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MARCADO SELECTIVO DE VASCÜLATURA TUMORAL UTILIZANDO
MOLÉCULAS DE ANTICUERPO
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se relaciona con el marcado de vasculatura tumoral utilizando moléculas de anticuerpo En particular, la invención se relaciona con el uso de moléculas de anticuerpo que unen ED-B o fibronectina y las cuales han demostrado ser útiles en el marcado de tumores En diferentes modalidades de la presente invención se utilizan moléculas de anticuerpo en diferentes formatos moleculares En algunas modalidades las moléculas de anticuerpo comprenden IgGl humana En otras modalidades las moléculas de anticuerpo son miniinmunoglobulmas tales como aquellas generadas por fusión de una molécula de anticuerpo scFv para el dominio CH4 constante de una isoforma IgE secretora que contiene naturalmente una cisteína en su parte COOH terminal la cual forma un dímero unido covalentemente La velocidad de depuración en sangre la estabilidad in vivo y otras propiedades venta]osas se utilizan en diferentes aspectos y modalidades de la invención por ejemplo en el marcado de tumores El comportamiento diferente m vivo de los diferentes formatos de molécula de anticuerpo se puede aprovechar para diferentes propósitos de diagnóstico o terapéuticos dependiendo de las necesidades clínicas y la enfermedad Pese a su enorme potencial como agentes terapéuticos los anticuerpos monoclonales (mAb) de origen no humano se han utilizado poco en pruebas clínicas como resultado de su inmunogenicidad (1 Shawlert et al 1985 2 Miller et al 1983) propiedades farmacocinéticas pobres (3 Hakimi et al 1991 4 Stephens et al 1995) e ineficiencia en reclutar funciones efectoras (5 Rj.echmann et al 1988 6 Junghens et al 1990) El prospecto reciente de aislar fragmentos de anticuerpo humano de bibliotecas de presentación de fagos (7 McCafferty et al 1990 8 Lowman et al , 1991 para revisiones véase 9 Nilsonn et al 200 y 10 Winter et al 1994) transciende estos problemas revitalizando los estudios y proporcionando esperanzas nuevas de la utilización ae estos reactivos para tratar enfermedades mayores En realidad estas moléculas deben servir como bloques de construcción ideales para herramientas novedosas de diagnóstico y terapéuticas (11 Reichert 2001 12 Huís et al 1999) Además estos anticuerpos pueden ser "maduros" para alcanzar afinidades en el intervalo picomolar (13 Pini et al 1998) por lo menos deseable si no necesario para su uso clínico Las aplicaciones clínicas de fragmentos de anticuerpo humano para el suministro selectivo de agentes de diagnóstico o terapéuticos no obstante requiere objetivos altamente específicos En el caso de tumores los objetivos más populares son antígenos en la superficie celular los cuales habitualmente no son ni abundantes ni estables No obstante durante el progreso del tumor el microambiente que rodea a las células tumorales experimenta una modificación extensa que genera un "ambiente tumoral" el cual representa un objetivo para el tratamiento tumoral basado en anticuerpos (14 Neri and Zardi 1998) De hecho el concepto de que el microambiente alterado por el tumor en sí mismo es carcinógeno y que puede ser marcado cada vez adquiere mayor aceptación Las moléculas que son capaces de suministrar eficazmente agentes terapéuticos al microambiente tumoral de esta manera representan herramientas nuevas promisorias e importantes para el tratamiento del cáncer (15 Bissel 2001, 14 Neri and Zardi 1998) La fibronectina (FN) es un componente de matriz extracelular (ECM) que se expresa ampliamente en aiversos tejidos normales y fluidos corporales Se pueden generar diferentes isoformas de FN por el empalme alternativo de pre-ARNm para FN, un procedimiento que es modulado por citocinas y el pH extracelular (16 Balza et al 1988 17 Carnemolla et al 1989 18 Borsi et al 1990 19 Borsi et al 1995) La secuencia repetida completa tipo III ED-B también conocida como la secuencia repetida extratipo III B (EIIIB) puede ser incluida u omitida por completo en la molécula de FN (20 Zardi et al 1987) ED-B está altamente conservada en diferentes especies tiene 100% de homología en todos los mamíferos estudiados hasta ahora (humano rata ratón perro) y 96% de homología con un domino similar en pollo La isoforma FN que contiene ED-B (B-FN) es indetectable ínmunohistoquímicamente en tejidos adultos normales con la excepción de tejidos que experimentan remodelación fisiológica (por ejemplo endometrio y ovario) y durante el sanado de heridas (17 Carnemolla et al 1989 21 ffrench-Constant, et al 1989) En contraste su expresión en tumores y tejidos fetales es elevada (17 Carnemolla et al 1989) Además se ha demostrado que B-FN es un marcador de angiogénesis (22 Castellani et al 1994) y que las células endoteliales que invaden tejidos tumorales migran a lo largo de fibras EC que contienen B-FN (23 Tarli et al 1999) El marcado selectivo de vasculatura tumoral se ha descrito utilizando un anticuerpo recombinante humano scFv(L19) (13 Pini et al , 98) , específico para la isoforma B-FN (24 Carnemolla et al 1996 23 Tarli et al 99 25 Viti et al 99 26 Neri et al 97 27 Demartis et al 2001) Se puede utilizar el anticuerpo en soluciones tanto de diagnóstico ín vivo (mmunocintigrafía) como en soluciones terapéuticas que implican la administración selectiva de radionúclidos terapéuticos o agentes tóxicos a vasculatura tumoral Además Birchler et al (28 1999) demostraron que scFv(L19) acoplado químicamente a un fotosensibilizador se acumula selectivamente en vasos sanguíneos recién formados del modelo de córnea de conejo angiogénica y después de irradiación con luz infrarroja cercana media la oclusión completa y selectiva de la neovasculatura ocular Mas recientemente Nilsson et al (29 2001) reportaron que el inmunoconjugado de scFv(L19) con el dominio extracelular de factor tisular media el infarto selectivo en diferentes tipos de modelo de tumor murmo Además las proteínas de fusión de scFv(L19) e IL-2 o IL-12 han demostrado una eficacia terapéutica mejorada de estas dos citocinas (30 Halm et al emitido 31 Carnemolla et al 2002) Véase también WO01/62298 para uso de fusiones en tratamiento de lesiones de angiogénesis patológica que incluyen tumores Finalmente dado que L19 reacciona igual de bien con ED-B de ratón y humano se puede utilizar para estudios preclínicos y clínicos Véanse también PCT/GB97/01412 PCT/EP99/03210
PCT/EP01/02062 y PCT/IB01/00382 Formatos de anticuerpos diferentes han demostrado un comportamiento diverso en términos de la estabilidad m vivo depuración y funcionamiento en el marcador tumoral (32 Wu et al 2000) La miniinmunoglobulma o la inmunoproteína pequeña (SIP) se describen en (33 Li et al 1997) La presente invención se basa en la preparación caracterización e investigación de la biodistribución m vivo de moléculas de anticuerpo humanas L19 en diferentes formatos específicamente scFv miniinmunoglobulma e IgGl completa
DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS
La figura 1 muestra modelos que ilustran las estructuras de proteínas diferentes A Modelo de la estructura de dominio de una subunidad FN Las secuencias de proteína que experimentan empalme alternativo se indican en gris Como se ha indicado el epítopo del anticuerpo recombmante L19 se localiza dentro de la secuencia repetida ED-B B - D Esquemas de los constructos (plásmidos recombinantes) utilizados para expresar respectivamente L19 (scFv) (B) L19-SIP (C) y L19-IgGl/K La figura 2 muestra las curvas de crecimiento de tumor SK-MEL-28 en ratones atímicos (triángulos) y de tumor F9 en la cepa en ratones 129 (círculos) Se gráfica el volumen (mm3) versus en tiempo (días) Cada punto de datos es el promedio de 6 ratones ± SD (desviación estándar) La figura 3 muestra los resultados de cromatografía por exclusión de tamaño en los diferentes formatos L19 En los paneles A B y C se muestra perfiles de cromatografía de exclusión por tamaño (Superdex 200) de los formatos L19 de scFv, miniinmunoglobulina e IgGl respectivamente después de radioyodado Los paneles D E y F muestran los perfiles de cromatografía de exclusión por tamaño (Superdex 200) de plasma en los tiempos indicados después de inyección i v de los formatos L19 radioyodados scFv miniinmunoglobulma e IgGl respectivamente No se detectaron cambios en los perfiles de curva de L19-SIP o L19-IgGl cuando se cargaba plasma en momentos diferentes después de la inyección mientras que 3h después ae la inyección de L19(scFv)2, se observa un segundo pico de masa molecular superior La figura 4 muestra los resultados ae experimentos de biodistribución en ratones que presentan tumores SK-MEL-28 utilizando diferentes formatos de moléculas de anticuerpo L19 radioyodadas Se presentan las variaciones de -íID/g en 4A) y en la sangre indicados después de inyección grafican las proporciones de curvas de L19(scFv) se indican por rombos de L19 miniinmunoglobulina por cuadros y de L19 IgGl por triángulos La figura 5 muestra resultados de experimentos de biodistnbución en ratones que presentan el tumo F9 utilizando L19(scFv) radioyodado (cuadros) y L19 miniimunoglobulina (rombos) Las variaciones de %ID/g en el tumor (A) y en la sangre (B) , en los tiempos diferentes indicados después de inyección i v son los que se reportan En un aspecto la presente invención proporciona un miembro de unión específico el cual une ED-B humana ae fibronectma y el cual comprende el dominio VH de L19 y un dominio VL opcionalmente el dominio VL de L19 y en aonde el miembro de unión específico comprende una miniinmunoglobulina que comprende el dominio W de anticuerpo y el domino VL de anticuerpo fusionados a cS2-CH4 y dimerizados o que comprenden una molécula de anticuerpo IgGl completa Las secuencias del dominio VH de L19 y del dominio VL de L19 se establecen en Pini et al (1998) J Biol Chem 273 21769-21776 dichas secuencias se incorporan por completo en este documento con referencia a Pini et al como se establece aquí De manera general , un dominio VH es panado con un dominio VL para proporcionar un sitio que une antígeno en un anticuerpo En una modalidad preferida el dominio VH de L19 es panado con un dominio VL de L19 de manera que se forma un sitio de unión de antígeno en el anticuerpo, que comprende los dominios tanto VH como VL de L19 En otras modalidades, el VH de L19 se parea con un dominio VL diferente de VL de L19 La promiscuidad de la cadena ligera ha sido bien establecida en la técnica Se pueden tomar uno o más CDR del dominio VH o VL de L19 y se pueden incorporar en una estructura principal adecuada Esto se discute adicionalmente después CDR 1 2 y 3 de VH de L19 se muestran en la SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO 1 2 y 3 respectivamente Los CDR 1 2 y 3 de VL de L19 se muestran en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS 1 2 y 3 respectivamente Las variantes de los dominios VH y VL y los CDR de los cuales se establecen secuencias en la presente y los cuales pueden ser utilizados en miembros de unión específicos para ED-B se pueden obtener por medio de métodos de alteración de secuencia o mutación y cribaao Las variantes de secuencia de aminoácidos de dominio variable de cualquiera de los dominios VH y VL cuyas secuencias se describen específicamente en la presente se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención como se discute Las variantes particulares pueden incluir uno o más alteraciones en la secuencia ae aminoácidos (adición supresión sustitución o inserción de residuos aminoácidos) que puede ser menor de aproximadamente 20 alteraciones menor de aproximadamente 15 alteraciones, menor de aproximadamente 10 alteraciones o menor de aproximadamente 5 alteraciones 4 3 2 ó 1 Las alteraciones pueden realizarse en una o más regiones de estructura principal o en uno o más de los CDR Un miembro de unión específico de acuerdo con la invención puede ser aquel que compita por la unión a antígeno con un miembro de unión específico el cual una tanto ED-B y comprende un sitio de unión a antígeno formado por el dominio VH de L19 y el dominio VL de L19 La competencia entre los miembros de unión se puede ensayar fácilmente m vi tro por ejemplo utilizando ELISA o por marcado de una molécula indicadora específica a un miembro de unión el cual se puede detectar en presencia de uno o varios miembros de unión no marcados para permitir la identificación de miembros de unión específicos los cuales unen el mismo epítopo o un epítopo que se superponga De esta manera, los aspectos adicionales de la presente invención utilizan un sitio que una antígeno ae un anticuerpo humano el cual compite con L19 por la unión a ED-B Un miembro de unión específico de acuerdo con la presente invención puede unir ED-B con por lo menos la afinidad de L19 afinidad de unión de miembros de unión específicos diferentes que se comparan bajo condiciones apropiadas Además de las secuencias de anticuerpo un miembro de unión específico de acuerdo con la presente invención puede comprender otros aminoácidos por ejemplo que formen un péptido o polipéptido tal como un dominio plegado (naturalizado) o para impartir a la molécula otra característica funcional además de la capacidad de unir antígeno Loa miembros de unión específicos de la invención pueden presentar una etiqueta detectable o pueden estar conjugados a una toxina o enzima (por ejemplo vía un enlace peptidilo o enlazante) En el tratamiento de desórdenes o lesiones de angiogénesis patológica un miembro de unión específico de la invención se puede conjugar a una molécula tóxica por ejemplo un biocida o una molécula citotóxica que se puede seleccionar de interleucma-2 (IL-2) , doxorrubicina mterleucina-12 (IL-12) mterferón-? (IFN-?) , factor o¡ de necrosis tumoral (TNFa) y factor tisular (preferiblemente factor tisular truncado por ejemplo a los residuos 1-219) Véase por ejemplo O01/62298 En aspectos adicionales la invención proporciona un ácido nucleico aislado el cual comprende una secuencia que codifica para un miembro de unión específico de acuerdo con la presente invención y métodos para preparar un miembro de unión específico el cual comprende expresar el ácido nucleico bajo condiciones para llevar a cabo la producción del miembro de unión específico y recuperarlo Los miembros de unión específicos de acuerdo con la invención se pueden utilizar en un método de tratamiento o diagnóstico del cuerpo humano o animal, tal como un método de tratamiento (el cual puede incluir el tratamiento profiláctico) de una enfermedad o desorden en un paciente humano el cual comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de un miembro de unión específico de la invención Las condiciones susceptibles de tratamiento de acuerdo con la presente invención incluyen tumores especialmente tumores sólidos y otras lesiones de angiogénesis patológica que incluyen artritis reumatoide retinopatía diabética degeneración macular relacionado con la edad y angiomas Un aspecto adicional proporciona un método para producir un miembro de unión específico de la invención el método comprende provocar la expresión de un ácido nucleico codificante Tal método puede comprender cultivar células hospedadoras bajo condiciones para producción del miembro de unión específico Un método de producción puede comprender una etapa de aislamiento o purificación del producto Un método de producción puede comprender formular el producto en una composición que incluye por lo menos un componente adicional, tal como un excipiente farmacéuticamente aceptable Estos y otros aspectos de la invención se describen con detalle adicional en lo siguiente
TERMINOLOGÍA
Miembro de Unión Específico Esto describe un miembro de un par de moléculas las cuales tienen especificidad de unión entre sí Los miembros de un par de unión específico pueden ser derivados naturalmente o bien producidos sintéticamente totalmente o de manera parcial Un miembro del par de moléculas tiene un área sobre su superficie o una cavidad la cual se une específicamente y por lo tanto es complementaria con una organización particular espacial y polar del otro miembro del par de moléculas De esta manera los miembros del par tienen la propiedad de unirse específicamente entre si Los ejemplos de tipos de pares de unión específicos son antígeno-anticuerpo biotina-avidma hormona-receptor ae hormona receptor-ligando enzima-sustrato Esta solicitud se relaciona con las reacciones de tipo de antígeno-anticuerpo
Molécula de Anticuerpo Esto describe una mmunoglobulma producida de manera natural o bien de manera sintética parcial o completamente El término también abarca cualcruier polipéptido o proteina que comprende un dominio de unión de anticuerpo Los fragmentos de anticuerpo los cuales comprenden un dominio de unión de antígeno son tales como Fab scFv Fv dAb Fd y diacuerpos (diabodies) La presente invención está relaciona con moléculas ae anticuerpo IgGl completas y miniinmunoglobulmas que comprenden cS2-CH4 como se describe Se pueden utilizar técnicas de tecnología ae ADN recombinante para producir a partir de una molécula de anticuerpo inicial otras moléculas de anticuerpo que retengan la especificidad de la molécula de anticuerpo original Tales técnicas pueden involucrar introducir ADN que codifique para la región variable de mmunoglobul a o las regiones determmadoras de complementariedad (CDR) de un anticuerpo a las regiones constantes, o regiones constantes más regiones de infraestructura ae una inmunoglobulina diferente Véanse por ejemplo EP-A-184187 GB 2188638A o EP-A-239400 Dado que los anticuerpos pueden ser modificados de muchas maneras se debe considerar que el término "molécula de anticuerpo" cubre a cualquier miembro de unión específico o sustancia que tenga un dominio que se una a antígeno de anticuerpo con la especificidad requerida Por lo tanto, este término abarca fragmentos de anticuerpo y derivados incluye a cualquier polipéptido que comprenda un dominio de unión de antígeno a mmunoglobulina ya sea natural o sintético total o parcialmente Por lo tanto se incluyen moléculas quiméricas (recombinantes) que comprenden un dominio de unión a mmunoglobulina o equivalente fusionado a otro polipéptido La clonación y expresión de anticuerpos quiméricos se describen en los documentos EP-A-0120694 EP-A-0125023
Dominios de Unión a Antígeno Esto describe la parte de una molécula de anticuerpo que comprende el área a la cual se une específicamente y que es complementaria a una parte o la totalidad de un antígeno Cuando un antígeno es grande un anticuerpo se puede unir únicamente a una parte esDecifica del antígeno parte la cual se denomina un epítopo Se puede proporcionar un dominio de unión a antígeno mediante uno o más dominios variables de anticuerpo (por ejemplo lo que se denomina un fragmento de anticuerpo Fd que consiste de un dominio VH) Preferiblemente un dominio de unión de antígeno comprende una región variable de cadena ligera
(VL) de anticuerpo y una región variable de cadena pesada
(VH) de anticuerpo
Específico Esto se puede utilizar para hacer referencia a la situación en la cual un miembro de un par de unión específico no mostrará ninguna unión significativa a moléculas diferentes de sus asociados de unión específicos El término también es aplicable por ejemplo cuando un dominio de unión a antígeno es específico para un epítopo particular el cual se encuentra en muchos antígenos en cuyo caso el miembro de unión específico que presenta el dominio de unión a antígeno será capaz de unirse a los diversos antígenos que presenten el epítopo
Comprende Esto se utiliza generalmente en el sentido de incluir es decir permitir la presencia de una o más características o componente Aislado Se refiere al estado en el cual los miembros de unión específicos de la invención o el ácido nucleico que codifica para tales miembros de unión generalmente estarán de acuerdo con la presente invención Los miembros y el acido nucleico estarán libres o sustancialmente libres de material con el cual están asociados de manera natural tales como otros polipéptidos o ácidos nucleicos con los cuales se encuentran en su ambiente natural, o el ambiente en el cual se preparan (por ejemplo un cultivo celular) cuando tal preparación es por tecnología de ADN recombmante que se practica in vitro o ín vivo Los miembros y el ácido nucleico se pueden formular con diluyentes o adyuvantes y aún así para propósitos prácticos están aislados -por ejemplo los miembros normalmente se mezclarán con gelatina u otros portadores si se utiliza para recubrir placas de microtitulación para uso en inmunoensayos o se mezclarán con portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables cuando se utilicen en diagnóstico o tratamiento Los miembros de unión específicos pueden estar glucosilados, ya sea naturalmente o por sistemas de células eucarióticas heterólogas (por ejemplo células CHO o NSO (ECACC 85110503) o pueden estar no glucosilados (por ejemplo si se producen por expresión en una célula procariótica) Mediante el término " sustancialmente como se establece" se quiere significar que el dominio VF o VL de las CDR relevantes de la invención serán idénticos o altamente similares a las regiones especificadas de las cuales se establece en la presente la secuencia Por "altamente similar" se contempla que se realicen sustituciones de 1 a 5 preferiblemente de 1 a 4 tal como 1 a 3 o l ó 2 ó 3 6 4, en la CDR o el dominio VH o VL La estructura para transportar una CDR de la invención generalmente será de una secuencia de cadena pesada o ligera de anticuerpo o una porción sustancial de la misma en la cual la CDR se localiza en un lugar que corresponde a la CDR de un dominio variable de anticuerpo VH y VL que se presenta de manera natural codificado por genes de inmunoglobulina redistribuidos Las estructuras y ubicaciones de los dominios variables de inmunoglobulina se pueden determinar con referencia a (Kabat E A et al Seguences of Proteins of Immunological Interest 5th edición US Department of Health and Human Services 1991 y actualizaciones de la misma ahora disponibles en la Internet (http //ímmuno bme-nwu edu or fmd "Kaíjat" utilizando cualquier motor de búsqueda) Preferiblemente una secuencia de aminoácidos de CDR sustancialmente como se establece en la presente es transportada como una CDR en un dominio variable humano o una porción sustancial del mismo Las secuencias CDR3 de VH de L19 o las secuencias CDR3 de VL de L19 sustancialmente como se establece en la presente se pueden utilizar en modalidades preferidas de la presente invención y se prefiere que cada una de estas se presente como una CDR3 en un dominio variable de cadena pesada o ligera humana según sea el caso o una porción sustancial de la misma Una porción sustancial de un dominio variable de mmunoglobulina comprenderá por lo menos tres regiones de CDR juntas con sus regiones de infraestructura interpuestas Preferiblemente la porción también incluirá por lo menos aproximadamente 50% ya sea de cualquiera o ambos de la primera y cuarta regiones de infraestructura el 50-- es el 50s- de la parte C terminal de la primera región de infraestructura y el 50- de la parte N terminal de la cuarta región de infraestructura Los resiauos adicionales en el extremo N terminal o C terminal de la parte sustancial del dominio variable pueden ser aquellos que normalmente no se asocian con regiones de dominio variable que se presentan de manera natural Por ejemplo una construcción de miembros de unión específicos de la presente invención realizada por técnicas de ADN recombinante puede resultar en la introducción de residuos de la parte N o C terminal por enlazantes introducíaos para facilitar la clonación u otras etapas de manipulación Otras etapas de manipulación incluyen la introducción de enlazantes para unir dominios variables de la invención a secuencias de proteína adicionales que incluyen cadenas pesadas de inmunoglobulina otros dominios variables o en etiquetas de proteína como se discute con mayor detalle en lo siguiente En una molécula de anticuerpo IgGl de acuerdo con la presente invención los dominios VL se pueden unir en el extremo C terminal a los dominios constantes de cadena ligera de anticuerpo que incluyen las cadenas CK o CX humana, preferiblemente las cadenas CK Los miembros de unión específicos de la invención se pueden etiquetar con una etiqueta detectable o funcional Las etiquetas detectables se describen en lo siguiente e incluyen radioetiquetas tales como radioisótopos de tecnecio indio itrio cobre lutecio o remo en particular 9 BTc "Te 186Re i88Re mIn 86Y 88Y 1 7Lu 64Cu y 67Cu los cuales se pueden unir a anticuerpos de la invención utilizando química convencional conociaa en la técnica de formación de imágenes por anticuerpos como se describe en la presente Las etiquetas también incluyen etiquetas de enzimas tales como peroxidasa de rábano Las etiquetas incluyen además porciones químicas tales como biotma las cuales se pueden detectar vía unión a una porción detectable semejante específica por ejemplo aviaina etiquetada Los miembros de unión específicos (L19-SIP) descritos en la presente son particularmente adecuados para el radio etiquetado con isótopos tales como 94mTc """Te 186Re 188Re 203Pb, e7Ga, 68Ga, 3Sc 47Sc, 110mln, "^n 97Ru "Cu 64Cu, 67Cu, 68Cu 86Y, 88Y, 90Y 121Sn 161Tb 153Sm l6SHo 105Rh 17Lu 72Lu y 18F y el uso subsecuente en radiodiagnóstico y radioterapia El radioisótopo preferido particularmente es 99mTc para etiquetado y un protocolo adecuado se describe en la sección experimental siguiente Para radioetiquetar directamente los miembros ae unión específicos las moléculas de cisteína que forman puentes primero se reducen por un agente reductor apropiado por ejemplo cloruro estanoso (II) La tris(2-carboxietil) fosfina (TCEP) genera grupos SH de cisteína libres que pueden reaccionar con isótopos por ejemplo Te o Re En este procedimiento particular los permetalatos obtenidos a partir del sistema generador actual se reaucen por un agente reductor, por ejemplo cloruro estanoso (II) en presencia de un ligando auxiliar por ejemplo tartrato de sodio y API (los detalles se proporcionan en lo siguiente en la sección experimental) Se puede realizar etiquetado indirecto por ejemplo con indio, itrio, lantánidos o tecnecio o remo al conjugar previamente un ligando quelante preferiblemente derivado de ácido etilendiaminatetraacético (EDTA) ácido dietilentriaminapentaacético (DTPA) ácido ciclohexil 1 2-diaminatetraacético (CDTA) ácido etilenglicol-0 0'-bis(2-aminoetil) -N N ?· N'-diacético (HBED) , áciao trietilentetraaminahexaacético (TTHA) ácido
1 4 7 10 tetraazaciclododecano N ?' 1 1 ' - tetraacético (DOTA) ácido 1 4 7-tnazaciclononano-N N 1 N 1 ' -triacético (NOTA) ácido 1 4 8, 11-tetraazaciclotetradecano-N N' N1 ' N' ' 1 -tetraacético (TETA) mercaptoacetildiglicina (MAG2) mercaptoacetiltriglicina (MAG3) mercaptoacetilglicilcisteína (MAGC) cisteinilglicilcisteína (CGC) a ya sea los grupos amina o tiol de un miembro de unión específico Los ligandos guelantes poseen un grupo acoplante adecuado por ejemplo ásteres activos maleimidas, tiocarbamatos o porciones acetamida or halogenadas Para conjugación de ligandos quelantes a grupos amina por ejemplo grupos e-??2 ae residuos lisina no se requiere la reducción previa ael compuesto L-19-SIP Los miembros de unión específicos de la presente invención se diseñan para ser utilizados en métodos de diagnóstico o tratamiento en sujetos animales o humanos preferiblemente humanos En consecuencia los aspectos adicionales de la invención proporcionan métodos de tratamiento que comprenden la administración de un miembro de unión específico como se proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden tal miembro de unión específico y el uso de tal miembro de unión específico en la elaboración de un medicamento para administración por ejemplo en un método para producir un medicamento o composición farmacéutica que comprende formular el miembro de unión específico con un excipiente farmacéuticamente aceptable Las indicaciones clínicas en las cuales se puede utilizar un miembro de unión específico de la invención para proporcionar beneficio terapéutico incluyen tumores tales como cualquier tumor sólido también otras lesiones de angiogénesis patológica que incluyen artritis reumatoide retinopatía diabética, degeneración macular relacionada con la edad y angiomas Los miembros de unión específicos de acuerdo con la invención se pueden utilizar en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal tal como un métoao de tratamiento (el cual puede incluir tratamiento profiláctico) de una enfermedad o desorden en un paciente humano que comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de un miembro de unión específico de la invención Las condiciones susceptibles de tratamiento de acuerdo con - -
la presente invención se discuten en otra parte de este documento En consecuencia los aspectos adicionales de la invención proporcionan método de tratamiento que comprenden la administración de un miembro de unión específico como se proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden tal miembro de unión específico y uso de tal miembro de unión específico en la elaboración de un medicamento para administración, por ejemplo en un método para elaborar un medicamento o una composición farmacéutica que comprende formular el miembro de unión específico con un excipiente farmacéu icamente aceptable De acuerdo con la presente invención las composiciones que se proporcionan se pueden administrar a los individuos La administración preferiblemente es en una "cantidad terapéuticamente eficaz", esto es suficiente para demostrar beneficio a un paciente Tal beneficio puede ser por lo menos una disminución de por lo menos un síntoma La cantidad real administrada así como la tasa y el curso en el tiempo de dicha administración dependerán de la naturaleza y gravedad de aquello que se quiere tratar La prescripción del tratamiento, por e emplo las decisiones sobre la dosificación etcétera, están dentro de la responsabilidad de los practicantes generales y otros doctores en medicina Las dosis apropiadas de anticuerpos son bien conocidas en la técnica véase Ledermann J A et al (1991) Int J Cáncer 47 659-664 Bagshawe K D et al (1991) Antibody Immunoconjugates and
Radiophartnaceuticals 4 915-922 Se puede administrar una composición sola o combinada con otros tratamientos de manera simultánea o secuencial dependiendo de la condición que se va a tratar
Los miembros de unión específicos de la presente invención que incluyen a aquellos que comprenden un dominio de anticuerpo que une antígeno se pueden administrar a un paciente en necesidad de tratamiento por medio de cualquier vía adecuada habitualmente por inyección en la corriente sanguínea o directamente en el sitio que va a ser tratado por ejemplo en tumor La aosis precisa dependerá de muchos factores la vía ae tratamiento el tamaño y ubicación del área que se va a tratar (por ejemplo tumor) la naturaleza precisa del anticuerpo (es decir una molécula de anticuerpo IgGl completa una molécula de inmunoglobulina) y la naturaleza de cualquier etiqueta detectable u otra molécula unida a la molécula de anticuerpo Una dosis típica de anticuerpo estará en el intervalo de 10-50 mg Esta es una dosis para un tratamiento único ae un paciente adulto, la cual se puede ajustar de manera proporcional para niños y lactantes y también se puede ajustar para otros formatos de anticuerpo en proporción al peso molecular Los tratamientos se pueden repetir diariamente dos veces a la semana semanalmente o a intervalos mensuales a criterio del médico Los miembros de unión específicos de la presente invención habitualmente se administrarán en forma de una composición farmacéutica la cual puede comprender por lo menos un componente además del miembro de unión específico De esta manera las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención y para uso de acuerdo con la presente invención pueden comprende además del ingrediente activo un excipiente portador amortiguador estabilizante u otros materiales farmacéuticamente aceptables bien conocidos por los expertos en la técnica Tales materiales deben ser no tóxicos y no deben interferir con la eficacia del ingrediente activo La naturaleza precisa del portador u otro material dependerá de la vía de administración la cual puede ser oral, o por inyección por ejemplo intravenosa Para inyección intravenosa o inyección el sitio de enfermedad el ingrediente activo estará en forma ae una solución acuosa parenteralmente aceptable la cual está libre de pirógeno y tiene un pH isotonicidad y estabilidad adecuada Aquellos con habilidad en la técnica serán capaces de preparar soluciones adecuadas utilizando por ejemplo vehículos isotónicos tales como inyección de cloruro de sodio inyección de solución inger inyección de solución Rmger lactada Se pueden incluir según se requiera conservadores estabilizantes amortiguadores antioxidantes u otros aditivos Una composición se puede administrar sola o en combinación con otros tratamientos ya sea simultánea o secuencialmente en base en la condición que se va a tratar Otros tratamientos pueden incluir la administración de dosis adecuadas de medicamentos para alivio de dolor tales como medicamentos antiinflamatorios no esteroio.es (por ejemplo aspirina paracetamol íbuprofeno o quetoprofeno) u opiáceos tales como formina o antieméticos La presente invención proporciona un métoao que comprende provocar o permitir la unión de un miembro de unión específico según se proporciona en la presente a ED-B Como se ha indicado tal unión se puede llevar a cabo m vivo por ejemplo después de la administración de un miembro de unión específica o ácido nucleico que codifica para un miembro de unión específico o se puede llevar a cabo in vi tro por ejemplo en ELISA transferencia Western ínmunocitoquimica mmunoprecipitación o cromatografía de afinidad Se puede determinar la cantidad de unión del miembro de unión específico para ED-B La cuantificación se puede relacionar con la cantidad de antígeno en una muestra de prueba la cual puede ser de interés diagnóstico la cual puede ser de interés diagnóstico Las reactividades de anticuerpos en una muestra se pueden determinar por cualquier medio apropiado El radioinmunoensayo (RIA) es una posibilidad El antígeno etiquetado radioactivo se mezcla con antígeno no etiquetado (la muestra de prueba) y se permite que se una al anticuerpo El antígeno unido está separado físicamente del antígeno no unido y se determina la cantidad de antígeno radioactivo unido al anticuerpo Cuanto mayor sea el antígeno que está unido en la muestra de prueba menor antígeno radioactivo se unirá al anticuerpo También se puede utilizar un ensayo de unión competitivo con un antígeno no radioactivo utilizando antígeno o un análogo unido a una molécula indicadora La molécula indicadora puede ser un fluorocromo, fósforo o un colorante láser con características de absorción o emisión aisladas espectrales Los fluorocromos adecuados incluyen fluoresceína rodamina ficoeritrina y ro]o de Texas Los colorantes cromogénicos adecuados incluyen diaminobencidma Otros indicadores incluyen partículas coloidales macromoleculares o material particulado tal como esfera de látex que están coloreadas que son magnéticas o paramagné icas y agentes biológica o químicamente activos que pueden provocar directa o indirectamente, señales detectables que van a ser observadas visualmente detectadas electrónicamente o registradas de alguna otra manera Estas moléculas pueden ser enzimas las cuales catalizan reacciones que desarrollan o cambian colores o causan cambios en propiedades eléctricas por ejemplo Pueden ser excitables molecularmente de manera tal que las transiciones electrónicas entre estados de energía resulten en absorciones o emisiones espectrales características Pueden incluir entidades químicas utilizadas junto con biodetectores Se pueden utilizar sistemas de detección de biotina/avidina o biotina/estreptavidma y fosfatasa alcalina Las señales generadas por conjugados de anticuerpo-indicador individuales se pueden utilizar para derivar datos absolutos o relativos cuantificables ae la unión de anticuerpo relevante en las muestras (normal y prueba) La presente invención se extiende adicionalmente a un miembro de unión específico el cual compite por la unión a ED-B con cualquier miembro de unión específico el cual se une al antígeno y también comprende un dominio B que incluye una CDR con aminoácido sustancialmente como se establece en la presente, preferiblemente un dominio VH que comprende la CDR3 de VH de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO 3 La competencia entre los miembros de unión se puede determinar fácilmente m vitro por ejemplo al marcar una molécula indicadora específica a un miembro de unión el cual se puede detectar en presencia de uno o varios miembros de unión no etiquetados de manera que permiten la identificación de miembros de unión específicos los cuales unen el mismo epítopo o un epítopo superpuesto Se puede determinar la competencia por ejemplo utilizando la prueba de ELISA como se describe en Carnemolla et al (24 1996) La presente invención proporciona adicionalmente un ácido nucleico aislado que codifica para un miembro de unión específico de la presente invención El ácido nucleico puede ser ADN o ARN La presente invención también proporciona constructos (plásmidos recombinantes) en forma de plásmidos vectores cásete de secuencias de transcripción o expresión que comprende por lo menos un polinucleótido como se explica en lo anterior La presente invención también proporciona una célula hospedadora recombinante que comprende uno o más constructos como se indica antes Un ácido nucleico que codifica para un miembro de unión específico como se proporciona a sí mismo forma un aspecto de la presente - invención así como un método de producción del producto codificado método el cual comprende la expresión de un ácido nucleico codificante para el mismo La expresión se puede obtener convenientemente al cultivar bajo condiciones apropiadas células hospedadoras recombinantes que contengan el ácido nucleico Después de la producción por expresión se puede aislar o purificar un miembro de unión específico utilizando cualquier técnica apropiada y después se puede utilizar según sea apropiado Los miembros de unión específicos y las moléculas de ácido nucleico codificante y los vectores de acuerdo con la presente invención se pueden proporcionar aislados o purificados por ejemplo de su ambiente natural en forma sustancialmente pura u homogénea o en el caso del áciao nucleico, libre o sustancialmente libre de ácido nucleico o de genes de origen diferente a la secuencia que codifica para un polipéptido con la función requerida El ácido nucleico de acuerdo con la presente invención puede comprender ADN o ARN y puede ser sintético total o parcialmente La referencia a una secuencia nucleotíaica como se establece en la presente abarca una molécula de ADN con la secuencia especificada y abarca una molécula de ARN con la secuencia especificada en la cual U sustituye a T a menos que el contexto lo requiera de otra manera - -
Los sistemas para clonación y expresión de un polipéptido en una diversidad de células hospedaaoras diferentes son bien conocidos Las células hospedadoras adecuadas incluyen bacterias, células de mamífero levadura y sistemas de baculovirus Las líneas de células de mamífero disponibles en la técnica para expresión de un polipéptido heterologo incluye células de ovario de hámster chino células HeLa, células de riñon de hámster bebé células de melanoma de ratón NSO y muchos otros Un hospedador bacteriano preferido común es E coli La expresión de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo en células procarióticas tales como E coli son bien establecidas en la técnica Para una revisión véase por ejemplo, Pluckthun A Bio/Technology 9 5*5-551 (1991) La expresión en células eucanóticas en cultivo también está disponible para aquellos expertos en la técnica como una opción para producción de un miembro de unión específico véanse para revisiones recientes por ejemplo Ref E (1993) Curr Opinión Biotech 4 573-576 Tnll J J et al (1995) Curr Opinión Biotech 6 553-560 Los vectores adecuados se pueden seleccionar o construir que contengan secuencias reguladoras apropiadas que incluyan secuencias promotoras secuencias terminadoras secuencias de poliadenilación secuencias me] oradoras genes marcadores u otras secuencias según sea apropiado Los vectores pueden ser plásmidos virales por ejemplo fagos o fagemidos según sea apropiado Para detalles adicionales véase por ejemplo Molecular Cloning a Laboratory Manual 3nd edición Sambrook et al 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press Muchas técnicas conocidas y protocolos para manipulación de ácido nucleico por ejemplo en la preparación de constructos de áciao nucleico mutagénesis, secuenciado introducción de AITO en células y expresión de genes así como análisis de proteínas se describen en detalle en Current Protocola m Molecular Biology segunda edición Ausubel et al eds John Wiley & Sons 1992 Las descripciones de Sambrook et al y Ausubel et al se incorporan en la presente como referencia Por lo tanto un aspecto adicional de la presente invención proporciona una célula hospedadora que contiene ácido nucleico como se describe en la presente Un aspecto aún adicional proporciona un método que comprende intioducir dicho ácido nucleico en una célula hospedadora La introducción puede utilizar cualquier técnica disponible Para células eucarióticas las técnicas adecuadas pueden incluir transfección con fosfato de calcio DEAE-dextrano electroporación transfección mediada por liposotnas y transducción utilizando retrovirus u otros virus por ejemplo vaccinia o para células de insectos baculovirus Para células bacterianas las técnicas adecuadas pueden incluir transformación con cloruro de calcio electroporación y transfección utilizando bacteriófago La introducción puede ser seguida al provocar o permitir la expresión del ácido nucleico por ejemplo al cultivar células hospedadoras bajo condiciones para expresión del gen En una modalidad, el ácido nucleico de la invención se integra en el genoma (por ejemplo el cromosoma) de la célula hospedadora La integración se puede promover por inclusión de secuencias las cuales promueven la recombinación con un genoma de acuerdo con técnicas estándar La presente invención también proporciona un método el cual comprende utilizar un constructo como se establece en lo anterior en un sistema de expresión con el fin de expresar un miembro de unión específico o polipéptido como en lo anterior Los aspectos adicionales en las modalidades de la presente invención serán evidentes para los expertos en la técnica en base en la presente descripción incluyendo la siguiente ejemplificación experimental Todos los documentos mencionados en este documento en la especificación se incorporan en la presente como referencia EJEMPLIFICACION EXPERIMENTAL DE ASPECTOS Y MODALIDADES DE LA PRESENTE INVENCIÓN
MATERIALES Y MÉTODOS Preparación y expresión de scFv inmunoproteína pequeña
(SIP) y constructo de Iggl y scFv El scFv (L19 9)) Cfkj-gura 1A) es un fragmento de anticuerpo maduro de afinidad (Kd = 5 4 x 1011 ) dirigido específicamente contra el dominio ED-B de fibronectina (13 Pmi et al 1998) El scFv(Dl 3) (7 McCafferty et al 26 Neri et al 1997) un anticuerpo de ratón contra scFv ae lisozima de clara de huevo de gallina se utiliza como un control Estos scFv se expresan en E coli cepa HB2151 (Maxim Biotech San Francisco CA) de acuerdo con üini et al (34 1997)
Mmiinmunoglobulina Para construir el gen para la mmunoproteína pequeña L19 1C) se amplifica la secuencia de ADN que codifica para el scFv (L19) mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) utilizando P o DNA polymerase (Roche) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante con los cebadores BC-618
(gtgtgcactcggaggtgcagctgttggagtctggg - SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO 8) y BC-619 (gcctccggatttgatttccaccttggtcccttggcc - SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO 9) que contiene los sitios de restricción ApaLI y BspEI respectivamente El producto ae amplificación se inserta ApaLI/BspEI en el vector pUT-eSIP, el cual proporciona el gen para scFv con una señal de secreción, requerida para secreción de proteínas al meaio extracelular El vector pUT-eSIP se obtiene de pUT-SIP-long descrito previamente (33 Li et al 1997) después ae sustituir el dominio Y1-CH3 constante humano con el dominio CH4 de la isoforma secretora de IgE humana IgE-S2 (eS2-CF4, 35 Batista et al , 1996) CH4 es el dominio que permite la dimerización de la molécula de IgE y la isoforma eS2 contiene una cisteína en el extremo carboxitermmal el cual estabiliza al dímero IgE a través de un enlace disulfuro entre cadenas En la molécula CIP final el ScFv(L19) se conecta al dominio eS2"CH4 mediante un enlazante GGSG corto El gen SIP después se corta del plásmido pUT- SIP-L19 con enzimas de restricción ???a??? y EcoRI y se clona en el vector de expresión de mamífero pcDNA3 (Invitrogen Groningen Países Ba30s) el cual contiene el promotor de citomegalovirus (CMV) con el fin de obtener el constructo pcDNA3-L19-SIP La secuencia de ADN que codifica para scFv (DI 3) se amplifica utilizando los cebadores BC-721 (ctcgtgcactcgcaggtgcagctgcaggagtca - SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO 10) y BC-732
(ctctccggacctgtttgatctcgcgcttggt - SECUENCIA DE
IDENTIFICACIÓN NÚMERO 11) y se inserta ApaLI/BspEI en el vector pUT-eSIP El gen de DI 3-SIP después se corta de pUT-sSIP-Dl 3 con las enzimas de restricción HindIII y Eco-RI y se clona en pcDNA3 con el fin de obtener el constructo pcDNA3-Dl 3-DIP Estos constructos se utilizan para transfectar células de mieloma murino SP2/0 (ATCC, American Type Culture Collection Rockville MD E U A ) utilizando reactivo de transfección FuGENE 6 (Roche) siguiendo el protocolo para células adherentes optimizado por el zabucante Los transfectomas se hacen crecer en DMEM suplementado con FCS 10- y se seleccionan utilizando 750 pg/ml de geneticina (G418, Calbiochem, San Diego, CA)
IgGl Para preparar IgGl completa la región variable de la cadena pesada de L19 (L19-VH) junto con su secuencia de péptido de secreción se corta con HindIII y Xhol a partir de L19-pUTeSIP descrito previamente y se inserta en el vector pUC-IgGl que contiene el gen para la cadena pesada constante ?1 humano completo El gen para IgGl recombinante después se corta de pUC-IgGl-L19-VH con HmdlII y EcoRI y se clona en pcDNA3 para obtener el constructo pcDNA3-L19-IgGl Para la preparación de la cadena ligera completa de L19 se amplifica L19-VL a partir de L19-pUT-eSIP (descrito antes) por PCR utilizando los cebadores BC-696 (tggtgtgcactcggaaattgtgttgacgcagtc - SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO 12) y BC-697
(ctctcgtacgtttgatttccaccttggtcc - SECUENCIA DE
IDENTIFICACIÓN NÚMERO 13) que contienen los sitios ae restricción ApaLI y BsiWI, respectivamente Después de digestión con ApaLI y Bsi I, el producto de amplificación se inserta en el vector pUT-SEC-hCx que contiene la secuencia de señal de secreción y la secuencia de la caaena ligera constante humana El gen para la cadena ligera recombmante después se corta de pUT-SEC-hCx-L19-VL con HindIII y Xhol y se inserta en el vector de expresión de mamífero pCMV2A, derivado del vector pcDNA3 al separar el gen de resistencia a G418 para obtener el constructo pCMV2A-L19-K Se utilizan cantidades equimolares de estos constructos para someter a cotransfección células de mieloma murinas SP2/0 como se describe antes Se criban los clones seleccionados por geneticina en ELISA para determinar la capacidad para secretar mmunoglobulma quimérica y las cadenas completas pesada y ligera -
Todos los constructos de ADN se purifican utilizando el sistema Maxiprep de Qiagen (Hilden Alemania) y las secuencia de ADN de ambas cadenas de los constructos se confirman utilizando el sistema ABI PRISM (equipo ae reacción listo de secuenciado de cicloterminador de rodamma (dRhodamine Termmator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit) (Perkm Elmer Foster City CA) Todas las enzimas de restricción (RE) son de Roche Diagnostics (Milán Italia) , con la excepción de BsiWI (New England Biolabs Beverly MA) Después de digestión con RE los insertos y vectores se recuperan a partir de geles de agarosa utilizando el método de Qiaqick (Qiagen)
Purificación y control de calidad de anticuerpos Se realiza cromatografía de inmunoafmidaa para purificar los diferentes anticuerpos de acuerdo con el procedimiento descrito por Carnemolla et al (24 1996) Se utiliza ED-B conjugado a Sepharose 4B (Amersham Pharmacia Biotech Uppsala Suecia) siguiendo las instrucciones del fabricante (24 Carnemolla et al 96) y se utiliza para inmunopurificar todos los formatos de anticuerpo L19 diferentes aunque se utiliza una columna de lisozima de clara de huevo de gallina (Sigma St Louis E U A ) conjugado con sefarosa y 4B (Amersham Pharmacia) para los anticuerpos DI 3 - -
Los formatos de anticuerpo inmunopurificados L19-SIP y L19-IgGl no requieren purificación adicional y se dializan contra PBS, pH 7 4, a +4°C Dado que los scFv obtenidos a partir de cromatografía de inmunoafínidad están constituidos de dos formas monomérica y dimérica se requiere una segunda etapa de purificación como se describe por Demartis et al (27 2001) para aislar esta ultima forma Se preparan lotes de formatos de anticuerpo diferentes y se analizan utilizando SDS-PAGE bajo condiciones reductores y no reductoras inmunoistoquímica cromatografía de exclusión de tamaño (Superdex 200 Amersham Pharmacia Biotech) y experimentos de ELISA
Electroforesis en gel con dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) , ensayo inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA) , cromatografía por exclusión de tamaño e inmunoquímica Los experimentos de cribado con ELISA del medio de cultivo acondicionado se realizan de acuerao con Carnemolla et al (24 1996) Para mostrar la expresión de los diferentes formatos de anticuerpo L19 el fragmento recombinante 7B89 (24 Carnemolla et al 1996) que contiene el dominio ED-B de FN que incluye al epítopo reconocido por L19, se inmoviliza en mmunoplacas Maxisorp (Nunc, Roskilde Dinamarca) Para detectar los anticuerpos DI 3 en los experimentos de ELISA se inmoviliza lisozima de clara de huevo de gallina (Sigma) sobre placas EIA de superficie NH2 (Costar Cambridge MA) Se utiliza un anticuerpo de conejo contra IgG humana conjugaao con peroxidasa (Pierce Rockford IL) diluido de acuerdo con las recomendaciones del fabricante como anticuerpo secundario para detectar los SIP Se utiliza un anticuerpo de conejo contra IgG humana conjugado a peroxiaasa (Pierce) en el caso de IgGl Para los scFv que contienen la secuencia de etiqueta FLAG, se utiliza un anticuerpo de ratón contra anticuerpo monoclonal FLAG humano (M2 Koaak) y un anticuerpo de chivo contra anticuerpo de ratón conjugado con peroxidasa (Pierce) como anticuerpos secundario y terciario respec ivamente En todos los casos la inmunorreactividad con el antígeno inmovilizado se detecta utilizando el sustrato ABTS para peroxidasa (Roche) y se mide la absorbancia fotométrica a 405 nm Se utiliza columna de cromatografía Superdex 200 (Amersham Pharmacia) para analizar los perfiles ae filtración en gel de los anticuerpos purificados bajo condiciones nativas utilizando cromatografía líquida de proteína rápida (FPLC Amersham Pharmacia) La mmunoistoquímica sobre las diferentes secciones criostáticas de tejido se realiza como se describe por Castellani et al (22 1994) y se lleva a cabo un gradiente de 4-18% de SDS-PAGE de acuerdo con Carnemolla et al (17 1989) ba^o condiciones reductoras y no reductoras
Animales en líneas de células Se obtienen ratones atímicos (de 8 semanas de edad hembras CDl nude/nude) de Harían Italia (Correzzana Milán Italia) 129 ratones de cepa (clon SvHsd) (8-10 semanas de edad hembras) obtenido de Harían UK (Oxon, Inglaterra) Se adquieren las células de teratocarcinoma embrionario de ratón (F9) células derivadas de melanoma humano (SK-MEL-28) y células de mieloma de ratón (SP2/0) de American Type Culture Collection (Rockville MD) Para inducir tumores a los ratones atímicos se les inyecta subcutáneamente con 16 x 106 células SK-MEL-28 y a los ratones de la cepa 129 con 3 x 106 células F9 Se determina el volumen de tumor con la siguiente formula (d) xDxO 52 en donde d y D son respectivamente, las dimensiones corta y grande (en cm) del tumor medido con un calibrador El alojamiento los tratamientos y el sacrificio de los animales se lleva a cabo de acuerdo con la legislación nacional (ley Italiana No 116 del 27 de enero de 1992) respecto a la protección de animales utilizados para propósitos científicos Radioyodado de anticuerpos recombinantes El radioyodado de las proteínas se lleva a cabo siguiendo el método indirecto de Chizzonite (36 Riske et al 1991) utilizando tubos de yodado recubiertos previamente con IODO-GEN (Pierce) para activar Na125I (NEN Life Science Products Boston MA) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante En los experimentos que se reportan se utilizan 1 0 mCi de Na125I por 0 5 mg ae proteína Las moléculas radiomarcadas se separan de ~25I libre utilizando columnas PD10 (Amersham Pharmacia) pretratadas con BSA 0 2S" y equilibradas en PBS Se establece la radioactividad de las muestras utilizando un contador ? Crystal (Packard Instruments, Milán, Italia) El ensayo de inmunorreactividad de la proteína radiomarcada se realiza en una columna de Sepharose ED-B de 200 µ? saturaaa con BSA 0 25" en PBS Se aplica una cantidad conocida de anticuerpo radioyodado en 200 ?? de BSA 0 25% en PBS en la parte superior y se permite que entre en la columna La columna después se enjuaga con 1 5 mi de BSA 0 25% en PBS para separar los anticuerpos unidos de manera no específica Finalmente el material unido inmunorreaccivo se eluye utilizando 1 5 mi de TEA 0 1 M pH 11 Se realiza la cuenta de la radioactividad de los materiales no unido y unido y se calcula el porcentaje de anticuerpos - -
inmunorreactivos La inmunorreactividad siempre es superior de 90* Para analizar adicionalmente los anticuerpos radioyodados se carga una cantidad conocida de proteína radiomarcada en 200 µ?, sobre la columna Superdex 200 El volumen de retención de las diferentes proteínas no varía después del radioyodado Para los tres formatos de anticuerpo L19 radioyodados y sus controles negativos la de la columna Superdex 200
Experimentos de jbiodistnjbución Para bloquear la acumulación no específica de 12Yodo en el estómago y la concentración en tiroides 30 minutos antes de la inyección de los anticuerpos radiomarcados los ratones recibieron oralmente 20 mg de perclorato de sodio (Cario Erba Italia) en agua Esce procedimiento se repite a intervalos de 24 h durante la duración de los experimentos de biodistribución Los ratones que presentan tumores se les inyecta en la vena de la cola con 0 1 nmoles de los diferentes anticuerpos radioetiquetados (que corresponden a 6 µ? para scFv, 8 µ? para los SIP y 18 \iq para las IgG) en 100 µ? de solución salina Se sacrificaron tres animales por cada punto en el tiempo, los diferentes órganos incluyendo los tumores se extirparon, pesaron, contaron en un contador ? y después se fijaron con formaldehído 5* en PBS pH 7 4 para ser procesados para microautorradiografías , realizadas de acuerdo con Tarli et al (23 1999) Se tomaron muestras de sangre también para la preparación de plasma con el fin de determinar la estabilidad de las moléculas radiomarcadas en la corriente sanguínea utilizando la prueba de inmunorreactividad descrita ya y el análisis de filtración en gel En ambos casos se utilizaron 200 µ? de plasma El contemao radioactivo de los diferentes órganos se expresa como porcentaje de la dosis inyectada por gramo C-ID/g) Los parámetros de depuración sanguínea de los anticuerpos radioyodados se ajusta con el procedimiento de mimmización de mínimos cuadrados utilizando el programa Macintosh Kaleidagraph (Synergy Software Reading PA E ü A ) y la ecuación X (t) = A exp (-(a t) ) + B exp (-(ß t) en donde X (t) es el - ID/g del anticuerpo radiomarcado en el tiempo t Esta ecuación describe un perfil de depuración sanguínea vía exponencial, en el cual la amplitud ae la fase a se define como A x 100 / (A + B) y la amplitud de la fase de eliminación ß se define como B x 100 / (A *¦ B) or y ß son los parámetros de velocidad relacionados cor las vidas medias de las fases de depuración sanguínea correspondientes Tl/2 (fase a) = ln2/a = 0 692 /a Tl/2 fase ß = 1?2/ = 0 692 / a X(0) se supone que es igual a 40-e lo que corresponde a un volumen sanguíneo de 2 5 mi en cada ratón
RESULTADOS Preparación de anticuerpos Utilizando las regiones variables de L19 (13 PIPÍ et al 1998) los diferentes formatos de anticuerpo (scFv miniinmunoglobulina e IgGl humana completa) y su funcionamiento m vivo en vasculatura tumoral marcada La figura 1 muestra los constructos utilizados para expresar los diferentes formatos de anticuerpo L19 Se preparan conBtructos similares utilizando las regiones variables del scFv específicos para un antígeno no relevante (DI 3 7 McCafferty 26 Neri et al 1997) Para obtener los SIP e IgGl se transfectan células de mieloma murmo SP2/0 con los constructos que se muestran en la figura 1 y se seleccionan los transíectomas estables utilizando G 18 Se determinan los mejores procedimientos por medio de ELISA y estos clones se expanden para purificación de anticuerpos La purificación de la totalidad de los tres formatos de anticuerpo de L19 se basa en cromatografía de inmunoafínidad utilizando ED-B recombinante conjugado a Sepharose Los rendimientos son de aproximadamente 8 mg/1 para scFv (L19) , 10 mg/l para L19-SIP 3 mg/1 para L19-IgGl Para las proteínas control se utilizó scFv (DI 3) específicos para lisozima de huevo de gallina y al utilizar las regiones variables de scFv DI 3 se construye DI 3-SIP Estos dos anticuerpos se purifican en lisozima de huevo de gallina conjugado a Sepharose Los rendimientos son de 8 y 5 mg/1, respectivamente Como controles para L19-IgGl utilizamos IgGl/? humana disponible comercialmente (Sigma) El análisis por SDS-PAGE de los tres formatos de L19 purificados se realiza bajo condiciones reductores y no reductoras Para scFv(L19) la masa aparente es como se esperaba de aproximadamente 28 kDa bajo condiciones tanto reductoras como no reductoras (no mostrado) L19-SIP muestra una masa molecular cercana a 80 kDa na o condiciones no reductoras y tiene una masa de aproximadamente 40 kDa ba o condiciones reductoras Los resultados demuestran que más de 95- de la molécula nativa existe como un dímero unido covalentemente Como se esperaba L19-IgGl muestra una banda principal de aproximadamente 180 kDa bajo condiciones no reductoras mientras que ba o condiciones reductoras muestra aos bandas que corresponden a la cadena pesada de aproximadamente 55 kDa y la cadena ligera de aproximadamente 28 kDa Se obtuvieron perfiles de elusión de los tres formatos de anticuerpo L19 analizados por cromatografía de exclusión de tamaño (Superdex 200) En la totalidad de los tres casos se detectó un pico único con una distribución normal que representa más del 98% Utilizando una curva de calibración estándar las masas moleculares aparentes fueron de 60 kDa para scFv(L19)2 80 kDa para L19-SIP y 180 kDa para L19-IgGl Además los agregados moleculares que con frecuencia están presentes en las preparaciones de proteínas recombinantes y que pudieran invalidar los resultados obtenidos en estudios m vivo se demostraron que no se encuentran aquí Las pruebas de SDS-PAGE y cromatografía de exclusión por tamaño (Superdex 200) realizadas sobre proteínas de control purificadas proporcionan resultados similares Utilizando estos tres formatos de anticuerpos diferentes para L19 se realizó un análisis inmunoistoquímico en secciones criostáticas de melanoma humano SK-MEL-28 inducido en ratones atímicos y teratocarcmoma murino F9 inducido en ratones cepa 129 Se obtuvieron resultados óptimos a concentraciones tan bajas como 0 25-0 5 nM La totalidad de los tres anticuerpos L19 purificados reconocen estructuras idénticas
Estabilidad m vivo de los formatos de anticuerpo L19 radioetiquetados Para los estudios de biodistribución ín vivo se utilizaron melanoma humano SK-MEL-28 y teratocarcmoma murino F9 El tumor SK-MEL-28 tiene una velocidad de crecimiento relativamente lenta, mientras que el tumor F9 crece rápidamente (figura 2) Por lo tanto el uso del tumor SK-MEL-28 permite realizar experimentos de larga duración (de hasta 144 h) mientras que el tumor F9 se induce para estudios de biodistribución cortos (de hasta 48 h) Todos los experimentos de biodistribución se realizaron cuando los tumores tienen un tamaño aproximado de 0 1-0 3 cm3 Para comparación de los diversos formatos de anticuerpo se inyectaron cantidades equimolares (0 1 nmol) en 100 µ? de solución salina estéril Antes de la inyección, los compuestos radioyodados se filtraron a 0 22 im y se verificó la inmunorreactividad y el perfil de filtración en gel (véase Materiales y Métodos) La inmunorreactividad de las proteínas radioetiquetas siempre fue mayor de 90< Las figuras 3 A-C presentan los perfiles ael análisis de filtración en gel (Superdex 200) de los formatos de anticuerpo L19 radioyodados Se tomaron muestras de sangre de animales tratados en diferentes intervalos de tiempo aesae el - - momento de la inyección y se analizó la radioactividad presente en plasma para inmunorreactividad y cromatografía de filtración en gel Los perfiles de filtración en gel mostraron un pico mayor único que tiene la masa molecular de la protelna inyectada, para la totalidad de los tres formatos de anticuerpo L19 Únicamente el perfil de scFv mostró un segundo pico que tiene una masa molecular mayor lo que sugiere la formación de agregados (figura 3 D-F) Además la formación de agregados de masa molecular grande que no eluyen de la columna Superdex 200 se observa para scFv (L19)2 De hecho aunque la recuperación de la columna Superdex 200 fue de 90-100* de la radioactividad aplicada para L19-SIP y L19-IgG el rendimiento de la radioactividad cargada de scFv (L19)2 es de aproximadamente 55% La radioactividad retenida se recupera únicamente después de lavado de la columna de cromatografía con NaOH 0 5M lo que demuestra que exisclan agregados grandes que bloqueaban el filtro de la columna (tabla 1) La tabla 1 también presenta los resultados de la prueba de inmunorreactividad realizada en plasma (véanse materiales y métodos) Durante el tiempo de los experimentos L19-SIP y L19-IgGl mantuvieron la misma mmunorreactividad en plasma en comparación con los reactivos iniciales Por el contrario ya a las 3 horas - -
después de la inyección la ínmunorreactividad de scFv(i_19) se reduce a menos de 40^
Experimentos de biodistribución comparativa Las tablas 2 a, b c y la figura 4 presentan los resultados que se obtuvieron en los experimentos de biodistribución con los anticuerpos L19 radiomarcados en ratones que presentan tumor SK-MEL-28 Las tablas 2 a b y c muestran en tiempos diferentes a partir de la inyección i v de los anticuerpos radiomarcados el promedio (±SD) de la % ID/g de los tejidos y órganos, incluyendo los tumores En la figura 4 se muestran las variaciones ae % ID/g de los diferentes formatos de anticuerpo en tumor (A) y sangre (B) en tiempos diferentes de los experimentos así como las proporciones (C) entre *¦ ID/g en tumor y sangre La totalidad de los tres formatos de anticuerpo L19 se acumularon selectivamente en el tumor y la proporción de •eID/g del tumor y otros órganos se reporta en la tabla 3 Como se demuestra por microautorradiografía los anticuerpos se acumulan únicamente sobre la vasculatura de tumor mientras que no se observa acumulación específica en la vasculatura de órganos normales En contraste no se encuentra acumulación específica de las moléculas control radioyodadas en los tumores o en tejidos normales (tablas 2 a b y c) La totalidad de los tres formatos de anticuerpo de L19 mostraron una depuración que es meaiaaa principalmente por el riñón determinado por la cuenta en las muestras de orina Como se esperaba la velocidad de depuración es más rápida para scFv(L19)2 y más lenta para L19-IgGl completa En la tabla 4 se presenta el ajuste de la curva con una función bioexponencial que proporciona los valores de vida media La figura 5 muestra las variaciones de %ID/g (±SD) de tumor y sangre que se obtuvieron con las formas radioyodadas de scFv(L19)2 y L19-SIP utilizando el moaelo de tumor de teratocarcinoma F9 Debido a la elevada actividad angiogénica del teratocarcinoma F9 la acumulación de moléculas radioactivas en ese tumor fue 3 a 4 veces mayor, 3 y 6 h después de inyección i v en comparación con el tumor SK-MEL-28 y fue persistentemente mayor para la duración de 48 h del experimento Al igual que para el tumor SK-MEL-28 se confirmó por microautorradiografía la acumulación específica en la vasculatura de tumor mientras que no se observó acumulación de tumor específica después de la inyección de las moléculas control En la tabla 5 se reporta la %ID/g de L19(scFv) y L19SIP, en tiempos diferentes después de la inyección i v en tumores F9 y otros órganos
Síntesis de L19-SIP reducida A una solución de 375 µ? (5 nmol) de L19-SIP en
422 µ? de PBS se agregan 50 µ? de TCEP-solución (14 * mg de TCEP X HC1/5 mi de Na2HP04 acuoso 0 1M pH = 7 4) La mezcla de reacción se agita suavemente durante 1 h a 37°C Se purifica L19-SIP reducido por cromatografía en gel utilizando una columna NAP-5 (Amersham Eluant PBS) El análisis por SDS-PAGE del producto aislado demostró la transformación cuantitativa de L19-SIP a L19-SIP reducido
Rendimiento 100 3 g/200 µ? de PBS (26 7%)
Síntesis de Tc-99m-L19-SIP Se colocan 3 0 mg de L-tartrato disódico en un frasco seguido por adición de 100 3 µg de L19-SIP reducido en 200 µ? de PBS y la solución se diluye con 100 µ? de Na2HP04 acuoso-amortiguador (1M pH = 10 5) Se agregan 85 µ? de eluato generador Tc-99m (24 h) y 10 µ? de solución de SnCl2 (5 mg de SnCl2/lml de HC1 0 1M) La mezcla de reacción se agita durante 0 5 h a 37°C Se purifica L19-SIP marcado con Tc-99m por cromatografía en gel utilizando una columna NAP-5 (Amersham Eluant PBS) - -
Rendimiento radioquímico 35 6»- Pureza radioquímica 90 2»· (SDS-PAGE) Actividad específica 26 4 MBq/nmol Inmunorreactividad 91 4%
Síntesis de Te-99m-MAG2-L19-SIP carboximetil -terbutildisulfuro Una solución de 21 75 mi (0 312 moles) de áciao 1-mercaptoacético, 43 5 mi (0 312 moles) de trietilamma y 100 g (0 312 moles) de N- (terbutiltio) -N N'-di-BOC-hidrazma en 1 1 de EtOH (absoluto) bajo reflujo (atmósfera de N2) durante 60 h Se evapora EtOH bajo presión reo.ucj.da hasta un volumen final de aproximadamente 200 mi El residuo se vierte en 1 8 1 de H20 y se ajusta el pH ae la solución resultante a 7 14 utilizando NaOH 5 molar Se separa por filtración Di-BOC-hidrazina y el pH de la solución resultante se ajusta a 2 2 utilizando HCl semiconcentrado El material crudo se extrae de agua 3x con 600 mi de CH2C12 Las capas orgánicas combinadas se secan sobre MgS0 y el solvente se evapora ba o presión reducida lo que proporciona 41 1 g (80*) como un aceite amarillo El material es lo suficientemente puro para síntesis adicional Ester terbutílico de N- (benciloxicarbonilo-Gly) Gly éster terbutílico de (Z- (N-Gly) Gly Una solución de 35 02 g (114 mmoles) de Z-Cly-Osuccinimida y 15 g (114 mmoles) de Gly-O^Bu en 1 4 1 de CH2C12 se agita bajo una atmósfera de N2 a temperatura ambiente durante 20 h La capa orgánica se lava 3 x con 250 mi de ácido cítrico acuoso 1* 2 x con 200 mi de NaHC03 acuoso semisaturado y 1 x con 200 mi de agua La capa orgánica se seca sobre MgS04 anhidro La evaporación de CH2C12 bajo presión reducida proporciona 36 5 g (99%) de Z-Gly-Gly-0-tBu como un aceite amarillo El material cruao es lo suficientemente puro para síntesis adicional
.Ester terbutílico de Gly-Gly Se disuelven 36 5 g (113 mmoles) de Z-Gly-Gly- OtBu en 1 1 de THF seguido por la adición de 3 65 g de paladio en carbón activado (10%) La mezcla se agita ba o una atmósfera de H2 (latm) durante 3 h a temperatura ambiente La suspensión se purga con N2 se filtra (PTFE-filtro 0 45 im) y el filtrado se concentra ajo presión reducida lo que proporciona 20 3 g (95-) de Gly-Gly-0- Bu como un aceite amarillo El material crudo es suficientemente puro para síntesis adicional - -
Éster terbutílico de carboximetil-terbutildisulfuroglicilglicma Una solución de 23 85 g (115 6 mmoles) DCC en 430 mi de CH2C12 se agrega a gotas a una solución de 21 76 g (115 6 mmoles) de Gly-Gly-O^Bu, 20 84 g (115 6 mmoles) de disulfuro de carboximetil-terbutilo y 13 3 g (115 6 mmoles) de NHS en 1 1 de CH2C12 La suspensión resultante se agita durante la noche bajo una atmósfera de N2 a temperatura ambiente Después de filtración la solución resultante se lava 3x con 400 mi de NaHC03 acuoso semisaturado y lx con 400 mi de agua La capa orgánica seca ( gS04) se evapora bajo presión reducida El producto crudo se purifica por cromatografía sobre gel de sílice utilizando un gradiente de solvente que varía de CH2Cl2/MeOH 99 1 a CH2Cl2/MeOF 98 5 1 5 se aislan 26 1 g (64^) como un aceite amarillo
Mercaptoacetilglicilglicma Se disuelven 26 32 g (75 09 mmoles) de ester terbutílico de carboximetil-terbutildisulfuroglicilglicma en 233 mi de TFA bajo una atmósfera de N2 La solución resultante se agita durante 20 min a temperatura amoiente Se evapora el TFA bajo presión reducida (5-10 x 102mbar) y el aceite resultante se seca bajo agitación durante 2 h adicionales (5-10 x 102mbar) Después de la adición ae 250 mi de Et20 precipita un polvo blanco y la suspensión se agita durante 3 h El material se separa por filtración y se resuspende en 100 mi de Et20 La suspensión resultante se agita durante la noche el producto se separa por filtración y el material se seca a temperatura ambiente bajo presión reducida lo que proporciona 20 46 g (92 5%) como un polvo blanco
Ester de NHS de ercaptoacetilglicilglicma Se combinan mercaptoacetilglicilglicma (1 g 3 4 mmoles) y N-hidroxisuccimmida (391 mg 3 4 mmoles) en un matraz de fondo redondo seco y se disuelve en 4 mi de DMF anhidra Se agrega DCC (700 mg 3 4 mmoles) en 2 mi de dioxano anhidro mientras se agita la mezcla de reacción Dentro de 15 min se comienza a formar un precipitado (DCU) Después de 1 h el precipitado se separa por filtración al vacío El precipitado se lava con dioxano frío El dioxano se separa del filtrado El producto se precipita a partir de la solución de DMF restante agregando dietiléter El producto se aisla por filtración se lava con dietiléter frío y se seca al vacío en un desecaaor durante la noche Rendimiento 1 33 (99')
Síntesis de Tc-99m-MAG2-e-HN(Lys) -L19-SIP Se diluyen 200 yg (2 66 nmoles) de L19-SIP no reducido en 111 µ? de PBS con 300 µ? de amortiguador de borato de sodio (0 1M pH 8 5) y se dializa 2 x 1 h con 200 mi de amortiguador fosfato (0 1M pH 8 5) utilizando un equipo Slide-A-Lyser 10 000 MWCO (Pierce Inc Rockford IL, E U A ) Se agregan 50 µ? de la solución de éster de NHS de mercaptoacetilglicilglicina (0 50 mg disuelto en 500 µ? de amortiguador de fosfato, 0 1 M, pH 8 5) y la mezcla de reacción se calienta durante 3 h a 37°C La mezcla de reacción se dializa 2 x l h y l x l7 h (durante la noche) con 200 mi de amortiguador de fosfato (0 1M pH 8 5) cada uno utilizando el equipo Slide-A-Lyzer 10 000 MWCO (Pierce Inc , Rockford, IL, E U A ) se agregan 3 0 mg de L-tartrato disódico al frasco seguido por adición de 90 µ? de eloato generador Tc-99m (eluido diariamente) y se agregan 25 µ? de solución SnCl2 (5 mg SnCl2/l mi 0 1M HC1) La mezcla de reacción se agita durante 0 5 h a 37°C Se purifica L19-SIP marcado con Tc-99m por cromatografía en gel utilizando una columna NAP-5 (Amersham Eluent PBS) Rendimiento radioquímico 55 1^ Pureza radioquímica 94 5-s (SDS-PAGE) Actividad específica 15 2 MBq/nmol Inmunorreactividad 81 "
Síntesis de Re-188-L19-SIP Se colocan 3 0 mg de L-tartrato disódico en un frasco seguido por adición de 150 µg de L19-SIP-SH reducido en 310 µ? de PBS y la solución se diluye con 100 µ? de Na2HP04 acuoso-amortiguador (1M pH = 10 5) Se agregan 100 µ? de eloato generador Re- 188 y 50 µ? de solución de SnCl2 (5 mg SnCl2/l mi 0 1M HCl) La mezcla de reacción se agita durante 1 5 h a 37°C Se purifica L19-SIP marcado con Re- 188 por cromatografía en gel utilizando una columna NAP-5 (Amersham, Eluente PBS) Rendimiento radioquimico 34 8- Pureza radioquímica 97 2s- (SDS-PAGE) Actividad específica 13 5 MBq/nmol Inmunorreactividad 91 7*
Síntesis de L18-SIP reducido para conjugación específica de EDTA CDTA TETA, DTPA, TTHA HBED, DOTA, NOTA D03A y guelantes de tipo similar al grupo cisteína-SH Se agregan 50 µ? de TCEP-solución (14 34 mg TCEP X HCl/5 mi de Na2HP04 acuoso 0 1M pH = 7 4) a una solución de 375 µg (5 nraoles) de L19-SIP en 422 µ? de PBS La mezcla de reacción se agita suavemente durante 1 h a 37°C Se purifica L19-SIP reducido por cromatografía en gel utilizando una columna NAP-5 (Amersham, Eluyente amortiguador de acetato de sodio 0 1M, pH 5 0) el análisis por SDS-PAGE del producto aislado demuestra la transformación cuantitativa de L19-SIP en L19-SIP reducido Rendimiento 105 7 µg 200 µ? (28 2%) - -
Síntesis de ln-111-MX-DTPA-maleimida-S (Cys) -L19-SIP-R (R = reducido,) Se hacen reaccionar 105 pg (2 8 nmoles) de L19-SIP reducido en 200 µ? de amortiguador ae acetato de sodio (0 1M, pH 5) con 50 µ? de 1, 4, 7-tnaza-2- (N-maleimidoetilen-p-amino) bencil-1 7-bis (carboximetil) -4-carboximetil 6-metilheptano disuelto (0 25 mg DTPA-maleimida en 500 µ? de amortiguador de acetato de sodio 0 1M pH 5) durante 3 h a 37°C La mezcla de reacción se dializa 2 x 1 h con 200 mi de amortiguador ae acetato de sodio (0 1M pH 6) utilizando el equipo Slide-A-Lyzer 10 000 MWCO (Pierce Inc Rockford IL E U A ) Se agregan 80 µ? de solución [In-111) InCl3 (Hcl 1N 40 MBq Amersbam Inc ) y la mezcla de reacción se calienta a 37 °C durante 30 min Se purifica DTPA-maleimida-S (Cys) -L19-SIP etiquetado con In-111 por cromatografía en gel utilizando una columna NAP-5 (Amersham Eluente PBS) Rendimiento radioquímico 51 6" Pureza radioquímica 97 2% (SDS-PAGE) Actividad específica 7 9 MBq/nmol Inmunorreactividad 88 5* Síntesis de MX-DTPA-maleimida (1,4 7-tnaza-2- (N-maleimidoetilen-p-amino) bencil-1 7-bis (carboximetil) -4-carboximetil - 6-metilheptano) Se disuelven 512 mg (1 inmoles) de ácido {[3- (4-aminofenil) -2- (bis-carboximetil -ammo) -propil] - [2- (bis-carboximetil-amino) -propil] amino} -acético (Macrociclics Inc Dallas TX E U A ) y 707 mg (7 mmoles) de trietilamina en 3 mi de DMF seco SE agregan a gotas 400 mg (1 5 mmoles) de éster 2 5-dioxopirrolidm-l-ílico del acido 3- (2 5-dioxo-2 5-dihidro-pirrol-l-il) propiónico (Aldricn) en 1 mi de DMF seco La solución se agita durante 5 h a 50°C Se agregan lentamente 30 mi de dietiléter La mezcla de reacción se agita durante 30 min adicionales El precipitado se recolecta por filtración El producto crudo se purifica por RP-CLAR (acetonitrilo- agua- acido trifluoroacético/3 96 9 0 1 ? 99 9 0 0 1) Rendimiento 61% (405 mg, 0 61 mmoles) EM-ESI 664 = M+ +1
Síntesis de In-lll-MX-DTPA-e-HN(Lys) -L19-SIP Se diluyen 200 iq (2 66 nmoles) de L19-SIP no reducido en 111 µ? de PBS con 300 µ? de amortiguador de borato de sodio (0 1M pH 8 5) y se dializa 2 x 1 h con 200 mi de un amortiguador de borato de sodio (0 1M, pH 8 5) utilizando un equipo Slide-A-Lyzer 10 000 MWCO (Pierce Inc Rockford IL E U A ) Se agregan 50 µ? de una - -
solución de 1 4, 7-triaza-2- (p-isotiocianato)bencil-l 7-bis (carboximetil) -4-carboximetil-6-metilheptano (MX-DTPA) (0 33 mg, de MX-DTPA disuelto en 500 µ? de amortiguador ae borato de sodio 0 1M pH 8 5) y la mezcla de reacción se calienta durante 3 h a 37°C La mezcla de reacción se dializa 2 x l h y l x l h (durante la noche) con 200 mi de amortiguador de acetato de sodio (0 1M pH 6 0) caaa uno utilizando el equipo Slide-A-Lyzer 10 000 MWCO (Pierce Inc ockford IL E U A ) Se agregan 80 µ? de solución de [In-lli] InCl3
(HCl 1N 40 MBq Amersham Inc ) y la mezcla de reacción se calienta a 37°C durante 30 mm Se purifica MX-DTPA- e -H (Lys) -L19-SIP etiquetado con In-111 por cromatografía en gel utilizando una columna NAP-5 (Amersham Eluente PBS) Rendimiento radioquímico 72 4« Pureza radioquímica 80 3% (SDS-PAGE) Actividad específica 8 8 MBq/nmol Inmunorreactividad 77 5%
Síntesis de In-111 -DOTA-C-bencil -p-NCS-e -HN(Lys) -L19 -SIP Se diluyen 200 µg (2 66 nmoles) de L19-SIP no reducido en 111 µ? de PBS con 300 µ? de amortiguador de borato de sodio (0 1M pH 8 5) y se dializa 2 x 1 h con 200 mi de un amortiguador de borato de sodio (0 1M, pH 8 5) utilizando un equipo Slide-A-Lyzer 10 000 MWCO (Pierce Inc Rockford, IL, E ü A ) Se agregan 50 µ? de una solución de ácido 1 4 , 7 , 10-tetraaza-2- (p-ísotiocianato) bencilciclododecan- 1 4 7 10- etraacético (bencil-p-SCN-DOTA Macrociclics Inc Dallas TX E U A ) en solución (1 5 mg de bencil-p-SCN-DOTA disuelto en 5 mi de amortiguador de borato de sodio 0 1M pH 8 5) y la mezcla de reacción se calienta durante 3 h a 37 °C La mezcla de reacción se dializa 2 x l h y l x l7 h (durante la noche) con 200 mi de amortiguador de acetato de sodio (0 1M, pH 6 0) cada uno utilizando el equipo Slide-A-Lyzer 10 000 MWCO (Pierce Inc , Rockford IL E U A ) Se agregan 80 µ? de solución de [In- 111] InCl3 (HC1 1N 40 MBq Amersham Inc ) y la mezcla de reacción se calienta a 37°C durante 30 mm Se purifica DOTA-C-bencil -p-NCS-e-HN(Lys) -L19-SIP etiquetado con In-111 por cromatografía en gel utilizando una columna NAP-5 (Amersham Eluente PBS) Rendimiento radioquímico 70 8-e Pureza radioquímica 92 Is- (SDS-PAGE) Actividad específica 10 1 MBq/nmol Inmunorreactividad 75 1*
Síntesis de ?-88-DTPA-c-HN (Lys) -L19-SIP Se diluyen 200 pg (2 66 nmoles) de L19-SIP no reducido en 110 µ? de PBS con 300 µ? de amortiguador de borato de sodio (0 1M pH 8 5) y se dializa 2 x 1 h con 200 mi de un amortiguador de borato de sodio (0 1M pH 8 5) utilizando un equipo Slide-A-Lyzer 10 000 M CO (Pierce Inc Rockford, IL E U A ) Se agregan 50 µ? de una solución de MX-DTPA (0 33 mg de MX-DTPA disuelto en 500 e? de amortiguador de borato de sodio 0 1M pH 8 5) y la mezcla de reacción se calienta durante 3 h a 37°C La mezcla de reacción se dializa 2 x l h y l x l7 h (durante la noche) con 200 mi de amortiguador de acetato de sodio (0 1M pH 6 0) cada uno utilizando el equipo Slide-A-Lyzer 10 000 MWCO (Pierce Inc , Rockford IL E U A ) Se agregan 100 µ? de solución [Y-88]YC13 ( Cl 1N 75 MBq Oak Ridge National Lab ) y la mezcla de reacción se calienta a 37°C durante 30 min Se purifica MX-DTPA- -HN (Lys) -L19-SIP etiquetado con Y-88 Dor cromatografía en gel utilizando una columna NAP-5 (Amersham Eluente PBS) Rendimiento radioquímico 58 1" Pureza radioquímica 91 5- (SDS-PAGE) Actividad específica 11 4 MBq/nmol Inmunorreactividad 70 5*
Síntesis de Lu-177 -DOTA-C-bencil-p-NCS-e-HN(Lys) -L19-SIP Se disuelven 200 pg (2 66 nmoles) de L19-SIP no reducido en 120 µ? de PBS con 300 µ? de amortiguador de -
borato de sodio (0 1 pH 8 5) y se dializa 2 x 1 h con 200 mi de un amortiguador de borato de sodio (0 1M pH 8 5) utilizando un equipo Slide-A-Lyzer 10 000 M CO (Pierce Inc , Rockford, IL, E U A ) Se agregan 50 µ? de una solución de bencil-p-SC -DOTA (1 5 mg disuelto en 5 mi de amortiguador de borato de sodio 0 1M, pH 8 5) y la mezcla de reacción se calienta durante 3 h a 37 °C La mezcla de reacción se dializa 2 x l h y l x l7 h (durante la noche) con 200 mi de amortiguador de acetato de sodio (0 1M pH 6 0) cada uno utilizando el equipo Slide-A-Lyzer 10 000 MWCO (Pierce Inc Rockford IL E U A ) agregan 200 µ? de solución de [Lu-177] LuCl3
(HC1 1N 80 MBq RH-Petten, Países Bajos) y la mezcla ae reacción se calienta a 37°C durante 30 min Se purifica DOTA-C-bencil-p-NCS-e-HN(Lys) -L19-SIP etiquetado con Lu-177 por cromatografía en gel utilizando una columna NAP-5 (Amersham Eluente PBS) Rendimiento radioquímico 72 2-e Pureza radioquímica 94 9% (SDS-PAGE) Actividad específica 18 3 MBq/nmol Inmunorreactívidad 73 4%
DistnJbución en órganos y excreción de In-lll-MX-DTPA-L19-SIP después de una inyección i v única en ratones atímicos con tumor Los peptidos etiquetados de la invención se inyectan intravenosamente en una dosis de aproximadamente 37 kBq en animales con F9 (teratocarcmoma) (peso corporal de aproximadamente 25 g) Se midió la concentración ae radioactividad en diversos órganos y la radioactividad en las excreciones utilizando un contador ? en diversos momentos después de la administración de la sustancia En la tabla 6 se muestra la biodistribucion de In-lll- X-DTPA-L19-SIP en ratones atímicos con F9 (teratocarcmoma) (media ± SD (desviación estándar) n = 3)
Distribución en órganos y excreción de Tc-99m-L19-SIP después de una inyección i v única en ratones atímicos con tumor Se inyectaron por vía intravenosa péptidos etiquetados en una dosis de aproximadamente 56 kBq en animales con F9 (teratocarcmoma) (peso corporal ae aproximadamente 25 g) Se midió la concentración ae radioactividad en diversos órganos y la radioactividaa en las excreciones utilizando un contador ? en diversos momentos después de la administración de la sustancia Además, se encontró la proporción de tumor respecto a sangre en diversos momentos en base en la concentración del péptido en el tumor y la sangre - -
En la tabla 7 se muestra la biodistribución de Tc-99m-L19-SIP en ratones atímicos con F9 (teratocarcmoma) (media ± SD, n = 3) En la tabla 8 se muestra la proporción de tumor respecto a sangre de Tc-99m-L19-SIP en ratones atímicos con F9 (teratocarcmoma) (media ± SD n = 3) Los péptidos radiomarcados demostraron poseer propiedades favorables en los experimentos en animales Por ejemplo Te 99m-L19-SIP e In-lll-MX-DTPA- e-NH(L.ys) -LJ.9-SIP mostraron una elevada acumulación de tumor de 17 2 (Tc-99m) o 12 9 (In-111) *· de dosis inyectada por gramo (ID/g) a 1 hora después de la inyección (p i ) Se observó retención significativa en tumor de 9 4 (Tc-99m) o 13 0 (In-111) de % ID/g a 24 horas p i Por lo tanto la captación en tumores significativamente más elevada en comparación con otros fragmentos de anticuerpos etiquetados con In-111 o Tc-99m conocidos (por ejemplo Kobayashi et al , J Nuc Med Vol 41(4) pp 755 - 762 2000 Verhaar et al J Nuc Med Vol 37(5) pp 868 - 872 1996) La depuración en sangre del compuesto genera proporciones de tumor/sangre de 13 1 y 6 1 respectivamente a las 24 h p i Resulta notable que In-lll-MX-DTPA- e-?? (Lys) -L19-SIP muestra una captación y retención renal significativamente menor (22 5-- de ID/g) en comparacxón con otros fragmentos de anticuerpos recombinantes etiquetados - - con In-111 altamente retenidos (descritos por ejemplo por obayashi et al a las 24 h p i La retención en riñon es un problema muy común y habitualmente imposibilita el uso de compuestos etiquetados con lantánidos en radioterapia Los resultados experimentales demuestran el excelente potencial de los radiommunocori]ugados descritos en la presente para aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas preferiblemente aplicadas al paciente por administración parenteral
DISCUSIÓN
La observación de que los medicamencos anticancerígenos citotóxicos se localizan de manera más eficaz en tejidos normales que en tumores (37 Bosslet et al 1998) ha desarrollado una oleada de estudios que investigan la posibilidad del suministro selectivo del medicamento en los tumores No obstante el marcado eficaz de los tumores requiere de dos cosas 1) un objetivo en el tumor que sea específico abundante estable y que esté disponible fácilmente para moléculas de ligando crue provengan de la corriente sanguínea y 2) una molécula ae ligando con propiedades farmacocinéticas adecuadas que se difunde fácilmente de la corriente sanguínea al tumor y con una afinidad elevada por el objetivo para asegurar su acumulación eficiente y selectiva en el tumor Debido a sus características distintivas el microambiente en el tumor es posible un objetivo pantumoral De hecho el progreso del tumor induce (y subsecuentemente necesita) modificaciones importantes en los componentes de microambiente del tumor particularmente aquellos de la matriz extracelular (ECM) Las moléculas que constituyen el ECM de tumores sólidos difieren tanto cuantitativa como cualitativamente de aquellos de ECM normal Además, muchos de estos componentes ECM de tumor son compartidos por todos los tumores sólidos que constituyen las propiedades generales y funciones tales como invasión celular (tanto de células normales como de tejidos tumorales y células cancerosas dentro de tejidos normales) y angiogénesis De las numerosas moléculas que constituyen el ECM de tumor modificado los presentes inventores han enfocado su atención en una isoforma ECM míe contiene el dominio ED-B (B-FN) B-FN se expresa ampliamente en el ECM de todos los tumores sólidos probados hasta ahora y se asocia de manera constante con procesos angiogénicos (22 Castellani et al 1994) pero de otra manera no es detectaole en tejidos adultos normales (17 Carnemolla et al , 1989) El suministro dirigido de agentes terapéuticos a ECM subendotelial resuelve problemas relacionados con la hipertensión intersticial de tumores sólidos (38 Jain et al 1988 39 Jain, 1997 40 Jain RK 1999) L19 (13 Pini et al 1988 25 Viti Canc Res 23 Tarli et al 1999) un scFv con una alta afinidad (Ka = 5 4 x 10 X1M) por el dominio ED-B de FN se acumula ae manera selectiva y eficazmente m vivo alrededor de la neovasculatura tumoral y es capaz de transportar selectivamente y concentrarse en la masa tumoral en cualquiera de muchas de las moléculas terapéuticas con las cuales se conjuga (28 Birchler et al 1999 29 Nilsson et al 2001 30 Halin et al 2002 31 Carnemolla et al 2002) La capacidad de L19 de dirigirse selectivamente a tumores también se ha demostrado en pacientes utilizando técnicas de cintigrafía La presente especificación informa sobre el funcionamiento de marcado o direccionamiento vascular de tumores y la farmacocinética de tres formatos de anticuerpo humano L19 diferentes El scFv la minunmunoglobulina/inmunoproteína pequeña (SiP) e IgGl humana completa La molécula de SIP se ha obtenido por fusión de scFv(L19) al dominio CH4 de la isoforma secretora S2 de IgE humana El eCH4 es el dominio que permite la dimerización de moléculas de IgE y la isoforma S2 contiene una cisteína en la parte COOH terminal que se estabiliza covalentemente al dímero a través de un enlace disulfuro entre cadenas (35 Batista et al 1996) Los sitios de unión de IgE para el residuo FCERI en el domino Ch3 (41 Turner and inet 1999 42 Vangelista et al 1999 a 3 Garman et al 2000) de manera que scFv fusionado al dominio CH4 de acuerdo con las modalidades de la presente invención no activa ninguna señalización que genere reacciones de hipersensibilidad Se ha estudiado el desempeño de estos tres formatos en dos modelos de tumor diferentes en ratones en teratocarcinoma F9 murino y en melanoma SK-MEL-28 humano El primero es un tumor que crecer rápidamente y que, una vez implantado mata a los animales en aproximadamente dos semanas Por otra parte el tumor SK-MEL-28 presenta una curva de crecimiento bifásica con una fase de crecimiento temprana rápida seguida por una segunda fase más lenta Se ha demostrado previamente que la cantidad de ED-B en teratocarcinoma F9 permanece estable durante el crecimiento del tumor (23 Tarli et a 1999) en contraste ED-B se acumula en el melanoma SK-MEL-28 proporcionalmente a la capacidad del tumor para crecer (23 Tarli et al 1999) encontrándose abundante ED-B en la primera fase y una cantidad menor en la segunda El uso del tumor de melanoma SK-MEL-28 permite estudios de biodistribución a largo plazo -
sin variaciones notables en la masa tumoral (figura 2) que puedan generar una mala interpretación de los resultados Los estudios comparativos de los tres formatos ae anticuerpo L19 en términos de estabilidad in vivo mostraron que L19-SIP y L19-IgGl mantienen durante la duración de los experimentos (144h) la misma ínmunorreactiviaad y masa molecular en plasma que antes de la inyección En contraste scFv(L19) pierde rápidamente su inmunorreactividad en plasma y genera agregados que son demasiado grandes para entrar en una columna de cromatografía y por filtración en gel Tal agregación de scFv muy probablemente es la responsable de la proporción entie -ID/g de tumor y pulmón puesto que los agregados se pueden acumular en la microvasculatura del pulmón (tabla 3) Para la totalidad de los tres formatos la depuración sanguínea es mediada principalmente por el riñón lo que muestra una curva bifásica con una fase y una ß, reportada en la tabla 4, la cual es inversamente proporcional al tamaño molecular La acumulación de los diferentes formatos ae anticuerpo en los tumores estudiados es una consecuencia de la velocidad de depuración y la estabilidad m vivo de las moléculas Utilizando a scFv, se observa un por ciento máximo de dosis inyectada por gramo (^ID/g) 3 h después ae la inyección del anticuerpo radiomarcado y después disminuye rápidamente Utilizando SIP el -ID/g en tumores es 2-5 veces mayor que el de scFv, que alcanza un máximo 4-6 horas después de la inyección Este patrón se ooserva tanto en tumores F9 como en SK-MEL-28 En contraste la acumulación de IgGl en tumores se incrementa de manera constante durante los experimentos No obstante debido a su depuración lenta la proporción tumor-sangre de %ID/g después de 144 horas es únicamente de aproximadamente 3 en comparación con una proporción de 10 para scFv y de 70 para SIP después del mismo período de tiempo (figura 4) Las mismas propiedades distintivas ae la estabilidad m vivo depuración y funcionamiento de remisión o dirección directa a tumores mostradas por los tres formatos de anticuerpos estudiados aquí fueron aprovechadas para propósitos diferentes de diagnóstico y/o terapéuticos dependiendo de las necesidades clínicas y de la enfermedad Por ejemplo los anticuerpos radiomarcados mostraron buena proporciones de tumor-órgano y tumor-sangre poco después de su inyección que son necesarias para inmunocintigrafía de diagnóstico m vivo aebido principalmente a la vida media corta de los isótopos que se utilizan en dicho análisis Son posibles soluciones diferentes utilizando anticuerpo como un vehículo para agentes terapéuticos el suministro de sustancias que muestran sus efectos terapéuticos después de alcanzar sus objetivos (por ejemplo los fotosensibilizadores activados únicamente en los objetivos) para los cuales la cantidad absoluta suministrada al tumor resulta relevante el suministro de sustancias que ejercen su efecto terapéutico y tóxico incluso antes de alcanzar el objetivo (por ejemplo ítrio-90 emisor de radiación ß) para lo cual debe proporcionarse atención particular a la proporción del área ba o las curvas de acumulación en tumor y sangre como una función del tiempo con el fin de minimizar la toxicidad sistémica y maximizar el efecto terapéutico antitumoral Por ejemplo L19-SIP parece ofrecer el mejor equilibrio de estabilidad molecular velocidad de depuración y acumulación en tumor Las proteínas de fusión similares constituidas de fragmentos de anticuerpo scFv unidos a un dominio dimerizante ya han sido descritas (44 Hu et al 1996 33 Li et al 1997) , pero en ambos casos se utiliza ?10?3 humana como el dominio dimerizante El uso del dominio es2CH4 humana proporciona una manera fácil de obtener estabilización covalente del dímero Ademas el puente disulfuro que se forma por los residuos cisterna en la parte C terminal se pueden reducir fácilmente en condiciones suficientemente moderadas para conservar la estructura total de la molécula, con lo que se proporciona un grupo reactivo fácilmente accesible para radiomarcaao o - -
conjugación química Esta característica parece ser particularmente promisoria en vista del potencial clínico L19-IgGl se acumula abundantemente en tumores aunque esta acumulación está desplazada por una velocidad de depuración en sangre lenta el procedimiento de las tres etapas para reducir los anticuerpos circulantes se puede utilizar para permitir su uso no sólo para propósitos terapéuticos sino también para ínmunocmtigrafía de diagnóstico (45 Magnani et al 2000)
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11 Reichert Nature Biotech 19 819-822 2001 12 Huís et al Nature Biotech 17 276-281 1999, 13 Pini et al J Biol Chem 273 21769-21776, 1998 14 Neri and Zardi Advanced Drug Delivery Reviews 31 43-52 1998 15 Bissel and Radisky Nature Reviews - Cáncer 1 46-54 2001 16 Balza et al FEBS Lett , 228 42-44 1988 17 Carnemolla et al J Cell Biol 108 1139-1148 1989
18 Borsi et al FEBS Lett , 261 175-178 1990 19 Borsi et al J Biol Chem 270 6243-6245 1995
20 Zardi et al EMBO J , 6 2337-2342 1987 21 ffrench-Constant et al J Cell Biol 109 903-914 1989 22 Castellani et al Int J Cáncer 59 612-618 1994
23 Tarli et al Blood 94 192-198 1999 24 Carnemolla et al Int J Cáncer 68 397-405, 1996 25 Viti et al Cáncer Res 59 347-353 1999 26 Neri et al Nature Biotechnol, 15 1271-1275 1997
27 Demartis et al Eur J Nucí Med 28 4534-4539 2001
28 Birchler et al Nat Biotechnol 17 984-988 1999
29 Nilsson et al Cáncer Res 61 711-716 2001 30 Halm et al Nature Biotechnol In the press 2002
31 Carnemolla et al Blood 99 2002 32 Wu et al Proc Nat Acad Sci U S A 97 8495-8500 2000 33 Li et al Protein Engmeering 10 731-736 1997 34 Pmi et al J Immunol Methods, 206 171-183 1997 35 Batista et al J Exp Med 184 2197-205 1996
36 Riske et al J Biol Chem 266 11245-11251 1991
37 Bosslet et al Cáncer Res 58 1195-1201 1998
38 Jam and Baxter Cáncer Res 48 7022-7032, 1988 39 Jam Vascular and mterstitial physiology of tumors Role m cáncer detection and treatment In R Bicknell C E Lewis and N Ferrara (eds) Tumour Angiogenesis pp 45-59 New York Oxford University Press 1997 40 Jain Annu Rev Biomed Eng 1 241-263 1999 1 Turner and Kinet Nature, 402 Suppl B24-B30 1999
42 Vangelista et al Jour Clin Invest 103 1571-1578 1999 43 Garman et al Nature 406 259-266 2000 44 Hu et al Cáncer Res 56 3055-3061 1996 45 agnani et al Br J Cáncer 82 616-620 2000
Tabla 1 Inmunorreactividad (1*) y recuperación de radioactividad (R) de Superdex 200 de loe anticuerpos radioetiquetados, y tiempoe diferentes después de inyección i v
La mmunorreactividad (%) y la recuperación de radioactividad (%) a partir de Superdex200 se determinó en plasma como se describe en Material y Métodos -* Para normalizar los resultados de la prueba de inmunorreactividad se relacionan con los valores de porcentaje de la mmunorreactividad antes de la inyección i v - nd no determinado
Tabla 2a Expenmentos de biodistnbucion de L19 radioetiquetado y fragmentos de anticuerpo D1 3 en ratones con tumor SK MEL 28
Los resultados se expresan como por ciento de dosis inyectadas de anticuerpo por gramo de tejido (%ID/g)±SO nd no determinado
Tabla 2b Expenmentos de biodistnbucion de L19 SIP radioetiquetado y D1 3 SIP en ratones con tumor SK MEL 28
Los resultados se expresan como por ciento de dosis inyectadas de anticuerpo por gramo de tejido (%ID/g)±SO nd no determinado
Tabla 2c Expenmentos de biodistnbucion de L19 igG1 radioetiquetada y hLgGI en ratones con tumor SK MEL 28
Los resultados se expresan como por ciento de dosis inyectadas de anticuerpo por gramo de tejido (%ID/g)±SD nd no determinado
Tabla 3 Proporciones de tumor órgano de % ID/g de los formatos de anticuerpo L19 radioetiquetados en ratones con tumor SK MEL 28 L19(ScFv) L19 SIP L19 lgG1
Tiempo 3 6 24 48 72 144 3 6 24 48 72 144 3 6 24 48 72 144 (h)
TUMOR 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Sangre 17 37 162 237 227 107 05 12 30 89 291 745 03 04 08 15 18 23
Hígado 51 111 405 475 340 160 20 35 84 135 233 298 07 08 28 54 71 63
Bazo 37 74 231 316 340 160 14 25 59 100 179 88 07 06 27 39 49 74
Rinón 06 12 101 158 170 107 07 16 38 86 166 298 07 10 22 45 58 53
Intestino 32 35 67 56 57 36 36 43 40 46 58 83 28 40 47 69 79 71
Corazón 32 65 231 475 340 160 13 29 81 200 388 745 08 11 23 53 67 58
Pulmón 09 13 15 13 12 06 07 11 23 43 123 298 07 10 16 34 45 37
Tabla 4 Parámetros cinéticos para depuración sanguínea de los tres formatos de anticuerpo L19
a) Magnitud relativa de los dos componentes de vida media
Tabla 5 Experimentos de biodistribución de L19(scFv) radioetíquetada y L19SIP en ratones con tumor F9
Los resultados se expresan como por ciento de dosis inyectqada de anticuerpo por gramo de tejió (%ID/g)±SD nd no determinado
Tabla 6
Tabla 7
Tabla 8