MXPA04008567A - Aislamiento, purificacion e identificacion estructural de un componente bioactivo de un extracto soluble en agua de una especie botanica, para mejorar los procesos inmunes, antiinflamatorios, antitumorales y de reparacion del adn de animales de sangr - Google Patents

Abstract

Un metodo para aislar el componente bioactivo de un extracto soluble en agua de Uncaria tomentosa, conocido como extracto C-MED-100(r), que comprende (i) precipitar el portador del secado por aspersion del extracto C-MED-100(r) para obtener la mezcla para salpicarla en la cromatografia en capa fina (TLC); (iii) salpicar la mezcla para salpicar del extracto C-MED-100(r) en placas para TLC corridas previamente y eluir las placas para obtener una banda fluorescente con Rf=0.2-0.3; (iv) rascar la banda con Rf=0.2-0.3 eluyendo con amoniaco y liofilizar la banda eluida para formar un polvo; y (v) extraer el polvo con metanol para eliminar el gel de silice solubilizado, concentrar la solucion de metanol y cristalizar la solucion concentrada para obtener el componente bioactivo. El componente bioactivo aislado es un analogo del acido quinico, de manera preferida, la lactona del acido quinico. Una composicion farmaceutica que comprende una cantidad farmaceuticamente efectiva del componente bioactivo y un portador o diluyente inerte no toxico. El componente bioactivo puede utilizarse para mejorar la competencia inmune, tratar los trastornos asociados con el sistema inmune, inhibir la respuesta inflamatoria, tratar los trastornos asociados con la respuesta inflamatoria, mejorar la respuesta antitumoral y tratar los trastornos asociados con la respuesta a la formacion y crecimiento de un tumor, todo en mamiferos.

Description

AISLAMIENTO, PURIFICACION E IDENTIFICACION ESTRUCTURAL DE UN COMPONENTE BIOACTIVO DE UN EXTRACTO SOLUBLE EN AGUA DE UNA ESPECIE BOTÁNICA, PARA MEJORAR LOS PROCESOS INMUNES, ANTIINFLAMATORIOS, ANTITUMORALES Y DE REPARACIÓN DEL ADN DE ANIMALES DE SANGRE CALIENTE ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención está dirigida al aislamiento, purificación e identif cación estructural del componente bioactivo de los extractos acuosos de la Uña de Gato (especie Uncaria) . El componente bioactivo se identifica como la lactona del ácido .guínico. La presente invención también está dirigida al uso farmacéutico del componente bioactivo, para mejorar los procesos inmunes, antiinflamatorios, antienve ecimiento, antitumorales y de reparación del ADN en animales de sangre caliente.

DISCUSIÓN DE LA TÉCNICA RELACIONADA La Uncaria tomentosa, conocida comúnmente como Uña de Gato (Cat's Claw) , históricamente, ha sido ampliamente utilizada como un remedio natural y actualmente está presente en varias formulaciones nutritivas para tratar una gran variedad de trastornos de la salud. Hasta donde sabe la solicitante, todas las preparaciones comerciales de la Uña de Gato, excepto el extracto soluble en agua (el "extracto de Pero"), descrito en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,039,949 y 6,238,675 Bl y en la patente autorizada de los Estados Unidos No. de Serie 09/824,508 (las "patentes de Pero")/ de Pero, se basan en el contenido del alcaloide del oxindol de la misma. Esto se debe al descubrimiento del Dr. Keplinger (Austria) , a principios de la década de 1960, de la presencia de los alcaloides de oxindol. (Keplinger, K. , Laus, G., urm, M. , Dierich, M.P., Teppner, H. Uncaria tomentosa (Willd.) DC . -Ethnomedicinal use and new pharmacological , toxicological and botanical results, J. Ethanopharmacology 64:23-34, 1999) . El extracto de Pero, la modalidad preferida del cual está comercialmente disponible bajo el nombre C-MED-100®, es un extracto basado en agua de la corteza del árbol de Uncaria tomentosa, también conocido como extracto de Uña de Gato, bastante distinto a cualesquier otras versiones comerciales en que contiene únicamente, trazas de alcaloides (<0.05%) . En su lugar, el extracto de Pero contiene una nueva clase de ingredientes activos, los ésteres de carboxilalquilo (CAE) , que han demostrado eficacia como se describe y protege en las patentes de Pero. El C-MED-100® es el primer producto ofrecido en la industria de la nutrición para mantener tanto las funciones autoinmunes como de reparación mejorada del ADN, que son de importancia crítica para reducir las consecuencias de los trastornos relacionados con la edad, tales como enfermedades autoinmues, inflamatorias y neoplásicas. Debe entenderse que las referencias en la presente al extracto C-MED-100®, incluyen al extracto de Pero, del cual el extracto C-MED-100® es una modalidad preferida. Hasta ahora, no se ha logrado la identificación química precisa de los ingredientes activos del extracto de Pero. Sin embargo, las características químicas y biológicas de estos ingredientes se han completado de manera suficiente para estandarizar la fabricación comercial del extracto de Pero. (Véase las patentes de Pero) . El extracto C-MED-100®, que es el extracto de Pero comercialmente disponible, está formulado y basado en los usos medicinales históricos de la Uña de Gato, de lo cual un paso importante es la extracción exhaustiva en agua caliente durante aproximadamente 18 horas a aproximadamente 952C. El extracto es ultrafiltrado a continuación para eliminar los conjugados tóxicos de alto peso molecular (PM >10,000) y se seca por aspersión para que contenga de 8-10% de esteres de carboxialquilo (CAE) como ingredientes activos. Los CAE se caracterizaron como los únicos ingredientes activos del extracto C-MED-100®, como resultado de su absorción (85%) en carbón. No se observó actividad biológica en la fracción no absorbida. Utilizando cromatografía en capa fina (TLC) como la herramienta de purificación, los ingredientes activos mostraron una absorción UV máxima a aproximadamente 200 nm, y reaccionaron con hidroxilamina y cloruro férrico, caracterizándolos como ésteres (por ejemplo, CAE) . Las dosis orales diarias del extracto C-MED-100® de entre 250-700 mg han probado ser eficaces en humanos. Estas dosificaciones han mostrado mejorar los procesos antiinflamatorios, de reparación del ADN, inmunológicos y antitumorales de animales de sangre caliente, incluyendo los humanos. (Véase las patentes de Pero, Lamm, S., Sheng, Y., Pero, R. W. , Persistent response to pneumococcal vaccine in individuáis supplemented with a novel water soluble extract of Uncaria tomentosa, extracto C-MED-100®. Phytomed 8: 267-274, 2001; Sheng, Y., Li, L., Holmgren, K. , Pero, R. W. , ADN repair enhancement of aqueous extracts of Uncaria Tomentosa in a human volunteer study. Phytomed 8:275-282, 2001; Sheng, Y., Bryngelsson, C, Pero, R. W.

Enhanced ADN repair, immune function and reduced toxicity of C-MED-100® extract, a novel aqueous extract from Uncaria tomentosa. J. of Ethnopharmacology 69:115-126 (2000)). Los CAE en el extracto C-MED-100® demuestran proporcionar un profundo apoyo nutritivo como un suplemento dietético, debido a que los CAE mejoran tanto la reparación del ADN como las respuestas de las células inmunes, las cuales, a su vez, son los procesos fisiológicos críticos que regulan el envejecimiento. (Véase las patentes de Pero, Sheng, Y., Pero, R. W. , Wagner, H. , Treatment of chemotherapy-induced leukopenia in a rat model with agueous extract from Uncaria tomentosa. Phytomedicine 7(2):137-143 (2000) y como se cita anteriormente) . Ambos de estos procesos involucran regular la transcripción nuclear kappa beta (NF-kB) . La NF-kB es bien conocida por controlar (i) los eventos nucleares que rescatan a las células de la muerte celular apoptótica y (ii) la producción de la citocina proinfla atoria . (Beg, AA y Baltimore, D., An essential role for NF-kB in preventing TNF-OC induced cell death. Science 274:782-784, 1996; Wang, C-Y, Mayo, M.W. , Baldwin, A.S., TNF-cc and cáncer therapy-induced apoptosis: Potentiation by inhibition of NF-kB. Science 274:784-787, 1996) . Por lo tanto, este mecanismo relaciona directamente la inducción de la apoptosis con la toxicidad programada de la célula con la inhibición de la producción de la citocina proinflamatoria y la inflamación. La apoptosis es un proceso bioquímico esencial en el cuerpo, que regula las células de la división (reproducción) a la diferenciación y hacia una capacidad funcional incrementada. Las células que entran a la apoptosis no sólo serán estimuladas a que se diferencien e incrementen la funcionalidad, sino que finalmente morirán de esta "muerte celular programada". Así, la apoptosis inducida que resulta de la inhibición de la NF-kB por el extracto C-MED-100® (i) destruiría de- manera efectiva las células de un tumor, debido a que serían forzadas a la reproducción por la apoptosis y hacia una muerte eventual, y simultáneamente (ii) incrementa la capacidad de respuesta de las células inmunes, debido a que más células inmunes competentes serían forzadas a diferenciarse y vivirían más debido a la mejora paralela de la reparación del ADN. La NF-kB también envía señales a las células inflamatorias, indicándoles que produzcan citocinas (factores de crecimiento). Estas señales, a su vez, estimulan las células fagocíticas para que destruyan más agentes infecciosos invasores, lo cual, al menos en parte, se logra produciendo altos niveles de radicales libres de oxígeno. Así, la inhibición de la NF-kB tiene propiedades antiinflamatorias, debido a que evita la reacción excesiva del proceso inflamatorio, que puede ser dañino para los tejidos normales del cuerpo. Además, debido a que las citocinas proinflamatorias son una fuente principal de de la producción de radicales libres endógenos en los humanos, la inhibición de la NF-kB es antimutagénica al reducir el daño genético que pueda acumularse con los años. Puesto que se producen menos radicales libres, hay menos daño al ADN y menos inhibición de la reparación natural. Un resultado es que el envejecimiento es reducido. El extracto de Pero, de manera preferida el extracto C-MED-100®, es por lo tanto, un suplemento nutritivo primordial para los remedios antienvej ecimiento, debido a que evita el daño de los radicales libres mediante la inhibición de la NF-kB, induce la diferenciación y la capacidad de respuesta de las células inmunes mediante la apoptosis, mejora la reparación del ADN y destruye las células de un tumor, que a su vez, son los principales factores relacionados con el enve ecimiento. (Sheng, Y., Pero, R.W. , Amiri, A. y Bryngelsson, C. Induction of apoptosis and inhibition of proliferation and clonogenic growth of human leukemic cell lines treated with aqueous extracts of Uncaria Tomentosa. Anticancer Research 18:3363-3368(1998); Sandoval-Chacón M, Thompson J H, Zhang X J, Liu X, annick E E, Sadowicka H, Charbonet R , Clark D A, Miller M J. Antiinflammatory actions of cat's claw: the role of NF-kappa B. Aliment Pharmacol Ther 12: 1279-1289, 1998; Sandoval M, Charbonnet R M, Okuhama N N, Roberts J, Krenova Z, Trentacosti, A M, Miller M J. Cat's claw inhibits TNF alpha production and scavenges free radicáis: role in cytoprotection. Free Radicáis Biol . Med. 29(1) : 71-78, 2000) . Es benéfico identificar el componente activo del mismo. Al aislar e identificar el componente activo, es posible purificar el componente y mejorar el uso farmacéutico e incrementar la eficacia del mismo. La presente invención está dirigida al aislamiento, purificación e identificación de los CAE, caracterizados como los ingredientes activos del extracto de Pero, CAE los cuales son identificados y elucidados estructuralmente como análogos del ácido quínico.

SOMARIO DE LA INVENCIÓN Si la planta de la especie Uncaria es extraída con agua caliente, lo cual ha sido la práctica histórica para el uso medicinal, y a continuación se ultrafiltra para disminuir los componentes de alto peso molecular (>10,000), incluyendo, por ejemplo, los conjugados tóxicos de los taninos, todavía permanecerá en ' la fracción no ultrafiltrada , una preparación fitomedicinal novedosa de Uncaria (por ejemplo, extracto C-MED-100®) , que tiene potentes propiedades inmunológicas, antitumorales, antiinflamatorias y de reparación mejorada del ADN. En una modalidad preferida de la presente invención, el extracto C-MED-100® se disuelve en agua, se seca por aspersión y el agente del secado por aspersión (almidón) se elimina mediante precipitación con etanol acuoso al 90%. La solución resultante se somete a cromatografía en capa fina (TLC) sobre gel de sílice para identificar los ingredientes activos que dan al producto su eficacia. El extracto C-NMD-100® en etanol al 90% se salpica (se aplica a) a placas para TLC (gel de sílice 60 F254) y a continuación se someten a cromatografía en un sistema de aproximadamente 1% de amoníaco en más que aproximadamente 95% de etanol. Únicamente hay un área en el cromatograma de la TLC que tiene actividad biológica (a Rf=0.2-0.3) cuando se eluye con amoníaco acuoso al 1% y posteriormente se bioensaya para la capacidad de destruir células de un tumor mediante la inducción de la apoptosis. El compuesto con Rf=0.2-0.3 muestra una absorción ultravioleta máxima en agua a aproximadamente 200 nm, se absorbe en carbón y es caracterizado químicamente como un CAE por la reacción con hidroxilamina y cloruro férrico. (Bartos, Colorimetric determination of organic compounds by formation of hydroxamic acids, Talanta 27: 583-590, 1980) . En otra modalidad de esta invención, los CAE biológicamente activos aislados del extracto de Pero, de manera preferida el extracto C-MED-100®, se purifican adicionalmente y se identifican estructuralmente como un análogo del ácido quínico. La elución de las placas de la TLC en sílice con amoníaco acuoso probó ser necesaria, debido a una unión muy fuerte con la sílice. Aunque la marca de Rf=0-2-0.3 está esencialmente libre de otros componentes del extracto C-MED-100®, contiene cantidades relativamente grandes de sílice inorgánica disuelta. Con el fin de eliminar los componentes inorgánicos introducidos del esquema de purificación en TLC sobre sílice, la solución acuosa al 1% de amoníaco se liofiliza y a continuación se redisuelve en metanol , dejando atrás la sílice solubilizada . La marca de Rf=0.2-0.3 se cristaliza a partir de metanol y se identifica posteriormente mediante análisis químicos como ácido quínico. Así, una modalidad de la presente invención comprende un método para aislar el componente bioactivo del extracto de Pero, de manera preferida, el extracto C-MED-100®, que comprende: (a) precipitar el portador del secado por aspersión del extracto de Pero, mezclando el extracto con agua destilada y evaporar el etanol y liofilizar el extracto disuelto en agua; (b) mezclar el extracto liofilizado con agua destilada y etanol para obtener una mezcla para salpicarla en la cromatografí en capa fina; (c) salpicar la mezcla en placas para TLC corridas previamente y someter a cromatografía las placas en un sistema de aproximadamente 1% de amoníaco y etanol, obteniendo por lo tanto, una banda fluorescente con Rf-0.2-0.3; (d) rascar la banda fluorescente con Rf=0.2-0.3; (e) eluir la banda rascada con amoníaco acuoso y liofilizar la banda rascada eluida hasta sequedad, para formar un polvo; (f) extraer el polvo con metanol para eliminar el gel de sílice solubilizado, dejando una solución de metanol; (g) concentrar la solución de metanol y (h) cristalizar la solución concentrada para obtener el componente bioactivo. Otra modalidad de la presente invención comprende la identificación del componente bioactivo del extracto de Pero, de manera preferida, el extracto C-MED-100®, obtenido por el método anterior. En esta modalidad, el componente bioactivo exhibe las mismas propiedades que el extracto de Pero y consiste esencialmente de un análogo del ácido quínico. De manera preferida, el análogo del ácido quínico es la lactona del ácido quínico. En otra modalidad, la presente invención comprende una composición farmacéutica que comprende una cantidad farmacéuticamente efectiva del componente bioactivo del extracto de Pero y un portador o diluyente inerte no tóxico. La presente invención también incluye modalidades que comprenden utilizar la composición farmacéutica para (i) mejorar la competencia inmune de un mamífero, inhibiendo la producción de TNF-a o induciendo la apoptosis de los leucocitos, que comprende administrar la composición farmacéutica en una cantidad efectiva para inhibir la producción de TNF-a o para inducir la apoptosis de los leucocitos; (ii) tratar los trastornos asociados con el sistema inmune de un mamífero, inhibiendo la producción de TNF-a o induciendo la apoptosis de los leucocitos, que comprende administrar la composición farmacéutica en una cantidad efectiva para inhibir la producción de TNF-Cí o para inducir la apoptosis de los leucocitos; (iii) inhibir la respuesta inflamatoria de un mamífero, inhibiendo la producción de TNF-ct o induciendo la apoptosis de los leucocitos, que comprende administrar la composición farmacéutica en una cantidad efectiva para inhibir la producción de TNF-Ot o para inducir la apoptosis de los leucocitos; (iv) tratar los trastornos asociados con la respuesta inflamatoria de un mamífero, inhibiendo la producción de TNF-Oí o induciendo la apoptosis de los leucocitos, que comprende administrar la composición farmacéutica en una cantidad efectiva para inhibir la producción de TNF-OC o para inducir la apoptosis de los leucocitos; (v) mejorar la respuesta antitumoral de un mamífero, induciendo la apoptosis de las células del tumor, que comprende administrar la composición farmacéutica en una cantidad efectiva para inducir la apoptosis de las células del tumor; (vi) tratar los trastornos asociados con la respuesta de un mamífero a la formación y crecimiento de un tumor, induciendo la apoptosis de las células del tumor, que comprende administrar la composición farmacéutica en una cantidad efectiva para inducir la apoptosis de las células del tumor y (vii) mejorar los procesos de reparación del ADN de un mamífero, y por lo tanto, proporcionar una actividad antimutagénica importante para tratar los trastornos del enve ecimiento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra la regresión lineal de la absorbancia UV versus CAE (estimada como _g/ml utilizando ftalato de dioctilo como patrón) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El método y la composición de la presente invención se entenderán mejor con referencia a los siguientes ejemplos.

EJEMPLO 1: Aislamiento y purificación del componente bioactivo del extracto de Pero. El método de preparación y la composición del extracto de Pero, de manera preferida, el extracto C-MEDIO0®, se describe en las patentes de Pero, que se incorporan aquí como referencia. El extracto C-MED-100®, una modalidad preferida del extracto de Pero, es una extracción en agua caliente de Uña de Gato (Uncaria tomentosa) , llevada a cabo durante 18-24 horas a 90-1002C y ultrafiltrada para eliminar los compuestos con un peso molecular mayor que 10,000, como se describió previamente en las patentes de Pero. El extracto C- ED-100® se prepara además para el mercado comercial secando por aspersión el extracto con almidón de maíz (Secador por Aspersión Niro F-10) . Los procedimientos se utilizan actualmente para purificar los componentes activos del extracto C-MED-100® como CAE y se entiende que estos procedimientos se aplicarían a cualquier extracto de Pero. Los procedimientos son: 1. Tratamiento del extracto C-MED-100® para la estimación del ingrediente activo: Los CAE en el extracto C-MED-100® tienen una solubilidad en agua bastante inusual. Tienden a unirse a los polímeros de tanino y de polisacárido , y por lo tanto, cuando se secan, son difíciles de redisolver en solventes orgánicos apropiados, tales como etanol. El procedimiento preferido, y debe entenderse que los parámetros proporcionados son aproximaciones y no limitaciones estrictas, es: (a) 100 mg del extracto C-MED-100® se disuelven en 1 mi de agua destilada en un tubo de vidrio durante 30 minutos. La solución disuelta se centrifuga a 2000 x g durante 10 minutos. El primer sobrenadante resultante se reserva para el análisis. (b) 200 µ? del primer sobrenadante se colocan en un nuevo tubo de vidrio y se agregan a los mismos, 4.8 mi de etanol al 99.7%. La solución resultante contiene 4 mg/ml de extracto C-MED-100® suspendidos en aproximadamente 96% de etanol . (c) La solución de extracto C-MED-100®/etanol se somete a un vórtice (se mezcla) y se centrifuga a 2000 x g para eliminar el material insoluole. El segundo sobrenadante resultante se reserva para el análisis. (d) El segundo sobrenadante se diluye de una concentración del extracto C-MED-100® de 4 mg/ml a una de 30-200 µg/ml con etanol al 99.7% para la medición de la absorbancia UV. De manera preferida, las concentraciones de 60 y 120 µg/ml se examinan como concentraciones por duplicado para el cálculo del CAE por absorbancia UV. (e) La absorbancia UV a 205 nm para las dos concentraciones de extracto C-MED-100® (de manera preferida 60 y 120 µg/ml) se mide en un espectrofotómetro UV. Debido a que los CAE en el extracto C-MED-100® tienen una absorción UV máxima a 205 nm, la cantidad de CAE puede estimarse por el grado de absorción UV. La curva patrón que muestra la cantidad de CAE en µg/ml con relación al grado de absorción UV se muestra en la Figura 1. (f) El cálculo de la concentración de CAE, en µg/ml, se determina por el análisis de la regresión lineal de la pendiente que mejor se ajusta por la ecuación y=0.0491x + 0.212, en donde y=valores determinados de la absorbancia UV y x=concentración de CAE (Hg/ml) . Las dos concentraciones diferentes del extracto C-MED-100® (de manera preferida 60 y 120 g/ml) sirven entonces como el denominador, por lo que el CAE calculado de la curva UV patrón sirve como el nominador en el cálculo del porcentaje de CAE en el extracto C-MED-100®. En la práctica, los dos valores de promedian. (g) El procedimiento anterior se ha validado contra un procedimiento colorimétrico que involucra la conversión del CAE a los ácidos hidroxámicos y la reacción con cloruro férrico. (Bartos, Colorimetric determination of organic compounds by formation of hydroxamic acids, Telanta 27:583-590, 1980) . Los dos procedimientos dan la misma estimación del contenido de CAE. 2. Procedimientos analíticos para la purificación final y el aislamiento del ingrediente activo del extracto C-MED-100®. Nuevamente, los parámetros proporcionados son aproximaciones y deben servir como ejemplos y no como limitaciones : (i) Precipitación del portador del secado por aspersión (almidón de maíz) de los extractos acuosos crudos del extracto C-MED-100®: 5 g del extracto C-MED-100® se mezclan con 50 mi de agua destilada y 950 mi de etanol al 99.7%. El etanol se evapora en el aire y la solución resultante se liofiliza. El rendimiento es de aproximadamente 1 g. (ii) Purificación y aislamiento por cromatografía en capa fina (TLC) sobre gel de sílice del ingrediente activo del extracto C-MED-100®: Paso 1: A 200 mg del extracto C-MED-100® menos la eliminación del almidón (después del procedimiento no. 1 anterior) , se le agregan 200 µ? de agua destilada y 200 µ? de etanol al 95.5%. Mezclar para formar la mezcla para salpicar . Paso 2 : Salpicar la mezcla para salpicar del Paso 1 en 4 placas para TLC corridas previamente (Gel de sílice 6OF254) . El sistema de elución consiste de aproximadamente 1% de NH3 en al menos 95% de etanol. El único componente activo se encuentra a Rf=0.2-0.3. Paso 3 : Rascar la banda azul fluorescente con Rf-0.2-0.3. Eluir con aproximadamente 1% de amoníaco acuoso y liofilizar hasta sequedad. Paso 4 : Extraer el polvo del Paso 3 con metanol para eliminar el gel de sílice solubilizado . Concentrar la solución de metanol y cristalizar el componente activo. (iii) Determinación cuantitativa por cromatografía líquida a alta presión (HPLC) del componente activo: La columna es de manera preferida, una columna Cíe de 3 µp? (83 mm x 4.3 mm de diámetro interno, Perkin Elmer Corp., Norwalk, CT) . La elución preferida del gradiente del solvente es como sigue: La bomba B contiene metanol y la bomba A contiene 1% de ácido acético en agua destilada. Se corrió un gradiente del 10% al 90% durante un periodo de 25 minutos a una velocidad de flujo de 1.5 ml/min. La detección es a 254 nm de UV. El punto máximo aparece a los 18 minutos en la corrida del gradiente. (iv) Detección espectrofotométrica de los ingredientes activos: El componente activo del extracto C-MED-100® tiene una absorción máxima en agua en el intervalo UV a aproximadamente 200 nm. Por lo tanto, los extractos crudos del extracto C-MED-100® también tiene una absorción máxima a aproximadamente 200 nm, asi como sus componentes activos purificados tales como los CAE, y sus ácidos orgánicos correspondientes pueden estimarse por la absorción UV a esta longitud de onda contra un patrón de CAE conocido. Un ensayo de la actividad biológica del extracto C-MED-100® se prepara como sigue: Células HBL-60 W6899 se exponen en un microcultivo a 5000 células por pozo (placas de 96 pozos) durante a 5 días a 37 SC en un incubador de C02. Después de la incubación, las células se lavan con suero fisiológico y la clonogenicidad se estima mediante un ensayo de MTT. Los resultados del ensayo se resumen en la Tabla 1, siguiente.

EJEMPLO 2 : Identificación analítica del ingrediente activo del extracto C-NMD-100® como ácido quinico» El componente bioactivo (muestra de aproximadamente 1 mg) aislado por TLC se disuelve completamente en aproximadamente 0.7 mi de D20 para RMN sin ningún reactivo de desplazamiento agregado. Se registran los siguientes espectros. RMN 020108ta -1: LH -2: 1H/1H-espectros correlacionados; COSY -3: lH/13C-espectros correlacionados; HMBC. -4: 13C-Deptl35. -5: 1H/13C-espectros correlacionados; HMQ El espectro """H contiene señales de un compuesto principal. Se encuentra que las tres señales de ""? a 4.03, 3.90 y 3.43 ppm son señales de los grupos metino (véase HMQC) . Además, las señales de 13C obtenidas a 66.9 B 75.1 se correlacionan con estos protones y sus desplazamientos químicos implican que estos carbonos están unidos al oxígeno, posiblemente como grupos CHOH. Las tres señales están unidas unas con otras en una cadena lineal, como se encuentra en el espectro COSY. El compuesto principal también mostró señales de XH a aproximadamente 1.72 B 1.99 ppm con correlaciones a las señales de C a aproximadamente 40 ppm. El espectro HMQC revela que estas señales son grupos CH2 y que el espectro COSY implica que los protones individuales en cada grupo CH2 no son iguales. A juzgar por el espectro COSY, los dos grupos CHOH externos están unidos a diferentes grupos C¾ . Esto proporciona la siguiente estructura parcial.

Sin embargo, como muchos de los acoplamientos H- H fueron mayores/menores en comparación con los acoplamientos normales, parece probable que la rotación del compuesto estaba impedida estericamente, y por lo tanto, se sugirió un sistema anular. Además, como los desplazamientos 13C para los grupos CH2 estuvieron cerca de 40 ppm, parece probable que Rl = R2 = un átomo de carbono. Esto da la siguiente estructura parcial.

No pueden encontrarse señales que expliquen a X y Y en el compuesto en el espectro R N. Después de que se obtuvo el espectro RMN, también se realizaron análisis de MS . La muestra se introdujo en el MS por infusión. Los espectro de MS en la solución de D20 diluida con acetonitrilo (ACN) (50/50) dio el número de masa de 197 (iones negativos, M-D=195) . A continuación, la solución se evaporó por medio de una corriente suave de nitrógeno y se reconstituyó en ¾0/ACN (50/50) . Aquí se alcanzó el número de masa de 192 (iones negativos, M-H=191) . En conclusión, el número de masa del compuesto es de 192 y contiene 5 protones intercambiables. Cuando se combina la información obtenida de la RMN y la MS, se propone la siguiente estructura para el compuesto principal: Ácido Quínico Esta estructura es el ácido quínico. Los espectros de referencia obtenidos utilizando ácido quínico auténtico fueron idénticos a aquél aislado y purificado del extracto C-MED-100®. El ácido quínico, ahora identificado como el ingrediente activo del extracto C-MED-100®, es un compuesto conocido que aparece como un metabolito intermediario en la síntesis natural de muchos compuestos aromáticos. (Bohm, BA, Shikimic acid (3 , 4 , 5- trihydroxy-l-cyclohexene-l-carboxylic acid) , Chem. Rev. 65: 435-466, 1965) . Por lo tanto, se describe aquí que se espera que el ácido quínico y su análogo aparezcan en muchas especies botánicas, otorgándoles beneficios nutritivos y de salud adicionales. La única técnica anterior conocida que describe algún uso médico del ácido quínico y sus análogos es para el tratamiento de las arrugas de la piel (Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,656,665 y 5,589,505) y de la gripe como inhibidores de la neuroamidasa (Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,111,132 y 6,225,341) . No ha habido una descripción en la técnica anterior de que el ácido quínico y sus análogos puedan ser útiles en el tratamiento de los trastornos para los cuales el extracto C-MED-100® ha sido útil, tales como el enve ecimiento, inflamación, inmunosupresión y control del crecimiento de un tumor y reparación del ADN. Por lo tanto, esta descripción es de estos usos adicionales para el ácido quínico y sus análogos, especialmente la lactona del ácido quínico. Además, el ácido quínico no da una reacción química positiva para un CAE. Sin embargo, tras la revisión de esta estructura, se vuelve evidente que el ácido quínico puede formar una lactona del ácido quínico con el calentamiento, la cual, a su vez, reaccionaría como un CAE (Fischer, H. 0. y Dangschat, G. Helv. Chim Acta 18: 1200, 1935). Además, el tratamiento de la lactona del ácido quínico con amoníaco acuoso al 1% la convertiría nuevamente al ácido quínico. Esta química fue validada utilizando ácido quínico purificado y establece que el ingrediente activo presente en el extracto C-MED-100® se ha sintetizado durante la preparación médica histórica de este producto de Uña de Gato. El Ejemplo 3 proporciona esta validación. Ácido Quínico Lactona del ácido quínico EJEMPLO 3: Este ejemplo explota el conocimiento bioquímico presentado en los ejemplos 1 y 2 para determinar que el componente activo del extracto C-MED-100® es, de hecho, la lactona del ácido quínico. El C-MED-100®, el ácido quínico y la lactona del ácido quínico se absorben todos en carbón y cuando lo hacen, tanto la actividad biológica como la absorción UV a 200 nm del extracto C-MED-1 00® también se eliminaron. Estos datos muestran que el componente bioactivo de extracto C-MED- 100® se absorbe de manera máxima a 2 00 nm. Los resultados de la TLC reportan que hay únicamente 2 componentes del extracto C-MED- 100® que tienen tal absorción máxima. Estos componentes, localizados a Rf= 0 . 05 y Rf= 0 . 3 , cuando se someten a cromatografía en amoníaco al 1 % en etanol, corresponden al ácido quínico y la lactona del ácido quínico, respectivamente . Sin embargo, tras la evaluación, las propiedades bioactivas del componente bioactivo del extracto C-MED- 100® podrían estar casi completamente constituidas por la lactona del ácido quínico. Como resultado, las propiedades de antienvejecimiento, antiinflamatorias, inmunes y de reparación mejorada del ADN y antitumorales del extracto C-MED- 100® se deben a la presencia de la lactona del ácido quínico. Estas propiedades se describen aquí como atribuibles a la lactona del ácido quínico. La Tabla 1 ilustra las actividades bioquímicas relativas de (i) el componente bioactivo aislado del extracto C-MED- 100® , (ii) el ácido quínico y (iii) la lactona del ácido quínico: El ácido quínico puede comprarse de Sigma (>99%) . La lactona del ácido quínico (>95) se sintetizó a partir del ácido quínico por sublimación a 250eC como se describió previamente (Fischer, HOL y Dangschat G. Zur konfiguration der skikimisaure . Helv. Chim. Act 18:1204, 1935) . Se agregaron diluciones en serie de los compuestos de prueba a las células leucémicas HL-60 (0.05 x 106 células /mi) en placas de fondo plano de 96 pozos, para dar concentraciones finales en los cultivos de hasta 3000 µg/ml. Las placas de microtitulación se incubaron durante 72 horas a 372C, se sometieron a impulsos con 20 µ? de MTT (5 mg/ml) durante 3 horas y el color se estimó espectrofotometricamente a 540 nanómetros, como se describió previamente (Schweitzer, C M et al. Spectrophotometric determination of clonogenic capacity of leukemic cells in semisolid microtiter culture systems. Experimental Hematology 21:573-578, 1993) .

Tabla 1. Comparación del ingrediente activo del extracto C-MED-100® con el ácido quínico y su lactona. (Los parámetros son aproximaciones) .

Parámetro Químico Ingrediente Ácido quínico activo del extracto C- Ácido Lactona MED-100® quínico Absorción de carbón en sí sí sí agua Auv máxima en agua 200 nm 200 nm 200 nm TLC en aproximadamente Rf=0-0.05 Rf=0-0.05 1% de amoníaco en 99% Rf=0.2-0.3 de etanol, utilizando A200 para la detección Rf=0.2-=.3 Formación del complejo sí no si coloreado de ácido hidroxámico/cloruro férrico Eficacia del bioensayo 40 µg/ml >3000 Mg/ml 80 g/ml utilizando la CI50 las células HL-60 Bioensayo después de >300 µg/ l >3000 |Og/ml >3000 µg/ml amoníaco acuoso al 1% CI50 células HL-60 De la comparación anterior, es evidente que el componente bioactivo en el extracto C-MED-100® es, de hecho, la lactona del ácido quínico. De manera específica, los valores relativos de CI50 para el componente bioactivo del extracto C-MED-100®, el ácido quínico y la lactona del ácido quínico, confirman que el componente bioactivo no puede ser el ácido quínico, per se, sino que debe ser un análogo del mismo, tal como la lactona del ácido quínico o la sal formada por el tratamiento con amoníaco al 1%. La diferencia en los valores de CI50 para el componente bioactivo del extracto C-MED-100® y la lactona del ácido quínico no es significativa, y probablemente se debe al efecto sinergístico de otros compuestos presentes en el extracto C-MED-100®. Sin embargo, la eficacia más alta del ingrediente activo, la lactona del ácido quínico, en el extracto C-MED-100® que en su forma pura, indica que la lactona del ácido quínico es más activa en la presencia de otros componentes que aparecen de manera natural en el extracto C-MED-100®, tal como el ácido quínico o su sal de amonio . Aunque la invención se ha descrito con respecto a ciertas modalidades específicas, se apreciará que pueden hacerse muchas modificaciones y cambios por aquellos con experiencia en la técnica, sin apartarse de la invención. Se pretende, por lo tanto, por lo anexo, que cubra tales modificaciones y cambios, que puedan caer dentro del verdadero alcance y espíritu de la invención.

Claims (9)

REIVINDICACIONES ;

1. Un método para aislar un componente bioactivo de un extracto soluble en agua de una especie botánica, en donde el extracto exhibe una UV máxima a aproximadamente 199 nm, es estable a temperaturas menores que 100 aC durante 24 horas y a la esterilización en autoclave durante hasta al menos 20 minutos a aproximadamente 1212C, mantiene la actividad biológica durante al menos 6 meses cuando se congela en forma líquida a aproximadamente -20SC y consiste esencialmente de moléculas que tienen un peso molecular de aproximadamente 12,000, que comprende: (a) eliminar los componentes insolubles en alcohol del extracto soluble en agua por la precipitación con una primera solución de alcohol; b) salpicar el extracto soluble en agua que resulta del paso (a) en placas para cromatografía en capa fina (TLC) corridas previamente, y someter a cromatografía las placas salpicadas en un sistema de aproximadamente 1% de amoníaco en una segunda solución de alcohol, obteniendo por lo tanto una banda fluorescente con un Rf=0.2-0.3,· (c) separar la banda fluorescente con Rf=0.2-0.3;: (d) eluir la banda fluorescente separada con amoníaco acuoso y secar la banda fluorescente separada eluida para formar un polvo; (e) extraer el polvo con una tercera solución de alcohol para eliminar el gel de sílice no solubilizado en el alcohol, dejando la tercera solución de alcohol; (f) concentrar la tercera solución de alcohol; y (g) separar el componente bioactivo de la tercera solución concentrada de alcohol.

2. El método para aislar un componente bioactivo según la reivindicación 1, en donde la especie botánica es la especie uncaria.

3. El método para aislar un componente bioactivo según la reivindicación 1, en donde el extracto soluble en agua es de uncaria tomatosa .

4. Un componente bioactivo de un extracto soluble en agua de una especie botánica, en donde el componente bioactivo consiste esencialmente de uno o más ésteres de carboxialquilo (CAE) .

5. El componente bioactivo según la eivindicacion 4, en donde los CAE son análogos del ácido quínico.

6. El componente bioactivo según la eivindicacion 5, en donde los análogos del ácido uínico incluyen la lactona del ácido quínico o una sal del ácido quínico.

7. El componente bioactivo según la eivindicacion 4, en donde los cae están en presencia del ácido quínico.

8. Una composición farmacéutica que comprende: a) una cantidad farmacéuticamente efectiva de uno o más ésteres de carboxialquilo (CAE) , para inhibir la producción de TNF-a o para inducir la apoptosis de los leucocitos; y b) un portador o diluyente inerte no tóxico. . La composición farmacéutica según la reivindicación 8, en donde los CAE son análogos del ácido quínico . 10. La composición farmacéutica según la reivindicación 8, en donde el análogo del ácido quínico incluye la lactona del ácido quínico o una sal del ácido quínico . 11. Un método de administración, que comprende administrar a un mamífero la composición farmacéutica según la reivindicación 8. 12. Un método según la reivindicación 11, que comprende además, mejorar la competencia inmune del mamífero, inhibiendo la producción de TNF-a o induciendo la apoptosis de los leucocitos, la inhibición surge por la administración al mamífero de la composición farmacéutica de la reivindicación 8, en una cantidad efectiva para inhibir la producción de TNF-a o para inducir la apoptosis de los leucocitos. 13. El método según la reivindicación 11, que comprende además, tratar los trastornos asociados con el sistema inmune de un mamífero, inhibiendo la producción de TNF-a o induciendo la apoptosis de los leucocitos, la inhibición surge por la administración al mamífero de la composición farmacéutica de la reivindicación 8, en una cantidad efectiva para inhibir la producción de TNF-a o para inducir la apoptosis de los leucocitos. 14. El método según la reivindicación 11, que comprende además, inhibir la respuesta inflamatoria del mamífero inhibiendo la producción de TNF-a o induciendo la apoptosis de los leucocitos, la inhibición surge por la administración al mamífero de la composición farmacéutica de la reivindicación 8, en una cantidad efectiva para inhibir la producción de TNF-a o para inducir la apoptosis de los leucocitos. 15. El método según la reivindicación 11, que comprende además, tratar los trastornos asociados con la respuesta inflamatoria de un mamífero, inhibiendo la producción de TNF-a o induciendo la apoptosis de los leucocitos, la inhibición surge por la administración al mamífero de la composición farmacéutica de la reivindicación 8, en una cantidad efectiva para inhibir la producción de TNF-a o para inducir la apoptosis de los leucocitos . 16. El método según la reivindicación 11, que comprende además, aumentar la respuesta antitumoral de un mamífero, induciendo la apoptosis de las células del tumor, la inducción surge por la administración al mamífero de la composición farmacéutica de la reivindicación 8, en una cantidad efectiva para inducir la apoptosis de las células del tumor. 17. El método según la reivindicación 11, que comprende además, tratar los trastornos asociados con la respuesta de un mamífero a la formación y crecimiento de un tumor, induciendo la apoptosis de las células del tumor, la inducción surge por la administración al mamífero de la composición farmacéutica de la reivindicación 8, en una cantidad efectiva para inducir la apoptosis de las células del tumor. 18. El método según la reivindicación 11, que comprende además, aumentar el proceso de reparación de ADN de un mamífero, la mejora surge por la administración al mamífero de una cantidad farmacéuticamente efectiva de la composición farmacéutica de la reivindicación 8. 1

9. El método según la reivindicación 11, que comprende además, tratar los trastornos asociados con el envejecimiento de un mamífero, por la administración al mamífero de una cantidad farmacéuticamente efectiva de la composición farmacéutica de la reivindicación 8. 20. El método según la reivindicación 11, que comprende además, mejorar la competencia inmune de un mamífero, estimulando la recuperación de las células sanguíneas periféricas después del empobrecimiento a partir de exposiciones tóxicas metabólicas o ambientales, la estimulación surge por la administración al mamífero de la composición farmacéutica de la reivindicación 8. 21. Un componente bioactivo de un extracto soluble en agua de una especie botánica, aislado según el método de la reivindicación 1. RESUMEN DE LA INVENCIÓN Un método para aislar el componente bioactivo de un extracto soluble en agua de Uncaria tomentosa, conocido como extracto C-MED- 100®, que comprende (i) precipitar el portador del secado por aspersión del extracto C-MED- 100® para obtener la mezcla para salpicarla en la cromatografía en capa fina (TLC) ; (iii) salpicar la mezcla para salpicar del extracto C-MED- 100® en placas para TLC corridas previamente y eluir las placas para obtener una banda fluorescente con Rf=0 . 2 - 0 . 3 ; (iv) rascar la banda con Rf= 0 . 2 - 0 . 3 eluyendo con amoniaco y liofilizar la banda eluida para formar un polvo; y (v) extraer el polvo con metanol para eliminar el gel de sílice solubilizado, concentrar la solución de metanol y cristalizar la solución concentrada para obtener el componente bioactivo. El componente bioactivo aislado es un análogo del ácido quínico, de manera preferida, la lactona del ácido quínico. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad farmacéuticamente efectiva del componente bioactivo y un portador o diluyente inerte no tóxico. El componente bioactivo puede utilizarse para mejorar la competencia inmune, tratar los trastornos asociados con el sistema inmune, inhibir la respuesta inflamatoria, tratar los trastornos asociados con la respuesta inflamatoria, mejorar la respuesta antitumoral y tratar los trastornos asociados con la respuesta a la formación y crecimiento de un tumor, todo en mamíferos.