MXPA04011527A

MXPA04011527A - Antigeno de muc-1 con numero de unidades de repeticion de vntr reducidas.

Info

Publication number: MXPA04011527A
Application number: MXPA04011527A
Authority: MX
Inventors: A Hamblin Paul
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 2002-05-24
Filing date: 2003-05-23
Publication date: 2005-09-30
Also published as: JP2005526520A; CN1668746A; RU2303069C2; EP1527177A2; US20060251665A1; WO2003100060A3; AU2003240729B2; IL165156A0; IS7526A; GB0212046D0; AR039846A1; BR0311211A; CN100408682C; KR20050004211A; AU2003240729A1; TW200407426A; NZ536668A; NO20044947D0; NO20044947L; PL374569A1

Abstract

La presente invencion se refiere a las nuevas construcciones de acido nucleico, utiles en los protocolos de vacunacion de acido nucleico para el tratamiento y profilaxis de los tumores que expresan MUC-1. En particular, el acido nucleico es ADN y las construcciones de ADN comprenden un gene que codifica un derivado de MUC-1 que tiene menos de 10 unidades de repeticion perfectas. La invencion provee ademas composiciones farmaceuticas que comprenden dichas construcciones, particularmente composiciones farmaceuticas adaptadas para administracion mediada por particulas, metodos para producirlas, y su uso en medicina. Se proporcionan tambien nuevas proteinas codificadas por el acido nucleico y composiciones que las contienen.

Description

ANTÍGENO DE MUC-1 CON NÚMERO DE UNIDADES DE REPETICIÓN DE VNTR REDUCIDAS La presente invención se refiere a las nuevas construcciones de ácido nucleico, útiles en los protocolos de vacunación de ácido nucleico para el tratamiento y profilaxis de tumores que expresan MUC-1. En particular, el ácido nucleico es ADN y la construcción de ADN comprende un gen que codifica un derivado de MUC-1 que tiene menos de 10 unidades de repetición perfectas. La invención proporciona también composiciones farmacéuticas que comprenden dichas construcciones, particularmente composiciones farmacéuticas concebidas para administración mediada por partículas, sus procedimientos de producción y su utilización en medicina. Se proporcionan también nuevas proteínas codificadas por el ácido nucleico y composiciones farmacéuticas que las contienen.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La mucina de célula epitelial MUC-1 (conocida también como episialina o mucina epitelial polimórfica, PEM) es una glucoproteína de elevado peso molecular expresada sobre muchas células epiteliales. La proteína consiste en una cola citoplasmática, un dominio transmembrana y un número variable de repeticiones en tándem de un motivo de 20 aminoácidos (denominado, en la presente memoria descriptiva, monómero VNTR, aunque puede conocerse también como epítopo VNTR o repetición VNTR) que contiene una elevada proporción de residuos de prolina, serina y treonina. El número de repeticiones es variable debido al polimorfismo genético en el locus MUC-1, y más frecuentemente cae en el intervalo de 30-100 (Swallow et al, 1987, Nature 328:82-84). En el epitelio ductal normal, la proteína MUC-1 sólo se encuentra en la superficie apical de la célula, expuesta al lumen ductal (Graham et al, 1996, Cáncer Immunol Immunother 42:71-80; Barratt-Boyes et al, 1996, Cáncer Immunol Immunother 43:142-151). Una de las características más llamativas de la molécula MUC-1 son las abundantes uniones de O-glucosilación. Hay cinco sitios de unión de O-glucosilación supuestos disponibles en cada monómero de VNTR de MUC-1. Según el sistema de numeración a continuación, estos son Thr-4, Ser-10, Thr- 1, Ser-19 y Thr-20. El VNTR puede ser caracterizado como típico o de repeticiones perfectas con una secuencia como la expuesta más adelante o una variación menor de esta repetición perfecta que comprende dos a tres diferencias sobre los 20 aminoácidos. La siguiente es la secuencia de la repetición perfecta: 1 2345678910 11 1213 14 15 16 17181920 A P D T R P A P G S T A P P A H G V T S E S T A Q Los aminoácidos que están subrayados se pueden sustituir por los residuos de aminoácidos mostrados.

Las repeticiones imperfectas tienen diferentes sustituciones de aminoácidos para la secuencia de consenso anterior con un 55-90% de identidad a nivel de aminoácido. A continuación se muestran las cuatro repeticiones imperfectas, con las sustituciones subrayadas: APDTRPAPGSTAPPAHGVTS - repetición perfecta APATEPASGSAATWGQDVTS - repetición imperfecta 1 VPVTRPALGSTTPPAHDVTS - repetición imperfecta 2 APDNKPAPGSTAPPAHGVTS - repetición imperfecta 3 APDNRPALGSTAPPVHNVTS - repetición imperfecta 4 En la MUC-1 de tipo salvaje, la repetición imperfecta rodea a la zona de repeticiones perfectas. En los carcinomas malignos que surgen de la transformación neoplásica de estas células epiteliales, hay diversos cambios que afectan a la expresión de MUC-1. Se pierde la expresión polarizada de la proteína y se encuentra extendida por toda la superficie de la célula transformada. La cantidad total de MUC-1 también aumenta, a menudo 10 veces o más (Strous & Dekker, 1992, Crit Rev Biochem Mol Biol. 27:57-92). Más significativamente, la cantidad y calidad de las cadenas de carbohidratos unidas por O cambia marcadamente. Se glucosilan menos residuos de serina y treonina. Estas cadenas de carbohidratos que se encuentran están anormalmente empequeñecidas, crean el antígeno de carbohidrato asociado a tumor STn (Lloyd et al, 1996, J Biol. Chem, 271:33325-33334). Como resultado de estos cambios de glucosilación, se hacen accesibles diversos epítopos de la cadena peptídica de MUC-1 que estaban previamente ocultos por las cadenas hidrocarbonadas. Uno de los epítopos que se hace accesible de esta manera está formado por la secuencia APDTR (Ala 8 - Arg 12 en la Figura 2), presente en cada monómero perfecto de VNTR de 20 aminoácidos. (Burchell et al, 1989, Int J Cáncer 44:691-696). Se entiende que estos cambios en la UC-1 significan que una vacuna que puede activar el sistema inmunológico contra la forma de MUC-1 expresada en tumores puede ser eficaz contra los tumores en células epiteliales y, de hecho, en otros tipos de células en los que se encuentra MUC-1, como por ejemplo linfocitos T. Uno de los mecanismos efectores principales usados por el sistema inmunológico para destruir las células que expresan proteínas anormales es una respuesta inmune al linfocito T citotóxico (CTL) y esta respuesta es deseable en una vacuna para tratar tumores, así como un anticuerpo de respuesta. Una buena vacuna activará todos los mecanismos de la respuesta inmune. Sin embargo, las vacunas de carbohidratos y péptidos habituales como por ejemplo Theratopo o BLP25 (Biomira Inc, Edmonton, Canadá) activan preferentemente un brazo de la respuesta inmune - una respuesta humoral y celular, respectivamente, y son deseables mejores diseños de vacuna para generar una respuesta más balanceada. Las vacunas de ácido nucleico proporcionan un gran número de ventajas sobre la vacunación convencional con proteínas, pues son fáciles de preparar en grandes cantidades. Se ha publicado que incluso en pequeñas dosis inducen fuertes respuestas inmunes y pueden inducir una respuesta inmune del linfocito T citotóxico así como una respuesta de anticuerpo. Sin embargo, es muy difícil trabajar con MUC-1 de longitud completa d e bido a la secuencia altamente repetitiva, pues es muy susceptible de recombinarse y dichos sucesos de recombi nación causan dificu ltades s ig nificativas de desa rrollo . biofarmacéutico. Además, la natu raleza rica en GC de la zona VNTR hace difícil la secuenciación Además , por razones de reg ulación - es necesario caracterizar completamente la construcción de ADN . Es muy problemático secuenciar una molécula con una estructura de tan alta repetición. Dado que no se conoce con precisión cua ntas unidades de repetición hay en el tipo salvaje de M UC- 1 esta incapacidad para caracterizar con precisión MUC-1 de long itud completa hace q ue esto sea inaceptable con respecto a la aprobación reguladora. Se cree que las zonas VNTR de M U C-1 contienen epítopos inmu nodomina ntes. Sorprend entemente, los presentes inventores han descubierto q ue es posible reducir el número de VNTR para producir una construcción inmu nogénica que tiene una actividad antitumor eq uivalente si se compara con MU C-1 de longitud completa de tipo salvaje. La construcción de la presente invención es esta ble. En particular, las construcciones son estables en término de caraceterísticas de crecimiento, retención de plásmido y calidad del plásmido cuando crecen como cultivo de E. Coli d urante el curso de 9 pases, d urando cada uno de 10 a 14 horas.

BREVE DESC RI PCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona una secuencia de ácido nucleico, q ue codifica el antígeno de MUC-1 , q ue es capaz de alcanzar una respuesta i nmune in vivo y es estable y tiene una red ucida susceptibilidad a la reco mbinación con respecto a MUC-1 de longitud com pleta. La estabi l idad es u na medida de la cantidad de plásmido de forma definida. Es preferible que haya menos del 2,0% de contaminación de l as formas recom bi nogénicas, seg ún se determina sobre un gel de agarosa o poliacri lam ida, cuando se observa visualmente, después del crecim iento a gran esca la . Gran escala significa, típicamente, crecim iento en u na escala mayor de litro. También es una medida separada de estabilidad que la copia del plásmido permanezca estable durante u n periodo de pases. Preferi blemente, el número de copi as del plásmido aumenta con el número de pases , particu larmente del pase 1 al 9. Preferiblemente, el número de copias del plásmido aumenta aproximadamente un 1 0% , 20%, 30% , 35%, 40% , más preferiblemente aproxim adamente un 50% sobre 9 pases. En modal idades particulares la invención proporciona construcciones que tienen de 1 a 1 5, preferiblemente entre 1 y 10 unidades de repetición perfectas de VNTR. Es preferible que haya menos de 8 repeticiones perfectas. Las modalidades preferidas proporcionan construcciones de ADN con una, dos, tres, cuatro, cinco, seis y siete repeticiones, respectivamente. En ciertas modalidades de la invención, se conserva la zona de repetición imperfecta. Las preferidas son construcciones que contienen una o siete repeticiones perfectas. Las proteínas cod ificadas por dichas construcciones son nuevas y forman un aspecto de la invención. En otro aspecto de la invención la secuencia de ácido n ucleico es una secuencia de ADN en forma de plásmido. Preferiblemente, el plásm ido está superenrollado. En otro aspecto de la invención se proporciona una composición farmacéutica que comprende una secuencia de ácid o n ucleico como la q ue se describe en la presente memoria descriptiva y un excipiente, diluyente o veh ículo farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, el vehículo es una perla de oro y la composición farmacéutica está preparada para su l iberación med iante administración de fárm aco medida por partícula . En otra moda lidad más, la invención proporciona la composición farmacéutica y construcciones de ácido nucleico para usar en medici na . En pa rticular, se proporciona u na construcción de ácido nucleico de la invención , en la fabricación de un medicamento pa ra usar en el tratamiento o profilaxis.de tumores q ue expresan MUC-1 . La i nvención proporciona también procedimientos de tratamiento de un paciente q ue sufre o es susceptible a un tumor q ue expresa M UC-1 , particularmente carcinoma de mama, pulmón, ovarios, próstata (particularmente carcinoma no-pequeño en células pulmonares) g ástrico y otros Gl (gastrointestinales) por administración de una cantidad segura y eficaz de u na composición o ácido nucleico según se describe en la presente memoria descriptiva . En otra modalidad más, la invención proporciona un procedimiento de producción de u na composición farmacéutica seg ún se describe en la presente memoria descriptiva mezclando una construcción de ácido nucleico o proteína de la invención con un excipiente, diluyente o veh ículo farm acéuticamente aceptable.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Según se describe en el presente documento las construcciones de ácido nucleico de la invención, tienen, típicamente, menos de 15, preferiblemente menos de 10 repeticiones perfectas. La molécula de MUC-1 de tipo salvaje (véase la figura 1) contiene una secuencia de señal, una secuencia líder, VNTR imperfecta o atípica, la zona de VNTR perfecta, otra zona de VNTR atípica, un dominio extracelular que no es VNTR, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático. Las modalidades preferidas de la invención tienen menos de 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 repeticiones. Las construcciones particularmente preferidas tienen 1, 2 o 7 repeticiones perfectas. Las construcciones particularmente preferidas tienen 1, 2 o 7 repeticiones perfectas. El dominio extracelular que no es VNTR es de aproximadamente 80 aminoácidos, 5' de VNTR y 190-200 aminoácidos el VNTR 3'. Todas las construcciones de la invención comprenden, al menos, un epítopo de esta zona. Un epítopo se forma, típicamente, a partir de una secuencia de al menos siete aminoácidos. Según esto, las construcciones de la presente invención incluyen al menos un epítopo del dominio extracelular que no es VNTR. Preferiblemente, se incluye sustancialmente todo o más preferiblemente todo el dominio que no es VNTR. Es particularmente preferido que la construcción contenga al menos un epítopo com prendido por la secuencia FLSFH ISN L, NSS LED PSTDYYQELQRDISE o NLTISDVSV. Más preferi blemente, se incorpora n dos, preferiblemente tres secuencias de epítopos en la construcción . En una modalidad preferida las construcciones comprenden una secuencia l íder N-terminal. La secuencia de señal, el domi nio transmembrana y el domin o citoplasmático son opcionales, cada u no de ellos, en la construcción. Pueden estar todos presentes o se puede no incluirse alg uno de ellos. Las con strucciones preferidas según la invención son : 1 ) 7 VNTR MUC-1 (es decir, MUC-1 completo con sólo 7 repeticiones perfectas). 2) 7 VNTR MUC-1 Ass (como I , pero sin la secuencia señal). 3) 7 VNTR, MUC-1 ??? ACYT (como I , pero sin los dominios transmembrana y citoplasmático). 4) 7 VNTR MUC- 1 Ass ??? ACYT (como 3, pero también sin la secuencia señal). Son preferidas tam bién las construcciones eq uivalentes de 1 a 4 anteriores, pero q ue sólo contienen 2 VNTR o 1 VNTR. El VNTR en dichas construcciones tiene la secuencia de una repetición perfecta según se ha descrito a nteriormente en la presente memoria descriptiva. En una modalidad una o más de las unidades VNTR se muta para reducir la capacidad potencial de glucosilación, alterando el sitio de glucosilación . La mutació n es , preferiblemente, un reem plazamiento, pero tam bién puede ser una inserción o deleción. Típicamente, al menos una treoni na o serina está sustituida con valina, isoleucina, alanina, asparagina, fenilalanina o triptófano. En un monómero de VNTR de tipo salvaje hay disponibles 5 supuestos sitios de unión O de glucosilación en cada monómero MUC-1 de VNTR. Son (véase la numeración anterior) Thr-4, Ser-10, Thr-11, Ser-19 y Thr-20. Por lo tanto, es preferible que al menos uno, preferiblemente 2 o 3 o más, preferiblemente al menos cuatro residuos estén sustituidos según se ha indicado anteriormente. Las sustituciones preferidas incluyen: Thr 4 -> Val Ser 10 ? Ala Thr 11 ? Me o Val Ser 19 ? Val Thr 20 ? Ala En otra modalidad las construcciones de MUC-1 están provistas de una secuencia de ácido nucleico que codifica un epítopo de una célula T heteróloga. Dichos epítopos incluyen epítopos de célula T provenientes d proteínas y toxinas bacterianas, como por ejemplo toxinas Tetanus y Diptheria. Por ejemplo, los epítopos P2 y P30 de la toxina Tetanus. Dichos epítopos pueden ser parte de una secuencia más larga. Los epítopos se pueden incorporar en la molécula de ácido nucleico o en el extremo 3' o 5' de la secuencia según la invención. Pueden contemplarse otros partícipes de fusión como los derivados de núcleo antigénico de la hepatitis B o tuberculosis. En una modalidad, un partícipe de fusión derivado de Mycobacterium tuberculosis, RA12, una subsecuencia (aminoácidos 192 a 323) de MTB32A (Skeiky et al Infection and Immunity (1999) 67:3998-4007). Otros partícipes inmunológicos de fusión incluyen, por ejemplo, la proteína D de Haemophilus influenza B (W091/18926) o una parte (típicamente la parte C-terminal) de LYTA proveniente de Streptococcus pneumoniae (Biotechnology 10: 795-798, 1992). Según otro aspecto de la invención, se proporciona un vector de expresión que comprende y es capaz de dirigir la expresión de una secuencia polinucleotídica según la invención. El vector puede ser adecuado para dirigir la expresión de heterólogos de ADN en células células de insectos, bacterias o mamíferos, particularmente células humanas. Según otro aspecto de la invención, se proporciona una célula huésped que comprende una secuencia de poiinucleótidos según la invención, o un vector de expresión según la invención. La célula huésped puede ser bacteriana, por ejemplo C. coli, de mamífero, por ejemplo humana, o puede ser una célula de insecto. Las células de mamíferos que comprenden un vector según la presente invención pueden ser células cultivadas transfectadas in vitro o pueden transfectarse in vivo administrando el vector al mamífero. La presente invención proporciona también una composición farmacéutica que comprende una secuencia de poiinucleótidos según la invención. Preferiblemente, la composición comprende un vector de ADN. En modalidades preferidas, la composición comprende una pluralidad de partículas, preferiblemente partículas de oro, revestidas con ADN que comprende un vector que codifica una secuencia polinucleotídica de la invención; dicha secuencia codifica una secuencia de aminoácidos de MUC-1 según se describe en el presente documento. En modalidades alternativas, la composición comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y un vector de ADN según la presente invención. La composición puede incluir también un adyuvante, o se puede administrar conjuntamente con o secuencialmente con un adyuvante o agente ¡nmunoestimulante. Por lo tanto, es una modalidad de la invención que los vectores de la invención se utilicen con agentes inmunoestimulantes. Preferiblemente, el agente ¡nmunoestimulante se administra al mismo tiempo que el vector de ácido nucleico de la invención y en las modalidades preferidas se formulan conjuntamente. Dichos agentes inmunoestimulantes incluyen (pero esta lista no es de ninguna manera exhaustiva y no impide la utilización de otros agentes): imidazoquinolinas sintéticas como por ejemplo ¡miquimod [S-26308, R-837], (Harrison, et al. "Reduction of recurrent HSV disease using ¡miquimod alone or combined with a glycoprotein vaccine", Vaccine 19:1820-1826, (2001)); y resiquimod [S-28463, R-848] (Vasilakos, et al. "Adjuvant activites of immune response modifier R-848: Comparison with CpG ODN", Cellular immunology 204: 64-74 (2000).), Las bases de Schiff de carbonilos y aminas que se expresan constitutivamente sobre la superficie de células y células T que presentan antígenos, como por ejemplo tucaresol (Rhodes, J. et al. "Therapeutic potentiation of the immune system by costimulatory Schiff-base-forming drugs", Nature 377: 71-75 (1995)), citoquina, quimioquina y moléculas coestimuladoras como cualquier proteína y péptido, esto incluiría citoquinas proinflamatorias como por ejemplo Interferones, interferones particulares y GM-CSF, IL-1 alfa, IL-1 beta, TGF-alfa y TGF-beta, inductores de Th1 como por ejemplo interferón gamma, IL-2, IL-12, IL-15, IL-18 e IL-21, inductores de Th2 como por ejemplo IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13 y otras quimioquinas y genes coestimulantes como por ejemplo MCP-1, MIP-1 alfa, MIP-1 beta, RANTES, TCA-3, CD80, CD86 y CD40L, otros ligandos objetivo ¡nmunoestimulantes como por ejemplo CTLA-4 y L-selectina, proteínas y péptidos estimulantes de apoptosis como por ejemplo Fas, (49), adyuvantes basados en lípidos sintéticos, como por ejemplo vaxfectína, (Reyes et al., "Vaxfectina enhances antigen specific antibody titres and maintains Th1 type immune responses to plasmid ADN immunization", Vaccine 19: 3778-3786) escualeno, alfatocoferol, polisorbato 80, DOPC y colesterol, endotoxina, [LPS], Beautler, B., "Endotoxin, "Toll-like receptor 4, and the afferent limb of innate immunity", Current Opinión in Microbiology 3: 23-30 (2000)); oligo- y dinucleótidos CpG, Sato, Y. et al., "Inmunoestimulatory ADN sequences necessary for effective intradermal gene immunization", Science 273 (5273): 352-354 (1996). Hemmi, H. et al., "A Toll-like receptor recognizes bacterial ADN", Nature 408: 740-745, (2000) y otros ligandos potenciales que desencadenan los receptores Toll para producir citoquinas que inducen Th1, como por ejemplo lipoproteínas micobacterianas sintéticas, proteína micobacteriana p19, peptidoglucano, ácido teicoico y lípido A. Otras proteínas ¡nmunoestimulantes provenientes de bacterias incluyen la toxina del cólera, toxina de E. coli y los mutantes toxoideos de las mismas. Ciertos adyuvantes preferidos para obtener una respuesta de tipo Th1 predominante incluyen, por ejemplo, un derivado de lípido A como por ejemplo lípido A monofosforílico o, preferiblemente, lípido A monofosforílico 3-de-O-acilado. Los adyuvantes MPL® están disponibles en Corixa Corporation (Seattle, WA; véase, por ejemplo, la patentes de los Estados Unidos N° 4,436,727; 4,877,611; 4,866,034 y 4,912,094). Los oligonucleótidos que contienen CpG (en los que el nucleótido CpG no está metilado) también inducen una respuesta predominantemente Th1. Dichos oligonucleótidos se conocen bien y se describen, por ejemplo, en los documentos WO 96/02555, WO 99/33488 y las patentes de los Estados Unidos N° 6,008,200 y 5,856,462. También se describen secuencias de ADN inmunoestumulantes, por ejemplo, Sato et al., Science 273:352, 1996. Otros adyuvantes preferidos comprenden una saponina, como por ejemplo Quil A o derivados de la misma, incluyendo QS21 y QS7 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA); Escina; Digitonina; o saponinas Gypsophila o Chenopodium quinoa. También se proporciona el uso de un polinucleótido o proteína según la invención, o un vector según la invención, en el tratamiento o profilaxis de tumores que expresan MUC-1 o metástasis. La presente invención proporciona también procedimientos de tratamiento o prevención de tumores que expresan MUC-1, cualquier síntoma o enfermedad asociada con los mismos, incluyendo metástasis que comprende la administración de una cantidad eficaz de un polinucleótido, un vector o una composición farmacéutica según la invención. La administración de una composición farmacéutica puede tomar la forma de dosis individuales, por ejemplo, un régimen de vacun ación terapéutica "in icial-refuerzo" . En ciertos casos, la vacu nación "inicial" puede ser vía la admi nistración de ADN mediada por partículas de un poli nucleótido seg ún la presente invención , q ue se incorpora, preferiblemente , en un vector dirig ido por un plásm ido y el "refuerzo" por administración de u n vector vírico recombinante q ue comprende la misma secuencia de polin ucleótido, o reforzando con la proteína en adyuvante. Por lo contrario, la sensibilización puede ser con el vector vírico o con una formulación proteinica , típicamente una vacuna de ADN de proteína formulada con adyuvante y estimulante de la presente invención . Tal y como se ha d iscutido anteriormente , la presente invención incluye vectores de expresión que comprenden las secuencias n ucleotídicas de la invención . Dichos vectores de expresión se construyen de manera rutinaria en la técn ica de la biolog ía molecular y pueden impl icar, por ejemplo, el uso de un plásmido de ADN e iniciadores, promotores, potenciadores y otros elementos apropiados , como por ejemplo señales de poliadeni lación q ue pueden ser necesarias y que se posicionan en la orientación correcta , para permitir la expresión de proteínas . Otros vectores adecuados se hacen evidentes para los expertos en la técnica. Otro ejemplo respecto a este mismo tema lo encontramos en Sambrook ef al. Molecular Cloning : a Laboratory Manual. 2a edición. CSH Laboratory Press ( 1989). Preferiblemente, un polinucleótido de la invención, o para usarlo en la invención en un vector, se une funcionalmente a una secuencia de control que es capaz de proporcionar la expresión de la secuencia de codificación por la célula huésped, es decir, el vector es un vector de expresión . El término "funcionalmente unido" se refiere a la yuxtaposición de los componentes descritos en una relación que les permite funcionar en la manera pretendida . Una secuencia reg uladora , como por ejem plo un promotor, "funcionalmente unido" a una secuencia cod ificadora se coloca de tal manera que la expresión de la secuencia cod ificadora se logra en cond iciones compatibles con la secuencia reguladora. Los vectores pueden ser, por ejemplo, plásmidos, cromosomas artificiales (por ejemplo, BAC, PAC, YAC), virus o vectores fagos provistos con un origen de replicación , opcionalmente un promotor para la expresión del polinucleotido y opcionalmente un reg ulador del promotor. Los vectores pueden contener uno o más genes marcadores seleccionabas, por ejemplo un gen de resistencia a ampicilina o ca namicina en el caso de un plásmido bacteriano o un gen de resistencia para un vector fúngico. Los vectores se pueden usar in vitro, por ejemplo para la producción de ADN o ARN o se pueden usar para transfectar o transformar una célula huésped, por ejemplo, u na célula huésped de mamífero, por ejemplo, para la producción de una proteína codificada por el vector. Los vectores se pueden adaptar también para usarlos in vivo, por ejemplo, en un proced imiento de vacunación de ADN o terapia génica . Los promotores y otras señales de reg ul ación de la expresión pueden seleccionarse para ser compatibles con la célula anfitriona para la cua l se diseña la expresión . Por ejemplo , los promotores en mam íferos incluyen el promotor de metalotioneina , que se puede inducir en respuesta a metales pesados como por ejemplo cadmio y el promotor de ß-actina.

Ta mbién se puede usar promotores víricos como por ejemplo el promotor del a ntígeno T g rande de SV40, el promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano el promotor del virus LTR del sarcoma de Rous, el promotor de adenovirus o un promotor H PV, particularmente la zona reguladora secuencia arriba (U RR) de H PV. Todos estos promotores están bien descritos y están fácilmente disponi bles en la técn ica. Un elemento promotor preferido es el promotor temprano inmediato C V sin el intrón A, pero incluyendo el exón 1 . Según esto, se proporciona un vector que comprende un polin ucleótido de la invención bajo el control del promotor temprano H CMV IE. Ejemplos de vectores víricos adecuados incluyen vectores de herpes viral simple, vacinales o vectores alfa y retrovirus, incluyendo lentivirus , adenovirus y virus adenoasociados. Las técn icas de transferencia gén ica usando estos virus son conocidas para los expertos en la técnica. Los vectores de retrovirus se pueden usar, por ejemplo, para integrar de manera estable el polinucleótido de la invención en el genoma del huésped , aunque dicha recombinación no es preferida. Los vectores de adenovirus de replicación defectuosa , por lo contrario, permanecen episom ales y permiten, por tanto, la expresión transitoria. Los vectores capaces de dirigir la expresión en células de insectos (por ejemplo, vectores de baculovirus) , en células humanas o en bacterias se pueden emplear para prod ucir cantidades de proteína VI H codificada por los nucleótidos de la presente invención , por ejemplo, para usar como vacunas subunita rias o en in munoensayos. Los poli nucleótidos de la invención tienen utilidad particular en vacunas víricas pues los intentos anteriores para generar construcciones vacinales de longitud completa ha n sido i nfructuosos . Los polinucleótidos según la invención tienen utilidad en la producción por expresión de las proteínas codificadas; dicha expresión tiene lugar in vitro, in vivo o ex vivo. Por lo tanto , lo nucleótidos pueden estar i m plicados en la s íntesis de proteínas recombinantes, por ejemplo, para aumentar los rend imientos o, de hecho, pueden usarse como agentes terapéuticos de derecho propio, utilizados en las técnicas de vacunación de ADN . Donde los polinucleótidos de la presente invención se usan en la producción de proteínas codificadas in vitro o ex vivo, las células, por ejemplo en un cultivo cel ular, se modifican para i ncl uir el polinucleótido q ue se quiere expresar. Dichas células incluyen estirpes celulares transitorias o preferiblemente estables de mamíferos. Ejem plos particulares de células que se pueden modificar por i nserción de vectores que codifican para u n pol i péptido según la invención incluyen las cél ulas de mam íferos H EK293T, CHO, HeLa, 293 y COS. Preferiblemente, la estirpe celular seleccionada es una que no sólo sea estable, sino que perm ita la glucosilación madura y la expresión en la superficie celular de un polipéptido . La expres ión se puede lograr en oocitos transformados. Se puede expresar un polipéptido a partir de un polinucleótido de la presente i nvención , en células de un animal no humano transgénico, preferiblemente , un ratón. Un animal no humano transgénico que expresa u n polipéptido a partir de un polinucleótido de la invención se incluye en el alcance de la invención. La i nvención proporciona también un procedimiento de vacunación de un sujeto mamífero que comprende administrarle una cantidad eficaz de dicha vacuna o composición de vacuna. Más preferiblemente, los vectores de expresión para usar en vacunas de ADN, composiciones de vacuna e inmunoterapia, son plásmidos vectores. Las vacunas de ADN se pueden administrar en forma de "ADN desnudo", por ejemplo, en una formulación líquida que se administra usando una jeringa o un chorro de alta presión, o de ADN formulado con liposomas o un potenciador de la transfección irritante o por administración de ADN mediada por partículas (PMDD). Todos estos sistemas de administración son bien conocidos en la técnica. El vector se puede introducir a un mamífero, por ejemplo, mediante un sistema de administración de vector vírico. Las composiciones de la presente invención se pueden administrar mediante un gran número de vías como por ejemplo intramuscular, subcutánea, intraperitoneal o intravenosamente. En una modalidad preferida, la composición se administra intradérmicamente. En particular, la composición se administra mediante técnicas de administración por pistola de genes (particularmente, bombardeo con partículas) que implica revestir el vector en una perla (por ejemplo, de oro) que después se administran a alta presión en la epidermis; como por ejemplo lo descrito en Haynes et al, J Biotechnoiogy 44: 37-42 (1996). En un ejemplo ilustrativo, se puede lograr la aceleración de partículas conducidas por gas con dispositivos como los fabricados por Powderject Pharmaceuticals PLC (Oxford UK) y Powderject Vaccines Inc.

(Madison, Wl); algunos ejemplos de los mismos se describen en las patentes de los Estados Unidos N° 5,846,796; 6,010,478; 5,865,796; 5,584,807 y la patente europea N° 0500 799. Este método ofrece un procedimiento de administración sin necesidad de aguja en el que una formulación en polvo seco de partículas microscópicas, como por ejemplo polinucleótidos, se aceleran a alta velocidad en un chorro de helio gas generado mediante un dispositivo manual, que impulsa las partículas hacia un tejido objetivo de interés, típicamente la piel. Las partículas son, preferiblemente, perlas de oro de 0,4-4,0 um, más preferiblemente de 0,6 a 2,0 pm de diámetro y el ADN conjugado sobre ellas y después encapsulado en un cartucho o módulo para colocarlo en la "pistola de genes". En una modalidad relacionada, otros dispositivos y procedimientos que pueden ser útiles para inyectar composiciones conducidas por gas sin necesidad de aguja de la presente invención incluyen las proporcionadas por Bioject, Inc. (Portland, OR), algunos de cuyos ejemplos se describen en las patentes de los Estados Unidos N° 4,790,824; 5,064,413; 5,312,335; 5,383,851; 5,399,163; 5,520,639 y 5,993,412. Los vectores que comprenden las secuencias nucleotídicas que codifican los péptidos antigénicos se administran en cantidades tales que son profiláctica o terapéuticamente eficaces. La cantidad a administrar, generalmente está en el intervalo de un picogramo a un miligramo, preferiblemente 1 picogramo a 10 microgramos para administración mediada por partículas y de 10 microgramos a 1 miligramo para otras vías de nucleótido por dosis. La cantidad exacta puede variar considerablemente dependiendo del peso del paciente a inmunizar y la vía de administración. Es posible administrar el componente inmunógeno que comprende la secuencia nucleotídica que codifica el péptido antigénico en una sola dosis o puede administrarse repetidamente, por ejemplo, entre 1 y 7 veces, preferiblemente entre 1 y 4 veces, a intervalos entre aproximadamente 1 día y aproximadamente 18 meses. De nuevo, sin embargo, el régimen de tratamiento variará significativamente dependiendo del tamaño del paciente, de la enfermedad a tratar o contra la que se quiere proteger, la cantidad de secuencia nucleotídica administrada, la vía de administración, y otros factores que se harán evidentes para un médico experto. El paciente puede recibir uno o más fármacos anticancerígenos como parte de su régimen general de tratamiento. Las técnicas adecuadas para introducir el polinucleótido o vector desnudo en un paciente incluyen también la aplicación tópica con un vehículo apropiado. El ácido nucleico se puede administrar tópicamente a la piel, o a las superficies de la mucosa por administración intranasal, oral, intravaginal o intrarectal. El polinucleótido o vector desnudo puede estar presente junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable como solución salina regulada con fosfato (PBS). La absorción de ADN puede facilitarse utilizando agentes de facilitación como por ejemplo bupivacaína, por separado o incluidos en la formulación del ADN. Otros procedimientos para administrar directamente el ácido nucleico en un receptor incluyen ultrasonidos, estimulación eléctrica, electroporación y microsembrado que se describen en la patente US-5,697,901.

Se puede potenciar la absorción de construcciones de ácido nucleico mediante diversas técnicas de transfección conocidas, por ejemplo, las que incluyen el uso de agentes de transfección. Ejemplos de estos agentes incluyen agentes catiónicos, por ejemplo, fosfato cálcico y DEAE-dextrano y lipofectantes, por ejemplo, lipofectamo y transfectamo. Se puede alterar la dosificación del ácido nucleico a administrar. Una secuencia de ácido nucleico de la presente invención se puede administrar también mediante células transformadas. Dichas células incluyen células recogidas de un sujeto. El polinucleótido o vector desnudo de la presente invención se puede introducir en dichas células in vitro y las células transformadas se pueden devolver al sujeto. El polinucleótido de la invención se puede integrar en un ácido nucleico ya presente en una célula mediante sucesos de recombinación homologa. Una célula transformada, si se desea, puede desarrollarse in vitro y una o más de las células resultantes se puede utilizar en la presente invención. Las células se pueden proporcionar a un paciente en el sitio apropiado mediante técnicas quirúrgicas o microquirúrgicas conocidas (por ejemplo, injertos, microinyección, etc.).

EJEMPLOS: 1.1. GENERACIÓN DE CONSTRUCCIONES Se puede encontrar en la Figura 1 un esquema de la relación entre todas las construcciones detalladas anteriormente. 1.2 CONSTRUCCIÓN DEL MÓDULO DE EXPRESIÓN DEL GEN COMPLETO DE MUC-1 El punto de partida de la construcción de un módulo de expresión de MUC-1 fue el plásmido pADNc-3-FL-MUC-1 (ICRF, Londres). Este plásmido tiene una estructura principal pADNc3 (Invitrogen) que contiene un módulo de ADNc del gen MUC-1 completo (FL-MUC1) clonado en el sitio BamHI. Sobre la base del mapa de restricción llevado a cabo en el ICRF, el gen de MUC-1 tiene aproximadamente 32 unidades de VNTR (número variable de repeticiones en tándem). La presencia de MUC-1 se confirmó mediante secuenciación fluorescente usando los cebadores 2004MUC1-2014MUC1 (Apéndice A). La secuencia de MUC-1 en la que se basa la secuencia de FL-MUC1 se muestra en la Figura 2. En la primera etapa del proceso de clonación, se aisló un fragmento BamHI que contiene la secuencia de ADNc MUC-1 y se clonó en el sitio BamHI del vector de expresión pADNc3.1 (+)/Hygro (Invitrogen), generando el pásmido JNW278. La orientación correcta del fragmento, en relación con el promotor CMV, se confirmó mediante PCR y secuenciación fluorescente. La siguiente etapa de la clonación requirió la eliminación de la región 3' no traducida (UTRs) y el reemplazamiento con sitios de enzima de restricción mejorados para facilitar procedimientos de clonación futuros. Se amplificó un fragmento de MUC-1 por PCR con los cebadores 2062MUC1 y 2063MUC1 (Apéndice A) usando JNW278 como una plantilla y se cortó por resticción usando BstXI y Xhol. En paralelo, el plásmido JNW278 se cortó por restricción usando BstXI y X ol. La estructura principal del vector purificado se ligó con el fragmento de PCR generando el plásmido JNW314. El análisis de restricción y la secuenciación fluorescente confirmaron la presencia del fragmento correcto. En paralelo, se eliminó el UTR 5' y se reemplazó con una secuencia de Kozak óptima y sitios de enzima de restricción mejorados. Se cortó por restricción JNVV278 con Nhel-Xhol eliminando la secuencia entera de ADNc de MUC-1. Se amplificó un fragmento de MUC-1 por PCR con los cebadores de PCR 2060MUC1 y 2061 MUC1 (Apéndice A), se cortaron por restricción Nhel-Xhol, y se ligaron en la estructura principal del vector, generando el plásmido JNW294. En la siguiente etapa de la clonación, se cortó por restricción JNW294 usando, liberando dos fragmentos (de aproximadamente 2,3 kpb y 3,2 kpb). El más grande de estos dos fragmentos (Fragmento A) se aisló y se purificó. En paralelo, se cortó por restricción JNW314 con BsaMI y se aisló y se purificó el más grande de los dos fragmentos (fragmento B, aproximadamente 7 kpb en tamaño). Los fragmentos A y B se ligaron juntos generando el plásmido JNW340. La orientación correcta se confirmó haciendo el mapa de restricción usando Nhe-Xhol y de forma separada, Xbal. En la etapa final de la clonación, se aisló un módulo de expresión de JNW340 por digestión por restricción con Nhel y Xhol, liberando un fragmento de aproximadamente 4 kpb. El plásmido de expresión pVAC1 (Thomsen Immunology 95: 51OP106, 1998) se cortó con Nhel-Xhol y se ligó con el módulo de MUC-1, generando el plásmido de expresión JNW358 con el gen completo de MUC-1. La orientación correcta de la secuencia de MUC-1 en relación al promotor CMV se confirmó mediante digestión por restricción y por secuenciación fluorescente. La secuencia del módulo de expresión de MUC-1 se muestra en la Figura 3. 1.3 CONSTRUCCIÓN DE UN VECTOR DE MUC-1 QUE CONTIENE UNA UNIDAD DE VNTR El punto de partida para la construcción del módulo de expresión de MUC-1 que contiene una unidad de VNTR es JNW278. Una característica única de la secuencia de ADN altamente repetitiva de VNTR es la presencia de un sitio de restricción Fsel en cada una de las unidades de repetición. JNW278 se digirió completamente por restricción usando Fsel, se aisló la estructura principal del vector y se religó para generar el plásmido JNW283. La presencia de una única unidad de VNTR se confirmó mediante análisis de restricción, PCR y por secuenciación fluorescente. La secuencia de MUC-1 de JNW283 se muestra en la Figura 2. 1.4 CONSTRUCCIÓN DE UN VECTOR DE EXPRESIÓN DE MUC-1 QUE CONTIENE UNA UNIDAD DE VNTR Se llevaron a cabo las siguientes etapas de clonación para transferir el módulo de MUC-1 que contiene una unidad de VNTR de JNW283 en el plásmido de expresión pVAC. La primera etapa de la clonación conllevó la eliminación de las regiones 5' y 3' no traducidas (UTRs) y el reemplazamiento con sitios de enzima de restricción mejorados para facilitar procedimientos de clonación futuros. Se amplificó un fragmento de UC-1 mediante PCR con los cebadores 2060MUC1 y 2062MUC1 usando JNW283 como una plantilla y se cortó usando Nhel y Xhol. En paralelo, el plásmido JNW278 se cortó usando BstXI y Xhol. La estructura principal del vector purificado se ligó con el fragmento de PCR generando el plásmido JNW322. El análisis de restricción y la secuenciación fluorescente confirmaron la presencia de un fragmento correcto. 1.5 CONSTRUCCIÓN DE UN MÓDULO DE MUC-1 QUE CONTIENE UN NÚMERO REDUCIDO DE UNIDADES DE VNTR El punto de partida para la construcción de un módulo de expresión de MUC-1, que contiene un número reducido de unidades de VNTR, es JNW283 que se linealizó usando Fsel. Las unidades de VNTR se generaron por digestión parcial del plásmido JNW278 con Fsel para liberar una escalera de pequeños fragmentos, que varían en tamaño de 60 pb-equivalente a una unidad de VNTR- a aproximadamente 420 pb que corresponde a 7 unidades de VNTR. La escalera de fragmentos de VNTR generados por una digestión parcial de JNW278 se muestra en la figura 7. Los fragmentos de 60 a 500 pb se purificaron por extracción en gel y se ligaron con JNW283 linealizado con Fsel . Los clones se seleccionaron inicialmente por PCR usando los cebadores 2005MUC1 y 2013MUC1 que se posicionan respectivamente en 5' y en 3' de la región VNTR de MUC-1.

La PCR se establece de un modo tal que los clones que contienen múltiples unidades de VNTR producirían un fragmento de PCR más grande que el fragmento de PCR que corresponde a una unidad de VNTR de JNW283. Los clones que dieron positivo a la PCR se sometieron a análisis adicional mediante digestión por restricción y secuenciación fluorescente para confirmar el número de unidades de VNTR presentes. Usando este protocolo, se obtuvo un número de plásmidos diferentes incluyendo JNW319, que posee siete unidades de VNTR en total, y JNW321 que posee dos unidades de VNTR. Las secuencias de JNW319 y JNW321 se muestran en las figuras 4 y 5. Las unidades de VNTR de JNW319 muestran polimorfismos que están presentes en la mayor parte de la población (indicados por los asteriscos). 1.6 CONSTRUCCIÓN DE UN VECTOR DE EXPRESIÓN DE MUC-1 QUE CONTIENE SIETE UNIDADES DE VNTR Para transferir el módulo de MUC-1 que contiene siete unidades de VNTR en el plásmido de expresión pVAC, se llevaron a cabo las siguientes etapas de clonación. La primera etapa de clonación conllevó la eliminación de la región 3' no traducida (UTRs) y el reemplazamiento con sitios de enzimas de restricción mejorados para facilitar procedimientos de clonación futuros. Se amplificó un fragmento de MUC-1 por PCR con cebadores 2062MUC1 y 2063MUC1 usando JNW278 como una plantilla y se cortó por restricción usando BstXI y Xhol. En paralelo, el plásmido JNW319 se cortó por restricción usando BstXI y Xhol. La estructura principal del vector purificado se ligó con el fragmento de PCR generando el plásmido JNW622. El análisis de restricción y la secuenciación fluorescente confirmaron la presencia de un fragmento correcto. En la siguiente etapa de la clonación se cortó por restricción JNW294 usando BsaMI, liberando dos fragmentos (de aproximadamente 2,3 kpb y 3,2 kpb). El más grande de estos dos fragmentos (Fragmento A) se aisló y se purificó. En paralelo, se cortó por restricción JNW622 con BsaMI y se aisló y se purificó el más grande de los dos fragmentos (Fragmento C, aproximadamente 4 kpb en tamaño). Los fragmentos A y C se ligaron juntos generando el plásmido JNW640. La orientación correcta se confirmó haciendo el mapa restricción usando Xbal y secuenciación fluorescente. En la etapa final de la clonación, el módulo de MUC-1 de JNW640 se aisló siguiendo la restricción con Nhel y Xhol y se ligó con pVAC (también linealizado con Nhel y Xhol), generando el plásmido JNW656. La secuencia del módulo de expresión de MUC-1 se confirmó mediante secuenciación fluorescente y se muestra en la Figura 6. 1.7 PURIFICACIÓN DE UNIDADES DE VNTR Después de la digestión de JNW278 (FL-MUC1) con Fsel, se liberó una escalera de VNTR, que se extiende de 60 pb (equivalente a una unidad de VNTR) a 420 pb (equivalente a 7 unidades de VNTR). Después de la electroforesis, los fragmentos se aislaron a partir del gel de agarosa y se purificaron. La Figura 8 muestra dos escaleras de unidades de VNTR.

Los marcadores de ADN se muestran en las calles A y D. La calle B muestra una escalera que representa unidades de VNTR en el intervalo de 60 a 240 pb. La calle C muestra la escalera que representa unidades de VNTR en el intervalo de 180 a 420 pb. Estos fragmentos se ligaron posteriormente en el plásmido JNW283, linealizado con Fsel para construir un gen MUC-1 que contiene 2, y 7 unidades de VNTR. Se pueden realizar de una forma análoga otras construcciones que contienen 3,4,5 o 6 unidades de VNTR (Ver Figura 7). 2. PREPARACIÓN DE CONSTRUCCIONES PARA INMUNIZACIÓN CUTÁNEA CON PISTOLA DE GENES.

El ADN del plásmido se precipitó en microesferas de oro de diámetro de 2 µ?? usando cloruro de calcio y espermidina. Las microesferas cargadas se revistieron en tubos flexibles Tefzel como se ha descrito (Eisenbraum et al, 1993; Pertmer et al, 1996). El bombardeo con partículas se llevó a cabo usando un sistema de suministro de genes Accell (PCT W095/19799). Para cada plásmido, se inmunizaron hembras de ratón C56B1/6 con 3 administraciones de plásmido en los días 0, 21 y 42. Cada administración consistió en 2 bombardeos con ADN/oro, proporcionando una dosis total de aproximadamente 4 a 5 de plásmido. 2.1 INMUNIZACIÓN INTRAMUSCULAR (I.M.) CON ADN Se inmunizaron intramuscularmente hembras de ratón C57B1/6 en la pata trasera con 50 g de ADN en PBS en los días 0, 21 y 42. 2.2 INYECCIÓN DE CÉLULAS TUMORALES Se llevaron a cabo dos baterías de experimentos de regresión tumoral en los que, en el primer experimento se inyectaron subcutáneamente 0,5 x 10e células tumorales en la ijada de los ratones anestesiados dos semanas después de la última inmunización. En el segundo experimento se usó un modelo mucho más agresivo, en el que el animal recibió 1,0 x 106 células tumorales. El crecimiento del tumor se controlaba dos veces a la semana usando un calibre de nonio en dos dimensiones. Los volúmenes del tumor se calcularon como (a x b2)/2, donde a representa el diámetro más largo y b el diámetro más corto. El punto final experimental (muerte) se definió como el tiempo en el que el diámetro del tumor alcanzó 15 mm. 3: ENSAYOS DE LAS CONSTRUCCIONES 3.1.1 MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS CÉLULAS TUMORALES B16F0 Y B16F0-MUC1 Las células B16F0 (melanoma metastático de murina) transfectadas con un vector de expresión para el ADNc humano de MUC-1 se obtuvieron de Glaxo Wellcome, EE.UU. Las células se cultivaron como monocapas adherentes en DMEM complementado con suero de feto bovino al 10% ¡nactivado por calor, L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ de estreptomicina y 1 mg/ml de antibiótico tipo neomicina (G148). Las células se retiraron de los matraces para su uso en ensayos ELISPOT usando Versene y se irradiaron (16.000 Rads). 3.1.2 CONSTRUCCIÓN DE CÉLULAS TUMORALES EL4 QUE EXPRESAN MUC-1 Las células EL4 se cultivaron en medio RPMI completo que contenía FCS al 10%, 100 U/ml de penicilina, 100 µ?/?t?? de estreptomicina, L-glutamina 2 mM,y 2-mercaptoetanol 50 µ?. El plásmido JNW278 (contiene el gen MUC-1 completo) se linealizó con Fspl, se purificó por extracción con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) seguido de precipitación con etanol. Se mezclaron 2 x 107 células en 0,5 mi de medio RPMI completo con 20 µg de ADN linealizado en una cubeta BIORAD de 0,4 mm. Las células se transfectaron por electroporación a 320 V, 960 µ?. Después de la electroporación, la suspensión celular se transfirió a 30 mi de medio RPMI completo precalentado y se incubó durante 24 horas para permitir la recuperación. Las células se dispusieron bajo selección en medio RPMI completo que contenía 500 µ9/??? de higromicina y se incubaron durante 7 a 10 días. Las células supervivientes se diluyeron en placas de fondo en U de 96 concavidades a 0,5 células/concavidad en 200 µ? de medio RPMI completo incluyendo 500 µ9/G?? de higromicina. De 8 a 10 días después, los clones se transfirieron a placas de 24 concavidades. En esta etapa, el perfil de expresión de MUC-1 se calculó medíante citometría de flujo y los clones uniformes que dieron positivo mantuvieron para análisis adicionales.

ENSAYOS ELISPOT PARA RESPUESTAS DE CÉLULAS T AL GEN PRODUCTO DE MUC-1 3.2.1 PREPARACIÓN DE ESPLENOCITOS Se obtuvieron los bazos de animales inmunizados a los 7 días después del estímulo, que fue tanto en el día 28 como en el día 49. Los bazos se procesaron por trituración entre placas de vidrio para producir una suspensión celular. Se lisaron células sanguíneas rojas mediante tratamiento con cloruro de amonio y se eliminaron los residuos para dejar una suspensión pura de esplenocitos. Las células se resuspendieron a una concentración de 8 x 10e células /mi en medio RPMI completo para su uso en ensayos ELISPOT. 3.3 RASTREO DE LA BIBLIOTECA DE PÉPTIDOS Se compró una biblioteca de péptidos que cubre la secuencia completa de MUC-1 a Mimotopes. La biblioteca contenía 116 péptidos de 15 monómeros que solapan por péptidos de 11 aminoácidos cubriendo la secuencia completa de MUC-1 (incluyendo una copia de la región de repetición en tándem). Los péptidos se representan por los números del 184 al 299. Para el rastreo de la biblioteca de péptidos, los péptidos se usaron a una concentración final de 10 µ? en ensayos ELISPOT de IFNy e IL-2 usando el protocolo que se ha descrito anteriormente. Para los ensayos ELISPOT de IFNy, la IL-2 se añadió a los ensayos a 10 ng/ml. Los esplenocitos usados para el rastreo se tomaron procedentes de ratones C57BL/6 en el día 49 o de ratones CBA inmunizados con FL MUC1 en los días 0, 21 y 42. 3.4 ELABORACIÓN DEL MAPA DEL EPÍTOPO Las dos regiones de MUC-1 que mostraban buena reactividad en ratones C57BL/6 se seleccionaron para un estudio adicional. Éstas eran regiones cubiertas por los péptidos 222-225 y 238-239. Se mostró mediante citometría de flujo (protocolo posterior) que las células que producían IFNy en respuesta a estos péptidos eran células CD8. Para elaborar el mapa de los epítopos se pidió además a Mimotopes los péptidos de 8 y 9 monómeros que se solapan por 7 u 8 aminoácidos respectivamente. Éstos se ensayaron en ELISPOT de IFNy usando esplenocitos de animales inmunizados como se ha detallado anteriormente. Se identificaron dos péptidos inmunodominantes, SAPDNRPAL y PTTLASHS. 3.5 ENSAYO ELISPOT Se cubrieron placas con 15 µ?/p?? (en PBS) de IFNy anti-ratón de rata o IL-2 anti-ratón de rata (Pharmingen). Las placas se cubrieron durante toda la noche a + 4°C. Las placas se lavaron tres veces con PBS antes de usar. Se añadieron los esplenocitos a las placas a razón de 4 x 105 células/concavidad. El péptido SAPDNRPAL se usó en ensayos a una concentración final de 10nM. El péptido PAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGV (péptido de 25 monómeros) se usó a una concentración final de 25 µ?. Estos péptidos se obtuvieron de Genemed Synthesis. Los péptidos identificados por estudios de rastreo de la biblioteca y de mapeo de epítopos se usaron también en los ensayos ELISPOT: 203 (DVTLAPATEPATEPA) a 10 µ?, 299 (LSYTNPAVAATSANL) a 10 µ?, PTTLASHS a 1 µ? (Mimotopes). Se usaron células tumorales irradiadas B16, B16-MUC-1 y EL4, EL4-278 en una célula tumoral: proporción del efector de 1:4. Los ensayos ELISPOT se llevaron a cabo en presencia de IL-2 (10 ng/ml), IL-7 (10 ng/ml) y en ausencia de citoquina. El volumen total en cada concavidad era de 200 µ?. Las placas que contenían células estimuladas por péptido se incubaron durante 16 horas en una incubadora humidificada a 37°C mientras que aquellos que contenían células tumorales como estimuladores se incubaron durante 40 horas. 3.5.1 DESARROLLO DE PLACAS DE ENSAYO ELISPOT Las células se retiraron de las placas lavando una vez con agua (1 minuto en remojo para asegurar la lisis de las células) y tres veces con PBS. Se añadió IFNy o IL-2 anti-ratón de rata conjugado con biotina (Phamingen) a razón de 1 µg ml en PBS. Las placas se incubaron con agitación durante dos hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con PBS antes de la adición de la fosfatasa alcalina de la Streptavidina (Caltag) a una dilución 1/1000. Después de tres lavados en PBS, se revelaron las manchas por incubación con sustrato BCICP (Biorad) durante 15 a 45 minutos. El sustrato se lavó usando agua y las placas se dejaron secar. Se enumeraron usando un sistema de análisis de imagen diseñado por Brian Hayes, unidad de Biología Celular del Asma, GSK. 3.6 CITOMETRÍA DE FLUJO PARA DETECTAR PRODUCCIÓN DE IFNY PROCEDENTE DE CÉLULAS T EN RESPUESTA A ESTIMULACIÓN POR PÉPTIDOS Los esplenocitos se resuspendieron en 4 x 106/ml. Se añadió péptido a una concentración final de 10 µ? e IL-2 a una concentración final de 10 ng/ml. Las células se incubaron a 37°C durante tres horas, se añadió Brefeldin A a 10 µg/ml, y la incubación continuó toda la noche. Se lavaron las células con regulador de FACS (PBS +2,5% de FCS +0,1% de azida) y se tiñó con citocromo anti-CD4 y FITC anti-CD8 (Pharmingen). Las células se lavaron y se fijaron con medio A del kit Caltag Fix and Perm durante 15 minutos seguido del lavado y adición de PE anti-IFNy (Pharmingen) diluido en medio B del kit Fix and Perm. Después de 30 minutos de incubación las células se lavaron y se analizaron usando un FACSCAN. Se recogió un total de 500.000 células por muestra y posteriormente se controlaron las células CD4 y CD8 para determinar las poblaciones de células que secretan IFNy en respuesta a cada péptido. 3.7 ENSAYO ELISA DE ANTICUERPOS PARA EL PRODUCTO DEL GEN DE UC-1 Se obtuvieron muestras de suero de animales por venopunción en los días -1, 21, 49 y 56, y se ensayó para la presencia de anticuerpos anti-MUC-1. El ELISA se llevó a cabo usando placas Nunc Maxisorp cubiertas toda la noche a 4°C con 3 µglm\ de secuencia del péptido de tipo salvaje MUC-01 (40 monómeros que corresponden a dos secuencias de repetición en tándem, PAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAP). Después de lavar con TBS-Tween (solución salina regulada con Tris, pH 7,4 que contiene un 0,05% de Tween 20), las placas se bloquearon con BSA al 3% en regulador TBS-Tween durante dos horas a temperatura ambiente. Se incubaron todos los sueros a una dilución 1:100 durante una hora a temperatura ambiente en regulador TBS-Tween. La unión de anticuerpo se detectó usando inmunoglobulinas anti-ratón de conejo conjugadas con HRP (#P0260, Dako) a una dilución de 1:2000 en regulador TBS-Tween. Las placas se lavaron de nuevo y se detectó el conjugado unido usando reactivos de color de OPD rápido (Sigma, UK). La reacción se paró por la adición de ácido sulfúrico 3M y el producto de OPD se cuantificó mediante la medida de absorbancia a 490 nm. 3.8 ANÁLISIS DE CITOMETRÍA DE FLUJO DE SUEROS DE RATONES INMUNIZADOS Para demostrar que los anticuerpos provocados por estas vacunas son capaces de reconocer células tumorales, las muestras de anti-suero procedentes de ratones inmunizados por PMID se usaron para clasificar varias líneas de células tumorales, y la clasificación se visualizó por citometría de flujo. Las células (T47-D, MCF-7, EL4, EL4-278, B16F0 y B16F0MUC1; 1 x 106) se lavaron en regulador PBS complementado con FCS al 5% y se incubaron a 4°C durante 15 minutos con sueros de ratón a una dilución de 1:100. Después de lavar, las células se incubaron con el segundo anticuerpo (IgG anti-ratón de oveja, Dako, Dinamarca, a una dilución 1:50) en las mismas condiciones. Se incubaron células de control con regulador de FACS en lugar del anticuerpo de la primera etapa previo a la tinción con el reactivo de la segunda etapa. El análisis de FACS se llevó a cabo usando un FACScan (Becton Dickinson). Se midieron simultáneamente de 1000 a 10000 células por muestra por FSC (dispersión de luz en un ángulo de avance) y SSC (dispersión de luz integrada) así como fluorescencia (expresada como logaritmo de la luz de fluorescencia integrada) verde (FLI). Los registros se hicieron excluyendo agregados cuyos FSC estaban fuera del intervalo. Los datos se expresaron como histogramas representados gráficamente como número de células (eje Y) frente a la intensidad de fluorescencia (eje X) para los diferentes tipos de sueros de ratón unidos a la superficie de células tumorales. 3.9 ENSAYOS DE TRANSFECCIÓN TRANSITORIA Se analizó la expresión de MUC-1 de varias construcciones de AD por transfeccion transitoria de los plásmidos en células CHO (ovario de hámster chino) seguida de una transferencia Western de la proteína celular total o de análisis de citometría de flujo de MUC-1 expresado en membrana celular. Las transfecciones transitorias se llevaron a cabo con reactivo Transfectam (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Al poco tiempo, se sembraron placas de cultivo tisular de 24 concavidades con 5 x 104células CHO por concavidad en 1 mi de medio DMEM completo (DMEM, FCS al 10%, L-glutamina 2 mM, 100 Ul/ml de penicilina, 100 µg ml de estreptomicina) y se incubaron durante 16 horas a 37°C. Se añadieron 0,5 µg de ADN a 25 µ? de NaCI de 0,3 M (suficiente para un concavidad) y se añadieron 2 µ? de Transfectam a 25 µ? de Milli-Q. Las soluciones de ADN y Transfectam se mezclaron lentamente y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos. Durante la etapa de incubación, las células se lavaron una vez en PBS y se cubrieron con 150 µ? medio libre de suero (DMEM, L-glutamina 2 mM). La solución de ADN-Transfectam se añadió gota a gota a las células, la placa se agitó lentamente y se incubó a 37°C durante 4 a 6 horas. Se añadieron 500 µ? de medio DMEM completo y las células se incubaron durante unas 48 a 72 horas adicionales a 37°C. 3.10 ANÁLISIS DE CITOMETRÍA DE FLUJO DE CÉLULAS CHO TRANSFECTADAS TRANSITORIAMENTE CON PLÁSMIDOS DE MUC-1 Después de la transfección transitoria, las células CHO se lavaron una vez con PBS y se trataron con una solución de Versene (1 :5000)/0,025% de tripsina para transferir las células en suspensión. Después de la tripsinación, las células CHO se agregaron y se resuspendieron en regulador de FACS (PBS, 4% de FCS , 0,01% de azida de sodio). El anticuerpo primario ATR1 se añadió a una concentración final de 15 µg/ml y las muestras se incubaron en hielo durante 15 minutos. Las células control se incubaron con regulador de FACS en ausencia de ATR1. Las células se lavaron tres veces en regulador de FACS, se resuspendieron en 100 µ? de regulador de FACS que contenía 10 µ? del anticuerpo secundario inmunoglobulinas anti-ratón de cabra conjugadas con FITC F(ab')2 (Dako, F0479) y se incubaron en hielo durante 15 minutos. Después de la tinción con anticuerpo secundario, las células se lavaron tres veces en regulador de FACS. El análisis FACS se llevó a cabo usando un FACScan (Becton Dickinson). Se midieron simultáneamente de 1000 a 10000 células por muestra mediante FSC (dispersión de luz del ángulo) y SSC (dispersión de luz integrada) así como fluorescencia (expresada como logaritmo de la luz de fluorescencia integrada) verde (FLI). Los registros se hicieron excluyendo agregados cuyos FSC estaban fuera del intervalo. Los datos se expresaron como histogramas representados gráficamente como número de células (eje Y) frente a la intensidad de fluorescencia (eje X). 3.11 ANÁLISIS DE TRANSFERENCIA WESTERN DE CÉLULAS CHO TRANSFECTADAS TRANSITORIAMENTE CON PLÁSMIDOS CON MUC-1 Las células CHO tansfectadas transitoriamente se lavaron con PBS y se trataron con una solución de Versene (1:5000)/ 0,025% de tripsina para transferir las células en suspensión. Después de la tripsinación, las células CHO se aglomeraron y se resuspendieron en 50 µ? de PBS. Se añadió un volumen igual de regulador de muestra 2x con SDS y TRIS-glicina (Invitrogen) que contiene DTT 50 mM a la solución calentada a 95°C durante 5 minutos. Se cargaron de 1 a 20 µ? de muestra en un gel de TRIS-glicina al 4-20% de 1,5 mm (Invitrogen) y se realizó la electroforesis a voltaje constante (125 V) durante 90 minutos en regulador 1x con TRIS-glicina (Invitrogen). Se usó un marcador pre-teñido de intervalo ancho (New England Biolabs, #P7708S) para determinar el tamaño de las muestras. Después de la electroforesis, las muestras se transfirieron a una membrana Immobilon-P PVDF ( illipore), pre-humedecida en etanol, usando un módulo de transferencia Xcell III (Invitrogen), regulador de transferencia 1x (Invitrogen) que contenía un 20% de metanol y un voltaje constante de 25 V durante 90 minutos. La membrana se bloqueó durante toda la noche a 4°C en TBS-Tween (solución salina regulada con Tris, pH 7,4 que contiene un 0,05% de T een 20) conteniendo un 3% de leche desnatada en polvo (Marvel). El anticuerpo primario (ATR1) se diluyó 1:100 y se incubó con la membrana durante una hora a temperatura ambiente. Después de un lavado a fondo en TBS-Tween, el anticuerpo secundario se diluyó 1:2000 en TBS-Tween que contenía un 3% de leche desnatada en polvo y se incubó con la membrana durante una hora a temperatura ambiente. Después de un lavado a fondo, la membrana se incubó con sustrato quimioluminiscente Supersignal West Pico Chemiluminescent (Pierce) durante 5 minutos. El exceso de líquido se eliminó y la membrana se selló entre dos láminas de película adherente y expuesta a una película Hyperfilm ECL (AmershamPharmaciaBiotech) durante 1 a 30 minutos. 4. RESULTADOS 4.1 COMPARACIÓN DE LA PISTOLA DE GENES Y LA INYECCIÓN INTRAMUSCULAR El módulo de expresión del FL-MUC1 en el plásmido pADNc3-FL- UC1, se administró a ratones mediante PMID e inyección intramuscular. 4.2 COMPARACION DE RESPUESTAS DE ANTICUERPOS En la Figura 9 se muestran las respuestas de anticuerpos anti-MUC1 que siguieron a la inmunización mediante inyección intramuscular (ratón A-C) y mediante PMID (ratón D-F). Los resultados muestran que la administración por PMID induce una respuesta de anticuerpo más robusta con cinéticas más rápidas, con 3 de 3 ratones respondiendo en el día 41. En contraste, solamente un ratón inmunizado por ruta intramuscular mostró buenas respuestas de anticuerpos en el día 41. Incluso después de un refuerzo adicional en el día 42, sólo 2 de 3 ratones mostraron niveles de anticuerpos de MUC-1 comparables a aquellos de los ratones inmunizados por PMID. 4.3 COMPARACIÓN DE RESPUESTAS CELULARES Las respuestas celulares que siguen a la inmunización intramuscular (IM) o por PMID con pADNc3 (vector vacío) o pADNc3-FL-MUC1 se determinaron por ELISPOT después de la inmunización primaria en el día 0 y a dos refuerzos en el día 21 y en el día 42. Este ensayo se llevó a cabo en el día 13 después del segundo refuerzo. Se estimularon los esplenocitos con el péptido SAPDTRPAP (9.1) que se ha descrito previamente en la bibliografía como un buen epítopo H de 2 kb. Las respuestas de IFNy, la Figura 10 muestra que el 100% de los ratones inmunizados por PMID tienen respuestas detectables al péptido mientras que no se detectaron respuestas en los ratones inmunizados intramuscularmente. 4.4 EXPRESIÓN IN VITRO DE CONSTRUCCIONES DE MUC-1- TRANSFERENCIA WESTERN La Figura 11 muestra los resultados de una transferencia Western del total de la proteína celular para MUC-1 que sigue a la transfección transitoria de varias construcciones de MUC-1 en células CHO. Los datos muestran que la construcción FL-MUC1 (JNW358) genera una mancha a 83-175 kDa, consistente con el peso molecular predicho de 108 kDa y glucosilación heterogénea pero considerable de la estructura de VNTR. La construcción de MUC-1 con 7 x VNTR (JNW656) produce una mancha más concentrada, centrada alrededor de ~65 kDa, consistente con el peso molecular predicho (61 kDa) y con la glicosilación heterogénea de la estructura de VNTR. La construcción de MUC-1 con 1 x VNTR (JNW332) produce una sola banda débil de -40 kDa, consistente con la presencia de una única unidad VNTR solamente. 4.5 EXPRESIÓN IN VITRO DE CONSTRUCCIONES DE MUC-1- CITOMETRÍA DE FLUJO Después de la transfección transitoria de las construcciones de MUC-1 en células CHO, se determinó la expresión de MUC-1 en la superficie celular mediante citometría de flujo usando el anticuerpo específico de VNTR de MUC-1 ATR1. El porcentaje de células positivas a MUC-1 fue de un 9,6% para muestras transfectadas con FL-MUC1 (JNW358), un 8,8% para muestras transfectadas con 7 x VNTR de MUC-1 y un 9,8% para muestras transfectadas con 1 x VNTR de MUC-1 (JNW332). Estos datos sugieren que la mayoría de los VNTRs no afecta a la habilidad de MUC-1 para translocarse a la superficie celular y ser detectadas por el anticuerpo ATR1. 4.6 RESPUESTAS DE ANTICUERPOS A FL-MUC1.7 X VNTR DE MUC-1 Y 1 X DE VNTR MUC-1 QUE SIGUEN A LA INMUNIZACIÓN MEDIANTE PMID Las respuestas de anticuerpos que siguen a la inmunización con pVAC (vector vacío), JNW358 (FL-MUC1), JNW656 (7 x VNTR de MUC-1) y JNW332 (1 x VNTR de MUC-1) se determinaron por ELISA después de una primera inmunización mediante PMID en el día 0 y dos refuerzos en el día 21 y en el día 42. La Figura 12 muestra las respuestas de anticuerpos de sueros tomados en el día 56. Mientras que no hubo respuestas específicas de MUC-1 en el vector vacío, la construcción FL-MUC1 y la construcción 7x VNTR de MUC-1 producían concentraciones robustas y comparables de anticuerpos específicos de MUC1. En contraste, la construcción 1x VNTR de MUC-1 indujo una respuesta de anticuerpos de más baja concentración. La Figura 12b muestra que las cinéticas de respuesta de anticuerpos a FL-MUC1 y a 7x VNTR de MUC-1 son también muy similares, mientras que la respuesta a 1x VNTR de MUC-1 se desarrolla más lentamente y requiere un segundo refuerzo en el día 42 para alcanzar una meseta. Estos datos confirman que la eliminación de la mayoría de las unidades de VNTR no es perjudicial para la inducción de una fuerte respuesta de anticuerpos específica para MUC-1. Sin embargo, la respuesta de anticuerpos a 1x VNTR de MUC-1 está por debajo de lo óptimo en términos de magnitud y de cinética con respecto al inicio. 4.7 RECONOCIMIENTO DE CÉLULAS TUMORALES QUE EXPRESAN MUC-1 POR SUEROS DE RATONES INMUNIZADOS CON MUC-1 Para confirmar que los anticuerpos inducidos por FL-MUC1, 7x VNTR de MUC-1 y por 1x VNTR de MUC-1 son capaces de reconocer la forma del MUC-1 humano expresado en células tumorales, se hizo un ensayo mediante citometría de flujo de los sueros de ratones inmunizados. Las células objetivo eran B16F0MUC1 , una línea de células tumorales que se había diseñado para expresar MUC-1 humano. Los resultados, mostrados en la Figura 13, confirman que los sueros de ratones inmunizados con FL-MUC1 (JNW358), ratones inmunizados con 7x VNTR de MUC-1 (JNW656) y ratones inmunizados con 1x VNTR de MUC-1 (JNW332) son equivalentes en su habilidad para reconocer MUC-1 expresado en células B16F0MUC1, sugiriendo que la eliminación de una cantidad grande de unidades de VNTR no es perjudicial para la inducción de una respuesta de anticuerpos fisiológicamente relevante. 4.8 IDENTIFICACIÓN DE EPÍTOPOS NUEVOS DE CÉLULAS T DE MUC-1 EN RATONES C57BL/6 POR RASTREO DE UNA BIBLIOTECA DE PÉPTIDOS DE MUC-1 Después de la inmunización con JNW358 (FL-MUC1) por PMID en el día 0 y de dos refuerzos en el día 21 y en el día 42, se llevaron a cabo ensayos ELISPOT en el día 49. Se hicieron ensayos con péptidos de la biblioteca de FL-MUC1 a una concentración final de 10 µ?. De este rastreo inicial se encontró que varios grupos de péptidos de 15 monómeros estimulaban la secreción de IFNy o IL-2. Las regiones de interés se marcan en la Figura 20. Los péptidos que estimulan la secreción de IFNy se estudiaron además tiñendo citoquina intracelular y por citometría de flujo para determinar si las regiones contenían epítopos de CD4 y CD8. Se encontró que los péptidos 223, 224, 225, 238 y 239 inducían una buena secreción de IFNy en células CD8. Para trazar el mapa de los epitopos de CD8, se obtuvieron péptidos de 8 y 9 monómeros solapados por 7 u 8 aminoácidos. Éstos se sometieron a ensayo en el ensayo ELISPOT de IFNy y posteriormente varios que mostraron reactividad fueron sometidos a ensayo por citometría de flujo. La región 223-225 contenía agrupaciones de epitopos de CD8. Se vio por titulación que el péptido dominante era SAPDNRPAL, un péptido que otros ya habían usado para medir respuestas específicas de MUC-1. Sin embargo, se identificaron varios péptidos nuevos en esta región que inducían secreción de IFNy por células CD8 a 10 µ? e inferior. Hemos mostrado que uno de éstos, TSAPDNRPA es capaz de inducir células T citotóxicas (datos no mostrados) in vitro. Se mostró que la región 238-239 contenía un epítopo fuerte de CD8, PTTLASHS, el cual habíamos usado para posteriores ensayos de MUC-1, y también varios epitopos de CD8 más débiles. 4.9 RESPUESTAS CELULARES A FL-MUC1.7x VNTR DE MUC-1 Y 1VNTR DE MUC-1 QUE SIGUEN A LA INMUNIZACIÓN MEDIANTE PMID Las respuestas celulares que siguen a la inmunización con pVAC (vector vacío), JNW358 (FL-MUC1), JNW656 (7x VNTR de MUC-1) y JNW332 (1x VNTR de MUC-1) se sometieron a ensayo por ELISPOT, siguiendo una inmunización primaria mediante PMID en el día 0 y a dos refuerzos en el día 21 y en el día 42. Los ensayos se llevaron a cabo 7 días después del refuerzo. Se usaron tres condiciones de ensayo diferentes: 1) células tumorales que expresan MUC-1, B16-MUC1 y EL4-MUC1, las cuales se usan para demostrar una respuesta amplia de células antitumorales , 2) péptido SAPDNRPAL, un péptido de elevada afinidad fuera de la región de VNTR de MUC-1 (representadas una vez en el total de las construcciones usadas), 3) un péptido de 25 monómeros que codifica una secuencia que incluye una repetición completa de la región de VNTR y 5 aminoácidos adicionales de una repetición adyacente. Este péptido induce predominantemente la producción de IL-2 de esplenocitos inmunizados. Las construcciones FL-MUC1, 7x VNTR de MUC-1 y 1x VNTR de MUC-1 produjeron respuestas celulares específicas de MUC-1 robustas y comparables a todos los estímulos ensayados (Figura 14). En el caso del péptido SAPDNRPAL hemos mostrado que las células CD8 producen IFNy, mientras que la producción de IFNy en respuesta a células tumorales y la producción de IL-2 en respuesta a péptidos de 25 monómeros puede ser tanto de células CD4 como de células CD8. Estos datos confirman que la eliminación de la mayoría de las unidades de VNTR no es perjudicial para la inducción de una respuesta celular específica fuerte de MUC-1 a epítopos tanto dentro como fuera de la región VNTR. 4.10 COMPARACIÓN DE LA PROTECCIÓN ÍPMID FRENTE A I.M.) QUE SIGUE AL ENSAYO TUMORAL Después de tres administraciones del plásmido de expresión de MUC-1 pADNc3-FL-MUC-1 o del vector vacío pADNc3.1, mediante PMID o inyección intramuscular, se sometieron a ensayo los ratones con células tumorales que expresan MUC-1 (B16F0MUC1). El porcentaje de ratones exentos de tumor se muestra en la Figura 15 demostrando claramente que PMID induce protección del ensayo tumoral posterior en un mayor número de ratones comparado con el suministro del mismo plásmido por inyección intramuscular. Estos datos, junto con el anticuerpo y las respuestas celulares detalladas anteriormente, sugieren que PMID induce una respuesta celular y de anticuerpo más robusta que el suministro intramuscular, correlacionándose con un perfil de protección mejorado frente a tumores. 4.11 EFICACIA DE CONSTRUCCIONES DE ADNc DE MUC-1 (F/L MUC-1 Y 7 VNTR) EN LA PROTECCIÓN FRENTE A TUMORES Se inmunizaron tres veces los ratones como se describe en Material y Procedimientos, tanto con el vector vacío (pVAC vacío) como con el vector que codifica el gen completo de MUC-1 (JNW358). Dos semanas después del último refuerzo se sometieron a ensayo tumoral con células B16F0MUC1 y se controló el crecimiento del tumor. Cuando aparecieron tumores, aparecieron aproximadamente de 10 a 15 días después del ensayo tumoral en el grupo vacunado con el vacío y aproximadamente 22 días en el grupo vacunado con FL-MUC1. La Figura 16a compara la supervivencia de ratones inmunizados tanto con el vector vacío como con el vector que codifica el gen MUC-1 completo en ambos grupos. Hay una supervivencia significativamente mejor en ratones inmunizados con FL-MUC1 (60% exento de tumor) que aquella en ratones inmunizados con el vector vacío (20% exento de tumor). La Figura 16b muestra la protección frente a tumores comparando tanto FL-MUC1 como 7 x VNTR con el grupo control con 2 x la cantidad de células tumorales (1,0 x 106) que en experimentos previos. Ambas construcciones de MUC-1 generan un retraso importante y comparable en el crecimiento tumoral relacionado con el grupo control vacunado hasta aproximadamente el día 25. Más adelante este efecto disminuyó, debido probablemente al agotamiento de la respuesta inmune al antígeno tumoral.

En conclusión, la construcción 7 x VNTR de MUC-1 dio la misma respuesta protectora anti-tumoral que FL-MUC1 incluso en condiciones altamente estrictas. 4.12 ESTABILIDAD DE FL FRENTE A 7 VNTR DE MUC-1 EN UN SISTEMA DE VIRUS VACCINIA RECOMBINANTE El gen MUC-1 humano completo se insertó en el engarce pSC del vector como un fragmento BamH1. Esta construcción se usó para crear virus vaccinia recombinantes por recombinación homologa del vector en el gen TK (timidinquinasa) del genoma del virus vaccinia. El virus recombinante se puso en placas sobre una lámina celular de células HTK y se realizaron ensayos de las placas para actividad beta-galactosidasa mediante ensayo bluo-gal. El gen beta-gal se transporta en el vector y de esta forma las placas azules indican virus recombinantes. Se seleccionó un número de placas azules y se clonaron hasta un 100% de placas que produjeron una tinción azul cuando se llevó a cabo un ensayo bluo-gal. Se usaron 6 de estos clones para infectar células HTK a una multiplicidad de infección de 10 y las células se recogieron a las 6 horas, 24 horas y 32 horas después de la infección. Las células se resuspendieron en 200 µ? de medio y se removieron y mezclaron 40 µ? con regulador de carga PAGE-SDS. Se llevaron a cabo electroforesis de estos extractos celulares en un gel PAGE-SDS y se analizaron por transferencia Western usando los anticuerpos monoclonales ATR1 y HMFG1, reconociendo ambos epítopos dentro de la región de VNTR de MUC-1. Ninguna de las muestras infectadas por virus recombinantes dio una tinción con estos anticuerpos.

Un extracto celular control de células transfectadas con pVAC- 7VNTRMUC1 se tifió con una banda intensa indicando presencia de epítopos TR. La tinción con un anticuerpo anti beta-galactosidasa indicó expresión de beta-galactosidasa en todas las muestras infectadas con el virus recombinante pero no con virus wt o con control celular. Se llevó a cabo un análisis molecular mediante PCR de las células infectadas recogidas. Se eligieron los pares de cebadores que indicarían la presencia de varias partes de la construcción FLMUC1-engarce pSC11 dentro del genoma del virus recombinante. Se eligieron los siguientes pares de cebadores: FMC101+2014MUC1-Unión entre vector y extremo 5' de MUC-1 2008MUC1+FMC102-Unión entre vector y extremo 3' de MUC-1 2004MUC1 + 2014MUC1 -Parte 5' de MUC-1 de región de VNTR 2007MUC1 + 2009M UC1 -Parte 3' de M UC-1 de reg ión de VNTR FMC1 01 y FMC 1 02 son cebadores en la secuencia del vector, los cuales aproximan 5' y 3' respectivamente a la secuencia de engarce. FMC1 01 :-CATAAATAATAAATACAATAATTAATTTCTCG FMC1 02:-GCCTCCTTAAAGCATTTCATACACACAGC Las 4 reacciones de PCR mostradas anteriormente se llevaron a cabo usando 1 µ? de células recogidas infectadas con el virus recombinante (32 horas después de la infección) después de calentar a 80°C durante 1 0 mi nutos. También se llevaron a cabo reacciones en muestras de células infectadas con el virus wt y de células no infectadas. Se incluyó también un control positivo de 1 ng de ADN del plásm ido FLMUC I -engarce pSC . El control positivo produj o fragmentos am plificados del tamaño correcto cuando se realizó la electroforesis en gel de agarosa. N inguna de las otras muestras produjo productos específicos, sugiriendo que la construcción no permanecía intacta por más tiempo dentro del genoma vira l. Posteriormente, se produjo de un modo similar un virus recombi nante q ue contenía una versión 7VNTR de M UC-1 h umano y, después de aseg urar una pobl ación clona!, se usó para i nfectar células HTK, que se recogieron como anteriormente. Los extractos celulares de estas células infectadas demostraron claramente expresión de M UC-1 por transferencia Western con ATR1 y tam bién por análisis FACS de células infectadas dos días después de la infección. Las célu las de ratón C57 infectadas con virus recom binante 7VNTR se usaron para estimular células de bazo a partir de ratones vacunados con MUC-1 en un ensayo ELISPOT. Después de incubación durante toda la noche se vio que las células de bazo secretaban IL-2 en respuesta a las células infectadas con vaccinia con 7VNTR pero no a células wt infectadas con vaccinia. Los resultados sugieren que usar una construcción de MUC-1 con 7 repeticiones en tándem mejora la estabilidad de la construcción. El hecho de que el virus vaccinia recombinante con el gen MUC-1 completo fuera incapaz de inducir expresión de MUC-1 en células infectadas sugiere de manera contundente que la construcción es inestable en esta preparación altamente recombinogénica. Ninguno de los seis clones de virus expresó MUC-1 ni parecía contener el gen de MUC-1, aunque todos expresaban Beta-galactosidasa, que se transportaba en el mismo vector. Sin embargo, la versión 7VNTR con menos repeticiones demostró claramente expresión en tres ensayos diferentes indicando mayor estabilidad, sin pérdida de reconocimiento por el anticuerpo o por las células T específicas de antígeno. 5. ESTABILIDAD DE FL-MUC, 7 VNTR Y 1 VNTR CUANDO CRECEN EN E. COLI DH1 El vector pertinente se usó para transformar E. Coli DH1. El vector vacío se transformó también a modo de control. Para determinar si el número de repeticiones en la región de VNTR influye en la estabilidad, se llevó a cabo un ensayo de estabilidad en matraz de agitación usando los plásmidos con FL-MUC1, 7x VNTR de MUC-1 y 1x VNTR de UC-1. El estudio de estabilidad abarcó el crecimiento, producción de plásmido y retención de plásmido de cada una de las construcciones en el cultivo del matraz de agitación durante el curso de 9 pases, cada uno con una duración de entre 10 y 14 horas. Se emplea el uso de un estudio de estabilidad para determinar si la producción de plásmido y la calidad cambian como resultado de los repetidos subcultivos de las células en los matraces de agitación. Como las condiciones en los matraces de agitación no están controladas (por ejemplo, pH, aireación), el mantenimiento de la calidad del plásmido y la producción durante el estudio es una buena indicación de que estas características permanecerán estables. 5. RESULTADOS 5.2.1 CRECIMIENTO DE CULTIVOS Aunque hubo alguna variación entre la DO final a 600nm alcanzada por las células en cada pase debido a ligeras variaciones en el volumen del inoculo, de forma global no hubo diferencias significativas en las velocidades de crecimiento durante el ensayo o entre las diferentes construcciones de MUC-1. 5.2.2 PRODUCCIÓN DE PLÁSMIDOS Los valores del número de copias de plásmido se obtuvieron a partir del 1er, 5o y 9o (final) pase. Para la construcción que contiene todo el gen, el número de copias de plásmido disminuyó en un 54% durante este período, mientras que para las otras tres construcciones aumentó en aproximadamente un 40%. El rendimiento volumétrico (mg de plásmido/l de cultivo) permaneció estable durante todo el estudio para 7 VNTR, mientras que disminuyó en un 64% en la construcción que contiene todo el gen. Se observó un ligero descenso en el rendimiento volumétrico en el vector vacío (21%) y en la construcción de una sola unidad de VNTR (24%) aunque este no fue de ningún modo tan acusado como aquel visto en la construcción que contiene todo el gen. 5.2.3 RETENCIÓN DE PLÁSMIDO La retención de plásmido se midió usando un ensayo de réplica de placas permaneciendo entre un 80% y un 100% para todas las construcciones durante todo el estudio de estabilidad. Además, no hubo diferencias significativas entre las construcciones. 5.2.4 ESTABILIDAD DE LOS PLÁSMIDOS Para investigar la estabilidad de los plásmidos durante la duración de este estudio, los extractos de plásmidos iniciales (recolección en el día 0) y los del punto final (recolección en el día 5) se hicieron con la ayuda de una Mini-prep Qiagen de columnas giratorias para extracción de plásmidos. Estos extractos . se analizaron luego por separación electroforética en gel de agarosa previo a la posterior tinción con Sybr-Gold. Este procedimiento de tinción basado en Sybr-Gold se considera pa rticularmente adecuado para analizar la estabilidad de plásmidos ya que el trabajo previo demostró que era capaz de detectar una pequeña cantidad de 1 ng de recombinante dentro de una muestra de 1 000 ng. Los resultados de la investigación se muestran posteri ormente (ver Figura 6), y de estos resultados, se sacaron tres conclusiones: 1 . Las construcciones 7x VNTR y 1 x VNTR contienen el número esperado de repeticiones de VNTR durante todo el experimento sin evidencia de inestabi lidad detectada en la estructura pri ncipal del plásmido o en la estructura de repetición de VNTR a ningún punto temporal. 2. El vector vacío p731 3 usado en el ensayo de estabilidad no tiene el perfil esperado y difiere del Plásmido Estándar p731 3. 3. Las muestras q ue contienen el gen Muc-1 tomadas en el punto de tiempo final (d ía 5; 9o pase) contienen pequeñas cantidades de plásmidos de origen desconocido. Como consecuencia de la discrepancia en el perfil de p7313 así como en la identificación de pequeñas cantidades de especies de plásmidos en la construcción de FL-MUC1 en el día 5, se realizó trabajo de investigación adicional. Para investigar la d iferencia observada entre el vector vacío p731 3 usado en el estudio de estabilidad y el del Plásmido Estándar, se realizó anál isis por enzimas de restricción. Los resultados del análisis revelan que una reg ión .de la construcción p7313 de -800 pb que contienen los sitios de restricción BamH 1 ( 1 926 pb) y Sap1 (2422 pb) se había eliminado. Se designaron después los cebadores flanqueando esta región y posteriormente se secuenció el plásmido. Los datos de la secuencia resultante confirmaron que se había eliminado la región entre 1866 y 2589. Esta región del plásmido contiene la secuencia Cer. Ya que esta secuencia Cer suele ayudar en la resolución de concatémeros, su ausencia puede explicar las especies plasm ídicas mu lti-banda de p731 3 observadas en el estudio de estabilidad.

TRABAJO DE INVESTIGACIÓN ADICIONAL: ANÁLISIS DE PEQUEÑAS CANTIDADES DE PLÁS IDOS EN MU ESTRAS DE FL-MUC1 Las pequeñas cantidades de plásmidos observadas solamente en las muestras del punto final de FL-MUC 1 se analizaron aún más. Este análisis reveló que estas pequeñas cantidades no se podían detectar antes del día 4. Concurrente con este hallazgo, estas pequeñas cantidades de plásmido también se purificaron por gel, se re-transformaron, se re-purificaron y se secuenciaron. Mediante tal análisis, estos plásmidos se identificaron posteriormente como contaminantes más que como recombinantes; se usaron éstas con el nombre de 7x VNTR en el ensayo de estabilidad (p7656), se eliminó p7313 en ja región Cer (mencionado anteriormente) y también un presumible concatjémero de esta eliminación de Cer de p731 3. A partir de estos resultados, se condluyó que las muestras de FL-MUC1 estaban contaminadas tanto con el vector vacío p7313 como con las construcciones 7x VNTR (p7656) y que no hay recombinantes presentes en las muestras del punto final de las FL-Muc1 . Estos contaminantes se cree que han entrado en la región FL-Muc1 de la cepa E. Coli DH 1 durante la transformación original de los plásmidos. Ya que las pequeñas cantidades de plásmidos no aparecen en geles de agarosa antes del día 4, una posibilidad es que se seleccionen durante el curso del estudio como consecuencia de su tamaño más pequeño en relación al plásmido FL-Muc1 .

CONCLUSIÓN Los datos del estudio de estabilidad mostraron que el plásmido con 7x VNTR de MUC1 es estable en términos de características de crecimiento, retención de plásmido y calidad de plásmido!. En términos de características de crecimiento, retención de plásmido y calidad de plásmido no hubo una diferencia discernible entre el veclor 1 x VNTR, 7x VNTR y el FL-MUC1. Sin embargo, los datos del número de copias pusieron de relieve que no había diferencias significatiias entre estas construcciones. Tanto el número de copias de plásmidos como el rendimiento volumétrico disminuyeron significativamente para la construcción que contenía el gen durante el curso del estudio de estabilidad comparado con la de 7x VNTR. Aunque se vio q'ue la retención de plásmido permanecía al 100% durante todo el experimento para la construcción que contenía el gen, esto sólo indica que todas\ las células en la población todavía contienen plásmido suficiente para conferir resistencia a Kanamicina en ellas. Si el experimento fuera a llevarse a cabo durante más tiempo es posible que el número de copias pudiera disminuir a tal nivel que la resistencia a kanamicina no sería suficiente para permitir crecimiento en placas selectivas, dando lugar a un descenso en la retención plasmídica observada. Estos datos sugieren que la construcción con 7x VNTR puede poseer ventajas significativas en términos de un perfil de desarrollo favorable. El contenido en plásmido puede tener un efecto en la purificación de la pasta celular. Con las diferencias entre la construcción 7 VNTR y la construcción FL-MUC1 , es probable que 7 VNTR sea más fácil de purificar y de obtener con rendimientos más altos. Habiendo descrito la invención como antecede, se declara como propiedad lo contenido en las siguientes ,

Claims

- 59- REIVINDIC ACIONES

1. Una molécula de ácido nucleico que codifica un antígeno de UC-1, siendo dicha molécula capaz de elevar una respuesta inmune in vivo y de tener susceptibilidad reducida a la recombinación en comparación con el gen MUC-1 completo.

2. Una molécula de ácido nucleico que codifica un antígeno de MUC-1 que comprende entre 1 y 15 unidades de repetición VNTR perfectas.

3. Una molécula de ácido nucleico como se reivindica en la reivindicación 2 que comprende menos de 8 unidades de repetición VNTR perfectas.

4. Una molécula de ácido nucleico como se reivindica en esta memoria descriptiva caracterizada porque al menos se muta un VNTR para' reducir el potencial para la glucosilación.

5. Una molécula de ácido nucleico como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que incorpora unas secuencias que codifican un epítopo seleccionado a partir del grupo: FLSFHISNL, NSSLEDPSTDYYQELQRDISE y NLTISDVSV.

6. Una molécula de ácido nucleico como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 caracterizada porque la molécula es una molécula de ADN.

7. Un plásmido que comprende la molécula de ADN de la reivindicación 6. - 60 -

8. Una prote ína codificada por un ácido n ucleico como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

9. Una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico como se reivindica en las reivindicaciones 1 a 6, o un plásmido como se reivindica en la reivindicación 7, o una prote ína como se reivindica en l a reivindicación 8 y un excipiente, diluyente o veh ículo farmacéuticamente aceptable.

10. U na composición farm acéutica como se reivindica en la reivind icación 9, caracterizada porque el vehículo es una micropartícula. 1 1 . Una composición farm acéutica como se reivindica en la reivindicación 1 0 , ca racterizada porque la m icropartícula es oro. 12. Un a composición farmacéutica como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 9 a 1 1 que comprende un adyuvante. 1 3. U n ácido nucleico como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un plásmido como se reivindica en la reivindicación 7„, una proteína como se reivindica en la reivindicación 8, o una composición farmacéutica como se reivindica en las reivindicaciones 9 a 12 para su uso en medicina. 14. Uso de un ácido nucleico como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la preparación de un medica mento para el tratamiento o prevención de tumores que expresan UC-1 . 1 5. Uso de una proteína como se reivind ica en la reivindicación 8 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de tumores que expresan MUC-1 . 16. Un procedimiento para tratar o prevenir tumores o - 61 - metástasis, que comprende ia administración de una cantidad segura y efectiva de un ácido nucleico como se reivindica en las reivindicaciones 1 a 6, un plásmido de la reivindicación 7 o una proteína de la reivindicación 8. -62- RESU EN La presente invención se refiere a las nuevas construcciones de ácido nucleico, útiles en los protocolos de vacunación de ácido nucleico para el tratamiento y profilaxis de los tumores que expresan MUC-1. En particular, el ácido nucleico es ADN y las construcciones de ADN comprenden un gene que codifica un derivado de MUC-1 que tiene menos de 10 unidades de repetición perfectas. La invención provee además composiciones farmacéuticas que comprenden dichas construcciones, particularmente composiciones farmacéuticas adaptadas para administración mediada por partículas, métodos para producirlas, y su uso en medicina. Se proporcionan también nuevas proteínas codificadas por el ácido nucleico y composiciones que las contienen.