MXPA06000469A

MXPA06000469A - Particulas funcionales similares al virus de la influenza (vlps).

Info

Publication number: MXPA06000469A
Application number: MXPA06000469A
Authority: MX
Inventors: Peter M Pushko
Original assignee: Novavax Inc
Priority date: 2003-07-11
Filing date: 2004-07-09
Publication date: 2006-08-23
Also published as: PL1644037T3; US8592197B2; SG165378A1; JP2007529997A; WO2005020889A3; KR101153929B1; US9144607B2; HK1091118A1; EP1644037A2; EP2343084B1; CN107513102A; AU2004268510A1; EP1644037B1; US9956280B2; JP2016164195A; US20130177587A1; US9474799B2; ATE538810T1; BRPI0412519A; WO2005020889A2

Abstract

Se describen las proteinas recombinantes del virus de la influenza, que incluyen capsomeros de influenza, particulas subvirales, particulas similares al virus (VLP), complejos de VLP, y/o cualesquiera porciones de las mismas, que son proporcionadas como una vacuna para el virus de la influenza. La invencion esta basada en la combinacion de dos tecnologias de vacuna: (1) la tecnologia de vacuna recombinante intrinsecamente segura, y (2) las macromoleculas de proteina auto-ensambladas, altamente inmunogenicas, incrustadas en membranas plasmaticas, y comprendidas de copias multiples de proteinas estructurales del virus de la influenza, que muestran epitopos neutralizadores en conformaciones nativas. Mas especificamente, esta invencion se refiere al diseno y produccion de particulas similares al virus de la influenza, recombinantes, homotipicas y heterotipicas, funcionales (VLPs) comprendidas de las proteinas estructurales recombinantes del virus de la influenza humana tipo A/Sydney/5/94 (H3N2) y/o el virus de la influenza aviar tipo A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) en celulas de insecto infectadas con el baculovirus, y su aplicacion como una vacuna en la prevencion de infecciones de influenza, y como un reactivo de laboratorio para estudios estructurales de virus y diagnosticos clinicos.

Description

PARTÍCULAS FUNCIONALES SIMILARES AL VIRUS DE LA INFLUENZA (VLPS) ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El virus de la influenza es un miembro de la " familia Orthomyxoviridae (para una revisión, ver Murphy y Webster, 1996) . Existen tres tipos de virus de la influenza designados A, B y C._ El virión de la influenza contiene un genoma' de ARN en sentido . negativo, segmentado. El virión de la influenza incluye las siguientes proteínas: hemaglutinina (HA), neuraminidasa (NA) , matriz (Ml) proteína de canales de iones de protones (M2), nucleoproteina (NP) , proteína básica de polimerasa 1 (PB1) , proteína básica de polimerasa 2 (PB2) , proteína acida de polimerasa (PA) , y proteína no estructural 2 (NS2) . La HA, NA, Ml y M2 están asociadas a la membrana, mientras que NP, PB1, PB2, PA y NS2 son proteínas asociadas a la nucleocápside. La NS1 es la única proteína no estructural no asociada con las partículas de los viriones, pero específica para las células infectadas con influenza. La proteína Ml es la proteína más abundante en las partículas de influenza. Las proteínas HA y NA son glucoproteínas de envoltura, responsables de la adhesión del virus y la penetración de las partículas virales dentro de la célula, y las fuentes de los epitopos inmunodominantes mayores para la neutralización del virus, y para la inmunidad protectora. Las REF:169403 proteínas HA y NA son consideradas los componentes más importantes para las vacunas profilácticas contra la influenza . La infección por el virus de la influenza es iniciada por la adhesión de la proteína HA de la superficie del virión, a un receptor celular que contiene ácido siálico (glucoproteínas y glucolípidos) . La proteína NA es mediadora del procesamiento del receptor de ácido siálico, y la penetración del virus dentro de la célula depende de la endocitosis mediada por el receptor dependiente de HA. En los confines ácidos de los endosomas internalizados que contienen un virión de la influenza, la proteína HA2 sufre cambios conformacionales que conducen a la fusión de las membranas virales y celulares, y el recubrimiento del virus y la liberación mediada por M2 de las proteínas Ml provenientes de las ribonucleoproteínas asociadas a la nucleocápside (RNPs por sus siglas en ingles) , que migran hacia el núcleo celular para la síntesis del ARN viral. Los anticuerpos para las proteínas HA previenen la infección del virus al neutralizar la infectividad del virus, mientras que los anticuerpos para las proteínas NA son mediadores de su efecto sobre los pasos tempranos de la replicación viral. Las vacunas para el virus de la influenza A y B inactivadas, están autorizadas actualmente para la administración parenteral. Estas vacunas trivalentes son producidas en la cavidad alantoica de huevos de pollo embrionados , purificadas mediante centrifugación zonal gradual o cromatografía en columna, inactivadas con formalina o ß-propiolactona, y formuladas como una mezcla de las dos cepas del tipo A y del tipo B de los virus de la influenza en circulación, entre la población humana para un año dado. Las vacunas para la influenza comercialmente disponibles son del virus completo (WV por sus siglas en ingles) o de subvirión (SV por sus siglas en ingles; antígeno superficial dividido o purificado) . La vacuna WV contiene viviones inactivados, intactos . Las vacunas SV tratadas con solventes tales como fosfato de tri-n-butilo (Flu-Shield, Wyeth-Lederle) contienen casi todas las proteínas estructurales virales y algunas de las envolturas virales. Las vacunas SV solubilizadas con Tritón X-100 (Fluzone, Connaught; Fluvirin, Evans) contienen agregados de monómeros de HA, NA y NP principalmente, aunque están presentes cantidades residuales de otras proteínas estructurales virales . Una vacuna para el virus de la influenza atenuada, viva, adaptada al frío, potencial (FluMist, Medlmmune) fue aprobada para la comercialización recientemente por la Administración de Fármacos y Alimentos de los Estados Unidos (FDA por sus siglas en ingles) para el uso comercial como una vacuna intranasalmente administrada para la inmunización activa y la prevención de la enfermedad provocada por los virus de la influenza A y B, en niños y adolescentes saludables, de 5 a 17 años de edad y en adultos saludables de 18 a 49 años de edad. Han sido desarrollados varios productos recombinantes como candidatos para la vacuna de la influenza recombinante. Estos procedimientos han enfocado la expresión, producción y purificación de las proteínas HA y NA tipo A de la influenza, incluyendo la expresión de estas proteínas utilizando células de insecto infectadas con baculovirus (Crawford et al., 1999; Johansson, 1999; Treanor et al., 1996), vectores virales (Pushko et al., 1997; Berglund et al., 1999) y construcciones de vacunas de ADN (Olsen et al., 1997) . Crawford et al. (1999) demostró que la HA de la influenza expresada en células de insecto infectadas con baculovirus, es capaz de prevenir la enfermedad letal de la influenza provocada por los subtipos de influenza aviar H5 y H7. Al mismo tiempo, otro grupo más demostró que las proteínas HA y NA de la influenza, expresadas en baculovirus, inducen respuestas inmunes en animales, superiores a aquellas inducidas por una vacuna convencional (Johansson et al . , 1999) . La inmunogenicidad y la eficacia de la hemaglutinina expresada por baculovirus, del virus de la influenza equina, fue comparada a una vacuna candidata de ADN homólogo (Olsen et al., 1997) . Tomados conjuntamente, los datos demostraron que un alto grado de protección contra el reto por el virus de la influenza puede ser inducido con proteínas HA o NA recombinantes, utilizando diversos procedimientos experimentales y en diferentes modelos animales . Lakey et al. (1996) mostraron que una vacuna de HA de influenza derivada del baculovirus fue bien tolerada e inmunogénica en voluntarios humanos en un estudio de seguridad a escala de dosis de Fase I. No obstante, los resultados provenientes de los estudios en Fase II conducidos en diversos sitios clínicos en voluntarios humanos vacunados con las diversas dosis de vacunas de influenza, comprendidas de las proteínas HA y/o NA, indicó que las vacunas de la proteína subunitaria recombinante no promovieron inmunidad protectora [G. Smith, Protein Sciences; M. Perdue, USDA, Personal Communications] . Estos, resultados indicaron que los epitopos conformacionales mostrados sobre la superficie de los peplómeros de HA y NA de los viriones infecciosos, eran importantes en la producción de anticuerpos neutralizadores y la inmunidad protectora. Respecto a la inclusión de otras proteínas de la influenza en candidatos de vacuna de la influenza, recombinantes, ha sido llevado a cabo un número de estudios, incluyendo los experimentos que involucran la nucleoproteína de la influenza, NP, sola o en combinación con la proteína Ml (Ulmer et al., 1993; Ulmer et al., 1998; Zhou et al., 1995; Tsui et al., 1998). Estos candidatos de vacuna, los cuales estuvieron compuestos de proteínas de virión internas cuasi-invariantes, promovieron una inmunidad de amplio espectro que fue principalmente celular (células T de memoria CD4+ y CD8+) . Estos experimentos involucraron el uso del ADN o vectores genéticos virales . Se necesitaron cantidades relativamente grandes de ADN inyectado, ya que los resultados provenientes de los experimentos con más bajas dosis de ADN indicaron poca o ninguna protección (Chen et al., 1998). Por lo tanto, la investigación preclínica y clínica adicional puede ser requerida para evaluar si tales procedimientos basados en ADN que involucran NP y Ml son seguros, efectivos y persistentes. Recientemente, en un intento para desarrollar vacunas más efectivas para la influenza, fueron utilizadas proteínas particuladas como portadores de los epitopos de la proteína M2 de la influenza. El racionamiento para el desarrollo de una vacuna basada en M2 fue que en estudios con animales , la inmunidad protectora contra la influenza fue promovida por las proteínas M2 (Slepushkin et al., 1995), Neirynck et al. (1999) utilizaron un dominio transmembranal M2 de 23 aminoácidos de longitud, como un socio de fusión amino-terminal, con el antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B (HBcAg) para exponer el o los epitopos de M2 sobre la superficie de las partículas similares a la cápside de HBcAg. No obstante, a pesar del hecho de que la proteína M2 de longitud completa y M2-HBcAg VLP indujeron anticuerpos detectables y protección en ratones, no fue probable que las vacunas futuras para la influenza pudieran estar basadas exclusivamente en la proteína M2, ya que la proteína M2 estuvo presente a un bajo número de copias por virión, fue débilmente antigénica, fue incapaz de promover anticuerpos que se enlazaran a los viriones libres de la influenza, y fue incapaz de bloquear la adhesión del virus a los receptores celulares (por ejemplo, neutralización del virus) . Ya que la investigación previa ha mostrado que las glucoproteínas superficiales de la influenza, HA y NA, son los principales objetivos para la promoción de la inmunidad protectora contra el virus de la influenza, y que Ml proporciona un objetivo conservado para la inmunidad celular hacia la influenza, un nuevo candidato de vacuna puede incluir estos antígenos virales como una partícula macromolecular de la proteína, tales como las partículas similares al virus (VLPs por sus siglas en ingles) . Además, la partícula con estos antígenos de la influenza puede mostrar epitopos conformacionales que promueven los anticuerpos neutralizadores para múltiples cepas de los virus de la influenza. Diversos estudios han demostrado que las proteínas recombinantes de la influenza podrían auto-ensamblarse en VLPs en el cultivo celular utilizando plásmidos de expresión en mamífero o vectores baculovirales (Gómez-Puertas et al., 1999; Neuman et al., 2000; Lathan y Galarza, 2001). Gómez-Puertas et al. (1999) demostraron que la formación eficiente de VLP de la influenza depende de los niveles de expresión de las proteínas virales. Neumann et al. (2000) establecieron ún sistema basado en plásmido de expresión en mamífero, para la generación de partículas infecciosas similares al virus de la influenza, completamente a partir de ADNcs clonados. Latham y Galarza (2001) reportaron la formación de VLPs de la influenza en células de insecto infectadas con baculovirus recombinante que co-expresa los genes de HA, NA, Ml y M2. Estos estudios demostraron que las proteínas del virión de la influenza pueden auto-ensamblarse después de la co-expresión en células eucarióticas . BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN De acuerdo a la presente invención, se proporcionan las estructuras de proteínas macromoleculares que comprenden las secuencias de codificación H9N2 del virus de la influenza tipo A, para HA (GenBank Acceso No. AJ404626) , NA (GenBank Acceso No. AJ404629) , Ml (GenBank Acceso No. AJ278646) , M2 (GenBank Acceso No. AF255363) , y las proteínas NP (GenBank Acceso No. AF255742) y que comprenden las secuencias de codificación H3N2 del virus de la influenza humana tipo A para HA (GenBank Acceso No. AJ311466) y para NA (GenBank Acceso No. AJ291403) . El ARN genómico que codifica para estos genes virales de la influenza puede ser aislado a partir de los aislados del virus de la influenza o a partir de tejidos de organismos infectados con la influenza. Cada una de estas secuencias de codificación provenientes de las mismas o diferentes cepas o tipos del virus de la influenza, son clonados en dirección 3 ' de los promotores transcripcionales dentro de los vectores de expresión, y son expresadas en células . De este modo, la invención proporciona una estructura de proteína macromolecular que contiene (a) una primera proteína Ml del virus de , la influenza y (b) una proteína estructural adicional, que puede incluir una segunda o más proteínas Ml del virus de la influenza; una primera, segunda o más proteínas HA del virus de la influenza; una primera, segunda o más proteínas NA del virus de la influenza, y primera, segunda o más proteínas M2 del virus de la influenza. Si la proteína estructura adicional no es proveniente de una segunda o más proteínas Ml del virus de la influenza, entonces ambas o todos los miembros del grupo, por ejemplo, la primera y segunda proteínas del virus M2 de la influenza son incluidas. Como tal, se proporciona una estructura de proteína de influenza funcional , que incluye una partícula subviral, VLP, o estructura de capsómero, o una porción de la misma, una vacuna, una vacuna multivalente, y mezclas de las mismas que consisten esencialmente de proteínas estructurales del virus de la influenza, producidas mediante el método de la invención. En una modalidad particularmente preferida, la estructura de la proteína macromolecular de la influenza incluye las proteínas HA, NA y Ml del virus de la influenza, que son los productos de expresión de los genes del virus de la influenza, clonados como fragmentos sintéticos provenientes de un virus de tipo silvestre. La estructura de proteína macromolecular puede también incluir, una proteína estructural adicional, por ejemplo, una nucleoproteína . (NP) , proteínas membranales provenientes de especies diferentes de los virus de la influenza, y una proteína membranal proveniente de una fuente no influenza, que son derivadas de orígenes aviar o de mamífero, y diferentes subtipos de virus de la influenza, incluyendo los virus de la influenza -subtipo A y B. La invención puede incluir una . - estructura . de proteína macromolecular quimérica, la cual incluye una porción de al menos una proteína que tiene una porción no producida por el virus de la influenza. - • La prevención de la influenza puede ser lograda mediante la provisión de .. una estructura de proteína macromolecular que puede ser auto-ensamblada en una célula hospedera a partir de una construcción recombinante. La estructura de proteína recombinante de la invención tiene la habilidad para auto-ensamblarse dentro de las partículas homotípicas y heterotípicas similares a virus (VLPs) , que muestran epitopos conformacionales sobre las proteínas HA y NA, que promueven anticuerpos neutralizadores, que son protectores,. La . composición puede ser una composición de vacuna, la cual puede contener un portador o diluyente y/o un adyuvante. Las VLPs de la influenza, funcionales, promueven anticuerpos neutralizadores contra una o más cepas o tipos de virus de la influenza, dependiendo de si las VLPs de la influenza funcionales contienen las proteínas HA y/o NA provenientes de una o más cepas o tipos virales. La vacuna puede incluir las proteínas del virus de la influenza que son las proteínas del virus de la influenza de tipo silvestre. Preferentemente, las proteínas estructurales que contienen la VLP de la influenza, o una porción de la misma, pueden ser derivadas de las diversas cepas de los virus de la influenza de tipo silvestre. Las vacunas de la influenza pueden ser administradas a humanos o animales para promover una inmunidad protectora contra una o más cepas o tipos del virus de la influenza. Las estructuras de proteína macromolecular de la invención pueden promover la actividad de hemaglutinina y/o actividad de neuraminidasa . La invención proporciona un método para producir una VLP derivada de la influenza al construir una construcción recombinante que codifica para los genes estructurales de la influenza, incluyendo Ml, HA, y al menos una proteína estructural derivada del virus de la influenza. Una construcción recombinante es utilizada para transfectar, infectar, o transformar una célula hospedera adecuada con el baculovirus recombinante. La célula hospedera es cultivada bajo condiciones que permiten la expresión de Ml, HA y al menos una proteína estructural derivada del virus de la influenza y la VLP es formada en la célula hospedera. Los medios celulares infectados que contienen una VLP de la influenza funcional son cosechados, y la VLP es purificada. La invención también caracteriza un paso adicional de co-transfección, co-infección o co-transformación de la célula hospedera con una segunda construcción recombinante que codifica para una segunda proteína de la influenza, con lo cual se incorpora la segunda proteína de la influenza dentro de la VLP. Tales proteínas estructurales pueden ser derivadas del virus de la influenza, incluyendo NA, M2 y NP, y al menos una proteína estructural es derivada de orígenes aviar o de mamífero. La proteína estructural puede ser un subtipo A y B de los virus de la influenza. De acuerdo a la invención, la célula hospedera puede ser una célula eucariótica. Además, la VLP puede ser una VLP quimérica. La invención también caracteriza un método para formular una sustancia farmacéutica que contiene una VLP de la influenza, al introducir construcciones recombinantes que codifican para los genes virales de la influenza, dentro de las células del hospedero, y que permiten el auto-ensamblaje de las proteínas virales de la influenza, recombinantes , dentro de una VLP homotípica o heterotípica funcional, en células. La VLP de la influenza es aislada y purificada, y una sustancia medicamentosa es formulada conteniendo la VLP de la influenza. La sustancia medicamentosa puede incluir además un adyuvante. Además, la invención proporciona un método para formular un producto medicinal, al mezclar tal sustancia medicinal que contiene una VLP de la influenza, con una vesícula lipídica, por ejemplo, una vesícula lipídica no iónica. De este modo, las VLPs homotípicas o heterotípicas funcionales pueden brotar como partículas envueltas a partir de las células infectadas. Las VLPs de la influenza, brotadas, pueden ser aisladas y purificadas mediante centrifugación y cromatografía en columna, como sustancias medicinales y formuladas solas o con adyuvantes tales como Novasomes®, un producto de Novavax, Inc., como productos medicinales tales como vacunas. Novasomes®, que proporciona un efecto inmunológico mejorado, son además descritas en la Patente de los Estados Unidos No. 4,911,928, la cual es incorporada por referencia en la presente . La invención proporciona un método para detectar la inmunidad humoral para la infección por el virus de la influenza, en un vertebrado, mediante la provisión de un reactivo de prueba que incluye una cantidad efectiva de detección del anticuerpo, de la proteína del virus de la influenza, que tiene al menos un epitopo conformacional de una estructura macromolecular del virus de la influenza. El reactivo de prueba es puesto en contacto con una muestra de fluido corporal proveniente de un vertebrado para ser examinado para la infección por el virus de la influenza. Las partículas específicas del virus de la influenza, contenidas en la muestra, se dejan enlazar al epitopo conformacional de una estructura macromolecular del virus de la influenza, para formar complejos antígeno-anticuerpo. Los complejos son separados de los complejos no enlazados y puestos en contacto con un agente de enlace a inmunoglobulina detectablemente ' marcada. La cantidad del agente de enlace a la inmunoglobulina detectablemente marcada, que se enlaza a los complejos, es determinada. El virus de la influenza puede ser detectado én un espécimen proveniente de un animal humano, sospechoso de estar infectado con el virus, al proporcionar anticuerpos I'., los cuales tienen un marcador que produce una señal detectable, o están enlazado a un reactivo detectablemente marcado, que tiene especificidad para al menos un epitopo conformacional de la partícula del virus de la influenza. El espécimen es puesto en contacto con los anticuerpos, y los anticuerpos se dejan enlazar al virus de la influenza. La presencia del virus de la influencia en el espécimen es determinada por medio del marcador detectable.

La invención proporciona los métodos para el tratamiento, prevención y generación de una respuesta inmune protectora, mediante la administración a un vertebrado, de una cantidad efectiva de la composición de la invención. Alternativamente, la sustancia medicinal de VLP de la influenza puede ser formulada como reactivos de laboratorio, utilizados para estudios de la estructura del virus de la influenza, y clínicos de diagnóstico. La invención también proporciona un equipo para tratar el virus de la influenza, al administrar una cantidad efectiva de una composición de la invención y las instrucciones para el uso. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 describe las secuencias nucleotídicas del gen de la neuraminidasa (?A) del virus de la -influenza aviar A/Hong Kong/1073/99 (H9?2) (SEQ ID ?O: 1)-. La Figura 2 describe las secuencias nucleotídicas del gen de la hemaglutinina (HA) del virus de la influenza aviar A/Hong Kong/1073/99 (H9?2) (SEQ ID NO : 2) . La Figura 3 describe las secuencias nucleotídicas del gen de la proteína de matriz (Ml) del virus de la influenza aviar A/Hong Kong/1073/99 (H9?2) (SEQ ID ?O: 3) . Las Figuras 4A-4B describen los vectores de transferencia para la construcción de baculovírus recombinantes para la expresión de las proteínas HA, ?A y Ml de la influenza aviar A/Hong Kong/1073/99 (H9?2) . La Figura 4A describe un vector de transferencia para la expresión de los genes individuales, y la Figura 4B describe el vector de transferencia para la multi-expresión de los genes. Las Figuras 5A-5B describen la expresión de las proteínas HA, NA y Ml del virus de la influenza aviar A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) en células Sf-9S. La Figura 6 describe la purificación de las VLPs del virus de la influenza aviar A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) por el método de gradiente de densidad de sucrosa. Las Figuras 7A-7C describen la detección de la proteína del virus de la influenza mediante cromatografía de filtración en gel. Los anticuerpos utilizados en los análisis de Western blot son como sigue: (Fig. 7A) anticuerpo de conejo anti-H9N2; (Fig. 7B) anticuerpo monoclonal murino anti-MI; y (Fig. 7C) anticuerpo murino anti-BACgp64. La Figura 8 describe la detección de las proteínas del virus de la influenza aviar A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) que incluyen las partículas subvirales, VLP, y complejos de VLP, mediante microscopía electrónica. La Figura 9 describe la actividad de hemaglutinación de las VLPs purificadas del virus de la influenza aviar A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) . La Figura 10 describe la actividad de neuraminidasa de las VLPs purificadas del virus de la influenza aviar A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) .

La Figura 11 describe el esquema de inmunización y sangrado para el estudio de la inmunogenicidad de la influenza recombinante con las VLPs purificadas del virus de la influenza aviar A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) en ratones. Las Figuras 12A-12B describen los resultados de un estudio de inmunogenicidad en ratones inmunizados con las VLPs de influenza recombinante H9N2. La Figura 12A describe los sueros provenientes de ratones BALB/c inmunizados con las VLPs recombinantes comprendidas de las proteínas HA, NA y Ml provenientes del virus de la influenza aviar tipo A/H9N2/Hong Kong/1073/99. La Figura 12B describe los sueros provenientes de conejos blancos New Zealand inmunizados con el virus de la influenza aviar inactivado tipo A H9N2 se hicieron reaccionar con transferencias de Western que contenían el virus de la influenza inactivado tipo A H9N2 (bandas 1 y 3) o el virus de la influenza aviar tipo A H9N2 adaptado al frío (bandas 2 y 4) . " DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como se utiliza en la presente, el término "baculovirus", también conocido como baculoviral, se refiere a la familia de virus de ADN envueltos de artrópodos, miembros de los cuales pueden ser utilizados como vectores de expresión para producir proteínas recombinantes en cultivos de células de insecto. El virión contiene una o más nucleocápsides en forma de bastón que contienen una molécula de ADN de doble hebra circular, superenrollado (Mr 54 x 106-154 x 106) . El virus utilizado como un vector es en general el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (NVP) . La expresión de los genes introducidos está bajo el control del promotor fuerte que normalmente ' regula la expresión de la proteína de polihedron de la inclusión nuclear grande en la cual los virus están incrustados en las células infectadas . Como se utiliza en la presente, el término "derivado de" se refiere al origen o la fuente, y puede incluir las moléculas de origen natural, recombinantes , no purificadas o purificadas . Las proteínas y moléculas de la presente invención pueden ser derivadas de las moléculas de la influenza o no de influenza. Como se utiliza en la presente el término "primera" proteína del virus de la influenza, por ejemplo, una primera proteína Ml del virus de la influenza, se refiere a una. proteína, tal como Ml, HA, ?A y M2 , que es derivada de una cepa particular del virus de la influenza. La cepa del tipo del primer virus de la influenza, difiere de la cepa o tipo de la segunda proteína del virus de la influenza. De este modo, la "segunda" proteína del virus de la influenza, por ejemplo, la segunda proteína Ml del virus de la influenza, se refiere a una proteína, tal como Ml, HA, ?A y M2 , que es derivada de una segunda cepa del virus de la influenza, que es una cepa o tipo diferente a la primera proteína del virus de la influenza.

Como se utiliza en la presente, el término "actividad de hemaglutinina" se refiere a la habilidad de las proteínas que contienen HA, las VLPs, o porciones de las mismas, para enlazarse y aglutinar las células sanguíneas rojas (eritrocitos) . Como se utiliza en la presente, el término "actividad de neuraminidasa" se refiere a la actividad enzimática de las proteínas que contienen NA, VLPs, o porciones de las mismas, para escindir los residuos de ácido siálico a partir de sustratos que incluyen proteínas tales como la fetuina. Como se utiliza en la presente, el término "heterotípico" se refiere a uno o más tipos diferentes o cepas de virus . Como se utiliza en la presente, el término "homotípico" se refiere a un tipo o cepa del virus . Como se utiliza en la presente, el término "estructura de proteína macromolecular" se refiere a la construcción o arreglo de una o más proteínas . Como se utiliza en la presente, el término vacuna "multivalente" se refiere a una vacuna contra múltiples tipos o cepas del virus de la influenza. Como se utiliza en la presente, el término "no influenza" se refiere a una proteína o molécula que no es derivada del virus de la influenza.

Como se utiliza en la presente, el término "vacuna" se refiere a una preparación de patógenos muertos o debilitados, o de determinantes antigénicos derivados, que se utiliza para inducir la formación de anticuerpos o la inmunidad contra el patógeno. Una vacuna dada para proporcionar inmunidad a la enfermedad, por ejemplo, la influenza, es provocada por virus de la influenza. La presente invención proporciona las composiciones de vacuna que son inmunogénica y proporcionan protección. La influenza sigue siendo un problema de salud pública persistente a pesar de la disponibilidad de vacunas específicas de virus inactivado, que son 60 a 80% .efectivas bajo condiciones óptimas. Cuando estas vacunas son efectivas, -la enfermedad es usualmente evitada al prevenir la infección viral. La falla de la vacuna puede ocurrir como resultado--.de las diferencias antigénicas acumuladas (desplazamiento antigénico y cambio antigénico) . Por ejemplo, el virus • de la influenza aviar tipo A H9N2 co-circuló con el virus * -de '-'la influenza tipo A Sydney/97 H3N2 en cerdos, condujo, a la reclasificación genética y a la aparición de nuevas cepas del virus de la influenza, con potencial pandémico (Peiris et al., 2001) . En el caso de tal cambio antigénico, es improblable que las vacunas actuales pudieran proporcionar protección adecuada . Otra razón más para la escasez de programas de vacunación contra la influenza, es la persistencia relativamente corta de la inmunidad promovida por las vacunas actuales . La no adecuación adicional de las medidas de control para la influenza, refleja el uso restringido de las vacunas actuales, debido a que la reactogenicidad de la vacuna y los efectos colaterales en niños pequeños, ancianos y personas con alergias a los compuestos de los huevos, que son utilizados- en la fabricación de las vacunas del virus de la influenza, inactivada, comercialmente autorizadas. Adicionalmente, las vacunas inactivadas del virus de la influenza frecuentemente carecen o contienen epitopos conformacionales de HA y NA alterados, los cuales promueven anticuerpos neutralizadores y juegan un papel principal en la protección contra la enfermedad. De este modo, las vacunas virales inactivadas, así como algunas vacunas de proteínas subunitarias de la influenza, monoméricas, recombinantes, dan protección inadecuada. Por otra parte, las estructuras proteicas macromoleculares, tales como los capsómeros, partículas subvirales, y/o VLPs, incluyen copias múltiples de las proteínas nativas que muestran epitopos conformacionales, que son ventajosos para la inmunogenicidad óptima de la vacuna . La presente invención describe la clonación de los genes de HA, NA y Ml del virus de la influenza aviar A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) en un vector de expresión baculoviral simple, solo o en tándem, y la producción de los candidatos de vacuna de la influenza y los reactivos comprendidos de las proteínas estructurales de la influenza, recombinantes, que se auto-ensamblan en estructuras de proteína macromolecular homotípicas, funcionales e inmunogénicas , incluyendo las partículas de influenza subvirales y VLP de la influenza, en células de insecto infectadas con el baculovirus. La presente invención caracteriza además la clonación de los genes de HA, NA, Ml, M2 y NP del virus de la influenza aviar A/Sydney/5/94 (H3N2) , en vectores de expresión baculovirales y la producción de candidatos o reactivos de vacuna para la influenza, comprendidos de proteínas estructurales', de la influenza que se auto-ensamblan en estructuras proteicas macromoleculares, homotípicas, funcionales e inmunogénicas, incluyendo las partículas de la influenza subvirales y VLP de la influenza, en células de insecto infectadas con baculovirus . Además, lá presente invención describe la clonación del gen HA del virus de la influenza humana A/Sydney/5/94 (H3N2) y los genes HA, NA y Ml de la influenza aviar A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) en un vector de expresión baculoviral simple en tándem, y la producción de candidatos o reactivos de vacunas de la influenza, comprendidos de las proteínas estructurales de la influenza que se auto-ensamblan en estructuras proteicas macromoleculares heterotípicas, funcionales e inmunogénicas, incluyendo las partículas subvirales de la influenza, y VLP de la influenza, en células de insecto infectadas con el baculovirus . Esta invención es además ilustrada por los siguientes ejemplos, que no deben ser considerados como limitantes. Los contenidos de todas las referencias, patentes y solicitudes de patente publicadas citadas a todo lo largo de esta solicitud, así como las Figuras y el Listado de Secuencias, son incorporados por referencia en la presente. EJEMPLOS ESPECÍFICOS EJEMPLO 1 Materiales y Métodos Los genes HA, NA y Ml del virus de la influenza aviar A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) fueron expresados en células de Spodoptera frugiperda (línea celular Sf-9S; ATCC PTA-4047) utilizando el sistema de expresión de bácmido baculoviral. Los genes HA, NA y Ml fueron sintetizados mediante transcripción inversa y la reacción en cadena de polimerasa (PCR por sus siglas en ingles) utilizando el ARN aislado del virus de la influenza aviar A/Hong Kong/1073/99 (H9?2) (Figuras 1, 2 y 3) .

Para la transcripción inversa y la PCR, fueron utilizados los cebadores oligonucleotídicos específicos para los genes HA, ?A y Ml del virus de la influenza aviar A/Hong Kong/1073/99 (H9?2) (Tabla 1) . Las copias de AD?c de estos genes fueron clonadas inicialmente dentro del vector de subclonación bacteriano, pCR2.1T0P0. A partir de los tres plásmidos resultantes basados en pCR2.1T0P0, los genes HA, NA y Ml fueron insertados en dirección (3') de los promotores de polihedrina AcMNPV en el vector de transferencia baculoviral, pFastBacl (Invitrogen) , dando como resultado tres plásmidos basados en pFastBacl : pHA, pNA y pMl que expresan estos genes del virus de la influenza, respectivamente. Luego, fue construido un plásmido pHAM basado en pFstBacl simple, que codifica para los genes HA y Ml, cada uno en dirección (3') de un promotor de polihedrina separado (Figura 4) . La secuencia nucleotídica del gen NA con las regiones 5' y 3' adyacentes dentro del plásmido pNA, fue determinada (SEQ ID NO: 1) (Figura 1) . Al mismo tiempo, fueron también determinadas las secuencias nucleotídicas de los genes HA y Ml con las regiones adyacentes, utilizando el plásmido pHAM (SEQ ID NOs: 2 y 3) (Figuras 2 y 3) . Finalmente, un fragmento de ADN de restricción proveniente del plásmido pHAM que codifica para los casetes de expresión de HA y Ml, fue clonado dentro del plásmido pNA. Esto dio como resultado el plásmido pNAHAM que codifica para los genes HA, NA y Ml del virus de la influenza aviar A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) (Figura 4) . El plásmido pNAHAM fue utilizado para construir un baculovirus recombinante que contiene los genes NA, HA y Ml del virus de la influenza, integrado dentro del genoma, cada uno en dirección 3 ' de un promotor de polihedrina baculoviral separado. La infección de las células de insecto Sf-9S permisivas con el baculovirus recombinante resultante, dio como resultado la co-expresión de estos tres genes de la influenza en cada célula Sf-9S infectada con tal baculovirus recombinante . Resultados Los productos de expresión en células Sf-9S infectadas, fueron caracterizados a las 72 horas después de la infección (p.i.) mediante el análisis de SDS-PAGE, tinción con proteína de azul de Csomassie, y análisis de Western inmunoblot utilizando los anticuerpos específicos de HA y Ml (Figura 5) . El análisis de Western inmunoblot fue llevado a cabo utilizando el anticuerpo de conejo producido contra el virus de la influenza aviar A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) (CDC, Atlanta, Georgia, EUA) , o el anticuerpo monoclonal de ratón para la proteína Ml de la influenza (Serotec, Reino Unido)..

Las proteínas HA, NA y Ml de los pesos moleculares respectivos (64 kd, 60 kd, y 31 kd, respectivamente) fueron detectadas mediante análisis de Western inmunoblot. En comparación a la cantidad de la proteína HA detectada en este ensayo, la proteína NA mostró menor reactividad con el suero de conejo para el virus de la influenza aviar A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) . Las explicaciones para la cantidad de proteína NA detectable incluyeron menores niveles de expresión de la proteína NA a partir de las células Sf-9S infectadas con el baculovirus recombinante en comparación a la proteína HA, menor reactividad de la NA con el suero bajo condiciones de desnaturalización en el ensayo de Western inmunoblot (debido a la eliminación de importantes epitopos de NA durante la electroforesis en gel del enlace de la membrana) , menor avidez del anticuerpo para NA, . en comparación al anticuerpo para HA, o una menor abundancia de los anticuerpos para NA en el suero. El medio de cultivo proveniente de las células Sf-9S infectadas con el baculovirus recombinante que expresa las proteínas HA, NA y Ml del virus de la influenza aviar A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) , fue también sondeado para las proteínas de la influenza. Los sobrenadantes de cultivo clarificados fueron sometidos a ultracentrifugación a 27,000 rpm, con el fin de concentrar los complejos de proteína de alto peso molecular del virus de la influenza, tales como las partículas subvirales, VLP, complejos de VLP, y posiblemente, • otras partículas auto-ensambladas comprendidas de las proteínas HA, NA y Ml de la influenza. Los productos proteicos en forma de pellas fueron resuspendidos en solución salina amortiguada con fosfato (PBS, pH 7.2) y posteriormente purificados mediante ultracentrifugación sobre gradientes graduales de 20 a 60% de sucrosa. Las fracciones provenientes de los gradientes de sucrosa fueron recolectadas y analizadas mediante análisis de SDS-PAGE, análisis de Western inmunoblot, y microscopía electrónica. Las proteínas HA y Ml de la influenza de los pesos moleculares esperados, fueron detectadas en múltiples fracciones de gradiente de densidad de sucrosa mediante tinción con azul de Coomassie y análisis de Western inmunoblot (Figura 6) . Esto sugirió • que las proteínas virales de la influenza provenientes de las células Sf-9S infectadas, son agregadas en complejos de alto peso molecular, tales como los capsómeros, partículas subvirales, VLP, y/o complejos de VLP. Las proteínas NA, aunque inconsistentemente detectadas por la tinción con azul de Coomassie y análisis de Western inmunoblot , que fue probablemente debida a la incapacidad del ' suero anti-influenza de conejo para reconocer la proteína ?A desnaturalizada, en el ensayo de Western inmunoblot, fueron consistentemente detectados en el ensayo de la actividad de la enzima neuroaminidasa (Figura 10) . La presencia de las VLPs de alto peso molecular fue confirmada mediante cromatografía de filtración en gel . Una alícuota proveniente de las fracciones de gradiente de densidad de sucrosa, que contenían las proteínas virales de la influenza, fue cargada sobre una columna CL-4B Sepharose para el fraccionamiento basado en masa. La columna fue calibrada con azul de dextrano 2000, amarillo de dextrano, y vitamina B12 (Amersham Pharmacia) con pesos moleculares aparentes de 2,000,000; 20,000; y 1,357 daltones, respectivamente, y el volumen vacío de la columna fue determinado. Como se esperaba, las proteínas virales de la influenza de alto peso molecular, migraron en el volumen vacío de la columna, lo cual fue característico de las proteínas macromoleculares, tales como las partículas virales. Las fracciones fueron analizadas mediante análisis de Western inmunoblot para detectar las proteínas de la influenza y baculovirales . Por ejemplo, las proteínas Ml fueron detectadas en las fracciones de volumen vacío, que también contenían proteínas baculovirales (Figura 7) . La morfología de las VLPs de la influenza y las proteínas en fracciones de gradiente de sucrosa fue elucidada mediante microscopía electrónica. Para la microscopía electrónica de tinción negativa, las proteínas de la influenza provenientes de dos fracciones de gradiente de densidad de sucrosa, fueron fijadas con 2% de glutaraldehído PBS, pH 7.2. El examen microscópico electrónico de las muestras tejidas negativamente, reveló la presencia de complejos proteicos macromoleculares o VLPs, en ambas fracciones. Estas VLPs mostraron diferentes tamaños, incluyendo diámetros de aproximadamente 60 y 80 nm y morfologías (esferas) . Los complejos más grandes de ambos tipos de partículas fueron también detectados, así como las partículas en forma de varilla (Figura 8) . Todas las estructuras macromoleculares observadas tuvieron picos (peplómeros) sobre sus superficies, lo cual es característico del virus de la influenza. Ya que el tamaño y la apariencia de las partículas de 80 nm fue similar a las partículas del virus de la influenza tipo silvestre, estas estructuras probablemente representaban las VLPs, que tienen distintas similitudes a los viriones de la influenza de tipo silvestre, incluyendo la geometría similar de partícula, la arquitectura, el número de triangulación, la simetría y otras características. Las partículas más pequeñas de aproximadamente 60 nm pueden representar partículas subvirales que difieren de las VLPs morfológica y estructuralmente. Un fenómeno similar de las proteínas macromoleculares recombinantes de diferentes tamaños y morfologías, fue también reportado para otros virus. Por ejemplo, el antígeno del núcleo recombinante (HBcAg) del virus de la hepatitis B, forma partículas de diferentes tamaños, que tiene diferente arquitectura y número de triangulación T=4 y T=3 , respectivamente (Crowther et al., 1994). Para caracterizar las propiedades funcionales de las muestras de VLPs purificadas del virus de la influenza A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) , las muestras fueron probadas en un ensayo de hemaglutinación (Figura 9) y en un ensayo de enzima neuraminidasa (Figura 10) . Para el ensayo de hemaglutinación, diluciones a la mitad de las VLPs de influenza purificada, fueron mezcladas con 0.6% de glóbulos rojos de cobayo e incubadas a 4°C por 1 hora o 16 horas. El grado de hemaglutinación fue inspeccionado visualmente y la dilución más alta de las proteínas recombinantes de la influenza, capaces de aglutinar las células sanguíneas rojas, fue determinada y registrada (Figura 9) . Nuevamente, muchas fracciones provenientes del gradiente de densidad de sucrosa mostraron la actividad de hemaglutinación, sugiriendo que múltiples formas macromoleculares y monoméricas de las proteínas de la influenza estaban presentes . El título más alto detectado fue de 1.-4000. En un experimento control, el virus de la influenza A tipo silvestre/Sangdong demostró un título de 1:2000. El ensayo de hemaglutinación reveló que las VLPs recombinantes que consistían de las proteínas HA, NA y Ml del virus de la influenza aviar A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) fueron funcionalmente activas. Esto sugirió que el ensamblaje, la conformación y el plegamiento de las proteínas subunitarias de HA dentro de las VLPs fueron similares o idénticas a aquellas del virus de la influenza tipo silvestre. Además, fue realizado un ensayo de enzima de neuraminidasa sobre muestras de VLPs de H9N2 purificadas . La cantidad de actividad de neuraminidasa en las fracciones de gradiente de densidad de sucrosa, fue determinada utilizando la fetuina como un sustrato. En el ensayo de neuraminidasa, la neuraminidasa escindió el ácido siálico proveniente de las moléculas de sustrato, para liberar el ácido siálico para la medición. El reactivo de arsenito fue agregado para detener la actividad enzimática. La actividad de ácido siálico liberado fue determinada químicamente con ácido tiobarbitúrico que produce un color rosado que fue proporcional a la cantidad de ácido siálico libre. La cantidad de color (cromóforo) fue medida espectrofotométricamente a una longitud de onda de 549 nm. Utilizando este método, la actividad de neuraminidasa fue demostrada en las fracciones de gradiente de sucrosa que contenía VLPs de influenza (Figura 10) . Como se esperaba, fue observada la actividad en varias fracciones, con dos fracciones pico. Como un control positivo, se utilizó el virus de la influenza tipo silvestre. El virus de la influenza tipo silvestre mostró actividad de enzima de neuraminidasa comparable a aquella de las VLPs de influenza purificadas . Estos hallazgos corroboraron los resultados de HA con respecto a la conformación de la proteína, y sugirieron que las VLPs purificadas del virus de la influenza A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) fueron funcionalmente similares al virus de la influenza tipo silvestre. Los resultados de los análisis y ensayos anteriores indicaron que la expresión de las proteínas HA, NA y Ml del virus de la influenza A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) fue suficiente para el auto-ensamblaje y el transporte de las VLPs funcionales provenientes de células de insecto infectadas con el baculovirus . Ya que estas VLPs de influenza representaron las proteínas estructurales de la influenza auto-ensambladas, y demostraron propiedades funcionales y bioquímicas similares a aquellas del virus de la influenza de tipo silvestre, estas VLPs de la influenza conservaron conformaciones estructurales importantes incluyendo los epitopos superficiales necesarios para las vacunas de la influenza efectivas . Ejemplo 2: clonación por RT-PCR de los genes virales de la influenza aviar A/Hong Kong/1073/99 Un objetivo de la presente invención es proporcionar las secuencias de ácido nucleico sintéticas, capaces de dirigir la producción de proteínas recombinantes del virus de la influenza. Tales secuencias de ácido nucleico sintéticas fueron obtenidas mediante transcripción inversa y los métodos de reacción en cadena de polimerasa (PCR) utilizando el ARN genómico natural del virus de la influenza, aislado del virus. Para el propósito de esta solicitud, la secuencia de ácido nucleico se refiere a ARN, ADN, ADNc o cualquier variante sintética de los mismos que codifique para la proteína. El virus de la influenza aviar "A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) fue proporcionado por el Dr. K. Subbarao (Centros para el Control de Enfermedades, Atlanta, GA, EUA) . El ARN genómico viral fue aislado mediante el método de extracción de ARN de fenol ácido bajo las condiciones de contención de Bioseguridad de Nivel 3 (BSL3 por sus siglas en ingles) en CDC utilizando el reactivo Trizol LS (Invitrogen, Carisbad, CA EUA) . Las moléculas de ADNc de los ARN virales fueron obtenidas mediante transcripción inversa utilizando la transcriptasa inversa MuLV (Invitrogen) y PCR utilizando cebadores oligonucleotídicos para las proteínas HA, NA y Ml y la ADN-polimerasa Taq 1 (Invitrogen) (Tabla 1) . Tabla 1 Fracción#* Título 1 < 1:500 3 < 1:500 5 :500 7 :1000 9 :2000 11 :2000 12 -.4000 14 :500 16 < 1:500 PBS** < 1:500 A/Shansdong/9/93 *** 1:1000 * Fracciones de gradiente de sucrosa de 20-60% ** Control Negativo + * * C ontrol Po sitivo Los fragmentos de PCR fueron clonados dentro del vector de subclonación bacteriano, pCR2.1TOPO (Invitrogen), entre los sitios EcoRI que dieron como resultado los tres plásmidos recombinantes, que contenían los clones de AD?c de HA, ?A y Ml. Ejemplo 3: clonación por RT-PCR de los genes virales del virus de la influenza humana A/Sydney/5/94 (H3?2) El virus de la influenza A/Sydney/5/94 (H3?2) obtenido del Dr. M. Massare (?ovavax, Inc., Rockville, MD) . El ARN genómico viral fue aislado por el método de extracción con fenol ácido de ARN, bajo las condiciones de contención BSL2 en Novavax Inc., utilizando el reactivo Trizol LS (Invitrogen). Las moléculas de ADNc de los ARNs virales fueron obtenidas mediante transcripción inversa y PCR utilizando los cebadores oligonucleotídicos, específicos para las proteínas HA, NA, Ml, M2 y NP (Tabla 2) . Tabla 2 Virus Cepa Gen Ctbadßper-fa. ?<?_N2) s fcqffOT ?fc__a?_ai?_ma.jj«) [.uraminidasa (SA) Delantera -<??? C ?Qt tct?C ?????<x?CQctt???<¡ ßAGATAGAACC ATC AAT8 ATCAAAAOATA?TAA&r Inverso r^? xuccAc?trerACAA< ?«coo?ccrAT?t ?<H?CArcA ?tt^UTCTcax>•.• Matriz (MI) Delantero i'-A?? a__ __lATO lmt?so r-AAA IJESM rA-p^CIAßCpp-ATCCTBtUÍlA ATGAC-3" M2 Delantero Iiwerso i'-A?A I£S___.TrACTCCA-CT »'TOCT< CAAMTaAW- Nucleoproteípa (m Delantero 5VA ß4?-3E ?TG ccer_cceA?GGCACCAA?Cß.r Imersß Tipo n Hema?hitbúna (HA) Delantera 3'-? £| l-eATCAA^K?_ T AT_^p^ CrACrCA? ».• inverso i%A 2K-__2_-TAT?C_VC??-TO«OCA?<_A??C¡^^ TCrCOAOAJ' earaj??ai4-s» (NA) Delantero S'-A S34_JII^TC ?MC?CAACTATACAAA O-J' Inverso Í'-A C£i____&srrACA&_«CAiA-tt^CACcp^^ Los fragmentos de PCR fueron clonados dentro del vector de subclonación bacteriano, pCR2.1TOPO, entre los sitios EcoRI que dieron como resultado cinco plásmidos recombinantes, que contenían los clones de ADNc de HA, NA, Ml, M2 y NP.

Ejemplo 4: Clonación de los ADNcs virales de la influenza A/Hong Kong/1073/99 dentro de vectores de transferencia baculovirales A partir de los plásmidos basados en pCR2.1T0P0, los genes HA, NA o Ml fueron subclonados dentro del vector de transferencia baculoviral pFastBacl (Invitrogen) dentro del locus de polihedron, y los sitios att de Tn7, y en dirección (3') del promotor de polihedrina baculoviral, y corriente arriba (5') de la señal de secuencia de poliadenilación. Los genes virales fueron ligados con la ADN-ligasa T4. Para el gen HA, un fragmento de ADN BamHl -Kpnl proveniente de pCR2.1T0P0- HA fue insertado dentro del ADN plasmídico pFastBacl digerido con BamHl-Kpnl. Para el gen NA, el fragmento de ADN de fícoRI proveniente del pCR2.1T0P0-NA fue insertado dentro del ADN plasmídico pFastBacl digerido con BcoRI . Para el gen Ml, un fragmento de ADN EcoRI proveniente de pCR2.1TOPO-M1 fue^ insertado dentro del ADN plasmídico pFastBacl digerido con EcoRI . Bacterias competentes de E. coli DH5a (Invitrogen) fueron transformadas con estas reacciones de ligadura de ADN, de lo cual resultaron colonias transformadas, y los clones bacterianos fueron aislados . Los plásmidos resultantes basados en pFastBacl, a saber pFastBacl-HA, pFastBacl-NA y pFastBacl- • Ml fueron caracterizados por el mapeo de enzimas de restricción sobre geles de agarosa (Figura 4A) . Las secuencias de nucleótidos como se muestran en las Figuras 1-3 de los genes clonados, fueron determinadas mediante secuenciamiento automatizado de ADN. El análisis de la secuencia de ADN mostró que los genes HA, NA y Ml de la influenza, clonados fueron idénticos a las secuencias nucleotídicas para estos genes, como se publicaron previamente [genes NA, HA y Ml de la influenza A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) (GenBank acceso números AJ404629, AJ404626, yAJ278646, respectivamente)]. Ejemplo 5: Clonación de los ADNcs virales de la influenza A/Sydney/5/94 en vectores de transferencia baculovirales A partir de los plásmidos basados en pCR2.1TOPO, los genes HA, NA, Ml, M2 y NP fueron subclonados dentro del vector de transferencia baculoviral pFastBacl dentro del locus de polihedron y los sitios att de Tn7, y en dirección (3') del promotor de polihedrina baculoviral, y corriente arriba (5') de la secuencia de señal de poliadenilación. Los genes virales fueron ligados con la ADN-ligasa T4. Para el gen HA, un fragmento de ADN de BamHl-Kpnl proveniente de pCR2. lTOPO-hHA3 fue insertado dentro del ADN plásmido pFastBacl digerido con BamHl-Kpnl. Para el gen NA, un fragmento de ADN de BcoRI proveniente de pCR2. ITOPO-hNA fue insertado dentro del ADN del plásmido pFastBacl digerido con EcoRI . Para el gen Ml, un fragmento de ADN de EcoRI proveniente de pCR2. lTOPO-hMl fue insertado dentro del ADN del plásmido pFastBacl digerido con EcsRI . Para el gen M2 , un fragmento de ADN de ScoRI proveniente de pCR2. lT0P0-hM2 fue insertado dentro del ADN del plásmido pFastBacl digerido con EcoRI . Para el gen NP, un fragmento de ADN de EcoRI proveniente de pCR2. lTOPO-hNP fue insertado dentro del AD? del plásmido pFastBacl digerido con ScoRI . Las bacterias competentes de E. coli DH5 fueron transformadas con estas reacciones de ligadura de AD?, dando como resultado colonias transformadas, y se aislaron los clones bacterianos . Los plásmidos resultantes basados en pFastBacl, a saber: pFastBacl-hHA3 , pFastBacl-h?A2, pFastBacl-hMl, pFastBacl-hM2 y pFastBacl-h?P fueron caracterizados por mapeo de enzima de restricción sobre geles de agarosa. Las secuencias nucleotídicas de los genes clonados fueron determinadas mediante secuenciamiento automatizado de AD?. El análisis de la secuencia de AD? mostró que los genes de HA, ?A, Ml, M2 y ?P de la influenza, clonados, fueron idénticos a las secuencias nucleotídicas para estos genes, como se publicaron previamente. Ejemplo 6: Construcción de vectores de transferencia baculoviral multigénicos que codifican para múltiples genes virales de la influenza aviar A/Hong Kong/1073/99 Con el fin de construir los vectores de transferencia bácmidos basados en pFastBacl, que expresan múltiples genes del virus de la influenza A/Hong Kong/1073/99 (H9?2) , inicialmente un fragmento de AD? de SnaBI-Hpal proveniente del plásmido pFastBacl-Ml que contenía el gen Ml, fue clonado dentro del sitio Hpal de pFastBacl-HA. Esto dio como resultado el plásmido pFastBacl-HAM que codifica para los genes HA y Ml dentro de los casetes de expresión independientes, y expresados bajo el control de promotores de polihedrina separados . Finalmente, un fragmento de ADN Sna-BI-AvrlI proveniente de pFastBacl-HAM que contenía los casetes de expresión HA y Ml fue transferido dentro de la ADN plasmídico pFastBacl-NA digerido con Hpal-Avrll. Esto dio como resultado el plásmido pFastBacl-NAHAM, que codifica para tres casetes de expresión independientes para la expresión de los genes HA, NA y Ml de la influenza, y expresados bajo el control de los promotores de polihedrina separados (Figura 4B) . En otro ejemplo más, el gen H3 proveniente de pFastBacl-hHA3 (ver Ejemplo 5) fue clonado dentro de pFastBacl-NAHAM como un cuarto gen viral de la influenza, para la expresión y producción de las VLPs de influenza, heterotipicas . Ejemplo 7: Generación de baculovirus recombinante multigénico que codifica para los genes NA, HA y Ml del virus de la influenza aviar A/Hong Kong/1073/99 en células de insecto El vector de transferencia bácmido multigénico, resultante, pFastBacl-NAHAM, fue utilizado para generar un baculovirus recombinante multigénico que codifica para los genes HA, NA y Ml del virus de la influenza aviar A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) , para la expresión en células de insecto.

Los ADNs de bácmido recombinantes fueron producidos mediante recombinación específica del sitio en las secuencias de ADN, la polihedrina y de att de Tn7, entre el ADN de pFastBacl-NAHAM y el genoma del baculovirus AcMNPC albergado en células de E. coliDHIOBAC competentes (Invitrogen) (Figura 4B) . El ADN bácmido recombinante fue aislado mediante el método de ADN de plásmido mini-prep, y transfectado dentro de las células Sf-9s utilizando el lípido catiónico CBLLFECTIN (Invitrogen) . Después de la transfección, fueron aislados baculovirus recombinantes, purificados en placa, y amplificados en células de insecto Sf-9S . Las reservas virales fueron preparadas en células de insecto Sf-9S y caracterizadas por expresión de los productos génicos HA, NA y Ml virales de la influenza aviar. El baculovirus recombinante resultante fue designado bNAHAM-H9N2. Ejemplo 8: Expresión de las proteínas recombinante del virus de la influenza A/Hong Kong/1073/99, en células de insecto Las células de insecto Sf-9S mantenidas en cultivos en suspensión en matraces de agitación a 28°C en medio libre de suero (HyQ SFM, HyClone, Ogden, UT) fueron infectadas a una densidad celular de 2 x 106 células/ml con el baculovirus recombinante, bNAHAM-H9N2 , a una multiplicidad de infección (MOI) de 3 unidades formadoras de placa (ufp) /célula. La infección viral procedió por 72 horas para permitir la expresión de proteínas de la influenza. La expresión de las proteínas HA y Ml de la influenza aviar A/Hong Kong/1073/99 (H9N2 ) en células de insecto infectadas fue confirmada mediante SDS-PAGE y análisis de Western inmunoblot. El análisis de SDS-PAGE fue realizado sobre geles ?uPAGE de gradiente lineal de 4 a 12% (Invitrogen) bajo condiciones-reducidas y de desnaturalización. Los anticuerpos primarios en análisis de Western inmunoblot fueron el antisuero de conejo policlonal producido contra la influenza aviar A/Hong Kong/1073/99 (H9?2) obtenida a partir de CDC y el antisuero murino monoclonal para la proteína Ml de influenza (Serotec, Reino Unido) . Los anticuerpos secundarios para el análisis de Western inmunoblot fueron los antisueros de IgG de cabra conjugados a la fosfatasa alcalina, producidos contra IgG de conejo o de ratón (H+L) (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD, EUA) . Los resultados de estos análisis (Figura 5) indicaron que las proteínas HA y Ml fueron expresadas en células de insecto infectadas con el baculovirus . Ejemplo 9: Purificación de partículas similares al virus H9?2 de influenza aviar, recombinantes, y complejos de proteínas macromoleculares Sobrenadantes de cultivo de 200 ml provenientes de células de insecto Sf-9S infectadas con el baculovirus recombinante b?AHAM-H9?2 que expresaron los productos de los genes HA, ?A y Ml de la influenza aviar A/Hong Kong/1073/99 (H9?2) , fueron cosechadas mediante centrifugación a baja velocidad. Los sobrenadantes de cultivo fueron aclarados mediante centrifugación en una centrífuga super-rápida Sorval RC-5B por 1 hora a 10,000 x g y 4°C utilizando un rotor GS-3. Los virus y las VLPs fueron aislados de los sobrenadantes de cultivo aclarados, mediante centrifugación en una ultracentrífuga Sorval OTD-65 por 3 horas a 27,000 rpm y 4°C utilizando un rotor de bolsa oscilante Sorval TH-641. El botón del virus fue resuspendido en 1 ml de PBS (pH 7.2), cargado sobre un gradiente gradual de sucrosa discontinua de 20 a 60% (p/v) , y resuelto mediante centrifugación en ultracentrífuga Sorval OTD-65 por 16 horas a 27,000 rpm y 4°C utilizando un rotor Sorval TH-641. Se recolectaron fracciones de 0.5 ml de la parte superior del gradiente de sucrosa. Proteínas de la influenza en fracciones de gradiente de sucrosa, analizadas mediante SDS-PAGE y los análisis de Western inmunoblot como se describe anteriormente en el Ejemplo 6. Las proteínas HA y Ml fueron encontradas en las mismas fracciones de gradiente de sucrosa (Figura 6) como se muestra por el análisis de Western blot y sugirieron que las proteínas HA y Ml estuvieron asociadas como complejos de proteína macromolecular. También, las proteínas HA y Ml fueron encontradas en fracciones a todo lo largo del gradiente de sucrosa, sugiriendo que estas proteínas virales recombinantes estaban asociadas con los complejos de proteína macromolecular de diferentes densidades y composiciones.

Ejemplo 10: Análisis de las VLPs y las proteínas de la influenza aviar recoitibinante H9N2, mediante cromatografía de filtración en gel Las macromoléculas proteicas tales como VLPs y proteínas monoméricas migran de manera diferente sobre columnas cromatográficas de filtración en gel o de exclusión de tamaño", basadas en su tamaño en masa y forma. Para determinar si las proteínas de influenza recombinantes provenientes de las fracciones de gradiente de sucrosa eran proteínas monoméricas o complejos de proteína macromolecular tales como VLPs, una columna de cromatografía (7 mm x 140 mm) con un volumen del lecho de resina de 14 ml de Sepharos.e CLr--4B (Amersham) fue preparada. La columna de exclusión - de - tamaño fue equilibrada con PBS y calibrada con Dextran Blue 2000,, Dextran Amarillo y Vitamina B12 (Amersham Pharmacia) con pesos moleculares aparentes de 2,000,000; 20,000; y 1,357., respectivamente, para averiguar el volumen vacío de la columna. Dextran Blue 2000 eluyó de la columna en el volumen vacío (fracción de 6 ml) . Como se esperaba, los complejos de proteína de influenza recombinante eluyeron también de la columna en el volumen vacío (fracción de 6 ml) . Este resultado fue característico de un complejo de' proteína macromolecular de alto peso molecular, tales como las VLPs. Las proteínas virales en las fracciones de la columna fueron detectadas mediante análisis de Western inmunoblot como se describió anteriormente en el Ejemplo 6. Las proteínas Ml fueron detectadas en las fracciones del volumen vacío (Figura 7) . Como se esperaba, las proteínas baculovirales estuvieron también en el volumen vacío. Ejemplo 11: Microscopia electrónica de las VLPs de influenza, recombinantes Para determinar si los complejos de proteína macromolecular aislados sobre gradientes de sucrosa y que contenían proteínas de influenza aviar recombinante tenía morfologías similares a los viriones de influenza, se realizo un examen de microscopia electrónica de las muestras teñidas negativamente. Los complejos de proteína de influenza aviar recombinante A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) fueron concentrados y purificados a partir de los sobrenadantes de cultivo mediante ultracentrifugación sobre gradientes discontinuos de sucrosa, como se describe en el Ejemplo 7. Las alícuotas de las fracciones de gradiente de sucrosa fueron tratadas con un glutaraldehído al 2% en PBS, pH 7.2, absorbidas sobre rejillas recubiertas con plástico/carbono, descargadas en fresco, y lavadas con agua destilada. Las muestras fueron teñidas con fosfotungstato de sodio al 2%, pH 6.5, y observadas utilizando un microscopio electrónico de transmisión (Philips) . Las microfotografías electrónicas de las muestras negativamente teñidas de los complejos de proteína de influenza aviar recombinante H9N2 provenientes de dos fracciones de gradiente de sucrosa, mostraron partículas esféricas y en forma de varilla (Figura 8) provenientes de dos fracciones de gradiente de sucrosa. Las partículas tuvieron tamaños diferentes (60 y 80 nm) y morfologías diferentes. Fueron también detectados complejos más grandes de arabos tipos de partículas, así como partículas en forma de varilla (Figura 8) . Todas las estructuras de complejo proteico observadas mostraron picos como proyecciones superficiales que se asemejan a los peplómeros de HA y NA del virus de la influenza. Ya que el tamaño y la apariencia de las partículas de 80 nm fue similar a aquella de las partículas del virus de la influenza de tipo silvestre, estas estructuras probablemente representaron las VLPs de influenza envueltas. Las partículas más pequeñas de aproximadamente 60 nm probablemente representaron partículas subvirales que difirieron de las VLPs anteriores tanto morfológica como estructuralmente . Ejemplo 12: Análisis de las características funcionales de las proteínas de influenza por el ensayo de hemaglutinación Para determinar si las VLPs y las proteínas de influenza, purificadas, poseían actividades funcionales, tal como la actividad de hemaglutinación y neuramidinasa, que fueron características para el virus de la influenza, las VLPs y proteínas de la influenza, purificadas, fueron probadas en los ensayos de hemaglutinación y de neuraminidasa. Para el ensayo de hemaglutinación, una serie de diluciones al 50 por ciento de fracciones en gradiente de sucrosa que contenían VLPs de influenza o virus de la influenza tipo A de tipo silvestre, control positivo, fueron preparadas. Luego éstas fueron mezcladas con 0.6% de células sanguíneas rojas de cobayo en PBS (pH 7.2) e incubadas a 4°C por 1 a 16 horas. Como un control negativo, se utilizó PBS. El grado de hemaglutinación fue determinado visualmente, y la más alta dilución de la fracción, capaz de aglutinar las células sanguíneas rojas de cobayo fue determinada (Figura 9) . El más alto título de hemaglutinación observado para las VLPs y proteínas de influenza purificadas, fue de 1:4000, que fue más alto que el título mostrado por el control de influenza tipo silvestre, que fue de 1:2000. Ejemplo 13: Análisis de las características funcionales de las proteínas de influenza por el ensayo de neuraminidasa La cantidad de actividad de neuraminidasa en las fracciones de gradiente de sucrosa que contenían VLP de • influenza, fue determinada mediante el ensayo de neuraminidasa. En este ensayo, la NA (una enzima) actúa sobre el sustrato (fetuina) y liberó ácido siálico. El reactivo de arsenito fue agregado para detener la actividad de la enzima. La cantidad del ácido siálico liberado fue determinada químicamente con el ácido tiobarbitúrico, que produjo un color rosa en proporción al ácido siálico libre. La cantidad de color (cromóforo) fue medida en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 594 nm. Los datos, como se describen en la Figura -8, mostraron que fue producida una cantidad significativa de ácido siálico por las fracciones que contenían VLP de los gradientes de sucrosa y que estas fracciones corresponden a aquellas fracciones que muestran actividad de hemaglutinación. Ejemplo 14: Inmunización, de ratones Balb/C con VLPs de influenza recombinante H9N2, homotípica, funcional La inmunogenicidad de las VLPs de influenza, recombinantes, fue evaluada mediante inmunización de ratones, seguido por el análisis de Western blot de los sueros inmunes. Las VLPs recombinantes (1 µg/inyección) comprendidas de las proteínas HA, NA y Ml virales provenientes del virus de la influenza aviar tipo A/Hong Kong/1073/99, y purificadas sobre gradientes de sucrosa, fueron inoculadas subcutáneamente dentro de la región deltoide de diez (10) ratones hembra Balb/c en el día 0 y en el día 28 (Figura 11) . Se administró PBS (pH 7.2) similarmente como un control negativo en cinco (5) ratones. Los ratones fueron sangrados a partir de la cavidad supraorbital en el día -1 (pre-sangrado) , día 27 (sangrado primario) y día 54 (sangrado secundario) . Los sueros fueron recolectados a partir de las muestras sanguíneas después de coagulación de toda la noche y centrifugación. Para el análisis de Western blot, 200 ng del virus de la influenza aviar inactivado tipo A H9N2 o el virus de la influenza aviar tipo A H9N2 , adaptado al frío, así como los estándares de proteína pre-teñidos See Blu Plus 2 (Invitrogen) fue desnaturalizado (95°C, 5 minutos) y sometido a electroforesis bajo condiciones reducidas (ß-mercaptoetanol 10 mM) sobre geles NuPAGE con gradiente de poliacrilamida de 4 a 12% (Invitrogen) en amortiguador MES a 172 voltios hasta que el colorante de rastreo azul de bromofenol desapareció. Para los geles de proteína, las proteínas electrofluorescentes fueron visualizadas mediante tinción con el reactivo Azul de Coomassie Coloidal (Invitrogen) . Las proteínas fueron transferidas del gel a membranas de nitrocelulosa en metanol mediante el procedimiento estándar de Western blot . Los sueros provenientes de los ratones y conejos inmunizados con VLP, inmunizados con el virus de la influenza aviar H9N2 inactivado (sueros control positivos) se diluyeron 1:25 y 1:100, respectivamente, en solución de PBS (pH 7.2) y se utilizaron como el anticuerpo primario. Las membranas enlazadas a la proteína, las cuales fueron bloqueadas con 5% de caseína, se hicieron reaccionar con los antisueros primarios por 60 minutos a temperatura ambiente, con agitación constante. Después del lavado de las membranas del anticuerpo primario con solución salina amortiguada con fosfato que contenía Tween 20, los antisueros secundarios [conjugado de IgG de cabra anti-murino-fosfatasa alcalina (1:10,000) o el conjugado de IgG de cabra anti-conejo -fosfatasa alcalina (1:10,000)] se hicieron reaccionar 60 minutos con la membrana. Después del lavado de las membranas del anticuerpo secundario con la solución salina amortiguada con fosfato que contenía Tween 20, las proteínas que se enlazan al anticuerpo sobre las membranas, fueron visualizadas por revelado con el sustrato cromogénico tal como NBT/BCIP (Invitrogen) . Los resultados del análisis de Western blot (Figura 12) fueron que las proteínas con pesos moleculares similares a las proteínas HA y Ml virales (75 y 30 kd, respectivamente) enlazadas a los sueros control positivo (Figura 12B) y los sueros provenientes de ratones inmunizados con las VLPs de influenza H9N2 recombinante (Figura 12A) . Estos resultados indicaron que las VLPs de la influenza recombinante H9N2 , solas, fueron inmunogénicas en ratones mediante esta ruta de administración. Las siguientes referencias son incorporadas por referencia en la presente: Berglund, P., Fleeton, M. N. , Smerdou, C, and Liljestrom, P. (1999) . 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Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Una estructura de proteína macromolecular, caracterizada porque comprende: (a) una primera proteína Ml del virus de la influenza y (b) una proteína estructural adicional seleccionada del grupo que consiste de : (i) una segunda proteína Ml del virus de la influenza, (ii) (a) una primera proteína HA del virus de la influenza, (b) una segunda proteína HA del virus de la influenza, (iii) (a) una primera proteína NA del virus de la influenza, (b) una segunda proteína NA del virus de la influenza; y (iv) (a) una primera proteína M2 del virus de la influenza, (b) una segunda proteína M2 del virus de la influenza; y en donde si la proteína estructural adicional no es del subgrupo (i) , ambos miembros de al menos uno de los subgrupos (ii) , (iii) y (iv) son incluidos. 2. La estructura de proteína macromolecular de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porgue la estructura de proteína macromolecular se selecciona del grupo que consiste de una partícula subviral, una partícula similar al virus (VLP) , una estructura de capsómero o una porción de la misma, una vacuna, una vacuna muítivalente, y mezclas de las mismas. 3. La estructura de proteína macromolecular de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína estructural adicional se selecciona del grupo que consiste de la nucleoproteína (NP) y proteínas membranales de las especies diferentes de los virus no influenza. 4. La estructura de proteína macromolecular de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la proteína estructural adicional es una proteína membranal proveniente de una fuente no influenza. 5. La estructura de proteína macromolecular de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la estructura de la proteína es auto-ensamblada en una célula hospedera proveniente de una construcción recombinante. 6. La estructura de proteína macromolecular de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque al menos una proteína estructural es derivada de orígenes aviar o de mamífero. 7. La estructura de proteína macromolecular de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la - 5 proteína estructural es derivada de los diferentes subtipos del virus de la influenza. 8. La estructura de proteína macromolecular de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el subtipo del virus de la influenza se selecciona del grupo que 10 consiste de los virus de la influenza subtipo A y B. 9. La estructura de proteína macromolecular de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el virus de la influenza comprende un virus de la influenza de tipo silvestre. 15 10. La estructura de proteína macromolecular de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la estructura de proteína macromolecular comprende al menos una proteína estructural que tiene la habilidad para auto- ensamblarse dentro de las partículas heterotípicas similares 20 al virus (VLPs) . 11. Una estructura de proteína macromolecular de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque una porción de al menos una proteína comprende una estructura de proteína quimérica que tiene una porción no producida por el 25 virus de la influenza. 12. Una composición, caracterizada porque comprende la estructura de proteína macromolecular de conformidad con la reivindicación 2 , y un portador o diluyente . 13. La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque comprende además un adyuvante . 14. La estructura de proteína macromolecular de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque se selecciona de las composiciones que muestran actividad' de hemaglutinina. 15. La estructura de proteína macromolecular de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque se selecciona de las composiciones que muestran actividad de neuraminidasa . 16. Una estructura de proteína macromolecular de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque comprende epitopos conformacionales de VLP de influenza, que inducen anticuerpos neutralizadores del virus de la influenza. 17. Una composición de vacuna, caracterizada porque comprende la estructura de proteína macromolecular de conformidad con la reivindicación 16, y un portador o diluyente . 18. Un método para producir una VLP derivada de la influenza, caracterizado porque comprende: (a) la construcción de una construcción recombinante que codifica para los genes estructurales de la influenza, en donde el baculovirus recombinante codifica para Ml, HA, y al menos para una primera proteína estructural derivada del virus de la influenza; (b) transfección, infección o transformación de una célula hospedera adecuada con el baculovirus recombinante, y el cultivo de la célula hospedera bajo condiciones que permiten la expresión de Ml, HA y al menos una proteína estructural derivada del virus de la influenza; (c) permitir la formación de una VLP en la célula hospedera; (d) cosechar el medio de las células infectadas, que contiene una VLP de influenza, funcional; y (e) purificar la VLP. 19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la proteína estructural derivada del virus de la influenza se selecciona del grupo que consiste de NA, M2 y NP. 20. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque al menos una proteína estructural es derivada de orígenes aviar o de mamífero. 21. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la proteína estructural se selecciona del grupo que consiste de los virus de la influenza subtipo A y B. 22. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la célula hospedera es una célula eucariótica. 23. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la VLP comprende una VLP quimérica. 24. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque comprende además el paso de: (a) co-transfectar, co-infectar o co-transformar la célula hospedera con una segunda construcción recombinante que codifica para una segunda proteína de influenza, mediante lo cual la segunda proteína de influenza es incorporada dentro de la VLP. 25. El método para formular una sustancia medicinal que contiene una VLP de influenza, caracterizado porque comprende : (a) introducir las construcciones recombinantes que codifican para los genes virales de la influenza, dentro de las células hospederas; (b) permitir el auto-ensamblaje de las proteínas virales de influenza recombinantes, dentro de una VLP homotípica o heterotípica funcional, en células; (c) aislar y purificar la VLP de influenza; y (d) formular una sustancia medicinal que contiene la VLP de influenza. 26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la sustancia medicinal comprende además un adyuvante. 27. Un método para formular un producto medicinal, caracterizado porque comprende el paso de mezclar la sustancia medicinal de conformidad con la reivindicación 25, que contiene una VLP de influenza con una vesícula lipídica. 28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la vesícula lipídica es una vesícula lipídica no iónica. 29. Un método para detectar la inmunidad humoral para la infección por virus de la influenza en un vertebrado, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar un reactivo de prueba que incluye una cantidad efectiva de detección del anticuerpo, de la proteína del virus de la influenza que tiene al menos un epitopo conformacional de una estructura macromolecular del virus de la influenza; (b) poner en contacto el reactivo de prueba con una muestra del fluido corporal proveniente de un vertebrado que va a ser examinado para la infección por el virus de la influenza; (c) permitir que los anticuerpos específicos para el virus de la influenza, contenidos en la muestra, se enlacen al epitopo conformacional de una estructura macromolecular del virus de la influenza, para formar los complejos antígeno-anticuerpo; (d) separar los complejos de los " complejos no enlazados; (e) poner en contacto los complejos con un agente de enlace a la inmunoglobulina, detectablemente marcado; y (f) determinar la cantidad del agente de enlace a la inmunoglobulina, detectablemente marcado, que se enlazó a los complejos. 30. Un método para detectar el virus de la influenza en un espécimen proveniente de un animal o humano sospechoso de estar infectado con el virus, caracterizado porque comprende : (a) proporcionar los anticuerpos que tienen una especificidad para al menos un epitopo conformacional de la partícula del virus de la influenza, en donde los anticuerpos tienen un marcador productor de señal detectable, o están enlazados a un reactivo detectablemente marcado; (b) poner en contacto el espécimen con los anticuerpos; (c) permitir que los anticuerpos se enlacen al virus de la influenza; y (d) determinar la presencia del virus de la influenza presente en el espécimen, por medio del marcador detectable. 31. Un método de tratamiento, caracterizado porque comprende administrar a un vertebrado una cantidad efectiva de la composición de conformidad con la reivindicación 13. 32. Un método para prevenir la influenza, caracterizado porque comprende administrarle a un vertebrado una cantidad efectiva de la formulación de vacuna de conformidad con la reivindicación 17. 33. Un método para proporcionar una respuesta inmunoprotectora, caracterizado porque comprende la administración de la composición de conformidad con la reivindicación 13.