MXPA05003260A - Composiciones y metodo de separacion de celulas. - Google Patents

Abstract

La invencion provee composiciones y metodos para la separacion de celulas. Estos reactivos y tecnicas aglutinan, especialmente, celulas mediante el reconocimiento de superficies y se pueden usar inclusive para recuperar tipos extranos de celulas.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA LA SEPARACION DE CÉLULAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con composiciones y métodos para la separación de células .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Muchos procedimientos para la separación de células sanguíneas incluyen una separación general de eritrocitos y granulocitos mediante sedimentación con gradiente de densidad. La separación se basa en pequeñas diferencias en la densidad de diferentes tipos de células, lo que provoca que se segreguen a diferentes niveles en un medio fluido de densidad variable. Las diferencias en la densidad entre los tipos de células pueden ser pequeñas y los tipos de células individuales pueden ser heterogéneas en tamaño y densidad. Como consecuencia, los tipos de células particulares se pueden distribuir a través de un medio de gradiente de densidad en lugar de precisamente segregar un área separada en el medio de densidad. Este fenómeno puede conducir a una recuperación deficiente de las células deseadas y/o contaminación con los tipos de células indeseables. En procedimientos que enriquecen los tipos de células sanguíneas raras como hemocitoblastos hematopoyéticos , el gradiente de sedimentación generalmente produce rendimientos bajos. Por ejemplo, al usar métodos convencionales de gradiente de densidad para aislar hemocitoblastos (por ejemplo, hemocitoblastos hematopoyéticos CD34+) de la sangre del cordón umbilical se ha publicado que se produce pérdida de los hemocitoblastos. Ver ejemplo en Wagner, J.E. Am. J. Ped Hematol Oncol volumen 15, página 169 (1993) . Se ha publicado otro ejemplo de empleo de métodos de gradiente de densidad convencional para aislar linfocitos, donde se produce la pérdida selectiva de subconjuntos de linfocitos particulares. Ver por ejemplo, Collins, D.P. J. Immunol Methods volumen 243 página 125 (2000) . El aumento en la recuperación de tipos de células raras a partir de tejidos donantes pudiera mejorar dramáticamente el éxito de las terapias de trasplante e inmunes (por ejemplo, trasplantes de médula ósea, terapia génica con base de hemocitoblastos y terapia de células inmunes) , cuyo éxito aparentemente se relaciona con el número real de células que se usan en la terapia.

SUMARIO DE L¾ INVENCIÓN La invención proporciona composiciones y métodos para separar las células. Las composiciones y métodos que aquí se describen revelados pueden usarse, por ejemplo, para preparar eficientemente células para tej idos celulares, caracterización inmunofenotípica, otras pruebas de diagnóstico, además de purificación y administración terapéutica. Los métodos de la invención incluyen poner en contacto una muestra que contiene células sanguíneas (por ejemplo, muestra de sangre periférica, muestra de médula ósea) con una composición para la separación de células. Sin restringirnos a un mecanismo en particular, las composiciones de la invención pueden aglutinar células en forma selectiva mediante la interacción con antígenos de superficie y/o estimulando la adherencia célula-célula (por ejemplo, mediante la expresión aumentada de factores de adhesión a la superficie de las células) . Las células aglutinadas se separan de las células sin aglutinar, que permanecen en la solución. Las células pueden recuperarse a partir del aglutinado o de la fase del supernadante. Las composiciones y los métodos revelados se pueden usar para aislar y enriquecer una variedad de tipos de células, por ejemplo, linfocitos T, células colaboradoras T, células supresoras B, hemocitoblastos hematopoyéticos, células fetales que circulan en la circulación materna y células tumorales metastásicas circulatorias . Las composiciones y los métodos revelados pueden usarse en el contexto de transplantes autólogos o autoinj ertos . En el contexto del transplante autólogo, las composiciones y métodos revelados pueden usarse por ejemplo, para eliminar células indeseables de la sangre o de la médula ósea de un paciente . Las células deseables (por ejemplo los hemocitoblastos hematopoyéticos) pueden devolverse a un paciente sin o prácticamente libres de células tumorales potencialmente mortales. Los métodos y composiciones descritos pueden aplicarse a las células de cualquier mamífero, incluyendo a los humanos, a los primates no humanos, roedores, porcinos, bovinos y equinos. Las composiciones para la separación de células pueden contener dextrano, anticuerpos anti-glicoforina A, asi como también uno o más anticuerpos contra los antxgenos de células superficiales como CD98, CD15, CD2, CD3 , CD4, CD8, CD72, CD16, CD41a, HLA clase I, HLA-DR, CD29, CDllam CDllb, CD11C, CD19, CD20, CD23, CD39, CD40, CD44, CDw49D, CD53, CD54, CD62L, CD63, CD66, CD67, CD81, CD82, CD94 , CDCD99, CD100, CD161, Leu-13, TPA-1 o Ig superficial, y sus combinaciones . Por ejemplo, una composición puede incluir dextrano, anticuerpos anti-glicoforina A, asi como también anticuerpo anti-CDl5, anticuerpo anti-CD9, anticuerpo anti-CD94 y anticuerpo anti-CD161. En algunas modalidades, la composición además puede incluir un anticuerpo anti-CD72 o un anticuerpo anti-CD2. En otras modalidades, la composición además puede incluir anticuerpo anti-CD4, anticuerpo anti-CD16, anticuerpo anti-CD19, anticuerpo anti-CD8, anticuerpo anti-CD16, y anticuerpo anti-CD19. Las composiciones para la separación de células pueden contener anticuerpos contra los antígenos de células superficiales de otros tipos de células (por ejemplo, proteínas de células superficiales, de células tumorales) . Los anticuerpos contra antígenos de células superficiales pueden incluirse en una composición para la separación de células ya sea en una o ambas formas solubles y ligadas al sustrato. Los anticuerpos pueden estar ligados a sustratos como micro partículas de látex, partículas mordentadas con ácido, polipéptidos ligados, polisacáridos , partículas de avidina o partículas de gel de agarosa biotinilado. Los anticuerpos en las composiciones para la separación de células pueden ser monoclonales, y pueden ser anticuerpos IgM o IgG. En algunas modalidades, una composición para la separación de células contiene anticuerpos anti-humanos . La concentración de un anticuerpo soluble en una composición para la separación de células puede ser aproximadamente 0.01 mg/L a aproximadamente 15 mg/L. Los anticuerpos ligados al sustrato pueden incluirse en una composición para la separación de células a una concentración aproximada entre 50.0 x 109 partícula /l. Las composiciones para la separación de células también pueden contener heparina, cationes equivalentes (por ejemplo, Ca2+, g2+) y solución salina de amortiguador fosfato. En algunas modalidades, las composiciones tienen un pH entre 6.8 y 7.8 (por ejemplo entre 7.2 y 7.4) . La invención también proporciona equipos que contienen componentes para una composición para la separación de células y material de empaque. Los equipos incluyen un recipiente recolector de sangre como una bolsa de sangre o un termo o tubo al vacío . A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos que se usan aquí tienen el mismo significado como lo entendería una persona con experiencia ordinaria en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque los métodos y materiales similares o equivalentes a los que aquí se describen pueden usarse poner en práctica la invención, se describen a continuación métodos adecuados. Todas las publicaciones, las solicitudes de patente y otras referencias que aquí se mencionan se incorporan como referencia en su totalidad. En caso de conflicto, la presente especificación incluyendo las definiciones, serán las que controlen. Además los materiales, métodos, y ejemplos, son ilustrativos y están limitados . Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y a partir de las reivindicaciones .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS O FIGURAS La Figura 1 es una gráfica del porcentaje de recuperación de las células T de CD4 de las muestras de sangre . La Figura 2 es una gráfica del porcentaje de pureza de células T de CD4 recuperadas de las muestras de sangre . La Figura 3 es una gráfica del porcentaje de recuperación de las células T de CD8 de las muestras de sangre . La Figura 4 es una gráfica del porcentaje de pureza de células T de CD8 recuperadas de las muestras de sangre. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención describe composiciones y métodos para la separación de células. Las composiciones de la invención pueden usarse selectivamente para aglutinar células de muestras que contienen células sanguíneas. Las composiciones pueden aglutinar células mediante antígenos de células superficiales y/o por la expresión estimulada de los factores de adhesión de las células superficiales como LFA-1 (Antigeno-1 asociado a la función linfocito, d CDlla/CD18) y ICAM-1 (Molécula -1 de adhesión intercelular, CD54) , sin estar ligadas a un mecanismos en particular de la invención. Las células aglutinadas se separan de las células sin aglutinar, que permanecen en solución. Las células se pueden recuperar del supernadante o del aglutinado .

Composiciones para la separación de células Una composición para la separación de células según la invención puede contener dextrano y uno o más anticuerpos contra (por ejemplo, que- tenga una afinidad de unión específica) a un antígeno de célula superficial. El dextrano es un polisacárido que consiste de unidades de glucosa unidas predominantemen e en el modo alfa (1 a 6) . El dextrano puede provocar la acumulación de eritrocitos (por ejemplo la formación rouleu y por lo tanto facilitar la eliminación de células eritroideas de la solución. Típicamente, la concentración de dextrano en una composición para la separación de células es de 10 a 20 g/L (por ejemplo 20 g/L) . Los anticuerpos contra los antígenos de células superficiales pueden facilitar la eliminación de células sanguíneas de la solución mediante la aglutinación hematopoyética (por ejemplo la aglutinación de células del mismo tipo de células) y/o la aglutinación heterotípica (por ejemplo, la aglutinación de células de diferentes tipos) . Las composiciones para la separación de células pueden contener anticuerpos contra antígenos de células superficiales de sangre incluyendo por ejemplo, glicoforina A, CD15, CD , CD2, CD3 , CD4 , CD8,CD72, CD16, CD41a, HLA clase I, HLA-DR, CD29, CDlla, CDllb, CDllc, CD19, CD20, CD23, CD39, CD40, CD43 , CD44, CDw49d, CD53 , CD54, CD62L, CD63 , CD66, CD67, CD81, CD82, CD94 , CD99, CD100, CD161, Leu-13, TPA-1, Ig superficial y sus combinaciones. Así, Las composiciones para la separación de las células se pueden formular para aglutinar selectivamente tipos particulares de células sanguíneas. En algunas modalidades, una composición para la separación de células incluye anticuerpos contra glicoforina A. Típicamente, la concentración de anti-glicoforina A en una composición para la separación de células está dentro del intervalo de 0.1 a 15 mg/L (por ejemplo, 0.1 a 10 mg/L, 1 a 5 mg/L o 1 mg/L) . Los anticuerpos anti-glicoforina A pueden facilitar la eliminación de células rojas de la solución mediante al menos dos mecanismos. Los anticuerpos anti-glicoforina A pueden provocar aglutinación homo típica de eritrocitos ya que la glicoforina A es la glicoproteína superficial mayor en los eritrocitos. Además, los anticuerpos anti-glicoforina A pueden también estabilizar la formación rouleau mediada por dextrano. Los modelos de anticuerpos anti-glicoforina A monoclonales, incluyen sin ser una limitación, 107FMN (Isotipo IgM murino) , YTH89.1 (Isotipo IgG2b de rata) y E4 (Isotipo IgM murino) . Ver e emplo. M. Vanderlaan y colaboradores. Molecular Immunology volumen 20, página 1353 (1983); Telen M.J. y Bolk, T.A. Transfusión volumen 27, página 309 (1987); y Outram S. y colaboradores, Leukocyte Research volumen 12, página 651 (1988) . En algunas modalidades, una composición para la separación de células incluye anticuerpos contra CD15. La concentración de anticuerpos anti-CD15 en una composición para la separación de células puede estar dentro del intervalo de 0.1 a 15 mg/L (por ejemplo, 0.1 a 10, 1 a 5, o 1 mg/L) Los anticuerpos anti-CD15 pueden causar aglutinación homotípica de granulocitos por entrecruzamiento de moléculas CD15 que están presentes en la superficie de granulocitos. Los anticuerpos anti-CD15 también pueden causar aglutinación homotípica y heterotípica de granulocitos con monocitos, las células NK y las células B mediante la expresión estimulada de las moléculas de adhesión (por ejemplo, L-selectin y beta-2-integrin) en la superficie de granulocitos que interactúan con moléculas de adhesión en monocitos. Las células NK y las células B. La aglutinación heterotípica de estos tipos de células puede facilitar la eliminación de estas células de la solución junto con los componentes de las células rojas. Los modelos de anticuerpos anti-CDl5 monoclonales incluyen sin limitación, AHN1.1 (Isotipo IgM murino) , FMC-10 (Isotipo IgM murino) , BU-28 (Isotipo IgM murino) , MEM-157 (Isotipo IgM murino) , MEM-158 (Isotipo IgM murino) , MEM-167 (Isotipo IgM murino) . Ver ejemplo Leukocyte typing IV(1989) ; Leukocyte typing 11(1984) ; Leukocyte typing VI (1995) ; Solter D. y colaboradores, Proc . Nati. Acad. Sci . USA volumen 75, página 5565 (1978) ; Kannagi, R. y colaboradores, J. Biol . Chem. Volumen 257 página 14865 (1982); Magnani. J.L. y colaboradores Archives of Biochemistry and Biophysics volumen 233, página 501 (1984) ; Eggens, I. y colaboradores, J. Biol. Chem. volumen 246 página 9476 (1989) . En algunas modalidades, una composición para la separación de células incluye anticuerpos contra CD9 (por ejemplo a un intervalo de concentraciones de 0.1 a 15, 0.15 a 10, 1 a 5 o 1 mg/L) . Los anticuerpos anti-CD9 pueden causar aglutinación homotípica de plaquetas. Los anticuerpos anti-CD9 pueden causar aglutinación heterotípica de granulocitos y monocxtos mediante plaquetas adheridas a la superficie de los granulocitos y monocitos. Los anticuerpos CD9 pueden promover la expresión de plaqueta-l-selectin el cual facilita la unión de plaquetas a la superficie celulares de leucocitos. Así, los anticuerpos anti-CD9 pueden promover uniones célula a célula múltiples y por lo tanto facilitar la aglutinación y eliminación de la solución. Los modelos de anticuerpos anti-CD9 incluyen sin limitación, MEM-61 (isotipo IgGl murino) , ME -62 (isotipo IgGl murino) , MEM-192 (isotipo IgM murino) , FMC-8 (isotipo IgC2a murino) , SN4 (Isotipo IgGl murino) , BU-16 (isotipo IgG2a murino) . Ver ejemplo, Leukocyte typing VI (1984); Leukocyte typing 11(1984); Von dem Bourne A.E. G. Kr. y Moderman P. N. (1989) en Leukocyte typing IV (Ed. W. Knapp, y colaboradores) páginas 989-92. Oxford University Press, Oxford; Jennings, L.K. y colaboradores; En Leukocyte typing V Ed. S.F. Schlossman y colaboradores, páginas 1249-51. Oxford University Press, Oxford (1995) ; Lanza, F. y colaboradores, J. Biol . Chem, volumen 266 página 10638 (1991); Wright y colaboradores, Immunology Today volumen 15, página 588 (1994); Rubinstein, E. y colaboradores, Seminars in Thromobosis and Hemostasis volumen 21, página 10 (1995) . En algunas modalidades, una composición para la separación de células contiene anticuerpos contra CD41 puede aglutinar plaquetas selectivamente. En algunas modalidades, una composición para la separación de células contiene anticuerpos contra CD3 puede aglutinar células T selectivamente. En algunas modalidades una composición para la separación de células contiene anticuerpos contra CD2 puede aglutinar células T y células NK selectivamente. En algunas modalidades, una composición para la separación de células contiene anticuerpos contra CD72 puede aglutinar células B selectivamente. En algunas modalidades, una composición para la separación de células contra CD16, puede aglutinar células NK y granulocitos neutrófilos selectivamente. La concentración de cada uno de los anticuerpos puede variar en un intervalo de 0.01 a 15 mg/L. En otras modalidades, una composición para la separación de las células incluye anticuerpos contra CD94 y CD161 puede aglutinar subconjuntos de células NK selectivamente. El clon HP-3D9 es un ejemplo de un anticuerpo anti-CD94. El clon B199.2 es un ejemplo de un anticuerpo anti-CD161 adecuado. Los anticuerpos monoclonales anti-CD94 y anti-CD161 son particul rmente útiles. Típicamente, las concentraciones de cada uno de estos anticuerpos están dentro del intervalo de 0.01 mg/1 a 10 mg/L (por ejemplo, 0.1 a 5, 0.1 a 2.5, 0.1 a 1.5 mg/L). Por ejemplo, la concentración de anticuerpo anti-CD4 puede ser 0.125 a 0.25 mg/L. La concentración de un anticuerpo anti-CD161 puede ser 0.25 a 1 mg/L. Como se mencionó antes, las composiciones para la separación de células pueden estar formuladas para aglutinar selectivamente células sanguíneas particulares.

Como un ejemplo, una composición para la separación de las células contiene dextrano y anticuerpos contra glicoforina A, CD15 y CD9 pueden facilitar la aglutinación de eritrocitos, granulocitos, células NK, células B y plaquetas. Las células T, las células NK y las células de precursores inusitados pueden eliminarse de la solución. Si la formulación también contuviera un anticuerpo contra CD3 , las células T también podrían aglutinarse y las células NK y los precursores inusitados podrían eliminarse de la solución. En otras modalidades, una composición para la separación de las células incluye dextrano y anticuerpos contra glicoforina A, CD15, CD9, CD94 y CD161 tales como eritrocitos, granulocitos, células NK, células N y plaquetas se aglutinan y las células T y las células precursoras inusitadas pueden recuperarse de la solución.

Para obtener poblaciones de Células T de CD4, los anticuerpos anti-CD8, los anticuerpos anti-CD16 y los anticuerpos anti-CD19 pueden incluirse en la composición. Para obtener poblaciones purificadas de células T de CD8, los anticuerpos anti-CD4, los anticuerpos anti-CD16, y los anticuerpos anti-CD19 pueden incluirse en la composición. Los ejemplos ilustrativos de anticuerpos anti-CD4 adecuados incluyen clones QS4120, RPA-T4, S3.5, M-T441, RTF-4 y 13B8.2. Los ejemplos ilustrativos de anticuerpos anti-CD8 adecuados incluyen clones HIT8a, UCHT4 y RPA-T8. El clon 3G8 es un ejemplo de un anticuerpo anti-CD16. Los ejemplos ilustrativos de anticuerpos anti-CD19 incluyen clones HIB19 y BU12. G Las composiciones para la separación de células pueden contener anticuerpos contra antígenos de la superficie de otro tipo de células (por ejemplo, proteínas de la superficie celulares de las células tumorales) . Aquellos con experiencia en la técnica usan métodos rutinarios para preparar anticuerpos contra antígenos de las superficie celular de sangre y otras células de humanos y otros mamíferos, incluyendo por ejemplo, primates no humanos, roedores (por ejemplo ratones, ratas, hámster, conejos y cobayos) porcinos, bovinos y equinos. Típicamente, los anticuerpos usados en las composiciones son anticuerpos monoclonales los cuales son poblaciones homogéneas de anticuerpos de un epítopo particular contenido dentro de un antígeno. Los anticuerpos monoclonales adecuados están disponibles comercialmente o pueden ser preparados empleando tecnología de hibridoma estándar. En particular, los anticuerpos monoclonales se pueden obtener por técnicas que proporcionan la producción de moléculas de anticuerpos mediante estirpes celulares continuas en un cultivo incluyendo la técnica descrita por Kohler, G. y colaboradores, Nature, 1975, volumen 256 página 495, la técnica de hibridoma de células B humanas (Kosbor y colaboradores, Immunology Today volumen 4, página 72 (1983) ; Colé y colaboradores, Proc . Nati, Acad. Sci. USA volumen 80, página 2026 (1983)) y la técnica de Hibridoma EBV (Colé y colaboradores, "Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, " Alan R. Liss, Inc. páginas 77-96 (1983)). Los anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulinas incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cualquiera de sus subconjuntos . Los anticuerpos de los isotipos IgG e IgM son particularmente útiles en las composiciones para la separación de las células de la invención. Los anticuerpos IgM pentaméricos contienen más sitios de unión al antígeno que los anticuerpos IgG y pueden, en algunos casos (por ejemplo, antiglicoforina A y anti-CD15) ser particularmente útiles para los reactivos de separación de las células. En otros casos (por ejemplo, los anticuerpos anti-CD9) los anticuerpos del isotipo IgG son particularmente útiles para estimular la aglutinación homotípica y heterotípica . Los anticuerpos contra los antígenos de la superficie celular pueden proporcionarse en fase líquida (por ejemplo, soluble) o pueden proporcionarse en asociación con la fase sólida (por ejemplo, ligados al sustrato) . Los anticuerpos de la fase líquida típicamente se proporcionan en una composición para la separación de células a una concentración aproximadamente entre 0.01 y aproximadamente 15 mg/L (por ejemplo 0.25 a 10, 0.25 a 1, 0.5 a 2, la 2, 4 a 8, 5 a 10 mg/L) . Los anticuerpos ligados al sustrato típicamente se proporcionan en una composición para la separación de células en una concentración aproximadamente entre 0.1 y aproximadamente 50.0 x 109 partículas, (por ejemplo, 0.25 a 10.0 x 109, 1 a 20.0 x 109 , 2 a 10.0 x 109, 0.5 a 2 x 109 , 2 a 5 x 109, 5 a 10 x 109, y 10 a 30 x 109 partículas/L en donde las partículas se refieren a partículas de fase sólida que tienen anticuerpos adheridos a ellas. Los anticuerpos contra diferentes antígenos de superficies celulares pueden estar ligados covalentemente a la fase sólida para promover el entrecruzamiento de moléculas de superficie celulares y la activación de moléculas de adhesión de superficies celulares. El uso de anticuerpos ligados al sustrato puede facilitar la separación celular (por ejemplo, por virtud de la masa con la que contribuyen las partículas a aglutinar las células o por virtud de la propiedades útiles para purificación) . En algunas modalidades, la fase sólida con la cual un anticuerpo ligado al sustrato se asocia está particulada. En algunas modalidades, un anticuerpo está ligado a una micropartícula de látex como una perla paramagnética (por ejemplo, mediante la unión biotina-avidina, unión covalente a grupos COO en perlas de poliestireno o unión covalente a grupos NH2 en perlas modificadas) . En algunas modalidades, un anticuerpo está ligado a una partícula de vidrio mordentadas con ácido (por ejemplo, mediante la unión biotina-avidina) . En algunas modalidades, un anticuerpo está ligado a un polipéptido agregado como la albúmina de suero bovino agregado (por ejemplo, mediante la unión biotina-avidina, o unión covalente a grupos C00 de polipéptidos o grupos ??2) . En algunas modalidades, un anticuerpo está unido covalentemente a un polisacárido como un sulfato de dextrano de peso molecular alto (por ejemplo, >1, 000, 000 Mr) . En algunas modalidades, anticuerpos biotinilados se ligan a partículas de avidina, creando complejos tetraméricos que tienen cuatro moléculas de anticuerpos por molécula de avidina. En algunas modalidades, los anticuerpos están ligados a partículas de gel de agarosa biotinilado (One Cell Syste s , Cambridge, MA, U.S.A.) vía uniones de anticuerpos biotin-avidin-biotinilados . Dichas partículas típicamente tienen un tamaño aproximado de 300-500 micrones, y pueden crearse en un baño de agua expuesto a ultrasonidos o en un baño de agua mezclado rápidamente. Las partículas de sustrato celular (por ejemplo, partículas incluyendo células y anticuerpos ligados al sustrato) pueden sedimentarse en una solución como un aglutinado. Las partículas de sustrato celular pueden también eliminarse de la solución por medio de por ejemplo un campo magnético, cuando la partícula es una perla paramagnética . Las composiciones para la separación de células también contiene cationes divalentes (por ejemplo, Ca2+ y Mg2+) . Los cationes divalentes pueden proporcionarse, por ejemplo, mediante una solución salina equilibrada (por ejemplo, solución salina equilibrada de Hank) . Los iones Ca2+ pueden ser importantes para la adherencia célula a célula en donde el integrin actúa como mediador y en donde el selectin actúa como mediador. Las composiciones para la separación de células de la invención también pueden contener un anticoagulante como heparina. La heparina puede prevenir la coagulación y la pérdida de células no específicas asociadas con la coagulación en un ambiente rico en calcio. La heparina también promueve la aglutinación de plaquetas . Las plaquetas aglutinadas pueden adherirse a granulocitos y monocitos y por lo tanto mejorar la aglutinación heterotípica más que las plaquetas solas. La heparina puede suministrarse como una sal de heparina (por ejemplo, heparina de sodio, heparina de litio, o heparina de potasio) .

Métodos de separación de células Las composiciones descritas pueden usarse, por ejemplo para preparar eficientemente células de un histocultivo, caracterización inmunofenotipica, pruebas de diagnóstico, además de purificación y administración terapéutica. Sin estar ligadas a un mecanismo en particular, las composiciones de la invención pueden selectivamente aglutinar células via interacción con los antigenos de la superficie celular y/o estimulación de la adherencia célula-célula (por ejemplo, por medio de la expresión acumulada de factores de adhesión de superficie celular. Las células aglutinadas se separan de las células sin aglutinar las cuales permanecen en solución. Después de la aglutinación, las células sin aglutinar pueden recuperarse de la fase de la solución (por ejemplo, el sobrenadante) . En modalidades en las que uno o más anticuerpos biotinilados se usan, el sobrenadante puede ponerse en contacto con una composición que contenga partículas recubiertas de avidina o estreptavidina (por ejemplo perlas magnéticas) para agotar más el sobrenadante de las células indeseables . Después de mezclar el sobrenadante con la composición, las perlas pueden separarse del sobrenadante (por ejemplo, al aplicar un magneto) y las células se pueden eliminar del sobrenadante. Las células también se pueden recuperar del aglutinado. Las células aglutinadas pueden disociarse por ejemplo al transferir las células a buffers que contengan cationes di alentes, quelante como EDTA o EGTA. Las células recuperadas del aglutinado pueden separase además empleando anticuerpos contra los antígenos de la superficie celular. Las células pueden recuperarse de un gel aglutinado de células-anticuerpo- micropartículas calentando el aglutinado a una temperatura justo arriba del punto de fusión. La composiciones descritas pueden usarse para separa células de una variedad de células sanguíneas que contengan muestras, incluyendo sangre periférica (por ejemplo, obtenida por venipunción) , sangre del cordón umbilical (por ejemplo obtenida después del parto) y médula ósea (por ejemplo aspirado) . Las muestras que contienen células sanguíneas pueden ponerse en contacto con una composición para la separación de las células para provocar la aglutinación de células de tipos particulares. Por ejemplo, los eritrocitos y los constituyentes sanguíneos mielocíticos diferenciados pueden ser aglutinados selectivamente empleando composiciones para la separación de células que contienen anticuerpos a antígenos superficiales de estas células. Las composiciones y composiciones reveladas puede ser usadas para aislar y enriquecer una variedad de tipos de células incluyendo por ejemplo, linfocitos T, células colaboradoras T, células supresoras T, células B, hemocitoblastos hematopoyéticos , células fetales circulatorias en la circulación materna, y células tumorales metastásicas circulatorias . Las composiciones reveladas pueden usarse para glutinar células de cualquier mamífero, incluyendo humanos, primates no humanos, roedores, porcinos, bovinos, y equinos . Las composiciones y los métodos descritos pueden usarse en el contexto de autoinjertos y transplantes autólogos. En el contexto del transplante autólogo, las composiciones y los métodos revelados pueden usarse, por ejemplo, para eliminar células indeseables como las células cancerígenas metastásicas de la sangre o la médula ósea de un paciente. Las células deseables (por ejemplo, hemocitoblastos) luego pueden ser devueltas al paciente sin o prácticamente libres, de células tumorales potencialmente mortales) . Las composiciones para la separación de células contenían anticuerpos contra las proteínas de la superficie celular de las células tumorales para purgar células tumorales de la sangre o la médula ósea de un paciente. Dichas composiciones también pueden usarse en procedimientos de diagnóstico por ejemplo, para obtener y detectar células tumorales en un aglutinado donde se concentran y son por lo tanto más fácilmente detectables que en la sangre que circula o en la médula ósea. Una composición para la separación de las células contienen anticuerpos contra el receptor del factor de crecimiento epitelial puede usarse para aglutinar células tumorales provenientes de tumores epiteliales (por ejemplo, los tumores de la cabeza o el cuello) Una composición para la separación de células que contiene anticuerpos contra receptores de estrógenos puede usarse para glutinar células tumorales provenientes de tumoraciones de las mamas o del ovario . Una composición para la separación de células que contiene anticuerpos contra inmunoglobulinas superficiales puede usarse para aglutinar células tumorales asociadas con leucemia linfocítica crónica, plasmacitoma y mieloma múltiple o enfermedad de Kahler. Las células ce carcinoma de mama expresan CD15 en su superficie celular y pueden purgarse usando combinaciones para la separación de células que contienen anticuerpos contra CD15. Otras fórmulas pueden hacerse con base al tipo de célula y las proteínas de la superficie celular para obtener o agotar células tumorales metastásticas provenientes de otros carcinomas (por ejemplo, eritroleucemia, carcinoma endotelial o carcinoma gastrointestinal) de la sangre o médula ósea de un paciente.

Equipos para la separación de células Una composición para la separación de células puede combinarse con material de empaque y venderse como un equipo. Los componentes de una composición para la separación de las células pueden empacarse en forma individual o en combinación con otros . En algunas modalidades, el material de empaque incluye contenedores recolectores de sangre (por ejemplo, bolsa de sangre, termo) . El material de empaque incluido en un equipo típicamente contiene instrucciones o una etiqueta que describe como la composición para la separación de las células puede usarse para aglutinar tipos de células particulares . Los componentes y métodos para producir los equipos son bien conocidos . La invención además describe los siguientes ejemplos que no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Separación de células sanguxneas Este ejemplo describe el método general por el cual se separan las células usando reactivos para la separación de las células descritos a continuación. Un volumen igual de un reactivo de separación de células (por ejemplo 25 mi) se combinó con un volumen igual de una muestra de sangre periférica (por ejemplo, 25 mi) eparinizada anti coagulada con ácido etilen diaminotetracético (EDTA) en un tubo cónico de 50 mi. Las muestras que contienen cifra de leucocitos mayores de 20 x 10s células/ml se combinaron una parte de sangre con dos partes de reactivo de separación de células . Los tubos se mezclaron suavemente en una plataforma oscilante de 20 a 45 minutos a temperatura ambiente. Los tubos se colocaron verticalmente en una gradilla de 30 a 50 minutos para permitir que las células aglutinadas se separen de las células sin aglutinar, que permanecen en la solución. Sin perturbar el aglutinamiento, se usó una pipeta para recuperar las células sin aglutinar del sobrenadante. Las células recuperadas se lavaron en 25 mi de PBS (sulfuro de plomo) y centrifugaron a 500 x g durante 7 minutos. El sedimento celular se resuspendio en 4 mi de PBS. En las modalidades en las cuales uno o más anticuerpos son biotinilados, se añadieron perlas magnéticas recubiertas de avidina al sobrenadante (1 mL de la muestra inicial) . Las perlas y el sobrenadante se mezclaron en una plataforma oscilante durante 20 minutos. Las perlas y las perlas unidas a las células indeseables se eliminaron al colocar el tubo que contenia la mezcla en un PrepaMag ™ durante 5 minutos. Las perlas y las perlas unidas a las células indeseables se tomaron de los lados del tubo. Una pipeta se usó para eliminar el líquido del centro y del fondo de cada tubo, con cuidado de no perturbar las perlas y las células de los lados del tubo. Las células también se recuperaron del aglutinado empleando una solución hipotónico de lisis que contiene EDTA y ácido etilen glicol-bis (2-aminoetiléter) -N, N,N, N' -tetracético (EGTA) . Las células aglutinadas se trataron con 25 mi de VitalLyse™ (BioErgonomics , St . Paul, MN.) y se colocaron en una agitadora vortical. Después de 10 minutos, las células ya se expusieron a un campo magnético para recuperar células asociadas con anticuerpos unidos a perlas paramagnéticas o se centrifugaron a 500 x g durante 7 minutos y se eliminó el sobrenadante. En cualquier caso, las células se resuspendieron en 4 mi de PBS . Las recuperaciones de los eritrocitos, leucocitos, linfocitos, monocitos granulocitos , células colaboradoras T y células NK se determinaron por citometría de flujo e inmunofenotipia. Antes de la citometría de flujo, la recuperación de leucocitos (por ejemplo, cifra de leucocitos) se determinó usando un analizador de hematología Coulter Onyx, y las muestras se ajustaron con PBS a una cifra de leucocitos de 1 x 107 células/mL. Las alícuotas de 10 µ? de la muestra ajustada al volumen se marcaron a temperatura ambiente en la oscuridad de 15 a 30 minutos con anticuerpos anti-CD3 marcados con FITC (reactivo para las células T) , anticuerpos anti-CD19 marcados con PE (reactivo para células B) o anticuerpos anti-CD16 marcados con PE (reactivo para células NK) . Se agregaron 2 mi de PBS a cada muestra y la muestra luego agitó en un vortex (agitadora vortical) y se centrifugó hasta el punto de sedimento celular. Los sobrenadantes se descartaron y los sedimentos celulares se agitaron en un vortex y se resuspendieron en 0.5 mi de PBS . Las células marcadas y sin marcar se analizaron por citometría de flujo usando un citómetro de fluidos Coulter XL. Los eritrocitos, leucocitos, linfocitos, monocitos, granulocitos y plaquetas se identificaron con base a las propiedades de dispersión de luz frontal y lateral de diagnóstico. Las células B, T y NK se identificaron con base a la dispersión de la luz y el mareaje con anticuerpos marcados.

Ejemplo 2: Aglutinación de eritrocitos . El reactivo descrito en la Tabla 1 se usó para separar las células según el método descrito en el ejemplo 1.

Tabla 1 Los resultados de una separación se muestran en la Tabla 2. Se agotaron los eritrocitos un 99.7% del sobrenadante. Los linfocitos (células T, B y NK) se enriquecieron en el sobrenadante con respecto a monocitos y granulocitos . Tabla 2 Ejemplo 3: Aglutinación de eritrocitos y de células CD2+ Los reactivos descritos en la Tabla 3 se emplearon para separar las células según el método descrito en el ejemplo 1.

Tabla 3 Los resultados de una separación se muestran en la Tabla 4. En el sobrenadante se agotaron los eritrocitos un 99.7%, las células T se agotaron un 95.1% y las células NK se agotaron un 69.1%. Las células B se enriquecieron en el sobrenadante con respecto a otras células .

Tabla 4 Ejemplo 4: Aglutinación de eritrocitos y células CD72+ El reactivo descrito en la Tabla 5 se emplearon para separar las células según el método descrito en el e emplo 1. Tabla 5 Los resultados de una separación se muestran en la Tabla 6. En el sobrenadante se agotaron los eritrocitos un 99.5%, las células B se agotaron un 81.6%. Tabla 6 Ejemplo 5: Aglutinación De eritrocitos, células CD15+ y células CD9+. El reactivo descrito en la Tabla 7 se usó para separar células según el método descrito en el ejemplo 1.

Tabla 7 Los resultados de la separación se muestran en la Tabla 8. En el sobrenadante, los eritrocitos se agotaron un 99.9%, los monocitos y granulocitos se agotaron un 99.8%, las células B se agotaron un 74% y las células NK se agotaron un 64.9%. Además, las plaquetas presentes en el sobrenadante a 226 x 10s/ml antes de la separación, se agotaron a 1.4 x 106/ml con un agotamiento de 99.4%.

Tabla 8 Antes de la separación Después de la separación Eritrocitos por mL 4.41 x 109 0.006 x 109 Leucocitos por mL 5.9 x 106 1.53 x 106 Linfocitos (%) 28.7 99.0 Monocitos (%) 8.69 0.12 Granulocitos (%) S2.5 0.083 Células T (CD3+) 19.7 83.2 Células B (CD19+) 4.46 8.10 Células NK (CD16+) 3.15 8.43 Ejemplo 6: Aglutinación de eritrocitos, células CD15+, células CD9+ y CD2+. El reactivo descrito en la Tabla 9 se usó para separar células según el método descrito en el ejemplo 1.

Tabla 9 Los resultados de una separación se muestran en la Tabla 10. En el sobrenadante, los eritrocitos se agotaron un 99.9%, los monocitos y granulocitos se agotaron un 99.9%, las células B se agotaron 16.8%, las células NK se agotaron un 29% y las células T se agotaron un 91.5%. Además, las plaquetas presentes en el sobrenadante a 226 x 10s/mL antes de la separación se agotaron a 0.3 x 106/ml para un agotamiento del 99.9%.

Tabla 10 Ejemplo 7: Aglutinación de eritrocitos, células CD15+, células CD9+ y células CD72+. El reactivo descrito en la tabla 11 se empleó para separar las células según el método descrito en el ej emplo 1. Tabla 11 Los resultados de una separación se muestran en la Tabla 12. En el sobrenadante, los eritrocitos se agotaron un 99.9%, los monocitos se agotaron más allá de la detección, los granulocitos se agotaron un 99.97%, las células T se agotaron un 99.97%, las células B se agotaron un 97.2%, las células NK se agotaron un 54.9%. Además las plaquetas, presentes en el sobrenadante a 226 x 10e/mL antes de la separación, se agotaron a 0.1 x 10s/ mL para un agotamiento del 99.96%. Tabla 12 Ejemplo 8: Aglutinación de eritrocitos, células CD15÷, células CD9+, células CD19+ y células CD16+. El reactivo descrito en la tabla 13 se empleó para separar las células según el método descrito en el ejemplo 1. Las células T y las células CD3+ se recuperaron del sobrenadante . Las células B y los granulocitos se recuperaron del aglutinado.

Tabla 13 Ejemplo 9: Aglutinación de eritrocitos, células CD15+, células CD9+, células CD19+,células CD16+ y células CD4+. El reactivo descrito en la Tabla 14 se empleó para separar células según el método descrito en el ejemplo 1. Las células CD8+ se recuperaron del sobrenadante.

Tabla 14 Ejemplo 10: Aglutinación de eritrocitos, células CD15+, células CD9+, células CD19+, células CD16+ y células CD8+. El reactivo descrito en la Tabla 15 se empleó para separar células según el método descrito en el ejemplo 1. Las células CD4÷ se recuperaron del sobrenadante .

Tabla 15 Ejemplo 11: Aglutinación de eritrocitos, células CD15+, células CD9+, células CD19 y células CD2+. El reactivo descrito en la Tabla 16 se empleó para separar células según el método descrito en el ejemplo 1. Las células CD34+ se recuperaron del sobrenadante a una pureza >50% y con un rendimiento >80%.

Tabla 16 Ejemplo 12: Aglutinación de eritrocitos, células CD15+, células CD9+, células CD2+, y células CD16+. El reactivo descrito en la Tabla 17 se empleó para separar células según el método descrito en el ejemplo 1. Las células B se recuperaron del sobrenadante .

Tabla 17 Ejemplo 13: Aglutinación de eritrocitos, células mielocíticas maduras, células NK y células B. El reactivo descrito en la Tabla 18 se empleó para separar células según el método descrito en el ejemplo 1. Se usó ácido clorhídrico (4N) o hidróxido de sodio (4N) para ajustar el pH entre 7.2 y 7.4. Los anticuerpos anti- CD8 , CD16, CD19, CD94 y CD161 se biotinilaron . Una célula enriquecida para células T de CD4 se obtuvieron del sobrenadante. Aproximadamente, del 75 al 94% de las células CD4 se recuperaron de cada muestra completa de sangre (la Fig.l proporciona datos representativos de cinco donadores) . En comparación, la recuperación de células fue 50% o menor en otros productos disponibles comercialmente que usaron la separación con gradiente de densidad. En promedio, la pureza de las células CD4 fue de 96.1% (ver la Figura 2, con datos representativos de 12 donadores) , mientras que la pureza promedio fue de 86.7% para las células CD4 purificadas usando otros productos disponibles comercialmente que usan la separación con gradiente de densidad. Tabla 18 Ejemplo 14: Aglutinación de eritrocitos, células mielocítícas maduras, células NK, y células B. El reactivo descrito en la Tabla 19 se empleó para separar células según el método descrito en el ejemplo 1. Se usó ácido clorhídrico (4N) o hidróxido de sodio (4N) para ajustar el pH entre 7.2 y 7.4. Los anticuerpos anti- CD4, CD16, CD19, CD94 y CD161 se biotinilaron. Una suspensión de células enriquecida para células T de CD8 se obtuvo del sobrenadante. Aproximadamente del 53 al 81% de las células CD8 se recuperaron de cada muestra completa de sangre (la Figura 3 proporciona datos representativos de cinco donadores) . En comparación, en otros productos disponibles comercialmente que requirieron la separación con gradiente de densidad, la recuperación de células fue menor que 52% y más típicamente la recuperación de células fue menor que 35%. En promedio, la pureza de las células CD8 fue de 93.9% (ver la Figura 4, con datos representativos de 12 donadores) , mientras que la pureza promedio de otros productos disponibles comercialmente fue 84.2% para células CD8 purificadas. Tabla 19 Dextrano (peso molecular promedio 413, 000) 2% Heparina de sodio (10,000 unidades/mL) 1 ü/L Solución de salina equilibrada de Hank (pH 7.2-7.4) A volumen final Glicoforina A anti humana (anticuerpo monoclonal IgM Dilución 1:40 murino, clon E4) Anti CD15 (anticuerpo monoclonal IgM murino, clon MEM- 1 mg/L) 158) Anti CD9 (anticuerpo monoclonal IgM murino, clon MEM- 1 mg/L 61) CD4 anti-humano (clon QS4120) 1 mg/L CD16 anti-humano (clon 3G8) 1 mg/L CD19 anti-humano (clon HIB19) 1 mg/L CD94 anti-humano (clon HP-3D9) 0.25 mg/mL CD161 anti-humano (clon B199.2) 1 g/mL OTRAS MODALIDADES Mientras la invención se describe en conjunto con la anterior descripción detallada y los ejemplos, esa descripción detallada y los ejemplos tienen la intención de ilustrar y no limitar el alcance de la invención definida por el alcance de las reivindicaciones anexas . Otros aspectos, ventajas y modificaciones quedan dentro del alcance de las reivindicaciones.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES ; 1. Una composición que comprende: a) dextrano; b) anticuerpo anti-glicoforina A; c) anticuerpo anti-CD15; d) anticuerpo anti-CD9; e) anticuerpo anti-CD94; y f) anticuerpo anti-CD161. 2. La composición de la reivindicación 1, al anticuerpo anti-CD72. 3. La composición de la reivindicación 1, en donde la composición además comprende al anticuerpo anti-CD4, anticuerpo anti-CD16, y anticuerpo anti-CD19. 4. La composición de la reivindicación 1, en donde la composición además comprende al anticuerpo anti- CD8, anticuerpo anti-CD16, y anticuerpo anti-CD19. 5. La composición de la reivindicación 1, en donde la composición además comprende al anticuerpo anti-CD2. 6. La composición de la reivindicación 1 además comprende heparina. 7. La composición de la reivindicación 1, además comprende cationes divalentes . 8. La composición de la reivindicación 7, en donde los cationes divalentes son Ca2+. 9. La composición de la reivindicación 7, en donde los cationes divalentes son Mg2+. 10. La composición de la reivindicación 1, que además comprende solución salina amortiguadora de fosfatos. 11. La composición de la reivindicación 1, en donde el pH de la composición está entre 6.8 y 7.8. 12. La composición de la reivindicación 1, en donde el pH de la composición está entre7.2 y 7.4. 13. La composición de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo anti-glicoforina A es monoclonal. 14. La composición de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo anti-glicoforina A es un anticuerpo IgM o un anticuerpo IgC. 15. La composición de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo anti-glicoforina A es un anticuerpo anti-glicoforina A anti-humano. 16. La composición de la reivindicación 1, en donde la concentración de el anticuerpo anti-glicoforina A es aproximadamente 0.1 mg/L a aproximadamente 15 mg/L. 17. La composición de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo anti-CD15 es un anticuerpo monoclonal. 18. La composición de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo anti-CD15 es un anticuerpo IgM o un anticuerpo anti IgG. 19. La composición de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo anti-CD15 es un anticuerpo anti-CD15 anti-humano . 20. La composición de la reiv8indicación 1 en donde la concentración de el anticuerpo anti-CD15 es aproximadamente 0.1 mg/L a aproximadamente 15 mg/L. 21. La composición de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo anti-CD9 es un anticuerpo monoclonal. 22. La composición de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo anti-CD9 es un anticuerpo anti IgM o un anticuerpo IgG. 23. La composición de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo anti-CD9 es un anticuerpo CD9 antihumano . 2 . La composición de la reivindicación 1 en donde la concentración de el anticuerpo anti-CD9 es aproximadamente 0.1 mg/L a aproximadamente 15 mg/L. 25. La composición de la reivindicación 1 en donde la concentración de el anticuerpo anti-CD94 es aproximadamente 0.01 mg/L a aproximadamente 10 mg/L. 26. La composición de la reivindicación 1 en donde la concentración de el anticuerpo anti-CD161 es aproximadamente 0.1 mg/L a aproximadamente 15 mg/L. 27. La composición de la reivindicación 1 en donde la concentración de el anticuerpo anti-CD94 es un anticuerpo IgM o IgG. 28. La composición de la reivindicación 1 en donde el anticuerpo anti-CD161 es un anticuerpo IgM o IgG. 29. La composición de la reivindicación 1 en donde el anticuerpo anti-CD94 es un anticuerpo CD94 anti-humano . 30. La composición de la reivindicación 1 en donde el anticuerpo anti-CD161 es un anticuerpo CD161 anti-humano . 31. Una composición que comprende : a) dextrano; b) anticuerpo anti-glicoforina A; c) anticuerpo anti-CD15 ; d) anticuerpo anti-CD9; e) anticuerpo anti-CD94 o anticuerpo anti-CD8; f) anticuerpo anti-CD16 ; g) anticuerpo anti-CD19; h) anticuerpo anti-CD94; i) anticuerpo anti-CD161; j ) heparina; y k) cationes divalentes . 32. La composición de la reivindicación 31, en donde la composición contiene anticuerpo anti-CD4. 33. La composición de la reivindicación 31, en donde la composición contiene anticuerpo anti-CD8. 34. La composición de la reivindicación 31, en donde al menos uno de los anticuerpos está biotinilado. 35. La composición de la reivindicación 34, en donde el anticuerpo anti-CD16, el anticuerpo anti-CD19, el anticuerpo anti-CD94 y el anticuerpo anti-CD161 están biotinilados . 36. Un equipo que comprende un recipiente recolector de sangre y la composición para la separación de células de la reivindicación 31. 37. El equipo de la reivindicación 36, en donde el recipiente recolector de sangre es una bolsa de sangre. 38. El equipo de la reivindicación 36 en donde el recipiente recolector de sangre es un termo o tubo al vacio . 39. Un método para separar células, el método comprende : a) poner en contacto una muestra que contiene células sanguíneas con una composición, la composición comprende: i) dextrano; ii) anticuerpo anti-glicoforina A; iii) anticuerpo anti-CD15 iv) anticuerpo anti-CD9; v) anticuerpo anti-CD94 o anticuerpo anti-CD8; Vi) anticuerpo anti-CD16; b) permitir que la muestra se separe en una fase aglutinada y una fase de sobrenadante; c) recuperar las células. 40. El método de la reivindicación 39, en donde la composición además comprende anticuerpo anti-CD4, anticuerpo anti-CD16 y anticuerpo anti-CD19. 41. El método de la reivindicación 39, en donde la composición además comprende anticuerpo anti-CD8, anticuerpo anti-CD16 y anticuerpo anti-CD19. 42. El método de la reivindicación 39, en donde la muestra proviene de un humano. 43. El método de la reivindicación 42, en donde la muestra es una muestra de sangre periférica. 44. El método de la reivindicación 42, en donde la muestra es una muestra del cordón umbilical . 45. El método de la reivindicación 42, en donde la muestra es una muestra de médula ósea. 46. El método de la reivindicación 42, en donde las células son células de tumores metastásicos . 47. El método de la reivindicación 42, en donde la células se recuperan de la fase sobrenadante. 48. El método de la reivindicación 47, en donde las células son hemocitoblastos . 49. El método de la reivindicación 39 en donde el anticuerpo anti-CD94 y el anticuerpo anti-CD161 están biotinilados . 50. El método de la reivindicación 49, en donde la recuperación de las células comprende poner en contacto la fase sobrenadante con una composición que comprende partículas recubiertas de avidina, separar la fase sobrenadante y la composición y recuperar las células de la fase sobrenadante .