MXPA05002764A

MXPA05002764A - Deconstruccion viral a traves de montaje de capsido in vitro.

Info

Publication number: MXPA05002764A
Application number: MXPA05002764A
Authority: MX
Inventors: Vishwanath R Lingappa
Original assignee: Univ California
Priority date: 2002-09-13
Filing date: 2003-09-11
Publication date: 2005-06-06
Also published as: AU2003270579A1; EP1537205A2; WO2004025256A3; US20070087330A1; CA2498367A1; CN1714148A; JP2005538716A; WO2004025256A2

Abstract

La presente invencion se refiere a un metodo libre de cedula para traduccion y montaje de un capsido viral e intermediarios de capsido, para uso en la deconstruccion de un virus desconocido y para seleccionar compuestos que inhiben el montaje de capsidos virales para los virus desconocidos.

Description

DECONSTRUCCION VIRAL A TRAVES DE MONTAJE DE CAPSIDO IN VITRO Campo de la Invención La invención está relacionada con métodos y composiciones para identificar fármacos objetivos para inhibir la replicación viral y métodos y/o composiciones para prevenir y/o tratar la infección por un virus desconocido y/o sintético, particularmente un virus usado como un arma biológica .

Antecedentes de la Invención Las guerras biológicas pueden ser usadas para diezmar poblaciones humanas y destruir ganados y cultivos de significancia económica. Ataques terroristas recientes en los Estados Unidos y otras partes, se han enfocado en la amenaza propuesta por armas biológicas y han provocado discusión de estrategias de vacunación en masa para tanto personal militar como poblaciones civiles. Las estrategias asumen el uso de agentes de armas biológicas clásicos. Sin embargo, el poder de la ingeniería genética eleva la posibilidad de agentes de armas biológicas de generación avanzada que aún son más virulentos que sus contrapartes que se originan de forma natural y que son capaces de evadir las defensas de vacunas actuales . La lista de agentes biológicos clásicos que podrían EF. : 162655 ser usados como armas biológicas incluyen más de 100 bacterias, virus, riquetsias, hongos, y toxinas. Sin embargo, muchos expertos creen que la mayoría de las armas biológicas probablemente incluyen ántrax, viruela, plagas, toxina botulina, tularemia y fiebres hemorrágicas virales. Usando bioingeniería de estos materiales, se pueden crear virus artificiales, cepas de microorganismos resistentes a antibióticos, toxinas y otras armas biológicas exóticas, tales como provirus bacterianos (virus insertados en bacterias, de manera que cuando una persona es tratada de la enfermedad bacteriana con antibióticos, el virus se libera) . En el grupo de virus de fiebre hemorrágica que son más probablemente a ser usados como armas biológicas están el Ebola, Marburg, Fiebre de Lasa, Nuevos Arenavirus mundiales, Fiebre del Valle del Rift, fiebre amarilla, fiebre hemorrágica de Ornsk, y Enfermedades del Bosque de Kyasanur. Como la viruela y el ántrax, los Centros para el Control y Prevención de enfermedades (CCE) consideran agentes de armas biológicas "categoría A" a virus de fiebres hemorrágicas, debido a que tienen el potencial para ocasionar que se extienda la enfermedad y muerte, y podrían requerir medidas en estados de preparación de salud pública especiales para contener un brote. El ébola y Marburg, los cuales pertenecen a la familia de virus Filoviridae, pueden ser esparcidos de persona a persona y están entre las enfermedades de fiebre hemorrágica mortales. El ébola mata de 50 a 90% de aquellos infectados, mientras el Marburg es fatal 23 a 73 por ciento del tiempo. No existen tratamientos específicos para un brote de estos virus. Cada uno de los virus anteriores es considerado por ser un candidato para uso por bioterroristas debido a su virulencia, estabilidad en el ambiente, alta inefectividad y en algunos casos, alto grado de comunicabilidad . Si un ataque fuera a ocurrir usando un virus como un arma biológica, diagnosticar el agente causativo para determinar el tratamiento apropiado, sea un virus de fiebre hemorrágica u otro virus, puede ser difícil. Como un ejemplo, la mayoría de las enfermedades de fiebre hemorrágica comienzan con una fiebre y erupción cutánea, lo cual es similar a otras más enfermedades comunes. No son solamente no están la mayoría de los especialistas familiarizados con estas enfermedades, sino que no existen pruebas diagnósticas ampliamente disponibles y se requieren instalaciones especiales para trabajar con estos virus. En los EUA, el CCE en Atlanta, Georgia y USAMRIID en Frederick Mariland, albergan las únicas instalaciones equipadas para diagnosticar virus de fiebre hemorrágica. Para virus conocidos tales como el ébola, las pruebas de ensayo inmunosorbente ligado a la enzima de captura de antígeno (ELISA) , Ig ELISA, reacción en cadena de la polimerasa (RCP) , y aislamiento de virus, pueden ser usados para establecer una diagnosis dentro de algunos días del comienzo de los síntomas. Personas probadas después en el cierre de la enfermedad o después de la recuperación, pueden ser probadas por anticuerpos IgM e IgG; la enfermedad puede también ser diagnosticada retrospectivamente en pacientes fallecidos, usando pruebas de inmunohistoquímica, aislamiento de virus o RCP. Estas pruebas no solamente exponen potencialmente al equipo de laboratorio a infección, sino también requieren conocimiento del agente causativo. Aún dentro de este conocimiento, puede ser carente la biodisponibi lidad de los anticuerpos que reaccionan con el agente causativo, la biodisponibilidad de los cebadores apropiados para RCP y la habilidad para hacer crecer suficiente virus en células vivientes apropiadas para aislamiento de virus. Si el virus ha mutado, ha sido genéticamente alterado y/o es virus híbrido, los anticuerpos disponibles y cebadores pueden no ser suficientemente útiles para diagnóstico y sin información por la naturaleza del virus, puede ser difícil determinar células hospedadoras apropiadas para hacer crecer el virus para aislamiento para diagnosis y desarrollo potencial de la vacuna y determinar un régimen de tratamiento apropiado. Para el tratamiento, están disponibles algunas terapias efectivas o vacunas para tratar con virus en general y virus de fiebre hemorrágica en particular. El fármaco antiviral ribavirina, es recomendado solamente para el tratamiento de las familias de virus Arenaviridae y Bunyaviridae . Para Filoviridae (Ebola, Marburg) , y Flaviviridae, actualmente los cuidados de apoyo solamente están disponibles para tratar los síntomas de pacientes infectados. Existe una vacuna para prevenir la fiebre amarilla, pero no está ampliamente disponible y no podría ser empleada para proporcionar protección después de la exposición. Sin embargo, los patógenos diseñados por ingeniería más amenazantes del arsenal de armas biológicas pueden permanecer desconocidos hasta que sean usados en un ataque. Es por lo tanto de interés, desarrollar métodos y composiciones para identificar fármacos objetivos potenciales y métodos y composiciones para prevenir y/o tratar la infección con virus desconocidos tales como aquellos usados como armas biológicas y para desarrollar métodos y composiciones para suministrar anticuerpos productivos a aquellos quienes son objetivos potenciales de bioterrorismo . Existe también una necesidad de compuestos para el tratamiento de individuos infectados que específicamente inhiban la replicación viral aún en la ausencia de conocimiento preciso relacionado con el agente infectivo.

LITERATURA RELEVANTE Los sistemas libres de células han sido usados para estudiar el montaje de virus que se preforman en cápsidos en el citoplasma (Lingappa et al (1994) J. Cell Biol . 125: 99-111; Sakalian et al (1996) J. Virol 70: 3706-15; y Sakalian y Hunter (1999) J. Virol 73: 8073-82) así como también aquellos que se montan en la interfaz de la membrana (Lingappa et al (1997) J. Cell Biol 136: 567-81; Singh et al (2001) Virology 279: 257-70) and Zimmerman et al (2002) Nature 24: 88-92. Sin embargo, no se reconoció intermediarios de montaje y proteínas hospedadoras involucradas en la formación de cápsidos no fueron ya sea examinadas en estos estudios, y/o su uso potencial en identificación de virus desconocidos y/o tratamiento y prevención de infección con virus desconocidos.

SUMARIO DE LA. INVENCIÓN Esta invención se refiere a métodos y composiciones para identificar y aislar proteínas virales y hospedadoras involucradas en el montaje de cápsido, particularmente de un virus desconocido o que no se origina naturalmente, usando un sistema de traducción libre de células y métodos y composiciones para identificar fármacos que específicamente dirigen el hospedero identificado y proteínas virales e inhiben el montaje de cápsido. El método para identificar las proteínas hospedadoras y virales incluye las etapas de identificar proteína (s) cápsidas que codifican ácido nucleico viral, preparar un transcripto in vitro a partir del ácido nucleico viral así identificado, traducir el transcripto viral para producir productos de transcripción en la mezcla de traducción de proteína libre de células que contiene cualquiera de las proteínas hospedadoras necesarias (chaperonas) para montaje de cápsido; incubar la mezcla resultante por un tiempo suficiente para sintetizar las proteínas de montaje de cápsido virales y montar las proteínas recientemente sintetizadas en intermediarios de montaje de cápsido, aislar los intermediarios del montaje de cápsido, y separar los intermediarios del montaje de cápsido en sus proteínas que codifican componentes virales y proteínas hospedadoras. Los métodos para identificar un agente para tratar síntomas de la infección con un agente viral desconocido incluyen, selección de alto rendimiento de moléculas pequeñas potenciales usando el sistema de expresión libre de células y comparar la cantidad de cápsido formada en la presencia de un compuesto de prueba con montaje de cápsido en la ausencia de un compuesto de prueba. Un método alternativo es comparar una o más características bioquímicas de las proteínas hospedadoras con las propiedades bioquímicas de los elementos individuales de una biblioteca de proteína hospedadora que incluye características bioquímicas de una pluralidad de chaperonas de montaje de cápsido viral individualmente de referencia cruzada con una o más moléculas pequeñas que inhiben la interacción entre un elemento individual de la biblioteca y una proteina cápsida viral y proporcionar un sujeto animal a infección o infectado con el virus desconocido con una molécula pequeña que es referenciada con un elemento individual de la biblioteca que tiene una o más características bioquímicas en común con la proteína hospedadora. Si el virus es un virus que se origina naturalmente, o es un híbrido relacionado a un virus que se origina naturalmente, la identificación de la proteína hospedadora en la biblioteca puede ser usada para identificar los virus desconocidos. La invención encuentra uso en la identificación de compuestos que específicamente inhiben la interacción de proteínas virales y hospedadoras que están involucradas en la formación cápsida y con ello, inhiben la replicación viral y pueden ser usadas en los protocolos de tratamiento y prevención viral. La invención también encuentra uso en la preparación de anticuerpos a las proteínas cápsidas virales, los intermediarios de montaje y las proteínas hospedadoras o sus conformadores involucrados en el montaje de cápsido, para diagnóstico y vacunas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra un diagrama de un sistema libre de células para montaje de cápsido viral. El transcripto cápsido es sintetizado in vitro y agregado a extracto de germen de trigo, un sistema regenerador de energía, 19 aminoácidos no etiquetados, y un aminoácido etiquetado (típicamente jS-met o JS-cys). Las reacciones se incubaron a 26°C por 150 minutos. La traducción de las proteínas cápsidas se sigue por una serie de eventos post-traduccionales (que difieren de varios tipos de cápsidos virales), resultando en 20-40% de cadenas de cápsidos que forman cápsidos completamente montados. Al final de la reacción, los productos de diferentes tamaños (es decir, proteínas de núcleo no montadas, parcialmente montadas, y completamente montadas) , pueden ser separadas de entre sí por sedimentación por velocidad en gradientes de sucrosa. Las Figuras 2A -2B muestran la migración de cápsidos de VIH formado en un sistema libre de células (Figura 2A) y en un sistema celular (Figura 2B) en gradientes de sedimentación por velocidad, en la forma de trazos de la densidad de flotación de cada una de las fracciones secuenciales colectadas, valoradas por índice refractivo (círculos abiertos) y la cantidad de proteína Gap en cada fracción, valorada por densitometría (círculos cerrados) . Las Figuras 3A-3B muestran el análisis de pulso-caza de montaje de cápsido de VIH por sedimentación por velocidad en una mezcla de reacción libre de células etiquetada continuamente (Figura 3A) , en donde las posiciones calculadas de los complejos IOS, 80S, 150S y 750S, están indicadas por marcadores en la parte superior de la gráfica, y en interacciones en la cuales se agregó la 35S cisteina no etiquetada 4 minutos en la reacción y se tomaron alícuotas para análisis de sedimentación después de 25 minutos (Figura 3B) , y 15 minutos de reacción (Figura 3C) , y las muestras fueron además analizadas por gel SDS y radiografía. Figuras 4A-4D. Una proteína hospedadora de 68 kD selectivamente asociada con VIH-1 Gag en el sistema libre de células . Figura 4A Se programaron traducciones libres de células con transcriptos para ya sea VIH-1 Gag, ß-tubilina, a-globulina, núcleo HBC, o el mutante p41 de montaje defectivo en VIH-1 Gag',u'15. Los productos de reacción fueron sometidos a inmunoprecipitación bajo condiciones nativas usando el anticuerpo monoclonal 23c (23c) o IgG (N) de rata no inmune, como se describe previamente10. Se muestran autoradiogra fías de muestras inmunoprecipitadas . La línea total (T) en cada serie muestra % del producto de traducción de entrada. Figura 4B Una reacción de montaje libre de célula programado con transcripto VIH-1 Gag se inmunoprecipitó bajo ya sea condiciones nativas o después de la desnaturalización como se indica usando los anticuerpos descritos en Fig. 4A. La línea total (T) muestra 5% del producto de traducción de entrada . Figura 4C Anticuerpo a 23c fue pre-incubado con cantidades diferentes de sobrenadante WG fraccionado (que contiene proteínas solubles de 40S o menos) , antes de la incubación con 2 µ? de una reacción libre de células programadas con el transcripto VIH-1 Gag. Se realizaron inmunoprecipitaciones bajo condiciones nativas. El conteo de extracto de WG presente en 2 µ? de una reacción libre de células se definió como un equivalente de WG. La cantidad de sobrenadante WG usado para preincubar el anticuerpo varió desde 2 hasta 200 equivalentes de WG. (100 equivalentes de WG representan una concentración final de proteina WG de 14 mg/ml) . La gráfica muestra la cantidad relativa de Gag radioetiquetado que fue inmunoprecipitada (en unidades arbitrarias) , como se determinó por densimetría de Autoradiógra os . Las barras indican el error estándar de la media a partir de 3 experimentos independientes. La inserción muestra un autoradiógrafo representativo de las inmunoprecipitaciones, con cantidades equivalentes de WG agregadas durante la pre-incubación indicada anteriormente. Figura 4D Un sobrenadante a alta velocidad de extracto WG se analizó directamente por manchado Western usando el anticuerpo 23c (línea 2), o se sometió primero a inmunoprecipitación bajo condiciones nativas usando ya sea el IgG de rata no inmune (línea 1) o el anticuerpo 23c (línea 3) y después se analizó por inmunomanchado con el anticuerpo 23c. Las flechas llenas indican el antígeno de 68 kD en el extracto de WG que es reconocido por el anticuerpo 23c después del manchado Western directo (linea 2) o después de la inmunoprecipitación con anticuerpo 23c, seguido por manchado Western (linea 3) . El anticuerpo secundario usado para inmunomanchado fue la Proteina G acoplada a HRP, la cual también reconoce las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos usados para inmunoprecipitación como se indica (HC y LC) . (Se nota que la cadenas CP y CL de diferentes anticuerpos usados en las lineas 1 y 3 migran de manera diferente) . Los marcadores de peso molecular están indicados en la izquierda, y los anticuerpos usados para inmunoprecipitación (IP) y manchado Western (WB) están indicados arriba de cada linea. Figuras 5A-5C. HP68 se asocia con los intermediarios de montaje de cápsido HIV-1. Figura 5A se programaron reacciones de montajes libres de células con transcripto VIH-1 Gap como en la Figura 2, excepto que las reacciones contienen j5S-cisteína7' 15. A tres minutos en la traducción, se agregó exceso de cisteina no etiquetada para eliminar la radioetiquetación adicional, y alícuotas de la traducción fueron removidas para análisis a varios tiempos, como se indica (tiempo de caza) . Estos fueron analizados directamente por SDS-PAGE y AR para determinar la cantidad total de Gag radioetiquetado presente en cada tiempo, y por inmunoprecipitación bajo condiciones nativas con ya sea 23c o IgG de rata no inmune (datos no mostrados) . Para determinar la inmunoreactividad 23c relativa mostrada en Figura 5A, autoradiógrafos de muestras inmunoprecipitadas de 3 experimentos independientes fueron cuantificados por densitometria, normalizados a síntesis Gag radioetiquetado total para cada punto de tiempo, promediados y después graficados con respecto al tiempo de caza. Las barras de error indican el error estándar de la media. Figuras 5B-5C Se programaron traducciones libres de células continuamente etiquetadas con transcripto Gag, incubado por 2 horas, y después sometido a sedimentación por velocidad en gradientes de sucrosa de 13 mi, como se describe en los métodos. La cantidad total de Gag radioetiquetado presente en cada fracción fue cuantificado y graficado Figura 5B. Las posiciones calculadas para complejos de varios valores S se muestran anteriormente. Las barras oscuras indican la posición de migración de cápsidos de VIH-1 inmaduros completamente montados auténticos en un gradiente de sedimentación por velocidad paralela (como se determina por comparación con cápsidos maduros auténticos. La flecha indica las posiciones de los intermediarios de montajes cápsidos previamente descritos. Cada fracción de gradiente también fue sometida a inmunoprecipitación bajo condiciones nativas usando el anticuerpo 23c y analizado por SDS-PAGE y AR. La cantidad de Gag radioetiquetado co-inmunoprecipitado por el anticuerpo 23c fue iniciada y graficada usando unidades arbitrarias Figura 5C. Los marcadores valiosos S y las barras oscuras se describen en A anterior. Fueren inmunoprecipi tados polipéptidos Gag no etiquetados por suero no inmune de cualquiera de las fracciones (datos no mostrados) . Este experimento se repitió por triplicado; los datos mostrados son desde un experimento representativo. Figura 6. Secuencia de aminoácido de WGKP68. La alineación de WGHP68 con HuHP68, previamente llamado inhibidor NRNase, revela una identidad de aminoácido total de 71%. Gaps en alineación están indicados por punteadas, aminoácidos idénticos por asteriscos y aminoácidos conservados por puntos. Los cuadros abiertos indican que las dos porciones de bucles P están presentes en ambos análogos. Los cuadros obscuros indican dos regiones de secuencia de aminoácido que fueron obtenidas por microsecuenciamiento y usadas para construir oligonucleótidos degenerados para RCP. Las flechas indican el último aminoácido en el mutante de truncación N-terminal WGHP68-Trl . Las Figuras 7A-7D muestran la producción de virión de bloques HP68 truncados. Células (Figuras 7A-7D) , Cos-1 (Figuras 7A, 7B) , o 293T (Figuras 7C, 7B} , se co-transfectaron con cantidades variantes de plásmido que expresa WGHP68-Trl y vector vacio como se indica, más plásmidos para la expresión de VIH-1 Gag (Figuras 7A, 7B) o pBRUAenv (Figuras 7C, 7B) . El medio (Figuras 7A, 7C) fue inmunoraanchado con anticuerpo Gag (p55; p24) y reprobado con anticuerpo a restos de cadena ligera (LC) . Los lisados celulares (Figuras 7B, 7D) , fueron inmunomanchados usando antisuero WGHP68 (HP) o anticuerpos Gag (p55;p24), y reprobados usando anticuerpo actina (actina) . Flechas: abierta, HP68 nativo; llena, WGHP68-Trl. Gráfica de barras: manchados de 3 experimentos cuantificados usando curvas estándares de dilución de muestra. Las Figuras 8A-8D muestran que HuHP68 co-inmunoprecipita VIH-1 Gag con en células de mamífero. Están indicadas inmunoprecipitaciones nativas (NATIVAS) o de desnaturalización (DESNAT) usando aHuHP68b (HP) o suero no inmune (N) , seguidas por inmunomanchado (IB) con anticuerpo a HuHP68 (IB:HP) o Gag (IB:Gag), fueron realizadas en: (Figura 8A) células 293T trans fectadas con tratamiento de pBRUAenv , +/- RNase; (Figura 8B) , Gag que expresa células Cos-1; (Figura 8C) , Gag que expresa células Cos-1 (Gag), un mutante Gag de montaje incompetente (p41), un mutante Gag de montaje competente (p46), o vector de control (solamente inmunoprecipitacicn nativa) ; o (Figura 8D) , células ACH-2 crónicamente infectadas con VIH-1. VIH-1 p24 y p55 (flechas), 5% de lisado celular de entrada (T) , y 10 µ? de medio (medio T) . Las Figuras 9A-9B muestran que HuHP68 co-inmunoprecipita VIH-1 Gag y Vif, pero no Nef o RNase L. (Figura 9A) , células Cos-1 transíectadas con plásmidos pBRUAenv o VIH-1 Gag, fueron irmunoprecipitadas bajo condiciones nativas (NATIVAS) o desnaturalizadas (DESNAT) usando aHHP68b (HP) o suero no inmune (N) , e inmunomanchadas (IB) con anticuerpos a HuHP68 (HP) , VIH-1 Gag, Vif de VIH, VIH-1 Nef, RNase L (RL) o Actina. Total (T) : 5% de lisado celular de entrada usado en la inmunoprecipi ación (HP:10¾). La parte superior de algunas lineas de actina contienen reacciones cruzadas a cadenas pesadas a secundarias. (Figura 9B) , muestra los resultados con lisados de células Cos-1 transfectadas con pBRUAenv, cosechadas en 10 mM de amortiguador que contiene EDTA y co-inmunoprecipitadas usando perlillas preincubadas con péptido HuHP68 o control diluyente. Figura 10. HP68 es reclutado por VIH-1 Gag en células de mamífero. Las células Cos-1 fueron transfectadas con pBRUAenv (columnas 1-3) o pBRU41Aenv, el cual codifica un codón de detención después del residuo 361 en Gag (columna 4) y examinadas por inmunofluorescencia indirecta doble etiquetada. Los campos fueron examinados por teñido HP68 (rojo, mostrado en la hilera superior), o teñido Gag (verde, hilera media) . Las imágenes fueron combinadas mostrando traslape de HP68 y Gag (amarillo; hilera inferior) . La barra a la izquierda inferior corresponde a aproximadamente 50 um.

Figuras 11A-11B. HuHP68 co-irrmunoprecipita a VIH-1 Vif pero no a R ase L en células de mamífero. Figura 11A Células Cos-1 transíectadas con ya sea plásmidos de expresión pBRUAenv o gag, fueron cosechadas y sometidas a inmunoprecipitación bajo condiciones nativas (NATIVA) o después de la desnaturalización (DESNAT) usando <¾HuHP68b (HP) o suero no inmune (N) , y analizadas por inmunomanchado (IB) con anticuerpo a ya sea HuHP68 (HP) , VIH-1 p 55 Gag, VIH-1 Vif, VIH-1 Nef, RNase L (RL) , o Actina como se indica. La línea total (T) mostró 5% del lisado de células de entrada usadas para inmunoprecipitación. Cuando los anticuerpos generados en conejos son usados para inmunomanchado ( inmunomanchados HP, RL, y Actina), puede observarse un artefacto de cadena pesada a 50 kD en líneas IP (más prominente en panel de actina) . Figura 11B Células Cos-1 transíectadas con bPruAenv fueron también sometidas a inmunoprecipi ación bajo condiciones nativas en la presencia de 10 mM de EDTA, y en la presencia o ausencia del péptido HuHP68 (200 uM) que se usó para generar el antisuero aHuHP68 (Féptido HP + o -) . El DMSO solo (0.25%), el cual se usó para disolver el péptido, no tiene efecto en la co-inmunoprecipitación de Gag y Vif por aHuHP68 (datos no mostrados) . La línea total (T) muestra 5% del lisado celular de entrado usado para inmunoprecipitación, excepto para el inmunomanchado HP total, el cual representa 10% de lisado celular de entrada. Todos los experimentos fueron realizados 3 veces y los datos mostrados son de un experimento representativo . La Figura 12 muestra que en células Cos-1, el HP68 está asociado con VIH-1 Gag y VIH-2 de dos aislados primarios, pero no con un mutante de VIH-1 Gag o VIH-2 Gag truncado en la unión CA/NC. Las células Cos-1 fueron transfectadas con plásmidos que codifican HIV-1 Gag, o Gag de dos diferentes aislados de VIH-2 (506 y 304), SIVmac239 o versiones de VIH-1, VIH-2, o SIV Gag que están truncadas en la unión CA/NC (Tr) . Se sometieron Usados a inmunoprecipitación con anticuerpos de afinidad purificados a HP68 (HP) o suero no inmune (N) bajo condiciones ya sea nativas o de desnaturalización como se indica, y analizados por inmunomanchado (IB) con anticuerpo a ya sea HP68 (HP) o anticuerpo a Gag. El total (Tot.) que muestra 5% de inmunoprecipitación de ADNo aislados primarios de VIH-2 de entrada, fue obtenido de Dr. S. L. Hu; y ADNc de SIVmac239 fue obtenido de Dr. P. Luciw. La Figura 13 muestra la sedimentación por velocidad de núcleos de HCV y HBV montados en un sistema libre de células. Las reacciones libres de células programadas con transcripto de núcleo HCV o HBV, fueron incubadas por 2.5 horas y analizadas por sedimentación por velocidad en 2 mi de gradientes de sucrosa que contienen 1% de NP40 (55, 000 rpm x 60 minutos, en un rotor Beckman TLS55) . Las fracciones (200 microlitros cada una) , fueron colectadas desde la parte superior del gradiente y examinadas por SDS-PAGE y autoradiografia . En ambas reacciones, las cadenas centrales forman partículas de 100S y complejos de otros tamaños. La figura 14 muestra que las partículas 100S producidas en el sistema libre de células tienen la densidad de flotación esperada para cápsidos HCV. Los productos de una reacción de montaje libre de célula programados con transcriptos de núcleo HCV, fueron separados por sedimentación por velocidad, como en la Figura 13. Las fracciones 6 y 7 (partícula de núcleo 100S) , fueron analizadas por centrifugación de equilibrio (50,000 rpm x 20 horas usando un rotor TLS55 Beckman) usando 337 mg/ml de una solución de CsCl. Las fracciones fueron colectadas, TCA precipitadas, analizadas por SDS-PAGE y autoradiografía y cuantificadas por densitometría . La proteína de núcleo HCV sobresale en la fracción 6. La densidad de fracción 5/6 (mitad del gradiente, se indica con flechas) es 1.25 g/ml. La Figura 15 muestra mutantes que contienen el dominio de interacción hidrofílico de montaje de núcleo en el sistema libre de células. Las reacciones libres de células fueron programadas con el núcleo HCV de tipo nativo (C191) o mutantes en el núcleo truncado a aminoácidos 122 o 115 (C122 contra C115) , y analizadas por sedimentación por velocidad en 2 mi de gradientes de sucrosa (como se describe en la Figura 13) . Las fracciones fueron examinadas por SDS-PAGE, y las autoradiografias fueron cuantificadas . La gráfica muestra la cantidad de cada proteína de núcleo presente en partículas 100S como % de síntesis total. La Figura 16 muestra la estrategia para co-inmunoprecipitación de núcleo HCV. La Figura 17 muestra co-inmunoprecipitación del núcleo HCV por anti-suero 60-C. Las reacciones libres de células fueron programadas con ya sea núcleo HCV, VIH-1 Gap o núcleo HBV. Durante el montaje, las reacciones fueron sometidas a inmunoprecipitación (IP) bajo condiciones nativas con antisuero dirigido contra diferentes epítopes de TCP-1 (60-C, 60-N, 23c y 91a) o con suero no inmune (NI) . Se analizaron eiuatos IP por SDS-PAGE y autoradiografía . Se muestra un total de 5¾ de la entrada usada para el programa IP. Las flechas muestran posiciones de las proteínas cápsidas de longitud completa. La Figura 18 muestra fraccionamiento de gradiente de glucosa de productos de traducción libres de células de núcleo HBV. El ADNc del núcleo HBV se transcribió y se tradujo por 120 minutos. Los productos de traducción fueron entonces cubiertos en 2.0 mi de un gradiente de sucrosa al 10-50¾ y centrifugados a 200,000 g por 1 hora. Las fracciones de 200 microlitros fueron removidas secuencialmente desde la parte superior a inferior del gradiente (líneas 1-11, respectivamente) y la pelotilla (línea 12) fue resuspendida en amortiguador NP-40 al 1%. Alícuotas de cada una de las fracciones fueron analizadas por SDS-PAGE y autoradiografía para detectar la banda de polipéptido de núcleo de 21 kD radioetiquetada . Se observan dos bandas de núcleo KBV menor de peso molecular inferior (en tanto traducciones in vitro, como también en proteínas de núcleo producidas por transfección de E. coli). Estas se piensan son ya sea productos degradativos del resultado de iniciación de la traducción a metioninas internas. Se muestran las posiciones de los estándares de peso molecular. La posición de catalasa, un estándar 11-S, en este tipo de gradiente (como se determina por teñido de Comassie) , se muestra con una flecha. Del mismo modo, la migración de partículas de núcleo recombinantes , conocidas por tener un coeficiente de sedimentación de -100S, se muestra con una flecha. Los polipéptidos de núcleo HBV radioetiquetados migran en estas regiones de este gradiente: superior (T) que corresponde a las fracciones 1 y 2; medio (M) que corresponde a las fracciones 6 y 7; y pelotilla (P) que corresponde a la fracción 12, como se muestra con barras obscuras. Las Figuras 19A-19D muestran análisis de pulso-caza de montaje de partículas de núcleo HBV. La transcripción y traducción in vitro se realizaron con un pulso inicial de 10 minutos de [35S] cisteína, seguidos por una caza con cisteina no etiquetada para ya sea Fig. 19A, Fig. 19B, Fig. 19C o 170 min Fig. 19D. Los productos de transcripción fueron cubiertos en gradientes de sucrosa, centrifugados, fraccionados, y analizados por SDS-PAGE y autoradiografiados como se describe previamente . Se muestran autoradiografos a la derecha de la gráfica de barras respectiva que cuantifican la densidad de bandas presentes en la parte superior (S), media (M) y pelotilla (P) de los autoradiografos respectivos. La cantidad total de polipéptido de núcleo de longitud completa radioetiquetado presente en cada punto de tiempo es la misma, como se determina por cuantificación de las densidades de banda de 1-microlitro de alícuotas de la traducción total. Los polipéptidos de núcleo etiquetado cazan desde la parte superior a la pelotilla y finalmente a la mitad del gradiente con el curso del tiempo. Las Figuras 20A-20C muestran preparación y caracterización de un antisuero policlonal contra una chaperonina citosólica. Figura 20A muestra alineación de secuencias de aminoácido presentes dentro del TCP-1 de ratón (posiciones 42-57) (Lewis et al. 1992 Nature 358: 249-252), TF55 de S. shibatae (una proteína de golpe por calor de una arquibacteria termofílica) (posiciones 55-70) (Trent et al. 1991 Nature 354: 490-493) y TCP-1 de levadura (posiciones 50-65) (Ursic and Culbertson, 1991 Mol. Cell Biol. 11: 2629-2640) . Aminoácidos idénticos a aquellos en la secuencia de ratón son designados por (.)· U péptido sintético se sintetizó de manera correspondiente a los aminoácidos 42-57 del TCP-1 de ratón debido al alto grado de homología en esta región. Este péptido se conjugó a la proteina portadora o se retículo a la misma y usó para generar antisuero policlonal de conejo (anti 60) . Las inmunoprecipitaciones fueron realizadas con este antisuero bajo condiciones desnaturalizadas en extractos de células completas de células HeLa etiquetadas con [35S] metionina de estado listo. Una proteína de ~60 kD se precipitó por anti60, mostrado en la Fig. 20B línea 1. Como un control, la Fig. 20B línea 2 muestra una inmunoprecipitación bajo condiciones de desnaturalización hechas con antisuero a hsp 70 en el mismo experimento. Los marcadores de peso molecular (92, 68, y 45 kD) , están indicados a la izquierda con cabezas de flecha abiertas. Bajo condiciones nativas, anti 60 también inmunoprecipita una proteína de 60 kD en células HeLa solubilizadas . Para caracterizar además el antígeno reconocido por este antisuero, extracto del reticulocito de conejo y extracto de germen de trigo fueron cubiertos sobre gradientes de sucrosa al 10-50%, centrifugados a 55,000 rpm por 60 minutos en un ultracentrífugo TL-100 de Beckman, fraccionados y analizados por SDS-PAGE. Las proteínas fueron transferidas a nitrocelulosa y fueron incubadas con anti 60 como se muestra en la Fig. 20C. Para determinar valores S, los estándares de proteina fueron centrifugados en un tubo de gradiente separado al mismo tiempo y las fracciones fueron visualizadas por teñido de Coomassie de geles SDS-PAGE. Las posiciones de estos marcadores (BSA y a-macroglobulina) están indicadas con flechas. Los marcadores de peso molecular (68 y 45 kD) están indicados a la derecha con flechas de cabeza abiertas. En ambos inmunomanchados, solamente se reconoció una banda única, que representa una proteina de 60 kD, que migra en la posición 20-S. De este modo, anti 60 parece reconocer una proteina de 60 kD (CC 60} que migra en la región 20-S y es probablemente ya sea TCP-1 u homologa. Las Figuras 21A-21C muestran inmunoprecipitación de productos de traducción de núcleo HBV. El núcleo HBV fue traducido in vitro por 60 minutos. Los productos de traducción fueron centrifugados en gradientes de sucrosa y fraccionados. Las fracciones de las regiones superior ("S"), media (M) y pelotilla (P) , fueron divididas en alícuotas iguales y se realizaron inmunoprecipitaciones como se describe en Materiales y Métodos bajo las condiciones nativas (A) o de desnaturalización (B) usando ya sea antisuero anti-núcleo (C) o suero no inmune (N) , o anti 60 (60) . La proteína de núcleo etiquetada inmunoprecipitada se visualizó por SDS-PAGE y la autoradiografía C mostró un experimento separado en el cual se realizaron las inmunoprecipitaciones nativas en productos de traducción de núcleo HBV, después de la centrifugación por densidad de equilibrio. En este experimento, el núcleo HBV se tradujo por 150 minutos y se centrifugó en gradientes de sucrosa como se describe. Los materiales de la mitad (líneas 6 y 7) de los gradientes de sucrosa, se combinaron y centrifugaron en gradientes de equilibrio CsCl. Las fracciones 3 y 6 fueron colectadas, divididas en alícuotas iguales e inmunoprecipitadas bajo condiciones nativas usando ya sea anticuerpo anti-núcleo (C) , suero no inmune (N) o anti 60 (60). Los tiempos de exposición para autoradiógrafos fueron idénticos para cada una de las tres líneas (C, N y 60) dentro de una serie, pero varía entre series. Las Figuras 22A-22D muestran que los polipéptidos de núcleo no montado pueden ser cazados en partículas multiméricas . El transcripto de núcleo HBV se diluyó con 50% con transcripto mock, y después se tradujo por 120 minutos. Los productos de traducción fueron divididos en tres alícuotas. Una alícuota se colocó en hielo Fig. 22A. A una segunda alícuota se agregó una traducción de polipéptidos de núcleo HBV que fue hecha usando 100¾ de transcriptos y solamente aminoácidos no etiquetados que han sido incubados por 45 minutos. La mezcla fue entonces incubada por ya sea 45 Fig. 22B o 120 minutos Fig. 22C. A una tercera alícuota se agregó una traducción del transcripto mock que ha sido incubado por 45 minutos, y esta mezcla además se incubó por 120 minutos Fig. 22D. Todas las cuatro muestras fueron entonces centrifugadas en gradientes de sucrosa y las fracciones fueron removidas y analizadas por SDS-PAGE y autoradiografia como se describe previamente. Los polipéptidos de núcleo no montado mostrados en la Fig. 22A se encuentran por moverse primero en la pelotilla y después en la mitad con el tiempo (Fig. 22B y Fig. 22C, respectivamente) con la adición de altas concentraciones de cadenas de polipéptidos de núcleo HBV (no etiquetadas) . Por el contrario, con adición de traducción mock (D) , los polipéptidos de núcleo permanecen en la parte superior del gradiente . Las Figuras 23A-23B muestran que cápsidos completados son liberados de la pelotilla aislada. Después de la traducción del transcripto de núcleo HBV por 30 minutos, el producto de traducción fue diluido en 0.01¾ de amortiguador de Nikkol y centrifugado en un gradiente de sucrosa al 10-50%. El sobrenadante se removió y la pelotilla se resuspendió en amortiguador y se dividió en alícuotas iguales. A una alícuota se agregó apirasa (A, superior), mientras el control se incubó en amortiguador solo (A, inferior) . Las incubaciones se hicieron a 25°C por 90 minutos. Las mezclas de reacción fueron entonces centrifugadas en gradientes de sucrosa estándares al 10-50?;. Las fracciones fueron analizadas por SDS-PAGE y autoradiografia . En un experimento separado (B) , la pelotilla se aisló y se resuspendió en forma idéntica. A una alícuota se agregó extracto de germen de trigo, asi como también mezcla energética no etiquetada [B, superior) / en la segunda alícuota se agregó extracto de germen de trigo y apirasa (B, inferior) . Las reacciones fueron incubadas a 25°C por 180 minutos y centrifugadas como se describe para A. El tratamiento con apirasa (con o sin extracto de germen de trigo) , resultó en liberación de material radioetiquetado que ha migrado en la mitad del gradiente. Este material que representa cápsidos completos, se confirmó por centrifugación en gradientes de equilibrio CsCl junto con cápsidos auténticos como un control (datos no mostrados) . Por el contrario, el tratamiento con extracto de germen de trigo y mezcla energética, resultó en la generación de material radioetiquetado que migró en la parte superior así como también en el gradiente medio. El material en la mitad de estos gradientes también mostró incluir cápsidos completados por centrifugación en CsCl junto con cáspidos auténticos como un marcador. La Figura 24 muestra micrógrafos del electrón de cápsidos producidos en un sistema libre de células. La traducción de transcripto de núcleo HBV (Libre de célula) , asi como también la traducción de una proteína no relacionada (GRP-94 no truncada en Ncol, referida aquí como Control) fue realizada por 150 minutos y estos productos así como también cápsidos recombinantes (auténticos), fueron centrifugados a equilibrio en gradientes CsCl separados. La fracción 6 de cada gradiente se colectó y además sedimentó en un Airfugo. En forma blindada única, la pelotilla de cada uno se colectó, resuspendió y preparó para EM por teñido negativo. La identidad de las muestras fue correctamente determinada por el experto en microscopio. No fueron vistas partículas que parecen cápsidos en las muestras de control. Barra, 34 nm. La Figura 25 muestra que los imitantes de supresión N-terminal del núcleo HVC fallan al montarse en un sistema libre de células.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención usa un sistema libre de células para la traducción y montaje de cápsidos virales como un medio de identificación de objetivos de fármacos potenciales para inhibir la replicación viral y pequeñas moléculas que interactúan con los objetivos de fármacos para el uso en el tratamiento y/o prevención de infección viral en una planta o un animal, particularmente un mamífero tal como un animal de ganadería y más particularmente un humano, aún si el agente viral es desconocido y/o no está presente naturalmente. Esta invención se basa en el hecho que todos los virus contienen una envoltura de proteínas (cápsido) que circunda un ácido nucleico que contiene núcleo (el complejo de proteína completa-ácido nucleico es el nucleocápsido) y el descubrimiento que todos los virus examinados a la fecha en el sistema libre de células requieren una o más caferonas o proteínas hospedadoras para el montaje de cápsido. Previamente se ha creído que algunos virus simples se forman espontáneamente de sus componentes de proteína disociados mientras que otros requieren modificaciones catalizadas con enzima de los capsómeros para activar el montaje. Sin embargo, en estudios recientes (véase por ejemplo PCT/US98/02350) usando un sistema de traducción libre de células, se mostró que el montaje de cápsido en VIH procede a través de uno o más intermediarios de montaje de cápsido. Este descubrimiento ahora se ha extendido a otros virus no relacionados incluyendo HCV y esta información conjuntamente con la información relacionada con VHB (Lingappa et al., J Cell Biol (1994) 125:99-111), ahora sugiere que las estructuras de cápsido viral en general se forman en una secuencia ordenada de intermediario de montaje que culminan en la estructura de cápsido final. Estos intermediarios de montaje son complejos que incluyen tanto proteína viralmente codificadas como proteínas hospedadoras que actúan como chaperonas. Por lo tanto, aunque los cápsidos de muchos virus difieren de la composición de proteina, una trayectoria viral general para la formación de cápsido que involucra proteínas hospedadoras es ahora evidente y se puede usar como un medio para identificar objetivos de fármacos potenciales para agentes virales no conocidos a través de la selección de compuesto que inhiben el proceso de montaje de cápsido y/o aislamiento de los intermediarios de montaje que son observables durante el montaje de cápsido usando un sistema libre de células. En la presente se ejemplifican proteínas de célula hospedadoras, trayectorias de montaje de cápsido e intermediarios para tres virus, VIH, VHB, HCV. Aunque los virus por si mismos son diferentes y las proteínas hospedadoras identificadas como involucradas en el montaje de cápsido son diferentes, las trayectorias para el montaje de cápsido son similares para estos tres virus. Debido a que los virus estudiados son tan diferentes, se espera que las trayectorias similares se usen para el montaje de cápsido por otros virus, y que los intermediarios descritos en la presente tengan contrapartes análogas en tales otras trayectorias de montaje de cápsido. Estas contrapartes se pueden identificar usando las manipulaciones generales descritas posteriormente aún si el virus mismo es desconocido . En el método para identificar objetivos de fármacos potenciales, el ácido nucleico viral de un agente viral desconocido se selecciona para identificar el ácido nucleico que codifica un gen de cápsido viral por ejemplo por la homología de secuencia a genes de cápsido conocidos. El ácido nucleico luego se usa para preparar un transcripto in vitro el cual a su vez se usa para programar un sistema de traducción libre de células para la preparación de cápsidos virales; la formación de cápsidos es evidencia que el ácido nucleico identificado es requerido para el montaje de cápsido. Los intermediarios de montaje de cápsido y proteínas hospedadoras suplentes trans involucradas en la trayectoria de montaje de cápsido se aislan y ordenan en secuencia y luego se usan en la selección de compuestos antivirales que inhiben la interacción de las proteínas hospedadoras identificadas y proteínas de cápsido viralmente codificadas, por ejemplo usando el sistema de traducción libre de células. La frase "trayectoria de montaje de cápsido" se refiere al conjunto ordenado de intermediarios de montaje seriales requerido para la formación de la estructura de cápsido completa, final. Para avanzar de un intermediario de montaje al siguiente, una modificación o modificaciones del intermediario toman lugar. La frase "traducción libre de células" se refiere a la síntesis de proteína llevada a cabo in vitro en un extracto celular que está esencialmente libre de células completas. La frase "mezcla de traducción libre de células" o "sistema de traducción libre de células" se refiere a un extracto libre de células que generalmente incluye suficientes componentes y mecanismo celular para soportar la traducción de proteínas que incluye ARN de transferencia, ribosomas, un complemento completo de al menos 20 diferentes aminoácidos, una fuente de energía, la cual puede ser ATP y/o GTP, y un sistema de regeneración de energía, tal como fosfato de creatina y fosfocinasa creatina. Alternativamente, los compuestos antivirales para el tratamiento de una infección viral se pueden identificar aislando los intermediarios de montaje de cápsido tal como desnaturalizando los complejos y separándolos en sus proteínas codificadas con componente viral y proteínas hospedadoras . Una o más características bioquímicas de la proteína hospedadora, tal como la secuencia de aminoácido de la región de la proteína hospedadora que enlaza a la proteína de cápsido viral o la identificación de los anticuerpos que enlazan a esta región se conparan con una biblioteca que incluye características bioquímicas de una pluralidad de chaperonas de montaje de cápsido virales individualmente referenciadas con una o más moléculas pequeñas que inhiben la interacción entre un miembro individual de la biblioteca y una proteína de cápsido viral. Una pequeña molécula que es referenciada con un miembro individual de la biblioteca que tiene una característica bioquímica en común con la proteína hospedadora luego se puede usar como un tratamiento para síntomas asociados con la infección con agente desconocido o para prevenir la infección con el agente desconocido. La invención objeto ofrece diversas ventajas sobre la tecnología existente. Una ventaja principal es que en el sistema libre de células la etapa universal en el ciclo de vida de todos los virus, formación del cápsido, se puede romper para habilitar el aislamiento de intermediarios de montaje que están únicamente asociados con cada clase de virus y la identificación de uno o más factores hospedadores distintos que se involucran en esta trayectoria, estereotipada, obligada del montaje de cápsido. Adicionalmente, el sistema libre de células ofrece la ventaja que permite la "deconstrucción" de algún virus por la determinación de cuales proteínas hospedadoras el virus utiliza para el montaje de cápsido sin considerar las condiciones necesarias para propagar o desarrollar el virus per se y por el uso solamente del ácido nucleico viral que codifica las proteínas virales que están involucradas en el montaje de cápsido, eliminado la exposición de personal de laboratorio a virus infeccioso. En este sistema, el cual reproduce exactamente que sucede dentro de una célula solamente más lentamente, los intermediarios de montaje se pueden detectar y enriquecer. La invención tiene la ventaja que las proteínas hospedadoras y proteínas virales involucradas en el montaje de cápsido se pueden identificar aún antes de que la capacidad de cultivar el virus se ha establecido, y/o el virus se ha identificado, y también se puede usar para virus que carecen de sistemas de cultivo celulares que producen altos títulos de virus. Este método de montaje libre de células de cápsidos virales tiene la ventaja adicional de que una biblioteca que se puede desarrollar correlacione la identidad de factores hospedadores, incluyendo tales características como su secuencia de aminoácido y/o cualesquiera anticuerpos que inhiben el montaje de cápsido con los virus particulares o familias de virus que usan estos factores hospedadores y para virus que se presentan naturalmente, esta información se puede referenciar adicionalmente con la identificación del virus y/o familia de virus. Las características de factor hospedador adicionalmente se pueden referenciar a la información relacionada con las moléculas pequeñas que inhiben el montaje de cápsido para un virus que usa proteína hospedadora particular, de modo que identificando la proteína hospedadora, una modalidad de tratamiento también se puede identificar. Una ventaja adicional de este sistema es que aún si un virus se ha alterado genéticamente y/o ha mutado y/o es un virus sintético, debido a que aún debe interactuar con las proteínas hospedadoras para producir cápsidos, el sitio de enlace de proteína viral para una proteína hospedadora requerida para montaje de cápsido tendrá que ser conservado y por la identificación de la proteina hospedadora en un intermediario de montaje, una modalidad de tratamiento se puede determinar basado en esta identificación. Esto puede ser particularmente útil cuando los epitopes de anticuerpo se han alterado y el virus no es reconocido más tiempo existiendo anticuerpos, o donde ninguno de los anticuerpos para un virus particular existe. Tanto las proteínas hospedadoras como intermediarios de montaje son objetivos antivirales candidato. Por consiguiente, otra ventaja de la invención objeto es que los intermediarios de montaje se pueden aislar y usar en el diseño de fármacos (incluyendo péptidos y anticuerpos) y vacunas que interfieren con la progresión de un intermediario al siguiente, en el diseño de fármacos que actúan inhibiendo el mecanismo de célula hospedadora involucrado en la formación de cápsido, y en el diseño de sistemas de ensayo que examinan la eficacia y mecanismo de acción de fármacos que inhiben la formación de cápsido aún en la ausencia de conocimiento relacionado con la identidad del virus mismo. Adicionalmente, si el objetivo para el fármaco antiviral es una proteína hospedadora antes que una proteína viral, existe una probabilidad disminuida del desarrollo de resistencia viral a tal fármaco. Otra ventaja de la invención objeto es que las piezas de ácido nucleico genómico se pueden encapsidar en los cápsido producidos en el sistema libre de células adicionando tal ácido nucleico al sistema. Este aspecto de la invención se puede usar para diseñar fármacos que interfieren con la encapsidación y en el diseño de sistemas de ensayo que examinen el mecanismo de acciones de fármacos que inhiben la encapsidación. Para producir intermediarios de montaje de cápsido virales, un sistema de traducción libre de células se usa. Conocido en la técnica está un número de sistemas de traducción in vitro, los requerimientos básicos de los cuales han sido bien estudiados (Erickson and Blobel, Methods Enzymol (1983) 96:38-50; Merrick, W. C, Methods Enzymol. (1983) 101:606-615; Spirin et al. Science (1988) 242:1162-1164) . Los ejemplos incluyen extracto de germen de trigo y extracto de reticulocito de conejo, disponibles de proveedores comerciales tal como Promega (Madison, WI), asi como sobrenadantes de alta velocidad formados de tales extractos. Mientras que la mezcla de traducción libre de células se puede derivar de algún número de tipos de células conocidos en la técnica que contienen los componentes necesarios para montaje de cápsido, la presente invención se ejemplifica usando extracto libre de células de germen de trigo el cual se prepara del germen de trigo de diferentes cepas. (Erickson and Blobel (1983) Methods Enzymol 96, 38-50) . Por ejemplo, los componentes necesario del extracto libre de células para formación de cápsido de VIH incluyen una proteína que enlaza a un anticuerpo 23c; el extracto de reticulocito de conejo no soporta la producción de cápsidos de VIH en la ausencia de factor hospedador agregado 68 (HP68) . Por lo tanto, dependiendo del virus involucrado, en algunos casos puede ser necesario suplementar el sistema libre de células con proteínas exógenas, tales como proteínas hospedadoras, las cuales facilitan el montaje de intermediarios de cápsido. La necesidad de adición de proteínas exógenas para un virus particular se puede determinar empíricamente. El extracto es la fuente de factores conocidos que se requieren para la traducción, más factores que todavía no se han definido y pueden ser requeridos para el montaje. Mientras que estos extractos contienen una mezcla de vesículas de membrana derivada de membrana de plasma y retículo endoplásmico (RE) al cual las proteínas se pueden dirigir, las vesículas de RE que son capaces de translocación generalmente no están presentes en cantidades significativas en el extracto y típicamente son suplementarias agregando membranas exógenas, tales como membranas de páncreas de perro. Como se muestra en esta solicitud, estos sistemas de montaje de cápsido reproducen estrechamente eventos de cápsido que se presentan in vivo (también véase Molla et al., (1991) Science 254, 1647-51, y Molla et al., (1993) Dev Biol Stand 78, 39-53). Los componentes de sistemas de montaje libres de células que se han usado para producir HCV, VHB, VIH-1, M-PMV, y otros cápsidos tienen similitudes y diferencias que reflejan las diferencias en morfogénesis de virión. Como un ejemplo, algunos virus, tal como VIH, tienen intermediarios miristoilados, por lo tanto es necesario agregar suficiente coenzima A de miristoilo (MCoA) al sistema para hacer posible que el sistema de cápsidos tenga el virus desconocido uno que requiere este componente. La cantidad de coenzima A de miristoilo que se usa para suplementar la mezcla de traducción libre de células es aquella la cual es suficiente para soportar la formación de cápsido. Mientras que la concentración requerida varia de acuerdo con las condiciones experimentales particulares, en experimentos realizados en el soporte de la presente invención, se encontró que una concentración entre aproximadamente 0.1 y 100 uM, y preferiblemente entre aproximadamente 5 y 30 uM, soporta la formación de cápsido de VIH. Algunos virus requieren proteínas de membrana para montaje de cápsido y las membranas apropiadas se pueden adicionar a la mezcla de traducción libre de membranas, incluyendo fracciones sensibles a detergente, insensibles a detergente, y de proteina hospedadora descritas posteriormente, o se pueden suplementar con tales fracciones. Como un ejemplo, para el VIH cuando las membranas están presentes en la mezcla de traducción libre de células son solubilizadas por la adición de detergente, el montaje del cápsido de VIH es sensible a la adición de detergente arriba pero no por debajo de la concentración de micelio crítica. Esta observación es consistente con un papel de las membranas que se requieren en una etapa particular en el montaje de cápsido. Además, el montaje de cápsido de VIH se mejora por la presencia de un componente celular que tiene un valor de sedimentación mayor que 90 S en un gradiente de sucrosa y es insensible a la extracción con al menos 0.5% de "NIKKOL". El término "fracción sensible a detergente" se refiere a un componente que contiene muy probablemente una bicapa de lipido de membrana que está presente en un extracto de germen de trigo estándar preparado de acuerdo con los métodos descritos por Erickson and Blobel (1983) (Methods in Enzymalogy Val 96) , el componente es desactivado con referencia para soportar el montaje de cápsido de VIH cuando una concentración de 0.1% (peso/vol) de "NIKKOL" se adiciona al extracto. Se aprecia que tal factor sensible a detergente puede estar presente en extractos de otras células similarmente preparadas, o puede ser preparado independientemente de un extracto de célula separado, y luego adicionado al sistema de traducción libre de células. Mientras que tanto el mecanismo de miristoilación como las membranas deben estar presentes en el sistema libre de células para virus tal como VIH, pero no son requeridas para el montaje de cápsido para virus tal como VHB y HCV debido a que las proteínas estructurales no son miristoiladas y el objetivo para la membrana se piensa que ocurre después del montaje de cápsido, la presencia de estos componentes en el sistema de traducción libre de células no afecta negativamente el montaje de cápsido viral para virus que no los requieren y estos componentes, por lo tanto, se pueden incluir en el sistema libre de células para producir cápsidos de virus desconocidos. Los métodos conocidos en la técnica se usan para mantener niveles de energía en el sistema libre de células suficientes para mantener la síntesis de proteína, por ejemplo, agregando fuentes de energía de nucleótido adicionales durante la reacción o por la adición de una fuente de energía, tal como fosfato de creatina/fosfocinasa creatina. Las concentraciones de ATP y GTP presentes en la mezcla de traducción estándar, generalmente entre aproximadamente 0.1 y 10 mM, más preferiblemente entre aproximadamente 0.5 y 2 mM, son suficientes para soportar tanto la síntesis de proteína como formación de cápsido, los cuales pueden requerir entrada de energía adicional. Generalmente, la mezcla de reacción preparada de acuerdo con la presente invención se puede titular con una cantidad suficiente de ATP y/o GTP para soportar la producción de una concentración de aproximadamente 10 picomolar de proteína viral en el sistema. El montaje de cápsidos inmaduros en el sistema libre de células requiere la expresión solamente de las proteínas virales particulares que están involucradas en el montaje de cápsido. Una muestra que contiene un virus desconocido o un fluido corporal de un individuo infectado con un virus desconocido, o células infectadas del individuo, se usa como una fuente de ácido nucleico viral que codifica las proteínas de cápsido para el virus. El fluido puede ser cualquier fluido corporal incluyendo sangre, suero, plasma, fluido linfático, orina, esputo, fluido cerebroespinal, o un espécimen purulento. Los genomas para muchos virus conocidos tales como Ebola, viruela, y virus de encefalitis venezolana, se han ordenado en secuencia, por ejemplo véase htt : //www. ncbi . im.nih.gov: 80/entrez/query. fcgi?db=Genome . <http: //www . ncbi . nim. nih . gov: 80/entrez/query . fcgi?db=Genome> . Para virus desconocidos o para aquellos para ios cuales el genoma no se ha ordenado en secuencia, el genoma viral es clonado y ordenado en secuencia y el gen de cápsido identificado por la homología de secuencia a genes de cápsido viral conocidos. Los ácidos nucleicos que codifican las proteínas virales involucradas en el montaje de cápsido se pueden obtener por amplificación usando la reacción de cadena de polimerasa (RCP) . Los conjuntos de cebadores que incluyen las secuencias de ácido nucleico necesarias son diseñados basado en los datos de secuencia para ácido nucleico que codifica las proteínas de cápsido de todos los virus conocidos, tanto hebras sentido como antisentido. Puesto que las secuencias codificantes para virus conocidos no pueden ser idénticas a las secuencias conocidas pero probablemente están relacionadas con las secuencias conocidas para codificar las proteínas virales involucradas en el montaje de cápsido, se usan cebadores de oligonucleótido híbrido degenerados por consenso (véase por ejemplo Rose et al., Nucleic ñcids Research (1998) 26:1628-1635, la descripción se incorpora por este medio para referencia) . En el sistema de montaje de cápsido (véase figura 1), la mezcla de traducción libre de células es programada con transcripto de cápsido para el virus desconocido que se sintetiza in vitro. El término "programada con" significa la adición de ARNm que codifica las proteínas de cápsido viral a la mezcla de traducción libre de células. Las preparaciones de ARNm adecuadas incluyen un transcripto de ARN tapado producido in vitro usando el kit mMESSAGE mMACHINE (Albion) . Las moléculas de ARN también se pueden generar en el mismo recipiente de reacción como se usa para la reacción de traducción por la adición de polimerasa SP6 o T7 a la mezcla de reacción, conjuntamente con la región que codifica la proteína de cápsido viral o ADNc.

Después de la incubación por un tiempo suficiente para producir cápsidos, los productos de la reacción libre de células se analizan para determinar el valor de sedimentación (S) (el cual valora el tamaño y forma de la partícula) , densidad de flotación (la cual indica la densidad de la partícula) y apariencia en microscopio electrónico. Conjuntamente estos forman un conjunto sensible de mediciones para la integridad de la formación de cápsido. Un cuarto criterio (resistencia a digestión de proteasa) también se puede usar. Para confirmar que las partículas desenvueltas obtenidas representan los cápsidos virales deseados, las fracciones que contienen los cápsidos desenvueltos del gradiente de sedimentación por velocidad son analizadas por centrifugación en equilibrio en CsCl y la densidad de flotación comparadas con aquellas de cápsidos (sin envolturas) producidas en células infectadas si están disponibles. La producción de cápsidos es la confirmación que el ácido nucleico viral identificado codifica una proteína de cápsido . La reacción de montaje de cápsido libre de células descrita anteriormente se puede extender para incluir el empaquetado de ácido nucleico, por la adición de ácido nucleico genómico o fragmentos del mismo durante la reacción de montaje de cápsido. La adición y monitoreo de la encapsidación proporcionan un parámetro adicional de formación de partículas que se puede explotar en ensayos de selección de fármacos, de conformidad con la presente invención. El ácido nucleico preferiblemente es mayor que aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud y es subclonado en un vector de transcripción. Una molécula de ARN correspondiente luego se produce por procedimientos de transcripción in vivo estándar. Esta se agrega a la mezcla de reacción descrita anteriormente, al comienzo del período de incubación. Aunque la concentración final de molécula de ARN presente en la mezcla variará, el volumen en el cual tal molécula se adicional a la mezcla de reacción deberá ser menor que aproximadamente 10% del volumen total . Los intermediarios de montaje de cápsido se pueden formar en un número de formas, tal como por bloqueo de la producción de cápsidos en el sistema de montaje libre de células agregando bloqueadores de montaje específicos (por ejemplo, apirasa para bloquear ATP) o por la sustracción de un componente clave, tal como coA de Miristoilo (para un virus el cual lo requiere) de la reacción. De esta forma, uno o más intermediarios de montaje se producen en gran cantidad. Los intermediarios de montaje luego se analizan para determinar los componentes del complejo, los cuales generalmente incluyen al menos una chaperona o proteína de montaje derivada de célula hospedadora . La presencia de tal proteína se detecta por algún número de medios, por ejemplo por initiunoprecipitación del complejo de proteína hospedadora-intermediario de montaje usando anticuerpos que enlazan a chaperonas de célula hospedadora conocidas. La proteína hospedadora se separa del complejo de intermediario de montaje, por ejemplo por desnaturalización y se determinan las características bioquímicas de la proteína de célula hospedadora. Las características bioquímicas que son perfiladas incluyen inmunoreactividad de identificación con anticuerpos monoclonales para conocer las chaperonas virales, por ejemplo por selección de bibliotecas que despliegan fagos y ordenación en secuencia de la proteína. La secuencia se evalúa para determinar si contiene secuencias de aminoácido de chaperonas virales conocidas y si existen algunos homólogos a la proteína hospedadora, incluyendo germen de trigo y homólogos de primate, particularmente humano. Los homólogos humanos se pueden identificar usando cebadores degenerados a la secuencia identificada, u otras proteínas chaperonas identificadas en el sistema libre de células que enlazan a los intermediarios de montaje de cápsido, y luego se clonan en un vector de expresión. Los productos de traducción de estos vectores de expresión se prueban en un sistema libre de células para determinar su capacidad de enlazar proteínas de montaje de cápsido por inmunopurificació . La proteína se caracteriza adicionalmente por peso molecular por ejemplo, cuando se valora por SDS-PAGE. Si los anticuerpos monoclonales para las proteínas hospedadoras no están disponibles, los mismos se preparan por algún número de métodos los cuales son conocidos por aquellos expertos en la técnica y previamente descritos (véase, por ejemplo, Kohler et al., Nature, 256: 495-497 (1975) y Eur. J. Immunol. 6:511-519 (1976); Milstein et al., Nature 266: 550-552 (1977), Koprowski et al., Pat . U.S. No. 4,172,124; Harlow, E. and D. Lañe, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); Current Protocols In Molecular Biology, Vol. 2 (Supplement 27, Summer 94), Ausubel, F. M. et al., Eds., (John Wiley & Sons: New York, N. Y.), Capítulo 11, (1991)). Generalmente, se produce un hibridoma fusionando una línea celular inmortal adecuada (por ejemplo, una línea celular de mieloma) con células que producen anticuerpos (por ejemplo, linfocitos derivados de los nodulo del bazo o linfático de un animal inmunizado con un antígeno de interés. Las células resultantes de una fusión de células inmunes y células de linfoma, generalmente referidas como hibridomas, se puede aislar usando condiciones de cultivo selectivas, y luego se clonan por dilución limitada. Las células las cuales producen anticuerpos con las propiedades de enlace deseadas se seleccionan por un ensayo adecuado, tal como un ensayo serológico, incluyendo ensayo inmunosorbente enlazado a enzima (ELISA) . Los fragmentos de enlace funcionales de anticuerpos monoclonales también se pueden producir, por ejemplo, por escisión enzimática o por técnicas recombinantes . Los métodos de escisión enzimática incluyen escisión con papaína o pepsina para generar fragmentos de Fab o F(ab' ) 2# respectivamente. Los anticuerpos también se pueden producir en una variedad de formas truncadas usando genes de anticuerpo en los cuales uno o más codones de terminación se han introducido corriente arriba del sitio de -terminación natural. Por ejemplo, un gen quimérico que codifica una porción de cadena pesada F(ab' >2 se puede designar para que incluya secuencias de ADN que codifican el dominio CíL y región articulada de la cadena pesada. Los fragmentos funcionales de los anticuerpos monoclonales retienen al menos una función de enlace y/o función de modulación del anticuerpo de longitud completa del cual se derivan. Los fragmentos funcionales preferidos retienen una función de enlace de antígeno de un anticuerpo de longitud completa correspondiente (por ejemplo, retienen la capacidad de enlazar un epitope de una proteina hospedadora) . En otra modalidad, los fragmentos funcionales retienen la capacidad de inhibir una o más funciones características de la proteína hospedadora, tal como una actividad de enlace. Los anticuerpos también se pueden producir usando ratones agénicos que carecen de un gen funcional para la proteína hospedadora. Los ratones agénicos se pueden producir usando técnicas estándar conocidas por aquellos expertos en la técnica (Capecchi, Science (1989) 244:1288; Koller et al. Annu Rev Immunol (1992) 10:705-30; Deng et al. Arch Neurol (2000) 57:1695-1702). Un vector objetivo se construye el cual, además de contener un fragmento del gen que será agénico, generalmente contiene un gen resistente a antibióticos, preferiblemente neomicina, para seleccionar la recombinación homologa y un gen de timidina cinasa (TK) viral. Alternativamente, el gen que codifica la difteria toxina (DTA) se puede usar para la selección contra inserción aleatoria. El vector se diseña de modo que si la recombinación homologa ocurre, el gen resistente a neomicina se integra en el genoma, pero el gen de TK o DTA siempre se pierde. Las células madre embrionarias (ES) murino son transíectadas con el vector de objetivo linearizado y a través de la recombinación homologa se recombinan en el locus del gen objetivo que será agénico. Las células ES murino son desarrolladas en la presencia de neomicina y ganciclovir (para TK) , un fármaco que se metaboliza por TK para producir un producto letal. Por consiguiente, las células que han sufrido recombinación homologa son resistentes tanto a neomicina como ganciclovir. Los vectores que contienen DTA aniquilan cualquier célula que codifica el gen, por consiguiente ningún fármaco adicional se requiere en el medio de cultivo celular. La hibridación por análisis de Southern y RCP se usan para verificar el evento de recombinación homologa, técnicas bien conocidas por aquellos expertos en la técnica . Para generar un ratón que porta un gen objetivo interrumpido, las células ES positivas se propagan en el cultivo para diferenciar y el blastocito resultante se implante en una mujer pseudopreñada . Alternativamente, las células ES se inyectan de nuevo en la cavidad blastocoélica de una preimplantación de embrión de ratón y el blastocito luego se implante quirúrgicamente. Las células ES transíectadas y los blastocitos receptores pueden ser de ratones con diferentes colores de pelo, de modo que la descendencia quimérica se puede identificar fácilmente. A través de las técnicas de crianza los ratones agénicos homocigóticos son generados. El tejido de es Los ratones se prueba para verificar lo agónico homocigótico para el gen objetivo, por ejemplo usando hibridación por RCP y análisis de Southern. En un método alterno, el gen de objetivo usando tecnología antisentido se puede usar (Bergot et al., JBC (2000) 275:17605-17610). Los ratones agénicos homocigóticos se inmunizan con péptidos de proteína hospedadora purificados, tanto proteínas recombinantes desnaturalizadas como nativas. Después de los refuerzos subsiguientes, en las semanas 3 y 6, con el inmunógeno, los ratones se sacrificaron y los bazos se tomaron y la fusión a células de mieloma se realizó (Kort et al. Methods in Enzymol . (1999) 309:106) . Los anticuerpos de hibridomas individuales se seleccionan para la especificidad de conformación, es decir, enlace con especificidad sustancial a un conformador único. El proceso de selección se lleva a cabo con productos de proteína radioetiquetada producidos en el sistema de traducción libre de células o medios radioetiquetados o extractos de células elegidos para enriquecer un conformador contra otro. Estos productos son inmunoprecipitados usando sobrenadante de hibridoma y se introducen en un gel SDS-PAGE. Preferiblemente, los extractos libres de células se usan debido a la posibilidad de que el uso de células transíectadas podría resultar en interacciones proteína-proteína las cuales podrían bloquear los anticuerpos de enlazar un epítope específico, enmascarando así un conformador potencial . El uso de una selección de inmunoprecipitacion con productos de traducción radioetiquetados, la formación de la cual se ha tergiversado (por ejemplo, por infección viral), es la clave que distingue esta selección de un procedimiento convencional para producción de anticuerpo monoclonal . El uso de placas de 96 pocilios para selección de líneas de corriente del proceso, permiten a un técnico único seleccionar muchos cientos de hibridomas individuales en un día único) . Los procedimientos anteriores también se pueden usar para preparar anticuerpos para proteínas de capsido, y para intermediarios de montaje. De interés particular son los anticuerpos para un sitio de enlace en la proteína hospedadora para una proteína de cápsido viral y/o en una proteína de cápsido viral para una proteína hospedadora. Los anticuerpos conocidos para proteínas hospedadoras incluyen anticuerpos para el polipéptido 1 de complejo t (TCP-1) (véase Willison et al, (1989) Cell, 57: 621-632. Diversos anticuerpos se han preparado que reconocen diferentes epítopes en TCP-1 y que también reconocer epítopes en VIH-1, HCV, HBV y N MPV [véase ejemplo 19) . Los anticuerpos para el dominio de montaje de matriz (MA) de M-PMV se han reportado para inhibir el montaje de cápsido y por lo tanto pueden inhibir ya sea una proteína hospedadora y/o una proteína de cápsido viral involucrada en el montaje de cápsido. El enlace entre proteínas de cápsido y proteínas hospedadoras en intermediarios de montaje de cápsido se puede analizar y los sitios de enlace se identifican usando tecnología desarrollada por Biacore AB (www.biacore.com) . El sistema libre de células se puede usar para identificar posibles compuestos que inhiben la formación de intermediarios de montaje de cápsido necesaria para la producción de cápsidos virales, los cuales luego se pueden seleccionar por su capacidad de inhibir la replicación. En la identificación de compuestos de interés, los compuestos se prueban en células humanas bajo condiciones similares. El ensayo se puede establecer de acuerdo con cualquier número de formatos. Dos diferentes tipos de ensayos se pueden usar ya sea solos o en combinación. Para seleccionar los compuestos que bloquean o imparten la formación de cápsido viral, se usan directamente anticuerpos monoclonales o policlonales . La selección de alto rendimiento de compuestos para candidatos guía que se puede realizar usando alguna variedad de técnicas conocidas por aquellos de experiencia es la acción tal como, por ejemplo la selección de inhibición y/o inversión de la configuración de enlace inmunofluorescente distintiva que se observa entre las proteínas de cápsido viral y proteínas hospedadoras . Estos compuestos guías luego se prueban adicionalmente para especificidad. En otro ensayo, el montaje y traducción libre de células se realiza en la presencia o ausencia de un fármaco candidato en una fase líquida. El producto de reacción es entonces agregado a un sitio de inmunocaptura de fase sólida revestido con anticuerpos específicos para uno o más de los intermediarios de montaje de cápsido viral originalmente identificados usando el sistema de traducción libre de células, o el cápsido viral libre de células. En esta forma, el punto preciso de interferencia de montaje del fármaco puede ser determinado. Compuestos de derivación pueden ser primero identificados basados en investigadores de bases de datos para compuestos probablemente enlazados a un sitio activo involucrados en montaje de cápsido después probados en un sistema libre de células para la inhibición de la formación de cápsido. Tal información puede ser usada para identificar tratamientos potenciales, o combinación terapéutica contra infección viral, dirigiendo aspectos diferentes de la replicación viral. Un compuesto que se encuentra por bloquear la formación de cápsido viral por enlace a un sitio activo en un intermediario de montaje y/o proteína hospedadora en el sistema libre de célula, es entonces probado en células de mamífero infectadas con el virus desconocido. Preferiblemente, los compuestos también son seleccionados por toxicidad, incluyendo respuestas a estrés de hospederos tales como activación de proteína de golpe por calor (HSP) 70, 80, 90, 94 y caspasas (Flores et al., J. Nueroscience (2000) 20: 7622- 30) . Métodos para evaluar la activación de estas proteínas se conocen por aquellos expertos en la técnica. El sistema de traducción/monta e libre de células puede ser usado para producir grandes cantidades de cápsidos virales tipo nativo, intermediarios cápsidos o mutantes cápsidos los cuales pueden ser usados, por ejemplo, para producir vacunas. El sistema puede también ser usado como un medio para identificar compuestos que inhiben la formación de cápsidos, agregando a una célula, un compuesto que ha sido seleccionado por su habilidad para inhibir la formación de cápsidos o formación de intermediario (s) cápsido en el sistema de traducción libre de células. Para virus desarrollados, el sistema libre de células puede ser usado con plásmidos que codifican para el genoma viral completo, excepto para la proteina envuelta. De este modo, la invención incluye un método para encapsidar fragmentos o nucleicos virales genómicos de los mismos. El ácido nucleico genómico o un fragmento o un plásmido que codifica un ácido nucleico viral, se agrega a tal sistema, y es encapsidado durante le proceso de reacción. Los anticuerpos que son producidos encuentran utilidad como reactivos en ensayos de selección que valoran el estatus de la formación de cápsido viral o en ensayos usados para la selección de fármacos que interfieren con la formación de cápsidos virales, y también pueden ser usados como un diagnóstico para determinar la identidad de un virus que causa una infección viral. Los genes que codifican la región variable de anticuerpos a las proteínas cápsidos virales, pueden ser insertados en un vector apropiado para transducir células que son el objetivo de virus desconocidos, y las células traducidas expresan el intracuerpo a la proteína de cápsido viral. Veáse por ejemplo, Goncalves et ai (2002) J. Biol. Chem. 35: 32036-32045, el cual describe la neutralización funcional de la proteína VIH-1 Vif por inmunización intracelular y consecuente inhibición de la replicación viral. Detectar y caracterizar proteínas hospedadoras y/o intermediarios de montaje asociados con un número de virus o familias de virus, una biblioteca de las varias proteínas hospedadoras y/o intermediarios de montaje, puede ser desarrollada, en la cual, los elementos de la biblioteca son virus individuales o familias de virus. Cada elemento está en referencia cruzada con las características bioquímicas de las proteínas hospedadoras y/o intermediarios de montaje para tales virus o familias de virus. Las características incluyen, por ejemplo, la secuencia de aminoácido de la(s) proteína (s) hospedadora (s ) , anticuerpos que se enlazan a la(s) proteína (s) hospedadora ( s) y/o intermediarios de montaje y preferiblemente inhiben el montaje de cápsido, la secuencia de ácido nucleico de los genes de cápsido viral, series de cebadores de RCP empleadas para amplificar estos genes, las características fisicoquímicas de los cápsidos virales producidas usando el sistema de traducción libre de célula, tal como coeficiente de sedimentación, densidad de flotación y apariencia usando microscopio electrónico, y cualquier molécula pequeña que inhiba el montaje de cápsido. La biblioteca puede ser usada para determinar una diagnosis de enfermedad definitiva cuando existe ai menos, una similitud substancial entre las características de los virus desconocidos y un elemento de la biblioteca. Un protocolo de tratamiento para un individuo infectado con un virus desconocido puede ser identificado por aquellos infectados, aún si la identidad del virus es desconocida o la única característica común entre el virus desconocido y un elemento de la biblioteca es la proteína hospedadora o una porción de la misma involucrada en el enlace a la(s) proteína (s) viral durante el montaje de cápsido. Como un ejemplo, la inhibición de la producción de cápsidos del virus desconocido en el sistema libre de células con un compuesto de prueba es una indicación de que este compuesto de prueba puede ser usado como un tratamiento contra el virus. La proteína hospedadora y/o intermediarios de montaje que son identificados usando el sistema libre de células, puede ser seleccionada usando un panel que incluye anticuerpos o fragmentos funcionales del mismo a los elementos de la biblioteca de las proteínas hospedadoras y/o intermediarios de montaje asociados con el montaje de cápsido en otros virus. Preferiblemente, el panel es inmovilizado como un soporte sólido. De manera general, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo específico para la proteína hospedadora o intermediario de montaje. El anticuerpo monoclonal o fragmento de enlace es etiquetado con una etiqueta detectable, por ejemplo, una radioetiqueta o una etiqueta de enzima. Ejemplos de etiquetas de enzima que pueden estar unidas al anticuerpo incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, y ureasa y métodos para enlazar enzimas con anticuerpos son bien conocidos en la técnica. La etiqueta puede ser detectada usando métodos bien conocidos para aquellos expertos en la técnica, tales como radiografía o métodos serológicos, que incluyen ELISA o métodos de manchado. La presencia de la etiqueta es indicativa de la presencia de al menos una proteína o intermediario de montaje involucrados en el montaje de cápsido que porta un epítope con un elemento de la biblioteca. Si las características bioquímicas para el elemento incluyen formación, significa que para inhibir el montaje de cápsido interfiriendo con el enlace entre la proteína hospedadora y la(s) prcteína(s) viral involucradas en el montaje de cápsido, tales medios serán eficaces en la inhibición del montaje de cápsido de los virus desconocidos. Los siguientes ejemplos ilustran, pero no están propuestos en alguna forma, para limitar la presente invención.

EJEMPLOS MATERIALES 1. Químicos Los recursos químicos son los siguientes, a menos que se indique de otro modo abajo: Nonidet P40 (NP40) se obtuvo de Sigma Chemical Co . (St. Louis, MO) . "NIKKOL" se obtuvo de Nikko Chemicals Ltd. (Tokyo, Japón) . El germen de trigo se obtuvo de General Mills (Vallejo, CA) . La Coenzyma A de Miristoilo (McoA) se obtuvo de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) . 2. Construcciones de Plásmido Todas las construcciones de plásmido para la transcripción libre de células, se hicieron usando reacciones en cadena de la polimerasa (RCP) y otras técnicas de ácido nucleico estándares (Sambrook, J., et al., in Molecular Cloning. A Laboratory Manual). Los vectores plásmidos se derivaron de SP64 (Promega) en el cual, la región 5' no traducida de globina de Xenopus se ha insertado en el sitio Hind 111 (Melton, D. A., et ai., Nucleic Acids Res. 12: 7035-7056 (1984)). La estructura lectora abierta gag (ORF) del ADN genómico de VIH (una ciase de donación de Jay Levy; Universidad de California, San Francisco) , se introdujo corriente abajo del promotor SP6 y la región de globina no traducida. La mutación GAA se hizo cambiando la glicina en la posición 2 de Gag a alanina usando RCP (Gottlinger, H. G., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 86: 5781-5785 (1989)) . El mutante Pr46 se hizo introduciendo un codón de detención después de gly 435 (elimina p6) ; el Pr41 tiene un codón de detención después de arg 361 (en la región C terminal de p24) . Estos mutantes de truncación son comparables con aquellos descritos por Jowett, J. B. M . , et al., J. Gen. Virol 73: 3079-3086 (1992), incorporado aquí por referencia. Para hacer los aminoácidos mutantes D2, fueron suprimidos de gly 250 a val 260 (como en Hockley, D. J. et al., J. Gen. Virol. 75: 2985-2997 (1994); Zhao, Y., et al., Virology 199: 403-408 (1994)). Todos los cambios diseñados por ingeniería genética por RCP fueron verificados por secuenciamiento de ADN. El plásmido, pBRUAenv, el cual codifica para el genoma de VIH-1 completo, excepto una supresión en envoltura, se hizo y usó como se describe previamente (Kimpton et al. J. Virology (1992) 66 : 2232-99). El plásmido, WGHP68-Trl, codifica una forma truncada de 379 aminoácidos del HP68 con un codón de detención antes del segundo dominio de enlace de nucleótido (Flecha, Figura 6). Este plásmido codifica dos tercios N-terminal de WGHP68 y produce la proteína de 43 kD esperada cuando se transfiere en las células (Figura 7) . 3. Mezcla energética 35S. La mezcla energética J3S (solución base 5x) , contiene 5 mM de ATP (Boehringer Mannheim) , 5 mM de GTP (Boehringer Mannheim) , 60 mM de Fosfato de Creatina (Boehringer Mannheim) , mezcla de 19 aminoácidos menos metionina (cada aminoácido excepto metionina; cada uno es 0.2 mM) , 3"S-metionina 1 mCurie(ICN) en un volumen de 200 mierolitros a pH de 7.6 con 2 M de base Tris. 4. Amortiguador de compensación El amortiguador de compensación (10X) contiene 40 mM de HEPES-KOH, a un pH de 7.6 (U.S. Biochemicals ) , 1.2 M de KAcetato (Sigma Chemical Co.) y 2 mM de EDTA (Mallinckrodt Chemicals, París, Kentucky) .

Ejemplo 1 Síntesis de Proteína Libre de Células 1. Transcripción in vitro El plásmido que contiene la región codificante Gag se linearizó al sitio EcoRI (como se describe en el catálogo NEB) . El plásmido linearizado se purificó por extracción de fenol-cloroformo (como se describe en Sambrook, J., et al., in Molecular Cloning. A Laboratory Manual) y este plásmido se ajustó a una concentración de ADN de 2.0 mg/ml . La transcripción se llevó a cabo usando una reacción que contiene: 40 mM de Tris Ac (7.5), 6 mM de Mg Ac, 2 mM de Espermidina, 0.5 mM de ATP, 0.5 mM de CTP, 0.5 mM de UTP, 0.1 mM de GTP, 0.5 mM de trifosfato de diguanosina (cap), 10 mM de Ditiotreitol, 0.2 mg/ml de ARN de transferencia (Sigma Chemical Co . ) , 0.8 unidades/microlitro de inhibidor RNAse (Promega), 0.4 unidades por µ? de Polimerasa SP6 (NEB). Los mutantes de ADN fueron preparados como se describe por Gottlinger, H. G., et al., Proc. Nati. Acad Sci. 86: 5781-5785 (1989); Jowett, J. B. M., et al., J. Gen. Virol. 73:3079-3086 (1992); Hockey, D. J. et al., J. Gen. Virol. 75:2985-2997 (1994); o Zhao, Y., et ai., Virology 199: 403-408 (1994); estas publicaciones están incorporadas aquí por referencia. 2. Sistema de Traducción Libre de Célula La traducción de los productos de transcripción se llevó a cabo en extracto de germen de trigo que contiene j5S metionina (ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA) . El germen de trigo se obtuvo de General Mills. El extracto de germen de trigo se preparó como se describe por Erickson y Blobel (1983) supra, con modificaciones indicadas. Tres gramos de germen de trigo fueron colocados en un mortero y molidos en 10 mi de amortiguador de homogenización (100 mM de K-acetato, 1 mM de Mg-acetato, 2 mM de CaCl?, 40 mM de amortiguador HEPES, pH 7.5 (Sigma Chemical, St. Louis, MO) , 4 mM de ditiotreitol) a una pasta espesa. Lo homogenizado se raspó en un tubo centrifugo enfriado y centrifugado a 4°C por 10 minutos a 23,000 X g. El sobrenadante resultante se centrifugó nuevamente bajo estas condiciones para proporcionar un extracto de germen de trigo S23. El montaje mejorado se obtuvo cuando el extracto de germen de trigo S23 se sometió además a ultracentrifugación a 50, 000 rpm en el rotor TLA 100 (100,000 x g) (Beckman Instruments, Palo Alto, CA) por 15 minutos a 4°C y el sobrenadante se usó para traducción in vitro. Este mejoramiento proporcionó 2-3X el rendimiento obtenido en reacciones comparables usando el extracto de germen de trigo S23. El sobrenadante es referido aquí como un "sobrenadante de extracto de germen de trigo a alta velocidad". Las reacciones se realizaron como se describe previamente (Lingappa, J. R., et al., J. Cell. Biol. (1984) 125 : 99-111), excepto para modificaciones notadas abajo. 25 µ? de mezcla de reacción de traducción/transcripción de germen de trigo contiene: 5 µ? de transcripto Gag, 5 µ? de solución base 5X de Mezcla Energética de ~=S (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) , 2.5 µ? de amortiguador de compensación (Sigma Chemical Co . ) , 1.0 µ? 40 mM de gAcetato (Sigma Chemical Co . ) . , 2.0 µ? 125 µ? de CoA de miristilo (elaborado en 20 mm de Acetato de Tris, pH 7.6; Sigma Chemical Co.), 3.75 µ? 20 mM de amortiguador de acetato de Tris, pH 7.6 (U.S. Biochemicals , Cleveland, OH), 0.25 µ de cinasa de creatinina (4 mg/ml de solución base en 50% de glicerol, 10 mM de acetato de Tris; Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) , 0.25 µ? de ARNt bovino (10 mg/ml de solución base; Sigma Chemical Co . , ) y 0.25 µ? de inhibidor RNase (20 unidades/50; Promega) . Se agregó coenzima A de miristoilo (MCoA; Sigma, St. Louis, MO) a una concentración de 10 uM al inicio de la traducción cuando se indica. Las reacciones de traducción variaron en volumen desde 20 a 100 µ? y fueron incubadas a 25°C por 150 minutos. Algunas reacciones se ajustaron a una concentración final de los siguientes agentes a tiempos indicados en las Figuras y especificación: 0.2 uM de emetina (Sigma) ; 1.0 unidades de apirasa (Sigma) por mL de traducción; 0.002¾, 0.1%, o 1.0% de "NIKKOL". En experimentos de pulso-caza, las reacciones de traducción contienen "S cisteína (Amersham Life Sciences, Cleveland, OH) para radioetiquetación . Después de 4 minutos de tiempo de reacción de traducción, se agregaron 3 mM de cisteína no etiquetada, y la reacción se continuó a 25°C por tiempos de caza variables como se indica en los experimentos descritos abajo. La síntesis de proteína se inició en el sistema de traducción/montaje libre de célula, agregando un A m que codifica una proteína Gag Pr55. Alternativamente, cuando el sistema incluye medios de transcripción tales como polimerasa SP6 o T7, la reacción puede ser iniciada por la adición de ADN que codifica la proteína. La síntesis completa de proteína y montaje en cápsidos es usualmente lograda dentro de aproximadamente 150 minutos. 3. Estimación de Coeficientes de Sedimentación Estimados de valores S de complejos que contienen Gag observados en 13 mi de gradientes de sucrosa, fueron determinados por el método de McEwen, C.R., Anal. Biochem. 20 : 114-149 (1967) usando la siguiente fórmula: S = AIAo2t en donde S es el coeficiente de sedimentación de la partícula en unidades Svedberg, ?? es el tiempo integral para sucrosa en la zona separada menos el tiempo integral para sucrosa en los meniscos del gradiente, ? es la velocidad del rotor en radianes/seg y t es el tiempo en segundos. Los valores para I fueron determinados por partículas de una densidad de 1.3 g/cm3 y por una temperatura de 5°C, de conformidad con las tablas publicadas por McEwen, C-. R., Anal. Biochem. 20: 114-149 (1967) . Los valores S calculados para diferentes fracciones en los gradientes son etiquetados como marcadores arriba de cada rastro de ingrediente mostrado aquí. Los marcadores tales como BSA (5-S), macroglobulina (20-S), cápsidos de virus de Hepatitis B (100-S), subunidades ribosomales (40-S y 60-S) , y polisomas (> 100-S), fueron usados para calibrar los gradientes y confirmar los valores S calculados. Sin embargo, se debe notar que las asignaciones de valor S para cada complejo que contiene Gag, son estimados aproximados y pueden variar por aproximadamente ± 10%.

Ejemplo 2 Traducción de la Proteína Gag Pr55 en Sistema Libre de Células El propósito de este experimento fue mostrar que los cápsidos formados en el sistema libre de células descrito en el Ejemplo 1, son substancialmente los mismos como aquellos formados en células. Las células Cos-1 (Instalaciones de Cultivos Celulares de la Universidad de California) , fueron transfectadas por el método a base de adenovirus (Forsayeth, J. R. y García, P. D., Biotechniques G7: 354-358 (1994)), usando plásmidos pSVGagRRE-R (un vector de expresión de mamífero que codifica Gag así como también el elemento de respuesta Rev requerido para la expresión de Gag en células de mamífero) y pSVRev (un vector de expresión de mamífero que codifica el gen Rev, el producto del cual se requiere para la expresión de Gag en células de mamífero) (Smith, A. J., et al., J. ViroJ. 67: 2266-2275 (1993)). Estos vectores fueron proporcionados por D. Rekosh (Universidad de Virginia) . Las células fueron también transfectadas con pBRUAenv. Cuatro días después de la transfección, partículas de VIH inmaduras fueron purificadas del medio de cultivo por sedimentación a través de 4 mi de un amortiguador de sucrosa al 20% en un rotor SW 40 a 29, 000 rpm por 120 minutos (Mergener, K., et al., Virology 186: 25-39 (1992)). La pelotilla se cosechó, se almacenó en alícuotas a -80°C, y se trató con amortiguador de NP40 al 1% solo antes de usarse para remover las envolturas. Estos cápsidos de VIH inmaduros auténticos desenvueltos fueron usados como estándares y analizados en paralelo con los productos de las reacciones libres de células por una variedad de métodos que incluyen sedimentación por velocidad, centrifugación por equilibrio, y microscopía de electrón. Se muestra en la Figura 2, una comparación de la migración del cápsido a través de un gradiente CsCl isopicnico, en donde los cápsidos formados en el sistema de traducción/montaje libre de células, se muestran en la Figura 2A, y los cápsidos formados en las células Cos transfectadas, se muestran en la Figura 2B. La traducción libre de células y las reacciones de montaje que contienen 10 uM de MCoA y J¾S de metionina, fueron programadas con transcripción de VIH Gag e incubadas bajo las condiciones detalladas en el Ejemplo 1. Al final de la reacción, las muestras fueron diluidas en amortiguador que contiene NP40 al 1% (un detergente no iónico) , y separadas en fracciones solubles y particuladas en gradientes de etapa sucrosa, de conformidad con los métodos estándares conocidos en la técnica que emplean etapa de sucrosa o gradientes lineales como sean apropiados. La fracción particulada se colectó y analizó por sedimentación por velocidad en 13 mi de un gradiente de sucrosa lineal al 15-60% (rotor Beckman SW40 Ti, 35, 000 rpm, 75-90 min) . Las fracciones del gradiente fueron colectadas y sometidas a análisis de electroforesis en gel de pol iacri lamida de laurilsulfato de sodio (SDS-PAGE) de conformidad con los métodos estándares. El polipéptido Gag presente en las fracciones fue visualizado por inmunomanchado con un anticuerpo monoclonal a Gag (Dako, Carpenteria, CA) . Se detectó un anticuerpo unido usando un sistema de quimioluminiscencia mejorado (Amersham) . La densidad de banda se determinó como se describe bajo el análisis de imagen abajo, y las densidades de banda relativa fueron confirmadas por películas de cuantificación que representan tiempos de exposición diferentes. Se realizó un análisis paralelo de la fracción particulada sometiendo la fracción particulada a separación de gradiente CsCl (2 mi de CsCl isopícnico, 402.6 mg/ml; 50,000 rpm en un centrifugo Beckman TLA 100) , de conformidad con los métodos estándares. Las fracciones fueron colectadas y valoradas para el producto de traducción Gag (Pr55) (arriba del gradiente está la fracción 1, círculos abiertos, FIG. 2B) . Las fracciones que contienen Pr55 radioetiquetado también fueron sometidas a análisis de SDS PAGE; el contenido Gag de las varias fracciones fue estimado por densitometría de exploración de autoradiógrafos hechos de los geles. Ambas condiciones producen bandas de proteínas radioetiquetadas idénticas bajo estas condiciones. El material en la fracción particulada (>500-S) fue además, analizado por una variedad de métodos como se describen abajo. Los cápsidos detergentes generados en el sistema libre de células y los cápsidos auténticos tratados con detergente (desenvueltos) , se comportaron como una población relativamente homogénea de partículas de aproximadamente 750-S (comparado con las Figuras 2A y 2B) , con una densidad de flotación de 1.36 g.cm3. Adicionalmente, los cápsidos montados libres de células y los estándares auténticos, fueron idénticos en tamaño como se juzga por la filtración en gel. El análisis de microscópico de electrón reveló que los cápsidos elaborados en el sistema libre de célula fueron morfológicamente similares a los cápsidos auténticos liberados de células transíectadas y tienen el diámetro esperado de aproximadamente 100 nm (Gelderblom, H.R., AIDS 5:617-638 (1991)). De este modo, la proteína Pr55 radioetiquetada sintetizada en montajes del sistema libre de células en partículas que estrechamente se montan en cápsidos de VIH inmaduro auténtico generado en células trans fectadas , como se juzga por apariencia EM, así como también el criterio bioquímico de tamaño, sedimentación, coeficiente y densidad de flotación. La traducción del transcripto VIH Gag que codifica Pr55 en el sistema libre de célula, resultó en la síntesis de aproximadamente 2 ng de la proteína Pr55 por microlitro de reacción de traducción. Se aprecia que la producción incrementada podría lograrse por ejemplo, empleado un sistema de traducción de flujo continuo (Spirin, A. S., et al., Science 242: 1162- 1164 (1988) aumentado con los factores específicos y componentes descritos anteriormente.

Ejemplo 3 Imunoprecipitacion de Intermediarios de Montaje de cápsido La inmunoprecipitación bajo condiciones nativas se realizó diluyendo muestras 2 \i de reacciones libres de células en 30 µL de amortiguador NP40 al 1¾, y agregando aproximadamente 1.0 g de un anticuerpo monoclonal 23c (Institute for Cáncer Research, Londres, UK Stressgen, Vancouver, BC) . Las muestras que contienen anticuerpos fueron incubadas por una hora en hielo, se agregó una suspensión al 50% de Perlillas de Proteína G (Pierce, Rockford, IL) o Affigel de Proteína A (BioRad, Richmond, CA) , y las incubaciones con mezclado constante se realizaron por una hora a 4°C. Las perlillas se lavaron dos veces en amortiguador de NP40 al II que contiene 0.1 M de Tris, pH 8.0, y después dos veces en amortiguador de lavado (0.1 M de NaCl, 0.1 M de Tris, pH 8.0, 4 mM de MgAc) . Las proteínas fueron eluidas de las perlillas por ebullición en 20 pL de amortiguador de muestra SDS y fueron visualizadas por SDS-PAGE y autoradiografía, de conformidad con los métodos estándares bien conocidos en la técnica.

Ejemplo 4 Identificación de Intermediarios de Cápsido de VIH El propósito de este experimento fue usar el sistema libre de células para detectar intermediarios de montaje de VIH que podrían hacer otro modo, difícil o imposible detectarlos. Se analizó una reacción libre de células continuamente etiquetada por sedimentación por velocidad. La traducción libre de células y el montaje Pr55 se realizaron como se describe en el Ejemplo 1 anterior. Después de la terminación de la reacción libre de células, los productos fueron diluidos en amortiguador de muestra NP40 al 1% en hielo, y fueron analizados por sedimentación por velocidad en 13 mi de gradientes de sucrosa al 15-601. Las fracciones fueron colectadas de la parte superior de cada gradiente, y la cantidad de proteína Pr55 radioetiquetada en cada fracción, se determinó y expresó como porcentaje de la proteína Pr55 total presente en la reacción. Las posiciones calculadas de los complejos IOS, 80S, 150S, 500S y 750S, son indicadas con marcadores arriba de las figuras (véase Figura 3A) . 750S representa la posición del cápsido de VIH inmaduro auténtico (desenvuelto). Los complejos intermediarios que tienen coeficientes de sedimentación calculados de IOS, 80S, 150S y 500S, son referidos aquí como intermediarios A, B, C y D, respectivamente. Experimentos adicionales indican que los intermediarios identificados representan intermediarios de montaje, como se evidencia por la observación de que estuvieron presentes en grandes cantidades en puntos de tiempo tempranos, y fueron disminuidos a tiempos tardíos durante la reacción. El análisis de Pulso-caza se usó para seguir un grupo pequeño de cadenas Pr55 radioetiquetadas con el tiempo durante la reacción de montaje. La traducción y montaje libre de células de Pr55 se realizó de conformidad con los métodos expuestos en el Ejemplo 1, excepto que la JOS cisteína se usó para radioetiquetación . A 4 minutos en la reacción de traducción, un exceso de cisteína no etiquetada se agregó a la reacción, de manera que no pudiera ocurrir radioetiquetación adicional. Alícuotas de la reacción fueron colectadas a 25 minutos (Figura 3C) y 150 minutos (Figura 3D) en la reacción. Un microlitro de cada alícuota se analizó por SDS-PAGE y AR para revelar la cantidad total del producto de traducción de Pr55 radioetiquetado (indicado por la flecha en la Figura 3B) presente en cada tiempo de caza. El resto de las alícuotas fueron diluidas en amortiguador de muestra NP40 al 1% en hielo y fueron analizadas por sedimentación por velocidad en 13 mi de gradientes de sucrosa al 15-60% (Figuras 3C y 3D respectivamente), en la manera descrita para la Figura 3A anterior. La cantidad total de Pr55 radioetiquetado fue la misma al minuto 25 y minuto 150 en la reacción de pulso-caza, indicando que ni la radioetiquetación adicional ni la degradación de las cadenas de Pr55 ocurren después de 25 minutos, y confirma que la misma población de cadenas Pr55 fue analizada en ambos puntos de tiempo. Después de 25 minutos de tiempo de reacción, todo el Pr55 radioetiquetado se encontró en los complejos A, B y C (Figura 3C) , sin cadenas Pr55 no radioetiquetadas presentes en la región del cápsido 750S completado. Mientras los complejos A y B parecen hablar de aproximadamente las posiciones IOS y 80S del gradiente, el complejo C parece un respaldo menos distinto en aproximadamente la posición 150S. En marcado contraste, la examinación de la reacción de montaje a 150 minutos, mostró que una cantidad significante de Pr55 radioetiquetado se montó en el cápsido completado que migra en la posición 70S (Figura 3D) . De manera correspondiente, la cantidad de Pr55 en los complejos A, B y C fue disminuida por precisamente, la cantidad que fue ahora encontrada por ser montada, demostrando que al menos algunos de los materiales en los complejos A, B y C, constituyen intermediarios en la biogénesis de cápsidos 750S completados. A tiempos de caza extremadamente cortos (es decir, 13 minutos) , cuando solamente algunas de las cadenas radioetiquetadas ha completado la síntesis, las cadenas Pr55 de longitud completa se encontraron exclusivamente en el complejo A en 13 mi de gradientes de sucrosa, mientras las cadenas nacientes que no están aún completadas, estuvieron en la forma de polisomas mayores de 100S. De este modo, las cadenas nacientes se asocian con el polímero de Gag, constituyen el material iniciador en esta trayectoria, y el complejo A IOS, el cual contiene cadenas Gag completadas, fue probablemente el primer intermediario en la formación de cápsidos inmaduros. Por lo tanto, los complejos B y C representan intermediarios de montaje últimos en la trayectoria de formación de cápsido. Como confirmación adicional que los complejos A, B y C constituyen intermediarios en el montaje de cápsido de VIH, el bloqueo del montaje se estudió para determinar si las cadenas Gag acumuladas en la forma de complejos con valores S, corresponden a los valores S de A, B y C, y si el bloqueo a diferentes puntos a lo largo de la trayectoria podría resultar en la acumulación de complejos A, B y C en varias combinaciones, como se determina por el orden de su aparición durante el curso del montaje. Por ejemplo, si existe la trayectoria ordenada de intermediarios, entonces bloquear en los puntos tempranos en la trayectoria debe resultar en acumulación de uno o dos complejos que contienen Gag que corresponden a intermediarios de montaje putativos tempranos, mientras el bloqueo a un punto muy tardío en la trayectoria, podría resultar en la acumulación de todos los intermediarios de montaje putativos, pero no en el producto de cápsido completo final. El montaje de cápsido se rompió agregando ya sea detergente de apirasa post-traduccionalmente o cotraduccionalmente, y los productos de reacción fueron analizados mediante sedimentación por velocidad. El material en las fracciones que corresponden a los intermediarios de montaje y cápsidos completos, fue cuantificado y se presenta en la Tabla 1 abajo.

Tabla 1 Efecto de Bloqueo Farmacológico en Montaje de Cápsido del VIH A B/C Cápsido final No tratado 2798 5046 739 + apirasa 2851 5999 133 + detergente 2656 6130 189 La reacción no tratada contiene Pr55 en complejos A, B y C, asi como también un pico en la posición de cápsido 750S final, mientras las reacciones tratadas no contienen picos en la posición del producto de cápsido final (Tabla 1). El tratamiento con ya sea apirasa o detergente, resultó en la acumulación de material adicional en los complejos B y C, pero no resultó en la acumulación de material adicional en el complejo A. Esto es consistente con la idea que los complejos B y C son los precursores más inmediatos de los cápsidos completados 750S, y que estas intervenciones bloquean la conversión de complejos B y C en el producto final de cápsido completamente montado.

Ejemplo 5 Proteínas de Células Hospedadoras involucradas en la formación de intermediarios de cápsidos del VIH Como chaperonas moleculares son probablemente candidatas para promover el montaje péptido, los anticuerpos dirigidos contra los epitopes de varias chaperonas moleculares fueron seleccionados por su habilidad para co-inmunoprecipitar cadenas Gag radioetiquetadas sintetizadas en el sistema libre de células. Uno anticuerpo monoclonal 23c (23c) , co-inmunoprecipitó cadenas Gag radioetiquetadas bajo condiciones nativas (Fig. 4A) , pero no después de la desnaturalización, la cual rompe las interacciones de la proteina-proteina nativa (Fig. 4B) . Este anticuerpo reconoce un epitope de 3 aminoácidos (LDDCOOH) presente en varias proteínas eucarióticas, que incluyen la chaperona molecular TCP-11~' 1J . El 23c falla al co-inmunoprecipitar otros substratos traducidos en el sistema libre de células que incluye ß-tubilina, -globina, la proteína del cápsido del Virus de la Hepatitis B (núcleo), y un mutante de montaje incompetente en Gag que está perdiendo los dominios NC y p6 (p41), bajo condiciones nativas (Fig. 4A) , o después de la desnaturalización (datos no mostrados) . La co-inmunoprecipitación de cadenas VIH-1 Gag por 23c, se inhibió de una manera dependiente de dosis por preincubación de 23c con extracto de germen de trigo (WG) (Fig. 4C) . Estos datos indican que el extracto de WG, el cual se usó como la fuente de los factores citosólicos para la reacción de montaje libre de célula, contiene una proteina reconocida por 23c que selectivamente se asocia con el montaje de cadenas de VIH-1 Gag. 23c reconoce una proteina única de WG de 68 kD por inmunoteñido (Fig. 4D) y por inmunoprecipitación bajo condiciones nativas (Fig. 4D, compare lineas 1 y 3) . La sedimentación por velocidad del extracto de WG reveló que esta proteina de WG de 68 kD (WGH68 o HP68), migró en una fracción 5S (datos no mostrados) . Su peso molecular y características de sedimentación, indican que HP68 no corresponde a ya sea las proteínas bien caracterizadas reconocidas por 23c, las cuales incluyen la chaperona molecular TCP-1 (una proteína de 55 kD que forma una partícula 20S) y pl05, un componente de 105 kD del complejo14 cotámero de Golgi. El reconocimiento de P68 por el manchado Western o inmunprecipitación, se inhibió por adición de un péptido que contiene LDDCOOH, pero no un péptido de control, a 125 uM (datos no mostrados), indicando que 23c reconoce HP68 por este epitope como se esperaba. Para determinar a que tiempo durante el montaje de cápsido HP68 se asocia con Gag, un grupo pequeño de cadenas Gag es radioetiquetado por reacciones de pulsación con 35Scisteina y caza con cisteina no etiquetada. Las co-inmunoprecipitaciones fueron realizadas a diferentes tiempos durante la reacción de montaje de pulso-caza. Mientras la cantidad total de Gag radioetiquetado en la reacción permanece constante después de los primeros 20 minutos (datos no mostrados), la cantidad de Gag co-inmunoprecipitado por 23c, se incrementa durante el curso de la reacción para alcanzar un pico en 120 minutos (Fig. 5A) . Estos datos sugieren que el SGHP68 se asocia con Gag, no durante la síntesis de Gag (el cual es ampliamente completado por 45 minutos en la reacción libre de célula'), sino post-traduccionalmente, cuando las cadenas Gag fueron formando complejos multiméricos que culminan en montaje del cápsido del VIH-1 inmaduro completo. La rápida caída de la inmunoreactividad de 23c durante la tercera hora de la reacción de montaje (Fig. 5A) , sugiere que el HP68 se asocia con Gag solamente temporalmente, liberando cadenas Gag una vez que el montaje está completo. Para determinar si el HP68 está asociado con intermediarios de montaje específico, una reacción libre de células programada con transcripto Gag se analizó por sedimentación por velocidad y las fracciones fueron sometidas a co-inmunoprecipitación con 23c. El análisis de los productos totales en estas fracciones reveló que las cadenas Gag radioetiquetadas estuvieron presentes en la posición de cápsido inmaduro completado 750S (barra oscura, figura 5B) , asi como también en las posiciones de los intermediarios de montaje previamente descritos IOS, 80S y 500S. Por el contrario, cadenas Gag fueron co-inmunoprecipitadas por 23c solamente desde las fracciones 10-80S y 500S (Figura 5C) . Un gradiente con alta resolución en el intervalo de 10-80S, mostró que el intermediario 80S, no el intermediario IOS, cuenta para la mayoría de la inmunoreactividad 23c en este intervalo (datos no mostrados). Se analizó una reacción de montaje de cápsido del Virus de la Hepatitis B libre de células en paralelo, como un control (datos no mostrados) . Las cadenas de núcleo HBV, las cuales forman ambos intermediarios de montaje y cápsidos completamente montados en el sistema libre de célula13, no fueron co-inmunoprecipitadas por 23c. De este modo, consistente con los resultados del curso de tiempo (Fig. 5A) , el análisis de complejos que contienen Gag indica que el HP68 fue selectivamente asociado con cadenas VIH-1 Gag recientemente sintetizadas, no con cápsidos 750S completamente montados, no con intermediarios de montaje de un virus relacionado.

Ejemplo 6 Purificación, Secuenciamiento e Identi icación de proteína hospedadora de VIH Para purificación de inmunoafinidad, se centrifugó 1 mi de extracto de WT a 100, 000 rpm en un rotor Beckman TL 100.2 por 15 minutos. El sobrenadante se sometió a inmunoprecipitación usando 50 ug de anticuerpo 23c purificado de afinidad (Stressgen) o una cantidad equivalente de anticuerpo de control (a-HSP 70, Affinity Reagents) . Los eluatos de inmunoprecipitación fueron separados por SDS-PAGE y transferidos a una membrana de difluoruro de polivinilideno . Se observó una banda única de 68 kD por teñido de Coomassie en la línea de inmunoprecipitación 23c pero no en la columna. Una porción de esta banda se escindió para microsecuenciamiento (ProSeq, Salem, MA) y el resto se usó para inmunoteñido, confirmando que la banda se reconoció por el anticuerpo 23c. La proteína purificada, la cual se bloqueó en el N-término, se desdobló con CNBr y se trató con o-ftalaldehído para permitir el microsecuenciamiento selectivo usando degeneración Edman de péptidos que contienen prolina cerca del N-término. Se sintetizaron los siguientes oligonucleótidos del 3' degenerados que corresponden a la secuencia peptídica de WGHP68 3' : ATGAATTC (ACTG) GG (ACTG) CG (GA) TA (GA) TT (ACTG) GT (ACTG) GG (GA) TC (SEC ID NO. 3) y ATGAATTC (ACTG) GG (CT) CT (GA) TA (GA) TT (ACTG) GT (ACTG) GG (GA) TC (SEC ID NO. 4) . La región codificante WGHP68 se amplificó por RCP usando ADNc de WG (Invitrogen), como la plantilla, los oligos 3' corresponden a la secuencia peptídica C-terminal de WGHp68 y los oligos 5' corresponden al vector en el cual el ADNc se clonó. Esta reacción de RCP se realizó cuatro veces independiente y cada vez proporcionó un producto de 2 kB único. Estos productos de RCP fueron ligados en vectores por clonación de TA (Invitrogen). El secuenciamiento de ADN reveló que cada producto de ADNc es idéntico. Los extremos codificantes y no codificantes de 3' y 5', se obtuvieron a través de reacciones de RACE RCP anidadas usando oligos degenerados correspondientes a secuencias en la región interna de HP28. De los clones de ADNc traslapantes, se definió una estructura lectora abierta completa para WGHP68. El inicio se identificó por la presencia de la secuencia consenso Kozak definida en la metionina de inicio, la presencia de dos codones de detención en estructura corriente arriba de la primera metionina, la ausencia de codones ATG corriente arriba del sitio de inicio presuntivo (Kozak, Ma m Genome (1996) 7:563-74), y por homología al homólogo humano en GenBank (Bisbal et al. J Biol Chem, (1995) 270: 13308-17) . La secuencia codificante para WGHP68 (SEC ID NO: 59, ha sido depositada en el GenBank bajo el número de acceso AY059462. Se generó antisuero policlonal de conejo contra los péptidos C-terminal de Hu y WGHP68 (Fig. 6) , y contra los aminoácidos N-terminales de la RNase L humana inyectando conejos con péptidos acoplados a KLH. El antisuero aHuHP68b purificado de afinidad, se preparó por antisuero que enlaza al péptido C-terminal HuHP68 acoplado a agarosa y que se eluye con glicina. Las células Cos-1 se transíectaron usando plásmidos pCMVRev y PSVGagRRE-R de expresión Gag se describe en Simón et al., J. Virology, (1997) 71:1013-18. Se construyeron plásmidos HP68 para la expresión de mamífero usando RPC para insertar regiones codificadas para GHP68, aminoácidos 1-378, Nhel/Xbal de pCADN 3.1 { Invitrogen) . Se secuenciaron regiones codificadas de todos los constructos. Las células se transfectaron usando Lipofectamina Gibco (Cos-1) o Lipofectamina Plus (293T) . Todas las transfecciones usan una cantidad constante de ADN (18 pg por 60 mm del disco) . Se cambió el medio 24 horas después de la transfección y la cosecha se realizó 28 ó 60 horas después de la transfección para inmunofluorescencia e inmunomanchado respectivamente. Para inmunofluorescencia, las células se fijaron en paraformaldehído, permeabilizado con tritón al 1%, y se incubaron con anticuerpo HIV-1 Gag de ratón (1:50) y antisuero HuHP68 de afinidad purificado (1:2000), seguido por Cy3 y Cy2 secundariamente acoplado (Jackson) (1:200). Se cuantificaron 178 células. Para inmunomanchado en la Figura 7, se agrega IgG de rata al medio como un indicador a 10 ug/ml al tiempo de cosecha, y las células se cosechan en amortiguador muestra SDS con ebullición. Para cuantificación de inmunomanchados, se compararon las bandas en una curva estándar de inmunomanchado generada con cantidades conocidas de muestra. Para inmunoprecipitaciones seguido por inmunomanchado (Fig. 8 y 9) , se acopló antisuero -HuHP68 de afinidad purificado descrito anteriormente a perlillas de Proteina A (7 mg/ml gotas) para generar aHuHP68b. Se transfectaron células Cos-1 confluentes en un disco de 60 mm, se cosecharon en amortiguador NP40 300 µ? y se inmunoprecipitaron 100 µ? de lisina con 50 µ? de HuHP68b. Se analizaron los inirmnoprecipitados por SDS-PAGE seguido por inmunomanchado con anticuerpos descritos. Se inmunosuprimió el extracto G (150 µ?) por 45 minutos a 4°C con 100 µ? de perlillas acopladas al agonista WGHP68 del anticuerpo. Se programaron reacciones (15 µ?) libres de cúlulas (Lingappa et al., J. Cell Biol. 136 : 567-81 (1997)) usando WG no suprimido o WG suprimido. Se agregó a algunas reacciones que contienen WG suprimido, WGHP68-GST purificado o proteina de fusión HuHP68-GST o GST solo (2 µ? de aproximadamente 20 ng/µ?) al inicio de la reacción.

Después de 3 horas a 26°C, se agregó NP40 a una concentración final de 1% y las reacciones se sometieron a sedimentación por velocidad (5 mi, 15-601 de ingredientes de sucrosa, rotor Beckman MLS55: 45,000 rpm, 45 minutos). Treinta fracciones, se colectaron usando un fraccionado , fueron analizadas por SDS-PAGE y AR, seguido por densitometria de Gag en cada linea. Para la digestión de proteinasa K, se colectaron alícuotas de fracciones de regiones 500S y 750S del gradiente, se colectaron y sometieron a incubación por 10 minutos a temperatura ambiente con ya sea sin Proteinasa K o 0.1 µ?/ml de Proteinasa K. Se terminó la digestión agregando SDS y se congeló. Las muestras se analizaron por SDS-PAGE y AR. Las gráficas muestran promedio de tres experimentos independientes (+/-SEM) . Para generar HP68 purificado, WGHP68 y HuHP68 se subclonaron en un vector pGEX (Pharmacia) , para codificar proteínas de fusión que contienen GST en el N-término. Se induce la expresión con IPTG 1 mM por 3 horas; se agrega sarcosilo (0.51) y se agregó PMSF (0.75 mM) después de la sonicación. Se incubó el sobrenadante 17,000 x g con perlillas de glutationa y se eluyó con 40 mM de glutationa en 50 mM de Trips, pH 8.0. Se determinó la concentración de proteína de fusión y GST en eluato usando el ensayo de proteína Plus Coomassie (Pierce) . Dos reacciones libres de células se programaron con transcripto VIH-1 Gag y WG de inmunosupresión, y se agregó WGHP68-GST a una de estas reacciones. En paralelo, las células se transíectaron resultando en expresión de Gag y liberación de partículas VIH-1 inmaduras. Las reacciones y medio de células transfectadas libres de células transfectadas se trataron con NP40 al 1% para remover las envolturas, y las membranas asociadas con cápsidos, sometidas a sedimentación por velocidad en 2 mi de ingredientes de sucrosa al 20-26% (rotor Beckman TLS55, 35 min, 45,000 rpm) . Se aisló germen de trigo HP68 (WGHP68) de extractos de WG por purificación de inmunoafinidad usando anticuerpo 23c. El microsecuenciamiento proporcionó dos secuencias bien definidas de 24 o más amino ácidos. Cada secuencia fue aproximadamente 70% homologa a una diferente región de una proteína de 68 kD sola identificada como inhibidor R ase L humano (Bisbal et al., JBC (1995) 270:13308-17; GenBank A57017, SEC ID NO: 6) (Figura 6) . Usando oligonucléotidos degenerados (SEC ID NOs : 3 y 4) que corresponden al péptido C-terminal, se amplificó un ADNc de 2 kB de una mezcla de ADNc WG. El secuenciamiento revela que este ADNc tiene 70% de identidad total al ADNc codificado por el inhibidor RNase L de humano a 68 kD (aquí nombrado HuHP68) (Bisbal et al. JBC (1995) 270:13308-17; Bisbal et al. Methods Mol Biol (2001) 1600:183-98). La estructura lectora abierta WGHP68 se deduce y su secuencia de aminoácido completa se pronostica (Fig. 6) .

La secuencia de aminoácido 604 de WGHP68 muestra 71% de identidad total con la secuencia de aminoácido 599 pero del inhibidor RNAse L humano. Tanto WGHP68 como HuHP68 contienen dos porciones canónicas que se enlazan a ATP/GTP (Traut T. Eur J. Biochem (1994) 222:9-19) asi como al epitope LDD-COOH (Fig. 6) . Se conoce HuHP68 por enlazar e inhibir R ase L (Bisbal et al. JBC (1995) 270:13308-17; Bisbal et al. Methods Mol Biol (2002) 160:183-98), en nucleasa dependiente de interferona asociada con polisomas (Salehzada. et ai JBC (1991) 266:5808-13; Zhou et al. Cell (1993) 72:753-65) y activadas por la trayectoria de oligoadenilado unido a interferona sensitiva 2' -5' (2-5S) . La inducción y activación dependiente de interferona de RNase L resulta en degradación de muchos ARNs virales (Player et al, Pharmacol Ther. (1998) 78:55-113; Samuel C. Virology (1991) 183:1-11; Sen et ai. JBC (1992) 267:5017-20). Previamente, la sobreexpresión del inhibidor RNAse L de 68 kD (HuHP68) en células infectadas con VIH-1 se ha mostrado por incrementar la producción de virión por la actividad de reducción de RNase, que resulta en niveles altos de proteina especifica de ARN VIH-l y VIH-1 (Martinand et ai. J. Virology (1999) 73:290-6). Estos hallazgos de que GHP68 se enlaza a los intermediarios post-traduccionales , que contienen Gag durante el montaje de cápsido de VIH-1 libre de célula, conducen a investigación adicional de si HuHP68 se enlaza a y actúa en cadenas Gag post-traduccionalmente completamente sintetizadas en células, además de enlazarse e inhibir RNase L previamente descrito (Salehzada et al. JBC (1991) 266:5808-13; Zhou et al. Cell (1993) 72:753-65).

Ejemplo 7 Asociación De HP69 Con Células Humanas Infectadas Con VTH-1 Gag Para analizar la función de HP68 en células, se genera un anticuerpo policlonal de péptido especifico contra ambos residuos internos y C-terminal de WGHP68, y residuos C-terminal de HuHP68. Este antisuero específicamente reconoce una proteína de 68 kD en WG y en células de primate respectivamente, por inmunoprecipitación, así como manchado Western. La detección de la banda de 68kD se eliminó por pre-incubación de cada anticuerpo con el péptido contra el cual se dirige. El antisuero de afinidad purificado para HuHP68 fue generado y acoplado a perlillas de Proteína A (o¡HuHP68b) , y se encontró tener una alta afinidad tanto para humanos como para HP68 de simio. Para determinar sí HP68 se asoció con cadenas VIH-1 Gag montadas en células humanas, células 239T humanas se transfectaron con un plásmido (pBRUAenv) que codifica el genoma de VIH-1 completo excepto para una porción suprimida del gen'5 env. Las células se cosecharon en un detergente no iónico y se sometieron a inmunoprecipitación bajo condiciones nativas y después a desnaturalización usando cxaHuHP68b. Se analizaron los inmunoprecipitados por manchado Western usando un anticuerpo monoclonal para VIH-1 Gag. El VIH-1 Gag fue co-inmunoprecipitado por aHuHP68 bajo condiciones nativas pero no después de la desnaturalización (Figura 8A) . El HP68 parece asociarse con Gag post-traduccionalmente . Estos datos revelan que HuHP68 se asocia con VIH-1 Gag en células humanas que producen viriones VIH-1 maduros. Investigaciones adicionales revelan que el HP68 se asoció con Gag en RNase tratadas y lisados de células sin tratar se analizaron en paralelo (Figura 8A) . Estos hallazgos de que HuHP68 se enlaza completamente a cadenas Gag sintetizadas, y no en la ausencia de ARN intacto, indican que esta proteina hospedadora se une en complejos post-traduccionales que contienen Gag. Como se muestra en la Figura 8B, el Gag se asoció con HP68 bajo condiciones nativas, pero no después de la desnaturalización cuando se inmunoprecipita con o¡HuHP68b. Esto confirma que el HP68 se enlaza a VIH-1 Gag en la ausencia de la proteasa VIH-1 y otras proteínas específicas de VIH-1. Como se muestra en la Figura 8C, el HP68 se asocia con Gag de tipo nativo y con montaje competente p46 mutante, pero no fue asociado con un montaje incompetente p41 mutante. Así, el HP68 se asocia específicamente con montaje de cadenas Gag en células de mamífero, como se hace en el sistema libre de célula. Para confirmar que el HP68 se asocia con Gag en células infectadas por VIH-1, se realizaron co-inmunoprecipitaciones en lisados de células T humanas que producen infecciones de VIH-1 completas (células ACH-2) . El Anti-HuHP68 co-inmunoprecipita cadenas de VIH-1 Gag bajo condiciones nativas pero no después de la desnaturalización en células ACH-2 crónicamente infectadas, estimuladas con acetato de forbol miristato (PMA) , las cuales liberan altos niveles de infección de VIH-1. Los mismos resultados se observaron con células ACH-2 no estimuladas (datos no mostrados) , las cuales producen bajos niveles de infecciones virales. La confirmación de co-asociación de HP68 y Gag se demostró usando microscopía de inmunofluorescencia de células Cos-1 transfectadas con el vector pBRU ñenv de expresión VIH-1 (Fig. 10, columnas 1-3) en doble etiquetado con anticuerpos para VIH-1 Gag y HP68. El VIH-1 Gag se expresa en aproximadamente 40% de células, y se encontró en un patrón predominantemente agrupado (Fig. 10B, E y H) que probablemente representa la localización de Gag a sitios de formación de partículas y que se destruyen en la membrana-32 del plasma. El HP68 teñido revela dos diferentes patrones de localización. El HP68 se presenta en un patrón difuso en 100% de las células que fallan para llegar a ser transfectadas y no expresan VIH-1 Gag (dos células a la izquierda en la Figura 10A-C) , así como en 100% de células de control que son transíectadas con constructos que expresan proteínas de control. En células que expresan VIH Gag, también se encontró HP68 en un patrón aproximadamente agrupado (Figura 10D y G) . Las figuras 10 C, F y I muestran una imagen difundida donde hubo una notable co-localización de HP68 y Gag en el agrupamiento ordinario amarillo. El reclutamiento de HP68 en agrupamientos que contienen Gag se observa en 100% de células que expresan VIH-1 Gag. Por el contrario, cuando las células se transíectaron con pBRUp41Aenv, el cual codifica un truncación de montaje defectivo de Gag (p41), no se encontró HP68 en un patrón de agrupamiento o co-localizado con VIH Gag (Figuran 10G-I) .

Ejemplo 8 El Complejo HP68 Gag Selectivamente se Asocia con VIH-1 Vif pero no con RNase L El propósito de este experimento fue determinar sí el complejo que contiene HP68-Gag post-traduccional que involucra una formación de virión es distinto del complejo que contiene RNase L post-transcripcional, aún a pesar de que ambos contienen HP68. Las células Cos-1 que expresan pBRUñenv se sometieron a inmunoprecipitación usando aHuHP68b seguido por inmunomanchado con anticuerpos a Vif y Nef para determinar si cualquiera de estas proteínas virales están presentes en el complejo HP68. El inmunomanchado también se realizó con anticuerpos a las proteínas RNase L celulares y actina. HuHP68b co-inmunoprecipita .Gag y Vif de las células bajo condiciones nativas pero únicamente inmunoprecipita VIH-l Gag bajo condiciones nativas (Fig. 11A) . Además, exposiciones prolongadas revelan que en células que expresan pBRUAenv aHuHP68b co-inmunoprecipita GagPol de longitud completa, el cuales debe estar presente junto con Gag en viriones de montaje (datos no mostrados). El VIH-l Vif, el cual está involucrado en el montaje de viriones, fue también co-inmunoprecipitado bajo condiciones nativas pero no en desnaturalizadas. Por el contrario, VIH-l Nef, una proteína viral que se similarmente incorporada en el virión a través de una asociación directa con la membrana del plasma, no se encontró asociada con HP68, que indica que únicamente proteínas VIH-l seleccionadas se asocian con HP68. La asociación de Gag y Vif con HP68 estuvo presente aún cuando las células se lisaron en 10 mM de EDTA (Fig. 11B) . Evidencias adicionales para la especificidad de la interacción ??-68-Vif se obtuvieron demostrando que la actina de la proteína celular abundante no está asociada con el HP68 (Fig. 11A) . Finalmente, la RNase L no está presente en el complejo que contiene HP68-Gag-Vif, soportando la idea de que este complejo es distinto del complejo de RNase L-HP69 previamente descrito (Fig. 11A) . Para conformar la especificidad de la asociación Vif, se realizó co-inmunoprecipitación con aHuHP68b en la presencia del péptido C-terminal HuHP68 que se usó para generar HuHP68b (Fig. 6) . A 200 uM, el péptido HuHP68, el cual se enlaza específicamente a OÍHUHP68, bloquea la inmunoprecipitación de HP68, Gag y Vif por ocHuHP68b (Fig.llB). Así, el complejo que contiene HP68-Gag está específicamente asociado con una segunda proteína viral VIH-1, Vif, pero no contiene ya sea RNase L o una proteína celular no especificada (actina) abundante y no se altera cuando los ribosomas son rotos. Todos estos hallazgos argumentan que el HP68 tiene una función post-traduccional que es separada de su acción post-transcripcional como un inhibidor de RNase L.

Ejemplo 9 HP68-Gag También se Enlaza a Pol Para demostrar además que HP68 tiene una segunda función durante el montaje viral, mostramos que el complejo HP68-Gag post-traduccional no contiene RNase L, pero contiene otras dos proteínas virales conocidas por estar involucradas en la morfogénesis del virión, llamadas VIH-1 GagPol y VIH-1 Vif (Figura 11). La asociación selectiva de HP68 con 3 proteínas que son críticas para el montaje de un virión completamente infeccioso (Gag, GagPol y Vif) proporciona soporte fuerte para los datos funcionales que demuestran un papel esencial para HP68 en formación de cápsido. En particular, la asociación para VIH-1 Vif con HP68 subraya la importancia de HP68 en la formación de virión, puesto que se requiere VIH-1 para la formación de viriones que son completamente infecciosos para células que son objetivos naturales de infecciones in vivo. Además, se conoce a Vif por actuar en un mecanismo indefinido en montaje de virión en células producidas, y es muy similar por requerir interacción con un factor hospedador aún indefinido que es crítico para su función. El enlace de Vif a HP68 parece ser independiente de VIH-1 Gas, puesto que ocurre cuando VIH-1 se expresa como un mutante truncado próximo a NC) que falla por enlazarse a HP68. Así, HP68 actúa en un complejo con al menos 3 proteínas involucradas en montaje de virión. Este complejo (o complejos) juega un papel post-traduccional crítico en la formación de virión y se separa del complejo R ase L-HP68 previamente descrito que protege el ARNm viral de la degradación mediada por el hospedador post-transcripcionalmente . Es posible que Vif enlace a HP68 en más de un complejo intermediario de montaje diferente, como es el caso para Gag.

E emplo 10 La Interacción del Hospedador Viral es Conservada Entre Lentivirus de Primate La importancia del papel post-traduccional de HP68 en el ciclo de vida retroviral es además subrayada por la observación que ambos VIH-1 y SIV mac239 Gag se enlazan a HP68, indicando conservación de esta asociación hospedador viral entre lentivirus de primate (véase Figura 12) .

Ejemplo 11 Montaje de Cápsido HVC en un Sistema Libre de Célula Se usaron extractos de germen de trigo para programar la traducción y montaje de polipéptidos de núcleo HCV en una manera análoga al sistema de montaje de cápsido VIH como se describe en el Ejemplo 1, con la excepción que no es necesario agregar CoA de miristoilo al sistema. Para soportar eficientemente el montaje de cápsido HCV-1 inmaduro, los extractos se ultracentrifugaron brevemente (más probablemente similar para remover un inhibidor, véase Lingappa, et al., (1997) Cell Biol 136:567-81). El montaje del cápsido HCV no parece ser efectuado por adición de un detergente no iónico para las reacciones de montaje. Esto es consistente con la idea que el núcleo HCV probablemente se monte en cápsidos preformados en el citoplasma. Mientras el núcleo HCV ha sido mostrado por tener una cola hidrobófica que está asociada con la cara citoplásmica de la membrana ER (Santolini, et al., (1994) J Virol 68-3631-41; Lo, et al., (1996) J Virol 70:5177-82). Esta asociación aparentemente no es requerida para montaje de cápsido HCV apropiado, y puede en cambio jugar un papel en la asociación del núcleo HCV con la proteína envuelta El. Después de la incubación por 2.5 horas, los productos de la reacción libres de células del núcleo HCV se analizaron por sedimentación por velocidad en 2 mi de gradientes de sucrosa que contienen 1% de NP40 (55,000 rpm x 60 min. en rotor Beckman TLS55) . Las fracciones (200 microlitros cada una) se colectaron de la superficie del gradiente y se examinaron por SDS-PAGE y autoradiografía . Se produjo una partícula de -100S en esta reacción (véase Figura 13) . Treinta a 50% de cadenas de núcleo HCV nuevamente sintetizadas forman estas partículas -100S por el final de la reacción, localizada en el medio (M) . El resto de las cadenas de núcleo HCV están en la fracción superior (T) y en la pelotilla (P) cercanamente pareciéndose a cuando se ha observado previamente con montaje del núcleo HBV en cápsidos en un sistema libre de célula (Lingapaa, J.R., et al., (1994) J Cell Biol 125:99-11). Para confirmar que la partícula desenvuelta 100S representa cápsidos HCV, las fracciones que contienen cápsidos desenvueltos (líneas 6 y 7) del gradiente de sedimentación por velocidad fueron analizadas por centrifugación en equilibrio en CsCl (50, 000 rpm x 20 horas usando un rotor TLS55 Beckman) usando una solución de CsCl 337 mg/ml. Las fracciones fueron colectadas, precipitadas de TCA, analizadas por SDS-PAGE y autoradiografia, y cuantificadas por densitometría . La proteina de núcleo HCV se eleva en la fracción 6. La densidad de la fracción 5/6 (mitad del gradiente, indicado con flecha) es 1.25 g/ml . La densidad de flotación de aproximadamente 1.25 g/ml (Fig. 14), es idéntica a aquellos cápsidos de HCV (sin envolturas) producidos en células infectadas (Kaito, M. et al., ((1994) J Gen Virol 75:1755-60; Miyamoto, H. et al., (1992) J Gen Virol 73:715-8) . Se analizaron fracciones que contienen la partícula 100S por transmisión de EM [ (TEM) /fracciones 6 y 7 del gradiente de sedimentación por velocidad en la Fig 14 fueron combinadas, poniendo una rejilla en una forma revestida, negativamente teñido con acetato de uranilo, y examinada por partículas esféricas TEM.] Partículas esféricas de 30-50 nm compuestas de subunidades capsoméricas fueron claramente vistas. Este es el tamaño esperado para cápsidos HCV que tienen sus envolturas removidas o que aún no se desarrollan (Mísuno, et al., (1995) Gastroenterology 109:1933-40; Takahashi, et al., (1992) Virology 191:431-4). (Nótese, por el contrario, que los ribosomas tienen un diámetro de 12-20 nm) . Así, por tres criterios presentados aquí (sedimentación por velocidad, densidad de flotación y microscopía de electrón) , el HCV forma cápsidos en el sistema libre de células que estrechamente se parece a aquellos encontrados en células infectadas.

Ejemplo 12 Montaje de truncacion de núcleo HCV que contiene el dominio de interacción homotípica Hallazgos previos indican que el dominio de interacción del núcleo HCV se localiza en la región hidrofílica de aa 1 hasta 115 (Matsumoto, et al., (1996) Virology 218:43-51; Nolandt, O. et al., (1997) J Gen Virol 78:1331-40; Yan, B.B., et al., (1998) Eur J Biochem 258:100-6; Kunkel, M. et al, (2001) J Virol 75: 2119-29). Por lo tanto, las truncaciones del núcleo HCV que abarca este domino serán montadas en cápsidos completos en el sistema libre de célula. Las reacciones de montaje se programaron con transcriptos que codifican C191, C115 y C124. La síntesis total fue similar para todos los 3 constructos. Después de la incubación por 2.5 horas los productos de reacción se analizaron por sedimentación a velocidad, y la cantidad del núcleo que migró en partículas 100S se gráfico como % del núcleo total sintetizado (Fig. 15 abajo). Los dos mutantes de truncacion C-terminal se montan en partículas 100S, como núcleo de longitud completa. El hallazgo de que los dominios requeridos para montaje se localizan en los primeros 115 aminoácido de núcleo HCV es consistente con observaciones en otros sistemas (Matsumoto, et al., (1996) Virology 218:43-51) . Mutantes de núcleo HCV fueron tamben diseñados genéticamente para codificar aminoácidos 42-173 (??42) y aminoácidos 68-73 (??68) (Figura 25) . Los transcriptos de núcleo tipo nativo (WT) C173 (aminoácidos 1-173) o los mutantes de supresión C-terminal descritos anteriormente fueron usados para programar las reacciones de traducción y montaje libre de células. Los productos de reacción fueron analizados por sedimentación a velocidad en gradientes de sucrosa. En la Figura 25, panel izquierdo, se programaron reacciones de montaje libres de célula con WT y transcriptos de núcleo mutante y separados por sedimentación a velocidad. Se analizaron las fracciones por SDS-PAGE y autoradiografia . Los valores S se indican como fracciones anteriores, y la barra obscura indica la posición esperada o cápsidos completamente montados. La Fig. 25, panel derecho, muestra la cantidad de núcleo radioetiquetado que migra en la fracción 100S como un porcentaje de proteina de núcleo total sintetizada ( de montaje), la cual se determinó por densitometria de autoradiograflas en el panel izquierdo. El C173 de tipo nativo se montó en estructuras similares a cápsido 100S muy eficientemente.

Ejemplo 13 Evidencia que el Montaje de Cápsido HCV Procede a través de una Trayectoria Ordenada de Intermediarios Para determinar sí el montaje de cápsido se origina por medio de intermediarios ensamblados, se realizó un experimento pulso-caza en el sistema libre de célula. Las reacciones libres de célula se programaron con un núcleo HCV de tipo nativo, etiquetados por 3 minutos con cisteína 35-S, y caza con cisteína sin etiquetar. Se tomaron alícuotas en los tiempos indicados, y se analizaron por sedimentación a velocidad en 2 mi de gradientes de sucrosa, como se describe en la Fig. 15. Las fracciones se examinaron por SDS-PAGE, y se cuantificaron autoradiógrafos . La gráfica muestra cantidad de proteína de núcleo HCV presente en las fracciones superiores 1 y 2 (T) , contra fracciones 6, 7 y 8 medias (M) , contra pelotillas (P) . Las fracciones medias representan cápsidos HCV completados 100S. El progreso de polipéptidos de núcleo etiquetado a través de complejos de diferentes tamaños se examinó por sedimentación a velocidad de alícuotas tomadas en diferentes tiempos durante la reacción de caza. Los resultados sugieren que las proteínas de cápsido primero aparecen en la superficie del gradiente (complejos ~10-20S que son similares a dímeros representados u oligómeros pequeños) , después aparecen en la pelotilla, las cuales pueden representar un intermediario de montaje grande, y finalmente aparecen a la mitad del gradiente (~ 100S), en la posición de cápsido completo. Estos resultados indican que el montaje de cápsido se origina a través de una trayectoria ordenada de un montaje complejos de intermediario. La pelotilla inicialmente incrementa, y después disminuye como se forman los cápsidos completos, lo que indica la presencia de un montaje de peso molecular alto intermediario en la pelotilla .

Ejemplo 14 Proteínas de Núcleo HCV Parecen estar Asociadas con una Proteína Hospedadora en el Sistema Libre de Célula Estudios de otros cápsidos virales tales como cápsidos VIH-1 y HBV (véase anteriormente) , sugieren que el montaje del cápsido en células es dependiente de energía y requiere factores hospedadores (Lingappa, J. R., et al., (1997) J. Cell Biol 136: 567-81; Lingappa, J. R. (1994) J Cell Biol 125: 99-111; Weldon, R. A., et al., (1998) J Virol 72: 3098-106; Mariani, R., et al., (2000) J Virol 74: 3859-70; Mariani, R. et al., (2001) J Virol 75: 3141-51; Unutmaz, D., et al., (1998) Sem in Immunol 10: 225-36). Factores celulares también están implicados en montaje de cápsido HCV, puesto que el montaje del núcleo de longitud completa en la ausencia de factores celulares resultan en partículas que tienen tamaños y formas anormales cuando se compara a cápsidos producidos en células (Kunkel, M., et al., (2001) J Virol 75:2119-29) . Usando el sistema libre de células para buscar factores hospedadores que puedan estar involucrados en la formación de cápsido, se hacen dos suposiciones: 1) que dicho factor hospedador del mismo modo está asociado con cadenas de núcleo temporalmente durante el montaje, y 2) que los candidatos para factores hospedadores involucrados en montaje de cápsido HCV incluyen la clase general de chaperonas moleculares, en particular chaperonas eucarióticas citosólicas. Proteínas que son reconocidas por anticuerpos dirigidos contra chaperonas eucarióticas citosólicas TCP-1 se han encontrado asociados con proteínas de cápsidos de dos diferente virus, llamados HBV (Lingappa, J.R. (1994) J Cell Biol 125:99-111). Y el tipo de retrovirus, Virus de Mono Mason-Pfizer (M-MPV) Hong, S., et al, (2001) J Virol 75: 2526-34) . Nótese que en ambos de estos estudios, el TCP-1 no se ha identificado definitivamente como la proteína de coasociación, así la posibilidad de una proteína de reacción cruzada aún no ha sido reglamentada. Los cápsidos de ambos de estos virus pre-formados en el citoplasma, son distintos de los cápsidos de tipo tales como VIH-1 (Wills y Craven) (1991) Aids 5: 639-54) . Para ver por una asociación de núcleo HCV coh chaperonas moleculares, las reacciones libres de célula se programaron con ya sea núcleo HCV, VIH-1 Gag o Núcleo HBV. Durante el montaje, las reacciones se sometieron a inmunoprecipitación (IP) bajo condiciones nativas con antisuero que se dirige contra epitopes diferentes de TCP-1 (60-C, 60-N, 23c, y 91a) con suero no inmune (NI). Se analizaron eluatos IP por SDS-PAGE y se autoradiografiaron . Todas las pruebas de anticuerpo fallaron para reconocer cadenas de núcleo HCV en estas reacciones de montaje excepto una, que sugiere que las chaperonas más moleculares no están asociadas con cadenas de longitud completa ensambladas de núcleo HCV. Sin embargo, un antisuero (60-c) dirigido contra un epitope especifico (aa 400 hasta 422) de la chaperonina cistólica eucariótica TCP-1 de núcleo HCV co-inmunoprecipita bajo condiciones nativas (Figura 16 y 17). Estos datos sugieren que ya sea TCP-1 o una proteina que porta un epitope con TCP-1 está asociada con cadenas de núcleos HCV en el sistema libre de célula. El epitope reconocido este antisuero corresponde a la secuencia: N-término-RGANDFMCDEMERSLHDA-C término Este epitope es altamente conservado entre TCP-1 aislado de especies diferentes. Además, este epitope tiene homología de secuencia para una región GroEL de chaperonina bacteriana. En general, GroEL porta poca especificidad de secuencia total con TCP-1, pero tiene una estructura y función muy similar (Frydham, J et al., (1992) Embo J 11:4767-78; Gao, Y. et al., (1992) Cell 69:1043-50; Lewis, V.A., et al., (1992) Nature 358: 249-52; Rommelaere, H. et al., (1993) Proc Nati Acad Sci USA 90:11975-9; Yaffe, M.B. et al., (1992) Nature 358: 245-8). Una búsqueda BLAST usando secuencia 60-C no revela cualquier otra proteina que tiene homología de secuencia significante a la secuencia 60-C además de subunidades TCP-1 de varias especies. El antisuero dirigido contra otras regiones de TCP-1, tal como 60-N (Lingappa, J.R., et al., (1994) J Cell Biol 125:99-111), 23c (Hynes, G. et al., (1996) Electroforesis 17: 1720-7; Willison, K et al., (1989) Cell 57:621-32), y 91A (Frydman, J. et al., (1992) Embo J 11: 4767-78), falla a un núcleo HCV co-inmunoprecipitado . Por el contrario, el núcleo HBV se reconoce por el antisuero 60-N (dirigido contra aa 42 - 57 en TCP-1 (Lingappa, J.R. et al., (1994) J Cell Biol 125:99-111). Se reconocen cadenas de montaje de VIH Gag por el antisuero 23c (el cual reconoce un epitope que contiene al menos 3 aminoácido en TCP-1) (Lingappa, J.R. et al., (1997) J Cell Biol 136:567-81), como se muestra en la Fig. 17. Estas diferencias en reconocimiento de epitope son consistente con la posibilidad que cada una de estas proteínas de cápsido se enlaza a una diferente proteína hospedadora. Alternativamente, sí las proteínas de cápsido de dos virus no relacionados se enlazan a la misma proteína celular (el cual ha sido el caso para el núcleo HBV y HCV) , uno podría esperar que cada una se podría enlazar a tal proteína en una forma única, puesto que las proteínas de cápsido de virus no relacionados no tienen homología de secuencia significante entre sí. Así, diferentes epitopes son probablemente expuestos cuando dos proteínas de cápsidos no relacionados se enlazan a la misma proteína celular. En conjunto, los datos argumentan fuertemente que las proteínas de cápsido de diferentes virus forman interacciones únicas con proteínas hospedadoras durante el montaje.

Ejemplo 15 Productos de Traducción libres de Célula de Núcleo HBV Migran en Tres Posiciones después de la Sedimentación por Velocidad Para sintetiza polipéptidos de núcleo HBV radioetiquetados, se transcribe ADN de núcleo HBV in vitro y se traduce por 120 minutos en un sistema libre de células heterólogas que contienen extracto de germen de trigo (Véase Ejemplo 1). Los productos de traducción radioetiquetados se analizaron por formación de multímeros de núcleo HBV por sedimentación en gradientes de sucrosa al 10-50% a 200,000 g por 1 hora. Después del fraccionamiento de los gradientes, se determinó la migración de proteínas de núcleo radioetiquetado usando SDS-PAGE, teñido Coomassie, y autoradiografía . Bajo estas condiciones, proteínas sin etiquetar estándares de menos que 12 S, tal como catalasa, migraron en las tres primeras fracciones. Partículas de núcleo maduro producidas en E. coli recombinante (referidas como cápsidos auténticos) se encuentran predominantemente en fracciones 5-7 (~100 S) . Los productos de traducción libre de células radioetiquetadas se encontraron por migrar en tres distintas posiciones usando estas condiciones de gradiente, como se muestra en la Fig. 18. La primera región, en la superficie del gradiente (T) que corresponde a la posición de polipéptidos de núcleo monomérico y oligomérico pequeño, mientras la segunda región, en la mitad del gradiente (M) , corresponde a la posición de cápsidos auténticos. La tercera región, en la pelotilla (P) , representa estructuras de peso molecular muy alto. La posibilidad que ya sea la pelotilla o la fracción media consista de cadenas completas aún no liberadas de ribosomas fue regida por tratamiento de los productos de traducción después que se completó la síntesis con EDTA, la cual es conocida para ribosomas desmontados (Sabatini et al., 1966). Tanto las pelotillas como las fracciones medias no se afectaron ampliamente por el tratamiento con EDTA (datos no mostrados) . Tomados en conjunto, estos resultados elevan la posibilidad que las partículas como cápsido sean agrupadas de polipéptidos de núcleo recientemente sintetizado en este sistema libre de célula . Para confirmar la autenticidad de los cápsidos producidos en el sistema libre de célula, se examinaron fracciones relevantes por EM. Los productos de traducción libre de célula del núcleo HBV (Figura 24, Libre de Célula) y la traducción libre de célula de una proteína no relacionada (GRP 94) (Figura 24 control) así como cápsidos HBV recombinantes (Figura 24, auténtico) se trataron con EDTA para desmontar ribosomas y después centrifugarlos para equilibrio en gradientes CsCl. Las fracciones 6 y 7 de cada uno de estos gradientes se colectaron y se concentraron en Airfuge. Los micrógrafos del electrón de las pelotillas resuspendidas examinadas por una microscopista en forma blindada única revelan partículas indistinguibles de cápsidos auténticos en los productos de traducción libre de células del núcleo HBV. Por el contrario, se observan cápsidos que no parecen partículas en las fracciones equivalentes de la traducción libre de células en una proteína no relacionada. Así, por cuatro criterios - sedimentación a velocidad, densidad de flotación, resistencia a la proteasa (datos no mostrados), y microscopio de electrón - una porción de los productos de traducción de núcleo HBV se monta en cápsidos HBV auténticos. Para determinar el orden de apariencia de polipéptidos de núcleo etiquetado en fracciones superiores, medias, y de pelotillas del gradiente de sucrosa descrito en la Fig. 18, se realizaron traducciones libres de células usando un pulso de 10 minutos de [35S] cisteina, seguido por una caza para longitudes variadas de tiempo en la presencia de exceso de cisteina sin etiquetar. Los productos de traducción se sedimentaron a través de gradientes de sucrosa y se analizaron por SDS-PAGE y autoradiografia . Después de un periodo de caza de 10 minutos, tiempo en el cual esencialmente todas las cadenas etiquetadas han sido traducidas completamente, el grupo de cadenas sintetizadas en la presencia de cisteina etiquetada se encontró predominantemente en la superficie del gradiente (Fig. 19A) . Después de extender el periodo de caza a 35 minutos, una cantidad significante de material se encontró en la pelotilla como en la media del gradiente (Fig. 19B) . Después de un periodo de caza de 50 min, había muy pocas cadenas etiquetadas presentes en la superficie del gradiente. Preferentemente, cantidades incrementadas de etiqueta se han acumulado en la pelotilla y fracciones medias (Fig. 19C) . Después de un periodo de caza de 170 minutos, la cantidad de material radioetiquetado en la mitad padece un incremento adicional con una disminución en material etiquetado en tanto en la pelotilla como en fracciones superiores (Fig. 19D) . La cuanti ficación de autoradiógrafos, mostrada después en los geles correspondientes, confirma que el material etiquetado en la superficie del gradiente disminuye dramáticamente con el tiempo. El material en la pelotilla inicial incrementa y después disminuye, mientras el material en la mitad se acumulada progresivamente sobre el curso del periodo de caza. Así, los datos indican que los polipéptidos de núcleo nuevamente sintetizado cazan sobre tiempo en cápsidos HBV, y del mismo modo no se hacen, al menos en parte, por medio de un complejo de peso molecular alto contenido dentro de la pelotilla. Confirmación definitiva de que la pelotilla contiene un intermediario en la formación de cápsidos completos se muestra en la Figura 23.

Ejemplo 16 CC 60 está Asociado con Intermediarios en el Montaje de Cápsidos HBV Un antisuero de conejo policlonal (anti 60) , se originó contra una secuencia peptídica de TCP-1 (Fig. 20A) . Estudios por otros han mostrado que el TCP-1 es una proteína de -60 kD que migra a una partícula S (Gao et al., 1992; Yafee et al., 1992). De los extractos totales de las células HeLa etiquetadas de estado listo, nuestro anti-suero anti-60 inmunoprecipitó en una proteína única de 60 kD bajo condiciones de desnaturalización (Fig. 19B, línea 1). La misma proteína de 60 kD se inmunoprecipitó por anti-60 bajo condiciones nativas (Martin, R., y W. J. Welch, manuscrito en preparación) . Cuando ya sea el lisado de reticulocito de conejo o el extracto de germen de trigo se fraccionó en un gradiente de sucrosa al 10-50%, el material anti-60 reactivo migró como una partícula 20-S como se revela por inmunomanchado de fracciones gradientes (Fig. 20C, superior e inferior, respectivamente) . Además, un componente polipéptido de 60-kD de una partícula 20-S (purificada del lisado de reticulocito) , que se conoce por ser reconocido por un anticuerpo previamente descrito a TCP-1 (Willison et al., 1989) , también se hizo reaccionar con el antisuero anti-60 descrito en este documento (H Sternlicht, comunicación personal) . El hsp 60 mitocondrial por el contrario, falló al ser reconocido por anti60 (datos no mostrados) . La partículas 20-S reconocidas por anti-60, también se reconocieron por un anticuerpo (proporcionado por J. Trent. Argonne National Laboratory, Argonne, IL) (véase Trent et al., 1991) contra TF 55, el homólogo hsp 60 encontrado en araquibacterium termofílica Sulfolobus shibatae (datos no mostrados) . De este modo, anti 60 parece estar reconociendo ya sea a TCP-1 o una proteína citosólica eucariótica estrechamente relacionada, la cual fue referida como C 60. Se examinó para determinar si CC60 está asociado con el núcleo HBV en el sistema de montaje libre de células, y si la anti 60 (Fig. 21, 60) fue capaz de co-precipitar polipéptidos de núcleo HBV nuevamente sintetizados a partir de varias fracciones de los gradientes de sucrosa. Las inmunoprecipitaciones de control se realizaron usando suero no inmune (Fig. 21, N) , asi como también antisuero de conejo policlonal al polipéptido de núcleo HBV (Fig. 21 C) . La Fig. 21A muestra que bajo condiciones nativas y polipéptidos de núcleo radioetiquetado coprecipitados de 60 presentes dentro de la mitad (M) y la pelotilla (P) de los gradientes de sucrosa, pero no polipéptidos de núcleo precipitado de la parte superior (T) . De manera similar, anticuerpos polipéptidos de núcleo coprecipitan a TF 55 (véase anteriormente) en la pelotilla y la mitad de los gradientes (datos no mostrados) . Como se espera, cuando se realiza la inmunización después de la desnaturalización de muestras por ebullición en SDS, polipéptidos de núcleo coprecipitan no más de 60 a partir de cualquiera de estas fracciones de gradientes (Fig. 21B) . Por el contrario, el antisuero al polipéptido de núcleo reconoce proteínas de núcleo etiquetadas en todas las tres fracciones bajo condiciones tanto nativas como de desnaturalización (Fig. 21, A y B) . Basados en estas observaciones, parece que el CC60 no está asociado con formas no montadas de la proteína de núcleo HBV, sino está asociado con formas multiméricas de la proteína. Estos resultados elevan la posibilidad de que el CC60 juega un papel en el montaje de partículas de núcleo HBV. Si el CC60 está jugando un papel en el montaje, uno podría esperar que esta chaperonina se disocie de la partícula de núcleo multimérico una vez que el montaje está completo. Para probar esta hipótesis, se realizaron inmunoprecipitaciones en material desde la mitad de los gradientes de sucrosa que han sido además fraccionados en un gradiente CsCl . Usando tal método de centrifugación por equilibrio, se pueden separar cápsidos maduros (encontrados en las fracciones 1-4 de los gradientes CSCL) y son posiblemente intermediarios de montaje incompletos. La Fig. 21C muestra que bajo condiciones nativas, los polipéptidos de núcleo HBV que precipitan 60, están presentes en la fracción 3 de los gradientes CsCl (que corresponden a cápsidos incompletos) , pero fallan al precipitar polipéptidos de núcleo precipitado presentes en la fracción 6 de estos mismos gradientes (que corresponden a cápsidos completos) . El antisuero al péptido de núcleo reconoce la proteína de núcleo en ambas fracciones. De este modo, parece que CC60 está asociado con cápsidos parcialmente montados, pero no está asociado con cápsido maduro. Como una confirmación adicional de que el CC está solamente temporalmente asociado con polipéptidos de núcleo en el proceso de montaje, se realizaron inmunomanchados de fracciones de gradientes con antisuero a CC60 a diferentes tiempos durante la traducción (Lingappa, J.R., W. J. Welch, y V.R. Lingappa, manuscrito en preparación) . Estos inmunomanchados revelaron la presencia de una gran cantidad de CC 60 en la pelotilla a puntos de tiempo tempranos durante la traducción del transcripto de núcleo HBV, pero no durante la traducción del transcripto mock. Por el contrario, a tiempos tardíos durante la traducción del núcleo y reacción de montaje, todos los CC60 se localizaron en la posición 20S con ninguno restante en la pelotilla. En estos experimentos, la cantidad total de CC60 fue esencialmente sin cambio durante el curso de la traducción.

Ejemplo 17 La Producción de Polipeptido de Núcleo HBV Puede no estar Acoplada a partir del Montaje de Partículas del Núcleo Para distinguir entre un papel para CC60 en el pliegue de monómeros de núcleo contra una función en montajes de multímetros, se intentó no acoplar la producción de polipéptidos de núcleo a partir de montajes de partículas de núcleo. En oocitos de Xenopus, el montaje de las partículas de núcleo se conoce por ser exquisitamente dependiente de la concentración de las cadenas de polipéptidos de núcleo (Seifer et al.,]. Se observo una dependencia de concentración igualmente impresionante en el sistema. Cuando se disminuyó la concentración del transcripto de núcleo HBV a 50% o menos de la concentración estándar usada en el sistema libre de células, el montaje de cápsido HBV fue inicialmente virtualmente abolido (Fig. 22A) , mientras la síntesis de polipéptido de núcleo total se disminuyó en una forma vigorosamente lineal (datos no mostrados) . Estas condiciones resultaron en la acumulación de una población de polipéptidos de núcleo de longitud completa no montados, que migraron a la parte superior de los gradientes de sucrosa previamente descritos (Fig. 22A) . Aún cuando se incubaron por tiempos prolongados (6h) , estas cadenas no montadas permanecen en la parte superior del gradiente, indicando que el montaje no ocurre aún a una tasa lenta bajo estas condiciones (datos no mostrados) . Cuando se centrifuga en un gradiente de glicerol al 5-25% por 24 horas, los polipéptidos de núcleo no montado migran en la región aproximada esperada para dímeros globulares plegados del núcleo, basados en la deposición de proteínas estándares (datos no mostrados) . De este modo, los datos indican que el material no montado en la parte superior del gradiente, no consiste de polipéptidos no plegados. Preferentemente, este material probablemente representa dímeros de polipéptidos de núcleo, o una mezcla de monómeros y dímeros. Los dímeros se conocen por ser precursores de montaje de c psidos in vivo (Zhou y Standring, 1992) . Para determinar si los polipéptidos de núcleo no motados presentes en la parte superior del gradiente son de hecho competentes para el montaje en cápsidos, se preguntó si podrían ser cazados en cápsidos en la presencia de exceso de cadenas de núcleo no etiquetado. Para hacer esto, se agregaron a estas cadenas radioetiquetadas no montadas, un exceso de una mezcla de traducción no etiquetada que ha sido programada con 100% de transcripto de núcleo por 45 minutos. El punto de tiempo de 45 minutos se eligió debido a que representa un punto en el cual las cadenas de núcleos recientemente sintetizadas están presentes en proporciones iguales en las regiones superior, media y pelotilla de los gradientes de sucrosa estándares (datos no mostrados) . Después de mezclar las cadenas no montadas etiquetadas, con la transcripción no etiquetada, se continuó la incubación a 24 °C por ya sea 45 o 120 minutos y la mezcla fue entonces cubierta en capas sobre gradientes de sucrosa, centrifugada, fraccionada y analizada por SDS-PAGE y autoradiografía como se describe previamente. Después de una incubación de 45 minutos, los polipéptidos etiquetados se encontraron principalmente en la pelotilla ( P) con una cantidad similar en la mitad del gradiente {M) (Fig. 22B), mientras después de 120 minutos, una cantidad significante de cadenas etiquetadas está presente en la mitad del gradiente (Fig. 22C) . Cuando el material de la mitad de tal gradiente de sucrosa (Fig. 22C) fue subsecuentemente centrifugado en CsCl, las cadenas radioetiquetadas se encontraron comigrar con las partículas de núcleo auténtico confirmando que los cápsidos completos fueron producidos durante la caza (datos no mostrados) .

Cuando se preincubó una . traducción mock no etiquetada por 45 minutos y se agregó a los polipéptidos de núcleo no montado, los polipéptidos de núcleo radioetiquetado en la parte superior del gradiente fallaron en la caza en ya sea la pelotilla o la mitad (Fig. 22D) . Un resultado similar se obtiene cuando una traducción programada con prolactina bovina, una proteina no relacionada, se agrega a los polipéptidos de núcleo no montado. Del mismo modo, cuando una traducción no etiquetada del 50% del transcripto de núcleo estándar se agrega a los polipéptidos de núcleo radioetiquetado no montado, las cadenas radioetiquetadas permanecen en la parte superior del gradiente (datos no mostrados) . En el último experimento, la concentración de las cadenas de núcleo HBV se mantuvo al 50% de la concentración estándar, y esto falló para originar el umbral necesario para el montaje. De este modo, bajo las condiciones apropiadas, las cadenas no montadas parecen ser competentes para formar cápsidos maduros.

Ejemplo 18 Cápsidos Terminados Pueden Ser Liberados Por Manipulación De La Pelotilla Aislada Habiendo encontrado una asociación de CC60 con complejos multiméricos, se desea determinar si cualquiera de estos complejos constituyen intermediarios en el montaje del producto de cápsido final y si los substratos energéticos juegan un papel en el progreso de tales intermediarios. Se conocen la chaperonas moleculares por estar involucradas en la solubilización de agregados de proteínas desplegadas, así como también en facilitar el correcto plegado y montaje de polipéptidos como se discutió anteriormente. De este modo, CC60 podría estar asociado con complejos multiméricos en las fracciones de pelotilla y medias, ya sea debido a estos complejos representan "trayectorias finales muertas" que consisten de agregados desplegados de proteínas desmontadas, o debido a que estos complejos representan intermediarios productivos junto a la trayectoria hacia el montaje de cápsidos completados. Para dirigir esto, el material de pelotilla fue aislado fraccionando los producto de una traducción de 30 minutos de núcleo HBV en un gradiente de sucrosa y resuspendiendo la pelotilla en el amortiguador. La pelotilla resuspendida se dividió en alícuotas iguales y se trató ya sea con afirasa o con amortiguador por 90 minutos a 24°C. El material radioetiquetado de la pelotilla cazada a la mitad con el tratamiento de afirasa (Fig. 23A, superior) , pero sin incubación en el amortiguador [Fig. 23A, inferior) . Cuando las fracciones 6 y 7 fueron colectadas después del tratamiento con apirasa y centrifugadas a equilibrio en un gradiente CsCl, la mayoría del material radioetiquetado se encontró comigrar con partículas de núcleo auténticas (datos no mostrados) . De este modo, el tratamiento con apirasa de material de pelotilla aislada resultó en liberación de cápsidos completados de la pelotilla. Cuando la pelotilla aislada se trató con la mezcla energética usada en las traducciones libres de células (que contienen ATP, GTP, y fosfato de creatina), junto con el extracto de germen de trigo, los polipéptidos de núcleo etiquetado en la pelotilla se encontraron por cazar fracciones tanto medias como superiores (Fig. 23B, superior) . Una vez nuevamente, cuando el material radioetiquetado en la mitad se examinó por sedimentación por equilibrio, una porción pequeña tuvo densidad vigorosa idéntica a aquella de los cápsidos auténticos (datos no mostrados) . El tratamiento de la pelotilla asilada con ya sea extracto de germen de trigo o mezcla energética sola, resultó en caza de una cantidad mucho menor de material radioetiquetado en la mitad del gradiente (datos no mostrados) . El tratamiento de la pelotilla aislada con apirasa y extracto de germen de trigo (Fig. 23B, inferior), produce los mismos resultados como el tratamiento con apirasa sola (Fig. 23A, superior) . De este modo, la adición de substrato energéticos resulta en liberación de tanto polipéptidos de núcleo etiquetado como también de cápsidos no montados de la pelotilla. Datos adicionales pueden demostrar que los polisomas no juegan un papel en la pelotilla; (a) el inhibidor de la síntesis de proteina emetina, no afecta los resultados del tratamiento de la pelotilla aislada con substratos energéticos o apirasa; y (b) como se mencionó previamente, el tratamiento de productos de traducción con 10 mM de EDTA no tiene efecto en la distribución relativa de los polipéptidos de núcleo etiquetado en las regiones superior, media y de pelotilla de los gradientes (datos no mostrados) . La capacidad de la pelotilla para cazar en cápsidos completados con varias manipulaciones de substratos energéticos indica que algo del material en la pelotilla constituye un intermediario en la trayectoria para cápsidos completados.

Ejemplo 19 Preparación de Bibliotecas de familias virales de referencia cruzada y proteínas de células hospedadoras Se desarrolló una biblioteca de proteínas de células hospedadoras de referencias cruzadas y familias virales particulares, preparando cápsidos por al menos, un elemento de cada familia viral usando el sistema libre de células descrito en el Ejemplo 1 y usando sedimentación por velocidad, separando los intermediarios de montaje de cápsido-que se forman. Los anticuerpos originados contra chaperonas hospedadoras son entonces usados para seleccionar intermediarios de montaje. Ejemplos de tales chaperonas incluyen TCP-1, HP68 y CC 60.

Tabla 2 Características de Proteínas hospedadoras Una etapa universal en el ciclo de vida de todos los virus es la formación del cápsido. Como muestran los resultados, para virus múltiples de diferentes familias, el montaje de cápsido no es espontáneo pero preferentemente es catalizado por la acción de las proteínas hospedadoras y ocurre vía intermediarios de montaje. Ocurre una trayectoria obligada, estereotipada de montaje de cápsido, distinta en tanto factores hospedadores como intermediarios de montaje para cada clase diferente de virus estudiados a la fecha. El sistema de transflación libre de células en el cual se hacen estos descubrimientos, permite la deconstrucción de cualquier virus por determinación de que en proteínas hospedadoras los virus utilizan sin considerar condiciones necesarias para propagar o crecer el virus per se. Además, en tal sistema, los intermediarios de montaje pueden ser detectados y enriquecidos. Tanto las proteínas hospedadoras como los intermediarios de montaje son objetivos anti-virales candidatos prometedores, como demuestran las evidencias en un caso, que tal expresión de un mutante negativo de una proteína hospedadora termina liberando el virus de las células infectadas. De este modo, la terapia anti-cápsido, en la forma de fármacos de moléculas pequeñas, que interfieren con aquellas proteínas hospedadoras o el flujo de intermediarios involucrados en el montaje de cápsido, son una nueva línea prometedora de rápidas respuestas a un brote viral, que pueden comprobarse efectiva aún antes de que el virus ha sido identificado y/o se haya establecido la habilidad para cultivar el virus. Esta etapa de montaje de cápsido no ha sido previamente el objetivo de terapia antiviral debido a que se ha creído que el cápsido se formó espontáneamente por "auto-monta e" y por lo tanto, carece de un objetivo de proteína específico. Todas las referencias citadas aquí están con ello incorporadas por referencia, como si se expusieran en su totalidad. Aunque la invención mencionada anteriormente ha sido descrita en algún detalle por medio de ilustración y ejemplo para los propósitos de claridad de entendimiento, será obvio que ciertos cambios y modificaciones pueden ser practicados dentro del ámbito de las reivindicaciones adjuntas .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Método para identificar, en un genoma viral que no se origina de forma natural, un gen viral requerido para montaje de cépsido, caracterizado porque el método comprende: aislar el ácido nucleico putativamente que codifica dicho gen viral a partir del genoma viral; programar un sistema de traducción libre de célula con el ácido nucleico; y determinar que ha ocurrido el montaje de cápsido como una indicación que el gen viral es requerido para el montaje de cépsido.

2. Composición caracterizada porque comprende: ácido nucleico aislado de un genoma que no se origina de forma natural que codifica un gen viral requerido para el montaje de cápsido.

3. Método para identificar un compuesto que inhibe el montaje de cápsido de un virus que no se origina de forma natural, caracterizado porque el método comprende: programar un sistema de traducción libre de célula con el ácido nucleico que codifica una proteina requerida para el montaje de cápsido del virus que no se origina de forma natural en la presencia y ausencia del compuesto; y determinar si el montaje de cápsido ha ocurrido como una indicación por si dicho compuesto inhibe el montaje de cápsido, en donde la inhibición del montaje de cápsido es inferida de un cambio seleccionado del grupo que consiste de (a) un cambio en la distribución de intermediarios de montaje en el sistema libre de célula; (b) un cambio en la localización de proteínas hospedadoras en el sistema libre de célula o glicerol o gradientes de sucrosa; (c) un cambio en la distribución de intermediarios de montaje en células; (d) un cambio en el nivel de intermediarios de montaje producidos en células; y (e) un cambio en la co-localización de proteína hospedadora y proteína de cápsido en las células como se observa durante la infección viral.

4. Composición caracterizada porque comprende: un compuesto identificado de conformidad con el método de la Reivindicación 3, en donde el montaje de cápsido es inhibido en la presencia de dicho compuesto.

5. Método para obtener una o más proteínas hospedadoras que interactúan con una o más proteínas virales requeridas para el montaje de cápsido de un virus que no se origina de forma natural, caracterizado porque el método comprende : programar un sistema de traducción libre de célula con ácido nucleico que codifica una o más proteínas requeridas para el montaje de cápsido del virus que no se origina de forma natural con ello se producen los productos de traducción para una o más proteínas de cápsido; incubar la mezcla de traducción por un periodo de tiempo suficiente para montar dichos productos de traducción en uno o más intermediarios de cápsido, en donde uno o más intermediarios de cápsido cada uno comprende un complejo de proteína de cápsido viral polimerizada y una proteína hospedadora; aislar uno o más intermediarios de cápsido; y disociar uno o más intermediarios de cápsido con ello se obtiene una o más proteínas hospedadoras.

6. Intermediario de cápsido, caracterizado porque comprende una proteína hospedadora obtenida de conformidad con el método de la Reivindicación 5.

7. Proteína hospedadora, caracterizada porque se obtiene de conformidad con el método de la Reivindicación 5.

8. Homólogo humano de una proteína hospedadora, caracterizado porque se obtiene de conformidad con el método de la Reivindicación 7.

9. Anticuerpos, caracterizados porque son de una proteína hospedadora de conformidad con la Reivindicación 7.

10. Anticuerpos de conformidad con la Reivindicación 9, caracterizados porque los anticuerpos inhiben el enlace de una proteína hospedadora a una o más proteínas virales requeridas para montaje de cápsido de un virus que no se origina de forma natural .

11. Método para obtener un intermediario de cápsido involucrado en el montaje de un virus que no se origina de forma natural, caracterizado porque comprende: combinar un ácido nucleico que codifica un gen viral requerido para el montaje de cápsido con una mezcla de traducción de proteína libre de célula; incubar la mezcla por un periodo de tiempo suficiente para montar los productos de traducción del gen viral en intermediarios del cápsido viral; separar la mezcla de traducción en fracciones de uno o más intermediarios de cápsido; y aislar uno o más intermediarios de cápsido con ello se obtienen los intermediarios de cápsido del virus que no se origina de forma natural .

12. Método para identificar proteínas hospedadoras involucradas en el montaje de cápsido de un virus que no se origina de forma natural, caracterizado porque el método comprende: desnaturalizar proteínas hospedadoras obtenidas de conformidad con el método de la Reivindicación 5; secuenciar dichas proteínas hospedadoras, y comparar las secuencias de las proteínas hospedadoras individuales a secuencias conocidas de proteínas hospedadoras, con ello se obtiene la identidad de proteínas hospedadoras que están involucradas en el montaje de cápsido del virus que no se origina de forma natural.

13. Método para identificar compuestos que interfieren con el montaje de cápsido de virus que no se origina de forma natural, caracterizado porque comprende : expresar una proteína requerida en el montaje de cápsido en una célula de mamífero; identificar la co-localización de dicha proteína y una o más proteínas hospedadoras usando inmunofluorescencia en dichas células de mamífero; y seleccionar compuestos para aquellos que interfieren con la co-localización de dicha proteína requerida en el cápsido y en una o más proteínas hospedadoras en dichas células de mamífero, con ello, los compuestos que interfieren con el montaje de cápsido son identificados por un cambio desde la co-localización de la inmunofluorescencia a un patrón de teñido difuso.

14. Método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque dichos compuestos no causan toxicidad o regulación ascendente a las proteínas de estrés hospedadoras en dicha célula de mamífero.

15. Método para identificar un compuesto que inhibe el montaje de cápsido de un virus que no se origina de forma natural, caracterizado porque el método comprende: agregar un compuesto de prueba a una mezcla de traducción libre de célula programada con ácido nucleico de virus que codifica una o más proteínas requeridas para el montaje de cápsido con ello, se producen cápsidos; comparar el montaje en la ausencia del compuesto de prueba al montaje en la presencia de dicho compuesto de prueba, en donde menos montaje medido en la presencia de dicho compuesto es indicativo de un compuesto que inhibe el montaje de cápsido.

16. Método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque dicho compuesto es una molécula pequeña.

17. Método para inhibir la formación de cápsido en una célula de un virus que no se origina naturalmente, caracterizado porque comprende: proporcionar a dicha célula un compuesto seleccionado de conformidad con el método de la reivindicación 15.

18. Método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque dicha célula es una célula humana.

19. Método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque dicho compuesto es un anticuerpo anti-cápsido .

20. Uso de un agente antiviral, el cual comprende: aislar ácido nucleico putativamente que codifica un gen viral involucrado en el montaje de cápsido a partir de dicho genoma viral ; programar un sistema de traducción libre de células con ácido nucleico por un periodo de tiempo suficiente para montar productos de traducción de dicho gen viral en intermediarios cápsidos virales; separar dichos productos de traducción en fracciones de uno o más intermediarios de cápsidos; aislar uno o más intermediarios de cápsidos; separar dichos intermediarios de cápsidos para obtener una o más proteínas hospedadoras que fueron unidas a una o más proteínas virales en dichos intermediarios de cápsidos ; comparar una característica bioquímica de dicho individuo con una o más proteínas hospedadoras a una biblioteca que comprende características bioquímicas de una pluralidad de chaperonas de montaje de cápsido viral individualmente de referencia cruzada con una o más moléculas pequeñas que inhiben la interacción entre un elemento individual de dicha biblioteca y una proteína de cápsido viral; y proporcionar dicho animal con una molécula pequeña de referencia cruzada con un elemento individual de dicha biblioteca que tiene una característica bioquímica en común con una o más proteínas hospedadoras, con ello se tratan dichos síntomas, para la manufactura de un medicamento para tratar los síntomas de un ataque bioterrorista en un animal en necesidad del mismo

21. Uso de conformidad con la reivindicación 20, en donde la característica bioquímica es una secuencia de aminoácido de una región enlazante para una proteína de cápsido viral .

22. Uso de conformidad con la reivindicación 21, en donde el mamífero es un animal.

23. Uso de conformidad con la reivindicación 21, en donde el mamífero es un humano.

24. Método para producir cápsidos virales de virus que no se originan de forma natural, caracterizado porque dicho método comprende: programar un sistema de traducción libre de célula con un ácido nucleico de dicho virus e incubar dicha mezcla de traducción por un periodo de tiempo suficiente para montar dichos productos de traducción en cápsidos; y aislar dichos cápsidos.

25. Anticuerpos para cápsidos virales, caracterizados porque son de un virus que no se origina de forma natural .

26. Anticuerpos de conformidad con la reivindicación 25, caracterizados porque dichos anticuerpos son anticuerpos monoclonales.