se puede mencionar a los buffers acetato, fosfato y borato de sodio. Una vez formado el derivado del polímero, que comprende el polímero y el compuesto conector por lo menos bifuncional unido allí, se puede aislar de la mezcla de la reacción mediante, por lo menos, con un método adecuado. Si fuera necesario, el derivado polímero puede ser precipitado antes de aislarlo mediante, por lo menos, un método adecuado. Si se precipitara primero el derivado polímero, es posible, por ej . , poner en contacto la mezcla de la reacción, por lo menos, con un solvente o una mezcla de solventes que no sea el solvente ni la mezcla de solventes presentes en la mezcla de la reacción a las temperaturas adecuadas. De acuerdo, particularmente con una forma de realización preferida de la presente invención donde se usa como solvente un medio acuoso, preferentemente agua, la mezcla de la reacción se pone en contacto con 2-propanol, a una temperatura, preferentemente en el rango entre -20 y +50°C y especialmente preferentemente en el rango entre -20 y 25°C. El aislamiento del derivado polímero se puede realizar mediante el proceso adecuado que puede incluir uno o más de un paso. De acuerdo con una forma de realización preferida de la presente invención, el derivado polímero se separa primero de la mezcla de la reacción o de la mezcla de la mezcla de la reacción, por ej . , con una mezcla acuosa de 2-propanol, mediante uno de los métodos adecuados, tales como la centrifugación o la filtración. En un segundo paso, el derivado del polímero separado además se puede someter a tratamientos, tales como un postratamiento como diálisis, filtración centrifuga o filtración a presión, cromatografía de cambio de iones, cromatografía de fase invertida, HPLC, MPLC, filtración y/o liofilización de gel . De acuerdo con un forma de realización aún más preferido, se dializa primero el derivado polímero separado, preferentemente contra agua, y luego liofilizarlo hasta que el contenido de solvente del producto de la reacción sea suficientemente bajo, de acuerdo con las especificaciones deseadas del producto. La liofilización puede ser llevada a cabo con temperaturas entre 20 y 35°C, preferentemente entre 20 y 30 °C. El derivado del polímero aislado así, se vuelve a someter a la reacción, a través del grupo funcional A, con el grupo funcional Z de la proteína, Z es un grupo aldehido o un grupo ceto. En el caso especialmente preferido que A sea un grupo aminooxi H2N-0- para producir la unión oxima entre el derivado del polímero y la proteína, la reacción se lleva a cabo preferentemente en un medio acuoso, preferentemente agua, a la temperatura preferida en el rango entre 0 y 40°C, de mayor preferencia entre 4 y 25°C y especialmente preferentemente entre 15 y 25 °C. El valor del pH del medio de la reacción está preferentemente en el rango entre 4 y 10, de mayor preferencia en el rango entre 5 y 9 y especialmente preferentemente en el rango entre 5 y 7. El tiempo de reacción está preferentemente en el rango entre 1 y 72 h, de mayor preferencia en el rango entre 1 y 48 h y especialmente preferentemente en el rango entre 4 y 24 h. El conjugado puede ser sometido a otro tratamiento, por ejemplo, un post-tratamiento como diálisis, filtración centrífuga o filtración a presión, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía en fase reversa, HPLC, MPLC, filtración y/o liofilización de gel . De acuerdo con otro forma de realización de la presente invención,' el grupo funcional Z de la proteína es un grupo amino. Por consiguiente, la presente invención se refiere a un método y un conjugado, según lo antes descrito, en donde el grupo funcional Z de la proteína es un grupo amino. De acuerdo con otra forma de realización preferida de la presente invención, el grupo funcional A sometido a la reacción con el .grupo funcional Z que es un grupo amino es un reactivo del grupo carboxi. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un método y un conjugado, según lo antes descrito, en donde el grupo funcional Z es un grupo amino y el grupo funcional A del polímero o el derivado del polímero es un reactivo del grupo carboxi. De acuerdo con el primer forma de realización preferido de la presente invención, el reactivo del grupo carboxi se introduce en ' el polímero mediante la oxidación selectiva del polímero en su extremo reductor .

Por consiguiente, el polímero dentro del que se introduce el reactivo del grupo carboxi tiene preferentemente la constitución de acuerdo con la fórmula (Ha) oxidación del extremo reductor del polímero de acuerdo la fórmula (I) preferentemente hidroxietil almidón, se puede llevar a cabo de acuerdo con el método o los métodos de combinación que se producen en los compuestos que tienen las estructuras (Ha) y/o (Ilb) , arriba mencionadas . Aunque la oxidación puede ser llevada a cabo de acuerdo con cualquier método o métodos adecuados resultante en el extremo reductor oxidado del hidroxialquil almidón, preferentemente se lleva a cabo usando una solución alcalina de yodo, según lo descrito, por e j . , en DE 196 28 705 Al, cuyo respectivo contenido (ejemplo A, columna 9, líneas 6 hasta 24) se incorporan aquí para referencia . La introducción del reactivo del grupo carboxi dentro del polímero oxidado selectivamente en su extremo reductor, se puede llevar a cabo mediante todos los métodos posibles . El polímero oxidado puede ser empleado como tal o como sal, por ejemplo, sal de metal alcalino, preferentemente sal de sodio y/o de potasio. De acuerdo con un método preferido de la presente invención, el polímero que es selectivamente oxidado en su extremo reductor se hace reaccionar en el extremo reductor oxidado, por lo menos, con un alcohol, preferentemente , por lo menos , con . un alcohol acídico . Todavía se prefiere más a los alcoholes acídicos que tienen un valor pKA en el rango entre 6 y 12 , de mayor preferencia entre 7 y 11 a 25 °C . El peso molecular del alcohol acídico preferentemente está en el rango entre 80 y 500 g/mol , de mayor preferencia entre 90 y 300 g/mol y especialmente preferentemente entre 100 y 200 g/mol .

Los alcoholes acidicos adecuados son todos los alcoholes H-0-Ra que tienen un protón acidico y se pueden hacer reaccionar con el polímero oxidado para producir el respectivo éster polímero reactivo, preferentemente de todavía de mayor preferencia de acuerdo con la fórmula Los alcoholes preferidos son N-hidroxi succinimidas, tales como N-hidroxi succinimida o Sulfo-N-hidroxi succinimida, fenoles sustitutos adecuados, tales como p- nitrofenol o p-dinitrofenol u o ' -dinitrofenol, triclorofenol, tales como 2, 4, 6-triclorofenol o 2 , 4 , 5-triclorofenol, trifluorofenol, tales como 2 , , 6-trifluorofenol o 2,4,5- trifluorofenol, pentaclorofenol, pentafluorofenol o hidroxiazoles, tal como el hidroxibenzotriazol . Se prefiere especialmente las N-hidroxi succinimidas, con N-hidroxi succinimida y Sulfo-N-hidroxi succinimida, se prefiere especialmente a todos los alcoholes que se pueden emplear solos o en las combinaciones adecuadas de dos o más de ellos. En el contexto de la presente invención, también es posible emplear' el compuesto que libera el alcohol respectivo, por ej . , agregando diésteres del ácido carbónico. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un método y un conjugado, según lo antes descrito, en donde el polímero oxidado selectivamente en su extremo reductor activado haciendo reaccionar el polímero oxidado con un alcohol acídico, preferentemente con N-hidroxi succinimida y/o Sulfo-N-hidroxi succinimida. De acuerdo con la forma de realización todavía de mayor preferencia de la presente invención, el polímero que está selectivamente oxidado en su extremo reductor se hace reaccionar en el extremo reductor oxidado, por lo menos, con un diéster carbónico RB-0- (C=0) -0-Rc, en donde RB y Rc puede ser el mismo o diferente. Preferentemente, este método produce polímeros reactivos de acuerdo con la fórmula en donde HAS 1 es preferentemente HES ' .

Como compuestos diésteres carboxílieos adecuados, se pueden emplear los compuestos cuyos componentes alcohol son independientemente N-hidroxi succinimidas , tales como N-hidroxi succinimda o Sulfo-N-hidroxi succinimida, fenoles sustitutos adecuados, tales como p-nitrofenol o p-dinitrofenol u o 1 -dinitrofenol, triclorofenol , tales como 2 , 4 , 6-triclorofenol o 2 , 4 , 5-triclorofenol , trifluorofenol , tales como 2 , 4 , 6-trifluorofenol o 2 , 4 , 5-trifluorofenol , pentaclorofenol, pentafluorofenol o hidroxiazoles, tales como hidroxi benzotriazol . Se prefiere especialmente al carbonato de ?G, N 1 -disuccinimidil y al carbonato de Sulfo-?,?'-disuccinimidilo, pero se prefiere especialmente el carbonato de ?,?' -disuccinimidilo . Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un método y un conjugado, según lo antes descrito, en donde el polímero oxidado selectivamente en su extremo reductor activado haciendo reaccionar el polímero oxidado con carbonato de ?,?' -disuccinimidilo. El alcohol acídico se hace reaccionar con el polímero oxidado o con la sal " del polímero oxidado a una relación molar alcohol acídico rpolímero preferentemente entre 5:1 y 50:1, de mayor preferencia entre 8:1 y 20:1, a una temperatura de reacción preferida entre 2 y 40°C, de mayor preferencia entre 10 y 30°C y especialmente preferentemente entre 15 y 25°C. El tiempo de reacción está preferentemente en el rango entre 1 y 10 h, de mayor preferencia entre 2 y 5 h, de mayor preferencia entre 2 y 4 h y particularmente entre 2 y 3 h. El compuesto diéster carboxilico se ace reaccionar con el polímero oxidado ó la sal del polímero oxidado a una relación molar compuesto diéster:polímero preferentemente entre 1:1 y 3:1, de mayor preferencia entre 1:1 y 1,5:1. El tiempo de reacción está preferentemente en el rango entre 0,1 y 12 h, de mayor preferencia entre 0,2 y 6 h, de mayor preferencia entre 0,5 y 2 h y particularmente entre 0,75 y 1,25 h. De acuerdo con una forma de realización preferida de la presente invención, la reacción del polímero oxidado con alcohol acídico y/o diéster carbónico se lleva a cabo, por lo menos, con un solvente aprótico, particularmente preferentemente en un solvente aprótico anhidro que tiene un contenido de agua no mayor al 0,5 por ciento en peso, preferentemente no más de 0,1 por ciento en peso. Los solventes adecuados son, entre otros, dimetilsulfóxido (DMSO) , N-metil pirrolidona, dimetilacetamida (DMA) , dimetilformamida (DMF) y mezclas de dos o más de ellos. Las temperaturas de reacción están preferentemente en el rango entre 2 y 40°C, de mayor preferencia entre 10 y 30°C. Para reactivar el polímero oxidado, por lo menos, con un alcohol acídico, se emplea por lo menos, un agente activador adicional.

Los agentes activadores adecuados, entre otros, son el carbonildiimidazol , las carbodiimidas, tales como diisopropil carbodiimda (DIC) , diciclohexil carbodiimidas (DCC) , 1-etil-3 - (3 -dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) , con diciclohexil carbodiimidas (DCC) y el preferido especialmente es l-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) . Por consiguiente, la presente invención también se refiere 'a un método y a un conjugado, según lo antes descrito, donde el polímero oxidado en su extremo reductor, se hace reaccionar con un alcohol acídico en presencia de un agente activador adicional para producir el polímero éster reactivo. De acuerdo con la forma de realización especialmente preferida de la presente invención, la reacción del polímero oxidado con diéster carbónico y/o alcohol acídico se lleva a cabo en una actividad de base baja que se puede determinar, agregando la mezcla de reacción al agua con una relación de volumen de agua a la mezcla de reacción de 10:1. Antes de la adición, el agua que principalmente no debe contener ningún buffer, tiene un valor de pH de 7 a 25°C. Después de la adición de la mezcla de reacción y midiendo el valor del pH, se obtiene la actividad de base de la mezcla de reacción, que tiene un valor preferentemente no mayor de 9,0, de mayor preferencia no mayor de 8,0 y especialmente preferentemente no mayor de 7,5. De acuerdo con una forma de realización preferida de la presente invención, el polímero oxidado se hace reaccionar con W-hidroxi succinimida en DMA seca en ausencia de agua con EDC para dar selectivamente el N-hidroxi succinimido éster del polímero, de acuerdo con la fórmula de mayor preferencia con HAS' es HES ' . Sorprendentemente, de esta reacción no se obtienen productos secundarios resultantes de las reacciones de EDC con los grupos OH de HES, y la reacción de reordenamiento de la O-acil isourea formada por EDC y el polímero oxidado a la respectiva N-acil urea se suprime sorprendentemente. De acuerdo con otra forma de realización preferida de la presente invención, el polímero oxidado se hace reaccionar con carbonato de N, N ' -disuccinimidilo anhidro DMF y en ausencia de agente activador para dar selectivamente el polímero éster N-hidroxi succinimida de acuerdo con la fórmula de mayor preferencia con HAS' es HES', El polímero reactivo, según lo descrito más arriba, además se hace reaccionar preferentemente, por lo menos, con un grupo amino de la proteína para producir una unión amida, De acuerdo con la forma de realización preferida de la presente invención, el polímero reactivo se hace reaccionar con un grupo amino de la proteina. Por consiguiente, el presente se refiere a un conjugado que tiene preferentemente una constitución de acuerdo con la fórmula en donde el átomo N de la unión amida deriva de un amino de la proteína, de mayor preferencia con HAS' es HES1, el hidroxietil almidón preferentemente es el hidroxietil almidón que tienen un peso molecular promedio de aproximadamente 10 kD y un GS de aproximadamente 0,4 o hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 10 kD y un GS de aproximadamente 0,7 o hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 12 kD y un GS de aproximadamente 0,4 o hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 12 kD y un GS de aproximadamente 0,7 o hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 18 kD y un GS de aproximadamente 0,4 o hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 18 kD y un GS de aproximadamente 0,7 o hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 50 kD y un GS de aproximadamente 0,4 o hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 50 kD y un GS de aproximadamente 0,7. La reacción del polímero reactivo con la proteína se puede llevar a cabo combinando la reacción de la mezcla de preparación del reactivo polímero, es decir, sin aislación del polímero reactivo que, por lo menos, incluye 10, más preferentemente, por lo menos, 30 y de mayor preferencia aún, por lo menos, 50 por ciento en peso del polímero reactivo con una solución acuosa de la proteína, Las soluciones acuosas preferidas de la proteína están incluidas entre 0,05 y 10, de mayor preferencia entre 0,5 y 5 y de preferencia especial entre 0,5 y 2 por ciento en peso de la proteína, con un preferido pH entre 5,0 y 9,0, de mayor preferencia entre 6,0 y 9,0 y de preferencia especial entre 7,5 y 8,5. De acuerdo con la presente invención, también es posible purificar el polímero reactivo mediante, por lo menos, una precipitación preferentemente múltiple, por lo menos, con un agente de precipitación adecuado, tales como anhidro etanol, esopropanol y/o acetona para producir un sólido que incluye, por lo menos, 10, más preferentemente, por lo menos, 30 y de mayor preferencia aún, por lo menos, 50 por ciento en peso del reactivo polímero.

El polímero reactivo purificado se puede agregar a la solución acuosa de la proteína, También es posible agregar una solución del polímero reactivo purificado a la solución acuosa de la proteína. De acuerdo con la forma de realización preferida de la presente invención, la reacción del polímero reactivo con la proteína para producir una unión amida se lleva a cabo a una temperatura entre 2 y 40°C, de mayor preferencia entre 5 y 35°C y especialmente entre 10 y 30°C y un pH preferido entre 7,0 y 9,0, preferentemente entre 7,5 y 9,0 y de preferencia especial entre 7,5 y 8,5, con un tiempo de reacción preferido entre 0,1 y 12 h, de mayor preferencia entre 0,5 y 5 h, de mayor preferencia entre 0,5 y 3 h, todavía de mayor preferencia entre 0,5 y 72 h y de preferencia especial entre 0,5 y 1 h, la relación molar del reactivo éster polímero: roteína es preferentemente entre 1:1 y 70:1, de mayor preferencia entre 5:1 y 50:1 y de preferencia especial entre 10 :1 y 50:1. De acuerdo con otra forma de realización de la presente invención, el polímero que está oxidado selectivamente en su extremo reductor se hace reaccionar en el extremo reductor oxidado con una azolida, tales como carbonildiimidazol o carbonilo dibenzimidazol para producir un polímero que tiene un grupo carboxi reactivo, En el caso del carbonildiimidazol, se produce el derivado del polímero reactivo de acuerdo con la fórmula en donde HAS' es preferentemente HES 1 , La imidazolida resultante de la reacción del polímero con la azolida puede ser preferentemente sometida a la reacción con un grupo amino de la proteína para producir una unión amida, También es posible la reacción, si estuviera presentecon un grupo hidroxi de la proteína para producir una unión éster o con un grupo tio de la proteína para producir una unión tio éster o, si estuviera presente, con un grupo carboxi de la proteína para producir una unión - (C=0) -O- (C=0) - . De acuerdo con otra forma de realización de la presente invención, el polímero que tiene un grupo A carboxi reactivo resultante de la reacción del extremo reductor del polímero selectivamente oxidado con uno de los compuestos antes mencionados, preferentemente, por lo menos, con uno de los alcoholes acídicos y/o, por lo menos, uno de los compuestos diéster carbónico, se puede unir al grupo funcional Z de la proteína a través de, por lo menos, una compuesto de la unión, En caso de que se use un compuesto de la unión, el compuesto mencionado, por lo menos, es un compuesto bifuncional que tiene, por lo menos, un grupo funcional Fi que se puede hacer reaccionar con el grupo funcional A del derivado del polímero y, por lo menos, un grupo funcional F2 que se puede hacer reaccionar con el grupo funcional Z de la proteína o un grupo funcional F2 que se puede modificar químicamente para someterlo a la reacción con el grupo funcional Z de la proteína, La modificación química puede ser, por ej , una reacción del grupo funcional F2 con un grupo funcional F3 de compuesto de la unión o una oxidación o una reducción del grupo funcional F2 adecuado, En caso de que se use, por lo menos, un compuesto de la unión, la reacción no se limita al grupo amino de la proteína sino que, según la naturaleza química de los grupos funcionales del compuesto de la unión o los compuestos de la unión, se puede usar para formar una unión con cadun grupo funcional de la proteína adecuado, tales como un grupo carboxi, un grupo carboxi reactivo, un grupo aldehido, un grupo ceto, un grupo tio, un grupo amino o un grupo hidroxi, En caso de que se usen dos compuestos de la unión, se emplea el compuesto de la primera unión que tiene, por lo menos, un grupo funcional Fj. que se puede hacer reaccionar con un reactivo del grupo del polímero A carboxi, tales como un grupo amino, un grupo tio, un grupo hidroxi, o un grupo carboxi, Asimismo, el primer compuesto de la unión, por lo menos, tiene otro grupo funcional F2 que se puede hacer reaccionar, por lo menos, con un grupo funcional F3 del segundo compuesto de la unión, Como grupo funcional F2, entre otros, se mencionan los siguientes grupos funcionales: C-C- uniones dobles o C-C- uniones triples o C-C-uniones aromáticas ; - un grupo tio o los grupos hidroxi ; ácido alquilsulfónico hidrazida, ácido arilsulfónico hidrazida; 1,2-dioles; 1, 2-aminoalcohol.es; - 1,2 amino-tioalcoholes; azidas; el grupo amino -NH2 o derivados de los grupos amino que incluyen la unidad estructural -NH-, tales como los grupos aminoalquilos , grupo aminoarilo, grupos aminoaralquilos , o grupos alcarliamino; el grupo hidroxilamino -0-NH2, o derivados del grupo hidroxilamino que incluye la unidad estructural -0-NH- , tales como los grupos hidroxilalquilamino, grupos hidroxilarilamino, grupos hidroxilaralquilamino, o grupos hidroxalalcarilamino; grupos alquiloxiamino, grupos ariloxiamino, grupos a alquiloxiamino, o grupos alcariloxiamino, cada uno incluy la unidad estructural -NH-0- ; residuos que tienen un grupo carbonilo, -Q-C (=G) -M, en donde G es 0 o S, y M es, por ejemplo, -OH O -SH; un grupo alquiloxi, un grupo ariloxi, un grupo aralquiloxi, o un grupo alcariloxi; un grupo alquilotio, un grupo arilotio, un grupo aralquilotio, o un grupo alcarilotio; un grupo alquilocarboniloxi , un grupo arilocarboniloxi , un grupo aralquilocarboniloxi , un grupo alcarilocarboniloxi ; esteres activados, tales . como esteres de hidroxilaminas que tienen una estructura imida, tales como N-hidroxisuccinimida o que tienen una unidad estructural O-N donde N es parte de un compuesto heteroarilo o con G = 0 y Q ausentes, tales como compuestos ariloxi con residuo arilo sustituido, tales como pentafluorofenilo, paranitrofenilo o triclorofenilo; en donde Q está ausente o NH o un heteroátomo, tales como S o O; -NH-N¾, o -NH-NH-; -N02; - el grupo nitrilo; - ' grupos carbonilo, tales como el grupo aldehido o el grupo ceto; el grupo carboxi ; el - grupo N=C=0 o el - grupo N=C=S ; - grupos vinilhaluro, tales como el vinilyoduro o el grupo vinyl bromuro o triflato; -C=C-H; - (C=NH2Cl) -OAlquilo grupos - (C=0) -CH2-Hal en donde Hal es Cl, Br, o I; -CH=CH-S02-; un grupo disulfuro que incluye la estructura -S-S-; el grupo el grupo en donde F3 es un grupo susceptible de formar una unión química con uno de los grupos antes mencionados y se selecciona preferentemente entre los grupos antes mencionados, Asimismo, el segundo compuesto de la unión, por lo menos, tiene un grupo funcional que es susceptible de reacción con el grupo funcional Z de la proteina que, por ej, es un grupo amino, un grupo tio, un grupo carboxi, un grupo carboxi reactivo, un grupo aldehido, un grupo ceto o un grupo hidroxi, En caso de que se use un compuesto de unión para unir el polímero y la proteína en forma covalente, el polímero se puede hacer reaccionar con elcompuesto de unión y el derivado del polímero resultante se hace reaccionar con la proteína, o la proteína se puede hacer reaccionar con el compuesto de unión y el derivado resultante de la proteína se hace reaccionar con el polímero. En caso de que se usen los dos compuestos de unión Ll y L2, es posible hacer reaccionar el polímero con Ll, el derivado del polímero resultante reaccionar con L2 y el derivado del polímero resultante reaccionar con la proteína o la proteína reaccionar con L2, el derivado de la proteína resultante reaccionar con Ll y el derivado de la proteína resultante reaccionar con el polímero, También es posible hacer reaccionar el polímero con Ll y la proteína reaccionar con L2 y el derivado del polímero reaccionar con el derivado de la proteína. Además, es posible hacer reaccionar Ll con L2, el compuesto resultante reaccionar con el polímero y el polímero derivado resultante con la proteína. Además, es posible hacer reaccionar Ll con L2, el compuesto resultante reaccionar con la proteína y el derivado de la proteína resultante reaccionar con el polímero. De acuerdo con una forma de realización especialmente preferida de la presente invención referente a la introducción de un grupo carboxi reactivo en el polímero, el grupo carboxi reactivo se introduce en el polímero cuyo extremo reductor no está oxidado, sometiendo a la reacción, por lo menos, un grupo hidroxi del polímero con un diéster carbónico. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un método y un conjugado, según lo descrito más arriba, en donde A es un grupo carboxi reactivo, y en donde A se introduce en el polímero cuyo extremo reductor no está oxidado, haciendo reaccionar, por lo menos, un grupo hidroxi del polímero, por lo menos, con un diester carbónico, diéster carbónico ¾-O- (C=0)-0-Rc, e donde ¾y ¾ puede ser el mismo o diferente. De acuerdo con otra forma de realización de la presente invención, el polímero cuyo extremo reductor no está oxidado, se hace reaccionar, por lo menos, un grupo hidroxi con un azolida, tales como carbonildiimidazol , carbonil-di- (1, 2 , 4-triazol) y carbonilo dibenzimidazol para producir un polímero que tiene un grupo carboxi reactivo. Como compuestos diéster carbónico adecuados, se pueden emplear los compuestos cuyos componentes alcohol son independientemente N-hidroxi succinimidas , tales como N-hidroxi succinimida o Sulfo-N-hidroxi succinimida, fenoles sustituidos adecuados, tales como p-nitrofenol , o,p-dinitrofenol o, o 1 -dinitrofenol , triclorofenol , tales como .2 , 4 , 6-triclorofenol o 2 , , 5-triclorofenol , trifluorofenol , tales como 2 , 4 , 6-trifluorofenol o 2 , 4 , 5-trifluorofenol , pentaclorofenol, pentafluorofenol , o hidroxiazoles, tales como hidroxi benzotriazol . Se prefiere especialmentes son los compuestos diéster carbónico simétricos, RB y e así sea el mismo, El componento alcohol del diéster carbónico se seleccionan preferentemente entre el grupo que consiste en N-hidroxi succinimida, N-hidroxi succinimida sulfonados, N-hidroxi benzotriazol , y fenoles sustituidos nitro- y halógeno, Entre otros, los preferidos son nitrofenol, dinitrofenol , triclorofenol , trifluorofenol , pentaclorofenol y pentafluorofenol . Se prefiere especialmentes son el carbonato de ?,?'-disuccinimidilo y el carbonato de de Sulfo-?,?'-disuccinimidilo y el carbonato de ?,?' -disuccinimidilo es el Se prefiere especialmente. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un hidroxialquil almidón derivado, preferentemente un hidroxietil almidón derivado, en donde, por lo menos, un grupo hidroxi, preferentemente, por lo menos, dos grupos hidroxi del almidón mencionado se sometieron a la reacción con un compuesto diéser carbóico para producir el éster reactivo respectivo. De acuerdo con la forma de realización preferida de la presente invención, la reacción del polímero cuyo extremo reductor no es oxidado, por lo menos, con un compuesto diéster carbónico se lleva a cabo a una temperatura entre 2 y 40°C, de mayor preferencia entre 10 y 30°C y especialmente entre 15 y 25 °C y el tiempo de reacción preferido entre 0,5 y 5 h, de mayor preferencia entre 1 y 3 h, y de preferencia especial entre 2 y 3 h. La relación molar del compuesto de diéster carbónico ·. polímero depende del grado de sustitución del polímero referente a la cantidad de grupos hidroxi sometidos a la reacción con compuesto diéster carbónico relativo a la cantidad de grupos hidroxi presentes en el polímero no reactivo . De acuerdo con la forma de realización preferida de la presente invención, la relación molar del compuesto de diéster carbónico : unidades de anhidroglucosa están en la escala entre 1:2 y 1:1000, de mayor preferencia entre 1:3 y 1:100 y de preferencia especial entre 1:10 y 1:50, para producir un grado de sustitución en la escala entre 0,5 y 0,001, preferentemente entre 0,33 y 0,01 y de preferencia especial entre 0,1 y 0,02. De acuerdo con la forma de realización preferido de la presente invención, la reacción del polímero, cuyo extremo reductor no es oxidado, se lleva a cabo con diéster carbónico, por lo menos, en un solvente aprótico, de preferencia particular en un solvente aprótico anhidro que tiene un contenido de agua no menor a 0,5 por ciento en peso, preferentemente no mayor a 0,1 por ciento en peso, Los solventes adecuados, entre otros, son dimetilsulfóxido (D SO) , N-metilpirrolidona, dimetilacetamida (DMA.) , dimetilformamida (D F) y la mezcla de dos o más de ellos. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un método y un conjugado, según lo descrito más arriba, en donde la reacción de, por lo menos, un grupo hidroxi del polímero cuyo extremo reductor no está oxidado con el diéster carbónico para producir un grupo éster reactivo A se lleva a cabo en solvente un anhidro aprótico polar, el solvente preferentemente es dimetilo de acetamida, dimetilformamida o una mezcla de ellos. La reacción del polímero reactivo que incluye, por lo menos, un grupo éster reactivo, preferentemente, por lo menos, dos grupos éster reactivo, con la proteína para producir, por lo menos, una unión amida, preferentemente, por lo menos, dos uniones amida, se puede llevar a cabo combinando la reactividad de la mezcla de la preparación del polímero reactivo, es decir, sin aislación del polímero reactivo, que incluye, por lo menos, 5, más preferentemente, por lo menos, 10 y de mayor preferencia aún, por lo menos, 15 por ciento en peso del polímero reactivo, con una solución acuosa de la proteína, Las soluciones acuosas de la proteína están entre 0,05 y 10, de mayor preferencia entre 0,5 y 5 y de preferencia especial entre 0,5 y 2 por ciento en peso de la proteína con un pH preferido entre 7,0 y 9, de mayor preferencia entre 7,5 y 9 y de preferencia especial entre 7,5 y 8,5. De acuerdo con la presente invención, también es posible purificar el reactivo polímero, por lo menos, mediante una, preferentemente mediante múltiples precipitaciones, por lo menos, con un agente de precipitación adecuado, tales como etanol anhidro, esopropanol y/o acetona para producir un sólido que incluye, por lo menos, 20, más preferentemente, por lo menos, 50 y de mayor preferencia aún, por lo menos, 80 por ciento en peso del polímero reactivo. El polímero reactivo purificado se puede agregar a la solución acuosa de la proteína, También es posible agregarle una solución del polímero reactivo purificado a la solución acuosa de la proteína. De acuerdo con la forma de realización preferida de la presente invención, la reacción del polímero reactivo con la proteína para producir, por lo menos, una, preferentemente, por lo menos, dos uniones amida se lleva a cabo a temperaturas entre 2 a 40°C, de mayor preferencia entre 5 y 35°C y especialmente entre 10 y 30°C y el pH preferido entre 7,5 y 9,5, preferentemente entre 7,5 y 9 y de preferencia especial entre 7,5 y 8,5, con un tiempo reactividad preferido entre 0,5 y 5 h, de mayor preferencia entre 0,5 y 3 h y de preferencia especial entre 0,5 y 1 h, la relación molar del ester polímero reactivo :proteína preferentemente está entre 1:1 y 70:1, de mayor preferencia entre 5:1 y 50:1 y de preferencia especial entre 10:1 y 50:1 , De acuerdo con la forma de realización preferida de la presente invención, los polímeros oligo- o multiproteína-sustituidos se obtienen donde las moléculas de la proteína se unen al polímero, a través de una unión amida. Según se usa en el contexto de la presente invención, el grado de sustitución de moléculas de la proteína (PGS) , se refiere a la porción de radicales de glucosa unidos a la proteína con respecto a todos los radicales . de glucose incluido en HAS, preferentemente en HES. El PGS está en la escala entre 0,001 y 1, preferentemente entre 0,005 y 0,5, de mayor preferencia entre 0,005 y 0,2. De acuerdo con otra forma de realización de la presente invención, el polímero que tiene un carboxi reactivo grupo A resultante de la reacción, por lo menos, de un grupo hidroxi del polímero con uno de los compuestos antes mencionados, preferentemente, por lo menos, con uno de los compuestos de diéster carbónico, se puede unir al grupo funcional Z de la proteína, a través de, por lo menos, un compuesto de la unión. En caso de que se use un compuesto de la unión, el compuesto mencionado, por lo menos, es un compuesto bifuncional que tiene, por lo menos, un grupo funcional Fi que puede ser sometido a la reacción con el grupo funcional A del derivado del polímero y, por lo menos, de un grupo funcional F2 que puede ser sometido a la reacción con el grupo funcional Z de la proteína o un grupo funcional F2 que puede ser modificado químicamente para su reacción con el grupo funcional Z de la proteína, La modificación química puede ser, por ej , una reacción del grupo funcional F2 con un grupo funcional F3 de otro compuesto de unión más o la oxidación o la reducción adecuada del grupo funcional F2, En caso de que, por lo menos, se use un compuesto de la unión, la reacción no se limita al grupo amino de la proteina sino que, según la naturaleza química del grupo funcional del compuesto de la unión o compuestos de la unión, se puede usar para formar una unión con cadun. grupo funcional adecuado de la proteína, tales como un grupo carboxi, un grupo carboxi reactivo, un grupo aldehido, un grupo ceto, un grupo tio, un grupo amino o un grupo hidroxi . En caso de que se usen dos compuestos, se emplea el primer compuesto de la unión que tiene, por lo menos, un grupo funcional Fi que puede ser sometido a la reacción con el grupo A del polímero carboxi reactivo, tales como un grupo amino, un grupo tio, un grupo hidroxi o un grupo carboxi, Asimismo, el primer compuesto de la unión, por lo menos, tiene otro grupo funcional F2 que puede ser sometido a la reacción, por lo menos, con un grupo funcional F3 del segundo compuesta de la unión. Como grupo funcional F2, entre otros se mencionan los siguientes grupos funcionales : uniones C-C- dobles o uniones C-C- triples o uniones C-C-aromáticas ; - el grupo tio o los grupos hidroxi; ácido hidrazida alquilsulfónico, ácido hidrazida arilsulfónico; 1, 2-dioles; 1, 2-aminoalcoholes; - 1,2 amino-tioalcoholes ; azidas; el grupo amino -N¾ o derivados de los grupos amino que incluyen la unidad estructural -NH- , tales como los grupos aminoalquilo, grupo aminoarilo, grupo aminoaralquilo, o grupo al cari lamino; el grupo hidroxilamino -0-NH2, o derivados del grupo hidroxilamino que incluye la unidad estructural -O-NH-, tales corro los grupos hidroxilalquilamino, grupos droxilarilamino, grupos óxoxilaralgiilamino o grupos hidroxalalcarilamino; - grupos alquiloxiamino, grupos ariloxiamino, grupos aralquiloxiamino, o grupos alcariloxiamino, cada uno de ellos incluye la unidad estructural -NH-O- ; residuos que tiene un grupo carbonilo, -Q-C(=G)- , en donde G es O o S, y M es, por ejemplo, -- -OH o -SH; un alquiloxi grupo, un grupo ariloxi, un grupo aralquiloxi, o un grupo alcariloxi; un grupo alquilotio, un grupo arilotio, un grupo aralquilotio, o un grupo alcarilotio; -- un grupo alquilocarboniloxi, un grupo arilocarboniloxi, un grupo aralquilocarboniloxi , un grupo alcarilocarboniloxi ; esteres activados, tales como esteres de droxilaminas que tienen una estructura imida, tales corro N-hidroxisuccinimida o que tienen una unidad estructural O-N donde N es parte de un compuesto heteroarilo o con G = O y Q ausente, tales como compuestos ariloxi con un residuo sustituido arilo, tales como pentafluorofenilo, paranitrofenilo o triclorofenilo; en donde Q está ausente o NH o un heteroátomo, tales como S o 0; - - -NH-NH2, o -NH-NH-; -N02; el grupo nitrilo; grupos carbonilo, tales como el grupo aldehido o el grupo ceto; - el grupo carboxi; el grupo -N=C=0 o el grupo -N=C=S; grupos vinilo halida, tales como el grupo vinl yoduro o el grupo vinyl bromuro o triflato; -C=C-H; - - (C=NH2C1) -OAlquilo grupos - (C=0) -CH2-Hal en donde Hal es Cl, Br, o I; -CH=CH-S02-; un grupo disulfuro que incluye la estructura -S-S-; el grupo el grupo en donde P3 es un grupo que puede formar una unión química con uno de los grupos antes mencionados y preferentemente se puede seleccionar entre los grupos antes mencionados . Asimismo, el segundo compuesto de la unión, por lo menos, tiene un grupo funcional que puede ser sometido a reacción con el grupo funcional Z de la proteína, que, por ej , es un grupo amino, un grupo tio, un grupo carboxi, un grupo carboxi reactivo, un grupo aldehido, un grupo ceto, o un grupo hidroxi . En caso de que se use un compuesto de unión para unir el polxmero y la protexna en forma covalente, el polxmero se puede hacer reaccionar con el compuesto de unión y el derivado del polímero resultante se somete a la reacción con la protexna, o la protexna se puede hacer reaccionar con el compuesto de unión y el derivado resultante de la protexna se hace reaccionar con el polxmero. En caso de que se unan dos compuestos se usan Ll y L2, es posible hacer reaccionar el polímero con Ll, reaccionar el derivado del polxmero resultante con L2 y reaccionar el derivado del polímero resultante con la proteína, o reaccionar la proteína con L2 , reaccionar el derivado de la protexna resultante con Ll y reaccionar el derivado de la proteína resultante con el polímero. También es posible hacer reaccionar el polímero con Ll y reaccionar la protexna con L2 y reaccionar el derivado del polímero con la proteína del derivado, Además, es posible reaccionar Ll con L2, reaccionar el compuesto resultante con el polímero y el derivado del polímero resultante con la proteína, Además, es posible reaccionar Ll con L2, reaccionar el compuesto resultante con la proteína y el derivado de la proteína resultante con el polímero. De acuerdo con la forma de realización se prefiere especialmente de la presente invención, el grupo funcional Z de la proteína es un grupo amino, y el grupo funcional A del polímero o un derivado ellos es un grupo aldehido, un grupo ceto o un grupo hemiacetal, De acuerdo con una forma de realización particularmente preferida, el grupo funcional Z y el grupo funcional ? se hacen reaccionar, a través de una reacción de aminación reductiva. La reacción de aminación reductiva, de acuerdo con la invención, en donde el polímero o un derivado del polímero está unido en forma covalente a través de, por lo menos, un grupo aldehido o grupo ceto o grupo hemiacetal , por lo menos, para un grupo amino de la proteína, que se lleva a cabo preferentemente a una temperatura entre 0 y 40°C, de mayor preferencia entre 0 y 25°C y de preferencia especial entre 4 y 21°C, El tiempo de reacción preferentemente está en la escala entre 0,5 y 72 h, de mayor preferencia entre 2 y 48 h y de preferencia especial entre 4 y 7 h, Como solvente para la reacción, se prefiere el medio acuoso. Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un método y un conjugado, según lo descrito más arriba, en donde la aminación reductiva se lleva a cabo a una temperatura entre 4 y 21°C. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un método y un conjugado, según lo descrito más arriba, en donde la aminación reductiva se lleva a cabo en un medio acuoso. Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un método y un conjugado, según lo descrito más arriba, en donde la aminación reductiva se lleva a cabo a una temperatura entre 4 y 21°C en un medio acuoso. El término "medio acuoso" cuando se usa en el contexto de la presente invención, se refiere a un solvente o una mezcla de solventes que incluyen el agua en una escala, por lo menos, entre 10 % por peso, más preferentemente, por lo menos, 20 % por peso, más preferentemente, por lo menos, 30 % por peso, más preferentemente, por lo menos, 40 % por peso, más preferentemente, por lo menos, 50 % por peso, más preferentemente, por lo menos, 60 % por peso, más preferentemente, por lo menos, 70 % por peso, más preferentemente, por lo menos, 80 % por peso, aún más preferentemente, por lo menos, 90 % por peso o hasta 100 % por peso, sobre la base del peso de los solventes usados. El medio de reacción preferido es el agua. El valor pH del medio de reacción, por lo general, está en la escala entre 4 y 9 o entre 4 y 8 o entre 4 y 7,3.

De acuerdo con la forma preferido de realización de la presente invención, el pH en el que la reacción de afinación reductiva se lleva a cabo, es inferior a 7,3, de mayor preferencia menor o igual a 7 y de mayor preferencia inferior a 7, i,e,en el nivel acídico, Por lo tanto, los niveles preferidos están entre 3 e inferior a 7, de mayor preferencia entre 3,5 y 6,5, todavía de mayor preferencia entre 4 y 6, todavía de mayor preferencia entre 4,5 y 5,5 y de preferencia especial aproximadamente 5,0, es decir,4, 6 o 4,7 o 4,8 o 4,9 o 5,0 o 5,1 o 5,2 o 5,3 o 5,4, Los rangos preferidos son, entre otros, 3 y 6,9 o 3 y 6,5 o 3 y 6 o 3 y 5,5 o 3 y 5 o 3 y 4,5 o 3 y 4 o 3 y 3,5 o 3,5 y 6,9 o 3,5 y 6,5 o 3,5 y 6 o 3,5 y 5,5 o 3,5 y 5 o 3,5 y 4,5 o 3, 5 y 4 o 4 y 6,9 o 4 y 6,5 o 4 y 6, o 4 y 5,5 o 4 y 5 o 4 y 4,5 o 4,5 y 6,9 o 4,5 y 6,5 o 4,5 y 6 o 4,5 y 5,5 o 4,5 y 5 o 5 y 6,9 o 5 y 6,5 o 5 y 6 o 5 y 5,5 o 5,5 y 6,9 o 5,5 y 6,5 O 5,5 y 6 o 6 y 6,9 o 6 y 6,5 o 6,5 y 6,9. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un método y un conjugado, según lo descrito más arriba, en donde la aminación reductiva se lleva a cabo con un pH de 7 o inferior, de mayor preferencia un pH de 6 o inferior. Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un método y un conjugado según lo descrito más arriba, en donde la aminación reductiva se lleva a cabo a una temperatura entre 4 a , 21°C, un pH de 7 o inferior, preferentemente de 6 o inferior.

En consecuencia, la presente invención también se refiere a un método y un conjugado según lo descrito más arriba, en donde la aminación reductiva se lleva a cabo en un medio acuoso con un pH de 7 o inferior, preferentemente de 6 o inferior. En consecuencia, la presente invención también se refiere a un método y un conjugado según lo descrito más arriba, en donde la aminación reductiva se lleva a cabo a una temperatura entre 4 y 21°C en un medio acuoso con un pH de 7 o inferior, preferentemente de 6 o inferior. La relación molar del derivado del polímero : proteína usado para la reacción está preferentemente en la escala entre 200:1 a 5:1, de mayor preferencia entre 100:1 y 10:1 y de preferencia especial entre 75:1 y 20:1. Fue sorprendente observar que era posible, especialmente en la escala de pH preferida indicada arriba, particularmente con un pH inferior a 7 y superior o igual a 4, hacer reaccionar el derivado del polímero predominantemente con el grupo amino ubicado en la terminal N de la proteína. El término "predominantemente", según se usa en el contexto de la presente invención se refiere a una forma de realización donde, por lo menos, 80 %, preferentemente, por lo menos, 85 % de la N-terminal amino de los grupos disponibles se someten a la reacción, por aminación reductiva, También es posible hacer reaccionar, por lo menos, 90 % o, por lo menos, 95 % o, por lo menos, 96 % o, por lo menos, 97 % o, por lo menos, 98 % o, por lo menos, 99 % de los grupos N-terminal amino disponibles, Aunque no se podría descartar por completo la unión de los grupos amino, que no sean del grupo N-terminal amino, se considera que de acuerdo con la presente invención, la aminación reductiva tuvo lugar principalmente, a través de la unión selectiva del grupo amino Ñ-terminal con un pH inferior a 7, preferentemente inferior a 6. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un método y un conjugado según lo descrito más arriba, en donde la proteína incluye el grupo amino N-terminal y, por lo menos, otro grupo amino más, el conjugado mencionado incluye el polímero predominantemente unido al grupo amino N-terminal . De acuerdo con una forma de realización Se prefiere especialmente, la presente invención se refiere a un método de unión aldehido o ceto o hemiacetal functional al hidroxialquil almidón o aldehido o ceto o hemiacetal functional al hidroxialquil almidón derivado predominantemente del grupo amino N-terminal de la proteína, el método que incluye someter al mencionado hidroxialquil almidón o alguno de sus derivados a la reacción de aminación reductiva, con un pH de 7 o inferior, preferentemente con un pH de 6 o inferior, la reacción de aminación reductiva mencionada se lleva a cabo preferentemente en un medio acuoso .

De acuerdo con la presente invención, se prefiere el aldehido functional al hidroxialquil almidón o al derivado aldehido functional al almidón de hidroxialquilo . De acuerdo con una forma de realización todavía más preferida de la presente invención se refiere a un método de unión aldehido o ceto o hemiacetal funcional al hidroxietil almidón o de un aldehido o ceto o hemiacetal funcional al hidroxietil almidón derivado selectivamente del grupo amino N-terminal de la proteína, el método mencionado incluye someter al mencionado hidroxialquil almidón o algún derivado a la reacción de aminación reductiva, con un pH de 7 o inferior, preferentemente con un pH de 6 o inferior, la reacción de aminación reductiva mencionada se lleva a cabo preferentemente en un medio acuoso, el hidroxietil almidón empleado preferentemente es un hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 10 kD y un GS de aproximadamente 0,4 o hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 10 kD y un GS de aproximadamente 0,7 o hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 12 kD y un GS de aproximadamente 0,4 o hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 12 kD y un GS de aproximadamente 0,7 o hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 18 kD y un GS de aproximadamente 0,4 o hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 18 kD y un GS de aproximadamente 0,7 o hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 50 kD y un GS de aproximadamente 0,4 o hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 50 kD y un GS de aproximadamente 0,7. La reacción del derivado del polímero y la proteína entre el grupo aldehido o grupo ceto o grupo hemiacetal y el grupo amino es una aminación reductiva en donde se produce una base de Schiff. Posteriormente después de la reacción, esta base se puede reducir, por lo menos, mediante un agente reductor para producir una unión estable entre el derivado del polímero y la proteína^ También es posible llevar a cabo la reacción en presencia de, por lo menos, un agente reductor. De acuerdo con la forma de realización preferida, la reacción de aminación reductiva se lleva a cabo en presencia de, por lo menos, un agente reductor. Los agentes reductores preferidos son borohidruro de sodio, cianoborohidruro de sodio, compuestos orgánicos complejo de borano, tales como el complejo 4- (dimetilamino)piridina borano, complejo N-etildiisopropilamina borano, complejo N-etilmorfolina borano, complejo N-metilmorfolina borano, complejo N-fenilmorfolina boran, complejo lutidina borano, complejo trietilamina borano o complejo trimetilamina borano. Se prefiere particularmente el ci noborohidruro de sodio.

Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un método y un conjugado según lo descrito más arriba, en donde la aminacion reductiva se lleva a cabo en presencia de NaCNBH3. En consecuencia, la presente invención también se refiere a un método y un conjugado según lo descrito más arriba, en donde la aminación reductiva se lleva a cabo en un medio acuoso con un pH de 7 o inferior, preferentemente de 6 o inferior en presencia del agente reductor, preferentemente N C BH3. En consecuencia, la presente invención también se refiere a un método y un conjugado según lo descrito más arriba, en donde la aminación reductiva se lleva a cabo a una temperatura entre 4 a 21°C en un medio acuoso con un pH de -7 o inferior, preferentemente de 6 o inferior en presencia del agente reductor, preferentemente NaC B¾. La relación molar del derivado del polímero : proteína usado para la reacción está preferentemente en la escala entre 200:1 a 10:1 de mayor preferencia entre 100:1 a 10:1 y de preferencia especial entre 75:1 a 20:1. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un método de producción de un conjugado, el método mencionado incluye la reacción de un polímero o un derivado del polímero que incluye un grupo aldehido en un medio acuoso con un grupo amino de la proteína en presencia del agente reductor, el agente reductor mencionado preferentemente es NaCNBH3.

De acuerdo con la primera forma de realización preferida de la presente invención, de acuerdo con la que el polímero incluye, por lo menos, dos grupo aldehido que son introducidos en el polímero mediante la reacción de oxidación de anillo-abierto, el polímero preferentemente incluye, por lo menos, una estructura de acuerdo con la fórmula De acuerdo con esta forma de realización de la presente invención, se puede emplear culaquier agente de oxidación o agentes de combinación de oxidación que puedan ser oxidados, por lo menos, un anillo sacárido del polímero para producir un anillo sacárido abierto que tiene, por lo menos, uno preferentemente, por lo menos, dos grupos aldehido, Esta reacción se ilustratra mediante el siguiente esquema de reacción que muestra un anillo sacárido del polímero que está oxidado para producir unn un anillo abierto que tiene dos grupos aldehido: Los agentes oxidantes adecuados son, entre otros, peryodatos, tales como peryodatos de metales alcalinos o mezclas de dos o más de ellos, los preferidos son el peryodato de sodio y el peryodato de potasio. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un método y un conjugado según lo descrito más arriba, en donde el polímero es sometido a una reacción de oxidación de anillo abierto, usando un peryodato para producir un derivado del polímero que tiene, por lo menos, uno, preferentemente, por lo menos, dos grupos aldehido. Para esta reacción de oxidación, el polímero se puede emplear con su extremo reductor ya sea oxidado o no oxidado, aunque se prefiere la forma no oxidada. Por consiguiente, ¦ la presente invención también se refiere a un método y un conjugado según lo descrito más arriba, en donde el polímero se emplea con su extremo reductor en forma no oxidada. La temperatura de reacción preferida oscila entre 0 y 40°C, de mayor preferencia entre 0 y 25°C y de preferencia especial entre 0 y 5°C, El tiempo de reacción preferido está en una escala entre 1 min y 5 h y de preferencia especial entre 10 min y 4 h, Según el grado de oxidación deseado, es decir, se puede elegir apropiadamente el numero de grupos aldehido resultante entre la reacción de oxidación y la relación molar peryodato ¡polímero .

Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un método y un conjugado según lo descrito más arriba, en donde la reacción de oxidación de anillo abierto se lleva a cabo a una temperatura entre 0 y 5°C. La reacción de oxidación del polímero con peryodato preferentemente se lleva a cabo en un medio acuoso, de mayor preferencia en agua. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un método y un conjugado según lo descrito más arriba, en donde la reacción de oxidación el anillo abierto se lleva a cabo en un medio acuoso, El valor pH adecuado de la mezcla de la reacción se puede ajustar agregando, por lo menos, un buffer adecuado, Entre los buffers preferidos, se puede mencionar buffer acetato de sodio, buffers fosfato o borato. El hidroxietil almidón sometido a la mencionada reacción de oxidación de anillo abierto preferentemente es el hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 10 kD y un GS de aproximadamente 0,4 o hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 10 kD y un GS de aproximadamente 0,7 o hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 12 kD y un GS de aproximadamente 0,4 o hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 12 kD y un GS de aproximadamente 0,7 o hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 18 kD y un GS de aproximadamente 0,4 o hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 18 kD y un GS de aproximadamente 0,7 o hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 50 kD y un GS de aproximadamente 0,4 o hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 50 kD y un GS de aproximadamente 0,7. El derivado del polímero resultante se puede purificar en la mezcla de reacción, por lo menos, mediante un método adecuado, Si fuera necesario, el derivado del polímero puede ser precipitado antes de la aislación, por lo menos, mediante un método adecuado. Si el derivado del polímero es precipitado primero, es posible, por ej , poniendo en contacto a la mezcla de reacción con, por lo menos, un solvente o una mezcla de solventes que no sea el solvente o la mezcla de solventes presentes en la mezcla de reacción a las temperaturas adecuadas, De acuerdo con una forma de realización particularmente preferid de la presente invención donde un medio acuoso, preferentemente agua se usa como solvente, la mezcla de la reacción se pone en contacto con 2 -propanol o con una mezcla de acetona y etanol, preferentemente a 1:1 mezcla (v/v) , indicando volúmenes iguales de los mencionados compuestos, a una temperatura, preferentemente en la escala entre -20 y +50°G y de preferencia especial en la escala entre -20 y 25°C.

La aislación del derivado del polímero se puede llevar a cabo mediante un proceso adecuado que puede incluir uno o más pasos, De acuerdo con una forma de realización preferida de la presente invención, el derivado del polímero se separa primero de la mezcla de la reacción o la mezcla de la mezcla de la reacciónda con, por ej , una mezcla acuosa de 2-propanol, mediante un método adecuado, tales como centrifugación o filtración. En un segundo paso, el derivado del polímero separado puede ser sometido además a un tratamiento, tales como postratamiento de diálisis, filtración centrífuga o filtración a presión, cromatografía de cambio de iones, cromatografía de fase reversa, HPLC, MPLC, gel filtración y/o liofilización, De acuerdo con una forma de realización aún más preferida, el derivado del polímero separado se dializa primero, preferentemente contra agua, y luego se liofiliza hasta que el contenido del solvente del producto de la reacción sea suficientemente bajo de acuerdo con las especificaciones deseadas del producto, La liofilización se puede llevar a cabo a temperatura entre 20 y35°C, preferentemente entre 20 y 30°C. De acuerdo con una forma de realización preferida, el polímero oxidado resultante de la reacción de oxidación se purifica usando, por lo menos, un método adecuado, tales como ultrafiltración y/o diálisis a fin de, por ej , eliminar el bajo peso molecular no deseado de las sales y componentes polímero, ofreciendo también asi los medios para controlar el índice de peso molecular del polímero oxidado. El polímero oxidado se puede usar directamente por la reacción con la proteína o se recupera en forma adecuada en el primer paso, por ej , por liofilización, y redisuelto en agua por conjugación a la proteína en el segundo paso, En lo referente a la unión de, por lo menos, un grupo amino de la proteína con, por lo menos, un grupo aldehido del polímero por aminación reductiva, se hace referencia a la declaración detallada arriba que trata los parámetros específicos de la reacción, de la reacción de aminación reductiva, tales como el pH o la temperatura. De acuerdo con la segunda forma de realización preferida, el polímero se somete a la reacción con, por lo menos, un compuesto bifuncional que incluye, por lo menos, un grupo funcional M que puede ser sometido a la reacción con el polímero y, por lo menos, un grupo funcional Q que es un grupo aldehido o un grupo ceto o un grupo hemiacetal y que se somete a la reacción con un grupo amino de la proteína por aminación reductiva. El polímero oxidado se puede usar directamente por la reacción con la proteína o se recupera en forma adecuada en el primer paso,, por ej , por liofilización, y redisuelto en agua por conjugación a la proteína en el segundo paso, En cuanto a la unión de, por lo menos, un grupo amino de la proteína con, por lo menos, un grupo aldehido del polímero por aminación reductiva, se hace referencia a la declaración detallada arriba que trata los ' arámetros específicos de la reacción, de la reacción de aminación reductiva, tales como el pH o la temperatura, De acuerdo con una forma de realización especialmente preferida de la presente invención, la aminación reductiva preferentemente se lleva a cabo a una temperatura entre 0 y 5°C, tales como aproximadamente 4°C con un ptí de aproximadamente 4,5 y 5,5, tales como aproximadamente 5,0 y para un tiempo de reacción de aproximadamente 20 y 30 h, tales como aproximadamente 24 h. De acuerdo con la segunda forma preferida de realización, el polímero se somete a la reacción con, por lo menos, un compuesto bifuncional que incluye, por lo menos, un grupo funcional M que puede ser sometido a la reacción con el polímero y, por lo menos, un grupo funcional Q que es un grupo aldehido, un grupo ceto o un grupo hemiacetal y que se somete a la reacción con un grupo amino de la proteína por aminación reductiva. Se prefiere emplear un compuesto que tenga, aparte del grupo aldehido o grupo ceto o grupo hemiacetal, por lo menos, un grupo carboxi o, por lo menos, un grupo carboxi reactivo, preferentemente un grupo carboxi o un grupo carboxi reactivo. El grupo aldehido o grupo ceto o grupo hemiacetal y el grupo carboxi o el grupo carboxi reactivo puede ser separado por cualquier espaciador adecuado, Entre otros, el espaciador puede ser opcionalmente un residuo hidrocarbonado cíclico sustituido, lineal y/o ramificado, Por lo general, el residuo hidrocarbonado tiene entre 1 a 60, preferentemente entre 1 a 40, de mayor preferencia entre 1 a 20, de mayor preferencia entre 2 a 10, de mayor preferencia entre 2 a 6 y de preferencia especial entre 2 a 4 átomos de carbono, Si los heteroátomos estuvieran presentes, el grupo espaciador incluye por lo general entre 1 a 20, preferentemente entre 1 a 8 y de preferencia especial entre 1 a 4 heteroátomos. El residuo hidrocarbonado puede incluir opcionalmente una cadena alquílica ramificada o un grupo arilo o un ciclogrupo alquilo que tiene, por ej , entre 5 a 7 átomos de carbono, o ser un grupo aralquilo, un grupo alcarilo donde la parte del alquilo puede ser a lineal y/o grupo alquilo cíclico. De acuerdo con una forma de realización aún más preferida, el residuo hidrocarbonado es un residuo arilo que tienen 5 a 7 y preferentemente 6 átomos de carbono . El de mayor preferencia, el residuo hidrocarbonado es el residuo benceno. De acuerdo con esta forma de realización preferida, el grupo carboxi y el grupo aldehido puede estr ubicado en el anillo bencénico en la posición 1,4-, la posición 1,3- o la posición 1,2-, siendo la 1,4- la preferida. Como grupo carboxi reactivo, se puede mencionar un éster reactivo, isotiocianatos o isocianatos. Los ésteres reactivos preferidos son los que derivan de N- idroxi succinamidas , tales como N-hidroxi succinimida o Sulfo-N-hidroxi succinimida, los fenoles sustituidos adecuados, tales como p-nitrofenol, ?,?-dinitrofenol , o, o ' -dinitrofenol , triclorofenol, tales como 2 , 4 , 6-triclorofenol o 2,4,5-triclorofenol , trifluorofenol , tales como 2,4,6-trifluorofenol o 2 , 4 , 5-trifluorofenol , pentaclorofenol , pentafluorofenol, o hidroxiazoles, tales como hidroxi benzotriazol, Se prefiere especialmente las N-hidroxi succinamidas con N-hidroxi succinimida y Sulfo-N-hidroxi succinimida. Todos los alcoholes puede ser empleado solos o como combinaciones adecuadas de o más de ellos, Como éster reactivo, se prefieren especialmente el pentafluorofeniléster y N-hidroxi succinimidaéster. Por lo tanto, de acuerdo con una forma preferida de realización, la presente invención se refiere a un método y un conjugado según lo descrito más arriba, en donde el polímero se somete a la reacción con ácido formilbenzoico. De acuerdo con otra forma de realización preferida, la presente invención se refiere a un método y un conjugado según lo descrito más arriba, en donde el polímero se somete a la reacción con ácido formilbenzoico pentafluorofenilo ester. De acuerdo con otra forma de realización preferido, la presente invención se refiere a un método y un conjugado según lo descrito más arriba, en donde el polímero se somete a la reacción con ácido formilbenzoico N-hidroxisuccinimida este . De acuerdo con otra forma de realización más, la presente invención se refiere a un método y un conjugado según lo descrito más arriba, en donde el polímero se somete a la reacción con ácido 4- (4-formil-3 , 5-dimetoxifenoxi) butírico . El hidroxietil almidón sometido a la reacción con el compuesto que incluyen M, M preferentemente es un grupo carboxi o un grupo carboxi reactivo y Q es un grupo aldehido o un grupo ceto o un grupo hemiacetal, el de mayor preferencia es hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 10 kD y un GS de aproximadamente 0,7. También son posibles los hidroxietil almidones que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 10 kD y un GS de aproximadamente 0,4 o hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 12 kD y un GS de aproximadamente 0,4 o hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 12 kD y un GS de aproximadamente 0,7 o hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 18 kD y un GS de aproximadamente 0,4 o hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 18 kD y un GS de aproximadamente 0,7 o hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 50 kD y un GS de aproximadamente 0,4 o hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 50 kD y un GS de aproximadamente 0,7, de preferencia particular, el hidroxialquil almidón y aún de mayor preferencia el hidroxietil almidón es empleado con su extremo reductor en su forma oxidada. El derivado del polímero resultante con el grupo aldehido o el grupo ceto o el grupo hemiacetal se hace reaccionar posteriormente con un grupo amino de la proteína por aminación reductiva. En cuanto a la unión de, por lo menos, un grupo amino de la proteína con, por lo menos, un grupo aldehido o grupo ceto o grupo hemiacetal del polímero por aminación reductiva, se hace referencia a la declaración detallada arriba que trata los parámetros específicos de la reacción de la reacción de aminación reductiva, tales como pH o la temperatura, De acuerdo con una forma especialmente preferida de realización de la presente invención, la reaccióncon el grupo amino de la proteína es preferentemente lleva a cabo a una temperatura entre 0 a 40°C, de mayor preferencia entre 0 a 25°C y de preferencia especial entre 4 a 21°C, El tiempo de reacción preferentemente oscila entre 30 min a 72 h, de mayor preferencia entre 2 a 48 h y de preferencia especial entre 4 h a 17 h, Como solvente para la reacción, un medio acuoso es preferido, El pH valor reactividad medio es preferentemente en la escala entre 4 y 9, de mayor preferencia entre 4 y 8 y de preferencia especial entre 4,5 y 5,5. De acuerdo con la tercera forma de realización en preferencia, el polímero se hace reaccionar en su extremo reductor opcionalmente oxidado con un compuesto, por lo menos, bifuncional que incluye un grupo amino y un grupo funcional Q, en donde dicho grupo amino M reacciona con el extremo reductor opcionalmente oxidado del polímero y en donde el grupo funcional Q es químicamente modificado para producir un aldehido funcional al derivado del polímero que se somete a la reacción con un grupo amino de la proteína por aminación reductiva. Como grupo funcional Q, los siguientes grupos funcionales deben mencionarse, entre otros: uniones dobles C-C o uniones triples CC o uniones CC aromáticas; el grupo tio o el grupo hidroxi; ácido alquilsulfónico hidrazida, ácido arilsulfónico hidrazida; 1,2-dioles; 1,2 amino-tioalcoholes ; azidas; 1, 2-aminoalcoholes; el grupo amino -NH2 o derivados del grupo amino que incluyen la unidad estructural -NH-, tales como grupos aminoalquilos, grupos aminoarilo, grupos aminoaralquilo, o alcarilaitdncgrupo; el grupo hidroxilamino -0-NH2, o derivados del grupo hidroxilamino que incluyen la unidad estructural -0-NH-, tales coito los grupos hidroxilalquilamino, grupos hidroxilarilamino, grupos áxoxilaralguilamino, o los grupos Mdroxalalcarilairu.no; los grupos alquiloxiamino, grupos ariloxiamino, grupos aralquiloxiamino, o grupos alcariloxiamino, cada uno de los cuales incluyen la unidad estructural -NH-0-; - residuos que tienen un grupo carbonilo, -Q-C (=G) -M, en donde G es O o S, y M es, por ejemplo, -OH o -SH; un grupo alquiloxi, un grupo ariloxi, un grupo aralquiloxi o un grupo alcariloxi ; -- un grupo alquiltio, un grupo ariltio, un grupo aralquiltio, o un grupo alcariltio; un grupo alquilcarboniloxi , un grupo arilcarboniloxi, un grupo aralquilcarboniloxi , un grupo alcarilcarboniloxi ; activadad de ésteres, tales como esteres de hidroxilaminas que tienen estructura imida, tales como N-hidroxisuccinimida o que tienen una unidad estructural O-N donde N es parte de un heteroarilo compuesto o con ausencia de G = 0 y Q, tales como compuestos ariloxi con un residuo arilo sustituido, tales como pentafluorofenilo, paranitrofenilo o triclorofenilo; en donde Q es ausente o NH o un heteroátomo, tales como S o 0; -NH-NH2, o -NH-NH-; -NO2; el grupo nitrilo; - grupos carbonilo, tales como el grupo aldehido o el grupo ceto ; el grupo carboxi ; el grupo -N=C=0 o el grupo -N=C=S ; grupos vinilhaluros, tales como el grupo yoduro vinilo o el grupo bromuro de vinilo o triflato; -C=C-H; - (C=NH2C1) -0A1quilo grupos - (C=0) -CH2-Hal en donde Hal es Cl, Br, o I; - -CH=CH-S02-; un grupo disulfuro que incluyen la estructura -S-S-; el grupo el grupo De acuerdo con una forma preferida de realización de presente invención, el término "grupo funcional Q" se refiere a un grupo funcional Q que incluye la estructura química - H- . De acuerdo con una forma de realización preferida de la presente invención, el grupo funcional M es un grupo que presenta la estructura R'-NH- donde R' es hidrógeno o a alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, arilocicloalquilo, alcarilo o cicloalquiloarilo residuo donde el residuo cicloalquilo, arilo, aralquilo, arilocicloalquilo, alcarilo o cicloalquiloarilo puede ser unido directamente al grupo NH ó, de acuerdo con otra forma de realización, puede ser unido mediante un puente de oxígeno al grupo NH. Los residuos alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, arilocicloalquilo, alcarilo, o cicloalquiloarilo pueden estar adecuadamente sustituidos, Como sustituyentes peferdiso puede mencionarse a halógenos, tales como F, Cl o Br, Se prefiere especialmente que los residuos R1 sean hidrógeno, grupos alquilo y alquiloxi y aún de mayor preferencia sean hidrógeno y un grupo alquilo y alquiloxi sustituidos . Entre los grupos alquilo y alquiloxi, son de preferencia los grupos con 1, 2, 3, 4, 5, o 6 átomos de C . De mayor preferencia son los grupos metilo, etilo, propilo, isopropilo, metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, Se prefiere especialmente que sean metilo, etilo, metoxi, etoxi, y de particular preference que sean metilo o metoxi .

De acuerdo con otra forma de realización de la presente invención, el grupo funcional M presenta la estructura R' -NH-R"-donde R" preferentemente incluye la unidad estructural -NH- y/o la unidad estructural - (C=G) - donde G es O o S, y/o la unidad estructural -S<¾- . Son ejemplos específicos del grupo funcional R" donde, si G se presenta dos veces, es independientemente O o S . Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un método y un conjugado como los mencionados anteriormente en donde el grupo funcional M se selecciona del grupo que consiste en en donde G es O o S y, si está presente dos veces , independientemente 0 o S , y R 1 es metilo . De acuerdo con una forma de realización particularmente preferida de la presente invención, el grupo funcional M es un grupo amino - H2, El término "grupo amino Q" se refiere a un grupo funcional Q que incluye la estructura química -NH- . De acuerdo con una forma preferida de realización de la presente invención, el grupo funcional Q es un grupo que tienen la, estructura R'-NH- donde R' es hidrógeno o a alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, arilocicloalquilo, alcarilo o cicloalquiloarilo residuo donde el residuo cicloalquilo, arilo, aralquilo, arilocicloalquilo, alcarilo o cicloalquiloarilo puede ser unido directamente al grupo NH ó, de acuerdo con otra forma de realización, puede ser unido mediante un puente de oxígeno al grupo NH, Los residuos alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, arilocicloalquilo, alcarilo, o cicloalquiloarilo pueden estar adecuadamente sustituidos, Pueden mencionarse como sustituyentes preferidos los halógenos, tales como F, Cl o Br, Se prefiere especialmente que los residuos R' sean hidrógeno, grupos alquilo y alquilox, y aún de mayor preferencias que sean hidrógeno y grupos alquilo y alquiloxi no sustituidos . Entre el grupo alquilo y alquiloxi, se prefiere a los grupos con 1, 2, 3, 4, 5 , o 6 átomos de C . De mayor preferencia los grupos metilo, etilo, propilo, isopropilo, metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, Se prefiere especialmente que sean metilo, etilo, metoxi, etoxi, y se brinda particular preferencia a metilo o metoxi.

De acuerdo con otra forma de realización de la presente invención, el grupo funcional Q tiene la estructura R'-NH-R"- donde R" preferentemente incluye la unidad estructural -NH- y/o la unidad estructural -(C=G)- donde G es 0 o S, y/o la unidad estructural -S02-, De acuerdo con una forma de realización de mayor preferencia, el grupo funcional R" se selecciona del grupo que consiste en donde, si G está presente dos veces, es independientemente O o S, Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un método y un conjugado como los mencionados anteriormente en donde el grupo funcional Q se selecciona del grupo que consiste en H H2NN O II H2N N-S- H O donde G es O o S y, si está presente dos veces, independientemente 0 o S, y R' es metilo. De acuerdo con una forma de realización de particular preferencia de realización de la presente invención, el grupo funcional Q es un grupo amino -NH2. De acuerdo con otra forma de realización preferida de la presente invención, ambos M y Q incluye un grupo amino -NH-, De acuerdo con una forma de realización de particular preferencia de realización, ambos M y Q son un grupo amino -N¾. De acuerdo con una forma preferida de realización de la presente invención, el compuesto que incluye M y Q es a homocompuesto bifuncional, de mayor preferencia es un homocompuesto bifuncional que incluye, como grupo funcional M y Q, el de mayor preferencia el grupo amino -?¾, o de acuerdo con una forma de realización, el grupo hidroxilamino -0-NH2 o el grupo siendo G preferentemente 0. Son ejemplos específicos de los ejemplos de los compuestos que incluyen y Q son ó El hidroxietil almidón sometido a la reacción con el compuesto que comprende M, siendo M preferentemente un grupo amino -NH- y siendo de mayor preferencia un grupo amino -NH2, todavía de mayor preferencia comprendiendo ambos M y Q un grupo amino -NH- y de preferencia particular comprendiendo arabos M y Q un grupo amino -NH2, es preferentemente hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 10 kD y un GS de aproximadamente 0,4 o hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 10 kD y un GS de aproximadamente 0,7. También son posibles los hidroxietil almidones que tienen peso molecular promedio de aproximadamente 12 kD y un GS de aproximadamente 0,4 o hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 12 kD y un GS de aproximadamente 0,7 o hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 18 kD y un GS de aproximadamente 0,4 o hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 18 kD y un GS de aproximadamente 0,7 o idroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 50 kD y u GS de aproximadamente 0,4 o hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 50 kp y un GS de aproximadamente 0,7. En caso de que ambos M y Q sean un grupo amino -NH2, M y Q pueden estar separados por cualquier espaciador adecuado. Entre otros, el espaciador puede ser opcionalmente un residuo idrocarbonado sustituido, lineal, ramificado y/o cíclico, Por lo general, el residuo hidrocarbonado tiene entre 1 y 60, preferentemente entre 1 y 40, de mayor preferencia entre 1 y 20, de mayor preferencia entre 2 y 10, de mayor preferencia entre 2 y 6 y de preferencia especial entre 2 y 4 átomos de carbono, Si los heteroátomos estuvieran presentes, el grupo espaciador incluye por lo general entre 1 y 20, preferentemente entre 1 y 8 y de preferencia especial entre 1 y 4 heteroátomos, El residuo hidrocarbonado puede incluir opcionalmente una cadena alquílica ramificada o un grupo arilo o un grupo cicloalquilo que tiene, por ej , entre 5 y 7 átomos de carbono, o ser un grupo aralquilo, un grupo alcarilo donde la parte del alquilo puede ser lineal y/o grupo alquilo cíclico, De acuerdo con una forma de realización aún más preferida, el residuo hidrocarbonado es una cadena alquílica con entre 1 y 20, preferentemente entre 2 y 10, de mayor preferencia entre 2 y 6, y de preferencia especial entre 2 y 4 átomos de carbono.

Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un método y un conjugado según lo descrito más arriba, en donde el polímero se somete a la reacción con 1,4-diaminobutano, 1, 3-diaminopropano o 1, 2-diaminoetano para producir el derivado del polímero. Por lo menos, la reacción del compuesto bifuncional que incluye M y Q con el polímero se lleva a cabo preferentemente a una temperatura entre 0 y 100°C, de mayor preferencia entre 4 y 80°C y de preferencia especial entre 20 y 80°C; el tiempo de reacción preferentemente oscila entre 4 h y 7 d, de mayor preferencia entre 10 h y 5 d de preferencia especial entre 17 y 4 h, La relación molardel compuesto por lo menos bifuncional ¡polímero preferentemente está en la escala entre 10 y 200, especialmente entre 50 y 100. Como solvente para la ¦ reacción del compuesto por lo menos bifuncional con el polímero, se prefiere, por lo menos, un solvente aprótico, de preferencia particular un solvente aprótico anhidro que tiene un contenido de agua no mayor que 0,5 por ciento en peso, preferentemente no mayor que 0,1 por ciento en peso, Los solventes adecuados son, entre otros, dimetilsulfóxido (DMSO) , N-metilpirrolidona, dimetilacetamida (DMA) , dimetilformamida (DMF) y mezclas de dos o más de ellos. Como solvente para la reacción del compuesto por lo menos bifuncional con el polímero, también se puede usar un medio acuoso .

De acuerdo con una forma preferida de realización, del derivado del polímero que incluye el polímero y el compuesto por lo menos bifuncional se puede modificar químicamente en el grupo funcional libre Q para producir un derivado del polímero que incluye un grupo aldehido o grupo ceto o grupo hemiacetal . De acuerdo con esta forma de realización, se prefiere hacer reaccionar el derivado del polímero, por lo menos, con un compuesto bifuncional, que por lo menos incluye un grupo funcional que puede ser sometido a la reacción con el grupo funcional Q y un grupo aldehido o grupo ceto o grupo hemiacetal . Es adecuado como compuesto bifuncional, el compuesto que tiene, por lo menos, un grupo aldehido o grupo ceto o grupo hemiacetal y, por lo menos, un grupo funcional con el que se puede formar una unión con el grupo funcional Q del derivado del polímero, Por lo menos, un grupo funcional se selecciona entre el mismo pool de grupo funcional como Q y se elige para que pueda reaccionar con Q, En el caso preferente de que Q sea un grupo amino-NH2, se prefiere emplear un ' compuesto que tenga, aparte del grupo aldehido o grupo ceto o grupo hemiacetal, por lo menos, un grupo carboxi o, por lo menos, un grupo carboxi reactivo, preferen emente un grupo carboxi o un grupo carboxi reactivo. El grupo aldehido grupo o grupo ceto o grupo hemiacetal y el grupo carboxi o el grupo carboxi reactivo puede ser separado por cualquier espaciador adecuado. Entre otros, el espaciador puede ser opcionalmente un residuo hidrocarbonado cíclico sustituido, lineal y/o ramificado, Por lo general, el residuo hidrocarbonado tiene entre 1 y 60, preferentemente entre 1 y 40, de mayor preferencia entre 1 y 20, de mayor preferencia entre 2 y 10, de mayor preferencia entre 2 y 6 y de preferencia especial entre 2 y 4 átomos de carbono. Si los heteroátomos estuvieran presentes, el grupo espaciador incluye por lo general entre 1 y 20, preferentemente entre 1 y 8 y de preferencia especial entre 1 y 4 heteroátomos. El residuo hidrocarbonado puede incluir opcionalmente una cadena alquílica ramificada o un grupo arilo o un ciclogrupo alquilo que tienen, por ej , entre 5 y 7 átomos de carbono, o ser un grupo aralquilo, un grupo alcarilo donde la parte del alquilo puede ser a lineal y/o grupo alquilo cíclico. De acuerdo con una forma de realización aún más preferida, el residuo hidrocarbonado es un residuo arilo que tienen entre 5 y 7 y preferentemente 6 átomos de carbono. El de mayor preferencia, del residuo hidrocarbonado es el residuo benceno. De acuerdo con esta forma de realización preferida, el grupo carboxi y el grupo aldehido puede está ubicada en el anillo benceno en la 1,4-posición, 1,3-posición o 1 , 2-posición, la 1,4-es la posición preferida . Como grupo carboxi reactivo, se puede mencionar un áster reactivo, esotiocianatos o esocianatos. Los ésteres reactivos preferidos son los que derivan de N-hidroxisuccinimidas, tales como N-hidroxi succinimida o Sulfo-N-hidroxi succinimida, los fenoles sustituidos adecuados, tales como p-nitrofenol o p-dinitrofenol o, o 1 -dinitrofenol, triclorofenoles , tales como 2 , 4 , 6-triclorofenol o 2,4,5-triclorofenol , trifluorofenol , tales como 2,4, S-trifluorofenol o 2 , 4 , 5-trifluorofenol , pentaclorofenol , pentafluorofenol, o hidroxiazoles , tales como hidroxi benzotriazol . Se prefiere especialmentes son N-hidroxi succinamidas, los Se prefiere especialmentes son N-hidroxi succinimida y Sulfo-N-hidroxi succinimida, Todos los alcoholes pueden ser empleados solos o como combinaciones adecuadas, de dos o más, de ellos, Como éster reactivo, se prefiere especialmente al éster pentafluorofenilo y al éster N-hidroxi succinimida. Por lo tanto, de acuerdo con una forma preferida de realización, de la presente invención se refiere a un método y un conjugado según lo descrito más arriba, en donde el derivado del polímero que incluye Q, Q es un grupo amino -NH2, se hace reaccionar además con ácido formilbenzoico . De acuerdo con otra forma de realización, la presente invención se refiere a un método y un conjugado según lo descrito más arriba, en donde el derivado del polímero que incluyen Q, Q es un grupo amino, se hace reaccionar además con el pentafluorofenil éster del ácido formilbenzoico .

De acuerdo aún con otra forma de realización, la presente invención se refiere a un método y un conjugado según lo descrito más arriba, en donde el derivado del polímero que incluyen Q, Q es un grupo amino, se nace reaccionar además con el N-M(iroxisuccinimidil éster del ácido f ormilbenzoico . De acuerdo con aún otra forma de realización, la presente invención se refiere a un método y un conjugado según lo descrito más arriba, en donde el derivado del polímero que incluyen Q, Q es un grupo amino, se hace reaccionar además con ácido 4- (4-formil-3 ,5-dimetoxif enoxi ) butírico . Como solvente para la reacción del derivado del polímero que incluyen un grupo amino y, por ej , ácido f ormilbenzoico, por lo menos, un solvente aprótico, de preferencia particular un solvente aprótico anhidro que tienen un contenido de agua no mayor que 0,5 por ciento en peso, preferentemente no mayor que 0 , 1 por ciento en peso, Los solventes adecuados son , entre otros , dimetilsulf óxido (DMSO) , N-metilpirrolidona, dimetilacetamída (DMA) , dimetilf ormamida (DMF) y mezclas de dos o más de ellos . La reacción se lleva a cabo preferentemente a una temperatura entre 0 y 40 °C, de mayor preferencia entre 0 y 25 °C y de preferencia especial entre 15 y 25 ° C para un tiempo de reacción preferentemente entre 0 , 5 y 24 h y de preferencia especial entre 1 y 17 h . De acuerdo con una forma preferida de realización, la reacción se lleva a cabo en presencia de un agente activador .

Los agentes activadores adecuados son, entre otros, las carbodiitnidas, tales como diisopropil carbodiimda (DIC), diciclohexil carbodiimidas (DCC) , l-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) , diisopropil carbodiimida (DIC) es la especialmente preferida. El derivado del polímero resultante puede ser purificado en la mezcla de la reacción, por lo menos, mediante un método adecuado. Si fuera necesario, el derivado del polímero puede ser precipitado antes de la aislación mediante, por lo menos, un método adecuado. Si el derivado del polímero es precipitado primero, es posible, por ej , poner en contacto a la mezcla de reacción con, por lo menos, un solvente o una mezcla de solventes que no sea el solvente o una mezcla de solventes presente en la mezcla de reacción a las temperaturas adecuadas. De acuerdo con una forma de realización particularmente preferida de la presente invención donde un medio acuoso, preferentemente agua se usa como solvente, la mezcla de la reacción se pone en contacto con 2-propanol o con una mezcla de acetona y etanol, preferentemente en una relación 1:1 mezcla (v/v) , indicando volúmenes iguales de los mencionados compuestos, a una temperatura, preferentemente en la escala entre -20 a +50°C y de preferencia especial en la escala entre -20 y 25°C. La aislación del derivado del polímero se puede llevar a cabo mediante un proceso adecuado que puede incluir uno o más pasos, De acuerdo con una forma preferida de realización de la presente invención, el derivado del polímero se separa primero de la mezcla de la reacción o de la mezcla de la mezcla de la reacciónda con, por ej , mezcla acuosa 2-propanol, mediante un método adecuado, tales como centrifugación o filtración. En un segundo paso, el derivado del polímero separado puede ser sometido a otro tratamiento, tales como un postratamiento como diálisis, filtración centrifuga o filtración a presión, cromatografía de cambio de iones, cromatografía de fase reversa, HPLC, PLC, filtración por geles y/o liofilización, De acuerdo con una forma de realización aún más preferida, el derivado del polímero separado se dializa primero, preferentemente contra agua, y luego se liofiliza hasta que el contenido del solvente del producto de la reacción sea suficientemente bajo de acuerdo con las especificaciones deseadas del producto. La liofilización se puede llevar a cabo a una temperatura entre 20 y 35°C, preferentemente entre 20 y 30°C. El derivado del polímero resultante con el grupo aldehido o grupo ceto o grupo hemiacetal se hace reaccionar posteriormente con un grupo amino de la proteína por aminación reductiva. En cuanto a la unión de, por lo menos, un grupo amino de la proteína con, por lo menos, un grupo aldehido o grupo ceto o grupo hemiacetal del polímero por aminación reductiva, se hace referencia a la declaración detallada arriba que trata los parámetros específicos de la reacción de la reacción de aminación reductiva, tales como pH o la temperatura, De acuerdo con una forma especialmente preferida de realización de la presente invención, la aminación reductiva se lleva a cabo a una temperatura entre 0 y 10 °C, tales como entre 1 y 8°C o entre 2 y 6°C, tales como aproximadamente 4°C con un pH de aproximadamente 4,5 y 5,5, tales como aproximadamente 5,0, El tiempo de reacción es aproximadamente 10 y 20 h, tales como entre 12 y 19 h o entre 14 y 18 h, tales como aproximadamente 17 h o aproximadamente 20 y 30 h, tales como aproximadamente 24 h. Por lo tanto, de acuerdo con la forma de realización preferida mencionada arriba, la presente invención también se refiere, en caso de que el polímero haya sido sometido a la reacción a través de su extremo reductor oxidado, a un conjugado de acuerdo con la fórmula De acuerdo con una forma de realización especialmente preferida, el polímero es hidroxietil almidón, es decir, HAS' es HES ' , y n = 2, 3, o 4, El de mayor preferencia es el 4, según lo descrito más arriba, Por consiguiente, en caso de que el polímero haya sido sometido a la reacción a través de extremo reductor oxidado, la presente invención también se refiere a a conjugado de acuerdo con la fórmula De acuerdo con otra forma preferida de realización, la presente invención también se refiere, en caso de que el polímero haya sido sometido a la reacción a través de extremo reductor oxidado, a un conjugado de acuerdo con la fórmula donde n = 2, 3, o 4, R4 es independientemente hidrógeno o un grupo metoxi, y m = 0 en caso de que R4 sea hidrógeno y m = 1 en caso de que R sea metoxi, siendo HAS preferentemente HES 1.

En cada una de las fórmula anteriores, el nitrógeno unido a la proteína deriva del grupo amino de la proteína a la cual el derivado del polímero está unido a través del grupo aldehido. Con respecto a las formas de realización antes mencionadas de acuerdo a las cuales los grupos funcionales M y Q comprenden un grupo amino -NH2, también es posible que M sea un grupo amino -NH2 y que Q comprenda un grupo beta hidroxi amino -CH (OH) -CH2-NH2 y preferentemente es un grupo beta hidroxi amino..

Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un método y un conjugado según lo descrito más arriba, en donde el grupo amino Q del compuesto que comrpende dos grupos amino M y Q, es un grupo beta hidroxi amino - En este caso, M y Q pueden estar separados por cualquier espaciador adecuado. Entre otros, el espaciador puede ser opcionalmente un residuo hidrocarbonado cíclico sustituido, lineal y/o ramificado, Por lo general, el residuo hidrocarbonado tiene entre 1 a 60, preferentemente entre 1 a 40, de mayor preferencia entre 1 a 20, de mayor preferencia entre 2 a 10, de mayor preferencia entre 1 a 6 y de preferencia especial entre 1 a 2 átomos de carbono, Si los heteroátomos estuvieran presentes, el grupo espaciador incluye por lo general entre 1 a 20, preferentemente entre 1 a 8 y de preferencia especial entre 1 a 4 heteroátomos, El residuo hidrocarbonado puede incluir opcionalmente una cadena alquílica ramificada o un grupo arilo o un ciclogrupo alquilo que tienen, por ej , entre 5 a 7 átomos de carbono, o ser un grupo aralquilo, un grupo alcarilo donde la parte del alquilo puede ser a lineal y/o grupo alquilo cíclico. De acuerdo con una forma de realización aún más preferida, el residuo · hidrocarbonado es una cadena alquílica entre 1 a 20, preferentemente entre 1 a 10, de mayor preferencia entre 1 a 6, de mayor preferencia entre 1 a 4 átomos de carbono y de preferencia especial entre 1 a 2 átomos de carbono, De mayor preferencia aún, M y Q son separated por un grupo metileno.

Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un método y un conjugado según lo descrito más arriba, en donde el polímero se somete a la reacción con 1,3-diamino-2-hidroxipropano . En caso de que el polímero se hace reaccionar a través de extremo reductor oxidado, un derivado del polímero de acuerdo con la fórmula resulta de preferencia especial con HAS' - HES' . La reacción del compuesto por lo menos bifuncional que incluye M y Qr de preferencia particular 1, 3-diamino-2-hidroxipropano, con el polímero se lleva a cabo preferentemente a una temperatura entre 40 y 120 °C, de mayor preferencia entre 40 y 90 °C y de preferencia especial entre 60 y 80°C, El tiempo de reacción preferentemente se ubica entre 17 a 168 h, de mayor preferencia entre 17 a 96 h y de preferencia especial entre 48 a 96 h, La relación molar de, por lo menos, compuesto bifuncional : polímero es preferentemente en la escala entre 200:1 a 10:1, especialmente entre 50:1 a 100:1.

Como solvente para La reacción del compuesto, por lo menos, bifuncional con el polímero, por lo menos, se prefiere un solvente aprótico, preferentemente un solvente aprótico anhidro que tienen un contenido de agua no mayor que 0,5 por ciento en peso, preferentemente no mayor que 0,1 por ciento en peso, Los solventes adecuados son, entre otros, dimetilsulfóxido (DMSO) , N-metilpirrolidona, dimetilacetamida (DMA) , dimetilformamida (DMF) y mezclas de dos o más de ellos . El grupo beta hidroxi amino Q del derivado del polímero por lo general puede hacerse reaccionar con un compuesto, por lo menos, bifuncional que incluyen, por lo menos, un grupo funcional que puede ser sometido a reacción con Q y además que incluyen, por lo menos, un grupo funcional que es un grupo aldehido o grupo ceto o grupo hemiacetal o un grupo funcional que puede ser sometido a modificado para producir un grupo aldehido o grupo ceto o grupo hemiacetal, De acuerdo con otra forma de realización de la presente invención, el grupo beta hidroxi amino es directamente químicamente modificado para producir un grupo aldehido mediante oxidación química. Esta oxidación puede ser llevada a cabo con todos los agentes de oxidación adecuados que son susceptible de convertir el grupo beta hidroxi amino a un grupo aldehido. Son reactivos de oxidación preferidos los peryodatos , tales como peryodatos de metal alcalino. Se prefiere especialmente el peryodato de sodio que es preferentemente empleado como solución acuosa. Esta solución tiene una concentración de yodato preferida de entre 1 a 50 rrM, de mayor preferencia entre 1 a 25 mM y de preferencia especial entre 1 a 10 rrM. La oxidación se lleva a cabo a una temperatura entre 0 a 0°C, preferentemente entre 0 a 25°C y de preferencia especial entre 4 a 20°C. El derivado del polímero resultante puede ser purificado entre la mezcla de la reacción por, por lo menos, un método adecuado, Si fuera necesario, el derivado del polímero puede ser precipitado antes de la aislación de, por lo menos, un método adecuado.

Si el derivado del polímero es precipitado primero, es posible, por ej , ,poner en contacto a la mezcla de reacción con, por lo menos, un solvente o una mezcla de solventes que no sea el solvente o una mezcla de solventes presente en la mezcla de reacción a las temperaturas adecuadas, De acuerdo con una forma de realización de particular preferencia de realización de la presente invención donde un medio acuoso, preferentemente agua se usa como solvente, la mezcla de la reacción se pone en contacto con 2-propanol o con una mezcla de acetona y etanol, preferentemente a 1:1 mezcla (v/v) , indicando volúmenes iguales de los mencionados compuestos, a una temperatura, preferentemente en la escala entre -20 a +50°C y de preferencia especial en la escala entre -20 a 25°C.

La aislación del derivado del polímero se puede llevar a cabo mediante un proceso adecuado que puede incluir uno o más pasos, De acuerdo con una forma preferida de realización de la presente invención, el derivado del polímero se separa primero de la mezcla de la reacción o la mezcla de la mezcla de la reacción acuosa, con, por ej , 2 -propanol, mediante un método adecuado, tales como centrifugación o filtración. En un segundo paso, el derivado del polímero separado puede ser sometido a otro tratamiento, tales como un postratamiento como diálisis, filtración centrífuga o filtración a presión, cromatografía de cambio de iones, cromatografía de fase reversa, HPLC, MPLG, gel filtración y/o liofilización, De acuerdo con una forma de realización aún más preferida, el derivado del polímero separado se dializa primero, preferentemente contra agua, y luego se liofiliza hasta que el contenido del solvente del producto de la reacción sea suficientemente bajo de acuerdo con las especificaciones deseadas del producto, La liofilización se puede llevar a cabo a temperatura entre 20 a 35°C, preferentemente entre 20 a 30°C. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un método y un conjugado según lo descrito más arriba, en donde el la oxidación del polímero grupo beta hidroxi amino Q se lleva a cabo usando un peryodato. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un método de producción de un conjugado, en donde, en caso de que el polímero empleado presentaba un extremo reductor oxidado, un derivado del polímero que presenta un grupo beta hidroxi amino, de preferencia especial y particularmente con HAS1 = HES 1 , es oxidado, preferentemente con un peryodato, a un derivado del polímero que tienen un grupo aldehido, de preferencia especial y particularmente con HAS ' = HES ' . El derivado del polímero resultante con el grupo aldehido A se hace reaccionar posteriormente con la proteína. Por consiguiente, la presente invención también se refiere á un método de producción de un conjugado, el método mencionado que incluye hacer reaccionar un derivado del polímero que presenta un grupo beta hidroxi amino, en caso de que el polímero empleado presentaba un extremo reductor oxidado, de preferencia especial de acuerdo con la fórmula y particularmentecon HAS ' = HES 1 , con un grupo amino de la proteina . El derivado del polímero resultante con el grupo aldehido se hace reaccionar posteriormente con un grupo amino de la proteina por aminación reductxva. En cuanto a la unión de, por lo menos, un grupo amino de la proteina con, por lo menos, un grupo aldehido del polímero por aminación reductxva, se hace referencia a la revelación detallada anterior. Por lo tanto, de acuerdo con la antes mencionada forma de realización preferida, la presente invención también se refiere a un conjugado de acuerdo con la fórmula Particularmente con HAS' = HES', en caso de que polímero empleado presentaba un extremo reductor oxidado, en la fórmula anterior, el nitrógeno unido a la proteína deriva del grupo amino de la proteína el derivado del polímero está unido a través del grupo aldehido. De acuerdo con otra forma de realización de la presente invención, el polímero se somete primero a una reacción con un compuesto adecuado para producir primero un derivado del polímero que incluye, por lo menos, un grupo carboxi reactivo, Este primer derivado del polímero se somete a otra reacción con, por lo menos, un compuesto bifuncional en donde, por lo menos, un grupo funcional de este otro compuesto se somete a la reacción con, por lo menos, -un grupo carboxi reactivo del derivado del polímero y, por lo menos, además otro grupo funcional del compuesto es un grupo aldehido o grupo ceto o grupo hemiacetal o es un grupo funcional químicamente modificado para producir un grupo aldehido o grupo ceto o grupo hemiacetal, y en donde el derivado del polímero resultante que incluye al mencionado grupo aldehido o grupo ceto o grupo hemiacetal se hace reaccionar por aminación reductiva, según lo descrito más arriba, por lo menos, con un grupo amino de la proteína, También es posible alterar la secuencia de reacción del respectivo compuesto con cada uno de los otros. De acuerdo con una primera alternativa de la mencionada forma de realización, el polímero que incluye, por lo menos, un grupo carboxi reactivo se prepara oxidando selectivamente el polímero en su extremo reductor y posteriormente haciendo reaccionar el polímero oxidado, que es una lactona y/o un ácido carboxilico o una sal adecuada del ácido carboxilico, tal como una sal de metal alcalino, preferentemente como sal de sodio y/o de potasio, y HAS' preferentemente es HES 1 , con un compuesto adecuado para producir el polímero que incluye, por lo menos, un grupo carboxi reactivo. La oxidación del polímero, preferentemente hidroxietil almidón, se puede llevar a cabo de acuerdo con cada método o combinación de métodos que son los compuestos que tienen las estructuras (lia) y/o (Ilb) mencionadas arriba.

Aunque la oxidación se puede llevar a cabo de acuerdo con cualquier método adecuado o métodos resultante en el extremo reductor oxidado de almidón de hidroxialquilo , preferentemente se lleva a cabo usando una solución alcalina de yodo según lo descrito, por ej , en DE 196 28 705 Al cuyo respectivo contenido (ejemplo A, columna 9, líneas 6 hasta 24) se incorpora aqui a título de referencia. La introducción del grupo carboxi reactivo en el polímero que está selectivamente oxidado en su extremo reductor se puede lleva a cabo mediante todos los métodos posibles y todos los compuestos adecuados . De acuerdo con un método específico de la presente invención, el polímero que está selectivamen e oxidado en su extremo reductor se hace reaccionar en el extremo reductor oxidado con, por lo menos, un alcohol, preferentemente con, por lo menos, un alcohol acídico, tales como alcoholes acídicos que tienen un valor pKA en la escala entre 6 y 12 o entre 7 y 11 a 25°C, El peso molecular del alcohol acídico puede estar en la escala entre 80 y 500 g/mol, tales como entre 90 y 300 g/mol o entre 100 y 200 g/mol. Los alcoholes acídicos adecuados son todos los alcoholes H-O-RA que tienen un protón acídico y que pueden ser sometidos a una reacción con el polímero oxidado para producir el respectivo éster polímero reactivo, preferentemente de acuerdo con la fórmula todavía de mayor preferencia de acuerdo con la fórmula los alcoholes preferidos son N-hidroxi succinimidas, tales como N-hidroxi succinimida o Sulfo-N-hidroxi succinimida, fenoles sustituidos adecuados, tales como p-nitrofenol, ?,?-dinitrofenol, o, o ' -dinitrofenol, triclorofenol, tales como 2 , 4 , 6-triclorofenol o 2,4,5-triclorofenol, trifluorofenol, tales como 2,4,6-trifluorofenol o 2,4, 5-trifluorofenol, pentaclorofenol, pentafluorofenol, o hidroxiazoles , tales como hidroxi benzotriazol . Se prefiere especialmente las N-hidroxi succinamidas, con N-hidroxisuccinimida y Sulfo-N-hidroxisuccinimida es especialmente el preferido, Todos los alcoholes pueden ser empleados solos o como combinaciones adecuadas de dos o más de ellos, En el contexto de la presente invención, también es posible emplear un compuesto que libere el alcohol respectivo, por e , agregando diésteres de ácido carbónico. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un método según lo descrito más arriba, en donde el polímero que está selectivamente oxidado en su extremo reductor se activa haciendo reaccionar el polímero oxidado con un alcohol acídico, preferentemente con . N-hidroxi succinimida y/o Sulfo-N-hidroxi succinimida. De acuerdo con una forma preferida de realización de la presente invención, el polímero que es selectivamente oxidado en su extremo reductor se hace reaccionar en el extremo reductor oxidado con, por lo menos, un diéster carbónico RB— 0- (C=0) -O-Rc, en donde RB y Rc puede ser el mismo o diferente, Preferentemente, este método da polímeros reactivos de acuerdo con la fórmula en donde HAS' es preferentemente HES ' . Como compuestos adecuados de diéster carbónico, pueden ser empleados los compuestos cuyos componentes alcohol son independientemente N-hidroxi succinimidas, tales como N-hidroxi succinimida o Sulfo-N-hidroxi succinimida, los fenoles sustituidos adecuados, tales como p-nitrofenol , o,p-dinitrofenol, o, o ' -dinitrofenol, triclorofenol, tales como 2 , 4 , ß-triclorofenol o 2 , 4, 5-triclorofenol, trifluorofenol , tales como 2 , , 6-trifluorofenol o 2 , 4 , 5-trifluorofenol , pentaclorofenol , pentafluorofenol , o hidroxiazoles, tales como hidroxi benzotriazol , Se prefiere especialmente al carbonato de ?,?' -disuccinimidilo y carbonato de S lfo-?,?'-disuccinimidilo, se prefiere especialmente el carbonato de ?,?' -disuccinimidilo. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un método según lo descrito más arriba, en donde el polímero selectivamente oxidado en su extremo reductor se activa haciendo reaccionar el polímero oxidado con carbonato de N, 1 -disuccinimidilo . El alcohol acídico se somete a la reacción con el polímero oxidado o la sal del polímero oxidado con una relación molar de alcohol acídico ¡polímero preferentemente entre 5:1 y 50:1, de mayor preferencia entre 8:1 y 20:1, a una temperatura de reacción preferida entre 2 y 40°C, de mayor preferencia entre 10 y 30°C y de preferencia especial entre 15 y 25°C, El tiempo de reacción está preferentemente en la escala entre 1 y 10 h, de mayor preferencia entre 2 y 5 h, de mayor preferencia entre 2 y 4 h y particularmente entre 2 y 3 h.

El compuesto de diéster carbónico se somete a la reacción con el polímero oxidado o con la sal del polímero oxidado en relación molar de diester compuesto : polímero, por lo general, entre 1:1 y 3:1, tales como entre 1:1 y 1,5:1, El tiempo de reacción está, por lo general, en la escala entre 0,1 y 12 h, como entre 0,2 y 6 h, o entre 0,5 y 2 h o entre 0,75 y 1,25 h. De acuerdo con una forma preferida de realización de la presente invención, haciendo reaccionar el polímero oxidado con alcohol acídico y/o diéster carbónico se lleva a cabo, por lo menos, en un solvente aprótico, tales como en un solvente aprótico anhidro que tiene un contenido de agua no mayor que 0,5 por ciento en peso, preferentemente no mayor que 0,1 por ciento en peso, Los solventes adecuados son, entre otros, dimetilsulfóxido (DMSO) , N-metilpirrolidona, dimetilacetamida (DMA) , di etilformamida (DMF) y mezclas de dos o más de ellos, Las temperaturas de reacción están preferentemente en la escala entre 2 y 40°C, de mayor preferencia entre 10 y 30°C. Haciendo reaccionar el polímero oxidado con, por lo menos, un alcohol acídico, se emplea, por lo menos, un agente activador adicional. Los agentes activadores adecuados son, entre otros, carbonildiimidazol , carbodiimidas, tales como diisopropil carbodiimida (DIC) , diciclohexil carbodiimidas (DCC) , 1-etil-3- (3-dimetiloaminopropil) carbodiimida (EDC) , siendo la diciclohexil carbodiimida (DCC) y la l-etil-3- (3-dimetiloaminopropil) carbodiimida (EDC) las especialmente preferidas. Por consiguiente, la presente invención también se refiere al método según lo descrito más arriba, donde el polímero que está oxidado en su extremo reductor, se somete a la reacción con un alcohol acídico en presencia de un agente activador adicional para producir el polímero ester reactivo. De acuerdo con una forma de realización de la presente invención, la reacción del polímero oxidado con diéster carbónico y/o alcohol acldico se lleva a cabo en una base de actividad baja que se puede determinar agregando agua a la mezcla de reacción con un coeficiente de volumen de agua a la mezcla de reacción 10:1, Antes de agregarle el agua que fundamentalmente no debe contener ningún buffer, tiene valor pH de 7 a 25°C, Después de agregar la mezcla de la reacción y midiendo el valor pH, se obtiene la base actividad de la mezcla de la reacción, que tiene un valor preferentemente no mayor que 9,0, de mayor preferencia no mayor que 8,0 y de preferencia especial no mayor que 7,5. De acuerdo con otra forma de realización de la presente invención, el polímero oxidado se somete a la reacción con N-hidroxi succinimida en DMA seco, en ausencia de agua, con EDC para dar selectivamente el polímeroN-hidroxi succinimida ester de acuerdo con la fórmula siendo HAS' con mayor preferencia HES'. Sorprendentemente, esta reactividad no da subproductos resultantes de la reacción de EDC con el grupo OH de HES, y la reacción de reordenamiento de la O-acil isourea formada por EDC y el polímero oxidado a la respectiva N-acila urea se suprime sorprendentemente. De acuerdo con otra forma preferida de realización de la presente invención, el polímero oxidado se somete a la reacción con carbonato de N, N 1 -disuccinimidilo en DMF seco en ausencia de agua y en ausencia de un agente activador para dar selectivamente el polímeroN-hidroxi succinimida ester, de acuerdo con la fórmula siendo HAS' con mayor preferencia HES'. De acuerdo con otra forma de realización de la presente invención, el polímero que está selectivamente oxidado en su extremo reductor se hace reaccionar en el extremo reductor oxidado con una azolida, tales como carbonilodiimidazol o carbonil dibenzoimidazol para producir un polímero que tiene un grupo carboxi reactivo. En el caso de carbonildiimidazol, resulta un derivado imidazólico del polímero de acuerdo con la fórmula en donde HAS 1 es preferentemente HES ' . De acuerdo con una segunda alternativa de la otra forma mencionado de realización de la presente invención respecto a la introducción de, por lo menos, un grupo carboxi reactivo en el polímero, el grupo carboxi reactivo se introduce en el polímero cuyo extremo reductor no está oxidado, haciendo reaccionar, por lo menos, un grupo hidroxi del polímero con un diéster carbónico. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un método y conjugados en donde el grupo carboxi reactivo se introduce en el polímero cuyo extremo reductor no está oxidado, haciendo reaccionar, por lo menos, un grupo hidroxi del polímero con, por lo menos, un diéster carbónico diéster carbónico RB-0- (C=0)-0-Rc, en donde RB y Rc puede ser el mismo o diferente. De acuerdo con otra forma de realización de la presente invención, el polímero cuyo extremo reductor no está oxidado, se hace reaccionar, por lo menos, en un grupo hidroxi con una azolida tales como carbonilodiimidazol , carbonilo-di- (1, 2 , 4-triazol) o carbonilo dibenzimidazol para producir un polímero que tienen un grupo carboxi reactivo.

Como compuestos adecuados de diester carbónico, pueden ser empleados los compuestos cuyos componentes alcohol son independientemente N-hidroxi succinamidas, tales como N-hidroxi succinimida o Sulfo-M-hidroxi succinimida, los fenoles sustituidos adecuados, tales como p-nitrofenol , o,p-dinitrofenol , o, o 1 -dinitrofenol , triclorofenol , tales como 2 , 4 , 6-triclorofenol o 2 , 4 , 5-triclorofenol , trifluorofenol , tales como 2 ,4, 6-trifluorofenol o 2 , 4 , 5-trifluorofenol , pentaclorofenol , pentafluorofenol , o hidroxiazoles , tales como hidroxi benzotriazol . Se prefiere especialmente a los compuestos de diester carbónico simétrico, RB y Re que sigue siendo el mismo, El componente del alcohol diéster carbónico está preferentemente seleccionado entre el grupo que consiste en fenoles sustituidos de N-hidroxi succinimida, N-hidroxi succinimida sulfonado, N-hidroxi benzotriazol, y nitro- y "halógeno-, Entre otros, nitrofenol, dinitrofenol , triclorofenol, trifluorofenol , pentaclorofenol , y penta luorofenol son los preferidos, Se prefiere especialmente al carbonato de ?,?'-disuccinimidilo y carbonato de Sulfo- ?,?' -disuccinimidile, con carbonato de ?,?' -disuccinimidilo que se prefiere especialmente .

Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un hidroxialquil almidón derivado, preferentemente un idroxietil almidón derivado, en donde, por lo menos, en un grupo hidroxi, preferentemente, por lo menos, en dos grupos hidroxi del mencionado almidón han sdio sometidos a la reacción con un compuesto de diéster carbónico para producir el éster reactivo respectivo. De acuerdo con una forma de realización de la presente invención, la reacción del polímero cuyo extremo reductor no está oxidado, por lo menos, con un compuesto de diéster carbónico se lleva a cabo a una temperatura entre 2 y 40°C, de mayor preferencia entre 10 y 30°C y especialmente entre 15 y 25°C, El tiempo de reacción preferido oscila entre 0,5 y 5 h, de mayor preferencia entre 1 y 3 h, y de preferencia especial entre 2 y 3 h. La relación molar del compuesto de diéster carbónico : polímero depende del grado de sustituición del polímero considerando el el número de grupos hidroxi en la reacción con compuesto de diéster carbónico relativo relativo al número de grupos hidroxi presentes en el polímero no-reactivo. De acuerdo con una forma de realización de la presente invención, la relación molar de compuesto de diéster carbónico :unidades de anhidroglucosa del polímero está en la escala entre 1:2 y 1:1000, de mayor preferencia entre 1:3 y 1:100 y de preferencia especial entre 1:10 y 1:50, para producir un grado de sustitución en la escala entre 0,5 y 0,001, preferentemente entre 0,33 y 0,01 y de preferencia especial entre 0,1 y 0,02. De acuerdo con una forrra de realización de la presente invención, haciendo reaccionar el polímero cuyo extremo reductor no está oxidado, se lleva a cabo con diéster carbónico, por lo menos, en un solvente aprótico, de preferencia particular in un solvente aprótico anhidro que tiene un contenido de agua no mayor que 0,5 por ciento en peso, preferentemente no mayor que 0,1 por ciento en peso, Los solventes adecuados son, entre otros, dimetilsulfóxido (DMSO) , N-metilpirrolidona, dimetilacetamida (DMA.) , dimetilformamida (DMF) y mezclas de dos o más de ellos. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un método según lo descrito más arriba en donde la reacción, por lo menos, de un grupo hidroxi del polímero cuyo extremo reductor no está oxidado con el diéster carbónico, para producir un grupo carboxi reactivo se lleva a cabo en un solvente anhidro aprótico polar, el solvente preferentemente es dimetilacetamida, dimetilformamida o una mezcla de ellos. El reactivo derivado del polímero que incluye, por lo menos, un grupo carboxi reactivo, preferentemente el resultante entre la reacción del polímero con el alcohol acídico, el carbonato de y/o el azolida, según lo descrito más arriba, se hace reaccionar, por lo menos, además con otro compuesto bifuncional en donde, por lo menos, un grupo funcional Fx de este otro compuesto , por lo menos , se somete a la reacción con un grupo carboxi reactivo del derivado del polímero, Por lo menos , como un grupo funcional Fi del otro compuesto no existen limitaciones específicas dado que se puede hacer la reacción con, por lo menos, un grupo carboxi reactivo del polímero, El grupo funcional F1; por ej , es un grupo amino o un grupo hidroxi o un grupo tio o un grupo carboxi . Además el compuesto bifuncional incluye, por lo menos, otro grupo funcional F2 que es un grupo aldehido o un grupo funcional F2 que puede ser modificado químicamente para producir un grupo aldehido, La modificación química puede ser, por ej , una reacción del grupo funcional F2 con un grupo funcional F3 otra unión compuesto o una oxidación o una reducción adecuada del grupo funcional F2. En caso de que F2 se someta a una reacción con un grupo funcional F3 de otr compuesto, el grupo funcional F2 puede ser seleccionado, entre otros, C-C- uniones dobles o C-C- uniones triples o C-C-uniones aromáticoas; el grupo tio o el grupo hidroxi ; ácido alquilsulf ónico idrazida, ácido arilsulf ónico hidrazida ; 1 , 2 -dioles ; 1 , 2 -aminoalcoholes ; 1 , 2 amino -tioalcoholes ,- azidas ; el grupo amino -N¾ o derivados del grupo amino que incluyen la unidad estructural -NH- , tales como el grupo aminoalquilo, grupo aminoarilo, grupo aminoarilálquilos, o grupo alcariiamino; - el grupo hidroxilamino -0-NH2, p derivados del grupo hidroxilamino que incluyen la unidad estructural -O- H-, tales como el grupo hidroxilalquilaminos, grupohidroxilarilaminos , grupo hidroxilaralquilaminos, o grupo hidroxalalcarilaminos; - grupo alquiloxiaminos , grupo ariloxiaminos , grupo aralquiloxiaminos, o grupo alcariloxiaminos , todos incluyen la unidad estructural -NH-0-; residuos que tienen un grupo carbonilo, -Q-C (=G) - , en donde G es 0 o S, y M es, por ejemplo, -- -OH o -SH; un grupo alquiloxi, un grupo ariloxi, un grupo aralquiloxi, o un grupo alcariloxi; un grupo alquilotio, an grupo arilotio, un grupo aralquilotio, o un grupo alcarilotio ; -- un grupo alquilocarboniloxi, un grupo arilocarboniloxi, un grupo aralquilocarboniloxi , un grupo alcarilocarboniloxi; esteres activados, tales como esteres de hidroxilaminas que tienen una estructura imida, tales como N-hidroxisuccinimida o que tienen una unidad estructural O-N donde N es parte de un compuesto heteroarilo 6, con G = 0 y Q ausente, tales como compuestos ariloxi con un residuo arilo sustituido, tales como pentafluorofenilo, paranitrofenilo o triclorofenilo; en donde Q está ausente o NH o un heteroátomo, tales como S o O; -NH-NH2, o -NH-NH-; -N02; el grupo nitrilo; grupos carbonilo, tales como el grupo aldehido o el grupo ceto ; - el grupo carboxi; el grupo -N=C=0 o el grupo -N=C=S; grupos vinlhaluros, tales como el grupo yoduro de vinilo o el bromuro de vinylo o triflato; - -C=C-H; - (C=NH2C1) -OAlquilo grupos - (C=0) -CH2-Hal en donde Hal es Cl, Br, o I; -CH=CH-S02-; - un grupo disulfuro que incluyen la estructura -S-S-; el grupo el grupo en donde F3 es un grupo que puede formar una unión química con uno de los grupos antes mencionados, uno de los grupos es preferentemente seleccionado entre los grupos antes mencionados, Asimismo, la segunda unión del compuesto preferentemente tiene, por lo menos, un grupo aldehido o grupo ceto o grupo hemiacetal que puede ser sometido a reacción co un grupo amino de la proteína, por aminación reductiva. El grupo funcional Fx y el grupo aldehido o grupo ceto o grupo hemiacetal, por lo menos, de la unión bifuncional del compuesto que se somete a la reacción con el polímero y/o los grupos funcionales Fi y F2 del, por lo menos, un compuesto de unión bifuncional que se somete a la reacción con el polímero, y/o el grupo funcional F3 y el grupo aldehido o el grupo ceto o grupo hemiacetal, por lo menos, de otro compuesto de unión bifuncional, puede ser independientemente separado por cualquier espaciador adecuado, Entre otros, el espaciador puede ser opcionalmente un sustituido, lineal, ramificado y/o cíclico, residuo hidrocarbonado alifático y/o aromático, Por lo general, el residuo hidrocarbonado tiene hasta 60, preferentemente hasta 40, de mayor preferencia hasta 20, de mayor preferencia hasta 10 átomos de carbono, Si los heteroátomos estuvieran presentes, el grupo espaciador incluye por lo general entre 1 y 20, preferentemente entre 1 y 8, de mayor preferencia 1 y 6, de mayor preferencia 1 y 4 y de preferencia especial entre 1 y 2 heteroátomos , Como heteroátomo, O es el preferido, El residuo hidrocarbonado puede incluir opcionalmente una cadena alqullica ramificada o un grupo arilo o un ciclogrupo alquilo que tiene, por e , entre 5 y 7 átomos de carbono, o ser un grupo aralquilo, un grupo alcarilo donde la parte del alquilo puede ser lineal y/ó grupo alquilo cíclico. Ejemplos de un compuesto con grupos funcionales Fi y F2 son, por ej , diaminoalcano opcionalmente sustituido que tiene entre 2 y 20 átomos de carbono, de preferencia especial 1,2-diaminoetano, 1, 3-diaminopropano, y 1, -diaminobutano, Los ejemplos preferidos de un compuesto con grupos funcionales F3 y un grupo aldehido o un grupo ceto o un grupo hemiacetal son, por e , ácido formilbenzoico, 4-ácido formilbenzoico pentafluorofenilo éster, 4-ácido formilbenzoico-N-hidroxisuccinimida éster y ácido 4- (4-formil-3 , 5-dimetoxifenoxi) -butírico. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un método de producción de un conjugado, el método mencionado que incluye hacer reaccionar el polímero, preferentemente hidroxietil almidón, compuesto opcionalmente oxidado en su extremo reductor, seleccionado entre el grupo que consiste en alcoholes acídicos, diésteres carbónicos y azolidas, para producir un derivado del polímero que incluye, por lo menos, un grupo carboxi reactivo, haciendo reaccionar el derivado del polímero mencionado con, por lo menos, un compuesto, por lo menos, compuesto bifuncional para producir un derivado del polímero que incluyen un grupo aldehido o un grupo ceto o un grupo hemiacetal o un grupo funcional que puede ser modificado químicamente para producir un grupo aldehido o un grupo ceto o un grupo hemiacetal, modificando químicamente opcionalmente el grupo funcional mencionado para producir un derivado del polímero que incluye un grupo aldehido o un grupo ceto o un grupo hemiacetal, y haciendo reaccionar el derivado del polímero que incluyen un grupo aldehido o un grupo ceto o un grupo hemiacetal con un grupo amino de una proteína, por aminación reductiva. En' consecuencia, la presente invención también se refiere a un conjugado que incluye un polímero, preferentemente hidroxietil almidón, y una proteína en unida en forma covalente a los otros, que se puede obtener por un método de producción de un conjugado; el método mencionado que incluyen la reaccioón del polímero, en su extremo reductor opcionalmente oxidado con un compuesto, seleccionado entre el grupo que consiste en alcoholes acídicos, diésteres carbónicos y azolidas, para producir un derivado del polímero que incluye, por lo menos, un grupo carboxi reactivo, por lo menos, haciendo reaccionar el mencionado derivado del polímero, por lo menos, con un compuesto bifuncional para producir un derivado del polímero que incluyen un grupo aldehido o un grupo ceto o un grupo hemiacetal o un grupo funcional que puede ser químicamente modificado para producir un grupo aldehido o un grupo ceto o un grupo hemiacetal, opcionalmente modificando químicamente el grupo funcional mencionado para producir un derivado del polímero que incluye un grupo aldehido o un grupo ceto o un grupo hemiacetal, y haciendo reaccionar el derivado del polímero que incluye un grupo aldehido o un grupo ceto o un grupo hemiacetal con un grupo amino de la proteína a través de la aminación reductiva. Un ejemplo específico del compuesto que tiene un grupo funcional Fi y un grupo funcional F2 que está oxidado para producir un grupo aldehido, por ej, es un compuesto que tiene un grupo amino corro Fx y un grupo hidroxi amino beta como F2, Se prefiere especialmente, por ejemplo, el l,3-dianunó-2-hidroxipropano, Esta oxidación se puede llevar a cabo con cualquiera de los agentes de oxidación adecuados que se pueden convertir en el grupo hidroxi amino beta en un grupo aldehido. Los reactivos de oxidación preferidos son peryodatos, tales como peryodatos metálicos alcalinos, Se prefiere especialmente al peryodato de sodio que se emplea preferentemente como solución acuosa, Esta solución tiene una concentración de yodato preferido entre 1 y 50 mM, de mayor preferencia entre 1 y 25 m y de preferencia especial entre 1 y 10 mM, La oxidación se lleva a cabo a una temperatura entre 0 y 40°C, preferentemente entre 0 y 25°C y de preferencia especial entre 4 y 20°C. El derivado del polímero resultante puede ser purificado en la mezcla de la reacción, por lo menos, mediante un método adecuado, Si fuera necesario, el derivado del polímero puede ser precipitado antes de la aislación, por lo menos, mediante un método adecuado. Si el derivado del polímero se precipita primero, es posible, por ej , poner en contacto a la mezcla de reacción con, por lo menos, un solvente o una mezcla de solventes que no sea el solvente o una mezcla de solventes de los presentes en la mezcla de reacción a las temperaturas adecuadas, De acuerdo con una forma de realización particularmente preferido de la presente invención donde un medio acuoso, preferentemente agua se usa como solvente, la mezcla de la reacción se pone en contacto con 2-propanol o con una mezcla de acetona y etanol, preferentemente a 1:1 mezcla (v/v) , indicando volúmenes iguales de los mencionados compuestos, a una temperatura, preferentemente en la escala entre -20 y +50°C y de preferencia especial en la escala entre -20 y 25°C. La aislación del derivado del polímero se puede llevar a cabo mediante un proceso adecuado que puede incluir uno o más pasos, De acuerdo con una forma preferida de realización de la presente invención, el derivado del polímero se separa primero de la mezcla de la reacción o la mezcla de la mezcla de la reacciónda con, por ej , una mezcla acuosa de 2-propanol, mediante un método adecuado, tales como centrifugación o filtración. En un segundo paso, el derivado del polímero separado puede ser sometido a otro tratamiento, tales como un postratamiento como diálisis, filtración centrifuga o filtración a presión, cromatografía de cambio de iones, cromatografía de fase reversa, HPLC, PLC, gel filtración y/o liofilización, De acuerdo con una forma de realización aún más preferida, el derivado del polímero separado se dializa primero, preferentemente contra agua, y luego se liofiliza hasta que el contenido del solvente del producto de la reacción sea suficientemente bajo de acuerdo con las especificaciones deseadas del producto, La liofilización se puede llevar a cabo a temperaturas entre 20 y 35°C, preferentemente entre 20 y 30°C. De acuerdo con otra forma de realización preferida de la presente invención, el grupo funcional Z de la proteína sometido a reacción con un grupo funcional al polímero o derivado del polímero es un grupo tiol . El grupo tiol puede estar presente en la proteína como tal, Asimismo, es posible introducir un grupo tiol en la proteína de acuerdo con un método adecuado, Entre otros métodos químicos se puede mencionar si un puente disulfuro está presente en la proteína, es posible reducir la estructura -S-S- para obtener un. grupo tiol, También es posible transformar un grupo amino presente en el polipéptido en un Grupo SH mediante la reacción del polipéptido a través del grupo amino con un compuesto que tiene , por lo menos , dos grupos funcionales diferentes , uno de los que puede ser sometido a la reacción con el grupo amino y el otro eis un grupo SH o un precursor de un grupo SH, por ej , ,N-succinimidil-S-acetyltioacetato, N-succimriudil-S-acetyltiopropionato o N-succinimidil-3- (pyridilditio)propionato, También es posible introducir un grupo SH por mutation de la proteína, tales como introduciendo una ciste na adicional en la proteína, cambiando un aminoácido por una cisteína o, tales como extrayendo a cisteína de la proteína para inhabilitar otra cisteína en la proteína para formar un puente disulfuro , El de mayor preferencia, es el polímero unido a cisteína libre de la proteína, de preferencia especial Cis 17 o Cis 18 , en donde Cis 17, por e j , está presente en Granocyte®, y Cis 18, por e j , , está presente en Neupogen® . De acuerdo con la primera forma de realización, el grupo funcional Z de la proteína es un grupo tiol y el grupo funcional A del polímero es un grupo acetilhalógeno y en donde A se introduce haciendo reaccionar al polímero en su extremo reductor opcionalmente oxidado con, por lo menos, un compuesto bifuncional que tiene, por lo menos , dos grupos funcionales y cada uno incluye un grupo amino para producir un derivado del polímero que tiene , por lo menos , un grupo funcional que incluye un grupo amino , haciendo reaccionar el derivado del polímero con un ácido acético mono- sustituido con halógeno y/o un reactivo derivado del ácido acético sustituido con halógeno .

En cuanto, por lo menos, al compuesto bifuncional que tiene, por lo menos, dos grupos funcionales cada uno que ' incluye un grupo arrd.no, todos los compuestos son concebibles si pueden ser sometidos a reacción con el polímero en su extremo reductor opcionalmente oxidado para producir- un derivado del polímero que incluye un grupo amino que se puede someter a reacción con un un ácido acético mono-sustituido con halógeno y/o un reactivo derivado del ácido acético sustituido con halógeno. De acuerdo con una forma preferida de realización, un grupo funcionaldel compuesto por lo menos bifuncional, del mencionado grupo funcional sometido a reacción con el opcionalmente extremo reductor oxidado del polímero, se selecciona del grupo que consiste en donde G es 0 o S y, si está presente dos veces, independientemente 0 o S, y R' es metilo. De acuerdo con una forma especialmente preferida de realización de la presente invención, el grupo funcionaldel compuesto por lo menos bifuncional, el mencionado grupo funcional sometido a reacción con el opcionalmente oxidado extremo reductor, es el grupo amino - H2/ De acuerdo con otra forma de realización preferida, está un grupo funcional, que es el de mayor preferencia el grupo amino, está en la reacción con el extremo reductor del polímero oxidado. De acuerdo con una forma preferida de realización de la presente invención, el grupo funcionaldel compuesto por lo menos bifuncional, el grupo funcional mencionado está sometido a reacción con el. monoácido acético sustituido con halógeno y/o un reactivo monoácido acético sustituido con halógeno derivado, es un grupo amino -N¾ ¦ Los grupos funcionales, preferentemente ambos de grupo amino -NH2/del, por lo menos, compuesto bifuncional, los grupos funcionales mencionados son sometidos a reacción con el polimero en su extremo reductor opcionalmente oxidado, preferentemente el extremo reductor oxidado, y el monoácido acético sustituido con halógeno y/o un reactivo monoácido acético sustituido con halógeno derivado, puede ser separado por cualquier espaciador adecuado, Entre otros, el espaciador puede ser opcionalmente un residuo hidrocarbonado cíclico sustituido, lineal y/o ramificado, Los sustituidos adecuados son, entre otros, alquilo, arilo, aralquilo, alcarilo, halógeno, carbonilo, acilo, carboxi, carboxiester, hidroxi, tio, alquiloxi y/o grupos alquilotio, Por lo general, el residuo hidrocarbonado tiene entre 1 y 60 , preferentemente entre 1 y 40 , de mayor preferencia entre 1 y 20 ," de mayor preferencia entre 2 y 10 , de mayor preferencia entre 2 y 6 y de preferencia especial entre 2 y 4 átomos de carbono, Si los heteroátomos estuvieran presentes , el grupo espaciador incluye por lo general entre 1 y 20 , preferentemente entre 1 y 8 y de preferencia especial entre 1 y 4 heteroátomos , El residuo hidrocarbonado puede incluir opcionalmente una cadena alquílica ramificada o un grupo arilo o un ciclogrupo alquilo que tienen, por ej , entre 5 y 7 átomos de carbono , o ser un grupo aralquilo , un grupo alcarilo donde la parte del alquilo puede ser a lineal y/o grupo alquilo cíclico, De acuerdo con una forma de realización aún más preferida, el residuo hidrocarbónado es una cadena alquílica con entre 1 y 20, preferentemente entre 2 y 10, y de preferencia especial entre 2 y 8 átomos de carbono. Por lo tanto, por lo menos, los compuestos bifuncional es preferidos son los compuestos bifuncional amino, de preferencia especial 1, 8-diamino octano, 1, 7-diamino heptano, 1, 6-diamino hexano, 1, 5-diamino pentano, 1, 4-diamino butano, 1, 3-diamino propano, y 1, 2-diamino etano, De acuerdo con otra preferido forma de realización, por lo menos, el compuesto bifuncional es un diaminopolietiloenglucol , preferentemente a diaminopolietiloenglucol de acuerdo con la fórmula ¾N~ (CH2-CH2-0) m-CH2-CH2-NH2 en donde m es un número entero , m preferentemente es 1 , 2 , 3 , , o 4 .

Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un método y un conjugado según lo descrito más arriba, en donde el polímero se somete a la reacción con 1,8-diaminooctano, 1, 7-diaminoheptano, 1, 6-diaminohexano, 1,5-diaminopentano, 1, 4-diaminobutano, 1, 3-diaminopropano, y 1,2-diaminoetano con el extremo reductor oxidado para producir un derivado del polímero de acuerdo con la fórmula con n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, o 8, y el polímero de preferencia especial es HES. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un método y un conjugado según lo descrito más arriba, en donde el polímero se somete a la reacción con H2N-(CH2-CH2-0) m-CH2-CH2-NH2 con extremo reductor oxidado, en donde m es 1, 2, 3, o 4, para producir un derivado del polímero de acuerdo con la fórmula con m = 1, 2, 3, o 4, y el polímero de preferencia especial es HES.

La oxidación del extremo reductor del polímero, preferentemente hidroxietil almidón, se puede llevar a cabo de acuerdo con cada método o combinación de métodos que dan lugar a los compuestos que tienen las estructuras (lia) y/o (Ilb) : Aunque la oxidación se puede llevar a cabo de acuerdo con cualquier método o métodos adecuados que dan lugar al extremo reductor del hidroxialquil almidón oxidado, preferentemente se lleva a cabo usando una solución alcalina de yodo según lo descrito, por ej , en DE 196 28 705 Al, cuyo respectivo contenido (ejemplo A, columna 9, lineas 6 a 24 ) se incorpora aquí a titulo de referencia. El derivado del polímero resultante de la reacción del polímero con el compuesto por lo menos bifuncional, se hace reaccionar además con el ácido acétido sustituido monohalogenado y/o un derivado reactivo del ácido acético sustituido con monohalógeno . Como ácido acético o reactivo ácido sustituidos con monohalógeno, son de preferencia el ácido acétido sustituido con Cl, sustituido con Br y sustituido con I, siendo de preferencia particular el cloruro del ácido acético. Si el ácido sustituido con halógeno se emplea como tal, se prefiere hacer reaccionar el ácido con el derivado del polímero en presencia de un agente activador, Los agentes activadores adecuados son, entre otros, carbodiimidas , tales como diisopropil carbodiimda (D1C) , diciclohexil carbodiimidas (DCC) , l-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) , siendo la diciclohexil carbodiimida (DCC) y la l-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) las especialmente pre eridas . Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un método y un conjugado según lo descrito más arriba, en donde el polímero, preferentemente HES, se somete a la reacción con un compuesto diamino, preferentemente un diaminoalcano con 2 y 8 átomos de carbono o H2N- (CH2-CH2-0) m-CH2-CH2-NH2 con m = 1, 2, 3, o 4, y haciendo reaccionar el derivado del polímero resultante con Br-sustituido y I-sustituido ácido acético en presencia de un agente activador, preferentemente EDC.

Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un derivado del polímero de acuerdo con la fórmula con X = Cl, Br o l, n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, o 8, y el polímero de preferencia especial es HES, o un derivado del polímero de acuerdo con la fórmula con X = Cl, Br o l, m = l, 2, 3, o 4, y el polímero de preferencia especial es HES, La reacción del derivado del polímero con el ácido acético sustituido con halógeno preferentemente se lleva a cabo en sistema acuoso preferentemente agua, el pH preferido está entre 3,5 y 5,5, de mayor preferencia entre 4,0 y 5,0 y de preferencia especial entre 4,5 y 5,0; y a una temperatura de reacción preferida entre 4 y 30 °C, de mayor preferencia entre 15 y 25 y de preferencia especial entre 20 y 25 °C; y para un tiempo de reacción preferido entre 1 y 8 h, de mayor preferencia entre 2 y 6 h y especialmente entre 3 y 5 h.

La mezcla de la reacción que incluye el derivado del polímero que incluye el polímero, por lo menos, el compuesto bifuncional y el ácido acético sustituido con halógeno, se puede usar para la reacción con la proteína como tal, De acuerdo con una forma preferida de realización de la presente invención, el derivado del polímero se separa de la mezcla de la reacción, preferen emente por ultrafiltración, subsiguiente precipitación, lavado opcional y secado al vacío . La reacción del derivado del polímero con la proteína preferentemente se lleva a cabo en un sistema acuoso. La reacción del derivado del polímero con la proteína se lleva a cabo a un pH preferido entre 6,5 y 8,5, de mayor preferencia entre 7,0 y 8,5 y de preferencia especial entre 7,5 y 8,5; y a una temperatura de reacción preferida entre 4 y 30°C, de mayor preferencia entre 15 y 25 y de preferencia especial entre 20 y 25°C; y para un tiempo de reacción preferido entre 0,5 y 8 h, de mayor preferencia entre 1 y 6 h y especialmente entre 2 y 5 h. La reacción del derivado del polímero con el grupo tiol de la proteína resulta ser un tioéter de unión- entre el derivado del polímero y la proteína. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un método y un conjugado según lo descrito más arriba, en donde el polímero, preferentemente HES, se somete a la reacción con un compuesto diamino, preferentemente un diaminoalcano con 2 a 8 átomos de carbono o ¾N- (CH2-CH2-0)m-CH2-CH2-NH2con m = 1, 2, 3, o 4, el derivado del polímero resultante se somete a la reacción con ácido acético sustituido con Br y sustituido con I en presencia de un agente activador, preferentemente EDC, y el derivado del polímero resultante se somete a reacción con un grupo tiol de la proteína para producir un conjugado que incluyen a tioéter de unión entre la proteína y el derivado del polímero. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un conjugado de acuerdo con la fórmula Proteína con n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, o 8, y el polímero de preferencia especial es HES, o un conjugado de acuerdo con la fórmula con m = 1, 2, 3, o 4, y el polímero de preferencia especial es HES, El hidroxietil almidón preferentemente es hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 10 kD y un GS de aproximadamente 0,4 o hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 10 kD y un GS de aproximadamente 0 , 7 o hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 12 kD y un GS de aproximadamente 0 , 4 o hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 12 kD y un GS de aproximadamente 0 , 7 o hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 18 kD y un GS de aproximadamente 0 , 4 o hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 18 kD y un GS de aproximadamente 0,7 o hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 50 kD y un GS de aproximadamente 0,4 o hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 50 kD y un GS de aproximadamente 0,7. De acuerdo con una segundo forma de realización, el grupo funcional Z de la proteína es un grupo tiol y grupo funcional A del polímero incluye un grupo maleimido. De acuerdo con esta forma de realización, existen varias posibilidades para producir el conjugado, En general, el polímero se hace reaccionar en su extremo reductor opcionalmente oxidado, con por lo menos, unodel compuesto por lo menos bifuncional, en donde está, por lo menos, el compuesto bifuncional que incluye un grupo funcional que puede ser sometido a la reacción con el extremo reductor del polímero opcionalmente oxidado, y ,por lo menos, un grupo funcional ya sea incluye el grupo maleimido o es químicamente modificado para producir un derivado del polímero que incluye el grupo maleimido, . De acuerdo con una forma preferida de realización, el grupo funcional mencionado es químicamente modificado para producir un derivado del polímero que incluye el grupo maleimido. Por consiguiente, la presente invención se refiere a un método y un conjugado según lo descrito más arriba, haciendo reaccionar un derivado del polímero que incluyen grupo maleimido con un grupo tiol de la proteína, el método mencionado que incluyen haciendo reaccionar el polímero en su extremo reductor opcionalmente oxidado, por lo menos, con un compuesto bifuncional que incluyen un grupo funcional U susceptible de reaccionar con el extremo reductor opcionalmente oxidado, por lo menos, el compuesto bifuncional además incluye un grupo funcional W que puede ser químicamente modificado para producir un grupo maleimido, el método además incluye la modificación química del grupo funcional W para producir un grupo maleimido. En cuanto al grupo funcional U, es posible que cada grupo funcional pueda ser sometido a la reacción con el extremo reductor del polímero opcionalmente oxidado. De acuerdo con una forma preferida de realización de la presente invención, el grupo funcional U incluye la estructura química - H- . Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un método y un conjugado según lo descrito más arriba, en donde el grupo funcional U incluye la estructura -NH- . De acuerdo con una forma preferida de realización de la presente invención, el grupo funcional U es un grupo que tienen la estructura R ' -NH- donde R 1 es hidrógeno o un residuo alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, arilocicloalquilo, alcarilo o cicloalquiloarilo donde el residuo cicloalquilo, arilo, aralquilo, arilocicloalquilo, alcarilo o cicloalquiloarilo se puede unir directamente al Grupo NH ó, de acuerdo con otra forma de realización, puede ser unido por un puente oxígeno al Grupo NH, Los residuos alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, arilocicloalquilo, alcarilo, o cicloalquiloarilo pueden ser sustituidos adecuados, Como sustituidos preferidos se puede mencionar a los halógenos, tales como F, Cl o Br, Se prefiere especialmente residuos R' son grupos hidrógeno, alquilo y alquiloxi, y aún de mayor preferencia son grupos hidrógeno y alquilo y alquiloxi no sustituido. Entre los grupos alquilo y alquiloxi, se prefiere los grupos con 1, 2, 3, 4, 5, o 6 átomos de C, De mayor preferencia son los grupos metilo, etilo, propilo, esopropilo, metoxi, etoxi, propoxi, e, esopropoxi, Se prefiere especialmente al metilo, etilo, metoxi, etoxi, y de preferencia particular son metilo o metoxi. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un método y un conjugado según lo descrito más arriba, en donde R' es hidrógeno o un metilo o un grupo metoxi . De acuerdo con otra forma preferida de realización de la presente invención, el grupo funcional U tiene la estructura R'-NH-R"- donde R" preferentemente incluye la unidad estructural -NH- y/o la unidad estructural - (C=G) - donde G es 0 o S, y/o la unidad estructural -S02-, De acuerdo con una forma de realización más preferida, el grupo funcional R" se selecciona entre el grupo que consiste en H H G donde, si G está presente dos veces, es independientemente O o S. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un método y un conjugado según lo descrito más arriba, en donde el grupo funcional U se selecciona del grupo que consiste en en donde G es 0 o S y, si está presente dos veces, independientemente 0 o S, y R' es metilo. De acuerdo con una forma de realización todavía más preferida de la presente invención, U incluye un grupo amino -NH2. De acuerdo con una forma de realización de la presente invención, el grupo funcional W del compuesto por lo menos bifuncional está químicamente modificado haciendo reaccionar el derivado del polímero que incluye W, por lo menos, con otro compuesto bifuncional que incluyen un grupo funcional que puede ser sometido a reacción con W y además que incluye un grupo maleimido. En cuanto al grupo funcional W y el grupo funcional además mencionado, por lo menos, el compuesto bifuncional que puede ser sometido a la reacción con , es el siguiente grupo funcional, donde se mencionan, entre otros: - dobles uniones C-C o triples uniones C-C- o uniones C-C aromáticas; el grupo tio o el grupo hidroxi; ácido alquilsulfónico hidrazida, ácido arilsulfónico hidrazida; 1,2 -dioles; - 1, 2-aminoalcoholes ; 1,2 amino-tioalcoholes ; azidas; el grupo amino -N¾ o derivados del grupo amino que incluyen la unidad estructural - H- , tales como grupo aminoalquilos , grupo aminoarilo, grupo aminoaralquilos, o grupoalcariiamino; el grupohidroxilamino ~0-NH2, o derivados del grupo hidroxilamino que incluyen la unidad estructural -O- H-, tales como grupo hidroxil lquilamino, grupo idroxilarilamino, grupo hidroxilaralquilaminos, o grupo hidroxalalcarilaminos ; grupo alquiloxiamino, grupo ariloxiamino, grupo aralquiloxiaminos, o grupo alcariloxaminos, cada uno incluye la unidad estructural -NH-0-; - residuos que tienen un grupo carbonilo, -Q-C (=G) -M, en donde G es O o S, y M es, por ejemplo, -OH o -SH; un grupo alquiloxi, un grupo ariloxi, un grupo aralquiloxi, o un grupo alcariloxi; -- un grupo alquilotio, un grupo arilotio, un grupo aralquilotio, o un grupo alcarilotio ; un grupo alquilocarboniloxi , un grupo arilocarboniloxi , un grupo aralquilocarboniloxi , un grupo alcarilocarboniloxi ; esteres activados, tales como esteres de hidroxilaminas que tienen la estructura imida, tales como N-hidroxisuccinimida o que tienen la unidad estructural 0-N donde N es parte de un compuesto heteroarilo ó, con G = 0 y Q ausente, tales como compuestos ariloxi con un residuo sustituido arilo; tales como pentafluorofenilo, paranitrofenilo o o triclorofenilo; en donde Q está ausente o NH o un heteroátomo, tales como S O O; -NH-NH2, O -NH-NH-; -N02; el grupo nitrilo; grupos carbonilo, tales como el grupo aldehido o el grupo ceto ; el grupo carboxi ; el grupo -N=C=0 o el grupo -N=C=S ; grupos haluro de vinilo, tales como el grupo yoduro de vinilo o bromuro de vinilo o triflato; -C=C-H; - (C= H2C1) -OAlquilo grupos - (C=0) -CH2-Hal en donde Hal es Cl, Br, o I; -CH=CH-S02-; un grupo disulfuro que incluye la estructura -S-S-; el grupo el grupo donde W y el grupo funcional, por lo menos, otro compuesto bifuncional, respectivamente, es un grupo susceptible de formar una unión química con de los grupos antes mencionados.

De acuerdo con todavía una forma más preferida de realización de la presente invención, W incluye un grupo amino -N¾. De acuerdo con forma preferida de realización de la presente invención, ambos W y el otro grupo funcional son grupos en la lista de grupos antes mencionados. De acuerdo con una forma de realización de la presente invención, uno de los grupos funcionales es un grupo tio, En este caso en particular, el otro grupo funcional es preferentemente seleccionado entre el grupo que consiste en en donde Hal es Cl, Br, o I, preferentemente Br o I. De acuerdo con una forma especialmente preferida de realización de la presente invención, el otro grupo funcional se selecciona entre el grupo que consiste en un éster reactivo, tales como un éster dehidroxilaminas que tienen una estructura imida, tales como N-hidroxisuccinimida o que tienen una unidad estructural 0-N donde N eis parte de un compuesto heteroarilo o, tales como un compuesto ariloxi con un residuo arilo sustituido, tales como pentafluorofenilo, paranitrofenilo o triclorofenilo, o un grupo carboxi que se transforma opcionalmente en un éster reactivo, En este caso en particular, el otro grupo funcional incluye la estructura química -NH-. De acuerdo con una forma especialmente preferida de realización de la presente invención, W incluye la estructura -NH- y el además, por' lo menos, el compuesto bifuncional incluye un ester reactivo y el grupo maleimido. En cuanto al grupo funcional que incluye la estructura -NH-, se puede hacer referencia al grupo fmcional según lo descrito más arriba, en donde W puede ser el mismo o diferente de U, De acuerdo con una forma preferida de realización de la presente invención, U y W son el mismo, Más preferentemente, ambos U y W incluye un grupo amino, Particularmente preferidos, ambos U y son un grupo amino -N¾. De acuerdo con una forma de realización de la presente invención, el polímero puede ser sometido a reacción con el compuesto, por lo menos, bifuncional que incluyen U y W en su extremo reductor no oxidado en un medio acuoso, De acuerdo con una forma preferida de realización donde U y W ambos son un grupo amino , la reacción se lleva a cabo usando el polímero con el extremo reductor oxidado formando, por lo menos, un solvente aprótico, de preferencia particular en un solvente aprótico anhidro que tiene un contenido de agua no mayor que 0, 5 por ciento en peso, preferentemente no mayor que 0, 1 por ciento en peso, Los solventes adecuados son, entre otros, dimetilsulf óxido (D SO) , N-metilpirrolidona, dimetilacetamida (DMA.) , dirretilforrinamida (DMF) y mezclas de dos o más de ellos . Especialmente en caso de que ambos U y W sean un grupo amino ¾, U y W puede ser separado por cualquier espaciador adecuado, Entre otros, el espaciador puede ser qpcionalmente un residuo hidrocarbonado cíclico sustituido, lineal y/o ramificado, Adecuadas sustituidos son, entre otros, grupo alquilo, arilo, aralquilo, alcarilo, halógeno, carbonilo, acilo, carboxi, carboxiester, hidroxi , tio , alquiloxi y/o alquilo , tio , Por lo general , el residuo hidrocarbonado tiene entre 1 y 60 , preferentemente entre 1 y 40 , de mayor preferencia entre 1 y 20 , de mayor preferencia entre 2 y 10 , de mayor preferencia entre 2 y 6 y de preferencia especial entre 2 y 4 átomos de carbono . Si los heteroátomos estuvieran presentes , el grupo espaciador incluye por lo general entre 1 y 20 , preferentemente entre 1 y 8 y de preferencia especial entre 1 y 4 heteroátomos , El residuo hidrocarbonado puede incluir opcionalmente una cadena . alquílica ramificada o un grupo arilo o un ciclogrupo alquilo que tiene, por ej , entre 5 y 7 átomos de carbono, o ser un grupo aralquilo, un grupo alcarilo donde la parte del alquilo puede ser a lineal y/o grupo alquilo cíclico, De acuerdo con una forma de realización aún más preferida, el residuo hidrocarbonado es una cadena alquílicaentre 1 y 20, preferentemente entre 2 y 10, de mayor preferencia entre 2 y 6, y de preferencia especial entre 2 y 4 átomos de carbono. Por consiguiente, . la presente invención también se refiere a un método y un conjugado según lo descrito más arriba, en donde el polímero se somete a la reacción con extremo reductor oxidado con 1, 4-diaminobutano, 1,3-diaminopropano o 1, 2-diaminoetano para producir un derivado del polímero de acuerdo con la fórmula con n = 2, 3, o 4, el polímero preferentemente es HES. De acuerdo con la antes mencionada forma de realización preferida, el derivado del polímero que incluye un grupo amino se hace reaccionar además con, por lo menos, un compuesto bifuncional que incluye un reactivo del grupo éster y el grupo maleimido, El reactivo grupo éster y el grupo maleimido puede ser separados por un espaciador adecuado , En cuanto al espaciador , se puede hace referencia del espaciador entre los grupos funcionales U y W, De acuerdo con una forma preferida de reali zación de la presente invención, el grupo reactivo éster y el grupo maleimido se separa por una cadena de hidrocarburo que tiene entre 1 y 10, preferentemente entre 1 y 8, de mayor preferencia entre 1 y 6, de mayor preferencia entre 1 y 4, de mayor preferencia entre 1 y 2 y de preferencia particular 1 carbón atom, De acuerdo con otra forma todavía de mayor preferencia de realización, el reactivo ester es un éster succinimida, y de acuerdo con una forma particularmente preferida de realización, por lo menos, el compuesto bifuncional que incluyen el grupo maleimido y el grupo reactivo ester es N- (alf a-maleimidoacetoxi) succinimido éster . Por consiguiente , la presente invención también se refiere a un derivado del polímero de acuerdo con la fórmula con n = 2 , 3 , o 4 , el polímero preferentemente es HES . El derivado del polímero que incluye el grupo maleimido se hace reaccionar además con el grupo tiol de la proteína para producir un conj ugado que incluye el derivado del polímero unido a la proteína a través del grupo tioéter .

Por consiguiente , la presente invención también se refiere a un conj ugado , que incluye la proteina y el polímero, de acuerdo con la fórmula con = 2 , 3 , o 4 , preferentemente 4 , el polímero preferentemente es HES , y en donde el átomo S en la fórmula arriba, deriva de Cisl7 o Cisl8 de la proteína, El hidroxietil almidón es preferentemente hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 10 kD y un GS de aproximadamente 0, 4 o hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 10 kD y un GS de aproximadamente 0, 7 o hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 12 kD y un GS de aproximadamente 0, 4 o hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 12 kD y un GS de aproximadamente 0, 7 o hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 18 kD y un GS de aproximadamente 0, 4 o hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 18 kD y un GS de aproximadamente 0, 7 o hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 50 kD y un GS de aproximadamente 0, 4 o hidroxietil almidón que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 50 kD y un GS de aproximadamente 0,7. La reacción del derivado del polímero que incluye el grupo maleimido con el grupo tiol de la proteína se realiza preferentemente en un sistema buffer acuoso, con un pH preferido entre 5,5 y 8,5, de mayor preferencia entre 6 y 8 y de preferencia especial entre 6,5 y 7,5, y una temperatura reacción preferida entre 0 y 40°C, de mayor preferencia entre 0 y 25 y de preferencia especial entre 4 y 21°C, y para un tiempo de reactividad preferido entre 0,5 y 24 h, de mayor preferencia entre 1 y 20 h y especialmente entre 2 y 17 h, El adecuadas pH valor reactividad mezcla puede ser ajustar agregando, por lo menos, un buffer adecuado, Entre los buffers preferidos, se puede mencionar al buffer acetato de sodio, fosfato o borato buffers, contienen ya sea concentración de urea entre 0 y 8 M, más preffered entre 2 y 8 M y se prefiere especialmente entre 4 y 8 M, y/o contienen SGS en una concentración preferida entre 0 y 1% (p/v) , de mayor preferencia entre 0,4 y 1% (p/v) y especialmente preferida entre 0,8 y 1% (p/v) . El conjugado puede ser sometido a otro tratamiento, tal como un post-tratamiento como diálisis, filtración centrífuga o filtración a presión, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de fase reversa, HPLC, MPLC, filtración por geles y/o liofilización . Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un conjugado que se obtiene mediante un método según lo descrito más arriba.

Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un conjugado que se puede obtener mediante un método según lo descrito más arriba, en donde A es un grupo carboxi reactivo, y en donde A fue introducido en el polímero cuyo extremo reductor no estaba oxidado, haciendo reaccionar, por lo menos, un grupo hidroxi del polímero con un diéster carbónico, y en donde, el mencionado incluye una molécula de polímero y, por lo menos, uno, en particular, entre 1 y 10 moléculas de proteína unidas al polímero, a través de uniones amida. La presente invención también se refiere a un conjugado que incluye una proteína y un polímero o un derivado de ellos, en donde el polímero es un hidroxialquil almidón (HAS) y la proteína es un factor de estimulación de colonias de granulocitos (G-CSF) , que tiene una estructura de acuerdo con la fórmula donde ¾, R2 y R3 son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, un grupo hidroxiarilo, un grupo hidroxiaralquilo o un grupo hidroxialcarilo que tienen entre 1 y 10 átomos de carbono, preferentemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, de mayor preferencia hidrógeno o un grupo hidroxietilo . donde G se selecciona entre el grupo que consiste en O y S, preferentemente 0, y donde L está adecuadamente sustituido opcionalmente con un residuo hidrocarbonado cíclico, lineal y/o ramificado que incluye opcionalmente, por lo menos, un heteroátomo, preferentemente un residuo alquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, heteroaralquilo que tiene entre 2 y 60 átomos de carbono . La abreviatura "Proteína1 " como se usa en las fórmula anteriores se refiere a la molécula G-CSF que se use para la reacción sin el átomo de carbono del radical carbohidrato que es parte de la unión oxima en la unión doble N=C. La presente invención también .se refiere a un conjugado según lo descrito más arriba, en donde -L- es -(C¾)n- con n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, preferentemente 2, 3, 4, 5, 6, de mayor preferencia 2, 3, 4, y de preferencia especial 4. La presente invención también se refiere a un conjugado que incluye una proteína y un polímero o un derivado de ellos, en donde el polímero es un hidroxialquil almidón (HAS) y la proteína es a factor de estimulación de colonias de granulocitos (G-CSF) , que tiene una estructura de acuerdo con la fórmula Proteína' y/o Proteína' donde Rlf R2 y R3 son independientemente un grupo hidrógeno o hidroxialquilo, un grupo hidroxiarilo, un grupo hidroxiaralquilo o un grupo hidroxialcarilo que tienen entre 1 y 10 átomos de carbono, preferentemente un grupo hidrógeno o hidroxialquilo, de mayor preferencia grupo hidrógeno o hidroxietilo, y en donde G se selecciona entre el grupo que consiste en 0 y S, preferentemente 0, y La abreviatura "Proteín 1 " como se usa en la fórmula anteriores se refiere a la molécula del G-CSF usada para la reacción sin el átomo carbono del radical carbohidrato que es parte de la unión oxima en el N=C unión doble. La presente invención también se refiere a un conjugado que incluye una proteína y un polímero o un derivado de ellos, en donde el «polímero es un hidroxialquil almidón (HAS) y la proteína es un factor de estimulación de colonias de granulocitos (G-CSF) , que tiene una estructura de acuerdo con la fórmula Proteína' Proteína' donde R2 y ¾ son independientemente un grupo hidrógeno o hidroxialquilo, un grupo hidroxiarilo, un grupo hidroxiaralquilo o un grupo hidroxialcarilo que tienen entre 1 y 10 átomos de carbono, preferentemente un grupo hidrógeno o hidroxialquilo, de mayor preferencia grupo hidrógeno o uno hidroxietilo, y donde L es sustituido adecuadamente en forma opcional por un residuo hidrocarbonado cíclico, lineal y/o ramificado, que incluye, por lo menos, un heteroátomo, preferentemente un residuo alquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, héteroaralquilo que tienen entre 2 y 60 átomos de carbono. La abreviatura " Proteína ' " como se usa en la fórmula anteriores se refiere a la molécula G-CSF usada para la reacción sin el átomo de carbono del radical carbohidrato que es parte de la unión oxima en el N=C unión doble . Las dos estructuras anteriores describen una estructura donde la unión cruzada del compuesto está unida a través de la unión anoxima al extremo reductor de tiene donde el terminal de la unidad sacárido de HES está presente en la forma abierta , y una estructura con el cíclico aminal respectivo forma donde la unión cruzada está unida compuesto en el extremo reductor de HES a través de un grupo oxiamino y donde la unidad terminal sacárido de HES está presente en forma cíclica . Ambas estructuras pueden estar presentes simultáneamente en equilibrio con cada una de las otras . La presente invención también se refiere a un conj gado según lo descrito más arriba , donde -L- es - [ (CRa¾) raG] n [CRcRd] 0-donde Ra; Rb, Rc, ¾ son independientemente hidrógeno , alquilo , arilo , preferentemente hidrógeno , donde G se selecciona entre el grupo que consiste en O y S , p e f er ent ement e O , y donde m 1 , 2 , 3 o 4 , en donde el residuos Ra y ¾ puede ser el mismo o diferente en el m grupos C Ra ¾; n 0 a 20 , preferentemente 0 a 10 , de mayor preferencia 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , El de mayor preferencia 1 o 2 ; o 0 a 20 , preferentemente 0 a 10 , de mayor preferencia 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , El de mayor preferencia 1 o 2 , en donde el residuos ¾ y ¾ puede ser el mismo o diferente en el o los grupos C ¾¾. La presente invención también se refiere a un conjugado según lo descrito más arriba, en donde ¾; ¾, R ¾ son hidrógeno, m = 2, n = 1, y o = 2. La presente invención también se refiere a un conjugado que incluye una proteína y un polímero o un derivado de ellos, en donde el polímero es un hidroxialquil almidón (HAS) y la proteína es un factor de estimulación de colonias de granulocitos (G-CSF) , que tienen una estructura de acuerdo con la fórmula Proteína' donde ¾ , R2 y 3 son independientemente un grupo hidrógeno o hidroxialquilo, un grupo hidroxiarilo, un grupo hidroxiaralquilo o un grupo hidroxialcarilo que tienen entre 1 y 10 átomos de carbono, preferentemente un grupo hidrógeno o hidroxialquilo, de mayor preferencia hidrógeno o un grupo hidroxietilo. La abreviatura "Proteína' " como se usa en la fórmula arriba a través de toda la invención se refiere a la molécula G-CSF usada para la reacción sin el átomo de nitrógeno el grupo amino que es parte del enlace amida. La presente invención también se refiere a un conjugado que incluye a proteina y un polímero o un derivado de ellos, en donde el polímero es un hidroxialquil almidón (HAS) y la proteína es a factor de estimulación de colonias de granulocitos (G-CSF) , que tienen a estructura de acuerdo con la fórmula proteiuna en donde Rlr í¾ y R3 son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, a hidroxiarilo grupo, a hidroxiargrupo alquilo o a hidroxialcarilo grupo que tienen entre 1 a- 10 átomos de carbono, preferentemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, de mayor preferencia hidrógeno o a hidroxietilo grupo, y en donde el unión -0-(C=0)- fue formada por la reacción de un grupo carboxi o un grupo carboxi reactivocon un grupo hidroxi de la molécul HASa. La abreviatura "Proteína' " como se usa en la fórmula arriba a través de toda la invención se refiere al G-CSF molécula usadas para formar la reacción sin el átomo de nitrógeno del grupo amino que es parte de la unión amida¿ La presente invención también se refiere a un conjugado, que incluyen una proteína y un polímero o un derivado de ellos, en donde el polímero es un hidroxialquil almidón (HAS) y la proteína es un factor de estimulación de colonias de granulocitos (G-CSF) , que tienen a estructura de acuerdo con la fórmula donde R2 y R3 son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, a hidroxiarilo grupo, a hidroxiargrupo alquilo o a hidroxialcarilo grupo que tienen entre 1 y 10 átomos de carbono, preferentemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, de mayor preferencia hidrógeno o un grupo hidroxietilo, y en donde L es opcionalmente un residuo hidrocarbonado cíclico sustituido, lineal y/o ramificado, opcionalmente que incluyen, por lo menos, un heteroátomo, que tienen entre 1 y 50 preferentemente entre 1 y 40, de mayor preferencia entre 1 y 20, de mayor preferencia entre 1 y 10, de mayor preferencia entre 1 y 6 de mayor preferencia entre 1 y 2 átomos de carbono y de preferencia especial 1 átomo de carbono, L es en particular CH2. La abreviatura "Proteína' " como se usa en la fórmula a través de toda la invención más arriba se refiere a la molécula G-CSF usada para la reacción sin el átomo de nitrógeno del grupo amino que es parte de la unión aminometilo . La presente invención también se refiere a un onjugado, que incluyen una proteína y un polímero o un derivado de ellos, en donde el polímero es un hidroxialquil almidón (HAS) y la proteína es un factor de estimulación de colonias de granulocitos (G-CSF) , que tiene una estructura de acuerdo con la fórmula Proteína' donde Rx, 1¾ y R3 son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, un grupo hidroxiarilo, un grupo hidroxiaralquilo o un grupo hidroxialcarilo que tienen entre 1 y 10 átomos de carbono, preferentemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo , de mayor preferencia hidrógeno o un grupo hidroxietilo, y en donde ¾. y L2 son independientemente opcionalmente un residuo hidrocarbonado cíclico sustituido, lineal y/o ramificado, opcionalmente que incluyen, por lo menos, un heteroátomo , que incluyen alquilo, arilo, aralquilp héteroalquilo, y/o héteroaralquilo radical, el residuo mencionado que tiene entre 1 y 60 preferentemente entre 1 y 40, de mayor preferencia entre 1 y 20, de mayor preferencia entre 1 y 10 átomos de carbono, y en donde D es una unión, preferentemente una unión covalente que fue formada por un grupo funcional F2 adecuado unido a Li y un grupo funcional F3 adecuado unido a L2. La abreviatura "Proteína 1 " como se usa en la fórmula anteriores a través de toda la invención se refiere a la molécula del G-CSF usado para la reacción sin el átomo de nitrógenoo del grupo amino que es parte de la unión aminometilo . La presente invención también se refiere a a conjugado según lo descrito más arriba, en donde L¡i es -(C¾)n-con n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, preferentemente 2, 2, 4, 5, 6, de mayor preferencia 2, 3, 4, y de preferencia especial 4. La presente invención también se refiere a un conjugado según lo descrito más arriba, en donde L2 incluye opcionalmente un sustituido adecuado radica arilol, preferentemente un radical arilo contiene 6 átomos de carbono, L2 es de preferencia especial C6H4, o en donde L2 es -(C¾)n-con n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, preferentemente 2, 3, 4, 5, 6, de mayor preferencia 2, 3, 4. La presente invención también se refiere a un conjugado según lo descrito más arriba, en donde se selecciona entre el grupo que consiste en C-C- uniones doble o C-C- uniones triple o aromático C-C-uniones ; - el grupo tio o el grupo hidroxi ; ácido alquilsulfónico hidrazida, ácido arilsulfonico hidrazida; 1, 2-dioles ;; 1,2 amino-tioalcoholes ; - azidas; 1 , 2-aminoalcoholes ; el grupo amino -N¾ 0 derivados del grupo amino que incluyen la unidad estructural -NH- , tales como grupo aminoalquilos, grupo aminoarilo, grupo aminoaralquilos , o grupoalcarliaminos ; el grupo hidroxilamino -0-NH2, o derivados del grupo hidroxilamino que incluyen la unidad estructural -O-NH-, tales como grupos hidroxilalquilomino, hidroxilarilamino, hidroxilaralquilamino, o hidroxalalcarilamino - grupos alquiloxiaminos , ariloxiaminos, aralquiloxiaminos o alcariloxi arainos, cada uno de ellos incluye la unidad estructural -NH-O- ; residuos que tienen un grupo carbonilo, -Q-C(=G)-M, en donde G es 0 o S, y M es, por ejemplo, -- -OH o -SH; un grupoalquiloxi , un grupo ariloxi, un grupo aralquiloxi, o un grupo alcariloxi ; un grupo alquilotio, un grupo ariltio, un grupo aralquilotio, o un grupo alcarilotio ; un grupo alquilocarboniloxi , un grupo arilocarboniloxi, un grupo aralquilocarboniloxi , un grupo alcarilocarboniloxi ; esteres activados, tales como esteres de hidroxilaminas que tienen una estructura imida, tales como N-hidroxisuccinimida o que tienen una unidad estructural 0-N donde N es parte de un compuesto heteroarilo ó, con G = 0 y Q ausente, tales como ariloxi compuestos con un residuo sustituido arilo, tales como pentafluorofenilo, paranxtrofenilo o triclorofenilo; en donde Q está ausente o NH o un heteroátomo, tales como S o O; -NH-NH2, o -NH-NH-; -N02; el grupo nitrilo ; grupos carbonilo, tales como el grupo aldehido o el grupo ceto ,· el grupo carboxi ; el grupo -N=C=0 o el grupo -N=C=S; grupos' vinil haluro, tales como el yoduro de vinilo o el grupo bromuro de vinilo o triflato; - -C=C-H; - (C=NH2C1) -0A1quilo grupos - (C=0) -CH2-Hal en donde Hal es Cl, Br, o I; -CH=CH~S02-; un grupo disulfuro que incluyen la estructura -S-S-; el grupo el grupo y en donde F3 es un grupo funcional susceptible de formar una unión química con F2 y es preferentemente seleccionado entre el mencionado grupo arriba, F2 preferentemente que incluye el radical -NH-, de mayor preferencia que incluyen un grupo amino, F3 preferentemente que incluyen el radical -(C=G)-, de mayor preferencia -(C=0)-, de mayor preferencia el radical -(C=G)-G-, todavía de mayor preferencia -(C=0)-G-, y de preferencia especial - (C=0) -O, D es de preferencia particular un enlace amida.

La presente invención también se refiere a un conjugado que incluyen un proteina y un polímero o un derivado de ellos, en donde el polímero es un hidroxialquil almidón (HAS) y la proteína es a factor de estimulación de colonias de granulocitos (G-CSF) , que tienen una estructura de acuerdo con la fórmula HAS" C — proteína rL H donde el átomo de carbono del radical -CH2-N2- deriva de un grupo aldehido que fue introducido en el polímero por una reacción de oxidación con apertura de anillo, donde HAS' ' se refiere a la molécula del hidroxialquil almidón sin el grupo aldehido resultante de la oxidación con apertura de anillo entre el anillo abierto y reaccionó con el grupo amino de la proteína, y donde el átomo de nitrógeno deriva de un grupo amino de la proteína. La abreviatura "Proteína' " como se usa en la fórmula a través de toda la invención arriba se refiere a la molécula del G-CSF usada para la reacción sin el átomo de nitrógenoo del grupo amino que es parte de la unión amida. La presente invención también se refiere a un conjugado, que incluyen una proteína y un polímero o un derivado de ellos, en donde el polímero es un hidroxialquil almidón (HAS) y la proteína es un factor de estimulación de colonias de granulocitos (G-CSF) , que tienen una estructura de acuerdo con la fórmula proteína donde ¾, i¾ y R3 son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, un hidroxiarilo grupo, un grupo hidroxiaralquilo o un grupo hidroxialcarilo que tienen entre 1 y 10 átomos de carbono, preferentemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, de mayor preferencia hidrógeno o un grupo hidroxietilo, y en donde L es opcionalmente un residuo hidrocarbonado cíclico sustituido, lineal y/o ramificado, opcionalmente que incluyen, por lo menos, un heteroátomo, que incluyen un radical alquilo, arilo, aralquilo héteroalquilo, y/o héteroaralquilo, el mencionado residuo que tiene entre 2 y 60 preferentemente entre 2 y 40, de mayor preferencia entre 2 y 20, de mayor preferencia- entre 2 y 10 átomos de carbono, y en donde el átomo de azufre se deriva entre residuo cisteína o un grupo disulfuro de la proteína. La presente invención también se refiere a un conjugado según lo descrito más arriba, en donde -L- es -[(CRaRb)mG]n[CRcRd]0- en donde Ra ¾, RC( Rd son independientemente hidrógeno, alquilo, arilo, preferentemente hidrógeno, en donde G se selecciona entre el grupo que consiste en O y S, preferentemente 0, y en donde m 1, 2, 3 o 4, El de mayor preferencia 2, en donde el residuos Ra y Rb puede ser el mismo o diferente en el m grupos C Ra ¾; n 1 y 20, preferentemente 1 y 10, El de mayor preferencia 1, 2, 3, o 4; o 1 y 20, preferentemente 1 y 10, de mayor preferencia 1, 2, 3, 4, 5, de mayor preferencia 1 o 2, El de mayor preferencia 1 , en donde los residuos Rc y Rd puede ser el mismo o diferente en los grupo CRcRd/- 6 en donde n 0, y o 2 y 20, preferentemente 2 y 10, de mayor preferencia 2, 3, 4, 5, 6, 7, o 8, en donde el residuos Rc y Rd puede ser el mismo o diferente en los grupos CRcRa. La presente invención también se refiere a un conjugado, que incluyen un proteina y un polímero o un derivado de ellos, en donde el polímero es un hidroxialquil almidón (HAS) y la proteína es un factor de estimulación de colonias de granulocitos (G-CSF) , que tienen a estructura de acuerdo con la fórmula donde Rlr ¾ y 3 son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, un grupo hidrox'iarilo, un grupo hidroxiaralquilo o un grupo hidroxialcarilo que tiene entre 1 y 10 átomos de carbono, preferentemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, de mayor preferencia hidrógeno o un grupo hidroxietilo, y donde L es opcionalmente un residuo hidrocarbonado cíclico sustituido, lineal y/o ramificado, opcionalmente que incluyen, por lo menos, un heteroátomo, que incluyen un radical alquilo, arilo, aralquilo héteroalquilo, y/o héteroaralquilo, el mencionado residuo que tienen entre 2 y 60 preferentemente entre 2 y 40, de mayor preferencia entre 2 y 20, de mayor preferencia entre 2 y 10 átomos de carbono, y en donde el átomo de azufre deriva de un residuo cisteína o un grupo disulfuro de la proteína, La presente invención también se refiere a un conjugado según lo descrito más arriba, en donde -L- es [ (CRaRb)mG]n[CRcRd] o- donde Ra; Rb, RC( R¿ son independientemente hidrógeno, alquilo, arilo, preferentemente hidrógeno, donde G se selecciona entre el grupo que consiste en O y S, preferentemente O, y en donde m 1, 2, 3 o 4, el de mayor preferencia es 2, en donde los residuos Ra y R puede ser el mismo o diferente en los m grupos C Ra Rb/-n 1 a 20, preferentemente 1 a 10, el de mayor preferencia 1, 2, 3, o 4; o 1 a 20, preferentemente 1 a 10, de mayor preferencia 1, 2, 3, '4, 5, de mayor preferencia 1 o 2, el de mayor preferencia 1, en donde los residuos Rc y Rd pueden ser el mismo o diferente en los grupos CRcRd; ó donde n 0, y o 2 a 20, preferentemente 2 a 10, de mayor preferencia 2, 3, 4, 5, 6, 7, o 8, en donde los residuos Rc y Ra puede ser el mismo o diferente en el o los grupos CRcRd. La presente invención también se refiere a cualquier conjugado según lo descrito más arriba, en donde el hidroxialquil almidón es hidroxietil almidón. La presente invención también se refiere a cualquier conjugado según lo descrito más arriba, en donde el hidroxietil almidón tiene un peso molecular entre 2 y 200 kD, preferentemente entre 4 y 130 kD, de mayor preferencia entre 4 y 70 kD.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se refiere a un conjugado según lo descrito más arriba, o un conjugado, que se puede obtener mediante un método según lo descrito más arriba, para usar en un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal. Además, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que incluyen en una cantidad terapéuticamente efectiva un conjugado según lo descrito más arriba o un conjugado, que se puede obtener mediante un método según lo descrito más arriba. El término "en una cantidad terapéuticamente efectiva" según se usa en el contexto de la presente invención se refiere a la cantidad de efecto terapéutico que proporciona en determinada condición y régimen posológico, La administración es preferentemente por difenterentes vías. La vía específica elegida dependerá de la afección a tratar. La administración forma parte preferentemente de la formulación contienen un transportador adecuado, tales como polisorbat, un diluyente adecuado, tales como el agua y/o un adyuvante adecuado, tales como sorbitol, La dosis requerida dependerá de la gravedad de la enfermedad a tratar, la respuesta de cada patiente, el método de administración usado, etc. Por lo tanto, en la forma preferida de realización, la composición farmacéutica además incluye por lo menos, un diluyente, adyuvante y/o vehículo aceptables para uso farmacéutico, especialmente y preferentemente eficaces para terapias con G-CSF. La composición farmacéutica se usa preferentemente para el tratamiento de enfermedades caracterizadas por una función hernatopoyetica e inraunológica reducidas, o de enfermedades relacionadas con las mismas. Por consiguiente, la presente invención también se refiere al uso de una composición farmacéutica según lo descrito más arriba, que incluye un conjugado segú lo descrito más arriba o un conjugado, que se puede obtener mediante un método según lo descrito más arriba, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de trastornos caracterizados por una función hematopoyética e imunológica reducida. De acuerdo con una forma preferida de realización, el trastorno caracterizado por una función hematopoyética e imunológica reducida es el resultado de la quimioterapia, radioterapia, enfermedades infecciosas, neutropenia crónica severa o leucemia. Por consiguiente, la presente invención también se refiere al uso de una composición farmacéutica según lo descrito más arriba, que incluye un conjugado según lo descrito más arriba o a conjugado, que se puede obtener mediante un método según lo descrito más arriba, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de trastornos caracterizados por una función hematopoyética e imunológica reducida, en donde el trastorno es el resultado de la quimioterapia, radioterapia, enfermedades infecciosas, neutropenia crónica severa o leucemia. El objetivo del tratamiento con la composición farmacéutica de acuerdo con la invención se administra preferentemente por vías i.v. o s.c. Por tal razón, la composición se puede administrar como solución estéril.

La invención se ilustra además por las siguientes figuras, tablas y ejemplos que de ninguna manera pretenden restringir el alcance de la presente invención. Breve descripción de las figuras Figura la La Figura la muestra un análisis por SGS PAGE del conjugado HES-G-CSF, producido de acuerdo al Ejemplo 2,1 (a), Neupogen®. Para la electroforesis en gel, se utilizaron una celda XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, arlsruhe, D) y una fuente de poder Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B) , Se utilizó un gel Bis-Tris al 12% con un buffer de corrida MOPS SGS en condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) de acuerdo a las instrucciones del fabricante, Calle A: Marcador de proteínas SeeBlue®Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) Marcador de pesos moleculares de arriba hacia abajo: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD, Calle B: Producto en bruto luego de la conjugación del G-GSF (Neupogen®) con HES como se describe en el Ejemplo 2, 1(a), Calle C: Material de partida G-CSF, Figura Ib Figura Ib muestra un análisis por SGS PAGE del conjugado HES-G-CSF, producido de acuerdo al Ejemplo 2, 1(a), l Granocyte® . Para la electroforesis en gel, se utilizaron una celGSe utilizaron una celda XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) y una fuente de poder Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B) , Se utilizaron un gel Bis-Tris al 12% con un buffer de corrida MOPS SGS en condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Calle A: Marcador de proteínas SeeBlue®Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) , Marcador de pesos moleculares de arriba hacia abajo: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD, Calle B: Producto en bruto luego de la conjugación del G-CSF (Granocyte®) con HES como se describe en el Ejemplo 2,1 (a) . Calle C: Material de partida G-CSF. Figura 2 La Figura 2 muestra un análisis por SGS PAGE del conjugado HES-G-CSF, producido de acuerdo al Ejemplo 2, 1(b), G-CSF de Strathmann Biotec AG, Hamburgo, D. Para la electroforesis en gel se utilizaron una celda XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) y una fuente de poder Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B) . Se utilizaron un gel Bis-Tris al 12% con un buffer de corrida MOPS SGS en condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Calle A: Marcador de proteínas SeeBlue®Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) . Marcador de pesos moleculares de arriba hacia abajo: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28· kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD Calle B: Producto en bruto luego de la conjugación del G-CSF con HES10/0,4 en buffer de NaOAc 0,1M pH 5,0. Calle C: Producto en bruto luego de la conjugación del G-CSF con HES10/0,7 en buffer de NaOAc 0 , 1M pH 5,0. Calle D: Producto en bruto luego de la conjugación del G-CSF con HES50/0,4 en buffer de NaOAc 0,1M pH 5,0. Calle E: Producto en bruto luego de la conjugación del G-CSF con HES50/0,7 en buffer de NaOAc 0,1M pH 5,0. Calle F: Material de partida G-CSF. Figura 3 La Figura 3 muestra un análisis por SGS PAGE de los conjugados HES-G-CSF, producido, de acuerdo al Ejemplo 2,2, G-"CSF de Strathmann Biotec AG, Hamburgo, D. Para la electroforesis en gel se utilizaron una celda XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) y una fuente de poder Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B) . Se utilizaron un gel Bis-Tris al 12% con un buffer de corrida MOPS SGS en condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Calle A: Marcador de proteínas SeeBlue®Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) , Marcador de pesos moleculares de arriba hacia abajo: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD .

Calle B: Producto en bruto luego de la conjugación del G-CSF con HESlO/0,7 oxidado en buffer de NaOAc 0,1M pH 5,0. Calle C: Producto en bruto luego de la conjugación del G-CSF con HES50/0,4 oxidado en buffer de NaOAc 0,1 pH 5,0. Calle D: Producto en bruto luego de la conjugación del G-CSF con HES50/0,7 oxidado en buffer de NaOAc 0 , 1M pH 5,0. Calle E: Material de partida G-CSF. Figura 4 La Figura 4 muestra un análisis por SGS PAGE de los conjugados HESG-CSF, producidos de acuerdo al Ejemplo 2,3, G-CSF es Neupogen® o Granocyte®. Para la electroforesis en gel se utilizaron una celda XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, arlsruhe, D) y una fuente de poder Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B) . Se utilizaron un gel Bis-Tris al 12% con un buffer de corrida MOPS SGS en condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) de acuerdo a las instrucciones del fabricante . Calle A: Marcador de proteínas SeeBlue®Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) , Marcador de pesos moleculares de arriba hacia abajo: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD. Calle B: Producto en bruto (i-N) de acuerdo al Ejemplo 2,3. Calle C: Producto en bruto (ii-N) de acuerdo al Ejemplo 2,3. Calle D: Producto en bruto (iii-N) de acuerdo al Ejemplo 2,3.

Calle E: Producto en bruto (iv-N) de acuerdo al Ejemplo 2,3. Calle F: Producto en bruto (i-G) de acuerdo al Ejemplo 2,3. Calle G: Producto en bruto (ii-G) de acuerdo al Ejemplo 2,3. Calle H: Producto en bruto (iii-G) de acuerdo al Ejemplo 2,3. Calle I: Producto en bruto (??-G) de acuerdo al Ejemplo 2,3, . Calle J: Neupogen®. Figura 5 La Figura 5 muestra un análisis por SGS PAGE de los conjugados HESG-CSF, producido de acuerdo al Ejemplo 2,4, G-CSF de Strathmann Biotec AG, Hamburgo, D. Para la electroforesis en gel se utilizaron una celda XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) y una fuente de poder Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B) , Se utilizaron un gel Bis-Tris al 12% con un buffer de corrida MOPS SGS en condiciones reductoras (ambos Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Calle A: Marcador de proteínas SeeBlue®Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) , Marcador de pesos moleculares de arriba hacia abajo: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kDr 6 kD, 3 kD. Calle B: Producto en bruto (vi) de acuerdo al Ejemplo 2,4. Calle C: Producto en bruto (v) de acuerdo al Ejemplo 2,4. Calle D: Material de partida G-CSF.

Calle E: Marcador de proteínas SeeBlue®Plus2 (Invitrogen GmbH, arlsruhe, D) , Marcador de pesos moleculares de arriba hacia abajo: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD . Calle F: Producto en bruto (ix) de acuerdo al Ejemplo 2,4. Calle G: Producto en bruto (viii) de acuerdo al Ejemplo 2,4. Calle H: Producto en bruto (vii) de acuerdo al Ejemplo 2,4. Calle I: Material de partida G-CSF. Figura 6 La Figura 6 muestra un análisis por SGS PAGE del conjugado HES-G-CSF, producido de acuerdo al Ejemplo 2,5, G~ CSF de Strathmann Biotec AG, Hamburgo, D. Para la electroforesis en gel se utilizaron una celda XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) y una fuente de poder Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B) . Se utilizó un gel Bis-Tris al 10% junto con buffer de corrida MOPS SGS en condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Calle ?: Marcador de proteínas SeeBlue®Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) , Marcador de pesos moleculares de arriba hacia abajo: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, , 6 kD,' 3 kD . Calle B: Producto en bruto de acuerdo al Ejemplo 2,5. Calle C: Material de partida G-CSF. Figura 7 La Figura 7 muestra un análisis por SGS PAGE del conjugado HESG-CSF, producido de acuerdo al Ejemplo 3, G-CSF es Neupogen® o Granocyte®. Para la electroforesis en gel se utilizaron una celda XCell Sure Lock ini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsru e, D) y una fuente de poder Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B) . Se utilizaron un gel Bis-Tris al 12% con un buffer de corrida MOPS SGS en condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Calle A: Marcador de proteínas SeeBlue®Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) , Marcador de pesos moleculares de arriba hacia abajo: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD. Calle B: Producto en bruto (x) de acuerdo al Ejemplo 3. Calle C: Producto en bruto (xi) de acuerdo al Ejemplo 3. Calle D: Producto en bruto (xii) de acuerdo al Ejemplo 3.

Calle E: Producto en bruto (xiii) de acuerdo al Ejemplo 3.

Calle F: Producto en bruto (xiv) de acuerdo al Ejemplo 3.

Calle G: Producto en bruto (xv) de acuerdo al Ejemplo 3. Figura 8 La Figura 8 muestra los resultados in vitro del Ejemplo 6, En el diagrama, el eje x muestra la concentración en pg/ml, el eje y se refiere a la cantidad de células/100.000. En el diagrama, las siguientes abreviaturas se refieren a: G-CSF/A32 conjugado G-CSF preparado de acuerdo al Ej emplo 2 , 5 G-CSF/A33 Material de partida G-CSF, usado para el conjugado del Ejemplo 2,5 G-CSF/A57 Neulasta® no modificado G-CSF/A58 Neupogen® no modificado G-CSF/A60 G-CSF conjugado preparado de acuerdo al Ejemplo 4,2 Figura 9 La Figura 9 muestra el cromatograma HPGPC con respecto al producto en bruto de la reacción de conjugación de acuerdo al Ejemplo 4,1. Se utilizaron los siguientes parámetros en el análisis HPGPC: Columna: Superosa 12 HR 10/30 300 x 10 tnm D.I. (Pharmacia) Eluyente: Ma2HP0427,38 mM; Na¾P0412,62 m ; NaCl 0,2 M; NaN30,005% en 1 1 de agua desmineralizada Flujo: 0,24 ml/h Detector 1 : Detector MALLS Detector 2: UV (280 nití) Detector 3 : RI (Detector del índice de refracción) A representa el resultado del detector 1, B representa el resultado del detector 2. Figura 10 La Figura 10 muestra el cromatograma HPGPC con respecto al producto en bruto de la reacción de conjugación de acuerdo al Ejemplo 4,1, donde se separó el contenido de los subproductos de reacción de la mezcla, tales como oxo-HES sin reaccionar y N-hidroxi succinimida libre, como asi también el solvente utilizando una membrana de ultrafiltración de 10 kD en una centrífuga refrigerante. Se utilizaron los siguientes parámetros en el análisis HPGPC : Columna: Superosa 12 HR 10/30 300 x 10 mmD.I. (Pharmacia) Eluyente: Na2HP0427,38 mM; Na¾P0412,62 mM; NaCl 0,2 M; NaN30,005% en 1 1 de agua desmineralizada Flujo: 0,24 ml/h Detector 1 : Detector MALLS Detector 2: UV (280 nm) Detector 3 : RI (Detector del índice de refracción) A representa el resultado del detector 1, B representa el resultado del detector 2. Figura 11 Se utilizaron los siguientes parámetros en el análisis HPGPC : Columna: Superosa 12 HR 10/30 300 x 10 mm D.I. (Pharmacia) Eluyente: Na2HP0427,38 mM; Na¾P0412,62 mM; NaCl 0,2 M; NaN30,005% en 1 1 de agua desmineralizada Flujo: 0,24 ml/h Detector 1 : Detector MALLS Detector 2: UV (280 nm) Detector 3 : RI (Detector del índice de refracción) A representa el resultado del detector 1, B representa el resultado del detector 2. Figura 12 Se utilizaron los siguientes parámetros en el análisis HPGPC : Columna: Superosa 12 HR 10/30 300 x 10 mmD.I. (Pharmacia) Eluyente: Na2HP0 27,38 m ; Na¾P0412,62 mM; NaCl 0,2 M; NaN30,005% en 1 1 de agua desmineralizada Flujo: 0,24 ml/h Detector 1: Detector MALLS Detector 2: UV (280 nm) Detector 3 : RI (Detector del índice de refracción) A representa el resultado del detector 1, B representa el resultado del detector 2. Figura 13 La Figura 13 muestra un análisis por SGS-PAGE del flujo y del eluato de G-CSF modificado con HES (A32) luego de la cromatografía sobre DEAE-Sefarosa CL-6B, 1,5% de las fracciones indicadas fueron desalinizadas mediante ultrafiltración, se secaron en un SpeedVac y se aplicaron sobre un gel de poliacrilamida al 12, 5%. Figura 14 La Figura 14 muestra un espectro MALDI/TOF del material de partida G-CSF (muestra A33) Figura 15 La Figura 15 muestra un espectro MALDI/TOF de G-SCF modificado con HES (muestra A32) Figura 16 La Figura 16 muestra un espectro ALDI/TOF de G-SCF modificado con HES (muestra A60) Figura 17 La Figura 17 muestra la electroforesis en gel de las mezclas de reacción del Ejemplo 7,2 (b) . Para la electroforesis en gel se utilizaron una celda XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) y una fuente de poder Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B) . Se utilizaron un gel Bis-Tris al 12% con un buffer de corrida MOPS SGS en condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El gel se tiñó con Roti-Blue (Cari Roth GmbH + Co,KG, Karlsruhe, D) de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

Calle A: Marcador de proteínas Roti- ark STANDARD (Cari Roth GmbH + Co,KG, Karlsruhe, D) Marcador de pesos moleculares de arriba hacia abajo: 200 KD, 119 KD, 66 KD, 43 KD, 29 KD, 20 KD, 14,3 KD Calle B: Producto en bruto luego de la conjugación de hG-CSF con el derivado de HES preparado en el Ejemplo 7.1(d) Calle C: Producto en bruto luego de la conjugación de hG-CSF con el derivado de HES preparado en el Ejemplo 7.1(b) Calle D: Producto en bruto luego de la conjugación de hG-CSF con el derivado de HES preparado en el Ejemplo 7.1 (j) Calle E: Control de reacción: HES 50/07 Figura 18 La Figura 18 muestra la electroforesis en gel de las mezclas de reacción del Ejemplo 7.2(d). Para la electroforesis en gel se utilizaron una celda XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) y una fuente de poder Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B) . Se utilizaron un gel Bis-Tris al 12% con un buffer de corrida MOPS SGS en condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El gel se tiñó con Roti-Blue (Cari Roth GmbH + Co,KG, Karlsruhe, D) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Calle A: Marcador de proteínas Roti-Mark STANDARD (Cari Roth GmbH + Co,KG, Karlsruhe, D) . Marcador de pesos moleculares de arriba hacia abajo: 200 KD, 119 KD, 66 KD, 43 KD, 29 KD, 20 KD, 14,3 KD, Calle B: hG-CSF luego del intercambio del buffer como se describe en el Ejemplo 7.2(c) . Calle C-. Producto en bruto luego de la conjugación de hG-CSF con el derivado de HES preparado como se describe en el Ejemplo 7.1(f). Calle D: Producto en bruto luego de la conjugación de hG-CSF con el derivado de HES preparado como se describe en el Ejemplo 7.1(h). Figura 19 La Figura 19 muestra el cromatograma HPGPC con respecto al producto en bruto de la reacción de conjugación de acuerdo al Ejemplo 7.3 (Detector MALLS: gráfico superior; detector UV: gráfico inferior) . Se utilizaron los siguientes parámetros en el análisis HPGPC : Columna: Superosa 12 HR 10/30 300 x 10 mmD.I. (Pharmacia) Eluyente: Na2HP04 27,38 mM; Na¾P0 12,62 mM; NaCl 0,2 M; NaN30,005 % en 1 1 de agua desmineralizada Flujo: 0,24 ml/h Detector 1: Detector MALLS Detector 2: UV (280 nm) Detector 3 : RI (Detector del índice de refracción) Figura 20 La Figura 20 muestra los resultados del ensayo de mitogenicidad del Ejemplo 7.4, El eje Y indica la cantidad de células NFS-60/ml de y el eje X la concentración en pg/ml. Figura 21 . La Figura 21 muestra los resultados del ensayo in vivo del Ej emplo 7.5. EJEMPLOS Ejemplo 1: Síntesis de hidroxietil almidón funcionalizado con aldehido Ejemplo 1.1(a) : Síntesis por oxidación con peryodato de hidroxietil almidón oxidado selectivamente en su extremo reductor e incubación a 0°C 100 mg de Oxo-HES10/0 , 4 (PM = 10 kD, GS = 0,4, preparados mediante Supramol Parenteral ColloiGS GmbH, Rosbach-Rodheim, D; de acuerdo a DE 196 28 705 Al, se disolvieron en 5 mi de buffer de fosfato de sodio 20 mM, pH 7,2 y se enfriaron a 0°C. Se disolvieron 21,4 mg de peryodato de sodio (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) en 5 mi del mismo buffer y se enfriaron a 0°C. Ambas soluciones se mezclaron y luego de la incubación durante 10 min a 0°C, se agregó 0,73 mi de glicerol y la mezcla de reacción se incubó a 21°C durante 10 min. La mezcla de reacción se dializó durante 24 h contra agua (tubos de diálisis SnakeSkin, corte 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. Ejemplo 1.1(b) Síntesis por oxidación con peryodato de hidroxietil almidón oxidado selectivamente en su extremo reductor e incubación a 21°C 100 mg de Oxo-HES10/0 , 4 (PM = 10 kD, GS = 0,4, preparados mediante Supramol Parenteral ColloiGS GmbH, Rosbach-Rodheim, D; de acuerdo a DE 196 28 705 Al) se disolvieron en 5 mi de buffer de fosfato de sodio 20 mM, pH 7,2. Se disolvieron 21,4 mg de peryodato de sodio (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) en 5 mi de del mismo buffer. Ambas soluciones se mezclaron y luego de la incubación durante 10 min a 21°C se agregó 0,73 mi de glicerol y la mezcla de reacción se incubó a 21°C durante 10 min. La mezcla de reacción se dializó durante 24 h contra agua (tubos de diálisis SnakeSkin, corte 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. Ejemplo 1.2(a): Síntesis de idroxieti1almidón funcionalizado con aldehido por oxidación con peryodato de hidroxietil almidón con el extremo reductor no oxidado e incubación a 0 °C 100 mg de HES10/0,4 (PM = 10 kD, GS = 0,4, Supramol Parenteral ColloiGS GmbH, Rosbach-Rodheim, D) se disolviéron en 5 mi de buffer de fosfato de sodio 20 m , pH 7,2 y se enfriaron a 0°C. Se disolvieron 21,4 mg de peryodato de sodio (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) en 5 mi del mismo buffer y se enfriaron a 0°C. Ambas soluciones se mezclaron y luego de la incubación durante 10 min a 0°C se agregó 0,73 mi de glicerol y la mezcla de reacción se incubó a 21°C durante 10 min. La mezcla de reacción se dializó durante 24 h contra agua (Tubos de diálisis SnakeSkin, corte 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó . Ejemplo 1.2(b): Síntesis de hidroxietil almidón funcionalizado con aldehido por oxidación con peryodato de hidroxietil almidón con el extremo reductor no oxidado e incubación a 21 °C 100 mg de HES10/0,4 (PM = 10 kD, GS = 0,4, preparados mediante Supramol Parenteral ColloiGS GmbH, Rosbach-Rodheim, D) se disolvieron en 5 mi de buffer de fosfato de sodio 20 mM, pH 7,2. Se disolvieron 21,4 mg de peryodato de sodio (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) en 5 mi de del mismo buffer. Ambas soluciones se mezclaron y luego de la incubación durante 10 min a 21°C se agregó 0,73 mi de glicerol y la mezcla de reacción se incubó a 21°C durante 10 min. La mezcla de reacción se dializó durante 24 h contra agua (Tubos de diálisis SnakeSkin, corte 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó, Ejemplo 1.3: Síntesis de hidroxietil almidón funcionalizado con aldehido a partir de hidroxietil almidón funcionalizado con amino y ácido formilbenzoico Oxo-HESlO/0 , 4 (PM = 10 kD, GS = 0,4) fue preparado por Supramol Parenteral ColloiGS GmbH, Rosbach-Rodheim, D; de acuerdo a DE 196 28 705 Al. 5,1 g (0,51 mmol) de oxo-HES10/0 , 4 se disolvieron en 15 mi de dimetilsulfóxido anhidro (DMSO, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) ) y se agregó gota a gota bajo atmósfera de nitrógeno a una solución de 5,1 mi (51 mmol) de 1 , 4-diaminobutano en 10 mi de dimetilsulfóxido anhidro y se agitó a 40°C durante 19 h. La mezcla de reacción se agregó a una mezcla de 80 mi de etanol y 80 mi de acetona. El precipitado resultante se separó por centrifugación, se lavó con una mezcla de 20 mi de etanol y 20 mi de acetona y se disolvió nuevamente en 80 mi de agua. La solución se dializó durante 4 días contra agua (Tubos de diálisis SnakeSkin, corte 3,5 kD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) y a continuación se liofilizó. El rendimiento fue del 67% (3,4 g) de amino-HESlO/0, 4. 150 mg de 4-ácido formilbenzoico y 230 mg de 1-hidroxi-??-benzotriazol (ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) se disolvieron en 10 mi de N,N-dimetilformamida (calidad para síntesis de péptidos, Biosolve, Valkens aard, NL) y se agregaron 204 µ? de ?,?'-diisopropil carbodiimida, Después de la incubación a 21°C durante 30 min, se agregó 1 g de amino-HES10/0 , 4. Después de agitar durante 19 h a 22°C, la mezcla de reacción se agregó a 84 mi de una mezcla helada 1:1 de acetona y etanol (v/v) . El producto precipitado se recolectó mediante centrifugación a 4°C, se disolvió nuevamente en 50 mi de agua, se dializó durante 2 d contra agua (Tubos de diálisis SnakeSkin, corte 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. Ejemplo 1.4: Síntesis de hidroxietil almidón funcionalizado con aldehido a partir de hidroxietil almidón y ácido formilbenzoico Oxo-HESlO/0, 7 (PM = 10 kD, GS = 0,7) fue preparado por Supramol Parenteral ColloiGS GmbH, Rosbach-Rodheim, D; de acuerdo a DE 196 28 705 Al. 83 mg de 4-ácido formilbenzoico y 180 mg de 1-hidroxi-lH-benzotriazol (ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) se disolvieron en 5 mi de N,N-dimetilformamida (DMF, calidad para síntesis de péptidos, Biosolve, Valkenswaard, NL) y se agregaron 78 µ? de ?,?'-diisopropilcarbodiimida . Después de la incubación a 21°C durante 30 min, se agregó 0,5 g de oxo-HES10/0 , 7. Después de agitar durante 19 h a 22 °C, la mezcla de reacción se agregó a 37,5 mi de una mezcla helada 1:1 de acetona y etanol (v/v) . El producto precipitado se recolectó mediante centrifugación a 4°C, se disolvió nuevamente en una mezcla de 2,5 mi de agua y 2,5 mi de DMF y se precipitó nuevamente como se describe más arriba. El producto de reacción se recolectó mediante centrifugación como se describió, se disolvió nuevamente en 10 mi de agua, se dializó durante 2 d contra agua (Tubos de diálisis SnakeSkin, corte 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. Ejemplo 1.5: Síntesis de hidroxietil almidón funcionalizado con aldehido a partir de hidroxietil almidón y ácido formilbenzoico HES10/0,7 (PM = 10 kD, GS = 0,7) fue preparado por Supramol Parenteral ColloiGS GmbH, Rosbach-Rodheim, D, 50 mg de 4-ácido formilbenzoico y 108 mg de 1-hidroxi-lH-benzotriazol (ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) se disolviero en 3 mi de N,N-dimetilformamida (calidad para síntesis de péptidos, Biosolve, Valkenswaard, NL) y se agregaron 47 µ? de ?,?'-diisopropilcarbodiimida. Después de la incubación a 21°C durante 30 min, se agregaron 0,3 g de HES10/0,7. Después de agitar durante 19 h a 22°C, la mezcla de reacción se agregó a 23 mi de una mezcla helada 1:1 de acetona y etanol (v/v) . El producto precipitado se recolectó mediante centrifugación a 4 °C, se disolvió nuevamente en una mezcla de 1,5 mi de agua y 1,5 mi de DMF y se precipitó nuevamente como se describió más arriba, El producto de la reacción se recolectó mediante centrifugación como se describió, se disolvió nuevamente en 10 mi de agua, se dializó durante 2 d contra agua (Tubos de diálisis SnakeSkin, corte 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. Ejemplo 1.6: Síntesis de hidroxietil almidón funcionalizado con aldehido a partir de hidroxietil almidón funcionalizado con amino y pentafluorofeniléster del ácido formilbenzoico Oxo-HESIO/0, 7 (PM = 10 kD, GS = 0,7) fue preparado por Supramol Parenteral ColloiGS GmbH, Rosbach-Rodheim, D; de acuerdo a DE 196 28 705 Al. 6,0 g (0,6 mmol) de oxo-HES10/0 , 7 se disolvieron en 20 mi de dimetilsulfóxido anhidro (DMSO, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) ) y se agregó gota a gota bajo atmósfera de nitrógeno a una soluci on de 6 mi (60 mmo 1 ) de 1 , 4 -diaminobutano en 11 mi de dimetilsulf óxido anhidro y se agitó a 40 °C durante 19 h . La mezcla de reacción se agregó a una mezcla de 80 mi de etanol y 80 mi de acetona . El precipitado resultante se separó por centrifugación, se lavó con una mezcla de 20 mi de etanol y 20 mi de acetona y se disolvió nuevamente en 80 mi de agua, La solución se dializó durante 4 días contra agua (Tubos de diálisis SnakeSkin, corte 3 , 5 kD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) y a continuación se liofilizó. El rendimiento fue del 52% (3 , 15 g) de amino-HES10/0, 7. Se sintetizó pentafluorofeniléster del ácido 4-formilbenzoico como se describe en J, S, LinGSey at al, , Tetrahedron 50 (1994) páginas 8941-68, especialmente pág. 8956, 50 mg de amino-HES10/0, 7 se disolvieron en 0, 5 mi de ?,?-dimetilformamida (calidad para síntesis de péptidos, Biosolve, Valkenswaard, L) y se agregaron 15, 3 mg de pentafluorofenléster del ácido 4-formilbenzoico. Después de agitar durante 22 h a 22 °C, la mezcla de reacción se agregó a 3 , 5 mi de 2-propanol helado. El producto precipitado se recolectó mediante centrifugación a 4 ° C , se lavó con 4 mi de 2 -propanol helado , se disolvió nuevamente en 50 mi de agua , se dializó durante 2 d contra agua (Tubos de diálisis SnakeSkin, corte 3 , 5 kD , Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó . Ej emplo 1 . 7 : Síntesis de hidroxietil almidón funcionalizado con aldehido a partir de hidroxietil almidón y pentafluorofeniléster del ácido f ormilbenzoico Oxo-HES10/0,7 (PM = 10 kD, GS = 0,7) fue preparado por Supramol Parenteral ColloiGS GmbH, Rosbach-Rodheim, D; de acuerdo a DE 196 28 705 Al. Se sintetizó pentafluorofeniléster del ácido 4-formilbenzoico como se describe en J, S, LinGSey et al., Tetra edron 50 (1994) páginas 8941-68, especialmente pág. 8956. 200 mg de oxo-HES10/0,7 se disolvieron en 2 mi de N, M-dimetilf ormamida (calidad para síntesis de péptidos, Biosolve, Valkens aard, NL) y se agregaron 61,2 mg de pentafluorofeniléster del ácido 4-formilbenzoico. Después de agitar durante 22 h a 22 °C, la mezcla de reacción se agregó a 15 mi de mezcla helada 1:1 de acetona y etanol (v/v) . El producto precipitado se recolectó mediante centrifugación a 4°C, se disolvió nuevamente en una mezcla de 1,4 mi de agua y 0,7 i de D P y se precipitó nuevamente como se describió más arriba. El producto de reacción se recolectó mediante centrifugación como se describió, se disolvió nuevamente en 10 mi de agua, se dializó durante 2 d contra agua (Tubos de diálisis SnakeSkin, corte 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. Ejemplo 1.8: Síntesis de hidroxietil almidón funcionalizado con aldehido a partir de hidroxietil almidón funcional izado con amino y ácido 4- (4-f ormil-3 , 5-dimetoxif enoxi) utírico Oxo-HESlO/0 , 4 (PM = 10 kD, GS = 0,4) fue preparado por Supramol Parenteral ColloiGS GmbH, Rosbach-Rodheim, D; de acuerdo a DE 196 28 705 Al. ,1 g (0,51 mmol) de oxo-HES10/0 , se disolvieron en 15 mi de dimetilsulfóxido anhidro (DMSO, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) ) y se agregaron gota a gota bajo atmósfera de nitrógeno a una solución de 5,1 mi (51 mmol) de 1,4-diaminobutano en 10 mi de dimetilsulfóxido anhidro y se agitó a 40 °C durante 19 h. La mezcla de reacción se agregó a una mezcla de 80 mi de etanol y 80 mi de acetona. El precipitado resultante se separó por centrifugación, se lavó con una mezcla de 20 mi de etanol y 20 mi de acetona y se disolvió nuevamente en 80 mi de agua. La solución se dializó durante 4 días contra agua (Tubos de diálisis SnakeSkin, corte 3,5 kD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) y a continuación se liofilizó. El rendimiento fue del 67% (3,4 g) amino-HES10/0, 4. 80,5 mg de ácido 4- (4-formil-3, 5-dimetoxifenoxi) butírico (Calbiochem-Novabiochem, Láufelfingen, CH) y 61 mg de 1-hidroxi-lH-benzotriazol (Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) se disolvieron en 3 mi de N,N-dimetilformamida (calidad para síntesis de péptidos, Biosolve, Valkenswaard, NL) y se agregaron 45,4 µ? de ?,?'-diisopropilcarbodiimida . Después de la incubación a 21°C durante 30 min, se agregaron 0,3 g de amino-HES10/0 , 4. Después de agitar durante 22 h a 22 °C, la mezcla de reacción se agregó a 23 mi de mezcla helada 1:1 de acetona y etanol (v/v) . El producto precipitado se recolectó mediante centrifugación a 4°C, se disolvió nuevamente en una mezcla de 2 mi de agua y 1 mi de DMF y se precipitó nuevamente como se describió más arriba. El producto de la reacción se recolectó mediante centrifugación como se describió, se disolvió nuevamente en 10 mi de agua, se dializó durante 1 d contra agua (Tubos de diálisis SnakeSkin, corte 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. Ejemplo 2: Síntesis de Conjugados de G-CSG por aminación reductiva Ejemplo 2.1 (a) : Síntesis de Conjugados de G-CSG por aminación reductiva con hidroxietil almidón con el extremo reductor no oxidado a pH = 7,4 (Ejemplo Comparativo) En el Ejemplo 2.1, se trató de utilizar el método de síntesis de la WO 03/074087 (Ejemplo 12, página 22-23) para la producción de un conjugado de HES-G-CSF. A 3,33 µ? de una solución acuosa de G-CSF (Meupogen® de Amgen, Munich, D, o Granocyte® de Aventis Pharma AG, Zurich, CH, respectivamente, 3 mg/ml) en buffer de fosfato de sodio 0,1 M de pH 7,4, se agregaron 3,33 µ? de una solución de HES10/0,4 (PM = 10 kD, GS = 0,4, Supramol Parenteral ColloiGS GmbH, Rosbach-Rodheim, D, 79 mg/ml) en el mismo buffer. A esta mezcla se agregaron 3,33 µ? de una solución de cianoborohidruro de sodio 60 M en el mismo buffer, y la mezcla resultante se incubó durante 4 h a 22 °C. A continuación se agregaron otros 3,33 µ? de la solución recién preparada de cianoborohidruro de sodio 60 mM. Durante el tiempo de incubación de 30 h, se agregaron otras 5 porciones de 3,33 µ? de solución recién preparada de cianoborohidruro de sodio 60 m . La mezcla de reacción se analizó mediante electroforesis en gel. No se observó ninguna reacción. Ejemplo 2.1(b): Síntesis de conjugados de G-CSP por aminación reductiva con hidroxietil almidón con el extremo reductor no oxidado con un pH de 5,0 a 9,2 (Ejemplo Comparativo) A 3,33 µ? de una solución acuosa de G-CSF (G-CSF de Strathmann Biotec AG, Hairiburgo, D, 3 mg/mL) en un buffer dado, se agregaron 3,33 µ? de una solución de HES (300 mg/ml) en el mismo buffer. La mezcla se enfrió a 4°C, y se agregaron 3,33 µ? de una solución de cianoborohidruro de sodio 60 n en el mismo buffer a 4°G, y la mezcla resultante se incubó durante 20 h a 4°C. Se utilizaron las siguientes preparaciones de HES y buffer: a) Buffer: buffer de acetato de sodio 0,1 M pH 5,0 HES10/0,4 (P = 10 kD, GS = 0,4, Supramol Parenteral ColloiGS GmbH, Rosbach-Rodheim, D) HESlO/0,7 (PM = 10 kD, GS = 0,7, Supramol Parenteral ColloiGS GmbH, Rosbach-Rodheim, D) - HES50/0,4 (PM = 50 kD, GS = 0,4, Supramol Parenteral ColloiGS GmbH, Rosbach-Rodheim, D) HES50/0,7 (PM = 50 kD, GS = 0,7, Supramol Parenteral ColloiGS GmbH, Rosbach-Rodheim, D) b) Buffer: buffer de fosfato de sodio 0,1 M pH 7,2 - HESlO/0,7 (PM = 10 kD, GS = 0,7, Supramol Parenteral ColloiGS GmbH, osbach-Rodheim, D) c) Buffer: buffer de borato de sodio 0,1 pH 8,3 HES10/0,7 (PM = 10 kD, GS = 0,7, Supramol Parenteral ColloiGS GmbH, Rosbach-Rodheim, D) d) Buffer: buffer de borato de potasio 0,2 M pH 9,2 HES10/0,7 (PM = 10 kD, GS = 0,7, Supramol Parenteral ColloiGS GmbH, Rosbach-Rodheim, D) Cada mezcla de reacción se analizó mediante electroforesis en gel. No se observó conjugación significativa (no se muestran los escaneos en gel para las reacciones b) a d) ) .

Ejemplo 2.2: Síntesis de Conjugados G-CSG por aminación reductiva con hidroxietil almidón con extremo reductor oxidado con un pH de 5,0 de 9,2 (Ejemplo Comparativo) A 3,33 µ? de una solución acuosa de G-CSF (G-CSF de Strathmann Biotec AG, Hamburgo, D, 3 mg/ml) en un buffer dado, se agregaron 3,33 µ? de una solución de oxo-HES (300 mg/ml) en el mismo buffer, La mezcla se enfrió a 4 °C, y se agregaron 3,33 µ? de una solución de cianoborohidruro de sodio 60 mM en el mismo buffer a 4°C, y la mezcla se incubó durante 17 h a 4°C. Se utilizaron las siguientes preparaciones HES y buffer: a) Buffer: buffer de acetato de sodio 0,1 M pH 5,0 oxo-HESlO/0, 7 (PM = 10 kD, GS = 0,7, Supramol Parenteral ColloiGS GmbH, Rosbach-Rodheim, D) oxo-HES50/0,4 (PM = 50 kD, GS = 0,4, Supramol Parenteral ColloiGS GmbH, Rosbach-Rodheim, D) oxo-HES50/0, 7 (PM = 50 kD, GS = 0,7, Supramol Parenteral ColloiGS GmbH, Rosbach-Rodheim, D) b) Buffer: buffer de fosfato de sodio 0,1 M pH 7,2 HES10/0,7 (PM = 10 kD, GS = 0,7, Supramol Parenteral ColloiGS GmbH, Rosbach-Rodheim, D) c) Buffer: buffer de borato de sodio 0,1 M pH 8,3 HES10/0,7 (PM = 10 kD, GS = 0,7, Supramol Parenteral ColloiGS GmbH, Rosbach-Rodheim, D) d) Buffer: buffer de borato de potasio 0,2 M pH 9,2 - HES10/0,7 (PM = 10 kD, GS = 0,7, Supramol Parenteral ColloiGS GmbH, Rosbach-Rodheim, D) Cada mezcla de reacción se analizó mediante electroforesis en gel . No se observó conjugación significativa (no se muestran los escaneos en gel para las reacciones b) a d) ) . Oxidación de HES10/0,4 (PM = 10 kD, GS = 0,4) se llevó a cabo mediante Supramol Parenteral ColloiGS GmbH, Rosbach-Rodheim, D; de acuerdo a DE 196 28 705 Al. Ejemplo 2.3: Síntesis de Conjugados G-CSG por aminación reductiva con hidroxietil almidón funcionalizado con aldehido sintetizado por oxidación con peryodato A 3,33 µ? de una solución acuosa de G-CSF (Granocyte® de Aventis Pharma AG, Zurich, CH, y Neupogen® de Amgen, Munich, D, respectivamente, 3 mg/mL) en buffer de acetato de sodio 0 , 1 M de pH 5,0, se agregaron 3,33 µ? de una solución de un HES-aldehldo (79 mg/ml) en el mismo buffer. Se agregó a la mezcla, 3,33 juL de una solución de cianoboroMdruro de sodio 60 m en el mismo buffer y la mezcla se incubó durante 25 h a 21°C. La mezcla de reacción se analizó mediante electroforesis en gel. Se emplearon los siguientes conjugados de HES funcionalizados con aldehido: (i-N) preparado con Neupogen® de acuerdo al Ejemplo 1.1(a) anterior; (ii-N) preparado con Neupogen® de acuerdo al Ejemplo 1.1(b) anterior; (iii-N) preparado con Neupogen® de acuerdo al Ejemplo 1.2(a) anterior; (iv-N) preparado con Neupogen® de acuerdo al Ejemplo 1.2(b) anterior; (i-G) preparado con Granocyte® de acuerdo al Ejemplo 1.1(a) anterior; (ii-G) preparado con Granocyte® de acuerdo al Ejemplo 1.1(b) anterior; (iii-G) preparado con Granocyte® de acuerdo al Ejemplo 1.2(a) anterior; (iv-G) preparado con Granocyte® de acuerdo al Ejemplo 1.2(b) anterior, Ejemplo 2.4: Síntesis de Conjugados G-CSG por aminación reductiva con hidroxietil almidón funcionalizado con aldehido sintetizado por conjugación de hidroxietil almidón a un ácido formil-carboxílico A 3,33 /xl de una solución acuosa de G-CSF (G-CSF de Strathmann Biotec AG, Hamburgo, D, 3 mg/ml) en buffer de. acetato de sodio 0,1 M pH 5,0, se agregaron 3,33 µ? de una solución de un HES-aldehído (118,5 mg/ml) en el mismo buffer y se enfriaron a 4°C. A la mezcla se agregaron 3,33 µ? de una solución de cianoborohidruro de sodio 60 mM en el mismo buffer a 4°C y la mezcla se incubó durante 17 h a 4°C. La mezcla de reacción se analizó mediante electroforesis en gel. Se emplearon los siguientes conjugados de HES funcionalizados con aldehido: (v) preparado de acuerdo al Ejemplo 1.4 anterior; (vi) preparado de acuerdo al Ejemplo 1.5 anterior; (vii) preparado de acuerdo al Ejemplo 1.6 anterior; (viii) preparado de acuerdo al Ejemplo 1.7 anterior; (ix) preparado de acuerdo al Ejemplo 1.8 anterior, Ejemplo 2,5: Síntesis de conjugados G-CSG por aminación reductiva con hidroxietil almidón funcionalizado con aldehido sintetizado por conjugación de hidroxietil almidón a ácido formil-carboxílico A 2,5 mi de una solución acuosa de G-CSP (G-CSF de Strathmann Biotec AG, Hamburgo, D, 2,27 mg/mL) en buffer de acetato de sodio 0,1 M pH 5,0, se agregaron 136 mg de HES-aldehído 10/0,4, preparado como se describe en el Ejemplo 1.3 anterior y la solución se enfrió a 0°C. A la mezcla se agregaron 2,5 mi de una solución helada 40 m de cianoborohidruro de sodio en el mismo buffer y la mezcla se incubó durante 17 h a 4°C. La mezcla de reacción se analizó mediante electroforesis en gel. Ejemplo 3:Síntesis de conjugados de G-SCF por alquilación de SH Oxo-HESlO/0, 7 (PM = 10 kD, GS = 0,7) fue preparado por Supramol Parenteral ColloiGS GmbH, Rosbach-Rodheim, D; de acuerdo a DE 196 28 705 Al, 6,0 g (0,6 mmol) de oxo-HES10/0 , 7 se disolvieron en 20 mi de dimetilsulfóxido anhidro (DMSO, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) ) y se agregaron gota a gota bajo atmósfera de nitrógeno a una solución de 6 mi (60 mmol) de 1 , 4-diaminobutano en 11 mi de dimetilsulfóxido anhidro y se agitó a 40°C durante 19 h. La mezcla de reacción se agregó a una mezcla de 80 mi de etanol y 80 mi de acetona. El precipitado resultante se separó por centrifugación, se lavó con una mezcla de 20 mi de etanol y 20 mi de acetona y se disolvió nuevamente en 80 mi de agua. La solución se dializó durante 4 dias contra agua (Tubos de diálisis SnakeSkin, corte 3,5 kD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) y a continuación se liofilizó. El rendimiento fue del 52% (3,15 g) de amino-HES10/0, 7. A 132 µ<3 de amino-HES10/0 , 7 , disueltos en 100 µ? de buffer de fosfato de sodio (0,1 , NaCl 0,15 M, EDTA 50 mM, pH 7,2), se agregaron 10 µ? de una solución de 17,5 mg/ml de N-alfa (maleimidoacetoxi) succinimido éster (AMAS) en DMSO seco (ambos Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) , y la solución clara se incubó durante 80 min a 25°C y a continuación durante 20 min a 40°C. Se eliminó el excedente de AMAS mediante filtración centrifugal con un concentrador VIVASPIN 0,5 mi, 5KD PMCO (VIVASCIENCE, Hannover, D) a 13.000 rpm, se lavó dos veces durante 30 min con 450 µ? del buffer de fosfato y una vez con 450 µ? de buffer B. A la solución residual se agregaron 10 /¿g de G-CSF (Neupogen® de Amgen, Munich, D, y Granocyte® de Aventis Pharma AG, Zurich, CH, respectivamente, 3 g/µ? en buffer de fosfato) y la mezcla se incubó durante 16h a 25°C. La mezcla de reacción se analizó mediante electroforesis en gel después de la concentración al vacío. Se eligieron los siguientes métodos : (x) G-CSF (Granocyte®) empleando buffer de fosfato de sodio (0,1 M, NaCl 0,15 M, EDTA 50 mM, pH 7,2) como buffer B. (xi) G-CSF (Neupogen®) empleando buffer de fosfato de sodio (0,1 M, NaCl 0,15 M, EDTA 50 mM, pH 7,2) como buffer B. (xii) G-CSF (Granocyte®) empleando una mezcla 1:1 (v/v) de buffer de fosfato de sodio (0,1 M, NaCl 0,15 M, EDTA 50 mM, pH 7,2) y urea 8 M, 1 % SGS, pH 7 , 4 como buffer B. (xiii) G-CSF (Neupogen®) empleando una mezcla 1 : 1 (v/v) de buffer de fosfato de sodio (0,1 M, NaCl 0,15 M, EDTA 50 mM, pH 7,2) y urea 8 , 1 % SGS, pH 7,4 como buffer B. (xiv) G-CSF (Granocyte®) empleando urea 8 M, 1 % SGS, pH 7,4 como buffer B, (xv) G-CSF (Neupogen®) empleando urea 8 M, 1 % SGS, pH 7,4 como buffer B, Ejemplo 4: Síntesis de conjugados de G-CSF por reacción de hidroxietil almidón que presenta un grupo éster reactivo con G-CSF Ejemplo 4,1: Oxo-HES10/0,4 (PM = 10,559 D, GS = 0,4) fue preparado por Supramol Parenteral ColloiGS GmbH, Rosbach-Rodheim, D; de acuerdo a DE 196 28 705 Al. El grado de oxidación de oxo-HES fue del 95% 66 mg de oxo-HES10/0 , 4 se disolvieron en 0,5 mi de DMF anhidra. A esta solución se agregaron 3,4 mg de ?,?' -disuccinimidil carbonato, y la mezcla se agitó durante 2 h a temperatura ambiente. La solución resultante presentaba una concentración de HES reactivo de 13 por ciento en peso. Una solución de G-CSF (Strathmann Biotec AG, Hamburgo, D) , que presentaba una concentración de alrededor de 0,5 mg de G-CSF/ml, se concentró hasta una concentración de 10 mg/ml mediante ultracentrifugación con un corte de 10 kD utilizando una centrífuga ref igerante. A 0,5 mi de esta solución de G-CSF concentrada, se agregaron 180 µ? de una solución de bicarbonato de sodio. A continuación se agregaron gota a gota 3 porciones (100 µ? cada una) de la solución de HES reactivo a la solución de proteína, hasta que después de alrededor de 30 minutos había concluido la reacción. Así, la relación molar global HES reactivo : G-CSF fue 20:1. Luego se ajustó el pH de la mezcla a 4,0 utilizando HCl 0,1 N. De un análisis por HPGPC (Cromatografía de permeación en gel de alta resolución) se obtuvo un rendimiento de alrededor del 70%. El resultado se indica en la Fig. 9. La mezcla pudo almacenarse a 4°C con un pH de 4,0 durante 4 d y de acuerdo a los análisis por HPGPC permaneció estable, es decir sin cambios.

La separación del contenido de los subproductos de reacción de la mezcla, tales como oxo-HES sin reaccionar y N-hidroxi succinimida libre, como así también el solvente, utilizando una membrana de ultrafiltracion 10 kD en una centrífuga refrigerante, pudo realizarse sin dificultades. Los resultados de este experimento de separación se muestran en la Fig. 10. Ejemplo 4.2: Oxo-HES10/0,4 (PM = 10,559 D, GS = 0,4) fue preparado por Supramol Parenteral ColloiGS GmbH, Rosbach-Rodheim, D; de acuerdo a DE 196 28 705 Al. El grado de oxidación de oxo-HES fue del 95%. 400 mg de oxo-HES10/0 , se disolvieron en 1 mi de DMF anhidra. A esta solución se agregaron 21 mg de ?,?'-disuccinimidil carbonato, y la mezcla se agitó durante 2 h a temperatura ambiente. La solución resultante presentó una concentración de HES reactivo del 40 porciento en peso. Una solución de G-CSF (Strathmann Biotec AG, Hamburgo, D) , que presentaba una concentración de alrededor de 0,5 mg de G-CSF/ml, se concentró hasta una concentración de 10 mg/ml mediante ultracentrifugacion con un corte de 10 kD utilizando una centrífuga refrigerante. A 0,5 mi de esta solución de G-CSF concentrada, se agregaron 180 µ? de una solución de bicarbonato de sodio. A continuación se agregaron gota a gota 3 porciones (100 µ? cada una) de la solución HES reactiva a la solución de proteína, hasta que después de alrededor de 30 minutos había concluido la reacción. Así, la relación molar global HES reactivo -.G-CSF fue 50:1. Luego se ajustó el pH de la mezcla a 4.0 utilizando HCl 0,1 N. De un análisis por HPGPC (Cromatografía de permeación en gel de alta resolución) se obtuvo un rendimiento superior al 95%. No pudo detectarse G-CSF sin reaccionar. Este resultado se indica en la Fig. 11. La mezcla se purificó utilizando sin dificultades tecnología de ultrafiltrado . Los resultados de esta separación se muestran en la Fig. 12. Ejemplo 5 5.1 Purificación Se obtuvo G-CSF purificado con esencialmente las mismas características que el producto comercial Neupogen® (Amgen) y se conservó una alícuota sin modificaciones como control. .2 Síntesis de conjugados de HES y G-CSF Los conjugados se sintetizaron esencialmente como se describe en el Ejemplo 4.2, pero con Oxo-HES50/0 , 7 (código de muestra A60) , o como se describe en el Ejemplo 2.5 (código de muestra A32) , y se usaron para el posterior intercambio de buffer y purificación, 5.3 Intercambio de buffer de G-CSF y muestras de G-CSF modificadas con HES previo a la purificación por cromatografía de intercambio de aniones Muestras de G-CSF modificadas con HES o G-CSF sin modificar (como control ) (0,5-5 mg de proteína ) se sometieron a intercambio de buffer utilizando unidades del concentrador Vivaspin 6 (10,000 PMCO PES, Vivascience, Cat, Nr, VS0602) . Las muestras se concentraron hasta 0,5-0,7 mi y se diluyeron a 5 mi con buffer de fosfato de sodio 10 mM pH 7,2. Cada muestra se sometió 3 veces a este ciclo de intercambio de buffer/concentración. ¦ 5.4 Cromatografía de intercambio de aniones de G-CSF y formas modificadas con HES de los mismos en una columna de DEAE-sefarosa Se purificaron muestras de G-CSF después de la modificación con HES y a los efectos de la comparación, muestras de G-CSF sin modificar y se analizaron mediante cromatografía de intercambio de aniones a temperatura ambiente utilizando un sistema ÁKTA explorer 10 como se describe. Se dializaron alícuotas de G-CSF antes o después de la HESilación, mediante ultrafiltración contra dicho buffer A (fosfato de sodio 10 mM, pH 7,2) o se diluyeron con alrededor de 13 volúmenes de buffer A. Se regeneró la columna que contenía 2 mi de DEAE-Sefarosa (DEAE-sefarosa CL-6B, Pharmacia Kat , Nro. 17-0710-01) aplicando 5,0 volúmenes de columna (VC) de guanidina 6,5 M /HCl, 5,0 VC de buffer A, 5,0 VC de buffer C (NaCl 1,5 M en fosfato de sodio 10 mM, pH 7,2) y luego 10 VC de buffer A. Las muestras (0,8-4,5 mi de buffer de fosfato de sodio 10 ttiM, pH 7 , 2 ) luego se inyectaron usando un caudal de fluj o de 0 , 6 ml/min . Luego del lavado del bucle de muestra con 10 mi (2 mi de bucle de muestra) o 20 mi (5 mi de bucle de muestra) de buffer A, dependiendo de la muestra aplicada, la columna fue luego lavada con 0-22 VC de buffer A (caudal de fluj o = 0 , 8 ml/min) . La elución se realizó aplicando un gradiente lineal de 0 - 100% de buffer B sobre 5 VC y una corrida isocrática con 2 , 5 VC de 100% de buffer B utilizando un caudal de 0 , 6 ml/min . La columna se equilibró nuevamente con 5 VC de buffer A y se regeneró como se detalló m s arriba utilizando un caudal de flujo de 1 ml/min. En caso necesario, se concentraron las muestras utilizando un concentrador Vivaspin y se efectuó el recambio de buffer como se describió más arriba. Las mezclas se almacenaron a 0-8°C en buffer de acetato de sodio 10 mM de pH 4, 0 antes o después de la filtración estéril utilizando una unidad de filtración de 0, 2 µp? (Corning, Cat, No, 431215) . Las siguientes muestras se prepararon para bioensayos in-vitro y para el posterior análisis analítico. Se determinó la concentración de proteína como se describe en la sección 6.1 más adelante : I . 0401-15/A33, 0, 44 mg/ml, volumen = 500 µ? G-CSF (E, coli) II . 0402-03/A60, 0, 35 mg/ml, volumen = 600 µ? H-G-CSF (G-CSF modificada con HES, 10/0,4) III . 0401-13 /A32, 0, 28 mg/ml, volumen = 900 µ? G-CSF (E.coli) modificada con HES; 10/0,4 IV. 0401-28/A58, 0,60 mg/ml, volumen = 350 µ? Neupogen V. 0401-28/A57, 0,50 mg/ml, volumen = 400 µ? Neulasta 5.5. Posterior análisis de muestras de G-CSF Se- analizaron alícuotas de las muestras respecto de su contenido de proteína y respecto de modificaciones. 5.5(a) Cuantif icación de proteína G-CSF mediante RP-HPLC Se cuantif ico el contenido de proteína del G-CSF de las muestras utilizando la preparación de proteína sin modificar (concentración: 0,453 mg/ml) como patrón. Se utilizó un sistema de HPLC Dionex que consiste de una bomba P 680 A HPG, unidad de desgasificado Degasys DG 1210, un automuestreador e inyector ASI-100, un bucle de muestra de 250 µ?, un recinto termostat izado para columna TCC 100 junto con un detector de UV/Vis UVD170U equipado con un sistema de software Chromeleon Chromatography Management . Se usaron una precolumna CC 8/4 Nucleosil 120-5 C4, Macherey-Nagel , Cat, No, 721889, y una columna de separación 40 C-4 Nucleosil MPN, 5 µt?, 125 x 4 rara RP-Columna (Macherey-Nagel, ordering No, 7200 45,40) . El solvente A fue H20 más ácido trif luoroacético 0,06% (v/v) y el solvente B fue acetonitrilo 90% en H20, que contenía ácido trif luoroacético 0,06% (v/v); el caudal de flujo fue: 1 ml/min. La detección por UV fue a longitudes de onda de 214 , 221 , 260 y 280 nra. Se inyectaron muestras de aproximadamente 10-20 xg en una columna de RP-HPLC . Se utilizó el siguiente gradiente : 0 - 5 min : 0-10% B - 17 min : 10 -45% B 35 min : 45 -80% B 36 min : 80 -100 % B 38 min : 100% B 39 min : 10% B - 45 min : 10% B Se usó el área del pico resultante en la posición de elución de la preparación de G-CSF patrón y se comparó con el estándar de referencia comparando el pico producido a los aproximadamente 29 rain con una longitud de onda de 280 nm. 5.5 (b) Reducción + carboxamidometilación de la proteína G-CSF Se redujeron alícuotas de las muestras de proteína G-CSF y se carboxamidometilaron del modo usualmente descrito (Guillermina Forno, Mariela Bollati Fogolin, Marcos Oggero, Ricardo Kratje, Marina Etcheverrigaray, Harald S, Conradt, Manfred Nimtz (2004) O-linked carbohydrates and glycosilation site occupancy in recombinant human .granulocyte-macrophage colony-stimulating factor secreted by a Chínese hámster ovary cell line; European J, Biochem, 273 (5) , 907-919) . La carboxamidometilación produce residuos de cisteína modificados . Se realizó la digestión con endoproteinasa Glu-C de la proteína carboxamidometilada en H4HCO3 25 mM que contenía urea 1 M a pH 7,8 y utilizando una relación enzima/sustrato de 0,2:10 durante 18-24 horas. 5.5(c) Separación de peptidos Endo-Glu-C mediante RP-HPLC Se separaron los peptidos generados por la digestión con Endo-Glu-C en un sistema HPLC Dionex que consiste de una bomba P 680 A HPG, la unidad de desgasificación Degasys DG 1210, un automuestreador y un inyector ASI-100, un bucle para muestra de 250 µ?, un recinto termostatizado para columna TCC 100 junto con un detector UV/Vis UVD170U equipado con un sistema de software Chromeleon Chromatography Management System. Se usó también una precolumna CC 8/4 Mucleosil 120-5 C4, Macherey-Nagel , Cat, No, 721889, y una columna de separación 40 C-4 Nucleosil PN, 5 µp?, 125 x 4 mm RP-Columna (Macherey-Nagel, ordering No, 7200 45,40). El solvente A fue H20 más ácido trifluoroacético 0,06% (v/v) y el solvente B fue acetonitrilo 90% en H20, que contenía ácido trifluoroacético 0,06% (v/v); el caudal de flujo fue: 1 ml/min. Se aplicó el siguiente gradiente: 0 - 5 min: 10% B - 17 min: 45% B 65 min: 100% B 67 min: 100% B 69 min: 10% B 75 min: 10% B La detección por UV se realizó a las longitudes de onda de 214, 221, 260 y 280 nm. Se separaron los péptidos generados por la digestión con Endo-Glu-C (datos no mostrados) , 5.5(d) Análisis de péptidos proteolíticos mediante Desorción por Láser Asistida por Matrices/Espectrometría de Masa con Ionización de Tiempo de Vuelo (MALDI/TOF/TOF-MS) Se usó la espectrometría de masa para detectar el extremo N-terminal intacto de los G-CSF's en las diferentes muestras preparadas. Se utilizaron muestras (3-5 µg) resultantes de las digestiones con Glu-C endoproteínasa y muestras de proteína carboxamidometiladas directamente para el análisis por MS (sin la RP-HPLC del paso 6.3) y se purificaron utilizando tips de pipetas ZipTip que contenían material C18 de fase reversa de acuerdo a las instrucciones del fabricante . Después del lavado con ácido fórmico al 0,1% (v/v) , se realizó la elución de los péptidos con 10 µ? de ácido fórmico al 0,1% (v/v) en acetonitrilo 60% (v/v). Se analizaron los fragmentos de los péptidos proteolíticos (Endo-Glu-C) con un instrumento Bruker ULTRAFLEX tiempo de vuelo (TOF/TOF) en el modo de ión positivo lineal usando una matriz de 22,4 mg de ácido 3,5-dimetoxi-4-hidroxi-cinámico en 400 µ? de acetonitrilo y 600 µ? de ácido trifluoroacético 0,1% (v/v) en H20; se midieron los (glico) -péptidos utilizando una matriz de 19 mg de ácido a-ciano-4-hidroxicinámico en la misma mezcla de solventes utilizando el reflectrón para aumentar la resolución. Se mezclaron soluciones de muestra de 1 µ? y una concentración aproximada de 1-10 pmol-µ?"1 con cantidades iguales de la matriz respectiva. Esta mezcla se sembró sobre un blanco de acero inoxidable y se secó a temperatura ambiente previo al análisis. Se registró el espectro en el rango de masas de 900-5000 dalton. En la siguiente tabla se correlacionan las masas esperadas con los respectivos péptidos de G-CSF, Tabla: Masas (monoisotópicas) teóricas de péptidos de Endo-Glu-C resultantes de XM02 Los residuos de cisteína fueron carboxamidometilados ; los péptidos marcados como grasa fueron detectados en el espectro MALDI/TOF del G-CSF no modificado . El péptido Endo-Glu-C N- terminal (MTPLGPASSLPQSFLLKCLE ; m/z 2189 , 1 ) que comprende la posición 1 -20 de la proteina fue detectado en el espectro MAIDl/TOF-MS de muestras después del tratamiento proteolítico del G-CSF con la endoprotenasa Glu-C como se describe más arriba. 5.6. Resultados 5.6 (a) Purificación de G-CSF y variantes modificadas con HES A32 , ?60 y G-CSF no modificado fueron sometidos a purificación usando una columna de DEAE-Sefarosa CL-6B como se describe en A4. En el caso de la muestra no modificada 0401-15/A33 , no se detectó una absorción significativa a 280 nm en el flujo y la proteína eluyó en una concentración de 40-50% de buffer B (NaCl 0, 16-0, 20 M) en un volumen de 6 mi, con un área de pico específica de 660 mAU x mi de x mg"1 a 280 nm. La muestra 0401-14/A32 (derivada de 0401-15/A33 ; HESilación con HES/aldehído 10/0, 4) eluyó en un amlio rango del gradiente con una concentración del buffer B de 20-80% (NaCl 0 , 08-0,32 M) en un volumen de 12 mi . Alrededor del 90% del área del pico total detectada a 280 nm se encontró en el flujo, que contenía alrededor del 50% del total de proteína con una masa molecular aparentemente algo superior en comparación con la proteína eluída, como se detectó en el análisis mediante SDS-PAGE según se muestra en la Figura 13 anterior .

La muestra 0402-03/A60 (HESilada con HES 10/0,4, siguiendo el proceso general del Ejemplo 4.2) eluyó en un volumen de 10,5 mi a una concentración similar de 20-80% del buffer B. En este caso, alrededor del 35% del área del pico total detectada a 280 nm se encontró en el flujo; de todos modos mediante el análisis por SGS-PAGE, no se detectó proteina no unida en esta • fracción. En comparación con el área del pico especifica de la muestra 0401-15/A33, el contenido de proteina en el eluato de la muestra 0402- 03/A60 fue 45% más alto que la cantidad de proteina establecida que se aplicó a la columna. Se calculó la recuperación de proteínas basada en el área del pico (A280 nm) de las fracciones de elución en comparación con la proteína G-CSF no modificada.

Tabla 1: Comparación de las áreas de los picos con detección a 280 nm ** la cuantificación por RP-HPLC de la proteína confirmó estos resultados 5.6(b) Análisis de proteínas por mapeo de péptidos y MALDI/TOP MS después del tratamiento con la endoproteinasa Glu-C El peptido N-terminal resultante de la digestión de la endoproteinasa Glu-C tanto del G-CSF no modificado carbox-amidometilado (Figura 14) como del producto comercial Neupogen (datos no mostrados) fue claramente detectado mediante MALDI/TOF-MS (MTPLGPASSLPQSFLLKC*LE, m/z 2189,1; cisteína carboxamidometilada) . Esta señal no existía en muestra sometidas a modificación por HES por aminación reductiva (Figura 15) y en Neulasta (datos no mostrados) , indicando la modificación de este peptido. En el caso del G-CSF modificado con HES, en donde la modificación se llevó cabo mediante química de ásteres activados, el peptido N-terminal se detectó con una intensidad regular de señal comparable a aquella del material de partida A32 no modificado (Figura 16) indicando que la modificación de HES de estos derivados se realizó en diferentes cadenas laterales de aminoácidos . El secuenciamiento N-terminal de G-CSF modificado con HES (muestra A33 y producto comercial Neulasta) reveló un extremo N-terminal bloqueado, sugiriendo que realmente el residuo de metionina N-terminal de este derivado de proteína es modificado por un derivado de HES. Dado que la señal corespondiente al péptido que comprende los residuos de aminoácidos de posic . 35-47 (KLCATYKLCHPEE ; ambos residuos de cisterna carboxamidometilados m/z 1648,78) no se detectó en la muestra A60, se concluye que uno o ambos residuos de Usina (en posic. 35 y posic. 41) podrían ser modificados por HES. Referencias : Guillermina Forno, Mariela Bollati Fogolin, Marcos Oggero, Ricardo Kratje, Marina Etcheverrigaray, Harald S, Conradt, Manfred Nimtz (2004) N- and O-linked carbohydrates and glycosilation site occupancy in recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor secreted by a Chínese hámster ovary cell line Eur, J, Biochem, 271 (5) , 907-919 Nimtz, M, , Grabenhorst, E, , Conradt, H,S,, Sanz, L, & Calvete, J,J, (1999) Structural characterization de the oligosaccharide chains de native y crystallized boar seminal plasma spermadhesin PSP-I y PSP-II glycoforms, Eur, J, Biochem, 265, 703-718, Nimtz, M, , Martin, W, , ray, V, , lóppel, K, -D, , Agustín, J, & Conradt, H,S, (1993) Structures de sialilated oligosaccharides de human erythropoietin expressed en recombinant BHK-21 cells, Eur J, Bioch n, 213, 39-56 Nimtz, M, , Noli G, , Paques, E, & Conradt, H,S, (1990) Carbohydrate structures de human tissue plasminogen activator variant expressed en recombinant Chínese hámster ovary cells, FEBS Lett. 271, 14-18, Schróter, S, , Derr, P, , Conradt, H,S,, Nimtz, M, , Hale, G, & Kirchhoff, C, (1999) Male-specif ic modification de human CD52, J. Biol. Chem. 274, 29852-29873 E, Grabenhorst y H,S,Conradt (1999) he Cytoplasmic, Transmembrane y the Stem Regions de Glycosiltransferases specify their en vivo functional sublocalization y stability en the Golgi, J. Biol. Chem., 274, 36107-36116 E, Grabenhorst, A,Hoffmann, ,Nimtz, G, ZettlmeiSl y H, S,Conradt (1995) Construction of stable BHK-21 cells coexpressing human secretory glycoproteins and human GalSl-4GlcNAc-R a2,6-sialiltransferase : 2,6-linked NeuAc is preferably attached to the GalEl-4GlcNAcEl-2ManEl-3-branch de biantennary oligosaccharides of secreted recombinant-trace protein, Eur . J.Biochem. , 232, 718-725 Ejemplo 6: Resultados in vitro del conjugado de G-CSF obtenido en los Ejemplos 2.5 y 4.2 y purificado de acuerdo al Ejemplo 5: Mitogenicidad de variantes del G-CSF para ceúlas NFS-60 de ratón Se conoce el G-CSF por sus efectos específicos sobre la proliferación, la diferenciación y la activación de células hematopoyéticas del linaje neutrofílico de granulocitos . Se verificó la capacidad mitogénica de las variantes de G-CSF usando células MFS-60 de ratón (N, Shirafuji et al,, Exp, Hematol, 1989, 17, 116-119) . Células desarrolladas en un medio RPMI con suero fetal de ternero al 10% (Gibco INVITROGEN GmbH, arlsruhe, D) que contenía 5-10% de medio acondicionado WEHI-3B (GSMZ, Braunschweig, D; cultivado como se describe a través del GSMZ) como fuente de IL-3 exógena se cosecharon por centrifugación, se lavaron y se distribuyeron en alícuotas de 100.000 células por cavidad en una placa de 24 cavidades. Se permitió que las células se adaptaran durante 1 hora a 37°C en un medio RPMI sin medios acondicionados WEHI-3B antes de agregar muestras de factor de crecimiento G-CSF diluidas en el mismo medio. Las células NFS-60 se expusieron a variantes de G-CSF purificadas durante 3 días a 37°C y luego las células se contaron en forma electrónica (Casy IT Cell Counter, Schá fe System, Reutlingen, D) . Los resultados se resumen en la Figura 12. Como se ve en la Figura 12, las diferentes variantes de G-CSF (0,5-50 pg/ml) fueron capaces de estimular un incremento en la cantidad de células después de 3 días en comparación con el medio que no contiene el agregado de factores de crecimiento. Las proteínas de control no modificadas G-CSF/A33 y G-CSF/A58 estimularon células en una magnitud muy similar (EDso=5-10 pg/ml) mientras que los conjugados de G-CSF, G-CSF/A60 G-CSF/A32 y G-CSF/A57 mostraron sólo una menor disminución de la actividad en comparación con la versión no modificada (ED50= 10-25 pg/ml) . (véase Figura 8) Ejemplo 7 Síntesis de conjugados G-CSF Ejemplo 7.1. Síntesis de los derivados HES-aldehído Ejemplo 7.1(a) Síntesis de AminoHES10/0 , 4 5,12 g de oxo HES10/0,4 (PM = 10000 D, GS = 0,4, Supramol Parenteral ColloiGS GmbH, Rosbach-Rodheim, D de acuerdo a DE 196 28 705 Al) se calentaron durante la' noche a 80 °C al vacío y se disolvieron bajo atmósfera de nitrógeno en 25 mi de sulfóxido de dimetilo seco (Pluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) y se agregaron 5,13 mi de 1,4-diaminobutano . Después de agitar a 40°C durante 17 h la mezcla de reacción se agregó a 150 mi de una mezcla helada 1:1 de acetona y etanol (v/v) . El producto precipitado se recolectó mediante centrifugación a 4°C, se lavó con 40 mi de una mezcla helada 1:1 de acetona y etanol (v/v) y se recolectó mediante centrifugación. El producto en bruto se disolvió en 80 mi de agua, se dializó durante 4 d contra agua (Tubos de diálisis SnakeSkin, corte 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El rendimiento del producto aislado fue del 67%. Ejemplo 7.1(b) Síntesis de HES-aldehído 10/0,4 105 mg de 4-ácido formilbenzoico y 135 mg de 1-hidroxi-lH-benzotriazol (ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) se disolvieron en 7 mi de N,N-dimetilformamida (calidad para síntesis de péptidos, Biosolve, Valkenswaard, NL) y se agregaron 135 µ? de ?,?'-diisopropil carbodiimida (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) . Después de la incubación a 21°C durante 30 min, se agregó 0,7 g de amino HES 10/0,4 (sintetizado como se describe en 1.1) . Después de agitar durante 18 h a 22°C, la mezcla de reacción se agregó a 42 mi de una mezcla helada 1:1 de acetona y etanol (v/v) . El producto precipitado se recolectó mediante centrifugación a 4°C, se disolvió nuevamente en 5 mi de DMP y se precipitó con 42 mi de etanol/acetona como se describió más arriba. Después de la centrifugación, se disolvió en agua el precipitado recolectado, se dializó durante 1 d contra agua (Tubos de diálisis SnakeSkin, corte 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó; el rendimiento del producto aislado fue del 95%. Ejemplo 7.1(c) Síntesis de AminoHESlO/O , 7 6,02 g de oxo-HES 10/0,7 (PM = 10000 D, GS = 0,7, Supramol Parenteral ColloiGS GmbH, Rosbach-Rodheim, D, de acuerdo a DE 196 28 705) se disolvieron bajo atmósfera de nitrógeno en 32 mi de sulfóxido de dimetilo seco (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) y se agregaron 6,03 mi de 1 , 4-diaminobutano . Después de agitar a 40°C durante 17 h la mezcla de reacción se agregó a 150 mi de una mezcla helada 1:1 de acetona y etanol (v/v) . El producto precipitado se recolectó mediante centrifugación a 4°C, se lavó con 40 mi de una mezcla helada 1:1 de acetona y etanol (v/v) y se recolectó mediante centrifugación. El producto en bruto se disolvió en 80 mi de agua, se dializó durante 4 d contra agua (Tubos de diálisis SnakeSkin, corte 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El rendimiento del producto aislado fue del 52%. Ejemplo 7.1(d) Síntesis de HES aldehido 0/0,7 150 mg de 4-ácido formilbenzoico y 230 mg de 1-hidroxi-IH-benzotriazol (ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) se disolvieron en 10 mi de N,N-dimetilformamida (calidad para síntesis de péptidos, Biosolve, Valkenswaard, NL) y se agregaron 204 µ? de ?,?'-diisopropil carbodiimida (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) . Después de la incubación a 21°C durante 30 min, se agregó 1 g de amino HES10/0,7 (sintetizado como se describe en 1.3). Después de agitar durante 19 h a 22°C, la mezcla de reacción se agregó a 84 mi de 2-propanol helado. El producto precipitado se recolectó mediante centrifugación a 4°C, se disolvió nuevamente en 50 mi de agua, se dializó durante 2 d contra agua (Tubos de diálisis SnakeSkin, corte 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El rendimiento del producto aislado fue del 83%. Ejemplo 7.1(e) Síntesis de Amino HES 30/0,4 Se calentaron 5 g de oxo-HES 30/0,4 (PM = 30000 D, GS = 0,4, ' Supramol Parenteral ColloiGS GmbH, Rosbach-Rodheim, D, usando relaciones molares de los componentes de acuerdo a DE 196 28 705 Al) durante la noche a 80 °C al vacío y luego de disolvieron bajo atmósfera de nitrógeno en 28 mi de suflóxido de dimetilo seco (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) y se agregaron 1,67 mi de 1 , -diaminobutano . Después de agitar a 40°C durante 17 h la mezcla de reacción se agregó a 175 mi de una mezcla helada 1:1 de acetona y etanol (v/v) , El producto precipitado se recolectó mediante centrifugación a 4°C. El producto en bruto se disolvió en 40 mi de agua, se dializó durante 2 d contra agua (Tubos de diálisis SnakeSkin, corte 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. No se determinó el rendimiento del producto aislado. Ejemplo 7.1(f) Síntesis de HES-aldehído 30/0,4 130 mg de 4-ácido formilbenzoico y 153 mg de 1-hidroxi-??-benzotriazol (ambos Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) se disolvieron en 36 mi de N,N-dimetilformamida (Peptide Síntesis grade, Biosolve, Valkenswaard, NL) y se agregaron 110 µ? de ?,?'-diisopropilcarbodiimida (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) . Después de la incubación a 21°C durante 30 min, se agregaron 2,61 g de aminoHES30/0 , 4 (sintetizado como se describe en 1.5) . Después de agitar durante 22,5 h a 22°C, la mezcla de reacción se agregó a 160 mi de una mezcla helada 1:1 de acetona y etanol (v/v). El producto precipitado se recolectó mediante centrifugación a 4°C y se lavó con una mezcla helada 1:1 de acetona y etanol (v/v). Después de la centrifugación, se disolvió el precipitado en en 30 mi de agua, se dializó durante 1 d contra agua (Tubos de diálisis SnakeSkin, corte 3,5 kD, Perbio Sciences De tschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El rendimiento del producto aislado fue del 81%. Ejemplo 7.1(g) Síntesis de HES-amino 30/0,7 Se calentaron 5 g de oxo-HES 30/0,7 (PM = 30000 D, GS = 0,7, Supramol Parenteral ColloiGS GmbH, osbach-Rodheim, D, usando relaciones molares de los componentes de acuerdo a DE 196 28 705 Al) durante la noche a 80°C al vacío y luego se disolvieron bajo atmósfera de nitrógeno en 28 mi de sulfóxido de dimeto seco (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) y se agregaron 1,67 mi de 1 , 4-diaminobutano . Después de agitar a 40°C durante 17 h, se agregó la mezcla de reacción a 175 mi de una mezcla helada 1:1 de acetona y etanol (v/v) . El producto precipitado se recolectó mediante centrifugación a 4°C. El producto en bruto se disolvió en 40 mi de agua, se dializó durante 2 d contra agua (Tubos de diálisis SnakeSkin, corte 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. No se determinó el rendimiento del producto aislado. Ejemplo 7.1(h) Síntesis de AldehídoHES30/0, 7 122 mg de 4-ácido formilbenzoico y 144 mg de 1-hidroxi-??-benzotriazol (ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) se disolvieron en 34 mi de N,N-dimetilformamida (calidad para síntesis de péptidos, Biosolve, Valkenswaard, NL) y se agregaron 103 µ? de N,N'~ diisopropil carbodiimida (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) . Después de la incubación a 21°C durante 30 min, se agregaron 2,46 g de HES-amino 30/0,7 (sintetizado como se describe en 1.7) . Después de agitar durante 22,5 h a 22 °C, la mezcla de reacción se agregó a 160 mi de una mezcla helada 1:1 de acetona y etanol (v/v) . El producto precipitado se recolectó mediante centrifugación a 4°C y se lavó con una mezcla helada 1:1 de acetona y etanol (v/v) . Después de la centrifugación se disolvió el precipitado en 30 mi de agua, se dializó durante 1 d contra agua (Tubos de diálisis SnakeSkin, corte 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El rendimiento del producto aislado fue del 87%. Ejemplo 7,1 (i) Síntesis de AminoHES50/0 , 7 Se calentaron 6,09 g de oxo-HES 50/0,7 (PM = 50000 D, GS = 0,7, Supramol Parenteral ColloiGS GmbH, Rosbach-Rodheim, D, usando relaciones molares de los componentes de acuerdo a DE 196 28 705 Al) durante la noche a 80 °C al vacío y luego se disolvieron bajo atmósfera de nitrógeno en 28 mi de sulfóxido de dimeto seco (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) y se agregaron 1,22 mi de 1 , 4-diaminobutano . Después de agitar a 40 °C durante 17 h, la mezcla de reacción se agregó a 150 mi de una mezcla helada 1:1 de acetona y etanol (v/v) . El producto precipitado se recolectó mediante centrifugación a 4°C, se lavó con 40 mi de una mezcla helada 1:1 de acetona y etanol (v/v) y se recolectó mediante centrifugación. El producto en bruto se disolvió en 80 mi de agua, se dializó durante 4 d contra agua (Tubos de diálisis SnakeSkin, corte 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El rendimiento del producto aislado fue del 82%. Ejemplo 7.1 (j) Síntesis de AldehídoHES50/0, 7 125 mg de 4-ácido formilbenzoico y 174 mg de 1-hidroxi -lH-benzotriazol (ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) se disolvieron en 38 mi de N,N-dimetilformamida (calidad para síntesis de péptídos, Biosolve, Valkenswaard, NL) y se agregaron 155 µ? de ?,?' -diisopropil carbodiimida (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) . Después de la incubación a 21°C durante 30 min, se agregaron 3,8 g de aminoHES50/0, 7 (sintetizado como se describe en 1,9) . Después de agitar durante 19 h a 22°C, la mezcla de reacción se agregó a 160 mi de una mezcla helada 1:1 de acetona y etanol (v/v) . El producto precipitado se recolectó mediante centrifugación a 4°C, se disolvió nuevamente en 20 mi de ?,?-dimetilformamida y se precipitó con 80 mi de una mezcla helada 1:1 de acetona y etanol (v/v) como se describió más arriba. Después de la centrifugación, se disolvió el precipitado en 50 mi de agua, se dializó durante 2 d contra agua (Tubos de diálisis SnakeSkin, corte 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El rendimiento del producto aislado fue del 77%. Ejemplo 7.2 Síntesis de los conjugados HES-G-CSG por aminación reductiva Ejemplo 7.2(a) Intercambio de buffer A: Se concentraron 33 mi de una solución de 0,454 mg/ml de hG-CSF (XM02, BioGeneriX AG, Mannheim, D) en acetato de sodio 10 Tri , 50 mg/ml de sorbitol y 0, 004% de Tween 80 de pH 4,0 mediante diafiltración a 0°C hasta 4 mi con un concentrador Vi aspin 15R (VS15RH11, 5 D PMCO, Vivascience AG, Hannover, D) y se dilueron nuevamente a 15 mi con un buffer de acetato de sodio 0,1 M de pH 5,0. Esta diafiltración se repitió dos veces. La concentración final en el último paso de diafiltración fue de 3 mg/ml. Ejemplo 7.2(b) Reacción de hG-CSF con derivados HES-aldehído de los ejemplos 7.1(b), 7.1(d) y 7.1 (j) A 1,67 mi de una solución de hG-CSF se agregaron después del intercambio del buffer en buffer de acetato de sodio 0,1 M, pH 5,0 (como se describe en 7.2(a) anterior), 1,67 mi de una solución del derivado de HES y 1,67 mi de una solución de cianoborohidruro de sodio 60 mM, ambos en el mismo buffer y la solución se incubó durante 15,5 h a 4°C. Todas las soluciones se enfriaron a 0°C previo al mezclado. Se emplearon las siguientes concentraciones finales de HES: 39,4 mg/ml para los derivados de HES preparados de acuerdo al Ejemplo 7.1(b) y 7.1(d), 197 mg/ml para el derivado de HES preparado de acuerdo al Ejemplo 7.1 (j ) , 197 mg/ml de HES50/0,7 (PM = 50000 D, GS = 0,7, Supramol Parenteral ColloiGS GmbH, Rosbach-Rodheim, D) como control de reacción. Las mezclas de reacción se analizaron mediante electroforesis en gel (véase Figura 17) Ejemplo 7.2(c) Intercambio de buffer B: Se concentraron 20 mi de una solución de 0,454 mg/ml de hG-CSF (XM02, BioGeneriX AG, Mannheim, D) en acetato de sodio 10 mM, 50 mg/ml de sorbitol y 0,004% de T een 80 de pH 4,0 mediante diafiltración a 15°C a 4 mi con un concentrador Vivaspin 15R (VS15RH11, 5KD PMCO, Vivascience AG, Hannover, D) y se diluyeron nuevamente a 15 mi con un buffer de acetato de sodio 0,1 M de pH 5,0. Esta diafiltración se repitió dos veces. La concentración final en el último paso de diafiltración fue de 1,5 mg/ml. Ejemplo 7.2(d) Reacción de hG-CSF con derivados HES-aldehído de los ejemplos 7.1(f) y 7.1(h) A 3,3 mi de una solución de hG-CSF se agregaron después del intercambio del buffer en buffer de acetato de sodio 0,1 M, pH 5,0 (como se describe en el Ejemplo 7.2(c) anterior) 3,3 mi de una solución de 789 mg del derivado de HES y 3,3 mi de una solución de cianoborohidruro de sodio 60 mM, ambos en , el mismo buffer, y la solución se incubó durante 30 h a 4°C. Todas las soluciones se enfriaron a 0°C previo al mezclado.

Después de 17 h se retiraron las muestras para el control de reacción. Las mezclas de reacción se analizaron mediante electroforesis en gel (véase Figura 18) . Ejemplo 7.3 Síntesis de conjugados de HES-GCFS por acoplamiento de ??G -succinimidil carbonato Ejemplo 7,3 (a) Síntesis de conjugados de G-CSF por reacción del hidroxietil almidón que presenta un grupo éster reactivo con G-CSF 400 mg de oxo-HES10/0 , 7 (preparados mediante Supramol Parenteral ColloiGS GmbH, Rosbach-Rodheim, D; de acuerdo a DE 196 28 705 Al, el grado de oxidación de oxo-HES fue del 95 %) se disolvieron en 1 mi de DMF anhidra. A esta solución se agregaron 21 mg de ?,?' -disuccinimidil carbonato, y la mezcla se agitó durante 2 h a temperatura ambiente. La solución resultante tenía una concentración de HES reactivo de 40 por ciento en peso. Se concentró una solución de G-CSF (Strathmann Biotec AG, Hamburgo, D) , que presentaba una concentración de alrededor de 0,5 mg de G-CSF/ml, hasta una concentración de 10 mg/ml mediante ultracentrifugación con un corte de 100 kD utilizando una centrífuga refrigerante. A 0,5 mi de esta solución concentrada de G-CSF, se agregaron 180 µ? de una solución de bicarbonato de sodio. A continuación se agi~egaron gota a gota 3 porciones (100 µ? cada una) de la solución de HES reactivo a la solución de proteína, hasta que después de alrededor de 30 min, concluyó la reacción. Así, la relación molar global HES reactivo :G-CSF fue de aproximadamente 50:1. Luego se ajustó el pH de la mezcla a 4,0 utilizando HCl 0,1 N. De un análisis de HPGPC (Cromatografía de permeación en gel de alta resolución) se obtuvo un rendimiento superior al 95%. No se detectó ningún G-CSF sin reaccionar. Este resultado se muestra en la Fig. 19. Ejemplo 7,4 Ensayo in vitro Mitogenicidad de variantes de G-CSF para células NFS-60 de ratón El G-CSF es conocido por sus efectos específicos sobre la proliferación, la diferenciación y la activación de células hematopoyéticas del linaje neutrofílico de granulocitos . Se verificó la capacidad mitogénica de las variantes de G-CSF usando células NFS-60 de ratón (N, Shirafuji et al,, Exp, Hematol , 1989, 17, 116-119). Células desarroladas en un medio RPMI con suero fetal de ternero al 10% (Gibco INVITROGEN GmbH, Karlsruhe, D) que contiene 5-10% de medio WEHI-3B (GSMZ, Braunschweig, D; cultivado como se describe a través del GSMZ) acondicionado como fuente de IL-3 exógena se cosecharon por centrifugación, se lavaron y se distribuyeron en alícuotas de 100.000 células por cavidad en una placa de 24 cavidades. Se permitió que las células se adaptaran durante 1 hora a 37 °C en un medio RPMI sin medio acondicionados por WEHI-3B antes de agregar muestras de factor de crecimiento G-CSF diluidas en el mismo medio. Las células NFS-60 se expusieron a variantes de G-CSF purificadas (purificación de acuerdo a los ejemplos 5.3, 5.4, cuantificación de proteína de acuerdo al Ejemplo 5.5(a)) : Neupogen®, Neulasta® ambos de Amgen, "Conjugado HES-GCFS10/0 , 4" preparado en el Ejemplo 7.2(b), "Conjugado HES-GCFS10/0 , 7" preparado en el Ejemplo 7.2(b), . "Conjugado HES-GCFS30/0,4" preparado en el Ejemplo 7.2(d), "Conjugado HES-GCFS30/0 , 7" preparado en el Ejemplo 7.2(d), "Conjugado HES-GCFS50/0,7" preparado en el Ejemplo 7.2(b), "Conjugado HES-GCFS 10/0,7 (Supramol)" preparado de acuerdo al Ejemplo 7.3(a), "Incubación Simulada" ( = Control de reacción, 197mg/ml de HES50/0,7, PM 50000D, GS 7, Supramol Parenteral ColloiGS GmbH, Rosbach Rodheim, Alemania) , durante 3 días a 37°C y luego se realizó el recuento electrónico de las células (Casy TT Cell Counter, Schárfe System, Reutlingen, D) . Los resultados se resumen en la Tabla 2 y en la Figura 20. En todos los casos, las cantidades de proteína indicadas en la Tabla 2 y la Figura 20 representan sólo el contenido de los conjugados G-CSF y se basan en las concentraciones determinadas por GlycoThera. Como puede verse en la Figura 20, todas las diferentes variantes del G-CSF (2,5-250 pg/ml) tuvieron la capacidad de estimular un incremento de la cantidad de células después de 3 días en comparación con un medio al que no se había agregado factores de crecimiento. Todas las variantes alcanzaron el mismo nivel máximo de estimulación a una concentración de 250 pg/ml. Tabla 2: Proliferación de células NFS-60 de ratón, inducidas por variantes de G-CSF (Supramol) Ejemplo 7.5 Efectos biológicos in vivo de conjugados hG-CSF en ratas Después de arribadas, las ratas [ratas macho CRL:CD (7 semanas de edad) , Charles River Deutschland GmbH, Sanghofer Weg 7, D-97633 Sulzfeld) ] se clasificaron al azar en grupos de 5. Después de 7 dias de acostumbramiento, se excluyeron las ratas en malas condiciones y se reemplazaron por animales sobrantes. El peso de las ratas al llegar fue de 181-203 g. A cada grupo "de cinco ratas seleccionadas al azar entonces se le administró en forma endovenosa 100 µ de proteína por kg de peso corporal (velocidad de inyección 15 seg/dosis, vehículo: 5ml de PBS/kg peso corporal) de las siguientes muestras de G-CSF conjugado o no conjugado (purificado de acuerdo a los ejemplos 5.3, 5.4, cuantificación de proteína de acuerdo al Ejemplo 5.5(a)) : Neupogen® y Neulasta®, ambos de Amgen, "Conjugado HES-GCSF10/0,4" (10/0,4) preparado en el Ejemplo 7.2(b) , "Conjugado HES-GCSF10/0,7" (10/0,7) preparado en el Ejemplo 7.2(b), "Conjugado HES-GCSF30/0,4" (30/0,4) preparado en el Ejemplo 7.2(d), "Conjugado HES-GCSF30/0,7" (30/0,7) preparado en el Ejen lo 7.2(d), "Conjugado HES-GCSF50/0,7" (50/0,7) preparado en el Ejemplo 7.2(b), "Supramol HES-GCSFlO/0, 7" (S10/0,7) preparado de acuerdo al Ejemplo 7.3(a) "Incubación Simulada" (= Control de reacción, 197mg/ml de HES50/0,7, PM 50000D, GS 7, Supramol Parenteral ColloiGS GmbH, Rosbach Rodheim, Alemania) y un vehículo control. Se tomaron muestras de sangre de todos los animales en aprox. 200 µ? de EDTA de la sangre completa del plexo venoso retrobulbar bajo una leve anestesia con éter. En el día 5 del ensayo, se extrajo sangre de todos los animales una vez por la mañana después de un ayuno durante la noche. En los días 1 a 8 del ensayo, se extrajo sangre dos veces al día con un intervalo de 12 horas . La primera muestra de sangre del día 1 se extrajo antes de la administración del conjugado de G-CSF/GCSF. Se realizaron recuentos de glóbulos blancos (RGB) empleando un Bayer ADVIA™ 120 (Fernwald, Alemania) . Los resultados se muestran en la Figura 21. Se hace constar que conrelacion a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la practica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede , se rerclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1 . Un método para preparar un conj ugado caracterizado porgue comprende una proteína y un polímero o un derivado del mismo , donde el polímero es un hidroxialquil almidón (HAS) y la proteína es un factor de estimulación de colonias de granulocitos (G-CSF) , comprendiendo el método hacer reaccionar , por lo menos , un grupo funcional A del polímero o del derivado del mismo con, por lo menos , un grupo funcional Z de la proteína y formar así una unión covalente , donde Z se selecciona del grupo que consiste en un grupo amino , un grupo tiol , un grupo aldehido y un grupo ceto , y - donde , en caso de que Z sea un grupo aldehido o un grupo ceto, A incluye un grupo amino que forman dicha unión con Z, o donde, en caso de que Z sea un grupo amino, A se selecciona del grupo que consiste en un grupo carboxi reactivo y un grupo aldehido, un grupo ceto o un grupo hemiacetal, — donde, en caso de que A sea un grupo aldehido, un grupo ceto o un grupo hemiacetal, el método además comprende introducir A en el polímero para dar un derivado de polímero haciendo reaccionar el polímero, por' lo menos, con un compuesto bifuncional, un grupo funcional de los cuales reacciona con el polímero y, por lo menos, otro grupo funcional de los cuales es un grupo aldehido, un grupo ceto o un grupo hemiacetal, o es un grupo funcional que además está químicamente modificado para dar un grupo aldehido, un grupo ceto o un grupo hemiacetal, u — oxidando el polímero para dar, por lo menos, uno, en particular por lo menos dos, grupos aldehido, o donde, en caso de que A sea un grupo carboxi reactivo, el método además comprende introducir A en el polímero para dar un derivado de polímero mediante la oxidación selectiva del polímero en su extremo reductor y activando el grupo carboxi resultante, o haciendo reaccionar el polímero en su extremo reductor no-oxidado con un diéster carbónico, o donde, en caso de que Z sea un grupo tiol, A comprende un grupo maleimido o — un grupo haloacetilo que forman dicha unión con Z.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado porque el hidroxialquil almidón es hidroxietil almidón.
3. El método de conformidad con la reivindicación 2 caracterizado porque el hidroxietil almidón tiene un peso molecular de 2 a 200 kD, preferentemente de 4 a 130 kD, de mayor preferencia de 4 a 70 kD.
4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque Z es un grupo aldehido o un grupo ceto.
5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el grupo aldehido o el grupo ceto está ubicado en un carbohidrato de cadena lateral de la proteína y/o en el grupo N-terminal de la proteína.
6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque comprende además oxidar el carbohidrato de cadena lateral de la proteína y/u oxidar el grupo N-terminal de la proteína para obtener el grupo aldehido o grupo ceto.
7. El método conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la reacción de oxidación se lleva a cabo enzimáticamente o utilizando un peryodato, en cada caso, si es necesario, después de haber eliminado un ácido siálico terminal.
8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, caracterizado porque conprende además hacer reaccionar el polímero en su extremo reductor no oxidado con un compuesto que al menos se une bifuncionalmente, que comprende un grupo funcional capaz de reaccionar con el extremo reductor no oxidado del polímero y un grupo A, previo a la reacción del derivado de polímero que comprende A y la proteína que conprende Z.
9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, caracterizado porque A es un grupo aminooxi o un grupo hidrazido.
10. El método de conformidad con la reivindicación 8 o 9, caracterizado porque el compuesto que al menos se une bifuncionalmente es un compuesto homobifuncional .
11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el compuesto homobifuncional comprende dos grupos arainooxi.
12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el compuesto homobifuncional es 0- [2- (2-aminooxi-etoxi) -etil]hidroxil amina.
13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, caracterizado porque la reacción del polímero con el compuesto que al menos se une bifuncionalmente se lleva a cabo en un medio acuoso.
14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizado porque la reacción del polímero con el compuesto que al menos se une bifuncionalmente produce una unión oxima y/o una unión oxiamino.
15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque Z es un grupo amino.
16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque comprende además oxidar selectivamente el polímero en su extremo reductor y hacer reaccionar el polímero oxidado con ?,?' -disuccinimidil carbonato en su extremo reductor oxidado para obtener un derivado de polímero que comprende el grupo reactivo carboxi A.
17. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque comprende además hacer reaccionar al menos un grupo hidroxi del polímero, cuyo extremo reductor no está oxidado, con un diéster carbónico para obtener el grupo reactivo carboxi A.
18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el diéster carbónico es un diéster simétrico.
19. El método de conformidad con la reivindicación 17 o 18, caracterizado porque el componente alcohol del éster se selecciona del grupo que consiste en N-hidroxi succinimida, N-hidroxi succinimida sulfonada, N-hidroxi benzotriazol y fenoles sustituidos con nitro o halógeno .
20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el fenol sustituido con halógeno se selecciona del grupo que consiste en nitrofenol , dinitrof enol , triclorof enol , trif luorof enol , pentaclorof enol y pentaf luorof enol .
21 . El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20 , caracterizado porque la reacción de al menos un grupo hidroxi del polímero, cuyo extremo reductor no está oxidado , con el diéster carbónico para obtener un grupo éster A reactivo se lleva a cabo en un solvente polar aprótico anhidro .
22 . El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado porque el solvente es dimetil acetamida , dimetil formamida o una mezcla de los mismos .
23 . El método de conformidad con la reivindicación 15 , caracterizado porque A es un grupo aldehido, un grupo ceto o un grupo hemiacetal , comprendiendo el método además hacer reaccionar el polímero con un grupo funcional M de un compuesto al menos bi funcional para obtener un derivado de polímero, coprende además el grupo al menos bifuncional al menos otro grupo funcional Q, que es el grupo aldehido, el grupo ceto o el grupo hemiacetal A.
24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque M comprende un grupo amino.
25. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque A es un grupo aldehido, un grupo ceto o un grupo hemiacetal, comprendiendo además el método hacer reaccionar el polímero con un grupo funcional M de un compuesto al menos bifuncional para obtener un derivado de polímero, comprendiendo además el compuesto al menos bifuncional al menos otro grupo funcional Q que no es un grupo aldehido, un grupo ceto o un grupo hemiacetal, comprendiendo además el método hacer reaccionar el grupo funcional Q con al menos un compuesto adecuado para obtener el derivado de polímero que comprende el grupo aldehido, el grupo ceto o el grupo hemiacetal A.
26. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque M y Q comprenden un grupo amino .
27. El método de conformidad con la reivindicación 25 o 26, caracterizado porque al menos uno de los compuestos adecuados comprende un grupo carboxi y un grupo aldehido, un grupo ceto o un grupo hemiacetal .
28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque al menos uno de los compuestos adecuados es ácido formilbenzoico o ácido 4- (4-formil-3 , 5-dimetoxifenoxi)butírico.
29. El método de conformidad con la reivindicación 25 o 26, caracterizado porque M comprende un grupo amino y Q comprende un grupo beta hidroxi amino.
30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porgue el polímero se hace reaccionar en su extremo reductor oxidado con un grupo funcional M dé un compuesto al menos bifuncional.
31. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque comprende además oxidar el grupo beta hidroxiamino para obtener el grupo aldehido.
32. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la reacción de oxidación se lleva a cabo usando un peryodato.
33. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el polímero se somete a una reacción de oxidación de apertura de anillo usando un peryodato para obtener un derivado de polímero que presenta al menos uno, an particular al menos dos, grupos aldehido A.
34. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 33, caracterizado porque la reacción del polímero o el derivado de polímero con la porteína es una aminación reductiva.
35. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la aminación reductiva se lleva a cabo en presencia de NaCNBH3.
36. El método de conformidad con la reivindicación 34 o 35, caracterizado porque la aminación reductiva se lleva a cabo a un valor de pH de 7 o inferior.
37. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el valor del pH es & o inferior.
38. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34 a 37, caracterizado porque la aminación reductiva se lleva a cabo a una temperatura de 0 a 25°C.
39. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34 a 38, caracterizado porque la aminación reductiva se lleva a cabo en un medio acuoso.
40. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque Z es un grupo tiol.
41. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque A comprende un grupo haloacetilo, comprendiendo el método además hacer reaccionar el polímero en su extremo opcionalmente oxidado con un compuesto al menos bifuncional que presenta al menos dos grupos funcionales que comprenden cada uno un grupo amino para dar un derivado de polímero que tenga al menos un grupo funcional que comprende un grupo amino, comprendiendo el método además hacer reaccionar el derivado de polímero con un ácido acético sustituido monohalogenado y/o un derivado de ácido acético reactivo sustituido monohalogenado.
42. El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque el halógen es Br o I.
43. El método de conformidad con la reivindicación 41 o 42, caracterizado porque el compuesto al menos bifuncional es un diaminoalcano que presenta de 2 a 10 átomos de carbono.
44. El método de conformidad con la reivindicación 41 o 42, caracterizado porque el compuesto al menos bifuncional es un diaminopolietilenglicol que presenta de 1 a 5 unidades de alquileno.
45. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41 a 44, caracterizado porque el polímero se hace reaccionar con el compuesto al menos bifuncional en su extremo reductor oxidado.
46. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41 a 45, caracterizado porque el derivado de polímero que comprende el grupo haloacetilo se hace reaccionar con la proteína en presencia de un solvente que comprende una mezcla de dimetilformamida y agua.
47. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque A comprende un grupo maleimido, comprendiendo el método además hacer reaccionar el polímero en su extremo opcionalmente oxidado con un compuesto al menos bifuncional que comprende un grupo funcional U capaz de reaccionar con el extremo reductor opcionalmente oxidado, comprendiendo el compuesto al menos bifuncional además un grupo funcional W capaz de ser químicamente modificado para dar un grupo maleimido, comprendiendo el método además modificar químicamente el grupo funcional para obtener un grupo maleimido .
48. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque U comprende un grupo amino.
49. El método de conformidad con la reivindicación 47 o 48 , caracterizado porque W comprende un grupo amino .
50. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 47 a 49, caracterizado porque el derivado de polímero que comprende W se hace reaccionar con un compuesto al menos bifuncional que comprende un grupo funcional capaz de reaccionar con W y que comprende además un grupo maleimido.
51. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque el compuesto al menos bifuncional es el éster N- (alfa-maleimidoacetoxi) succinimida.
52. Un conjugado caracterizado porque puede obtenerse mediante un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 51.
53. El conjugado de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque A es un grupo carboxi reactivo, y donde A fue introducido en el polímero, cuyo extremo reductor no estaba oxidado, haciendo reaccionar al menos un grupo hidroxi del polímero con un diéster carbónico, comprendiendo dicho conjugado una molécula de polímero y al menos una, en particular de 1 a 10 moléculas de proteína unidas al polímero a través de uniones amida.
54. ün conjugado caracterizado porque comprende una proteína y un polímero o un derivado del mismo, donde el polímero es un hidroxialquil almidón (HAS) y la proteína es un factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) , que presenta una estructura conforme la fórmula donde R2 y R3 son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, un grupo hidroxiarilo, un grupo hidroxiaralquilo o un grupo hidroxialcarilo que presentan de 2 a 10 átomos de carbono, preferentemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, de mayor preferencia hidrógeno o un grupo hidroxietilo, donde G se selecciona del grupo que consiste en O y S, preferentemente O, y donde L es un residuo hidrocarbonado, opcionalmente sustituido, lineal, ramificado y/o cíclico, que opcionalmente comprende un heteroátomo, con preferencia un residuo alquilo, arilo, aralquilo, heteroalquilo, heteroaralquilo que presentan de 2 a 60 átomos de carbono.
55. Los conjugados de conformidad con la reivindicación 54, caracterizados porque -L- es -(C¾)n- con n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, preferentemente 2, 3, 4, 5, 6, de mayor preferencia 2, 3, 4, y de preferencia especial 4.
56. Un conjugado caracterizado porque comprende una proteina y un polímero o un derivado del mismo, donde el polímero es un hidroxialquil almidón (HAS) y la proteína es un factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) , que presenta una estructura conforme la fórmula Proteína' y/o Proteína' donde Rlr R2 y R3 son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, un grupo hidroxiarilo, un grupo hidroxiaralquilo o un grupo hidroxialcarilo que presentan de 2 a 10 átomos de carbono, preferentemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, de mayor preferencia hidrógeno o un grupo hidroxietilo, y donde G se selecciona del grupo que consiste en 0 y S, preferentemente 0.
57. ün conjugado caracterizado porque coirprende una proteína y un polímero o un derivado del mismo, donde el polímero es un hidroxialquil almidón (HAS) y la proteína es un factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) , que presenta una estructura conforme la fórmula donde Rlr R2 y R3 son independientemente hidrógeno grupo hidroxialquilo, un grupo hidroxiarilo, un grupo hidroxiaralquilo o un grupo hidroxialcarilo que presentan de 1 a 10 átomos de carbono, preferentemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, de mayor preferencia hidrógeno o un grupo hidroxietilo, y donde L es un residuo hidrocarbonado, opcionalmente sustituido, lineal, ramificado y/o cíclico, que opcionalmente comprende un eteroátomo, preferentemente un residuo alquilo, arilo, aralquilo, heteroalquilo que presenta de 2 a 60 átomos de carbono.
58. El conjugado de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque -L- es donde ¾, ¾, Re, ¾ son independientemente hidrógeno, alquilo, arilo, preferentemente hidrógeno, donde G se selecciona del grupo que consiste en O y S, preferentemente 0, y donde mi, 2, 3 o 4, donde los residuos Ra y í¾> pueden ser iguales o diferentes en los m grupos (CRaRb) ; nO a 20, preferentemente 0 a 10, de mayor preferencia 1, 2, 3, 4, 5, de máxima preferencia 1 o 2; oO a 20, preferentemente 0 a 10, de mayor preferencia 1, 2, 3, 4, 5, de máxima preferencia 1 o 2, donde los residuos ¾ y ¾ pueden ser iguales o diferentes en los o grupos (CRoRd) ;
59. El conjugado de conformidad con la reivindicación 57 o 58, caracterizado porque ¾, ¾, Re, Rd son hidrógeno, m = 2, n=lyo = 2.
60. Un conjugado caracterizado porque comprende una proteína y un polímero o un derivado del mismo, donde el polímero es un hidroxialquil almidón (HAS ) y la proteina es un factor estimulante de colonias de granulocitos ( G-CSF) , que presenta una estructura conforme a la fórmula Proteína' donde Ri , í½ y R3 son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, un grupo hidroxiarilo, un grupo hidroxiaralquilo o un grupo hidroxialcarilo que presenta de 2 a 10 átomos de carbono, preferentemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, de mayor preferencia hidrógeno o un grupo hidroxietilo.
61. Un conjugado caracterizado porque comprende una proteina y un polímero o un derivado del mismo, donde el polímero es un hidroxialquil almidón (HAS) y la proteina es un factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) , que presenta una estructura conforme a la fórmula Proteína' donde Ri , R2 y R3 son independientemente hidrógeno grupo hidroxialquilo, un grupo hidroxiarilo, un grupo hidroxiaralquilo o un grupo hidroxialcarilo que presenta de 2 a 10 átomos de carbono, preferentemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, de mayor preferencia hidrógeno o un grupo hidroxietilo, y donde la unión -O- (C=0) - se formó por una reacción entre un grupo carboxi o un grupo carboxi reactivo con un grupo hidroxi de la molécula de HAS, y donde HAS'1 se refiere a la molécula de HAS sin dicho grupo hidroxi .
62. Un conjugado caracterizado porque comprende una proteina y un polímero o un derivado del mismo, donde el polímero es un hidroxialquil almidón (HAS) y la proteína es un factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) , que presenta una estructura conforme a la fórmula Proteína' y/o Proteína' donde Rlf R2 y R3 son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, un grupo hidroxiarilo, un grupo hidroxiaralquilo o un grupo hidroxialcarilo que presenta de 2 a 10 átomos de carbono, preferentemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, de mayor preferencia hidrógeno o un grupo hidroxietilo, y donde L es un residuo hidrocarbonado, opcionalmente sustituido, lineal, ramificado /o cíclico, que opcionalmente comprende un heteroátomo, que presenta de 1 a 60, preferentemente de 1 a 40, de mayor preferencia de 1 a 20, de mayor preferencia de 1 a 10, de mayor preferencia de 1 a 6, de mayor preferencia de 1 a 2, átomos de carbono y de preferencia especial 1 átomo de carbono, siendo L en particular C¾.
63. Un conjugado caracterizado porque comprende una proteína y un polímero o un derivado del mismo, donde el polímero es un hidroxialquil almidón (HAS) y la proteína es un factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) , que presenta una estructura conforme a la fórmula Proteína' donde Rle R2 y R3 son independientemente hidrógeno grupo hidroxi al quilo , un grupo hidroxiarilo, un grupo hidroxiaralquilo o un grupo hidroxialcarilo que presenta de 2 a 10 átomos de carbono , preferentemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, de mayor preferencia hidrógeno o un grupo hidroxietilo , y donde Ll y L2 son independientemente un residuo hidrocarbonado , opcionalmente sustituido, lineal , ramificado y/o cíclico , que opcionalmente comprende un heteroátomo, que comprenden un residuo alquilo , arilo , aralquilo , heteroalquilo y/o heteroaralquilo, presentando dicho residuo de 1 a 60, preferentemente de 1 a 40, de mayor preferencia de 1 a 20, de mayor preferencia de 1 a 10, átomos de carbono, y donde D es una unión, preferentemente una unión ccvalente, que se formó a través de un grupo funcional adecuado F2 unido a La y un grupo funcional adecuado F3 unido a IQ .
64. El conjugado de conformidad con la reivindicación 63 , caracterizado porque La es - (dí2) n- , con n = 2 , 3 , 4, 5, 6, 7, 8 , 9, 10, preferentemente 2, 3 , 4 , 5, 6, de mayor preferencia 2, 3 , 4, y de preferencia especial 4.
65 . El conjugado de conformidad con la reivindicación 63 o 64, caracterizado porque ?¾ comprende un resto arilo opcionalmente sustituido en forma adecuada, preferentemente un resto arilo que contiene 6 átomos de carbono , siendo L2 de especial preferencia C6H4 .
66 . El conj ugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 63 a 65, caracterizado porque F2 se selecciona del grupo que consiste en: -uniones dobles C-C o uniones triples C-C o uniones aromáticas C-C; -el grupo tiol o los grupos hidroxi; -hidrazida de ácido alquilsulfónico , hidrazida de ácido arilsulfónico; - 1, 2 -dioles ; -1,2 amino-tioalcoholes ; -azidas; - 1, 2-aminoalcoholes; -el grupo amino ~N¾ o derivados de los grupos amino que comprenden la unidad estructural -NH- tales como grupos aminoalquilo, grupos aminoarilo, grupos aminoaralquilo, o grupos alcarilamino; -el grupo hidroxilamino -0- ¾, o derivados del grupo hidroxilamino que comprende la unidad estructural -O-NH- , tales como grupos hidroxilalquilamino, grupos hidroxilarilamino, grupos hidroxil-aralquilamino o grupos hidroxalalcarilamino; -grupos alcoxiamino, grupos ariloxiamino, grupos aralquiloxiamino, o grupos alcariloxiamino, que comprende cada uno la unidad estructural -NH-0-; -residuos que presentan el grupo carbonilo, -Q-C (=G) -M, donde G es O o S, y M es, por ejemplo, -OH O -SH; un grupo alcoxi, un grupo ariloxi, un grupo aralquiloxi, o un grupo alcariloxi; un grupo alquiltio, un grupo ariltio, un grupo aralquiltio, o un grupo alcariltio; un grupo alquilcarboniloxi , un grupo arilcarboniloxi, un grupo aralquilcarboniloxi, un grupo alcarilcarboniloxi ; esteres activados, tales como esteres o hidroxilaminas que presentan una estructura de imida, tal como N-hidroxisuccinimida o que presentan una unidad estructural 0-N, donde N es parte de un heteroaril compuesto o en ausencia de G = O y Q, tales como ariloxi compuestos con un residuo arilo sustituido, tales como pentafluorofenilo, paranitrofenilo o triclorofenilo; donde Q está ausente o NH o un heteroátomo tal como S o O; ~-NH-NH2, o -NH-NH-; --N02; -el grupo nitrilo; -grupos carbonilo, tales como el grupo aldehido o el grupo ceto; - el grupo carboxi ; -el grupo -N=C=0 o el grupo -N=C=S; -grupos haluro de vinilo, tales como yoduro de vinilo o el grupo bromuro de vinilo o triflato; --C=C-H; -- (C=NH2C1) -Oalquilo -grupos - (C=0) -CH2-Hal donde Hal es Cl, Br o I; --CH=CH-S02-; -un grupo disulfuro que comprende la estructura -S-S-; y donde 3 es un grupo funcional capaz de formar una unión química con F2 y se selecciona preferentemente del grupo antes mencionado, comprendiendo F2 preferentemente el resto -NH-, comprendiendo de mayor preferencia un grupo amino, comprendiendo F3 preferentemente el resto (C=G)-, de mayor preferencia -(C=0)-, de mayor preferencia el resto -(C=G)-G-, de mayor preferencia aún -(C=0)- G-, y de preferencia especial (C=0)-0, siendo D de preferencia particular una unión amida.
67. Un conjugado caracterizado porque comprende una proteína y un polímero o un derivado del mismo, donde el polímero es un hidroxialquil almidón (HAS) y la proteína es un factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) , que presenta una estructura conforme la fórmula HAS" C — N — Proteina' H2 H donde el átomo de carbono del resto -CH2-N2- deriva de un grupo aldehido que fue introducido en el polímero mediante una reacción de oxidación con apertura de anillo, y donde el átomo de nitrógeno deriva de un grupo amino de la proteina.
68. ün conjugado caracterizado porque comprende una proteina y un polímero o un derivado del mismo, donde el polímero es un hidroxialquil almidón (HAS) y la proteína es un factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) , que presenta una estructura conforme la fórmula Proteína' donde ¾, R2 y R3 son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, un grupo hidroxiarilo, un grupo hidroxiaralquilo o un grupo hidroxialcarilo que presenta de 2 a 10 átomos de carbono, preferentemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, de mayor preferencia hidrógeno o un grupo hidroxietilo, y donde L es un residuo hidrocarbonado, opcionalmente sustituido, lineal, ramificado y/o cíclico, que opcionalmente comprende un heteroátomo, que comprende un resto alquilo, arilo, aralquilo, heteroalquilo y/o heteroaralquilo, presentando dicho residuo de 2 a 60, preferentemente de 2 a 40, de mayor preferencia de 2 a 20, de mayor preferencia de 2 a 10, átomos de carbono, y donde el átomo de azufre deriva de un residuo de cisteina o un grupo disulfuro de la proteina.
69. El conjugado de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque -L- es - [ (C aRb) mG] n [CRcRd] 0- donde Ra, ^, RC( Rd son independientemente hidrógeno, alquilo, arilo, preferentemente hidrógeno, donde G se selecciona del grupo que consiste en 0 y S , preferentemente O, y donde mi, 2, 3 o 4, de máxima preferencia 2, donde los residuos Ra y b pueden ser iguales o diferentes en los m grupos (CRaRb) ; ni a 20, preferentemente 1 a 10, de máxima preferencia 1, 2, 3, o 4; ol a 20, preferentemente 1 a 10, de mayor preferencia 1, 2, 3, 4, 5, de mayor preferencia 1 o 2, de máxima preferencia 1, donde los residuos Rc y d pueden ser iguales o diferentes en los o grupos (CRcRa) ; o donde ? ? , y o 2 a 20 , preferentemente 2 a 10 , de mayor preferencia 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 u 8 , donde los residuos Rc y Rd pueden ser iguales o diferentes en los o grupos CRcRd-
70 . Un conj ugado caracterizado porque comprende una proteina y un polímero o un derivado del mismo , donde el polímero es un hidroxialquil almidón (HAS ) y la proteína es un factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) , que presenta una estructura conforme la fórmula Proteína' donde Ri, R= y R3 son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo , un grupo hidroxiarilo , un grupo hidroxiaralquilo, o un grupo hidroxialcarilo que presenta de 2 a 10 átomos de carbono, preferentemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, de mayor preferencia hidrógeno o un grupo hidroxietilo, y donde L es un residuo hidrocarbonado, opcionalmente sustituido, lineal, ramificado y/o cíclico, que opcionalmente comprende un heteroátomo, que comprende un resto alquilo, arilo, aralquilo, heteroalquilo y/o heteroaralquilo, presentando dicho residuo de 2 a 60, preferentemente de 2 a 40, de mayor preferencia de 2 a 20, de mayor preferencia de 2 a 10 , átomos de carbono , y donde el átomo de azufre deriva de un residuo de cisteina o un grupo disulfuro de la proteína.
71. El conjugado de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque -L- es - [ (CRaRb) mG] n [CRcRd] o- donde Ra, R^,, RCj Rd son independientemente hidrógeno, alquilo, arilo, preferentemente hidrógeno, donde G se selecciona del grupo que consiste en O y S, preferentemente O, y donde mi, 2, 3 o 4, de máxima preferencia 2, donde los residuos ¾y¾ pueden ser iguales o diferentes en los m grupos C ¾ ¾; ni a 20, preferentemente 1 a 10, de máxima preferencia 1, 2, 3, o 4; ol a 20, preferentemente 1 a 10, de mayor preferencia 1, 2, 3, 4, 5, de mayor preferencia 1 o 2, de máxima preferencia 1, donde los residuos Re y a pueden ser iguales o diferentes en los o grupos CRcRa; o donde nO, y o2 a 20, preferentemente 2 a 10, de mayor preferencia 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, donde los residuos Re y Ra pueden ser iguales o diferentes en los o grupos C o a.
72. El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 54 a 71, caracterizado porque el hidroxialquil almidón es hidroxietil almidón.
73. El conjugado de conformidad con la reivindicación 72 caracterizado porque el hidroxietil almidón presenta un peso molecular de 2 a 200 kD, preferentemente de 4 a 130 kD, de mayor preferencia de 4 a 70 kD.
74. Un conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 52 a 73 , caracterizado porque se usa para el tratamiento del cuerpo humano o animal .
75. Una composición farmacéutica caracterizada porgue comprende, en una cantidad terapéuticamente efectiva, un conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 52 a 73 .
76. Una composición farmacéutica reivindicada en la reivindicación 75, caracterizada porque comprende además al menos un diluyente, un adyuvante o un vehículo aceptables para uso farmacéutico.
77. Uso de un conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 52 a 73 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno de una f nción hematopoyética o inmune reducidas .
78 . El uso de conformidad con la reivindicación 77 , donde el trastorno es el resultado de la quimioterapia , la terapia radiante , una enfermedad infecciosa, neutropenia crónica grave o leucemia .