MXPA05008252A

MXPA05008252A - Metodos para tratar, prevenir y detectar una infeccion con helicobacter.

Info

Publication number: MXPA05008252A
Application number: MXPA05008252A
Authority: MX
Inventors: Joel Flores
Original assignee: Cerebus Biolog Inc
Priority date: 2003-02-03
Filing date: 2004-02-02
Publication date: 2006-05-22
Also published as: WO2004069184A3; EP1599164A2; EP1599164B1; HUE026171T2; AU2004209985B2; RU2005127573A; UA84284C2; WO2004069184A2; CA2514576C; US20070026018A1; BRPI0407207A; DK1599164T3; AU2004209985A1; CA2514576A1; EP1599164A4

Abstract

Se divulgan composiciones y metodos para tratar, prevenir y diagnosticar una infeccion con Helicobacter. Los metodos usan proteinas y/o acidos nucleicos derivados de Helicobacter cerdo, un nuevo patogeno aislado de los cerdos.

Description

METODOS PARA TRATAR, PREVENIR Y DETECTAR UNA INFECCION CON HELICOBACTER CAMPO TECNICO La presente invención se relaciona generalmente a inmunogenos bacterianos. En particular, la invención se refiere a Helicobacter cerdo, un nuevo patógeno aislado de los cerdos, y métodos para tratar, prevenir y detectar una infección con Helicobacter usando proteínas inmunogénicas y ácidos nucleicos derivados de H. cerdo. ANTECEDENTES La enfermedad gástrica es una causa importante de morbosidad y pérdida económica en las operaciones de cría de cerdos (O'Brien, J. (1992) "Gastric ulcers" página 680. En A. D. Leman, B. E. Straw, W. L. Mengeling y S. D. D'Allaire (ed) , Diseases of swine. Wolfe, Londres, Reino Unido) . Aunque la causa de la enfermedad gástrica porcina no se ha establecido previamente, ésta es más f ecuentemente atribuida a la dieta y/o estrés (O'Brien, J. (1992) "Gastric ulcers" página 680. En A. D. Leman, B. E. Straw, W. L.- Mengeling y S. D. D'Allaire (ed) , Diseases of swine. Wolfe, Londres, Reino Unido) . En 1984, Helicobacter pylori (Hp) surgió como un agente etiológico en la enfermedad de gastritis/úlcera humana después de la documentación, de este agente en pacientes con gastritis (Marshall y Warren (1984) Lancet _1: 1311-1314) . Hp es ahora uni ersarmenté reconocido como uno de los patógenos gástricos primarios y el estudio de esta especie bacteriana y el espectro de enfermedades asociados con éste, ha llegado a ser un mayor foco en la gastroenterología humana (Suerbaum y Michetti (2002) N. Eng J. Med. 347:1175-1186). Hp está causalmente asociado con la gastritis tipo B superficial (activa) crónica (Buck (1990) Clin. Micro. Rev. 3:1-12; Blaser (1992) Gasteroenterol . 1^2:720-727; Consensus Statement, 1994, NSAID) , ulceración gástrica independiente (Peterson (1991) N. Eng. J. Med. 324:1043-1047; Moss y Calam (1992) Gut 33:289-292; Leung y colaboradores, (1992) Mi. J. Clin. Pathol. 98_:569 574; Forbes y colaboradores, (1994) Lancet 343 : 258-260) , gastritis atrófica (Nomura y colaboradores, (1991) N. Engl. J. Med. 325:1132-1136; Parsonnet y colaboradores, (1991) JNCI 83:640-643; Sipponen (1992) Drugs 52:799-804,1996) y linfoma MALT gástrico (Rodríguez y colaboradores, (1993) Acta Gastro-Enterol . Belg. 56 (suppl) : 47; Eidt y colaboradores, (1994) J. Clin. Pathol. 47:436-439) . Las terapias con agentes antimicrobianos múltiples han estado disponibles para el Hp humano por más de una década. Estas terapias pueden ser costosas, difíciles de administrar, y frecuentemente sin curar completamente la enfermedad. Tales terapias serían imprácticas en el ganado doméstico. Además, el uso imprudente de agentes antimicrobianos promueve la emergencia de cepas de Hp resistentes a antibióticos a incrementado la resistencia del Hp al metronidazol y clariritromicina (Michetti, (1997) Gut 41:728-730). Adicionalmente, el uso de antibióticos en animales alimenticios es indeseable. Los intentos para tratar una infección de Hp en humanos usando la inmunoterapia antes que la quimioterapia ha sido grandemente sin éxito. En particular, la inducción de la inmunidad que imita la respuesta inmune "natural" de humanos infectados convalescentes no ha sido exitosa, puesto que la infección de Hp humana puede persistir indefinidamente a pesar de una fuerte respuesta inmune al Hp (Lee (1996) Gastroenterol. 110 : 2003-2006) . En ratones, la protección se ha logrado con sonicatos o proteínas recombinantes tales como ureA y ureB, vacA y GroEL, dadas oralmente con la toxina de cólera (CT) y la toxina inestable al calor (LT) como adyuvantes. El enfoque ha sido principalmente en el uso de proteínas bacterianas purificadas y/o recombinantes como inmunógenos objetivos en programas de desarrollo de vacunas. En general, se ha logrado la protección inconsistente y solamente parcial. En sistemas de roedores, la vacunación mucosal asistida por CT o LT ha emergido como la ruta favorecida, no importando el hecho de que estas especies sean altamente resistentes a los efectos tóxicos de CT/LT y los datos de los roedores resultantes no se traducen directamente a la experiencia de humanos o de cerdos. En particular, en cerditos pequeños inmunizados y luego estimulados con Hp, el indicador de pre-estimulación más fuerte de eficacia es el nivel y la presencia de IgG del suero/salival especifico de Hp, no IgA (Eaton y rakowka (1992) Gastroenterol . 103:1580-1586) . La vacunación parenteral estimula una fuerte respuesta al IgG; la vacunación oral no lo hace. La inmunización parenteral fue completamente protectora en 50% de los cerditos pequeños inmunizados subcutáneamente y en 60% de cerditos inmunizados intraperitonealmente (Eaton y colaboradores, (1998) J. Infect. Dis. 178 : 1399-1405) . En contraste, la vacunación oral con: 1) bacterias vivas (clarificadas con agentes antimicrobianos antes de la estimulación) , 2) bacterias inactivadas intactas completas, 3) sonicatos bacterianos completos 4) sonicatos bacterianos completos con adyuvante LT mucosal no lograron proporcionar un solo caso (0 de 27 cerditos o 0%) de protección. Los cfu bacterianos se redujeron comparados con los controles pero los niveles de reducción no alcanzan el significado estadístico. Asi, en el modelo porcino de la colonización de Hp y la gastritis aguda, la ruta parenteral de vacunación se presenta que es superior a la ruta oral en tanto las mediciones absolutas (infectados contra no infectados después de la estimulación) y relativas (cfu bacteriano en controles vacunados contra controles no vacunados) de eficacia antimicrobiana . BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención está basada en el descubrimiento de un patógeno de Helicobacter novedoso aislado de los cerdos que exhiben enfermedad de gastritis/úlcera. Este organismo ha sido llamado Helxcobacter cerdo (He) por los inventores en la presente. Este organismo ha sido mostrado por los inventores que causa enfermedad gástrica en cerditos jóvenes que es similar a la gastritis activa asociada con Hp en humanos . Las vacunas subunitarias, incluyendo antigenos y mezclas de antigenos derivados de H. cerdo, proporcionan protección contra la infección subsecuente con la especie Helxcobacter, tal como H. pylori y H. cerdo. La presente invención proporciona un método seguro, eficaz y económico para tratar y prevenir la infección con He en cerdos. Por consiguiente, en una modalidad, la presente invención se dirige a una composición que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y por lo menos un inmunogeno de Helicobacter cerdo. En ciertas modalidades, el por lo menos un inmunogeno de H. cerdo se proporciona en un lisado de H. cerdo, tal como un lisado producido mediante la digestión proteolítica de las bacterias de H. cerdo. En modalidades adicionales, la composición además comprende un adyuvante .

En otra modalidad, la invención se dirige a métodos para tratar o prevenir una infección con Helicobacter en un sujeto vertebrado que comprende la administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición como es descrito en lo anterior. En ciertas modalidades, el sujeto vertebrado es un sujeto porcino. En modalidades adicionales, la infección con Helicobacter es una infección con Helicobacter cerdo. En todavía modalidades adicionales, la composición se administra parenteralmente . En todavía otra modalidad, la invención se dirige a métodos para tratar o prevenir una infección con Helicobacter cerdo en un sujeto porcino, que comprende administrar parenteralmente al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición como es descrito en lo anterior . En otra modalidad, la invención se dirige a un método para producir una composición que comprende: (a) proporcionar por lo menos un inmunógeno de Helicobacter cerdo; y (b) combinar el inmunógeno de H. cerdo con un vehículo farmacéuticamente aceptable. En ciertas modalidades, el por lo menos un inmunógeno de H. cerdo se proporciona en un lisado de H. cerdo, tal como un lisado de H. cerdo producido mediante la digestión proteolitica de las bacterias de H. cerdo. En modalidades adicionales, también se proporciona un adyuvante . En todavía otra modalidad, la invención se dirige a un método para detectar la infección con Hellcobacter en un sujeto que comprende: (a) proporcionar una muestra biológica del sujeto y (b) hacer reaccionar la muestra biológica con por lo menos un inmunógeno de H. cerdo, bajo condiciones que permiten a los anticuerpos de Hellcobacter, cuando están presentes en la muestra biológica, enlazarse con el (los) inmunógeno (s) , para de esta manera detectar la presencia o ausencia de la infección de Helicobactex en el sujeto. En ciertas modalidades, el método además comprende: (c) remover los anticuerpos no enlazados; (d) proporcionar uno o más porciones capaces de asociarse con los anticuerpos enlazados; y (e) detectar la presencia o ausencia de las una o más porciones, para de esta manera detectar la presencia o ausencia de la infección con H. cerdo. En ciertas modalidades, la marca detectable es un agente fluorescente o una enzima. En modalidades adicionales, el por lo menos un inmunógeno se proporciona en un lisado de H. cerdo. En aun modalidades adicionales, la muestra biológica es una muestra de suero porcino. En modalidades adicionales, la invención se dirige a un método para detectar la infección con Helicobacter cerdo en un suj eto porcino que comprende : (a) proporcionar una muestra biológica del sujeto; Y (b) hacer reaccionar la muestra biológica con por lo menos un inmunógeno de H. cerdo, bajo condiciones que permiten a los anticuerpos de H. cerdo, cuando están presentes en la muestra biológica, enlazarse con el (los) inmunógeno (s) , (c) remover los anticuerpos no enlazados; (d) proporcionar una o más porciones capaces de asociarse con los anticuerpos enlazados; y (e) detectar la presencia o ausencia de las una o más porciones, para de esta manera detectar la presencia o ausencia de la infección con H. cerdo. En todavía modalidades adicionales, la invención se dirige a un anticuerpo específico para un inmunógeno de Helicobacter cerdo. En ciertas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal. En otras modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En otra modalidad, la invención se dirige a un lisado de Helicobacter cerdo que comprende por lo menos un inmunógeno de H. cerdo. En ciertas modalidades, el lisado de H. cerdo se produce mediante la digestión proteolltica de las bacterias de H. cerdo. Estas y otras modalidades de la presente invención fácilmente se les ocurrirán a aquellos expertos en la técnicas en vista de la descripción en la presente. BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra perfiles de SDS-PAGE de preparaciones de H. pylori y H. cerdo intactas y digeridas. El ?>" en la figura ilustra bandas presentes en H. pylori y ausentes de H. cerdo. El "]" indica productos de digestión de proteasa de bajo peso molecular. Las Figuras 2A y 2B muestran separaciones de SDS-PAGE del H. cerdo intacto (2A) y la digestión de H. cerdo (2B) . Una cantidad incrementada de material de bajo molecular (<) se observa en la preparación digerida. Las Figuras 3A y 3B muestran un análisis de manchado de Western del H. cerdo intacto (3A) y una digestión de H. cerdo (3B) separada sobre un gel no reductor, natural. La Figuras 4A y 4B muestra un análisis de manchado de Western del perfil de reactividad de anticuerpo contra el H. cerdo intacto (4A) y una digestión de H. cerdo (4B) . Una cantidad incrementada de material de bajo peso molecular se observa en la digestión (indicada por ] ) . La intensidad de manchado incrementada también se observa (??) , asi como bandas inmunorreactivas adicionales (<) .

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otra manera, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, bacteriología, tecnología de DNA recombinante e inmunología, que están dentro de la habilidad de la técnica. Tales técnicas son explicadas completamente en la literatura. Ver, por ejemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloníng; A Laboratory Manual, Segunda Edición (1989) ; DNA Cloning, Volúmenes I y II (D. N. Glover ed. 1985) ; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybxidization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds . 1984); Animal Cell Culture (R. K. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL press, 1986); Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); las series, Methods In Enzymology (S. Colowick y N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); y Handbook of Experimental Immunology, Volúmenes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell eds., 1986, Blackwell Scientific Publications) . Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas en la presente, ya sea supra o infra, se incorporan en la presente por referencia en su totalidad. 1. DEFINICIONES En la descripción de la presente invención, serán empleados los siguientes términos,' y se proponen para ser definidos como es indicado enseguida.

Se debe observar que, como se utiliza en esta especificación y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", "el" incluyen referencias plurales a menos que el contenido claramente lo dicte de otra manera. Así, por ejemplo, la referencia a "un inmunógeno de H. cerdo" incluye una mezcla de dos o más de tales inmunógenos, y similares . Por "infección con Helicobacter" se propone cualquier desorden causado por una bacteria de Helicobacter, incluyendo sin limitación, H. cerdo, H. pylori y H. heil annii, tal como, pero no limitado a, gastritis tipo B superficial (activa) crónica, ulceración gástrica independiente, úlceras pépticas, gástricas y duodenales, ulceración gastroesofágica (GEU) , úlceras proventriculares , hemorragia gástrica ulcerativa, gastritis atrófica y carcinoma incluyendo linforna MA1T gástrico . El término también propone la enfermedad subclínica, por ejemplo, donde la infección con Helicobacter está presente pero los síntomas clínicos de la enfermedad todavía no se han manifestado por sí mismos. Los sujetos con enfermedad subclínica pueden ser asimptomáticos pero no obstante están en un riesgo considerable de desarrollar úlceras pépticas y/o adenocarcinomas gástricos. Para una revisión de enfermedades asociadas con el Helicobacter, ver, Telford y colaboradores, Trends in Biotech. (1994) 12:420-426 y Blaser, M. J., Scientific American (Febrero de 1996) : 104-107. Por "un Usado de H. cerdo" se propone un extracto o lisado derivado de una bacteria completa de H. cerdo que incluye uno o más polipeptidos inmunogénicos de H. cerdo como es definido enseguida. El término por lo tanto se propone para comprender extractos crudos . que contienen varios inmunógenos de H. cerdo asi como composiciones relativamente purificadas derivadas de tales lisados crudos que incluyen solamente uno o pocos de tales inmunógenos. Tales lisados se preparan usando técnicas bien conocidas en el arte, descritas adicionalmente enseguida. Los inmunógenos representativos que pueden estar presentes en tales lisados, ya sea solos o en combinación, incluyen inmunógenos con uno o más epitopes derivados de adhesinas de H. cerdo tales como, pero no limitados a, inmunógenos de H. cerdo correspondientes a una hemaglutinina (HpaA) fibrilar que enlaza N-acetil-neuraminillactosa de 20 kDa, una proteina de 63 kDa que enlaza fosfatidiletanolamina y gangliotetraosil ceramida, y una estructura similar a pilosa fimbrial conservada como se encuentra en H. pylori. Ver, por ejemplo, Telford y colaboradores, Trends in Biotech. (1994) L2:420-426 para una descripción de estos antigenos. Otros inmunógenos que pueden estar presentes en el lisado incluyen inmunógenos con uno o más epitopes derivados de cualquiera de las diversas flagelinas correspondientes a las flagelinas de H. pylori conocida como la flagelina mayor, FlaA y la flagelina menor, FlaB. Los flagelos de H. pylori están compuestos de FlaA y FlaB, cada uno con pesos moleculares de aproximadamente 55 kDa. Los inmunógenos de H. cerdo correspondientes a cualquiera o ambos de FlaA y/o FlaB se pueden utilizar en los lisados de la presente invención. Otro inmunógeno de H. cerdo representativo es un inmunógeno correspondiente a la ureasa de H. pylori que está asociada con la membrana externa y el espacio periplásmico de la bacteria. La holoenzima de H. pylori es un complejo grande constituido de dos subunidades de 26.5 kDa (UreA) y 61 kDa (UreB) , respectivamente. Los inmunógenos de H. cerdo con epitopes derivados de la holoenzima, ya sea de la subunidades, o una combinación de las tres pueden estar presentes en las composiciones. Otro inmunógeno representativo que puede estar presente en el lisado o utilizado en forma purificada adicional incluye la proteina de H. cerdo correspondiente a la proteina de choque térmico de H. pylori conocida como "hsp60". "Ver, por ejemplo, Publicación Internacional No. WO 93/18150. Adicionalmente, la citotoxina de H. cerdo correspondiente a la citotoxina de H. pylori también puede estar presente. La citotoxina es una ATPasa de transporte iónico que incluye las formas de 87 kDa (monómero) y 972 kDa (decámero) . Una citotoxina es comúnmente llamada "CagA". CagA está asociada con el antigeno inmunodominante y es expresada en la superficie bacteriana. El DNA y las secuencias de aminoácidos correspondientes para CagA de H. pylori son conocidos. Ver, por ejemplo, la Publicación Internacional No. WO 93/18150, publicada el 16 de Septiembre de 1993. La proteina nativa muestra la variabilidad de tamaño inter-cepa debido a presencia de un número variable de repeticiones de un segmento de DNA de 102 bp que codifica repeticiones de una secuencia de aminoácidos rica en prolina. Ver, Covacci y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1993) 90:5791-5795. Por consiguiente, el peso molecular reportado de CagA varía de aproximadamente 120-135 kDa. Por consiguiente, si CagA está presente en el lisado, está puede estar presente como cualquiera de las diversas variantes de CagA, fragmentos de los mismos y muteínas de los mismos, que retienen la actividad. Todavía otro inmunogeno que puede estar presente en el lisado incluye la proteína VacA de H. cerdo. El DNA y las secuencias de aminoácidos correspondientes para VacA de H. pylori son conocidos y reportados en, por ejemplo, Publicación Internacional No. WO 93/18150, publicada el 16 Septiembre de 1993. El gen para el polipéptido VacA codifica un precursor de aproximadamente 140 kDa que es procesado a una molécula activa de aproximadamente 90-100 kDa. Estas moléculas a su vez, es de manera lenta proteollticamente segmentada para generar dos fragmentos que se co-purifican con la molécula de 90 kDa intacta. Ver, Telford y colaboradores, Trends in Biotech. (1994) 12:420-426. Así, el lisado puede incluir la proteína precursora, así como la molécula activa procesada, fragmentos proteolíticos activos de la misma o porciones o muteínas de la misma, que retiene la actividad biológica. Se va a entender que el lisado también puede incluir otros inmunogenos no específicamente descritos en la presente . El término "polipéptido" cuando se utiliza con referencia a un inmunógeno de H. cerdo, tal como VacA, CagA o cualquiera de otros inmunogenos descritos en lo anterior, se refiere a un VacA, CagA etc., ya sea nativo, recombinante o sintético, que es derivado de cualquier cepa de H. cerdo. El polipéptido no necesita incluir la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la molécula de referencia, pero puede incluir solamente tanto de la molécula como sea necesario para que el polipéptido retenga la inmunogenicidad y/o habilidad para tratar o prevenir la infección por H. cerdo, como es descrito enseguida. Así, solamente uno o pocos epítopes de la molécula de referencia necesitan estar presentes. Además, el polipéptido puede comprender una proteína de fusión entre la molécula de referencia de longitud completa o un fragmento de la molécula de referencia y otra proteína que no interrumpe la reactividad del polipéptido de H. cerdo. Es fácilmente evidente que el polipéptido por lo tanto puede comprender la secuencia de longitud completa, fragmentos, secuencias truncadas y parciales, asi como análogos y formas precursoras de la molécula de referencia. El término también propone supresiones, adiciones y sustituciones a la secuencia de referencia, mientras que el polipéptido retenga la inmunogenicidad . Asi, las proteínas de longitud completa y fragmentos de las mismas, así como proteínas con modificaciones, tales como supresiones, adiciones y sustituciones (ya sea de naturaleza conservativa o no conservativa) a la secuencia nativa, se proponen para el uso en la presente, mientras que la proteína mantenga la actividad deseada. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como a través de la mutagénesis dirigida al sitio o puede ser accidental, tal como a través de mutaciones de huéspedes que producen las proteínas o errores debido a la amplificación de PCR. Por consiguiente, las proteínas activas sustancialmente homologas a la secuencia de origen, por ejemplo, proteínas con identidad de 70...80...85...90...95...98...99% etc. que retienen la actividad biológica son contempladas para el uso en la presente . El término "análogo" se refiere a derivados biológicamente activos de la molécula de referencia, fragmentos de tales derivados, que retienen la actividad, como es descrito en lo anterior. En general, el término "análogo" se refiere a compuestos que tiene una secuencia de polipéptido y estructura de polipéptido nativa con una o más adiciones de aminoácidos, sustituciones y/o supresiones, con relación a la molécula nativa. Los análogos particularmente preferidos incluyen sustituciones que son de naturaleza conservativa, es decir, aquellas sustituciones que toman lugar dentro de una familia de aminoácidos que. están relacionados en sus cadenas laterales. Específicamente, los aminoácidos generalmente se dividen en cuatro familias: (1) acídico — aspartato y glutamato; (2) básico — lisina, arginina, histidina; (3) no polar — alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polar sin carga — glicina, asparagina, glutamina, cistina, serina treonina, tirosina. Fenilalanina, triptófano y tirosina son algunas veces clasificados como aminoácidos aromáticos. Por ejemplo, es razonablemente predecible que un reemplazo aislado de leucina con isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o un reemplazo conservativo similar de un aminoácido con un aminoácido estructuralmente relacionado, no tendrá un efecto mayor sobre la actividad biológica. Por ejemplo, el polipéptido de interés puede incluir hasta aproximadamente 5-10 sustituciones de aminoácidos conservativas o no conservativas, o aun hasta a aproximadamente 15-25 o 50 sustituciones de aminoácidos conservativas o no conservativas, o cualquier número entre 5-50, mientras que la función deseada de la molécula permanezca intacta. Una proteina o polipéptido "purificado" es una proteina que es recombinantemente o sintéticamente producida, o aislada de su huésped natural, tal que la cantidad de proteina presente en una composición es sustancialmente más alta que aquella presente en una preparación cruda. En general, una proteina purificada será por lo menos aproximadamente 50% homogénea y más de preferencia por lo menos aproximadamente 80% a 90% homogénea. Por "biológicamente activo" se propone una proteina de H. cerdo que induce una respuesta inmunológica, como es definido enseguida. Por "epitope" se propone un sitio sobre un antigeno al cual responden las células B y células T especificas. El término también se usa intercambiablemente con "determinante antigénico" o "sitio determinante antigénico" . Un epitope puede comprender 3 o más aminoácidos en una conformación espacial única al epitope. Generalmente, un epitope consiste de por lo menos 5 de tales aminoácidos y, más usualmente, consiste de por lo menos 8-10 de tales aminoácidos. Los métodos para determinar la conformación espacial de aminoácidos son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, la cristalografía de rayos x y la resonancia magnética nuclear y dimensional. Además, la identificación de epítopes en una proteína dada es fácilmente realizado usando técnicas bien conocidas en el arte, tal como mediante el uso de estudios de hidrofobicidad y mediante la serología dirigida al sitio. Ver, también, Geysen y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1984) 8JL: 3998-4002 (método general para sintetizar rápidamente péptidos para determinar la ubicación de los epítopes inmunogénicos en un antígeno dado) ; la patente norteamericana No. 4,708,871 (procedimientos para identificar y sintetizar químicamente epítopes de antígenos) ; y Geysen y colaboradores, Molecular Immvnology (1986) 23 : 709-715 (técnica para identificar péptidos con alta afinidad para un anticuerpo dado) . Los anticuerpos que reconocen el mismo epítope puede ser identificados en un inmunoensayo simple que muestra la habilidad de un anticuerpo para bloquear el enlace de otro anticuerpo a un antígeno objetivo. Una "respuesta inmunológica" a una composición o vacuna es el desarrollo del huésped de una respuesta inmune celular y/o mediada por el anticuerpo a la composición o vacuna de interés. Usualmente, una "respuesta inmunológica" incluye pero no está limitada a una o más de los siguiente efectos: la producción de anticuerpos, células B, células T ayudantes, células T supresoras y/o células T citotóxicas y/o células ?d T, dirigidas específicamente a un antígeno o antígenos incluidos en la composición o vacuna de interés. De preferencia, el huésped exhibirá una respuesta inmunológica protectora al (los) inmunógeno (s) de H. cerdo en cuestión, por ejemplo, el huésped será protegido de la infección subsecuente por el patógeno y tal protección será demostrada ya sea por una reducción o falta de síntomas normalmente exhibidos por un huésped infectado o un tiempo de recuperación más rápido. Los términos proteína o polipéptido "inmunogénico" se refiere a una secuencia de aminoácidos que produce una respuesta inmunológica como es descrito en lo anterior. Una proteína o polipéptido "inmunogénico", como se utiliza en la presente, incluye la secuencia de longitud completa del inmunógeno de H. cerdo particular en cuestión, incluyendo cualquier precursor y formas maduras, análogos de los mismos, o fragmentos inmunogénicos de los mismos. Por "fragmento inmunogénico" se propone un fragmento del inmunógeno de H. cerdo en cuestión que incluye uno o más epítopes y así produce la respuesta inmunológica descrita en lo anterior. Los fragmentos inmunogénicos, para propósitos de la presente invención, usualmente serán de por lo menos de aproximadamente 2 aminoácidos en longitud, más de preferencia de aproximadamente 5 aminoácidos en longitud, y mucho más de preferencia al menos aproximadamente 10 a 15 aminoácidos en longitud. No hay limite superior critico para longitud del fragmento, que podría comprender casi la longitud completa de la secuencia de proteina, o aun una proteina de fusión que comprende dos o más epitopes del inmunogeno de H. cerdo en cuestión. "Homología" se refiere al por ciento de identidad entre dos polinucleótidos o dos porciones de polipéptido. Dos DNA, o dos secuencias de polipéptido son "sustancialmente homologas" entre sí, cuando las secuencias exhiben por lo menos aproximadamente 50%, de preferencia por lo menos aproximadamente 75%, más de preferencia por lo menos aproximadamente 80%-85%, de preferencia por lo menos aproximadamente 90%, y mucho más de preferencia por lo menos aproximadamente 95%-98% de identidad de secuencia sobre una longitud definida de las moléculas. Como se utiliza en la presente, sustancialmente homólogo también se refiere a secuencias que muestran identidad completa al DNA específico o secuencia de polipéptido. En general, "identidad" se refiere a una correspondencia de nucleótido a nucleótido o aminoácido a aminoácido exacta de dos polinucleótidos o secuencias de polipéptido, respectivamente. El por ciento de identidad se puede determinar mediante una comparación directa de la información, de la secuencia entre dos moléculas al alinear las secuencias, al contar el número exacto de igualaciones entre las dos secuencias alineadas, al dividir entre la longitud de la secuencia más corta, y al multiplicar el resultado por 100. Se pueden utilizar programas de computadora fácilmente disponibles para ayudar en el análisis, tal como ALIGN, Dayhoff, M. O. en Atlas of Protein Sequence and Structure M. O. Dayhoff ed., 5 Suppl . .3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC, que adapta el algoritmo de homología local de Smith y Waterman Advances in Appl. Math. 2_: 482-489, 1981 para análisis de péptidos . Los programas para determinar la identidad de la secuencia de nucleótidos están disponibles en el Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 (disponible de Genetics Computer Group, Madison, WI) por ejemplo, los programas BESTFIT, FASTA y GAP, que también depende el algoritmo de Smith y Waterman. Estos programas son fácilmente utilizados con los parámetros de error recomendados por el fabricante y descritos en el Wisconsin Sequence Analysis Package referido en lo anterior. Por ejemplo, el por ciento de identidad de una secuencia de nucleótidos particular a una secuencia de referencia se puede determinar usando el algoritmo de homología de Smith y Waterman con una tabla de registro de error y una sanción de espacio de seis posiciones de nucleótidos .

Otro método para establecer el por ciento de identidad en el contexto de la presente invención es usar el paquete de programas MPSRCH con derechos de autor por la Universidad de Edinburgh, desarrollado por John F. Collins y Shane S. Sturrok, y distribuido por IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA) . A partir de esta colección de paquetes se puede emplear el algoritmo de Smith-Waterman donde los parámetros de error son utilizados para la tabla de registro (por ejemplo, sanción de espacio abierto de 12, sanción de extensión de espacio de uno y un espacio de seis) . A partir de los datos generados, el valor de "igualación" refleja la "identidad de secuencia". Otros programas adecuados para calcular el por ciento de identidad o similitud entre secuencias son generalmente conocidos en la técnica, por ejemplo, otro programa de alineación es BLAST, usado con parámetros de error. Por ejemplo, BLASTN y BLASTP se pueden utilizar usando los siguientes parámetros de error: código genético = estándar; filtro = ninguno; hebra = ambos; corte = 60; esperado = 10; Matrix = BLOSUM62; Descripciones = 50 secuencias; clasificado por = HIGH SCORE; Bases de datos = no redundantes, traducciones de CDS de GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank + proteina suiza + Spupdate + PIR. Los detalles de estos programas son bien conocidos en la técnica. Alternativamente, la homología se puede determinar mediante la hibridación de polinucleótidos bajo condiciones que forman dúplexes estables entre regiones homologas, seguido por la digestión con la(s) nucleasa(s) especificas de una sola hebra y la determinación del tamaño de los fragmentos digeridos. Las secuencias DNA que son sustancialmente homologas pueden ser identificadas en un experimento de hibridación de Southern bajo, por ejemplo, condiciones severas, como es definido para ese sistema particular. Las definición de condiciones de hibridación apropiadas está dentro de la habilidad de la técnica. Ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, supra; DNA Cloning, supra; Nucleic Acíd Hybridization, supra. Una "secuencia de codificación" o una secuencia que "codifica" un polipéptido seleccionado, es una molécula de ácido nucleico que es transcripta (en el caso de DNA) y traducida (en el caso de mRNA) en un polipéptido in vitro o in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los limites de la secuencia de codificación son determinados por un codón de inicio en la terminal 5' (amino) y un codón de detención de traducción en la terminal 3' (carboxi) . Una secuencia de terminación de transcripción puede ser ubicada 3' a la secuencia de codificación. Por "vector" se propone cualquier elemento genético tal como plásmido, fago, transposon, cósmido, cromosoma, virus, virión, etc., que es capaz de la replicación cuando es asociado con los elementos de control apropiados que pueden transferir las secuencias de genes a las células. Asi, el término incluye vehículos de clonación y expresión, y así como vectores virales . Por "vector recombinante" se propone un vector que incluye una secuencia de ácido nucleico heteróloga que es capaz de la expresión in vitro o in vivo. El término "transíección" se utiliza para referirse a la captación de DNA extraño por una célula, y una célula se ha transfectado" cuando el DNA exógeno se ha introducido dentro de la membrana celular. Un número de técnicas de transfección son generalmente conocidas en el arte. Ver, por ejemplo, Granara y colaboradores, (1973) Virology, 52 : 56, Sambrook y colaboradores, (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Nueva York, Davis y colaboradores, (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, y Chu y colaboradores, (1981) Gene L3:197. Tales técnicas se pueden utilizar para introducir uno o más porciones de DNA exógenas en células hospederas adecuadas . El término "heterólogo" como se relaciona a secuencias de ácido nucleico tal como las secuencias de codificación y secuencias de control, denota secuencias que normalmente son unidas de manera conjunta y/o están normalmente asociadas con una célula particular. Así, una región "heterologa" y una construcción de ácido nucleico o un vector es un segmento de ácido nucleico dentro o unido a otra molécula de ácido nucleico que no se encuentra en asociación con la otra molécula en la naturaleza. Por ejemplo, una región heterologa de una construcción de ácido nucleico podría incluir una secuencia de codificación flanqueada por secuencias no encontradas en asociación con la secuencia de codificación en la naturaleza. Otro ejemplo de otra secuencia de codificación heterologa es una construcción donde la secuencia de codificación misma no es encontrada en la naturaleza (por ejemplo, secuencias sintéticas que tienen codones diferentes del gen nativo) . De manera similar, una células transformada con una construcción que no está normalmente presente en la célula sería considerada heterologa para propósitos de esta invención. La variación o los eventos mutacionales que surgen de manera natural no dan origen al DNA heterólogo, como se utiliza en la presente. Una secuencia de "ácido nucleico" se refiere a una secuencia de DNA o RA. El término captura secuencias que incluyen cualquiera de los análogos de bases conocidos de DNA y RNA tal como, pero no limitados a, 4-acetilcitosina, 8-hidroxi-N6-metiladenosina, aziridinilcitosina, pseudoiso-citosina, 5- (carboxihidroxil-metil) uracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-carboximetil-aminometiluracilo, dihidrouracilo, inosina, N6-isopenteniladenina, l-iuetiladenina, 1-metilpseudouracilo, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2, 2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metil-citosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxi-amino-metil-2-tiouracilo, beta-D-mannosilqueosina, 5' -metoxicarbonilmetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina/ éster metílico de ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, oxibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico de ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina y 2, 6-diaminopurina. El término "secuencias de control" de DNA se refiere colectivamente a secuencias promotoras, señales de poliadenilación, secuencias de terminación de transcripción, dominios regulatorios corriente arriba, orígenes de replicación, sitios de entrada de ribosoma interna ("IRES") , aumentadores y similares, que colectivamente proporcionan la replicación, transcripción y traducción de una secuencia de codificación en una célula recipiente. No todas estas secuencias de control necesitan siempre estar presentes mientras que la secuencia de codificación seleccionada sea capaz de ser replicada, transcrita y traducida en una célula hospedera apropiada.

El término "promotor" se utiliza en la presente en su sentido ordinario para referirse a una región de nucleótidos que comprende una secuencia regulatoria de DNA, en donde la secuencia regulatoria es derivada de un gen que es capaz de enlazar RNA polimerasa e iniciar la transcripción de codificación corriente abajo (dirección 3'). Los promotores de transcripción pueden incluir "promotores inducibles" (donde la expresión de una secuencia de polinucleótido operablemente enlazada al promotor es inducida por un analito, cofactor, proteina regulatoria, etc.), y "promotores represibles" (donde la expresión de una secuencia de polinucleótido operablemente enlazado al promotor es inducida por un analito, cofactor, proteina regulatoria, etc.) y "promotores constitutivos". "Operablemente enlazado" se refiere a un arreglo de elementos en donde los componentes asi descritos están configurados para realizar su función usual. Asi, las secuencias de control operablemente enlazadas a una secuencia de codificación son capaces de efectuar la expresión de la secuencia de codificación. Las secuencias de control no necesitan estar contiguas con la secuencia de codificación, mientras que ellas funcionen para dirigir la expresión de las mismas. Asi, por ejemplo, las secuencias de intervención no traducidas para transcritas pueden estar presentes entre una secuencia promotora y la secuencia de codificación y la secuencia promotora puede ser todavía considerada "operablemente enlazada" a la secuencia de codificación. Para el propósito de describir la posición relativa de las secuencias de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico particular por toda la presente solicitud, tal como cuando una secuencia de nucleótido particular es descrita como que está situada "corriente arriba", "corriente abajo" "3 prima (3')" o "5 prima (5' ) con relación a otra secuencia, se va a entender que esta es la posición de las secuencias en la hebra de "sentido" o "codificación" de una molécula de DNA que es referida como es convencional en la técnica. Por "sujeto vertebrado" se propone cualquier miembro del subfilum chordata, incluyendo, sin limitación, mamíferos tal como ganado vacuno, ovejas, cerdos, cabras, caballos y humanos; animales domésticos tales como perros y gatos; y aves, incluyendo aves domésticas, silvestres y de caza tales como gallos de pelea y gallinas incluyendo pollos, pavos y otras aves gallináceas y peces. El término no denota una edad particular. Así, se propone que están cubiertos tanto animales adultos y recién nacidos así como fetos. Los términos "cantidad efectiva" o "cantidad terapéuticamente efectiva" de una composición o agente, como se proporciona en la presente, se refiere a una cantidad no tóxica pero suficiente de la composición o agente para proporcionar el "efecto terapéutico" deseado, tal como para producir una respuesta inmune como es descrito en lo anterior, de preferencia para prevenir, reducir o revertir los síntomas asociados con la infección con Helicobacter. Este efecto puede ser para alterar un componente de una enfermedad (o desorden) hacia un efecto o punto final deseado, tal que una enfermedad o desorden del sujeto muestra mejora, frecuentemente reflejado por la aminoración de un signo o síntoma relacionado con la enfermedad o desorden. Por ejemplo, un efecto terapéutico representativo puede transformar el sujeto negativo para la infección con Helicobacter cuando la mucosa gástrica se cultiva para la especie de Helicobacter particular en cuestión tal como H. cerdo. De manera similar, las biopsias que indican la producción de anticuerpo IgG, IgM y IgA disminuida dirigida contra la especie de Helicobacter en cuestión, tal como H. cerdo son una indicación de un efecto terapéutico. De manera similar, los anticuerpos de suero disminuidos contra la especie de Helicobacter en cuestión son indicativos de un efecto terapéutico. La inflamación gástrica reducida también es indicativa de un efecto terapéutico. La cantidad exacta requerida variará de sujeto a sujeto de pendiendo de la especie, edad y condición general del sujeto, la severidad de la condición que es tratada y los componentes particulares de la composición administrada, modo de administración y similares. Una cantidad "efectiva" apropiada en cualquier caso individual puede ser determinada por un experto ordinario en la técnica usando la experimentación de rutina. "Tratamiento" o "para tratar" la infección con Helicobacter incluye: (1) prevenir la enfermedad de Helicobacter o (2) causar que los desordenes relacionados con la infección con Helicobacter se desarrollen o que ocurran en proporciones menores en un sujeto que puede ser expuesto a Helicobacter, tal como H. cerdo, (3) reducir la cantidad de Helicobacter presente en un sujeto, y/o reducir los síntomas asociados con la infección con Helicobacter. Como se utiliza en la presente, una "muestra biológica" se refiere a una muestra de tejido o fluido aislado de un individuo, incluyendo, pero no limitado a, por ejemplo, sangre, plasma, suero, materia fecal, orina, médula ósea, bilis, fluido espinal, fluido linfático, muestras de la piel, secreciones externas de la piel, tractos respiratorios, intestinal y genitourinario, muestras derivadas del epitelio gástrico y la mucosa gástrica, lágrimas, saliva, leche, células de la sangre, órganos, biopsias y también muestras de constituyentes de cultivo de células in vitro incluyendo pero no limitado a, medios acondicionados que resultan del crecimiento de células y tejidos en el medio de cultivo, por ejemplo, células recombxnantes y componentes celulares. Como se utiliza en la presente, los términos "marca" y "marca detectable" se refieren a una molécula capaz de detección, incluyendo, pero no limitados a, isótopos radiactivos, agentes fluorescentes, quimioluminiscentes, enzimas, substratos de enzima, cofactores de enzima, inhibidores de enzima, cromóforos, tintes, iones metálicos, soles metálicos, ligandos (por ejemplo, biotina o haptenos) y similares. El término "agente fluorescente" se refiere a una sustancia o una porción de la misma que es capaz de exhibir fluorescencia en la gama detectable. Ejemplos particulares de marcas que pueden ser usadas bajo la invención incluyen fluoresceina, rodamina, dansilo, umbeliferona, rojo de Texas, luminol, ésteres de aaradimum, NADPH y a-ß-galactosidasa . 2. MODOS PARA LLEVAR A CABO LA INVENCION Antes de describir la presente invención en detalle, se va a entender que esta invención no está limitada a las formulaciones o parámetros de proceso particulares ya que tales, por supuesto, pueden variar. También se va a entender que la terminología usada en la presente es para el propósito de describir modalidades particulares de la invención solamente, y no se proponen para ser limitativas. Aunque un número de métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente se pueden utilizar en la práctica de la presente invención, los materiales y métodos preferidos se describen en la presente. El punto central para la presente invención es el descubrimiento de una nueva especie de Helicobacter aislada de los cerdos con enfermedad de gastritis/úlcera. Este organismo llamado H. cerdo (He) por los inventores en la presente, produce enfermedad gástrica en cerditos -jóvenes que es similar a la gastritis activa asociada con Hp en humanos. Además, los inmunógenos de H. cerdo proporcionan protección contra la estimulación subsecuente con las especies de Helicobacter y proporcionan reactivos de diagnóstico para detectar la infección con Helicobacter, tal como la infección con H. cerdo, en sujetos vertebrados tales como cerdos. Las vacunas de H. cerdo se pueden usar contra una amplia gama de aislados de Helicobacter. Además, las vacunas son seguras, económicas, tiene un periodo de vida indefinido y se pueden administrar eficientemente de manera parenteral. Con el fin de ilustrar un entendimiento de la invención, una discusión más detallada se proporciona enseguida que considera los inmunógenos de H. cerdo, así como varios usos de los mismos. Inmunógenos de H. cerdo Los inmunógenos de H. cerdo para el uso en composiciones de vacuna y de diagnóstico se pueden producir usando una variedad de técnicas. Por ejemplo, los inmunógenos se pueden obtener directamente de las bacterias de H. cerdo que se han aislado de los cerdos usando técnicas bien conocidas en el arte y descritas en los ejemplos en la presente. Generalmente, las bacterias de H. cerdo se obtienen de cerdos destetados, jóvenes, típicamente de tres semanas a ocho semanas de edad, más típicamente de cinco a seis semanas de edad, antes del inicio de la enfermedad de úlcera. La presencia de la bacteria se puede detectar como es descrita en los ejemplos, por ejemplo, mediante examen microscópico, así como al detectar la actividad de la enzima ureasa y/o catalasa. Por ejemplo, la ureasa cataliza la conversión de urea a amonio causando un incremento en el pH del medio de cultivo . El cambio de pH puede ser detectado por un cambio de color al medio debido a la presencia de un indicador sensible al pH. Ver, por ejemplo, la patente norteamericana No. 5, 98, 528. Los inmunógenos de H. cerdo a partir de las bacterias se pueden proporcionar en un lisado que puede ser obtenido usando métodos bien conocidos en la técnica. Generalmente, tales métodos realizan la extracción de proteínas de las bacterias de H. cerdo usando tales técnicas como sonicación o ultrasonicación; agitación; extrusión líquida o sólida; tratamiento térmico; técnicas de congelación-descongelación; descompresión explosiva; choque osmótico; digestión proteolítica tal como el tratamiento con enzima líticas incluyendo proteasas tales como pepsina, tripsina, neuraminidasa y lisozima; tratamiento con álcali; desintegración por presión; el uso de detergentes y solventes tales como sales biliares, dodecilsulfato de sodio, TRITON, NP40 y CHAPS; fraccionamiento y similares. La técnica particular utilizada para romper las células es grandemente una materia de elección y dependerá de las condiciones de cultivo y cualquier tratamiento utilizado. Después del rompimiento de las células, los desechos celulares pueden ser removidos, generalmente por centrifugación y/o diálisis. Los inmunógenos presentes en tales lisados además pueden ser purificados si es deseado usando técnicas de purificación estándares tales como, pero no limitadas a, cromatografía en columna, cromatografía de intercambio iónico cromatografía de exclusión de tamaño, electroforesis, HPLC, técnicas inmunoadsorbentes, cromatografía de afinidad, inmunoprecipitación y similares. Ver, por ejemplo, la Publicación Internacional No. WO 96/12965, publicada el 2 de Mayo de 1996, para una descripción de la purificación de varios antígenos de H. pylori. Tales técnicas también son útiles para purificar antígenos de H. cerdo. Los inmunógenos de H. cerdo también se pueden generar usando métodos recombinantes, bien conocidos en la técnica. A ese respecto, se pueden idear sondas de oligonucleótido basados en las secuencias del genoma de H. cerdo y/o H. pylori y usadas para sondear librerías genómicas o de cDNA para los genes de H. cerdo que codifican para los antígenos útiles en la presente invención. Los genes luego pueden ser aislados adicionalmente usando técnicas estándares y, si es deseado, enzimas de restricción empleadas para mutar el gen en porciones deseadas de la secuencia de longitud completa . De manera similar, los genes de H. cerdo se pueden aislar directamente de las células bacterianas usando técnicas conocidas, tal como la extracción de fenol, y la secuencia además puede ser manipulada para producir cualquiera de las alteraciones deseadas. Ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, supra, para una descripción de técnicas usadas para obtener y aislar DNA. Finalmente, los genes que codifican los inmunógenos de H. cerdo se pueden producir sintéticamente, basado en las secuencias conocidas. La secuencia de nucleótidos se puede diseñar con los codones apropiados para la secuencia de aminoácidos particular, deseada. En general, se seleccionarán codones preferidos para el huésped propuesto en el cual las secuencias serán expresadas. La secuencia completa generalmente es ensamblada a partir de oligonucleótidos sobrepuestos preparados mediante métodos estándares y ensamblados en una secuencia de codificación completa. Ver, por ejemplo, Edge, Nature (1981) 292:756; Nambair y colaboradores, Science (1984) 223: 1299; Jay y colaboradores, J. Biol. Chem. (1984) 259 : 6311. Una vez que las secuencias de codificación para los polipéptidos deseados se han aislado o sintetizado, ellas se pueden clonar en cualquier vector o replicón adecuado para la expresión en una variedad de sistemas, incluyendo sistemas de expresión de insectos, mamíferos, bacterianos, virales y de levadura, como es bien conocido en la técnica. En particular, las células hospederas se transforman con vectores de expresión que incluyen secuencias de control operablemente enlazadas a la secuencia de codificación deseada. Las secuencias de control serán compatibles con la célula hospedera particular, utilizada. Frecuentemente es deseable que los polipéptidos preparados que usan los sistemas anteriores sean polipéptidos de fusión. Como con las proteínas de no fusión, estas proteínas se pueden expresar intracelularmente o se pueden secretar de la célula en el medio de crecimiento. Además, se pueden construir plásmidos que incluyen una secuencia de gen quimérico que codifica, por ejemplo, múltiples antígenos de H. cerdo. Las secuencias de gen se pueden presentar en una configuración de gen dicistrónico . Los elementos de control adicionales se pueden situar entre los diversos genes para la traducción eficiente del RA a partir de la región de codificación distal. Alternativamente, una unidad de transcripción quimérica que tiene una sola estructura de lectura abierta que codifica los múltiples antígenos también puede ser construida. Ya sea una fusión se puede hacer para permitir la síntesis de la proteína quimérica o alternativamente, señales de procesamiento de proteínas se pueden diseñar para proporcionar la segmentación mediante una proteasa tal como una peptidasa de señal, permitiendo de esta manera la liberación de las dos o más proteínas derivadas de la traducción del RNA de plantilla. La proteasa de procesamiento también se puede expresar en este sistema ya sea independientemente o como parte de una quimera con el antígeno y/o la(s) región (es) de codificación de citoquina. La proteasa misma puede ser tanto una enzima de procesamiento y un antígeno de vacuna. Dependiendo del sistema de expresión y el huésped seleccionado, los inmunógenos de la presente invención se producen al cultivar células hospederas transformadas por un vector de expresión bajo condiciones de entre las cuales se expresa el inmunógeno de interés. El inmunogeno luego se aisla de las células hospederas y se purifica. Si el sistema de expresión proporciona la secreción del inmunógeno, el inmunógeno puede ser purificado directamente a partir del medio. Si el inmunógeno no es secretado, es aislado de los lisados de células. La selección de las condiciones de crecimiento apropiadas y los métodos de recuperación están dentro de la habilidad de la técnica. Los inmunógenos de H. cerdo también se pueden producir mediante síntesis química tal como mediante la síntesis de péptido en fase sólida o en solución, usando métodos conocidos para aquellos expertos en la técnica. La síntesis química de péptidos puede ser preferible si el antígeno en cuestión es relativamente pequeño. Ver, por ejemplo, J. M. Stewart y J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesís, 2- Edición, Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984) y G. Barany y R. B. Merrifield, The Peptides : Analysis, Synthesís, Biology, editors E. Gross y J. Meienhofer, Volumen 2, Academic Press, Nueva York, (1980), páginas 3-254, para técnicas de síntesis de péptido en fase sólida; y M. Bodansky, Principies of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlín (1984) y E. Gross y J. Meienhofer, Eds., The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, supra, Volumen 1, para la síntesis en solución clásica. Los inmunógenos de H. cerdo, incluyendo lisados de H. cerdo, se pueden usar para producir anticuerpos tanto policlonales como monoclonales . Si se desean anticuerpos policlonales, un mamífero seleccionado, (por ejemplo, ratón, conejo, cabra, caballo, etc.) se inmuniza con un inmunógeno de la presente invención, o su fragmento o un inmunógeno mutado. El suero del animal inmunizado es recolectado y tratado de acuerdo con procedimientos conocidos. Ver, por ejemplo, Jurgens y colaboradores, (1985) J. Chrom. 348 : 363-370. Si se utiliza el suero que contiene los anticuerpos policlonales, los anticuerpos policlonales pueden ser purificados mediante la cromatografía por inmunoafinidad, usando procedimientos conocidos.

Los anticuerpos monocionales para los inmunógenos de H. cerdo, también se pueden producir fácilmente por un experto en la técnica. La metodología general para elaborar anticuerpos monocionales mediante el uso de la tecnología de hibridoma es bien conocida. Las líneas de células que producen anticuerpo inmortal se pueden crear mediante la fusión celular, y también por otras técnicas tal como la transformación directa de linfocitos B con DNA oncogénico o la transfeccion con el virus Epstein-Barr . Ver, por ejemplo, M. Schreier y colaboradores, Hybridoma Techniques (1980) ; Hammerling y colaboradores, Monoclonal Antíbodies and T-cell Hybridomas (1981) ; Kennett y colaboradores, Monoclonal Antibodles (1980); ver también las patentes norteamericanas Nos. 4,341,761; 4,399,121; 4,427,783; 4,444,887; 4,452,570; 4,466,917; 4,472,500, 4,491,632; y 4,493,890. Los paneles de anticuerpos monocionales producidos contra el inmunógeno de H. cerdo de interés, o fragmento del mismo, se pueden clasificar para varias propiedades; es decir, por isotipo, epítope, afinidad, etc. Los anticuerpos monocionales son útiles en la purificación, usando técnicas de inmunoafinidad, de los antígenos individuales contra los cuales ellos están dirigidos. Los anticuerpos tanto policlonales como monocionales también se pueden usar para la inmunización pasiva o se pueden combinar con preparaciones de vacuna subunitaria para incrementar la respuesta inmune.

Formulaciones ? Administración de H. cerdo Los iniaunógenos de H. cerdo de la presente invención, incluyendo los Usados de H. cerdo, se pueden formular en composiciones, tales como composiciones de vacuna o diagnóstico, ya sea solas o en combinación con otros antígenos, para el uso en la inmunización de sujetos como es descrito enseguida. Los métodos de preparación de tales formulaciones se describen en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pensilvana, 18- Edición, 1990. Típicamente, las vacunas de la presente invención se preparan como inyectables, ya sea soluciones líquidas o suspensiones. Las formas sólidas adecuadas para la solución en o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección también pueden ser preparadas . La preparación también puede ser emulsificada o el ingrediente activo encapsulado en vehículos de liposoma. El ingrediente inmunogénico activo es generalmente mezclado con un vehículo farmacéutico compatible, tal como, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares, y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, el vehículo puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsificantes y agentes reguladores del pH. Los adyuvantes que incrementan la efectividad de la vacuna también pueden ser adicionados a la formulación. Los adyuvantes pueden incluir por ejemplo, dipéptidos de muramilo, avridina, hidróxido de aluminio, alum, adyuvante de Freund, adyuvante de Freund completo (ICFA) , bromuro de dimetildioctadecil amonio (DDA) , aceites, aceite en agua, emulsiones, saponinas, citoquinas y otras sustancias conocidas en la técnica. Tales adyuvantes son bien conocidos y comercialmente disponibles de un número de fuentes, por ejemplo Difco, Pfizer Animal Health, Newport Laboratories, etc . Los inmunógenos de H. cerdo también pueden ser enlazados a un portador con el fin de incrementar la inmunogenicidad de los mismos. Los portadores adecuados incluyen macromoléculas lentamente metabolizadas grandes tales como proteínas, incluyendo albúminas de suero, hemocianina de lapa de punta, moléculas de inmunoglobulina, tiroglobulina, ovalbúmina y otras proteínas bien conocidas para aquellos expertos en la técnica; polisacáridos, tales como sefarosa, agarosa, celulosa, cuentas de celulosa y similares; aminoácido poliméricos tales como ácido poliglutámico, polilisina y similares; copo! i.meros de aminoácidos; y partículas de virus inactivo. Los inmunógenos de H. cerdo se pueden usar en su forma nativa o su contenido del grupo funcional puede ser modificado, por ejemplo, mediante succinilación de los residuos de lisina o la reacción con Cys-tiolactona . Un grupo sulfhidrilo también puede ser incorporado en el portador (o antigeno), por ejemplo mediante la reacción de las funciones de amino con 2-iminotiolano o el éster de N-hidroxisuccinimida de 3- ( 4-ditiopiridil) propionato . Los portadores adecuados también pueden ser modificados para incorporar brazos espaciadores (tal como hexametilen diamina u otras moléculas bifuncionales de tamaño similar) para la unión de los péptidos. Además, los in unógenos de H. cerdo se pueden formular en composiciones de vacuna en sus formas neutras o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos de amino libre de los polipéptidos activos) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico o fosfórico, o tales ácidos orgánicos como ácido acético, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas de grupos carboxilo libres también pueden ser derivadas de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos y tales bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamina, etanol, histidina, procaína y similares. Las formulaciones de vacuna contendrán una "cantidad terapéuticamente efectiva" del ingrediente activo, es decir una cantidad capaz de producir una respuesta inmune en un sujeto al cual se administra la composición. En el tratamiento y la prevención de la infección con Helicobacter, un "cantidad terapéuticamente efectiva" se determina fácilmente por un experto en la técnica usando pruebas estándares. Los inmunógenos de H. cerdo típicamente variarán de aproximadamente 1% a aproximadamente 95% (p/p) de la composición, o aun más alta o menor si es apropiado. Con las presentes formulaciones de vacuna, .1 a 500 mg de ingrediente activo por mi, de preferencia 1 a 100 mg/ml, más de preferencia 10 a 50 mg/ml, tales como 20... 25... 30... 35... 40, etc., o cualquier número con estos intervalos establecidos de solución inyectable debe ser adecuado para elevar una respuesta inmunológica cuando se administra una dosis de .25 a 3 mi por animal. Para inmunizar un sujeto, la vacuna generalmente se administra parenteralmente, de manera usual mediante inyección intramuscular. Otros modos de administración, sin embargo, tales como la inyección subcutánea, intraperitoneal y intravenosa, también son aceptables. La cantidad a ser administrada depende del animal que es tratado, la capacidad del sistema inmune del animal para sintetizar anticuerpos y el grado de protección deseado. Las dosificaciones efectivas se pueden establecer fácilmente por un experto ordinario en la técnica a través de ensayo de rutina que establecen curvas de dosis-respuesta. El sujeto se inmuniza mediante la administración de la vacuna y por lo menos una dosis, y de preferencia dos o más dosis. Además, el animal puede ser administrado con tantas dosis como sea requerido para mantener un estado de inmunidad a la infección. Las formulaciones de vacuna adicionales que son adecuadas para otros modos de administración incluyen supositorios y, en algunos casos, formulaciones en aerosol, intranasales, orales y formaciones de liberación sostenida. Para supositorios, la composición del vehículo incluirá aglutinantes y portadores tradicionales, tales como glicoles polialcalinos o triglicéridos . Tales supositorios se pueden formar a partir de mezclas que contiene el ingrediente activo en intervalo de aproximadamente 0.5% a aproximadamente 10% (p/p) , de preferencia de aproximadamente 1% a aproximadamente 2%. Los vehículos orales incluyen tales excipientes normalmente empleados como, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, magnesio, estearato, celulosa de sacarina sódica, carbonato de magnesio y similares. Estas composiciones de vacuna oral se pueden tomar en la forma de soluciones, composiciones, tabletas, pildoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos y contiene de aproximadamente 10% a aproximadamente 95% del ingrediente activo, de preferencia de aproximadamente 25% a aproximadamente 70%. Las formulaciones intranasales usualmente incluirán vehículos que ni causarán irritación a la mucos nasal ni alterarán significativamente la función ciliar. Los diluyentes tales como agua, solución salina acuosa u otras sustancias conocidas se pueden emplear con la presente invención. Las formulaciones nasales también pueden contener conservadores tales como, pero no limitados a, clorobutanol y cloruro de benzalconio. Un surfactante puede estar presente para incrementar la absorción de las presentes proteínas por la mucosa nasal. Las formulaciones controladas o de liberación sostenida se hacen al incorporar la proteína en portadores o vehículos tales como liposomas, polímeros impermeables no resorbibles tales como copolímeros de etileno acetato de vinilo y copolímeros Hytrel, polímeros hinchables como hidrogeles o polímeros resorbibles tales como colágeno y ciertos poliácidos o poliésteres tales como aquellos usados para hacer suturas resorbibles. Los inmunógenos de H. cerdo también se pueden suministrar usando minobombas implantadas, bien conocidas en la técnica. Los inmunógenos de H. cerdo de la presente invención también se pueden administrar por la vía de un virus portador que expresa los mismos. Los virus portadores que encontrarán uso con la presente invención incluyen, pero no están limitados a, los virus de vaccinia y otros virus pox, adenovirus y virus de herpes. A manera de ejemplo, los recombinantes de virus de vaccinia que expresan las proteínas novedosas se pueden construir como sigue. El DNA que codifica la proteina particular primero se inserta en un vector apropiado de modo que está adyacente a un promotor de vaccinia y flanqueando las secuencias de DNA de vaccinia, tal como la secuencia que codifica la timidina quinasa (TK) . Este vector luego se utiliza para transfectar células que son simultáneamente infectadas con vaccinia. La recombinación homologa sirve para insertar el promotor de vaccinia más el gen que codifica la presente proteina en el genoma viral. El TK recombinante resultante puede ser seleccionado al cultivar las células en la presencia 5-bromodeoxiuridina y al recolectar las placas virales resistentes a la misma . Una ruta alternativa de administración implica la terapia génica o la inmunización con ácido nucleico. Asi, las secuencias de nucleótidos (y elementos regulatorios acompañados) que codifican los inmunógenos de H. cerdo presentes se pueden administrar directamente a un sujeto para la traducción in vivo de los mismos. Alternativamente, la transferencia del gen se puede realizar al transfectar las células o tejidos del sujeto ex vivo y al reintroducir el material transformado en el huésped. El DNA puede ser introducido directamente en el organismo huésped, es decir mediante inyección (ver la Publicación Internacional No. WO/90/11092; y Wolf y colaboradores, (1990) Science 247:1465-1468) . La transferencia del gen mediada por liposomas también se puede realizar usando métodos conocidos. Ver, por ejemplo, Hazinski y colaboradores, (1991) M. J. Respir. Cell Mol. Biol. 4_: 206-209; Brigham y colaboradores, (1989) Mi. J. Med. Sci. 298:278-281; Canónico y colaboradores, (1991) Clin. Res. 39:219A; y Nabel y colaboradores, (1990) Science 1990) 249 : 1285-1288. Los agentes de dirección al objetivo, tales como anticuerpos dirigidos contra los antigenos superficiales expresados sobre tipos de células específicos, pueden ser covalentemente conjugados a la superficie liposomal de modo que el ácido nucleico puede ser suministrado a tejidos y células específicas susceptibles a la infección. Las composiciones de la presente invención se pueden administrar antes de, subsecuente a, o concurrentemente con los agentes microbianos tradicionales usados para tratar la enfermedad de Helicobactez, pero no limitados al subsalicilato de bismuto, metronidazol, amoxicilina, omeprazol, claritromicina, ciprofloxacina, eritromicina, tetraciclina, nitrofurantoina, ranitidina, omeprazol y similares. Un método particularmente preferido de tratamiento es primero administrar antibióticos convencionales como es descrito en lo anterior seguido por la vacunación con las composiciones dé la presente invención una vez que se ha aclarado la infección con Helicobacter.

Diagnósticos Los inmunógenos de H. cerdo, incluyendo los Usados de H. cerdo, también se pueden utilizar como diagnósticos para detectar la presencia de anticuerpos reactivos dirigidos contra la bacteria en una muestra biológica. Además, los inmunógenos se pueden usar para inspeccionar el curso de la terapia con antibióticos al comparar los resultados obtenidos al inicio de la terapia con aquellos obtenidos durante y después de un curso de tratamiento. Por ejemplo, la presencia de anticuerpos reactivos con los antigenos de H. cerdo se puede detectar usando técnicas electroforéticas y de inmunodiagnóstico estándares, incluyendo inmunoensayos tales como la competición, reacción directa, o los ensayos de tipo emparedado. Tales ensayos incluyen, pero no están limitados a, manchados de Western; pruebas de aglutinación; inmunoensayos marcados y mediados con enzima, tales como ELISAs ; ensayos de tipo biotina/avidina; radioinmunoensayos; inmunoelectroforesis; inmunoprecipitación, etc. Las reacciones generalmente incluyen marcas de revelación tales como moléculas fluorescentes, quimioluminiscentes, radiactivas, marcas enzimáticas o moléculas, de tinte, u otros métodos para detectar la formación de un complejo entre el antigeno y el anticuerpo reaccionados con el mismo. Los ensayos mencionados en lo anterior generalmente implican la separación del anticuerpo no enlazado en una fase liquida a partir de un soporte en fase sólida al cual se unen los complejos de antigeno-anticuerpo. Los soportes sólidos que pueden ser utilizados en la práctica de la invención incluyen substratos tales como nitrocelulosa, (por ejemplo, en membrana o en forma de cavidad de microtitulo) ; polivinilcloruro (por ejemplo, láminas o cavidades de microtitulo) ; látex de poliestireno (por ejemplo, cuentas o placas de microtitulo) ; fluoruro de polivinilidino; papel diazotizado; membranas de nylon; cuantas activadas, cuentas magnéticamente responsivas y similares . Típicamente, un soporte sólido primero se hace reaccionar con un componente en fase sólida (por ejemplo, uno o más antígenos de H. cerdo, tal como un lisado de H. cerdo producido mediante la digestión proteolítica de las bacterias de H. cerdo) bajo condiciones de enlace adecuadas tal que el componente es suficientemente inmovilizado al soporte. Algunas veces, la inmovilización del antígeno al soporte se puede incrementar al primero acoplar el antígeno a , una proteína con mejores propiedades de enlace. Las proteínas de acoplamiento adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, macromoléculas tales como albúminas de suero incluyendo albúmina de suero bovino (BSA) , hemocianina de lapa punta, moléculas de inmunoglobulina, tiroglobulina, ovalbúmina y otras proteínas bien conocidas para aquellos expertos en la técnica. Otras moléculas que pueden ser utilizadas para enlazar los antigenos al soporte incluyen polisacáridos, ácidos polilácticos, ácido poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolimeros aminoácido y similares. Tales moléculas y métodos de acoplamiento de estas moléculas a los antigenos, son bien conocidos para aquellos expertos ordinarios en la técnica, Ver, por ejemplo, Brinkley, M. A., Bioconjugate Clam. (1992) _3:2-13; Hashida y colaboradores, J. Appl. Biochem. (1984) 6: 56-63; y Anjaneyulu y Staros, International J. of Peptide and Protein Res. (1987) 30 : 117-124. Después de hacer reaccionar el soporte sólido con el componente en fase sólida, cualquiera de los componentes en fase sólida no inmovilizados son removidos del soporte mediante el lavado, y el componente enlazado al soporte luego se pone en contacto con una muestra biológica que se sospecha que contiene porciones de ligando (por ejemplo, anticuerpos hacia los antigenos inmovilizados) bajo condiciones de enlace adecuados . Después del lavado para remover cualquier ligando no enlazado, una segunda porción enlazadora se adiciona bajo condiciones de enlace adecuadas, donde el segundo enlazador es capaz de asociarse selectivamente con el ligando enlazado. La presencia del enlazador secundario luego se puede detectar usando técnicas bien conocidas en el arte. Más particularmente, se puede utilizar un método de ELISA, donde las cavidades de una placa microtitulo se recubren con el (los) antigeno (s) de H. cerdo. Una muestra biológica que contiene o que se sospecha de contener moléculas de inmunoglobulina anti-H. cerdo luego se adiciona a las cavidades recubiertas. En los ensayos donde se desea utilizar una placa microtitulo, un número seleccionado de cavidades se puede recubrir con, por ejemplo, una primera porción de antigeno, un diferente conjunto de cavidades recubierta con una segunda porción de antigenos, y asi sucesivamente. En lo alternativo, una serie de ELISAs se pueden correr en tándem. Después de un periodo de incubación suficiente para permitir que el anticuerpo enlace a los antigenos inmovilizados, la(s) placa (s) se puede lavar para remover las porciones no enlazadas y adicionar una molécula de enlace secundario detectablemente marcada. Las moléculas de enlace secundario se deja reaccionar con cualquiera de los anticuerpos de muestra capturados, la placa se lava y la presencia de la molécula de enlace secundaria se detecta usando métodos bien conocidos en la técnica. Asi, en una modalidad particular, la presencia de los ligandos de antigeno anti-H. cerdo enlazados de una muestra biológica se pueden detectar fácilmente usando un enlazador secundario que comprende un anticuerpo dirigido contra los ligandos de anticuerpo. Un número útil de moléculas de inmunoglobulina (Ig) son conocidos en la técnica y comercialmente disponibles. Las moléculas Ig para el uso en la presente de preferencia serán del tipo IgG o IgA, sin embargo, IgM también puede ser apropiado en algunos casos. Las moléculas Ig se pueden conjugar fácilmente a una marca de enzima detectable, tal como la peroxidasa de rábano picante peroxidase, oxidasa de glucosa, Beta-galactosidasa, fosfatasa alcalina y ureasa, entre otras, usando métodos conocidos para aquellos expertos en la técnica. Un substrato de enzima apropiado luego se utiliza para generar una señal detectable. En otras modalidades relacionadas, las técnicas de ELISA de tipo competitivas se pueden practicar usando métodos conocidos para aquellos expertos en la técnica. Los ensayos también se pueden conducir en solución, tal que las proteínas bacterianas y los anticuerpos específicos para esas proteínas bacterianas forman complejos bajo condiciones precipitantes. En una modalidad particular el (los) antígeno(s) de H. cerdo se pueden unir a una partícula en fase sólida (por ejemplo, una cuenta de agarosa o similar) usando técnicas de acoplamiento conocidas en el arte, tal como mediante el acoplamiento químico directo o indirecto. La partícula recubierta con antígeno luego se pone en contacto bajo condiciones de enlace adecuadas con una muestra biológica que se sospecha de tener anticuerpos para H. cerdo. La reticulación entre los anticuerpos enlazados causa la formación de agregados complejos de partícula-antígeno-anticuerpo que pueden ser precipitados y separados de la muestra usando el lavado y/o centrifugación. La mezcla de reacción se puede analizar para determinar la presencia o ausencia de complejos de anticuerpo-antigeno usando cualquiera de un número de métodos estándares, tales como aquellos métodos de inmunodiagnóstico descritos en lo anterior . En todavia una modalidad adicional, se puede proporcionar una matriz de inmunoafinidad, en donde una población policlonal de anticuerpos a partir de una muestra biológica que se sospecha de contener anticuerpos anti-íT. cerdo es inmovilizada a un substrato. En este respecto, una purificación de afinidad inicial de la muestra se puede llevar a cabo usando antigenos inmovilizados . La preparación de muestras resultante de esta manera solamente contendrá porciones de anti-H. cerdo, evitando las propiedades de enlace no especificas potenciales en los soportes de afinidad. Un número de métodos de inmovilización de inmunoglobulina (ya sea intactas o en fragmentos específicos) en alto rendimiento y que tiene buena retención de actividad de enlace de antigeno, son conocidos en la técnica. No siendo limitado por cualquier método particular, la proteina ? inmovilizada o la proteina G se puede utilizar para inmovilizar inmunoglobulinas . Por consiguiente, una vez que las moléculas de inmunoglobulina se han inmovilizado para proporcionar una matriz de inmunoafinidad, los antigenos de H. cerdo, que tienen marcas separadas y distintas, se ponen en contacto con los anticuerpos enlazados bajo condiciones de enlace adecuadas. Después de que cualquier antigeno no específicamente enlazado se ha lavado del soporte de inmunoafinidad, la presencia del antigeno enlazado se puede determinar al analizar cada marca especifica usando métodos conocidos en la técnica. Los reactivos de ensayo descritos en lo anterior, incluyendo los inmunogenos de H. cerdo (tal como un lisado de H. cerdo) , opcionalmente inmovilizados sobre un soporte sólido, se pueden proporcionar en kits, con instrucciones adecuadas y otros reactivos necesarios, con el fin de conducir los inmunoensayos como es descrito en lo anterior. El kit también puede contener, dependiendo del inmunoensayo particular utilizado, marcas adecuadas y otros reactivos empaquetados y materiales (es decir soluciones reguladoras de lavado y similares) . Los inmunoensayos estándares, tales como aquellos descritos en lo anterior, se pueden conducir usando estos kits. 3. EXPERIMENTAL Enseguida están ejemplos de modalidades especificas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos se presentan para propósitos ilustrativos solamente y no se proponen para limitar el alcance de la presente invención de ninguna manera. Se han hecho esfuerzos para asegurar la presición con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.) pero algún error y desviación experimental por supuesto debe ser permitido. Ej emplo 1 Aislamiento del H. cerdo a Partir de la Mucosa Gástrica Porcina Las bacterias se recuperaron de la mucosa gástrica porcina bajo condiciones microaerofilicas como sigue. Los estómagos se removieron de cerdos jóvenes y se abrieron mediante la incisión a lo largo de las curvaturas mayores y menores. Los contenidos se removieron y la mucosa se enjuagó con lavados de solución salina estériles. Tiras mucosales de la cardia glandular de curvatura menor y la cavidad mucosal, 5 x 20 mía, (menos el muscularis) , se removieron mediante disección estéril y se suspendieron en 5 mi de caldo Brucella (Difco) complementado con suero bovino fetal al 10% (B-FBS) y la tira se colocó en molinos de tejido Broeck de vidrio de 7.0 mi estériles. Los tejidos se molieron 10 veces y se hicieron diluciones en serie de 10 veces (10"° a 10-4) en B-FBS . 1/10 mi de cada dilución se colocó sobre placas de agar que contiene ya sea el medio de Skirrow o TSAII (agar de soya de tripticasa con sangre de oveja al 5%) . Las placas se incubaron en un ambiente microaeróbico húmedo durante 3-4 dias. Las colonias de especies de Helicobacter sospechosas (puntos de perno pequeños translúcidos y no emoUticos) se identificaron y se sub-pasaron sobre placas de agar fresco como antes. Las alícuotas de cada aislado sospechoso se mancharon mediante el método de manchado de Gram y se probaron para la actividad de ureasa (colocación de una torunda de algodón que contienen los organismos en B-FBS que contiene urea e indicador de pH) y en una solución de peróxido de hidrógeno al 1% (v/v) en agua destilada estéril. Los microbios que fueron bastones de curva corta Gram negativos que fueron positivos a la ureasa y catalasa se consideran que son especies de Helicobacter. En la base de la localización (estómago) , morfología (bastoncitos Gram negativos, cortos, curvos "similares a alas de gaviotas") , la actividad de la ureasa y la reactividad cruzada con un reactivo anti-Hp, la bacteria aislada se asignó al género Helicobacter y se llamó H. cerdo (Español para "puerco") . H. cerdo es distinto de, pero antigénicamente relacionado a Hp, y el organismo espiral más grande, Candidatus Helicobacter suis (Degroote y colaboradores, (2000) J. Clin. Microbiol. 38:1131-1135), otra especie de Helicobacter que se encuentra en los cerdos normales y los cerdos con gastritis y por lo tanto se piensa que es un organismo comensal no patogénico. Ej emplo 2 Infección y Recuperación de H. cerdo a Partir de Cerdos Experimentalmente Infectados Tres cerditos gnotobióticos se infectaron oralmente con H. cerdo en tres días de edad y se terminaron en 35 días de edad. Un procedimiento similar aquel detallado en lo anterior se usó para recuperar las bacterias gástricas de los cerdos experimentalmente infectados. Para esto, la mitad del estómago se removió estérilmente y se colocó en cajas petri de 100 mm3 prepesadas, estériles. 5 mi de B-FBS se adicionaron y la mucosa se separó del muscularis gástrico mediante disección aguda y el raspado con instrumentos estériles. El muscularis se removió y las cajas petri que contienen la mucosa recuperada se pesaron nuevamente. La mucosa y B-FBS se removieron y se colocaron en moledores de tejido Broek de vidrio de 7.0 mi, estériles y se molieron como en lo anterior. Diluciones en serie 10 veces del homogenado se hicieron en B-FBS y 1/10 mi de cada dilución se colocó por duplicado sobre TSAII o placas de agar de sangre. Las placas se incubaron en un medio ambiente microaeróbico húmedo durante 3-4 días. Las colonias de especies de Helicobacter sospechosas (punto de perno pequeño translúcido y no hemolítico) se identificaron en cada dilución en placa. Las colinas discretas se contaron en la placa/la dilución que contiene entre 30 y 300 colonias bacterianas. Para determinar las unidades de formación de colonias bacterianas (cfu) por gramo de mucosa gástrica, el número de colonias contadas entre las dos diluciones se promediaron (colonias totales contadas divididas entre 2) y se multiplicaron por el factor de dilución (10"° a 10"4) , por 5 (para la dilución inicial en B-FBS) , 10 veces (para la dilución inicial) para llegar al cfu total recuperado. El cfu total se dividió entre el peso de la mucosa gástrica y el número resultante fue el cfu bacteriano/gramo de mucosa gástrica. Las Tablas 1-4 resumen las observaciones generales (Tabla 1), los cambios istopatológicos (Tabla 2), los descubrimientos histopatológicos extra-gástricos (Tabla 3) y los descubrimientos microbiológicos (Tabla 4) en los cerdos infectados. Todos los cerdos probados (3/3) tuvieron cultivo y W/S positivo en el estómago. 3/3 cerdos exhibieron ulceración gastroesofágica (GEU) en la cardia nonglandular; 2/3 mostraron microúlceras antrales sanadas; y 3/3 exhibieron gastritis antral lipofolicular . Asi, el H. cerdo colonizó la mucosa gástrica de los cerdos. Adicionalmente, la infección con H. cerdo estuvo fuertemente asociada con la enfermedad de úlcera gástrica y duodenal, y produjo una infección bacteriana gástrica persistente de los cerdos análoga a H. pylori en humanos.

Tabla 1. Un resumen de observaciones generales en cerditos gnotobióticos infectados con H. cerdo y terminados en 35 días de edad.

Grupo & Peso Género Mucus Folículos Edema Pruebas de Ulceras y/o (Gms) (M/F) en Linfoides Submucosal la Piel" Erosiones Cerdito Exceso 24h 48h No- 02-2662 2650 M lb 2 2 ligera GEU, rojo Curvatura menor 02-2663 2700 F 2 2 0 GEU, curvatura menor. posible úlcera en el fundus 02-2654 2960 F 2 3 3 _ _ GEU, curvatura menor, posible úlcera en el antrum a El antígeno de la prueba de la piel consistió de la preparación de Helxcobacter pylori, (10.0 ug de sonicato clarificado 26695 en 0.1 mi de PBS) . b Visualmente registrado como 0 = sin cambio de lo normal; 1 = cambio minino; 2 = cambio moderado; y 3 = cambio severo. c Respuestas de la prueba de la piel registradas como negativas (-) o positivas (+) con descripción adicional. Tabla 2. Un resumen de cambios histopatológicos en los estómagos de cerditos gnotobioticos infectados con H. cerdo y terminados en 35 días de edad.

Región Anatómica del Estómago Grupo y Cardia Fundus Antrum Píloro Cerdito H/E W/Sa H/E W/S H/E /s H/E Número ID W/S 02-2662 3b +c 1 Xd 2 X 0 X GEUe Micro ulcera posiblemente sanada 02-2663 3 +/- 0 X 1 X 1 X 02-2664 3 + 0 X 3 X 0 X Micro ulcera posiblemente sanada a H/E = mancha con hematoxilina y eosina; W/S = mancha de Warthin-Starry. b Sugestivamente registrado como 0 = sin cambio de lo normal (sin inflamación) / 1 = cambio minimo de lo normal; 2 = cambio moderado de lo normal; y 3 = cambio severo de lo normal. c Registrado como (+) para microorganismos extracelulares de curva pequeña presentes en la superficie luminar gástrica de las secciones o (-) : no se observan microbios. d X - Las manchas- W/S son de pobre calidad y deben ser repetidas antes de que se pueda realizar una determinación de la presencia de organismos. e GEU: ulceración gastroesofágica en la cardia no glandular y la mucosa glandular adyacente de la curvatura menor del estómago . Tabla 3. Un resumen de descubrimientos histopatológicos extra-gástricos en cerditos gnotobióticos infectados con H. cerdo y terminados en 35 dias de edad.

Región Anatómica del Trasto Gastrointestinal Grupo y Esófago Duodeno Yeyuno Ileon Colón Nodos Sitios de Cerdito Gástrico Linfáticos Prueba de la Número ID Piel ¡Oreja] 24hr 48hr 02-2662 0 Reactivo 0 Reactivo 0° Parches Hiperplasia de Peyer Infiltrados Celulares Mononucleares 02-2663 Atrofia 0 Reactivo 0 ndc Vellosa Parches PMNs S de Peyer mononucleares 02-2664 0 Reactivo Reactivo Reactivo Parches Linfoides de Folículo de Hiperplasia Peyer Infiltrados de Células Mononucleares a Sugestivamente registrado como 0 = sin cambio de lo normal (sin inflamación) ; 1 = cambio mínimo de lo normal; 2 = cambio moderado de lo normal; y 3 = cambio severo de lo normal en las secciones manchadas con H/E. b Sitios de la prueba de la piel (oreja) registrados como 0 (sin infiltrado de célula inflamatoria) o 1 (infiltrados de célula inflamatoria moderado) . ° nd: no hecho. Tabla . Un resumen de descubrimientos microbiológicos en cerditos gnotobióticos infectados con H. cerdo y terminados en 35 dias de edad.

Grupo y H. cerdo en Terminación (PID 35) Otros Cerdito No . cfu/gm (xlO6) Ureasa Cata Oxi Contaminantes Microbianos 02-2662 5.54 x 105 + + + ninguno 02-2662 + (re+ + + Ninguno raspaduras) 02-2664 5.52 x 106 + + + Ninguno Ejemplo 3 Prevención de la infección con H. cerdo usando un lisado de H. cerdo preparó una vacuna de H. cerdo usando digestión proteolitica para producir un lisado de H. cerdo, de acuerdo con un método similar al protocolo de digestión descrito en Waters y colaboradores, (2000) Vaccine 18:711-719. En particular, las suspensiones de bacterias de H. cerdo propagadas en cultivos líquidos de B-FBS bajo condiciones microaerofilicas se dejaron alcanzar aproximadamente 109 bacterias por mi. Las bacterias se recuperaron por centrifugación (2000-3000 x g) durante 10 minutos. El sobrenadante consumido se desechó y la pelotilla bacteriana se resuspendió en una cantidad mínima de solución salina regulada con fosfato Dulbecco, se transfirió a un crio frasquito de plástico y se congeló a -70°C. Mientras que se congeló, la pelotilla bacteriana se liofilizó en un aparato evaporador centrifugo (velocidad vac.) Las pelotillas bacterianas liofilizadas se acumularon y se pesaron. Para la digestión bacteriana, la pepsina (Sigma, St. Louis, MO) a una concentración de 1.0 µg/ml se preparó mediante la dilución en HC1 10 mM, pH 1.9-2.2. 1 µg de pepsina se incubó con 1 mg de bacterias liofilizadas durante 24-25 horas a 37 grados C en un agitar magnético. Después de terminación de la digestión, la digestión se tomó en alícuotas, se marcó y se congeló a -70 grados C hasta su utilización. El lisado de H. cerdo se formuló en una composición de vacuna y se usó para vacunar cerditos gnotobióticos como sigue. El lisado se diluyó a 24-25 mg/ml en solución salina regulada con fosfato de Dulbecco y se mezcló con 1 mi de adyuvante. La vacuna se emulsificó en adyuvante y .5 mi de la mezcla se inyectó en la axilas dorsales y las caderas de cada cerdito. Cada cerdito recibió 3 inyecciones en 3, 10 y 17 días de edad (ver, Tabla 5) . Los resultados indicaron una reducción significante en las cargas de patógenos y escasa enfermedad en los cerditos vacunados, demostrando la eficacia de este procedimiento inmunoprofiláctico . En particular, como se observan en las tablas en la presente, H. cerdo infecta los cerditos y persistentemente coloniza la mucosa gástrica y los segmentos del intestino delgado próximo. H. cerdo está asociado con la enfermedad de úlcera gástrica. La vacuna parenteralmente administrada, homologa, protegió contra la estimulación oral subsecuente con la infección mediante H. cerdo. Tabla 5. Diseño Experimental y Evaluación.

Vacunado en 3, 10 y 17 días de edad con: Cerdito y Infección con H. cerdo en el día 21: Grupo No . Digestión de Digestión de 24 días de H. pylori H. cerdo edad Aislador no. 1 A (n=2) si - si B (n=2) - si si C (n=2) - - si 1. Los cerditos se terminaron aproximadamente 2 semanas después de la estimulación con H. cerdo (35 días de edad) . 2. La mitad del estómago se removió, se pesó, se raspó la mucosa libre de muscularis y se pesó nuevamente. Un homogenado al 10% (p/v) se hizo y el re-aislamiento cuantitativo de los organismos se determinó mediante titulación sobre placas microtítulo. Los organismos se confirmaron que son de Helicobacter spp mediante ensayos de ureasa, catalasa, mancha de Gram y la morfología de la colonia . 3. El medio estómago restante se examinó para la evidencia histológica de la enfermedad mediante métodos estándares. 4. Para los dos cerditos del grupo C, muestras estériles de esófago, duodeno, yeyuno, íleon, colón espiral, colón descendente y colón terminal también se cultivaron para la presencia de organismos (positivo o negativo, no cuantitativo) , para determinar si H. suis es un patógeno específico del estómago, de los cerdos como el H. pylori es en los cerdos gnotobióticos experimentaliuente infectados y también en humanos . Tabla 6. Un resumen de observaciones generales en cerditos gnotobióticos vacunados con digestiones de proteasa, infectados con H. cerdo y terminados en 35 días de edad.

Grupo & Peso Género Mucus Folículos Edema Ulceras y/o Cerdito (Gms) (M/F) en Linfoides Submucosal Erosiones No. Exceso Vacunado con digestión de H. pylori e infectado con H. cerdo 02-3481 2750 F 0a +/- 0 Ninguno 02-3482 3400 M I O 0 Ninguno Vacunado con digestión de H. cerdo e infectado con H. cerdo 02-3484 2840 M i l 1 GEU-leve 02-3485 3410 I 2 1 GEU posible & úlcera Sin vacunar e infectado con H. cerdo 02-3483 2970 F 1 3 1 GEU masivo, 02-3486 3520 M I 3 1 GEU pequeña hemorragia a Visualiuente registrado como 0 = sin cambio de lo normal; +/- = cambio posible de lo normal; 1 = cambio mínimo; 2 = cambio moderado; y 3 = cambio severo. Se realizaron las prueba de ELISA especificas del isotipo con el fin de detectar los anticuerpos del suero dirigidos contra el antigeno de la especie Heldcobacter en los sueros infectados con H. cerdo y H. pylori como es descrito en Krakowka y colaboradores, (1987) Infect. Immun . 55:2789-2796; Krakowka y colaboradores, (1996) Vet. Immunopathol . 55 : 2789-2796; y Eaton y colaboradores, (1992) Gastroenterol . 103:1580-1586. La vacuna en la solución salina sola sin adyuvante o combinada con los adyuvantes descritos adicionalmente enseguida, estimularon los anticuerpos específicos del isotipo IgG. Además, los sueros de los cerdos infectados con H. cerdo e infectados con H. pylori reaccionaron cruzadamente en la prueba de ELISA cuando se utilizó cualquier antígeno bacteriano. Ver, las Tablas 7-9.

Tabla 7. Respuestas del anticuerpo de suero (IgG) de ELISA a los Usados de la especie de HelicoJacfcer en cerditos gnotobióticos vacunados tres veces con digestión proteolitica de H. pylor , infectados oralmente con una cantidad subóptima da H. pilori y terminados en 24 días de edad.

Grupo & Antigeno de Helicobacter pylori: Antigeno de Helicobacter cerdo: Cerdito Pre-vacunación Pre-estimulación Terminal Pre-vacunación Pre-estimulación Terminal Grupo A: Vacunados tres veces con digestión de proteasa en Escualeno y estimulados con H. pylori 01-4161 0.86 1.02 · 0.74 0.81 01-4162 — 1.07 1.35 — 1.18 1.45 01-4163 — 1.02 1.25 —- 0.92 1.05 Grupo B: Vacunados tres veces con solución salina solamente y estimulados con H. pylori 01-4165 01-4166 Grupo C; Vacunados tres veces con la digestión de proteasa en solución salina y estimulados con H. pylori 01-4167 — 1.10 1.23 —- 1.01 1.21 01-4168 0. 41 0.60 0.28 0.42 01-4169 1.19 1.16 1.05 1.12 Interpretación (es) 1. Los valores de OD de ELISA se corrigieron para el antecedente de aproximadamente 0.1-0.2 unidades OD; no hubo diferencia significante entre los antigenos de HelicoJacter sp en los ensayos de ELISA. 5 2. La dosis de estimulación ¦ del inoculo de H. pylori estuvo por debajo del umbral de colonización para los cerditos gnotobióticos, aunque todos los vacunados (digestión proteolitica en escualeno o solución salina, Grupo A y Grupo C) seroconvertidos después de las vacunaciones (sueros de pre-estimulación) y títulos de ELISA se han incrementado ^ ligeramente mediante la terminación. 10 3. Un efecto de "cebado" de vacunación puede ser evidente si las respuestas a las digestiones de vacuna en ya sea el adyuvante de escualeno o en solución salina (Grupos A y C) se compara a 'la carencia de respuesta, aun después de la estimulación subinfecciosa, en el grupo dé control de estimulación (Grupo B) .

Tabla 8. Respuestas del anticuerpo de suero (IgG) de ELISA a los lisados de las especies de Hel co acter en cerd os gnotobióticos oralmente infectados con H. cerdo y terminados en 34 días de edad.

Grupo & Antigeno de Helicobacter pylorl: Anti eno de Helicobacter cerdo: Cerdito Pre-vacunación Pre-estimulación Terminal Pre-vacunación Pre-estimulación Terminal 02-2662 02-2663 — -— -— — 1 02-2664 — 0.23 — -— 0.25 Interpretació (es) 1. Los valores de OD de ELISA se corrigieron para el antecedente de aproximadamente 0.1-0.2 unidades OD; no hubo diferencia significante entre los antigenos de Helicobacter sp en los ensayos de ELISA. 2. El cerdito 02-2663 se colonizó ligeramente; los organismos se recuperaron solamente 10 en re-raspadura; los otros dos cerditos tuvieron niveles de colonización de aproximadamente un décimo que (por ejemplo, 105 cfu/gramo) esperado para H. pylori.

Tabla 9. Respuestas del anticuerpo de suero (IgG) da ELISA a los lisados de las especies de Helicobacter en carditos gnotobióticos vacunados tres veces con digestión de proteasa de ya sea H. pylori o H. cerdo, estimulados con H. cerdo después de las vacunaciones y terminados en 35 dias de edad. 5 Grupo & Antígeno de Helicobacter pylori: ' Antígeno de Helicobacter cerdo: Cerdito Pre-vacunación Pre-estimulación Terminal . Pre-vacunación Pre-estimulación Terminal Grupo A: Vacunados con la digestión de H. pylori e infectados con H. cerdo 02-3481 1.23 1.29 1.20 1.18 02-3482 — 1.11 1.32 1.13 1.20 Grupo B: Vacunados con la digestión de H. cerdo e infectados con H. cerdo 02-3484 0.93 1.08 1.83 02-3485 1.15 1.84 — 0.65 1.44 Grupo C: Sin vacunar e infectados con H. cerdo 02-3483 — 0.09 — 0.11 02-3486 — — — Interpretación (es) 1. Los valores de OD de ELISA se corrigieron para el antecedente de aproximadamente 0.1-0.2 unidades OD; no hubo diferencia significante entre los antigenos de Helicobacter sp en los ensayos de ELISA. 2. Ambas digestiones estimularon la producción de anticuerpo tanto homólogo y heteróloga a los antigenos de Helicobacter spp específicos; no hubo diferencia obvia en los títulos entre el antígeno homólogo (mismo antígeno para la vacunación y combinación de anticuerpos) y heterólogos (diferente antígeno y combinación de anticuerpos) de los sistemas de ELISA. 3. La respuesta moderada al antígeno en los cerditos de control de estimulación (Grupo C) es probablemente atribuible al hecho de que la infección de estimulación fue por solamente 18 días (después de las vacunaciones) .

Ej emplo 4 Eficacia de Varios Adyuvantes Se condujeron un número de experimentos para probar la eficacia de varios adyuvantes con las composiciones de vacuna, incluyendo el adyuvante de Freund incompleto (ICFA) (Difco) , TRIGEN (Ne port Laboratories, Worthington, MN) , 1M-CREST 21 (Newport Laboratories, Worthington, MN) y RESPISURE (Pfizer Animal Health) . Los cerdos administrados con la vacuna de adyuvante con TRIGEN mostraron una reacción granulomatosa severa en los sitios de inyección pero mostraron respuestas positivas en las pruebas de la piel de 24 horas. Las pruebas de seroconversión en los cerdos administrados con la vacuna que contienen TRIGEN mostraron prometimiento. Dos de cada tres de los cerdos administrados con la vacuna de adyuvante con IM-CREST 21 murieron 48 horas después de la primera inyección, probablemente debido al LPS incluido en el adyuvante. La vacunación parenteral usando ICFA y RESPISURE previene la colonización bacteriana y la gastritis. Sin embargo las vacunaciones parenterales de cerditos activamente infectados no fueron efectivas y pueden incrementar la severidad histológica de la gastritis. Por lo tanto, la terapia con antibiótico podría ser administrada desde la inmunización de los animales activamente infectados. Los inmunógenos en Escualene, RESPISURE e ICFA estimularon las respuestas del anticuerpo especifico del isotipo IgG antes de la estimulación. Los inmunógenos en solución salina también estimularon la producción de anticuerpo pero los valores OD fueron menores que aquellos que se les dio el inmunógeno en adyuvantes. La infección de estimulación con HP/HC incrementó los valores de OD en los sueros terminales. Resultados adicionales se muestras en las Tablas -16.

Tabla 10. Un resumen de observaciones histop tológicas en cerditos gnotobióticos vacunados con digestión de proteasa en el adyuvante de Freund incompleto, infectados con H. cerdo y terminados en 35 dias de edad.

Grupo & Región Anatómica del Estómago Cardia no Gástrico Orgs Cerdito Glandular* No. ID Cardia Fundus Antrum Piloro Ero Ule Otro Nodos Presente Linfáticos H & E Vacunados con la digestión de H. pylorí e infectados con H. cerdo 02-3481 2b 0 1 0 + reactivo 02-3482 2 1 2 0 + reactivo -o Vacunados con la digestión de H. cerdo e infectados con H. cerdo 02-3484 1 0 1 0 + + reactivo 02-3485 3 0 2 0 No disponible reactivo Sin vacunar e infectados con H. cerdo 02-3483 2 0 4 1 + + duodeno reactivo 02-3486 3 0 3 0 + + Micro-úlcera reactivo a Las erosiones (pérdida epitelial restringida al epitelio superficial a la membrana de basamento) observadas en la cardia no glandular del estómago. Las lesiones ulcerativas de la cardia no glandular penetran la membrana de basamento, se extienden y dentro del muscularis. El lecho de úlceras consiste de tejido de granulación inmaduro. 5 b Infiltrados linfociticos multifocales y foliculares en la mucosa gástrica subjetivamente registrados como 0 = sin cambio de lo normal (sin inflamación); 1 = cambio mínimo de lo normal; 2 = cambio moderado de lo normal; 3 = cambio severo de los normal y 4 = cambio muy severo de lo normal. c Organismos detectados en la sección manchado con hematocilina y eosina del antrum 10 adyacente en la gastritis folicular gástrica (secciones manchadas con Warthin Starry ^ están pendientes) . d Una mico-úlcera se detectó en la mucosa duodenal de una sección del duodeno presente en este bloque. Los tejidos del resto del tracto gastrointestinal se guardaron en formalina y serán examinados. 15 Tabla 11. Un resumen del cultivo microbiano y los resultados de reaislamiento en cerditos gnotobióticos vacunados con digestión de proteasa en el adyuvante de Freund incompleto, infectados con JET, cerdo y terminados en 35 dias de edad.

Grupo & H. cerdo en la terminación (PID 35) Resultados del cultivo en el resto del tracto qia, Cerdito cfu/gm (xlO6) Ureasa Cata Eso Dúo Jej Ileon Sp Col dis Col ter Col No. ID Vacunados con la digestión de H. pylori e infectados con H. cerdo 02-3481 5.58 4 + _ _ _ _ 02-3482 2.17 + + _ _ _ _ _ - _ ^ 00 Vacunados con la digestión de H. cerdo e infectados con H. cerdo 02-3484 - - - 02-3485 0.06 + + Sin vacunar e infectados con H. cerdo 02-3483 6.40 + + - + + + 02-3486 33.20 + + _ + - - a Abreviaciones utilizadas: gi = tracto gastrointestinal, Eso = esófago, Dúo = Duodeno, Jej = yeyuno, Sp Col = colon en espiral, dis Col = colon distal, ter Col = colon terminal. b reportado como nd = no hecho; + = organismos presentes, - = organismos no presentes, (-) : sin crecimiento, aún en reraspaduras de las placas . Tabla 12. Un resumen de observaciones generales en cerditos gnotobióticos vacunados3 con la digestión proteolítica de H. cerdo (HC) emulsificada en ICFA y estimulados con 5 días de He después de la última vacunación Grupo & Peso Género Mucus Folículos Edema Pruebas de Ulceras y/o Cerdito (Gras) (M/F) en Linfoides Sutamucosal la Piela Erosiones No. Exceso 48 hr Controles sin Infectar (Infectados por contacto) 03-1100 1840 F 1° 1 Ulcera raucosal fúndica potencial 03-1091 2100 F 1 2 GEU (lxl cm] Vacunados 3X Con He y luego estimulados con He 03-1091 2050 M I 1 03-1092 2590 1 +/- GEU y congestión general 03-1093 2400 ¿erosión pequeña? 03-1094 1690 +/- 03-1095 2380 03-1096 2080 +/-a Inmunizados en 7, 10 y 17 días de edad con la digestión de He proteolítica en adyuvante de Freund incompleto. b Antígeno de la prueba de la piel consistió de la preparación de H. cerdo, (10.0 ug, sonicato clarificado en 0.1 mi de PBS) . c Visualmente registrado como 0 = sin cambio de lo normal; 1 = cambio mínimo; 2 = cambio moderado; y 3 = cambio severo. d Respuestas de la prueba de la piel registradas como negativas (-) , positivas (+ ) o +/- (enrojecimiento en el subcutxs sin hinc amiento obvio) . Tabla 13. Un resumen de cambios histopatológieos en cerditos gnotobióticos vacunadosa con la digestión proteolítica de H. cerdo (He) emulsificada en ICFA y estimulada con He 5 días después de la última vacunación.

Grupo & Región Anatómica del Estómago Cerdito Cardia Fundus Antrum Píloro Duodeno Nodos Prueba No. ID Linfáticos de la Gástricos piel (24 hr) Controles Infectados (estimulación) 1100 2 reactivo 2+ Úlcera Profunda 03-1097 2 1 0 reactivo 2+ Úlcera Profunda Vacunado 3X con He y luego estimulado 03-1091 2 1 0 reactivo 4+ (-) 03-1092 1 reactivo 4+ Úlcera 03-1093 2 reactivo 4+ erosión 03-1094 0 reactivo 4+ (-) PMNs/hem 03-1095 1 o o reactivo 4+ erosión PMNs 03-1096 1 reactivo 1+ erosión a H/E = mancha de hematoxilina y eosina; W/S = mancha de Warthin-Starry b Sub eti amente registrado como 0 = sin cambio de lo normal (sin inflamación) ; 1 = cambio mínimo de lo normal; 2 = cambio moderado de lo normal; y 3 = cambio severo de lo normal. c Registrado como (+) para microorganismos extracelulares de curva pequeña presentes en la superficie luminar gástrica de las secciones o (-) : no se observan microbios, d GEU: ulceración gastroesofágica en la cardia no glandular y la mucosa glandular adyacente de la curvatura menor del estómago . Tabla 1 . Un resumen de descubrimientos microbiológicos en cerditos gnotobióticos vacunados3 con la digestión proteolítica de H. cerdo (He) emulsificada en ICFA y estimulados con He 5 días después de la última vacunación.

Grupo y Hellcobacter cerdo en terminación Otros Cerdito (PID 35) Contaminantes No. efu/gm (xlü6) Ureasa Catalasa Microbianos Controles Infectados (estimulación) 03-1100 0.21 + + ninguno 03-1097 6.61 + + ninguno Vacunado 3X con He y luego estimulado con HC 03-1091 0.16 + + ninguno 03-1092 0.07 + + ninguno 03-1093 0.93 + + ninguno -1094 - ninguno -1095 - ninguno -1096 0.003 + + ninguno Tabla 15. Respuestas del anticuerpo de suero (IgG) de ELISA a los lisados de la especie de Helicobacter en cerditos gnotobióticos vacunados tres veces con digestión proteolitica de H. pylori, en ya sea en RespisureR o en adyuvante de Freund incompleto (ICFA) , oralmente infectados con H. pllori y terminados en 35 días de edad.

Grupo & Antígeno de Helicobacter pylori: Antíqeno de Helicobacter cerdo: Cerdito Pre-vacunación Pre-estimulación Terminal Pre-vacunación Pre-estimulación Terminal Grupo A: Vacunados tres veces con digestión de proteasa emulsificada en Respisure y estimulados con H. pylori 02-2021 1. , 13 1.45 0. 98 1.34 02-2022 1. .47 1.30 1. 06 1.18 02-2023 1. , 14 1.40 1. 23 1.47 Grupo B: Vacunados tres veces con la digestión de proteasa en adyuvante de Freund incompleto y estimulados con H. pylori 02-2024 1. ,26 1.89 0. 80 1.39 02-2025 1. , 41 1.92 1. 35 1.63 02-2026 1. ,34 1.64 1. 42 1.44 Grupo C: Estimulados con H. pylori 02-2027 —- — — 02-2028 0.27 0.12 Interpretación(as) 1. Los valores de OD de ELISA se corrigieron para el antecedente de aproximadamente 0.1-0.2 unidades OD; no hubo diferencia significante entre los antigenos de Helicobacter sp en los ensayos de ELISA. 5 2. Los adyuvantes RespisureR e ICFA estimularon los títulos de ELISA significantes a los antígenos de Helicobacter sp antes de la estimulación con H. pylori. 3. Uno de dos cerdos de control no vacunados estimulados con H. pylori seroconvertidos; esta respuesta sexológica "lenta" se ha observado en experimentos de estimulación previos en que toma varias semanas para detectar los anticuerpos IgG y la 10 estimulación para el intervalo de terminación fue de solamente 15 días.

Tabla 16. Respuestas del anticuerpo de suero (IgG) de ELISA a los lisados de las especies de Hellcobacter en cerditos gnotobióticos vacunados tres veces con digestión proteolitica de H. pylori, infectados oralmente con una cantidad suboptima de H. pxlorl y terminados en 24 dias de edad.

Grupo & Antíqeno de Hellcobacter pylorl : Antíqeno de Hellcobacter cerdo: Cerdito Pre-vacunación Pre-estimulación Terminal Pre-vacunación Pre-estimulación Terminal Grupo A: Vacunados tres veces con solución salina solamente y estimulados con H. pylori 02-742 02-743 — - Grupo B; Vacunados tres veces con digestión de proteasa en solución salina y estimulados con H. pylori 02-744 — 0.75 0.75 0.67 0.74 02-745 — 1.11 0.78 1.08 0.78 02-746 — 0.73 1.05 0.73 0.98 Grupo C; Vacunados tres veces con la digestión de proteasa en el adyuvante TRIGEN (Newport Laboratories) y estimulados con H. pylori 02-750 (ELISA en progreso) 02-751 02-752 Grupo D: Vacunados con la digestión de proteasa en el adyuvante IM-CREST 21 (Newport Laboratories) 02-747 murieron 48 hrs después de la primera vacunación 02-748 — 0.25 02-749 murieron 48 hrs después de la primera vacunación Interpretación(es) 1. Los valores de OD de ELISA se corrigieron para el antecedente de aproximadamente SJ 0.1-0.2 unidades OD; no hubo diferencia significante entr.e los antigenos de Helicobacter sp en los ensayos de ELISA.

Ejemplo 5 Caracterización del H. cerdo y H. pylori Con el fin de demostrar que el H. cerdo fue de hecho un organismo distinto del H. pylori, los geles de SDS-PAGE se corrieron bajo condiciones reductoras para examinar los perfiles de proteina de los dos organismos. El apilamiento de gel para la separación consistió de 3.9% de acrilamida; el gel de separación contuvo 12% de acrilamida. Cada uno se hizo usando procedimientos estándares como es resumido en Current Protocole in Molecular Biology, suplemento 47, sección 10.2A.6. En algunos casos, se utilizaron geles PAGE naturales, que se adquirieron de BioRad Corporation. La solución reguladora de carga de gel consistió de Tris-Cl (50 mM) , pH 6.8, SDS al 2% (grado de electroforesis) , azul de bromofenol al 0.1% y glicerol al 10%. Las muestras se corrieron en una solución reguladora de Tris-glicina que contiene Tris 25 M, glicina 250 mM (grado de electroforesis, pH 8.3) y SDS al 0.1%. Las muestras consistieron de H. pylori (Hp) y H. cerdo (He) intactos y digeridos. Las digestiones proteoliticas se hicieron como es descrito en lo anterior. Un µ? de cada muestra (2.4-3.9 ]ig) se diluyó en agua destilada a un volumen final de 15 µ? y se diluyó 1:2 con solución reguladora de carga. Las muestras se hirvieron durante 3 minutos, y 20 µ? de cada muestra se cargaron sobre el gel.

Las muestras (junto con un estándar) luego se sometieron a electroforesis en 100 V durante 60-75 minutos o hasta que los frentes del tinte an precisamente salido de los geles . Los geles luego se mancharon de Azul de Coomassie o manchas de plata para desarrollar las bandas separadas y luego se fotografiaron. Después de la aclaración en solución de ácido acético diluida durante la noche, los geles se deshidrataron y luego se fotografiaron. Como se muestra en la Figura 1, los perfiles de SDS-PAGE de H. pylori y H. cerdo tanto intactos como digeridos fueron diferentes. El en la figura ilustra bandas presentes en Hp y ausentes de He. El w]" indica los productos de digestión de proteasa de bajo peso molecular. Los geles de SDS-PAGE del H. cerdo intacto y digerido también se corrieron y se compararon. Como se puede observar en la Figura 2A (intacta) y 2B (digerida) , una cantidad incrementada de bajo peso molecular estuvo presente en el producto de digestión proteolítico (indicado por en la Figura 2B) . El análisis de manchado de Western del H. cerdo intacto y el H. cerdo digerido también se realizó. Las muestras se separaron en geles PAGE (geles reductores y nativos, como es descrito en lo anterior) y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa mediante la metodología electroforética estándar usando un aparato BioRad. Las membranas de nitrocelulosa se incubaron durante la noche (4°C) en solución salina regulada con fosfato que contiene leche secas sin grasa al 10% que contiene TWEEN 20 (PBS-NEM) para bloquear los sitios reactivos sobre las membranas. Después del lavado, se hizo una dilución de 1:250 de suero porcino (diluido en PBS-NEM) y se incubó durante 2 hr a 22°C. Después de lavar 3 veces (5 minutos cada uno) en PBS-NFM, las membranas se incubaron con IgG anti-porcino de cabra, durante una hr a 22°C. Las membranas se lavaron nuevamente como en lo anterior y se revelaron con el sustrato de peroxidasa de rábano picante de la membrana T B calentada (37°C) durante varios minutos. La reacción se detuvo mediante la adición de agua destilada en exceso. Las membranas luego se secaron y se fotografiaron. Como se observa en las Figuras 3A y 3B, el material de bajo peso molecular presente en la Figura 2B entra al gel natural y es inmunorreactivo con los sueros de prueba de los cerdos. Como se muestra en las Figuras 4? y 4B, el análisis de manchado de Western del perfil de reactividad de anticuerpo contra H. cerdo intacto (4A) y una digestión de H. cerdo (4B) mostró una cantidad incrementada de material de bajo peso molecular en la digestión (indicado por ] ) . La intensidad de manchado incrementado también se observó (¦), asi como bandas inmunoreactivas adicionales (<) . Como es evidente, el lisado de H. cerdo contiene material inmunorreactivo que reacciona cruzadamente con el organismo intacto, indicando que esto es probablemente la base para la protección. Además, los sueros de prevacunación fueron negativos y los sueros de post-vacunación/post-estimulación fueron fuertemente positivos. Asi, se describen métodos para tratar, prevenir y diagnosticar la infección con Helicobacter, asi como composiciones para el uso con los métodos. Aunque las modalidades preferidas de la presente invención se han descrito en algún detalle, se entiende que se pueden hacer variaciones obvias sin apartarse del espíritu y el alcance de la invención como es definido por las reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Una composición, caracterizada porque comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y por lo menos un inmunógeno de Helicobacter cerdo.
2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el por lo menos un inmunógeno de H. cerdo se proporciona en un lisado de H. cerdo.
3. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el lisado de H. cerdo se produce mediante la digestión proteolítica de bacterias de H. cerdo.
4. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada porque además comprende un adyuvante.
5. Un método para tratar o prevenir una infección con Helicobacter en un sujeto vertebrado, caracteri ado porque comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el sujeto vertebrado es un sujeto porcino .
7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la infección con Helicojacter es una infección con Helicobacter cerdo.
8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5-7, caracterizado porque la composición se administra parenteralmente .
9. Un método para tratar o prevenir una infección con Helicobacter cerdo en un sujeto porcino, caracterizado porque comprende administrar parenteralmente al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
10. Un método para producir una composición, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar por lo menos un inmunógeno de Helicobacter cerdo; y (b) combinar el inmunógeno de H. cerdo con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el por lo menos un inmunógeno de H. cerdo se proporciona en un Usado de H. cerdo.
12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el lisado de H. cerdo se produce mediante la digestión proteolítica de bacterias de H. cerdo.
13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10-12, caracterizado porque además comprende proporcionar un adyuvante.
14. Un método para detectar una infección con Helicobacter en un sujeto vertebrado, caracterizado porque comprende : (a) proporcionar una muestra biológica del sujeto; y (b) hacer reaccionar la muestra biológica con por lo menos un inmunógeno de H. cerdo, bajo condiciones que permiten a los anticuerpos de Helicobacter, cuando están presentes en la muestra biológica, enlazarse con el (los) inmunógeno (s) , para de esta manera detectar la presencia o ausencia de la infección con Helicobacter en el sujeto.
15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque además comprende: (c) remover los anticuerpos no enlazados; (d) proporcionar una o más porciones capaces de asociarse con los anticuerpos enlazados; y (e) detectar la presencia o ausencia de las una o más porciones, para de esta manera detectar la presencia o ausencia de la infección con H. cerdo.
16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la marca detectable es un agente fluorescente o una enzima.
17. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el por lo menos un inmunógeno se proporciona en un lisado de H. cerdo.
18. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la muestra biológica es una muestra de suero porcino .
19. Un método para detectar una infección con Helxcobacter cerdo en un su eto porcino, caracterizado porque comprende : (a) proporcionar una muestra biológica del sujeto; y (b) hacer reaccionar la muestra biológica con por lo menos un inmunógeno de H. cerdo, bajo condiciones que permiten a los anticuerpos de H. cerdo, cuando están presentes en la muestra biológica, enlazarse con el (los) inmunógeno (s) , (c) remover los anticuerpos no enlazados; (d) proporcionar una o más porciones capaces de asociarse con los anticuerpos enlazados; y (e) detectar la presencia o ausencia de las una o más porciones, para de esta manera detectar la presencia o ausencia de la infección con H. cerdo.
20. Un anticuerpo especifico para un inmunógeno de iTelicojacter cerdo.
21. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo policlonal .
22. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
23. Un lisado de Helicobacter cerdo, caracterizado porque comprende por lo menos un inmunógeno de H. cerdo.
24. El lisado de H. cerdo de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el lisado de H. cerdo se produce mediante la digestión proteolitica de bacterias de H. cerdo.
25. Uso de una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o un lisado de H. cerdo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 o 24 en un método para tratar o prevenir una infección con Helicobacter en un sujeto vertebrado.
26. El uso de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el sujeto vertebrado es un sujeto porcino y la composición se administra parenteralmente.
27. Uso de una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o un lisado de H. cerdo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 o 24 en un método para detectar la infección con Helicobacter en un sujeto.
28. El uso de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el sujeto vertebrado es un sujeto porcino y la infección con Helicobacter es una infección con H. cerdo.