MXPA04010366A - Sistema promotor y plasmido para ingenieria genetica. - Google Patents

Abstract

Esta invencion proporciona una seria de plasmidos de bajo numero de copias que comprenden los sitios de reconocimiento de endonucleasa de restriccion utiles para clonar al menos tres diferentes genes u operones, cada uno flanqueado por una secuencia terminadora, los plasmidos contienen variantes de promotores de glucosa isomerasa para variar los niveles de expresion de la proteina. Los materiales y metodos son utiles para la ingenieria genetica en microorganismos, especialmente donde se busca las inserciones geneticas multiples.

Description

SISTEMA PROMOTOR Y PLASMIDO PARA INGENIERIA GENETICA Campo de la Invención Esta invención está en el campo de la biología molecular. Más específicamente, se refiere a una serie de plásmidos de bajo número de copias que comprende los sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción, útiles para clonar al menos 3 diferentes genes u operones, cada sitio flanqueado por una secuencia terminadora y un conjunto de promotores para variar los niveles de expresión de proteína. La invención es útil para la ingeniería genética en microorganismos, especialmente donde se busca las inserciones genéticas múltiples.

Antecedentes de la Invención La biotecnología molecular es una disciplina que se basa en la capacidad de los investigadores para transferir unidades específicas de información genética de un organismo a otro. Este proceso, conocido como clonación, asiste en las técnicas de tecnología de ADN recombinante para producir un producto útil o un proceso comercial (Glick, B. R. ; Pasternak, J. J. , Molecular Biotechnology Principies and Applications of Recombinant DNA, 2nd ed. American Society for Microbiology, Washington, DC. (1998)). Los procesos comerciales frecuentemente requieren que REF: 157996 las proteínas codificadas por el gen clonado se produzcan en alta relaciones de expresión. No hay una estrategia sencilla para realizar la expresión máxima de cada gen clonado. La mayoría de los genes clonados tienen propiedades moleculares distintivas que requieren la inversión de tiempo considerable y esfuerzo antes de que se encuentre un conjunto específico de condiciones que resultan en un nivel aceptable de expresión. Meramente al insertar un gen en un vector clonado no se asegura que se expresará exitosamente al nivel necesitado. En respuesta a la necesidad de una relación de expresión alta, muchos vectores de expresión especializados se han creado al manipular un número de diferentes elementos genéticos que controlan efectos de transcripción, traducción, estabilidad de proteína, limitación de oxigeno, y secreción de la célula hospedadora. Más específicamente, las características moleculares que se manipulan para controlar la expresión del gen incluyen: (1) la naturaleza del promotor transcripcional relevante y las secuencias terminadoras , (2) la fortaleza del sitio de enlace de ribosoma, (3) el número de copias del gen clonado y si el gen es un portador de plásmido o está integrado en el genoma de la célula hospedadora, (4) la ubicación celular final de la proteína externa sintetizada, (5) la eficiencia de la traducción en el organismo hospedador, y (6) la estabilidad intrínseca de la proteína de gen clonado con la célula hospedadora. Adicionalmente , la introducción y expresión de ADN externo en un organismo hospedador frecuentemente cambia el metabolismo del organismo de manera que pueda afectar una funcionalidad celular normal. Este fenómeno se debe a la carga o fenómeno metabólico impuesto, sobre el hospedador por el ADN externo. La carga metabólica puede resultar en una variedad de condiciones que incluyen: 1) número de copias de plásmido incrementadas, 2) sobreproducción de proteínas, 3) saturación de sitios de exportación, y/o 4) interferencia de función celular por la proteína externa por sí misma. Las técnicas para atender algunos de los obstáculos presentados arriba se conocen. Varios grupos han usado múltiples promotores en tándem para expresar genes en diferentes fases del crecimiento celular (CN 1186856) , a partir de diferentes polimerasas de ARN o en diferentes especies de fago (US 5547862; J. Biotechnol . 2(5):303-316 (1985); Biotechniques, 18(1): 152-154, 156-157(1995)). Otro grupo ha usado sitios de clonación múltiples repetidos en tándem para facilitar el movimiento del ADN dentro y fuera del vector plásmido. Un grupo ha reportado el uso de un vector de alto número de copias con 3 sitios de clonación múltiples, cada uno detrás de un diferente promotor para expresión de células diferentes en células de mamíferos (Biotech. Bioeng., 57(1): 1-10 (1998)). A pesar de esta técnicas, el problema a solucionarse se mantiene en como clonar fácil y rápidamente genes múltiples u operones mientras se minimiza el impacto de la carga metabólica, se controla el rendimiento de la proteína recombinante para reunir la necesidades de producción, y se aumenta la estabilidad de la célula hospedadora transformada.

Breve Descripción de la Invención Los solicitantes han creado secuencias de promotor de isomerasa de glucosa novedosas, que permiten variar los niveles de expresión del gen en organismos de producción. Los solicitantes incorporan casetes de expresión que contienen los promotores GI de variantes en un plásmido de bajo número de copias derivado de pCL 1920 para construir una serie de plásmidos para ingeniería genética. Los terminadores de la transcripción aislan el promotor asociado de la transcripción de otros promotores localizados fuera de este constructo. Los solicitantes también han construido una secuencia de nucleótido única que contiene los sitios de clonación para múltiples enzimas de restricción escasas, además de facilitar la clonación en este constructo o transferir de este constructo a columnas de plásmido o vector alternas. Los sitios de clonación únicos permiten la introducción de genes u operones a expresarse ba o el control de promotores apropiados de resistencias variadas. La invención abarca: 1. Una molécula de ácido nucleico aislada o recombinante que codifica una variante de isomerasa de glucosa de Streptomyces lividíns, la molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 9-28; 2. Una molécula de ácido nucleico aislada o recombinante que codifica una variante de isomerasa de glucosa de Streptomyces lividins, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótido de cualesquiera de SEQ ID NO: 9-28; 3. Una colección de moléculas de ácido nucleico aisladas o recombinantes que codifican una variante de isomerasa de glucosa de Streptomyces lividins, la colección comprende las secuencias de nucleótido de SEQ ID NO: 9-28; 4. Un cásete de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de las diversas variantes GI establecidas arriba; y, 5. Un kit que comprende las moléculas de ácido nucleico que codifican las diferentes variantes de isomerasa de glucosa de Streptomyces lividins establecidas arriba. Una modalidad adicional de la invención es un constructo de ADN que comprende al menos tres terminadores transcripcionales y al menos un sitio de clonación situado en cualesquiera de los 2 terminadores transcripcionales. Una modalidad preferida de este constructo de ADN comprende los terminadores transcripcionales tonB, thrA, o aspA, y los sitios de clonación se seleccionan del grupo que consiste de Avrll, Nhel, Bfal, Cac8I, BsaJI, y Styl . Los sitios de clonación preferidos son Nhel o Avrll. Una colección de estos constructos también se abarca en la invención. La invención incluye los siguientes constructos de ADN: El plásmido pSYCO109mcs que consiste de SEQ ID NO: 30, El promotor 1.5 GI corto que consiste de SEQ ID NO: 31, El promotor 1.20 GI corto que consiste de SEQ ID NO: 32, El plásmido pAH105 que consiste de SEQ ID NO: 70, El plásmido pSYCOlOl que consiste de SEQ ID NO: 71, El plásmido pSYCO103 que consiste de SEQ ID NO: 72, El plásmido pSYCO106 que consiste de SEQ ID NO: 73, El plásmido pSYCO109 que consiste de SEQ ID NO: 74, El plásmido pSYCO106mcs que consiste de SEQ ID NO: 78, y El plásmido pRJ50 que consiste de SEQ ID NO: 79. Una modalidad adicional de la invención es un vector que tiene un sitio de clonación múltiple que contiene secuencias de sitio de reconocimiento de restricción específicas para la endonucleasa de restricción AscI, Nhel, Pací, RsrII, Nsil, SacII, MluI, Agel, SapI, y SnaBI . Una modalidad particular de este vector es la secuencia de nucleótido de SEQ ID NO: 77. Los materiales genéticos de esta invención incluyen células hospedadoras transformadas que contienen las moléculas de ácido nucleico descritas arriba y los polipéptidos codificados por los polinucleotidos.

Breve descripción del listado de secuencias y el depósito biológico Los solicitantes han proporcionado 83 secuencias de conformidad con la reglas para la presentación estándar de secuencias de nucleótido y aminoácido en las solicitudes de patente (Anexos I y II a la decisión del presidente de la EPO, publicada en el suplemento No. 2 para OJ EPO, 12/1992) , con 37 C.F.R. 1.821-1.825 y los apéndices A y B (requerimientos para la divulgación de descripciones que contienen secuencias de nucleótidos y/o aminoácidos) con la Organización Mundial de la Propiedad Intelectual (OMPI) estándar ST.25 (1998) y los requerimientos del listado de secuencia de la EPO y PCT (reglas 5.2 y 49.5 (a-bis) y sección 208 y anexo C de las instrucciones administrativas) . Las descripciones de secuencia que contienen la letra código para los caracteres de secuencia de nucleótido y las tres letras código para aminoácido de definen de conformidad con los estándares IUPAC-IYUB descritos en Nucleic Acids Research 13: 3021-3030 (1985) y en Biochemical Journal 219 (No. 2) : 345-373 (1984) , que se incorporan en la presente para referencia.

La SEQ ID N0:1 es la secuencia de nucleótido para un promotor (GI) de isomerasa de glucosa de Streptomyces lividans de tipo silvestre. Las SEQ ID NOs : 2-8 son cebadores de origen nucleótido usado para la mutagénesis de saturación del promotor GI . En las SEQ ID NOs: 3 -8, "N" representa ya sea A, T, C, o G. Las SEQ ID NOs : 9-28 son secuencias de nucleótido para las variantes de promotor GI . La SEQ ID NO: 29 es la secuencia de nucleótido para el gen yghD de E. coli. La SEQ ID NO: 30 es la secuencia de nucleótido para el plásmido pSYCO109mcs. La SEQ ID NO: 31 es la secuencia de nucleótido para el promotor 1.5 GI corto. La SEQ ID NO: 32 es la secuencia de nucleótido para el promotor 1.20 GI corto. La SEQ ID NO: 33 es la secuencia de nucleótido para el promotor GI corto de tipo silvestre. Las SEQ ID NO: 34 -37 son los cebadores de oligonucleótido usados para la amplificación de yqhD con la incorporación de promotores GI cortos. Las SEQ ID NOs: 38-39 son cebadores de oligonucleótidos usados para construir la disrupcion yqhD. Las SEQ ID NOs : 40-43 son cebadores de oligonucleótidos usados para confirmar la disrupcion de yqhD.

Las SEQ ID NOs : 44-46 son cebadores de oligonucleótido usados para reemplazar el promotor ppc cromosomal con el promotor GI de tipo silvestre corto. La SEQ ID NO: 47 es la secuencia de nucleótido para un sitio y terminador de clonación múltiple. La SEQ ID NO: 48 es la secuencia de nucleótido para el plásmido pHK28-26. Las SEQ ID NOs: 49-50 son cebadores de oligonucleótido usados para amplificar dhaB3. Las SEQ ID NOs : 51-52 son cebadores oligonucleótidos usados para amplificar dhaBl . Las SEQ ID NOs: 53-54 son cebadores de oligonucleótido usados para crear la eliminación dhaT. Las SEQ ID NOs: 55-56 son oligonucleótidos usados para crear un enlazador. La SEQ ID NO: 57 es una secuencia de nucleótido que codifica tres terminadores transcripcionales separados por sitios de restricción. Las SEQ ID NOs : 58-59 son oligonucleótidos usados para crear SEQ ID NO: 60. La SEQ ID NO: 60 es la secuencia de nucleótido que codifica 3 terminadores transcripcionales flanquedos por sitios EcoRI y Kpnl . Las SEQ ID NOs : 61-62 son cebadores de oligonucleótidos usados para amplificar SEQ ID NO: 60.

Las SEQ ID NO: 63-65 son cebadores de oligonucleótido usados para amplificar un cásete de expresión. La SEQ' ID NO: 67 es la secuencia de nucleótido de un enlazador de doble hebra usado para generar pCR-pCL 1920. Las SEQ ID NOs : 68-69 son cebadores de oligonucleótido usados para amplificar el terminador rrnBTlT2 de pTrc99A. La SEQ ID NO: 70 es la secuencia de nucleótido para el plásmido pAH105. La SEQ ID NO: 71 es la secuencia de nucleótido para el plásmido pSYCOlOl. La SEQ ID NO: 72 es la secuencia de nucleótido para el plásmido pSYCO103. La SEQ ID NO: 73 es la secuencia de nucleótido para el plásmido pSYCO106. La SEQ ID NO: 74 es la secuencia de nucleótido para el plásmido pSYCO109. Las SEQ ID NOs: 75-76 son cebadores de oligonucleótidos usados para formar SEQ ID NO: 77. La SEQ ID NO: 77 es la secuencia de nucleótidos de un fragmento de clonación múltiple que contiene sitios de reconocimiento de restricción par las siguientes enzimas : Nhel, RsrII, SacI, Agel, SnaBI, AscI, Pací, Nsil, MluI , y SapI . La SEQ ID NO: 78 es la secuencia de nucleótido para el plásmido pSYCO106mcs.

La SEQ ID NO: 79 es la secuencia de nucleótido para el plásmido pRJ50. Las SEQ ID NOs: 80-81 son cebadores de oligonucleótidos usados para amplificar el operon orf. Las SEQ ID NOs: 82-83 son cebadores de oligonucleótido para revisar transformantes en el ejemplo 4. Los solicitantes han hecho los siguientes depósitos biológicos bajo los términos del tratado de Budapest en el Reconocimiento Internacional para el Depósito de Microorganismos para el Propósito de Procedimiento de Patente: Como se usa en la presente, "ATCC" se refiere al American Type Culture Collectionlinternational Depository ubicado en 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-1109, U.S. A. El "ATCC No." es el número de acceso a los cultivos en depósito con el ATCC. Los depósitos listados se mantendrán en el depositario internacional indicado durante al menos treinta (30) años y estarán disponibles al público al otorgar la patente que lo describe. La disponibilidad del depósito no constituye una licencia para practicar la invención actual en derogación de los derechos de patente otorgados por la acción gubernamental .

Descripción Detallada de la Invención Los solicitantes han solucionado el problema establecido al crear una serie de constructos que contienen al menos 3 sitios de clonación únicos, cada sitio de clonación separado operablemente uno del otro por terminadores transcripcionales y promotores de diferentes resistencias. Los promotores de diferentes resistencias son variantes del promotor (GI) de isomerasa de glucosa de Streptomyces lividans (SEQ ID NO:l). Al combinar los promotores GI variantes en casetes de expresión con un plásmido SYCO como la plataforma de producción se proporciona un sistema útil para el desarrollo de biocatalizador en una amplia variedad de proyectos de bioproceso . La invención permite la incorporación fácil y estable de genes u operones endógenos o exógenos en un vector para controlar los niveles de expresión del gen. El uso del plásmido sencillo para expresar genes u operones múltiples reduce el número de marcadores antibióticos necesarios para mantener los plásmidos múltiples en el hospedador de E. coli que los métodos previos requerían para producir un producto de gen. El uso de la invención puede minimizar el impacto de la carga metabólica, optimizar el rendimiento de la proteína recombinante, y aumentar la estabilidad de la célula hospedadora transformada. La invención es especialmente útil para la ingeniería genética en bioprocesos donde se puede requerir expresar dos o más genes u operones para la formación del producto. Los solicitantes han creado secuencias de promotor GI novedosas que permiten niveles variados de expresión de genes. Los solicitantes incorporan los casetes de expresión que contienen los promotores GI variantes en un plásmido de bajo numero de copias derivado de pCL 1920 para construir una serie de plásmidos para ingeniería genética. Los terminadores de transcripción aislan el promotor asociado de la transcripción de los otros promotores fuera de este constructo. Los solicitantes también han construido una secuencia de nucleótido única que contiene los sitios de clonación para al menos 10 enzimas de restricción escasas, además de facilitar la clonación en este constructo o la transferencia de este constructo a columnas de plásmido o vector alterno. Los sitios de clonación únicos permiten la introducción de genes u operones a expresarse bajo el control de promotores apropiados de resistencias variadas. Además, un constructo dado puede flanquearse por los sitios de clonación únicos para facilitar la integración en cualquier número de estructuras de columnas de plásmido que incluyen pUC, pBR322, pACYC, pSClOl, u otros conocidos y contemplados por aquellos expertos en la técnica. Los solicitantes han demostrado una utilidad específica de la invención en la biosíntesis de 1 , 3-propanodiol (3G) a partir de glucosa en E. coli transformada con los materiales reivindicados. Los casetes de expresión se construyen en un plásmido de bajo número de copias como se describe en la presente y los genes para la producción de 1 , 3-propanodiol se clonan en este vector. La invención puede usarse para variar la expresión del gen en otros sistemas de expresión.

De iniciones Las siguientes definiciones y abreviaturas son para usarse para interpretar las reivindicaciones y especificación. "Estructura de lectura abierta" se abrevia ORF. "Reacción de cadena de polimerasa" se abrevia PCR. Los términos "células hospedadora" o "organismo hospedador" se refieren a un microorganismo capaz de recibir genes externos o heterólogos o copias múltiples de genes endógenos y de expresar aquellos genes para producir un producto de gen activo. Los términos "constructo de ADN" o "constructo" se refieren a un fragmento construido artificialmente de ADN.

"Gen" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa una proteína específica, incluyendo secuencias reguladoras precedentes (secuencias que no codifican 5') y de continuación (secuencia que no codifican 3') de la secuencia codificada. "Gen nativo" se refiere a un gen como se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras. "Gen quimérico" se refiere a cualquier gen que no es un gen nativo, que comprende secuencias reguladoras ? de codificación que no se encuentran juntas en la naturaleza. En consecuencia, un gen quimérico puede comprender secuencias reguladoras y secuencias de codificación que se derivan de diferentes, o secuencias reguladoras, y secuencias de codificación derivadas de la misma fuente, pero colocadas de manera diferente a la que se encuentran en la naturaleza. "Gen endógeno" se refiere a un gen nativo en su ubicación natural en el genoma de un organismo . Un gen "externo" , "exógeno" o "heterólogo" se refiere a un gen que no se encuentra normalmente en el organismo hospedador pero que se introduce en el organismo hospedador por transferencia de gen. Los genes externos pueden comprender genes nativos insertados en un organismos no nativo, o genes quiméricos. Un "transgen" es un gen que se ha introducido en el genoma por un procedimiento de transformación. Un "constructo de gen" se refiere a un fragmento de un ácido nucleico que codifica la expresión de una o más proteínas específicas. En el constructo del gen, el gen pueden ser nativo, quimérico o externo en naturaleza. El término "ácido nucleico aislado" se refiere a un ácido nucleico (por ejemplo, un ARN, ADN o un polímero mezclado) que se separa substancialmente de otros componentes que acompañan naturalmente una secuencia nativa (por ejemplo, ribosomas, polimerasas y/o secuencias genómicas de flanqueo de las especies originales) . El término incluye ARN recombinante o clonado aislado y análogos químicamente sintetizados, o análogos biológicamente sintetizados por sistemas heterólogos. Los términos "codificados" y "codificar" se refiere al proceso por el cual un gen, a través de los mecanismos de transcripción y traducción produce una secuencia de aminoácidos. El proceso de codificar una secuencia de aminoácidos específica incluye secuencias de ADN que pueden involucrar cambios de bases que no causan un cambio en el aminoácido codificado, o el cual involucra cambios de bases que pueden alterar uno o más aminoácidos pero no aceptar las propiedades funcionales de las proteína codificada por la secuencia de ADN. Por lo tanto se entenderá que la invención abarca más que las secuencias ejemplares específicas. También se contemplan las modificaciones a la secuencia tales como eliminaciones, inserciones o substituciones en la secuencia que producen cambios silentes que no afectan substancialmente las propiedades funcionales de la molécula de proteína resultante. Por ejemplo, las alteraciones en la secuencia de gen que reflejan la degeneración del código genético, o que resultan en la producción de una aminoácido químicamente equivalente en un sitio dado se contemplan. De esta manera, un codón para la alanina de aminoácido, un aminoácido hidrofóbico, puede substituirse por un codón que codifica a otro residuo hidrofóbico (tal como glicina) , o un residuo más hidrobófico (tal como valina, leucina, o isoleucina) . Similarmente, los cambios que resultan en la substitución de una residuo negativamente cargado para otro (tal como ácido aspártico para ácido glutámico) , o un residuo positivamente cargado para otro (tal como lisina para arginina) también puede esperarse que produzca un producto biológicamente equivalente. Los cambios de nucleótido que resultan en la alteración de las porciones en terminal N y terminal C de la molécula de proteína, tampoco se esperaría que alteren la actividad de la proteína. En algunos casos puede de hecho ser deseable hacer mutantes de la secuencia, con objeto de estudiar el efecto de la alteración en la actividad biológica de la proteína. Cada una de la modificaciones propuestas está bien dentro de la habilidad de la rutina del arte, como se determina de la retención de actividad biológica en los productos codificados. Por otro lado, el técnico experimentado reconocerá que las secuencias abarcadas por esta invención también se definen por su capacidad para hibridizar, bajo condiciones severas (0.1X SCC, 0.1% SDS, 65 °C) , con las secuencias ejemplificadas en la presente.

El término "expresión" se refiere a la transcripción y traducción para un producto de gen para un gen codificado por la secuencia del producto de gen. El término "promotor" se refiere a una región de ADN a la cual la polímerasa de ARN se enlaza e inicia la transcripción del gen. Los términos "terminador transcripcional" o "terminador" se refieren al elemento genético que termina la síntesis de proteína . El término "operón" se refiere a un racimo de genes que se regulan coordinadamente. Los términos "polipéptidos" y "proteínas" se usan intercambiablemente para referirse al producto de gen. Los términos "plasmido" , "vector" , y "cásete" se refiere a un elemento cormosomal extra que frecuentemente porta genes que no son parte del metabolismo central de la célula, y usualmente en forma de moléculas de ADN de hebra doble circulares. Tales elementos pueden ser secuencias autónomamente replicadas, secuencias que integran el genoma, secuencias de fago o nucleótido (lineal o circular) de un ADN o ARN de hebra sencilla, derivados de cualquier fuente. Tales elementos contienen un número de secuencias de nucleótidos que se han unido o están recombinantes en la construcción única capaz de introducir un fragmento de promotor y una secuencia de ADN para un producto de gen seleccionado, junto con la secuencia no traducida 3 ' apropiada en las células . El "cásete de transformación" se refiere a un vector especifico que contiene un gen externo y tiene elementos además del gen externo que facilitan la transformación de una célula hospedadora particular. "Cásete de expresión" se refiere un vector específico que contiene un gen externo y que tiene elementos además del gen externo que permiten la expresión aumentada de tal gen en este hospedador. El término "endonucleasas de restricción" se refiere a una clase de enzimas que cortan a una longitud dada del ADN en una ubicación interna específica y única. Al crear el corte en el ADN, la endonucleasa de restricción permite el empalme o inserción posterior de segmentos de ADN en la ubicación interna. Los términos "sitio de restricción" o "sitio de reconocimiento de restricción" se refieren a una secuencia de nucleótidos (de pares bases) en la molécula de ADN que se "reconoce" y corta por una enzima de restricción dada. El término "escaso" , como se aplica a los sitios de enzima de restricción, se refiere a la baja frecuencia de presentación de una secuencia dada en un gen. Un grupo preferido de sitios de enzimas de restricción escaso para propósitos de esta especificación son AscI, Nhel, Pací, Rsrll, Nsil, Sacll, MluI, Agel, SapI, y SnaBI .

El término "sitio de clonación" se refiere a una ubicación de vector en la cual el ADN puede insertarse. El término "sitio de clonación múltiple" o "mes" se refiere a una secuencia de ADN sintética que contiene cualesquiera o un número de diferentes sitios de enzima de restricción para permitir insertarse en diferentes ubicaciones (el sitio de restricción) en el vector. El término "sitio de clonación único" se refiere a un sitio de clonación que aparece unas veces con una secuencia de ADN dada. Para describir las ubicaciones relativas de los elementos de un vector, un sitio o ubicación dado de interés está "entre" dos de los otros si está situado en la longitud intermedia del ADN que separa los otros dos . En el caso de un vector circular, el sitio de ubicación dado de interés está "entre" dos de los otros si se sitúa dentro de la longitud más corta del ADN que separa los otros dos sitios en el vector. El sitio o ubicación dado se dice que está "flanqueado" por otro situado ya sea precedente o después del sitio o ubicación de interés. El término "genéticamente alterado" se refiere al proceso de cambiar el material hereditario por transformación o mutación. Los términos "transformación" y "transfección se refieren a la adquisición de genes nuevos en una célula, después de la incorporación de ácido nucleico. Los genes adquiridos pueden integrarse en ADN cromosomal o introducirse como secuencias de replicación extra cromosomales . El término "transformante" se refiere al producto de un transformación.

Los términos "glicerol deshidratasa" o "enzima deshidratasa" se refiere a los polipéptidos responsables de activar la enzima dependiente de coenzima Bi2 que es capaz de isomerizar o convertir una molécula de glicerol al producto 3-hidroxipropionaldehído . Para los propósitos de la presente invención las enzimas deshidratasa incluyen deshidratasa de glicerol (GenBank U09771, U30903) y una deshidratasa de diol (GenBank D45071) que tienen substratos preferidos de glicerol y 1, 2-propandiol, respectivamente. La deshidratasa de glicerol de K.pneumoniae ATCC 25955 se codifica por los genes de dhaBl, dhaB2, dhaB3 (GenBank U30903) . Los genes dhaBl, dhaB2, dhaB3, codifican las subunidades a, ß y ? de la enzima deshidratasa de glicerol, respectivamente. La deshidratasa de glicerol y deshidratasa de diol son complejos (con un composición de subunidad a2ß2?2) que utilizan la coenzima B12 · Las hidratasas de glicerol y diol se someten a una inactivación de suicido basado en el mecanismo por glicerol y algunos otros substratos (Daniel et al., FEMS Microbiol . Rev 22:553(1999)). El término "factor de reactivación de deshidratasa" se refiere a aquellas proteínas responsables de la reactivación de actividad de deshidratasa. Los términos "activar la reactivación de deshidratasa", "reactivar la actividad de deshidratasa", o "regenerar la actividad de deshidratasa" se refiere al fenómeno de convertir una deshidratasa no capaz de catalizar a un substrato a una capaz de catálisis de un substrato, o al fenómeno de inhibir la inactivación de una deshidratasa, o el fenómeno de prolongar la vida media de la enzima de deshidratasa in vivo. Se han identificado dos proteínas como que están involucradas como el factor de reactivación de deshidratasa (ver WO 9821341 (US 6013494 incorporado en la presente para referencia) y referencias en la presente; Daniel et al., supra; Toraya and Mori, J. Biol. Chem. 274:3372 (1999); y Tobimatsu et al., J. Bacteriol. 181-4110 (1999)). Los términos "óxidoreductasa" o "óxidoreductasa 1,3-propanodiol" se refiere a los polipéptidos responsables para una activación de enzima que es capaz de catalizar la reducción de 3 -hidroxipropionaldehído para 1 , 3 -propanodiol . La óxidoreductasa 1 , 3 -propanodiol incluye, por ejemplo, el polipéptido codificado por el gen dhaT (GeneBank U09771, U30903) . Alternativamente, yqhD, una estructura de lectura abierta de E. coli con 40% de identidad al gen adhB en Clostridium (una deshidratasa 2 de butanol dependiente de NADH probable) , codifica un polipéptido que funciona como una óxidoreductasa de 1 , 3 -propanodiol (WO 0112833). Las enzimas expresadas por los plásmidos pSYCO (pSYCOlOl, pSYCO103, pSYCO106, pSYCO109, pSYCO106mcs, y pSYCO109mcs) pueden todas comprender genes referidos para expresar la deshidratasa de glicerol, el factor de reactivación de deshidratasa, la deshidrogenasa de glicerol-3-fosfato, y glicerol-3-fosfatasa. Los términos "substrato de carbono fermentado" y "fuente de carbono fermentable" se refieren a una fuente de carbono capaz de metabolizarse por los organismos hospedadores de la presente invención, y particularmente fuentes de carbono seleccionadas del grupo que consiste de monosacáridos , oligosacáridos , polisacáridos, glicerol, dihidroxiacetona, y substratos de un carbono o mezclas de los mismos.

Sistema de expresión de gen con variantes del promotor GI de diferentes resistencias El requerimiento mínimo para un sistema de expresión de gen efectivo es la presencia de un promotor (un sitio en el ADN donde la polimerasa de ARN se enlaza e inicia la transcripción) en dirección ascendente de un gen clonando. Frecuentemente un promotor fuerte, uno que tiene una alta afinidad para la polimerasa de ARN, se usa con el resultado que la región de dirección descendente adyacente se transcribe altamente o frecuentemente . En el promotor la secuencia principal determinante de la resistencia del promotor (el nivel al cual el gen en dirección descendente se transcribe) es los pares bases más altamente conservados. Los promotores que tienen desviaciones de las secuencias conservadas han reducido la frecuencia de inicio de la transcripción (Hawley, D.K, McClure, .R, Nucleic Acids Res., 11:2237-2255(1983)). Los promotores para polimerasa de ARN de E. coli se ha demostrado que contienen dos regiones de secuencia de ADN conservadas ubicadas alrededor de 10 y 35 pares bases en dirección ascendente del sitio de inicio de transcripción. Se determinaron 12 pares bases para ser los más altamente conservados entre los promotores. Estas bases son TTGACA alrededor de 35 pares base dirección ascendente, la llamada región -35, TATAAT alrededor de 10 pares base en dirección ascendente, la llamada región -10. El espaciado óptimo entre las regiones -10 y -35 son 17 pares base. El promotor es más fuerte si el espaciado es más cerrado a 17 parea base; sin embargo los promotores con interespaciado de 15 y 20 pares base mantienen una función parcial. Los solicitantes han creado una serie de constructos que incorporan las variantes del promotor Streptomyces lividans de isomerasa de glucosa (GI) . Los constructos de una colección o kit de variantes de promotor con un rango de diferentes resistencias confieren la capacidad de confeccionar niveles variados de expresiones de genes como sea necesario. La isomerasa de glucosa de Strepto yces (EC 5.3.1.9) cataliza la conversión de la glucosa-6-fosfato para fructosa-6-fosfato . La transcripción del gen que codifica la isomerasa de fosfoglucosa (pgi) se controla por un promotor que contiene una secuencia firmada -10 característica (AATAAT) y una secuencia de firma -35 característica (TTGACA) . No obstante que la mutagénesis de saturación se lleva a cabo en la región -35 del promotor, los cambios al sitio de restricción SpeJ de aproximadamente 122 pares base en dirección ascendente de la región -35 también tuvo efectos en la expresión de la actividad del gen. Además una eliminación de 25 pares base entre el -10 y el final de este promotor permite la retención del 86% de la actividad de enzima aun con los cambios al sitio de restricción Spel. Estos resultados particulares no se reportan previamente. La terminación de transcripción de la síntesis del AR se presenta en las secuencias bases específicas en el ADN y regula la terminación de la transcripción. Una secuencia de terminación común en el ADN es una que contiene una repetición invertida con un segmento no repetitivo central. Cuando tal secuencia de ADN se transcribe, el ARN puede formar una estructura de rizo- madre por el empare amiento de bases entre hebras. Cuando tales estructuras de rizo-madre en el ARN se siguen por corridas de uridina, son terminadores de transcripción efectivos. Otros sitios de terminación son regiones en donde la secuencia rica en GC se sigue por una secuencia rica en AT. Tales tipos de estructuras llevan a la terminación de la transcripción sin agregar ninguno de los factores y algunas veces son llamados terminadores intrínsecos o, rho-independientes . Otros tipos de secuencias de terminador se ha descubierto que requieren factores de proteína tal como Rho de E. coli además de la polimerasa de ARN para funcionar. El Rho no se enlaza a la polimerasa ARN o al ADN sino que se enlaza estrechamente al ADN y se mueve hacia abajo la cadena hacia el complejo ADN-polimerasa de ARN, Una vez que la polimerasa de ARN se ha pausado en el sitio de terminación dependiente de Rho, el Rho puede entonces provocar que el ADN y la polimerasa dejen al ADN, de esta manera terminando la transcripción. Otras proteínasinvolucradas en la terminación de la transcripción son proteínas enlazadas al ARN tipo Rho. En todos los casos las secuencias involucradas en la terminación operan al nivel del ARN. Sin embargo, el ARN se transcribe del ADN, y de esta manera la terminación de la transcripción se determina por último por secuencias de nucleótido específicas en el ADN ( adigan, M,T.; Martinko, J. .; Parker J, ; Brock Biology of Microorganisms , 8 ed. , Prentice Hall; Upper Saddle River, NJ (1997)). Los solicitantes han construido una región de terminación en la cual tres diferentes secuencias terminadoras se han colocado en tándem. Estos tres terminadores se flanquean por sitios de enzima de restricción únicos útiles para el clonado de genes u operones. El terminador tonB es un terminador transcripcional independiente de rho- bidirecccional encontrado entre el gen tonB de E. coli y un gen opuesto (Postle, K. ; Good, R.F., Cell, 41, 577-585 (1985)). El atenuador thr, similar en estructura a los otros terminadores independientes de rho, facilita la terminación transcripcional del operón de treonina de E. coli (Yanget et al., J. Biol . Chem. , 270:23330-23336 (1995)). El terminador aspA con una estructura característica de terminadores independientes de rho, facilita la terminación transcripcional del operón de aspartasa de E. coli (Takagi et al., Nucleic Acid Res., 13 :2063-2074 (1985) ) . Como elementos genéticos autoreplicantes, autónomos, los plásmidos tienen atributos básicos para hacerlos vectores potenciales para portar el ADN clonado. Los plásmidos que se presentan naturalmente frecuentemente carecen de varias características importantes requeridas en un vector de clonación de alta calidad. Estas características incluyen (1) un tamaño pequeño (necesario para transferencia eficiente del ADN exógeno en un hospedador) , (2) sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción únicos en los cuales el ADN insertado puede clonarse, y (3) uno o más marcadores genéticos selecciónateles para identificar las células receptoras que portan el constructo de ADN insertado en el vector clonado. En consecuencia, los vectores de clonación plásmidos son producidos por ingeniería genética (Glick, B. R. , Pasternak, J.J., Molecular Biotechnology Principies and Applications of Recombinant DNA 2a' ed., American Society for Microbiology, Washington, DC (1998)). Los vectores pCL 1920/21 son un par de plásmidos de bajo número de copias que contiene un fragmento de 580 pares base BstUI que porta el promotor/operador lac, un sitio de clonación múltiple y un fragmento lacZ de pUC19 que se ha clonado en lugar de la región polienlazadora de pGB2, un plásmido derivado de pSClOl que confiere resistencia a la espectinomicina y estreptomicina en E. coli. Los vectores pCL 1920/21 (cinco copias por célula) tiene una diferencia de 40 veces en el número de copia de plásmido entre los vectores pCL 1920/21 y los vectores pUC (200 copias por célula) . De esta manera, los vectores pCL 1920/21 permiten regular la expresión de bajo nivel de los genes insertados en dirección descendente del promotor-operador cuando se transforma en cepas. También deberán ser útiles para genes clonados que pueden ser perjudiciales a un número alto de copias. Ya que los vectores pCL 1920/21 son compatibles con los plásmidos derivados de ColEl, pueden usarse para formar co-trasformantes estables junto con pBR322 o plásmidos derivados de pUC (Lerner et al., Nucleic Acids Res., 18:4631 (1990)). Los plásmidos de las invenciones pueden usarse en una variedad de hospedadores para la bioproducción de materiales .

Reemplazo de promotores nativos ubicados cromosomalmente de cualquier gen u operón endógeno para alterar el nivel transcripcional . Las variantes de promotor reivindicadas (constructos que comprenden las SEQ ID NO: 31 y 32) pueden usarse en un método para reemplazar promotores nativos cromosomalmente ubicados con cualquier gen u operón endógenos con objeto de alterar el nivel de transcripción del gen u operones. El resultado es los niveles de producción de proteína cambiados . El promotor a reemplazarse puede ser cualquier gen en cualquier microorganismo donde es operable el método rojo Lambda de Datsenko y Wanner [(2000)PNAS 97: 6640-6645] o un método equivalente. En el método, un molécula de ADN quimérica que comprende un marcador de selección enlazado operablemente a un promotor no nativo colocado divergentemente, enlazado operablemente a la región codificadora 5' de un gen objetivo, se sintetiza por la reacción de cadena de polimerasa (PCR) . La síntesis se realiza usando (1) un par de cebadores químicamente sintetizados, (a) el primer cebador comprende: (i) una región de ADN distal al promotor natural objetivo a reemplazarse, (ii) un promotor no nativo y (iii) una región de ADN ya sea del extremo 3' o 5' del marcador seleccionable ,- y (b) el segundo cebador comprende (i) una región de ADN próxima al sitio de inserción objetivo y (ii) una región del ADN del extremo opuesto de marcador seleccionable que se usa en el primer cebador; y (2) una plantilla de ADN que codifica marcador seleccionable. Este producto se integra en el producto de ADN sintetizado arriba en el sitio objetivo cromosomal de cualquier célula hospedadora usando el método de Datsenko y Wanner (supra) . El resultado de este protocolo es que los promotores nativos objetivos se reemplazan con la molécula quimérica sintetizada por PCR que porta el promotor no nativo. Una extensión del método puede usarse para evaluar el efecto del nivel de expresión gen variante en el desempeño del biocatalizador. Biosíntesis de la 1, 3-propanodiol (3G) a partir de glucosa en E. coli.

Loas plásmidos de la invención pueden usarse en E. coli para la biosíntesis de 1 , 3 -propanodiol (3G) a partir de la glucosa. Los ejemplos de la presente incluyen la construcción de un organismo de producción que incorpora la invención reivindicada y la maquinaria genética necesaria para convertir un substrato de carbono fermentable a 1,3-propanodiol . Los genes involucrados en la producción de 1,3-propanodiol incluyen un gen de deshidratasa (típicamente una deshídratasa de glicerol o diol) y una óxido reductasa así como otras proteínas que se espera que ayuden en el ensamble o en el mantenimiento de la estabilidad de la enzima de deshidratasa. Estos genes pueden ser transgenes introducidos en la célula hospedadora, o pueden ser endógenos. Al menos uno de estos genes será un transgen y se introducirá en la célula de producción. Los organismos recombinantes que contienen los genes necesarios que codifican la trayectoria enzimática para convertir un substrato de carbono al 1,3-propanodiol , pueden construirse usando técnicas bien conocidas en el arte. La célula de producción transformada se hace crecer entonces bajo condiciones apropiadas para la producción de 1 , 3 -propanodiol . La producción de 1 , 3 -propanodiol en E. coli se ha descrito previamente (US 5,633,362, US 5,8212,092; US 5,686,276; US 6,025,184, US 6,013,494; US 5,599,689; US 6,136,576) . La expresión de muchos genes diferentes se involucra en la producción a partir de glucosa de 1,3-propanodiol por un E. coli recombinante . Los genes que codifican la glicerol deshidratasa (dhaB) y óxido reductasa 1 , 3 -propanodiol (dhaT) se aislan del hospedador nativo tal como Klebsiella y se usan para transformar cepas hospedadoras tales como cepa de E. coli DH5a o FM5; K.pneumoniae ATCC 25955; cepa K. oxytoca ATCC 8724 o 5al, cepa S. cerevisiae YPH499, cepa P, pastoris GTS115 y cepa A. niger FS1. En Klebsiella pneumonía, Citrobacter freundii, y Clostridium pasteurianum, los genes que codifican las tres subunidades estructurales de la deshidratasa de glicerol (dhaBl-3 o dhaB, C, y E) se ubican adyacentes a un gen que codifica una óxido reductasa de 1, 3-propanodiol específica (dhaT) . No obstante que la organización genética difiere algunas veces entre estos microorganismos, estos genes se agrupan en un grupo que también incluye orfX u orfZ (genes que codifican el factor de reactivación de deshidratasa para la deshidratasa de glicerol) , así como orfY y orfW (genes de función desconocida). Las óxido reductasas de 1 , 3 -propanodiol específicas (dhaT) de estos microorganismos se conocen por pertenecer a la familia de deshidrogenasa de alcohol de tipo III; cada una exhibe una porción de enlace a hierro conservada y tiene una preferencia para la interconversión enlazada al NAD+NADH de 3-HPA y 1 , 3 -propanodiol . Sin embargo, la interconversión enlazada NAD^ADH de 1 , 3 -propanodiol y 3-HPA también se cataliza por las deshidrogenasas de alcohol que no se enlazan específicamente a las enzimas de deshidratasa (por ejemplo, deshidrogenasa de alcohol de levadura de panadero y de hígado de caballo (E . C .1.1.1.1) ) , aunque con menos parámetros benéficos eficientes. La deshidratasa de glicerol (E.C.4.2.1.30) y la deshidratasa [1 , 2 -propanodiol] de diol (E . C .4.2.1.28) son enzimas relacionadas pero distintas que se codifican por distintos genes. Los genes de deshidratasa de diol de Klebsiella oxytoca y Salmonella typhimurium son similares a los genes de deshidratasa de glicerol y se agrupan en un grupo que comprenden genes análogos a orfX y orfZ (Daniel et al., FEMS Microbiol . Rev. 22:553 (1999); Toraya and Mori, J. Biol . Chem. 274:3372 (1999); GenBank AF026270) .

El gen que codifica la dehidrogenasa de glicerol 3-fosfato (DAR1, GPD1) se ha clonado y secuenciado de S. diastaticus (Wang et al., J., Bact . 176:7091-7095 (1994)) . El gen DAR1 se clona en un vector de programa y se usa para transformar E. coli donde la expresión produce una enzima activa. Wang et al., (supra) reconoce que DAR1 se regula por el ambiente osmótico celular, pero no sugiere como el gen pudiera usarse para aumentar la producción de 1, 3-propanodiol en un microorganismo recombinante . Otras enzimas de deshidrogenasa de glicerol -3 -fosfato se han aislado. Por ejemplo, la deshidrogenasa sn-glicerol-3-fosfato se ha clonado y procesado en secuencia a partir de Saccharomyces cerevisiae (Larason et al . , Mol. Microbiol. 10: 1101(1993)). Alberty et al . , (Mol. Cell . Biol . 14: 4135 (1994) ) enseña la clonación de GPD1 que codifica una deshidrogenasa de glicerol-3-fosfato a partir de Saccharomyces cerevisiae. Como Wang et al. (supra) , tanto Alberty et al. y Larson et al. reconocen la sensibilidad osmótica de la regulación de este gen, pero no sugieren como el gen puede usarse en producción de 1 , 3 -propanodiol en mecanismos recombinantes . Como con G3PDH, la glicerol-3-fosfatasa se ha aislado de Saccharomyces cerevisiae y la proteína identificada como codificada por los genes GPP1 y GPP2 (Norbeck et al., J. Biol Chem. 271:13875 (1996)). Como los genes que codifican G3PDH, parece que GPP2 es osmosensible .

EJEMPLOS La presente invención se define además en los siguientes ejemplos que indican modalidades preferidas de la invención. De la discusión anterior y estos ejemplos, alguien experto en la técnica pueden determinar las características esenciales de esta invención, y sin salirse del espíritu y alcance de la misma, pueden hacerse varios cambios y modificaciones de la invención para adaptarla a varios usos y condiciones.

MÉTODOS GENERALES El ADN recombinante estándar y las técnicas de clonación molecular usados en los ejemplos son bien conocidas en el arte y se describen por Sambrook, J. , Fritsch, E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, (1989) (Maniatis) y por T.J Silhavy, M.L. Bennan, y L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) y por Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, pub. por Greene Publishing Assoc. y Wiley-Interscience (1987) . Los materiales y métodos apropiados para el mantenimiento y crecimiento de cultivos bacterianos son bien conocidos en el arte. Las técnicas apropiadas para usarse en los siguientes ejemplos pueden encontrarse como se establece en Manual of Methods for General Bacteriology (Phillipp Gerhardt, R.G.E. Murray, Ralph N.Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg, and G. Briggs Phillips, eds) , American Society for Microbiology, Washington, DC (1994) ) o por Thomas D. Brock en Biotechnology : A Textbook of Industrial Microbiology, Segunda Edición, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1989) . Todos los reactivos, enzimas de restricción y materiales usados para el crecimiento y mantenimiento de las células bacterianas se obtienen de Aldrich Chemicals (Milwaukee, WI) , DIFCO Laboratories (Detroit, MI), GIBCO/BRL (Gaithersburg, MD) , New England Biolabs (Beverly, MA) o Sigma Chemical Company (St. Louis MO) salvo que se especifique de otra manera. El significado de la abreviaturas es como sigue: "h" significa horas, "min" significa minutos, "seg" significa segundos, "d" significa días, wml" significa mililitros "L" significa litros, "mm" significa milímetros, "nm" significa nanómetros, "mM" significa milimolar, "M" significa molar, "mmol" significa milimoles, "µt???e" significa micromoles, "g" significa gramos, l^g" significa microgramos .

EJEMPLO 1 CONSTRUCCIÓN DE VARIANTES DE PROMOTOR DE ISOMERASA DE GLUCOSA El promotor de isomerasa (GI) de glucosa de Streptomyces lividans (SEQ ID NO: 1) contiene una secuencia de firma -10 característica (AATAAT) y una secuencia de firma -35 característica (-35T, -34T, -33G, -32A, -31C, -30A) . Usando una mezcla con base de oligonucleótidos , la mutagénesis de saturación de la región -35 del promotor GI en pMP38 (como se describe en el ejemplo 6 siguiente) se realiza por PCR estándar. En seis reacciones PCR individuales, un cebador en dirección ascendente (SEQ ID NO: 2) se empareja con uno de seis cebadores en dirección descendente (SEQ ID NO: 3-8) , cada uno de los cuales contiene una mezcla igual de todas las cuatro bases posibles en una posición sencilla en la región -35, designada como N. El cebador en dirección ascendente también incorpora dos cambios de par base sencillo que cambian el sitio de restricción Spel (ACTAGT) inmediatamente después del sitio EcoRI a un sitio de restricción Avrll (CCTAGG) . Los seis productos PCR se digieren con EcoRI e HindIII, y se ligan individualmente al pMP38 EcoRI/HindIII . Las ligaciones de transforman en E. coli, y los plásmidos recombinantes se identifican a través del análisis de restricción por la conversión de Spel a Avrll, y se someten a un secuenciado de nucleótidos. Solo los plásmidos recombinantes se esperaría que alojaran los cambios en la región -35 posibles. De los 24 resultados recombinantes posibles (4 bases en 6 posiciones) , se obtienen 18, de los cuales 13 representan cambios en la región -35 (tabla 1) .

Tabla 1. Variantes del promotor GI obtenidos por mutagénesis de saturación PCR Posición Base Nombre Comentarios SEQ ID NO. -30A A P1.6 Sin cambio en la 9 región -35 T P1.5 10 G P1.20 11 = no ap.ica e No obstante que 5 de los 18 cambios posibles en la región -35 no se aislan, estos también pueden ser útiles para variar los niveles expresión de genes u operones nativos y no nativos codificados cromosomalmente o clonados. Estas cinco variantes de promotor GI adicionales se describen en la Tabla 2. Tabla 2. Otras variantes de promotor GI potenciales EJEMPLO 2 ANALISIS DE LAS VARIANTES DE PROMOTOR DE ISOMERASA DE GLUCOSA MIDIENDO LA ACTIVIDAD DE DESHIDRATASA DE GLICEROL La actividad de la deshidratasa de glicerol (GDH; codificada por dhaBl-3) se usa como un reportero para medir el efecto de las mutaciones del promotor GI (tabla 3) . Se observa que aun en ausencia de un cambio en la región -35, la actividad GDH cae significativamente debido a que los dos cambios en par base que convierte el Spel a Avrll (por ejemplo, P1.6). También se determina que P3. no tiene una mutación -35, pero tiene una eliminación de 25 pares base inmediatamente después de la región -10, y tiene una resistencia del promotor cercanamente a la del tipo silvestre (86%) . La actividad de la deshidratasa en extracto libre de células se determina usando ya sea glicerol o 1 , 2-propanoidol como substrato. Los extractos libres de células se preparan por disrupción celular usando una prensa Francesa seguido por la centrif gación de las desechos celulares. El ensayo, con base en la reacción de los aldehidos con metilbenzo-2-tiazolona hidrazona se ha descrito por Forage and Foster (Biochim, Biophys. Acta 569:249(1979)). Tabla 3: Medidas de la actividad GDH relativa en variantes de promotor GI Plásmido Actividad GDH activa pMP38 100 PMP38/1.6 13 pMP38/1.5 3 pMP38/1.20 1 pMP38/l.10 1 PMP38/2.39 0 pMP38/3.4 86 pMP38/3.5 1 EJEMPLO 3 ANALISIS DE LAS VARIANTES DE PROMOTOR GI USANDO EL ANALISIS LUX Un segundo tipo de reportero se usó para medir los niveles de expresión manejados de las variantes de promotor GI . La bioluminiscencia bacteriana es un fenómeno en el cual los productos de 5 genes estructurales (luxA, luxB, luxC, luxD, luxE) trabajan en concierto para producir luz. El producto luxD genera un ácido graso C14 de un precursor. El ácido graso C14 activa una reacción dependiente ATP para un conjugado de acil enzima a través de la acción de producto luxE, que acopla la bioluminiscencia bacteriana al estado energético celular. La acil-encima (producto luxE) sirve como un agente de transferencia, donando el grupo acilo al producto luxC. El complejo binario acilo-luxC se reduce entonces en una reacción en la cual NADPH sirve como un par electrón y protón donador que reduce el conjugado acilo al aldehido C14. Esta reacción acopla el poder reductor de la célula a la emisión de luz bacteriana. La reacción de producción de luz;, catalizada por luciferasa (el producto de luxA y luxB) , genera luz. La energía para emisión de luz se proporciona por el aldehido a la conversión de ácido graso y la oxidación de FMN¾, proporcionando otro acoplamiento entre la producción de luz y el estado de energía celular. Los genes Photorabdus luminenscens luxAB se usan como reporteros para la resistencia de variante del promotor GI (Van Dyk et al., Appl . Environ. Microbiol . , 180: 785-792 (1995)) . Un fragmento PCR porta los genes P. luminenscens luxB y contiene los sitios Spel en los extremos 3' y 5' y un sitio Ncol producido por ingeniería en el codón de iniciación de luxA se subclona en el sitio Spel en pMCS5 (MobiTec, Góttingen, Alemania) proporcionando el pJT13. Entonces un cásete de canamicina basado en PCR del gen SOEling con extremos Swal/Ncol se clona en Swal/Ncol pJT13 diferido en pJT14.HIGHCOPY, para hacer el luxAB, la sonda de promotor. El pJT14.HIGHCOPY se difiere entonces con Spel para producir el cásete de canamicina luxAB, se subclona en el ciclo Nhel único (compatible con Spel) , en pRJ50 (SEQ ID NO: 79) para hacer el pJT14.LOWCOPY.l, la sonda de promotor luxAB de baja copia. Los promotores GI 1.6, 1.5, 1.20, y los nativos donde se clonan en pJT14. HIGCOPY y pJT14L0WC0PY como fragmentos Notl/Ncol para hacer los constructos de alta copia pJT18, pJT19, pJT20 y pJT25, respectivamente los constructos de baja copia pJT21.1, pJT22.1, pJT23.1, y pJT26.1, respectivamente. Los plásmidos se transforman entonces en cepas E. coli seleccionadas para dimensiones de bioluminiscencia in vivo. Las resistencias del promotor se miden por luminometría usando cultivos de caldo de cepas reportero de E. coli, n-decanal como el substrato de aldehido, y un luminómetro, como se describe por Van Dyk and Rosson (Methods in Molecular Biology, Vol . 102: Bioluminescence Methods and Protocols, 85 (1998)). Los clones de E. coli se inoculan de una placa de agar fresca en tubos de prueba que contienen un medio de crecimiento líquido Luria-Bertani estándar con antibiótico apropiado y crecen aeróbicamente (con agitación) a 37°C durante aproximadamente 16 horas. Las células se subcultivan entonces en matraces de 100L que contiene 25 mL de medio fresco y se hacen crecer bajo las mismas condiciones durante aproximadamente 8-10 h. Las alícuotas (200µL) se toman entonces de cada cultivo y se colocan en placas blancas y transparentes de 96 pozos para mediciones de densidad óptica a 600nm (SpectraMax 190 Plater Reader, Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA) y las mediciones de luminómetro (Luminoscan Ascent TAype 392, LabSystems, Helsinki, Finlandia), respectivamente. Para las lecturas de luminometría, 2µ1_? del aldehido exógeno (n-decanal) se agrega a cada pozo y se hacen las mediciones. Los resultados de estos ensayos se enlistan en la tabla 4. Estas dimensiones de luminometría indican el nivel de la resistencia del promotor similar a la que se indica por los ensayos de deshidratasa de glicerol .

Tabla 4 : Mediciones de Bioluminiscencia EJEMPLO 4 USO DE SECUENCIAS DE PROMOTOR GI ACORTADAS PARA RELAIZAR DIFERENTES NIVELES DE EXPRESIÓN DEL GEN. Un subconjunto de las secuencias de promotor GI descritas y usadas en los ejemplos 1-3 se usan para variar los niveles expresión de E. coli yqhD (SEQ ID NO: 29) del plásmido pSYCO109mcs (como se describe en el ejemplo 8 y SEQ ID NO: 30) en cepa RJ8n en la cual el gen (yqhD) se rompe en el cromosoma para crear la cepa RJ8n(yqhD-) . Se construyen tres casetes de expresión para yqhD. Estos casetes contienen (i) uno de los promotores GI más acortados designados cortos 1.5 GI SEQ ID NO: 31, corto 1.20 GI (SEQ ID NO: 32), de tipo silvestre GI (SEQ ID NO: 33); (ii) yqhD para E. coli KLP23 (WO9928480) ; y (iii) el terminador de treonina (Lyn et al., J. Mol. Biol . , 183:529-541 (1985)). El gen yqhD se aisla por amplificación PCR del ADN KLP23 genómico usando cebadores sintéticos delanteros para el 1.5 GI (SEQ ID NO: 34) corto 1.20 GI (SEQ ID NO: 35), o GI (SEQ ID NO: 36) de tipo silvestre corto, que contienen uno de los promotores GI acortados y también incorporan un sitio de restricción RsrII, y el cebador inverso para yqhD (SEQ ID NO: 37) que contiene el terminador de treonina e incluye un sitio Sacl. El plásmido pSYCO109mcs se digiere con RsrII/SacI y los productos de PCR diferidos con Rsrll/Sacl se ligan en un plásmido. La mezcla de ligación se transforma en la cepa RJ8n(yqhD-) por electroporacion y los niveles de actividad en cada una de las cepas se compara (tabla 5) . La actividad de la enzima expresada por yqhD reducirá los aldehidos de 3-hidroxipropionaldehído (3-HPA) y butanal con relaciones similares usando NADPH como la puente de equivalentes reductores . Ya que 3-HPA no está comercialmente disponible, se usa generalmente el butanal . La mezcla de ensayo contenida en un volumen total de lmL: solución amortiguadora de fosfato de potasio 200nM (pH 7.50), butanal lOm , NADPH 0.2 mM y aproximadamente 0.01 mg de proteina extracto libre de célula se ensayan. La relación inicial de oxidación de NADPH después de la adición de la muestra de proteína se sigue al medir el cambio en la absorbancia a 340 nm (?e= 6.22 mM-1) . Una unidad de actividad se define como que se requiere para oxidar un micromol de NADPH en un minuto en presencia de butanal lOmM a 35°C. Las actividades de variaciones se dan en la tabla 5 a continuación y son consistentes con los niveles de expresión permitidos por las variantes de promotor GI más largas.

Tabla 5. Actividad YqhD Cepa y constructo Actividad % Actividad (ü/mg) RJ8n(yqhD-) 0.015 0.8 RJ8n (yqhD-) /pSYCO109mcs 0.010 0.5 RJ8n(yqhD-) /pSYCO109mcs-corto 0.14 7.3 1.20 GI yqhD RJ8n(yqhD-) /pSYCO109mcs-corto 1.5 0.29 15 GI yqhD RJ8n(yqhD-) /pSYCO109mcs-GI yqhD 1.92 100 de tipo silvestre corto Para crear RJ8n (yqhD-) el gen yqhD se rompe en E. coli MG1655 usando el procedimiento como se describe por Wanner y Datsenko (PNAS, 97(12): 6640-6645 (2000)) para recombinación homóloga mediada por Red. El cebador PCR delantero Hl:6574 (SEQ ID NO: 38) (que contiene 42 pares base de secuencia homóloga a yqhD y el cebador en sitio enlace Pl para pKD13) y el cebador PCR inverso H2 : 6706 (SEQ ID NO: 39) (que contiene 47 pares base de secuencia yqhD homóloga y el sitio de enlace cebador P4 a pKD13) se preparan. La amplificación PCR con pDK13 como la plantilla produce un producto PCR que tiene la secuencia yqhD en cada extremo seguido por sitios FRT (objetivo de reconocimiento FLP) que flanquean el marcador resistente a la canamicina (kanR) . El producto PCR se electrotransforma en células E. coli MG1655 y los transformantes resistentes a la canamicina se seleccionan. La inserción corregida en los transformantes se confirma por PCR usando cebadores yqhDUP (SEQ ID NO: 82) y yqhDDN (SEQ ID NO: 83) flanqueados por el gen yqhD. El plásmido sensible a la temperatura que contiene un sistema Lambda Red se cura por crecimiento de las cepas a 42°C. La disrupción yqhD: :kan se mueve en RJ8n por traducción Pl y se confirma por PCR usando los cebabores yqhDUP2 (SEQ ID NO: 40) Y yqhDDN2 (SEQ ID NO: 41) emparejados con cebadores internos para el gen KanR (Vec 61; SEQ ID NO: 42 and Vec 60; SEQ ID NO: 43) . Para remover el marcador de canamicina, los integrantes se transforman con el replicón sensible a la temperatura, pCP20 que contiene el gen para la recombinasa FLP. La recombinasa FLP extirpa el marcador de la canamicina en los sitios FRT de flaqueo (objetivo de reconocimiento FLP) . Las células sensibles a la canamicina se hacen crecer entonces a 42°C para curar el pCP20. La cepa resultante fue RJ8n (yqhD-) .

EJEMPLO 5 REEMPLAZO DEL PROMOTOR CROMOSOMAL DE CARBOXILASA FOSFOENOLPIRUVATO DE E. COLI CON UN PROMOTOR GI El ejemplo 5 describe el reemplazo en el genoma de Escherichia coli del ppc natural (codificando la carboxilasa de fosfoenolpiruvato o carboxilasa PEP) por el promotor de GI de tipo silvestre corto (SEQ ID NO: 33) . Diseño de los oligonucleótidos para el reemplazo del promotor ppc . Dos oligonucleótidos (ppcF, SEQ ID NO: 44 y ppcR, SEQ ID NO: 45) se diseñan para amplificar por PCR un cásete que contiene una secuencia 80-pares base homologa a la región en dirección ascendente en promotor ppc natural , un gen que codifica la resistencia al cloranfenicol (cat) flanqueado por sitios FRT de levadura de panadero, la secuencia del promotor GI de tipo silvestre corta (SEQ ID NO: 33) , y una secuencia de 40 pares base homologa a la región en dirección descendente del sitio de transcripción +1 del promotor ppc natural . El cebador ppcR (SEQ ID NO: 45) es de 100 nucleótidos de longitud e incluye: la secuencia completa del inicio de transcripción +1 de Pl (promotor ppc natural) para 41 pares base en dirección ascendente del ATG del ppc, la secuencia de promotor GI de tipo silvestre corta (SEQ ID NO: 33) de 4 pares base en dirección ascendente del -35 para 9 pares base en dirección ascendente del -10, y el sitio de cebador para pKD3 (Wanner y Datsenko, supra) , un plásmido R6K que contiene el gen cat flanqueado por dos sitios FRT. El cebador ppcF (SEQ ID NO: 44) es de 100 nucleótidos de longitud que incluye 80 pares base de secuencia en dirección ascendente del promotor ppc natural y sitio cebador para pKD3. Los cebadores ppcF y ppcR (SEQ ID NO: 44 y 45) se usan para amplificar el cásete de reemplazo de promotor usando el plásmido pKD3 como una plantilla. El producto de 1.15-kb por PCR se purifica por electroforesis por gel de agarosa seguido por el kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen, Inc., Valencia, CA) .

Reemplazo del promotor ppc natural en el genoma de Escherichia coli por recombinación homologa usando ADN lineal . Las células MG1655 de Escherichia coli competentes que contienen p D46 (Datsenko y Wanner, supra) , un plásmido de recombinasa Red que expresa ?, ß y exo bajo el control del promotor de arabinosa, se electrotransformó con 0.5 9 del ADN lineal del 1.15 kb anterior y los transformantes resultantes se separan por exclusión para resistencia al cloranfenicol (15µ9/??) . Las cepas recombinantes se checan por PCR usando cebadores ppcF y seqppcR (SEQ ID NO: 46) . La integración no específica del cásete da productos no de PCR mientras que los recottibinantes reales dan un producto de PCR de 1.25-kb. La secuencia del tipo GI de tipo silvestre corto se confirma por el secuenciado del producto 1.25kb PCR con cebador seqppcR (SEQ ID NO: 46) .

Medición de la actividad enzimática Las actividades de carboxilasa PEP MG1655 y MG1655 (GI-ppc de tipo silvestre corto) se miden en un extracto libre de células ultracentrifugado usando el siguiente ensayo que se indica en la tabla 6. La actividad del PPC bajo control del promotor GI de tipo silvestre corto fue sobre 3 veces mayor que bajo el control natural. La reducción a 3 0nm (debido al consumo de NADH) se mide en una mezcla que contiene: 0.11 M solución amortiguadora Tris (pH 8.5), NADH (0.22ttiM), sulfato de magnesio (11.1 mM) bicarbonato de sodio (ll.lmM) , acetil-CoA(0.25mM) , malatoDH (Sigma) , 50µL de extractos celulares 6U y fosfoenolpiruvato de 0.03 (l.llmM) . La siguiente fórmula se usa para determinar la actividad: Unidades/mg de proteína = AA340/min (prueba)- AA340/min (blanco) 6.22 x mg protelna/mL de mezcla de reacción Tabla 6 Actividad del PPC de promotores y naturales de GI 1.6.

EJEMPLO 6 CONTRUCCION DE UN PLASMIDO DE EXPRESIÓN PARA USARSE EN LA TRANSFORMACIÓN DE ESCHERICHIA COLI CON GENES DEL REGULON DE KLEBSIELLA PNEUMONIAE dha Construcción del vector de expresión pTaclQ: El vector de expresión de E. coli pTaclQ se prepara al insertarse el gen laclQ (Farabaugh, Nature, 274(5673): 765-769 (1978)) y el promotor tac (Amann et al., Gene 25: 167-178 (1983)) en el sitio EcoRI de pBR322 (Sutcliffe, Cold Spring Harb, Symp. Quant . Biol . 43:77-90 (1979)). Un sitio de clonación múltiple y una secuencia terminadora (SEQ ID NO: 47) reemplaza la secuencia pBR322 del EcoRI para Sphl . Subclonado de los genes de deshidratasa glicerol (dhaBl, 2, 3, X) : La estructura de lectura abierta para el gen dhaB3 se amplifica de pHK28-26 (SEQ ID NO: 48) por PCR usando cebadores (SEQ ID NO: 49-50) que incorporan un sitio EcoRI en el extremo 5' y un sitio Xbal en el extremo 3'. El producto se subclona en pLitmus29 (New England Biolabs) para generar el plásmido pDHAB3 que contiene dhaB3. La región (que contiene la región codificadora completa dhaBl, dhaB2, dhaB3 y dhaBX del operón PHK28-26) se clona en pBluescriptllKS+ (Stratagene, La Jolla, CA) usando las enzimas de restricción Kpnl y EcoRI para crear el plásmido pM7. El gen dhaBX se remueve por la digestión del plásmido pM7 con Apal y Xbal purificando el fragmento 5.9-kb y ligándolo con el fragmento Apal-Xbal de 325-pares base de plásmido pDHAB3 para crear pMll (contiene dhaBl, dhaB2 , dhaB3) . La estructura de lectura abierta para el gen dhaBl, se amplifica de pHK28-26 por PCR usando cebadores (SEQ ID NO: 51-52) que incorporan un sitio HindIII y un sitio de enlace a la ribosoma de consenso (RBS) en el extremo 5' y un sitio Xbal en el extremo 3' . El producto se subclona en pLitmus 28 (New England Biolabs) para generar el plásmido pDTl que contiene dhaBl. Un fragmento Notl-Xbal de pMll (que contiene parte del gen dhaBl, el gen dhaB2 y el gen dhaB3) se inserta en pDTl para crear el plásmido de expresión dhaB, pDT2. El fragmento HindIII-Xbal (que contiene los genes dhaB (1,2, 3) de pDT2) inserta en pTaclQ para crear pDT3.

Subclonado del gen de deshidrogenasa 1 , 3 -propanodiol dhaT: El fragmento Kpnl-Sacl del pHK28-26 (que contiene el gen de deshidrogenasa 1, 3-propanodiol (dhaT) se subclona en el plásmido creado por pBluescriptll KS+ pAHl . El gen dhaT se amplifica por PCR usando pAHl como el ADN de plantilla y los cebadores sintéticos (SEQ ID NO: 53-54) que incorporan un sitio Xbal en el extremo 5' en un sitio Bamhll en el extremo 3'. El producto se subclona en PCR-Script (Stratagene) en el sitio Srfl para generar los plásmidos pAH4 y pAH5 que contiene dhaT. El plásmido pAHA4 contiene el gen dhaT en la orientación correcta para la expresión del promotor lac en Pcr-Script y pAH5 el gen contiene en la orientación opuesta. El fragmento Xbal-BamHl de pAH4 (que contiene el gen dhaT) se inserta en pTaclQ para generar el plásmido pAH8. El fragmento Hindll-BamHl de pAH8 (que contiene el RBS y el gen dhaT) se inserta en pBluescriptllKS+ para crear pAHll. Construcción de un cásete de expresión para dhaT y dhaB (1,2,3) : Un cásete de expresión para dhaT y dhaB (1,2,3) se ensambla del dhaB (1,2,3) y dhaT individual subclonados descritos previamente usando métodos de biología molecular estándar. Un fragmento Spel-Sacl (que contiene los genes dhaB (1,2,3) de pDT3) se inserta en pAHll a los sitios Spel-Sacl para crear pAH24. Un enlazador Salí-Xbal creado de las SEQ ID NO: 55-56 se inserta en pAH5 que se ha digerido con las enzimas de restricción Sall-Xbal para crear pDT16. El enlazador destruye el sitio Xbal. El fragmento 1-kb Sall-Mlul de pDT16 se inserta entonces en pAH2 reemplazando el fragmento Sall-Mull existente para crear pDT18. El pDT21 se construye al insertar el fragmento Sall-Notl de pDT18, y el fragmento Notl-Xbal de pM7 en pCL 1920 (Gen Bank AX085428) . La secuencia promotora de isomerasa glucosa de Streptomyces lividans (SEQ ID NO: 1) se clona por PCR y se inserta en los sitios EcoRI-HindIII de pLitmus28 para el constructo pDT5. El pCL1925 se construye al inserta el fragmento EcoRI-Pvull al pDT5 (que contiene el promotor GI) en el sitio EcoRI-Pvull de pCL 1920 (Gen Bank AX085428) .

Construcción del Vector de Expresión para Deshidratasa de Glicerol bajo el Control del Promotor de Isomerasa de Glucosa . El fragmento de restricción HindIII (que contiene dha T) se elimina de pDT24 para generar pRN105. El plásmido pDT24 se construye por el clonado del fragmento HindlII-Mlul de pDT21 y el fragmento Mlul-Xbal de pDT21 en los sitios HindIII -Xbal de pCL1925. Un producto PCR (que comprende la región 3' de dhaX de un sitio de restricción Hpal único para el extremo de dhaX, e incorpora el sitio de restricción Hpal en el extremo 5' y un sitio de restricción Xbal en el extremo 3')/ se genera de la plantilla pRN105 y se usa al reemplazar el fragmento de restricción Hpal/Xbak existente en pRN105, generando pMP37. Un producto PCR (que comprende la región 5' de dhaBl, de un sitio de restricción HindIII único justo en dirección ascendente del codón de inicio al sitio de restricción Notl único dentro de dhaBl, e incorpora el sitio de restricción HindIII en el extremo 5' y en el sitio de restricción Notl en el extremo 3') se genera de la plantilla pDT29 y se usa para reemplazar el fragmento de restricción HindIII/Notl pequeño en pRN105, generando pRJ25. El pDT29 se había construido al insertar el fragmento Sacl-EcoRI de pHK28-26 en sitios Sacl-EcoRI de pCL1925. EL fragmento de restricción Hpal/Xbal pequeño (que contiene la región 5' de dhaX a partir de p P37) se ligó al fragmento de restricción Xbal/Hpal grande de pRJ25 para generar p P38, en el cual el promotor de isomerasa glucosa de Streptomyces lividans (SEQ ID NO: 1) conduce la expresión del operón K.pneumoniae dhaBl-3, X usando el sitio de enlace de ribosoma nativo.

EJEMPLO 7 CONSTRUCCION DE PLÁSMIDOS SYCO PARA PRODUCCIÓN DE 1,3- PROPANODIOL Para producir 1, 3-propanodiol a partir de glucosa en un hospedador de E. col , pueden ser expresados varios operones de varias fuentes. Estos incluyen genes que codifican para una actividad de deshidrogenasa de glicerol-3 -fosfato, fosfatasa de glicerol-3-fosfato, y deshidratasa de glicerol. Estos genes pueden venir de fuentes tales como operón dha de klebsiella pnuemoniae (que contiene dhaR, dhaT, dhaX, y dhaBl-3) , y el operón orf también a partir de klebsiella pnuemoniae (que contiene orfYXW) , y un operón que contiene DAR1 y GPP2 de Saccharomyces. Con el propósito de mantener la estabilidad de la línea en la fermentación es preferible mantener tan pocos plásmidos como sea posible en el hospedador de E. coli. Hasta este punto, fueron construidos una serie de plásmidos para esta terminación para hacer posible la clonación de por lo menos tres diferentes operones en un plásmido único. Fueron usados tres terminadores transcripcionales para flanquear los sitios de clonación únicos con el propósito de prevenir la lectura a través de la polimerasa de ARN. Estos terminadores transcripcionales incluyen el terminador toziB, el atenuador thr y el terminador aspA. El terminador tonB es un terminador rho-independiente bi-direccional localizado entre el gen tonB de E. coli y un gen de oposición (Postle, k. y Good, R. F., Cell, 41:577-585 (1985)). El atenuador thr facilita la terminación transcripcional del operón de treonina de E. coli (Lynn y colaboradores, J. Mol. Biol . , 183:529-541 (1985)). El terminador aspA facilita la terminación transcripcional del operón de aspartasa E. coli (Takagi y colaboradores, Nucleic Acid Research. 13 (6) : 2063 : 2072 (1985)). Construcción de pRJ50 que comprende tres terminadores transcripcionales flanqueados por sitios de clonación única: Un fragmento de ADN sintético (que comprende los terminadores transcripcionales tonB, thr, y aspA (SEQ ID NO: 57) y varios sitios de restricción) fue ensamblado usando la extensión traslapada PCR-mencionada (Horton y colaboradores, BioTechniques, 8:528-535, (1990)). Dos oligonucleótidos base 100 (SEQ ID Nos: 58-59) que se complementan uno al otro para un campo de 25 pares base en las terminaciones 3' fueron combinados de pares base para generar un fragmento de ADN base 175 (SEQ ID NO: 60) . Fueron usados dos cebadores de oligpnucleótido adicional (SEQ ID NO: 61-62) para amplificar más el fragmento base 175, lo cual es flanqueado por los sitios de restricción EcoRI y Kpnl. El producto de PCR de par base 175 fue digerido con EcoRI y Kpnl y subclonado en pCL 1925 de plásmido digerido de EcoRI/Kpnl para generar pRJ50 (SEQ ID NO: 9) .

Construcción de un cásete de expresión para dhaR; orfY, orfX, orfW y dhaB (1,2,3,X) : Un derivado de plásmido pDT29 fue construido en el cual todos, excepto los primeros cinco y los últimos cinco codones (más el codón de detención) del gen dhaT fueron eliminados por una técnica conocida como extensión de traslape mediante PCR . Usando pDT29 como plantilla, se generaron dos productos de PCR primarios usando los siguientes cebadores : SEQ ID NO: 63 = 5 ' GAC GCA ACA GTA TTC CGT CGC3 ' ; SEQ ID NO: 64 = 5'ATG AGC TAT CGT ATG TTC CGC CAG GCA TTC TGA GTG TTA ACG3 ' ; SEQ ID NO: 65 = 5'GCC TGG CGG AAC ATA CGA TAG CTC ATA ATA TAC3 ' ; SEQ ID NO: 66 = 5 ' CGG GGC GCT GGG CCA GTA CTG3 ' . SEQ ID NO: 65 fue hecha en pares con SEQ ID NO: 66 para generar un producto de 9311 pares bases y que comprende ácido nucleico que incluye 5' dhaBl (para el sitio Seal único), todos de orfY, y los cinco primeros codones de dhaT. SEQ ID NO: 63 fue hecha pares con SEQ ID NO: 64 para generar un producto de 1348 pares bases y que comprende ácido nucleico que incluye los cinco últimos codones (m s codón de detención) de dhaT, todos de orfX, todos de prfW, y 5' dhaR (para el sitio Sapl único) . Las 15 bases en la terminación 5' de SEQ ID NO : 64 constituyen una cola que es el complemento inverso de una porción de base- 15 de SEQ ID NO: 65.

Símilármente, las 11 bases en la terminación 15 de SEQ ID NO: 65 constituyen una cola que es el complemento inverso de una porción de base 11 de SEQ ID NO:64. Así, los dos productos de PCR primarios fueron unidos juntos después de la combinación de pares base (vía traslape de la cola 26-pares base) y que se extiende por PCR, para generar un tercer producto de ácido nucleico de 2253 pares bases. El tercer producto de PCR fue digerido con SapI y Seal y ligados en pDT29 el cual también fue generado con SapI y Seal, para generar el plásmido pKP32, el cual es idéntico a pDT29, excepto por el largo, la eliminación en el cuerpo dentro de dhaT.

Construcción de plásmidos para expresión de orfWXY y dhaBl-3 que contiene variantes de promotor GI diferente: El operón orf de pKP32 fue amplificado por PCR (SEQ ID NO: 80-81) con HindlII en la terminación 5' y AvrJI en la terminación 3 ' , y subclonado entre HindJIJ y Avrll en Plitmus28 (New England Biolabs) para generar p P38. El fragmento de restricción EcoRl/HindIII (que contiene el promotor imitante GI Pl .6 (SEQ ID NO: 9) de pMP38/1.6) fue subclonado entre EcoRI y HindlII en PKP38 para generar p P39. El fragmento de restricción Avrl/Xhal (que contiene el cásete de expresión dhaB de p P38/l.6) fue subclonado entre Avrll y Sbal en pLitmus 28 (New England Biolabs) para generar pMP39.

El fragmento de restricción Avrl/Xbal (que contiene el cásete de expresión dhaB de pMP39) fue subclonado dentro del sitio Avrll de pRJ50 para generar pSYCOll. El fragmento de restricción Avrl (que contiene el cásete de expresión orf de pKP39) fue subclonado dentro del sitio Nhel de pSYCOll para generar pSYC012. Los plásmidos PSYCOll y pSYC012 son idénticos excepto que pSYCOll no contiene el operón orf. El fragmento de restricción EcoRl/HindIII (que contiene el promotor mutante GI Pl .5 (SEQ ID NO: 10) de pMP38/1.5) fue subclonado entre EcoRI y HindIII en pKP38 para generar pKP40. El fragmento de restricción Avrll (que contiene el operón orf conducido por P1.5 de pKP40) fue subclonado dentro del sitio iVheJ de pSYCOll para generar pSYC013. El fragmento de restricción Avrll/Notl (que contiene el Pl .6 y la terminación 5' de dhaBl en pSYC013) fue remplazado con el fragmento de restricción Avrll/Notl de p P38/l.5 para generar pSYC019.

Construcción de los vectores pSYCOlOl, pSYCQ103, pSYCOlOe y pSYCO109 con tres operones cada uno aislado por terminadores transcripcionales ; Un enlazador de ácido nucleico de hebra doble (SEQ ID NO: 67) fue subclonado entre los sitios de restricción Xbal ? Smal en pCL1920 (GenBank AX085428) para generar pCR-pCL1920. El cásete de expresión de la trayectoria del glicerol en pAH48 que comprende el promotor trc el cual fue derivado de pTrc99A (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) , las secuencias que codifican para DAR1 y GPP2 , de S. cerevisiae, y el terminador mBTlT2 (de pTrc99A) fue amplificado de PCR (SEQ ID NO-.68-69) y subclonado en el sitio de restricción Srfl de pCR-pCL1920 para generar pAH105 (SEQ ID NO: 70) . El fragmento de restricción PvuII(2) /PvuII {4) (que contiene el cásete de expresión DAR1/GPP2 de pAH105) fue subclonado en el sitio Bstll07I de pSYCOlOl (SEQ ID NO: 71). El operón DAR1/GPP2 está en la orientación opuesta relativa al operón orf y el operón dhaB. El fragmento de restricción Miel (que contiene el cásete de expresión DAR1/GPP2 de pAH105) fue subclonado dentro del sitio Xbal de pSYC019 para generar pSYCO103 (SEQ ID NO:72). El plásmido pSYCO103 comprende (a) un conjunto de dos genes exógenos obtenidos de Saccharomyces cerevisiae {DAR1 (un gen que codifica deshidrogenasa de glicerol-3 -fosfato) y GPP2 (un gen que codifica glicerol-3-fosfatas) ) ; (b) un conjunto de tres genes exógenos obtenidos de Klebsiella pneumoniae (dhaBl (un gen que codifica la subunidad "a" de deshidratasa de glicerol) , dhaB2 (un gen que codifica la subunidad "ß" de deshidratasa de glicerol) ) ; y (c) un conjunto de dos genes exógenos obtenidos de Klebsiella pneumoniae (dhaBl (un gen que codifica la subunidad "a" de factor de reactivación de deshidratasa) y orfX (un gen que codifica la subunidad "ß" de factor de reactivación de deshidratasa) ) . En pSYCO103 el operón DAR1/GPP2 está en la misma orientación relativa del operón orf y del operón dhaB.

El fragmento de restricción Nhel (que contiene el cásete de expresión DAR1/GPP2 de pAH105) fue subclonado en el sitio Xbal de pSYCO102 para generar pSYCO106 (SEQ ID NO:73). El operón DAR1/GPP2 está en la misma orientación relativa al operón orf y el operón dhaB. El fragmento de restricción Pmll/Notl en pSYCO106 fue removido y colocado con el fragmento de restricción Stul/Notl de traslape de pSYCO106, que resulta en una eliminación de 141 pares base cerca de la terminación 3' de orfW para generar pSYCO109 (SEQ ID NO: 74) .

EJEMPLO 8 UNA SECUENCIA DE NUCLÉOTIDO NOVEDOSA CON DIEZ SITIOS DE ENZIMAS DE RESTRICCION ESCASAS UTILES PARA CLONACION Una secuencia de nucleótido novedosa fue diseñada para codificar diez sitios de endonucleasa de restricción poco frecuentes útiles para clonación de genes, operones, o casetes adicionales y como sitios para casetes de transferencia desde estos plásmidos a otros. El plásmido pSYC0106deltaS fue construido por restricción de pSYCO106 con Spel, ocupando las terminaciones de klenow y volviéndose a ligar. El pSYCO106deltaS fue digerido con EcoRI para aislar la columna vertebral del vector y luego fue recirculado por la ligadura para formar pSpREPds . Los oligonucleótidos (SEQ ID NO: 75-76) fueron combinados de pares base a 60 °C y diferidos con Kpnl/Stul. El fragmento de clonación múltiple (SEQ ID NO: 77) contiene sitios de reconocimiento para las enzimas siguientes: Nhel, RsrII, SacI, AgeJ, SnaBI, AscI, Pací, Nsil, Mlil, y SapI . Los fragmentos fueron purificados por gel y clonados a pSpREPds para formar pSpREpmcs. El pSpREPmcs fue linearizado con EcoRI y los fragmentos EcoRI (que contienen los genes de camino de pSYCO106deltaS y pSYCO109) fueron ligados a pSpREPmcs para formar pSYCO106mcs (SEQ ID NO:78) y pSYCO109mcs (SEQ ID NO:30), respectivamente.

EJEMPLO 9 PRODUCCIÓN DE 1, 3 -PROPANODIOL QUE USA LEVA DE E. COLI RJ8N/PSYCO101 El plásmido pSYCOlOl (SEQ ID NO: 71) fue usado para transformar las células de RJ8n de E. col i electrocompetente, resultando en la línea de E. coli, RJ8n/pSYCO101. El RJ8n/pSYCO101 fue pre cultivado para siembra de fermentados en medio 2YT (10 g/L de extracto de levadura, 10 g/L de tristona, y 10 g/L de NaCL) que contiene 50 mg/L de espectinomicina . Los cultivos fueron iniciados de almacenados congelados (glicerol 10% como crioprotector) en 500 mL de medio en un frasco de Erlenmeyer de 2-L, crecieron a 35°C en un agitador a 250 rpm hasta un ODS50 de aproximadamente 1.0 fue logrado y usado para dar semilla en el fermentador. Los siguientes componentes fueron esterilizados juntos en el recipiente fermentador: 45 g KH2P04, 12 g de monohidrato de ácido cítrico, 12 g de gS04.7H20, 30 g de extracto de levadura, 1.8 g de citrato de amonio férrico, 5 mL de Mazu DF204 como antiespumante, 1.2 g de CaCl2.2H20, 7.2 mL de ácido sulfúrico y 60 mL de una solución de elemento de traza. Después de la esterilización, el pH fue elevado a 6.8 con 20-28% NH4OH y se agregaron los siguientes componentes: 0.30 g de espectinomicina, y glucosa (de un 67% en peso de alimentación) . La solución de elementos de traza contenía (g/L): ácido cítrico. H20 (4.0), nS04.H20 (3.0), NaCl (1.0), FeS04.7H20 (0.10), CoCl2.6H20 (0.10), ZnS04.7H20 (0.10), CuS04.5H20 (0.010), H3BO3 (0.010), y Na2Mo0 .2H20 (0.010). Después de la inoculación, el volumen fue 6.0 L y la concentración de glucosa fue 10 g/L. Un fermentador de tanque agitado 15-L fue preparado con el medio descrito arriba. La temperatura fue controlada a 34 °C y el amoniaco acuoso (20-28 % peso) fue usado para controlar el pH en 6.8. El oxígeno disuelto (DO) de control fue puesto a 10% y la contra presión fue controlada a 0.5 bar. Excepto para excursiones menores, la glucosa fue mantenida entre 10 g/1 y 25 g/L con un 67% (peso) alimentado. Una adición de 10 mg de vitamina Bi2 fue hecha en 10 h de tiempo de fermentación transcurrido y una co-alimentación (2.64 tng/h de una solución de 0.0167 mg/mL) inició una hora después. Una titulación de 99 g/L de 1 , 3 -propanodiol fue obtenida después de 64h. Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la practica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un polinucleótido aislado o recombinante caracterizado porque comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una variante de isomerasa de glucosa Strepto-nyces lividins, la secuencia de ácido nucleico comprende cualquiera de SEQ ID NO: 9-28.
2. 2. Un polinucleótido aislado o recombinante caracterizado porque comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una variante de isomerasa de glucosa Streptoínyces lividins, la secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 9-28.
3. 3. Una colección de polinucleótidos aislados o recombinantes caracterizado porque comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una variante de isomerasa de glucosa de Streptomyces lividins, la colección comprende las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO: 9-28.
4. 4. Un cásete de expresión caracterizado porque comprende el polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una variante de isomerasa de glucosa de Streptomyces lividins de la reivindicación 1.
5. 5. Un kit caracterizado porque comprende el polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una variante de isomerasa de glucosa de Streptomyces lividins de la reivindicación 1.
6. 6. Un constructo de ADN caracterizado porque comprende por lo menos tres terminadores transcripcionales y por lo menos un sitio de clonación situado entre cualquiera de dos terminadores transcripcionales .
7. 7. El constructo de ADN de la reivindicación 6 caracterizado porque los terminadores transcripcionales son tonB, thrA o aspA, y los sitios de clonación son seleccionados del grupo que consiste de Avrll, Nhel, Bfal, Cac8I, BsaJI, y Styl.
8. 8. Una colección de constructos de ADN, cada uno de los constructos de ADN caracterizado porque comprende por lo menos tres terminadores transcripcionales y por lo menos un sitio de clonación situado entre cualquiera de dos terminadores transcripcionales .
9. 9. Un constructo de ADN caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de a) Un plásmido pSYCO109mcs que consiste de SEQ ID NO: 30, b) Un constructo de ADN para el promotor GI 1.5 corto que consiste de SEQ ID NO: 31, c) Un constructo de ADN para el promotor GI 1.20 corto que consiste de SEQ ID NO: 32, d) Un constructo de ADN para el plásmido de pAH105 que consiste de SEQ ID NO: 70, e) Un constructo de ADN para el plásmido pSYCOlOl que consiste de SEQ ID NO: 71, f) Un constructo de ADN para el plásmido pSYCO103 que consiste de SEQ ID NO: 72, g) Un constructo de ADN para el plásmido pSYCO106 que consiste de SEQ ID NO: 73, h) Un constructo de ADN para el plásmido pSYCO109 que consiste de SEQ ID NO: 74, i) Un constructo de ADN para el plásmido pSYCO106mcs que consiste de SEQ ID NO: 78, y j) Un constructo de ADN para el plásmido pRJ50 que consiste de SEQ ID NO: 79.
10. 10. Un vector caracterizado porque tiene un sitio de clonación múltiple que contiene secuencias de sitio de reconocimiento de restricción específicas para las endonucleasas de restricción AscI, Nhel, Pací, RsrII, Nsil, SacII, MluI, Agel, SapI y SnaBI .
11. 11. El vector de la reivindicación 10 caracterizado porque el sitio de clonación múltiple tiene la secuencia de nucleotido de SEQ ID NO: 77.
12. 12. Una célula hospedadora transformada caracterizado porque comprende el polinucleótido que codifica una variante de isomerasa de glucosa de Streptomyces lividins, de la reivindicación 1 ó reivindicación 9.
13. 13. La célula hospedadora transformada de la reivindicación 12 caracterizada porque la célula hospedadora es RJ8n.