MXPA04008061A - Uso de inhibidor o antagonista contra factor tisular. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se relaciona con el uso de un inhibidor o antagonista contra factor tisular, TF, en la produccion de un farmaco para el tratamiento o prevencion de la diabetes o enfermedades relacionadas con la diabetes. Se pretende que el inhibidor o antagonista sea principalmente para el tratamiento de pacientes diabeticos que sufren de diabetes de tipo I o de tipo II, respectivamente, asi como el sindrome metabolico precedente a la diabetes del tipo II. El inhibidor o antagonista es un agente el cual inhibe completa o parcialmente la produccion de TF, como un anticuerpo anti-TF o un plasmido recombinante antisentido que actua sobre el gen de TF.

Description

USO DE INHIBIDOR O ANTAGONISTA CONTRA FACTOR TISULAR Campo de la Invención La presente - invención se relaciona con el uso de un inhibidor o antagonista contra factor tisular, TF, para la producción de un fármaco para el tratamiento o prevención de la diabetes o enfermedades relacionadas con la diabetes. Se pretende que el inhibidor o antagonista sirva principalmente para el tratamiento de pacientes diabéticos que sufran de diabetes del tipo I o del tipo II, respectivamente, así como síndrome metabólico que precede a la diabetes del tipo II. En el primer caso (diabetes tipo I) el antagonista o inhibidor es usado en asociación con el transplante de islotes de Langerhans a paciente del tipo I para mejorar la sobrevivencia de los islotes. En el último caso el antagonista o inhibidor es usado para prevenir la arteriesclerosis y enfermedad cardiovascular observada en pacientes diabéticos del tipo II.

Antecedentes de la Invención La hemostasis es crucial para la sobrevivencia. Cualquier perturbación el equilibrio hemostático como daño a la pared de un bazo, conduce a una activación inmediata del sistema de coagulación. In vivo el sistema de coagulación es activado principalmente por el factor tisular (TF) de la Ref: 158003 glicoproteína transmembranal de 47 kD, el cual actúa como cofactor para al escisión del factor VII a Vlla, para la función proteolítica del factor Vlla de la vía (extrínseca) de coagulación del factor tisular y como un receptor. El TF pertenece a la superfamilia de receptores de citosina y cuando se compleja con el factor Vlla, ha mostrado activar la transducción de señales intracelulares implicada en la angiogénesis, diapédesis e inflamación. El TF es expresado constitutivamente por células en la adventicia de los vasos sanguíneos, y también en tejidos ricamente vascularizados como la placenta, el cerebro y los pulmones. Normalmente, las células expuestas a la sangre como las células endoteliales y monocitos no expresan TF, pero ciertos estímulos inflamatorios como LPS, complejos inmunes y citocinas pueden inducir la expresión de TF en esas células. El TF es regulado estrictamente por el inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI) en sangre. Varias publicaciones recientes han presentado evidencias de cantidades mínimas de TF críptico en la sangre que pueden ser activadas por estímulos no definidos. Se considera que el TF portado por la sangre permite la activación inmediata de la cascada de coagulación pero también es probablemente un contribuyente al TF encontrado en las placas arterioscleróticas . El origen del TF portado por la sangre es hasta ahora desconocido. Existe un acoplamiento potencial entre la hiperinsulinemia/hiperglicemia y la activación de la cascada de .coagulación. Ceriello et al reportaron que la activación de la coagulación se incrementa después de un alimento. Esto fue subrayado por estudios que muestran que la infusión de glucosa indujo un incremento transitorio en la generación de FVIIa, reflejando la activación de la vía de TF, y en la generación de trombina en sujetos normales. Este efecto fue aún más pronunciado en pacientes con diabetes mellitus tipo 2 que tuvieron periodos prolongados de hiperglicemia/hiperinsulinemia . De manera notable, el mismo nivel de hiperglicemia combinado con infusión simultánea de insulina que reduce la secreción interna de insulina, abrogó en la actividad de la vía del TF . No únicamente los individuos con diabetes mellitus tipo 2 sino también aquellos con BMI alta, es decir, individuos con resistencia a la insulina y en consecuencia producción y niveles incrementados de insulina en circulación, han incrementado la actividad de la vía de TF. Este estado hipercoagulable en pacientes con diabetes mellitus tipo 2 es una explicación concebible del incremente de riesgo de complicaciones vasculares diabéticas en este grupo de pacientes . Otra asociación potencial entre el TF y los islotes de Langerhans es la reacción de coagulación activada por los islotes expuestos a sangre compatible ABO tanto en el transplante clínico de islotes como en estudios experimentales. Esta reacción, designada como reacción inflamatoria instantánea mediada por al sangre (IBMIR) , se caracteriza por una activación inicial en sistemas de la coagulación y el complemento, unión y activación rápida de las plaquetas, unión de leucocitos, junto con la perturbación resultante de la integridad del islote, y que conduce a trombos rodeando los islotes. Durante muchos años el transplante clínico de islotes ha tenido una tasa de éxito, evaluada como independencia de la insulina después de un año, de aproximadamente el 10%. El año pasado Shapiro et a-1. efectuaron un avance dado que demostraron que la independencia de la insulina podía ser obtenida si el paciente era tratado con transplantes repetidos de más de un donador. Un estudio de seguimiento del mismo grupo mostró que los pacientes transplantados tuvieron una función de células ß correspondiente a solo 20% de los individuos sanos a pesar de que los pacientes habían recibido islotes de más de un donador. Combinados, esos descubrimientos subrayaron que estaría implicado un proceso adverso, muy probablemente la pérdida de tejido transplantado.

Sumario de la Invención Los inventores de la presente encontraron, de manera sorprendente, que el factor tisular es expresado en islotes de Langerhans humanos. El factor tisular fue encontrado en la mayoría de las células endocrinas dentro de los islotes pero no en aquellas del tejido exógeno. El descubrimiento inesperado de que el TF es expresado y producido por las células endocrinas en los islotes de Langerhans ( "TF producido por islotes") indica que el TF es liberado en asociación con la liberación de insulina. Este TF es muy probablemente responsable del incremento del riesgo de arteriosclerosis y enfermedad cardiovascular en pacientes con diabetes del tipo II o preetapas de la misma y objetos con tolerancia a la glucosa empeorada. De este modo, puede ser usado un inhibidor antagonista contra la producción de TF en lo islotes de Langerhans o la liberación de factor tisular, o al menos una forma activa del mismo, de los islotes, para evitar la arteriosclerosis y enfermedad cardiovascular en esos pacientes. Es razonable creer que la IBMIR explica la pérdida de tejido inicial que ocurre durante el transplante clínico de islotes. La activación de la IBMIR no es conocida pero los inventores de la presente han demostrado que la IBMIR puede ser abrogada in vitro por Melagatran, un inhibidor de trombina, indicando que la IBMIR depende, de manera crítica de la activación de trombina. La trombina puede ser generada por dos vías: la vía del factor tisular (vía extrínseca) y un ciclo de amplificación que implica la vía intrínseca. En consecuencia, una producción local de TF en islotes humanos es más probablemente la iniciadora de la IBMIR. De este modo, un inhibidor antagonista contra el TF puede suprimir o eliminar la IBMIR y esta estrategia puede ser usada para el tratamiento de paciente con diabetes del tipo I en asociación con el transplante de islotes para mejorar la sobrevivencia y evitar el rechazo de los islotes transplantados. De este modo, en un primer aspecto, la invención se relaciona con el uso de, o método de uso de, un inhibidor o antagonista contra el factor tisular, TF, en la producción de un fármaco para el tratamiento o prevención de la diabetes; o enfermedades relacionadas con la diabetes. La expresión "diabetes o enfermedades relacionadas con la diabetes" incluye tolerancia a la glucosa empeorada o resistencia a la insulina con producción no normal de insulina (por ejemplo, hipersecreción de insulina) y enfermedades resultantes de esas como la arteriesclerosis, enfermedades cardiovasculares (por ejemplo, infarto al miocardio agudo) y enfermedades cerebrovasculares (por ejemplo hemorragia e infarto) . El inhibidor/antagonista puede ser cualquier agente que afecte al TF sobre el ADN, ARN o al nivel de proteína, y de este modo puede ser seleccionado del grupo de inhibidores de TF conocidos, aunque el agente no se restringe a aquellos. En el contexto de la presente invención, la expresión "inhibición de TF" significa la inhibición completa o parcial de la producción de TF , así como la liberación de TF especialmente en una forma activa del mismo, de los islotes. La invención comprende además la inhibición del TF producido por los islotes liberado. "Inhibidor" significa sustancias capaces de la inhibición del TF . Una primera modalidad de la invención proporciona el uso, como arriba, en la producción de un fármaco para la administración en asociación con el transplante de células productoras de insulina a pacientes con diabetes mellitus insulinodependiente, IDDM. En una segunda modalidad, la invención proporciona el uso de in inhibidor/antagonista contra el TF para la producción de un fármaco para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares y/o arteriosclerosis . El TF libre se une a las placas arterioscleróticas y contribuye al incremento de riesgo de trombosis en, por ejemplo, infarto al miocardio. Se espera que este uso sea especialmente importante para el tratamiento de pacientes con diabetes del tipo II o preetapas de la misma. El inhibidor o antagonista contra el TF puede ser un anticuerpo anti-TF que tiene el efecto biológico de unir TF especialmente TF producido por los islotes. El inhibidor o antagonista contra el TF también puede ser un agente capaz de bloquear la síntesis de TF , como un plásmido recombinante antisentido que bloquea al gen del TF .

En una modalidad alternativa, el inhibidor o antagonista contra el TF es usado en combinación con un anticoagulante como la heparina o fracciones o derivados de la misma. Otras posibles combinaciones comprenden un inhibidor de la trombina y/o inhibidor plaquetario. En un segundo aspecto, la invención se relaciona con un método de tratamiento o prevención de la diabetes o enfermedades relacionadas con la diabetes, que comprende la administración de un inhibidor o antagonista contra el factor tisular, TF a un sujeto que necesite del mismo. Se pretende que el método sirva, por ejemplo, para el tratamiento de pacientes diabéticos y pacientes con tolerancia a la glucosa empeorada. El método comprende la administración de agente anti-TF el cual inhibe completa o parcialmente la producción de TF en o liberado de los islotes de Langerhans. En un tercer aspecto, la invención se relaciona con inhibidores/antagonistas per se, los cuales tienen la propiedades de inhibir, completa o parcialmente la producción de TF liberados de los islotes de Langerhans o liberados de ellos.

Breve descripción de las figuras La invención será ahora descrita en asociación con las figuras acompañantes, el contenido de los cuales se describe brevemente a continuación: Figura la: Un corte de páncreas teñido con Acm #4509 muestra una tinción distinta a la de los islotes pancreáticos . Figura Ib. Un corte de un islote humano aislado teñido con el Acm anti-TF #4509. El TF se encuentra en la mayoría de las células del islote. Figura le. Los islotes humanos puros de tres individuos fueron inmunoprecipitados con Acm anti-TF #4503 o 4509 y sometidos a SDS-PAGE y electroinmunotransferencia Western usando anti-TF #4502 policlonal de conejo. Los carriles 1-6 representan tres pares de TF precipitados con Acm 4503 (carriles 1, 3, 5) y Acm 4509 (carriles 2, 4, 6) ; carril 7 precipitación de anticuerpo solo. Figura Id. RT-PCR de islotes humanos aislados de 6 individuos (carriles 2-7) produciendo un producto de 0.3 kb . El carril 7 contiene el estándar de peso molecular. Figura le. Cuantificación de TF en islotes humanos cultivados durante 0.2 y 7 días (n=3) . Figuras 2a-2d: Microfotograflas electrónicas que muestran los resultados representativos de la marcación inmunológica con oro con el Acm anti-TF#4509 sobre cortes de islotes aislados. Todas las partículas de oro son de 15 nm de diámetro. Todas las barras indican 100 nm. a) Moléculas de TF (flechas) demostradas en el retículo plásmico liso de una célula ß (?540?0) . b) Un aparato de Golgi en una célula a con partículas de oro demostrando moléculas de TF en las islas de Golgi (cabezas de flecha) , en vesículas transitorias las cuales brotan de la transcripción de Golgi (flecha larga) y en un gránulo secretor (flecha pequeña) (X36000) . C) Almacenamiento de TF (flechas) en el núcleo de gránulos de células ß (x36000) . d) Almacenamiento de TF (flechas) distribuido aleatoriamente en gránulos de células a (x 54000) . Figura 3a: El efecto del anti-TF sobre el tiempo de coagulación activado por los islotes humanos. Se pretrataron cuatro µ? de islotes humanos con un medio, Acm anti-TF #4503 no inhibidor (Acm control) , y anti-TF #4509 inhibidor durante 10 min a temperatura ambiente. Posteriormente, los islotes fueron incubados con 250 µ? de plasma humano no anticoagulado y el tiempo de coagulación fue verificado en un dispositivo ReoRoxMR (n=7) . IBMIR inducida por islotes en el modelo de anillo tubular. Los islotes fueron pretratados con medios (cuadros abiertos) , Acm anti-TF #4503 no inhibidor (Acm control) (triángulos abiertos) , y anti-TF #4509 inhibidor (círculos llenos) durante 10 min a temperatura ambiente. Los islotes sin medio son representados por diamantes llenos. Posteriormente, se incubaron 4 µ? de islotes humanos con 5 mi de sangre compatible con ABO humana sin anticoagulante en anillos tubulares heparinizados . La IBMIR fue verificada por conteo plaquetario, e EIAs (figura 3b) para TAT (figura 3c) , F 1+2 (figura 3d) , y FXIa-AT (figura 3e) . Figuras 4a-4b: Se mezclaron doscientos cincuenta µ? de plasma citrado humano con varios volúmenes de medios de cultivos de islotes de Langerhans humanos. El tiempo de coagulación fue evaluado después de la recalcificación del plasma en un dispositivo ReoRoxMR. Figura 4a es una dilución en serie representativa de medio de un lote de islote mientras que la figura 4b es 60 µ?. de medio de cultivo de los islotes de tres individuos diferentes que han sido tratados con PBS Acm 4503 o Acm 4509 (media +DEM) . Figuras 5a- 5f: La IBMIR activada por los islotes humanos a ser bloqueada por anti-TF e iFVIIa. IBMIR inducida por islotes en el modelo de anillo tubular. Los islotes fueron pretratados con PBS (!) , Acm anti-TF 4503 no inhibidora (Acm control; A), o Acm anti-TF 4509 inhibidora (?) . 0 indica medios sin islotes. Los islotes fueron incubados con sangre compatible con ABO humana sin anticoagulante en anillos tubulares heparinizados . La IBMIR fue verificada por a) control plaquetario y EIAs para b) TAT, y c) FXIa-AT. (*p<0.05 cuando se comparó con el anillo que contenía islotes únicamente) . De manera alternativa, la incubación de los islotes se llevó a cabo en presencia (?) o en ausencia (!) de 40 pmol/L de iFVII. indica medios sin islotes. La IBMIR fue verificada por d) conteo plaquetario y EIAs para e) TAT, f) FXIa-AT. (*p<0.05 cuando se comparó con el anillo sin iFVIIa) . Figura 6 : Concentración intracelular de TF después de cultivar en un medio que contenía nicotinamida y evaluada en comparación con un control. Figura 7: Generación de TAT, que refleja la activación de la coagulación. Figura 8: La concentración intracelular de TF después de cultivar en un medio que contenía Enalapril (40 µ9/t?1) , Ciclosporina A (10 µt???/L) , L-Arginina (1 mmol/L) , Nicotinamida (10 mmol/L) , respectivamente, y evaluada en comparación con un control .

Descripción Detallada de la Invención La expresión y producción de TF en islotes humanos Se tiñeron cortes de páncreas humano para determinar la presencia de TF con Acm 4509 (Figura la) . El TF se encontró distribuido en la mayoría, pero no en todas, de las células endocrinas de los islotes de Langerhans . El patrón de tinción sugirió que el TF se localizara en los gránulos de la mayoría de las células de islotes. También los islotes aislados de páncreas humanos mostraron una distribución similar de TF demostrando que la expresión de TF no fue afectada por el procedimiento de aislamiento (Figura Ib) . También se encontró que TF en la adventicia de los vasos sanguíneos grandes. Las células endoteliales no se tiñeron indicando que el TF no fue expresado en respuesta a ninguna de las señales inflamatorias. No se encontró TF en las células acinares del páncreas exócrino. Para confirmar que el TF estuvo presente en los islotes humanos, se extrajo la proteína de los lisados de los islotes puros con dos anticuerpos anti-TF Acm (#4503 y 4509) . La proteína unida al anticuerpo fue ensayada sobre SDS-PAGE seguida por electroinmunotransferencia Western. La proteína precipitada fue identificada usando anti-TF policlonal . En experimentos similares el TF fue extraído con anti-TF policlonal e identificado con otros dos Acm (no mostrados) . El polipéptido tuvo un peso molecular de 47 kDa similar al del TF (Figura le) . La cantidad de TF por islote cultivado fue calculada después de la cuantificación de TF en los lisados por ELISA (Figura Id) . Directamente después del aislamiento del islote el contenido fue de 13 pg/islote. Este se incrementó temporalmente en cultivo, tres veces en el día 2 (42 pg/islote) pero disminuyó considerablemente el día 7 (21 pg/islote). La RT-PCR efectuada en islotes aislados manualmente confirmó la expresión de TF también a nivel de ARNm (Figura le) .

Detección por microscopía electrónica de TF en islotes humanos. La demostración por microscopía electrónica del TF se efectuó en islotes in situ de dos páncreas normales y dos lotes de islotes aislados usando la técnica inmunológica con oro en especímenes incrustados en Lowicryl procesados a baja temperatura (Figura 2) . Las células endocrinas en todos los islotes examinados estuvieron bien preservadas a nivel ultraestructural aunque el contraste de la estructura intracelular no fue óptimo puesto que los tejidos no fueron tratados con osmio. En ambos los islotes pancreáticos in situ y los islotes aislados, las partículas de oro demostraron la presencia de TF en ambas células a y ß. En ambos tipos de células, el TF se localizó en el reticulendo plásmido liso (Figura 2a) , en las tiras de Golgi y en las vesículas estacionarias que brotan de las islas trans-Golgi (Figura 2b) y también en los gránulos de hormona de las células a y ß (Figuras 2c y d) . Las moléculas de TF fueron detectadas a una concentración moderando los gránulos de las células ß, preferiblemente en el núcleo denso de electrones, pero a una concentración mayor y distribuidas aleatoriamente a través de la matriz de los gránulos de las células a. No se demostró inmunorreactividad de TF en las células d- o PP- . Todos los experimentos de marcación fotonegativos fueron negativos.

Bloqueo de IBMIR con anticuexpos anti-TF Los islotes de Langerhans humanos en contacto con plasma sanguíneo humano no anticoagulado indujeron gelificación después de aproximadamente 9.5 min de acuerdo a lo verificado por medio de un viscosímetro en comparación con el control con amortiguador únicamente, el cual no indujo coagulación dentro de 60 min, indicando que los islotes fueron capaces de inducir la activación de la coagulación (Figura 3a) . Para enlazar la expresión del TF de los islotes con la actividad procoagulante se hicieron intentos por bloquear la actividad con anticuerpos anti-TF. En presencia de un anti-TF inhibidor (Acm 4509) la gelificación se retardó 5.6 veces a 53 minutos, en comparación con 1.8 veces para el Acm control contra el epítopo no funcional del TF (Acm 4503) . Para investigar si el TF activó la IBMIR, fuero perfundidos islotes humanos con sangre compatible ABO humana fresca en el modelo del anillo tubular durante 30 min (Figura 3) . Los islotes fueron incubados con anticuerpos anti-TF durante 10 min y entonces lavados tres veces antes de que fueran agregados a los anillos tubulares. En el medio control y con el anti-TF no inhibidor (4503), la coagulación ocurrió dentro de 15 min, pero con el anti-TF inhibidor (4509) la coagulación fue inhibida durante todo el periodo de observación. Esto se reflejó en el consumo de plaquetas (conteo de plaquetas) , en la liberación del contenido de a-gránulos de las plaquetas (b-tromboglobulina) , y en generación de trombina-antitrombina, fragmentos de protrombina 1+2 y complejos de factor Xla-antitrombina los cuales fueron todos suprimidos por el 4509 pero no por el 4503 (Figura 3; tabla I). Esos descubrimientos demuestran que el TF fue el activador de la IBMIR.

Coagulación de plasma sanguíneo humano por TF liberado de islotes pancreáticos cultivados. ' Se encontró una actividad procoagulante en medios., de cultivo de los islotes cultivados, cuando el medio fue mezclado con plasma humano (Figura 4) . En presencia de medio de cultivo, el plasma coaguló dentro de 5 min. La actividad coagulante fue bloqueada por el Acm 4509 mientras que el Acm 4503 no tuvo efecto. Si los sobrenadantes fueron: ultracentrifugados a xlOO.OOO g no se observó coagulación con los sobrenadantes, mientras que el sedimento tuvo doble actividad en comparación con el medio de cultivo no separado. Esto demostró que la actividad del TF estaba asociada con la fracción de peso molecular alto y dado que TF es una protexna unida a la membrana con una parte transmembranal , la proteína estuvo muy probablemente asociada con micropartículas .

Bloqueo de la IBMIR con anticuerpos anti-TF e iFVIIa La incubación de islotes .humanos de Langerhans con plasma humano fresco sin aditivos indujo la gelificación (como verificado por viscosimetría) después de aproximadamente 9.5 min, mientras que el amortiguador solo no indujo coagulación después de 60 min, indicando que los islotes fueron capaces de inducir la activación de la coagulación (n=7; no mostrada) . Para enlazar la expresión de TF en los islotes con actividad procoagulante, intentamos bloquear la gelificación con anticuerpos anti-TF. En presencia de un anti-TF inhibidora (Acm 4509) , la gelificación ocurrió 5.6 veces más lenta (después de 53 min), en comparación a 1.8 veces más lenta para los islotes expuestos a Acm control contra un epítopo no funcional de TF (Acm 4503) . Para investigar si el TF observado activa la IBMIR, perfundimos islotes humanos con sangre compatible ABO fresca en el modelo de anillo tubular durante 30 min (Figura 5) . Los islotes fueron incubados con Acm anti-TF inhibidor o no inhibidor durante 10 min y entonces lavados tres veces antes de ser agregados a los anillos tubulares. En las muestras control (sangre con islotes únicamente o con el Acm anti-TF no inhibidor 4503) , la coagulación ocurrió dentro de 15 min, pero con el anti-TF inhibidor (Acm 4509) , la coagulación fue inhibida durante todo el periodo de observación. Esta diferencia se reflejó en el consumo de plaquetas (conteo plaquetario) , en la liberación del contenido de gránulos a de las plaquetas (ß-tromboglobulina) , y en la generación de TAT, Fl+2 y FXIa-AT, los cuales fueron todos suprimidos por el Acm inhibidor 4509 pero no por Acm 4503 no inhibidor (Figura 5 a-c; Tabla I) . Se obtuvo una inhibición aún más pronunciada de la IBMIR con el iFVIIa, un inhibidor eficiente de la actividad del TF. La sangre que contenía 40 pmol/L iFVIIa inhibió completamente la caída en el conteo plaquetario y el incremento en TAT, FXIa-AT, y C3a (Figura 5d-h) . El efecto de esos dos inhibidores indica fuertemente que el TF es el inhibidor de la IBMIR.

Anticuerpos anti-TF y FVIIa inactivado en el sitio Los anticuerpos contra el factor tisular humano (Acm 4509 y 4503 y el anticuerpo ppliclonal 4502) fueron comprados de American Diagnostica Inc. (Greenwich, Connecticut) . El Acm 4509 inhibe la actividad del TF, y el Acm 4503 reconoce un epítopo no funcional del TF. El anti ratón de cabra policlonal/Au de 10 y 15 nm (GAM-G10/15) y anti -conejo de cabra policlonal/Au de 10 y 15 nm (GAR-G 10/15) fueron comprados de Amersham International (Amersham, Bucks, Inglaterra) . El factor Vlla inactivado en el sitio Vlla (iFVIIa) fue obtenido inactivando FVIIa (NovoSeven, Novo Nordic, Dinamarca) con dansyl-Glu-Gly-Arg clorometil cetona de acuerdo a Wildgoose et al .

Discusión Los resultados en el presente estudio indican unánimamente que el TF es producido y secretado por las células a y ß de los islotes de Langerhans . Los estudios de inmunoprecipitación, RT-PCR y microscopía electrónica apuntan hacia una expresión del TF en ambas células a y ß, pero no por células d o PP. La actividad del TF encontrada en un sobrenadantes de cultivo indican que el TF es liberado de los islotes. La localización del TF en los gránulos de las células ot y ß indica que el TF es liberado junto con la insulina y el glucagon. La regulación de la síntesis del TF es, sin embargo, desconocida. El hecho de que la IBMIR fue inhibida por el an i-TF combinado con los descubrimientos recientes de que la mayoría del proceso de la IBMIR es derivado y amplificado por la trombina, nos permite proponer una hipótesis de cómo esta reacción es impulsada hacia delante, aunque de ninguna manera nos limitamos a esta hipótesis, y la hipótesis no debe constituirse en restrictiva del alcance de la invención de acuerdo a lo definido en las reivindicaciones. Después de la generación inicial de la trombina por el TF expresado por los islotes, las plaquetas activadas por la trombina comienzan a unirse a la superficie de los islotes. Los ligandos a los cuales las plaquetas se unen sobre las superficies de los islotes no están identificados aún, pero se ha reportado que el colágeno de los tipos I, III, IV y V rodean los islotes humanos. El colágeno es un mediador conocido de la unión y activación plaquetaria. Esto es seguido por una pérdida rápida de plaquetas de la sangre. Vía un ciclo de amplificación que implica al factor XI y las plaquetas activadas, se forma más trombina la cual genera una cápsula de fibrina que rodea a los islotes. La inhibición de la actividad del TF unido a los islotes antes del transplante probablemente prevenga la IBMIR en el transplante clínico de islotes. Se contempló que en un futuro cercano serán desarrollados protocolos de pretratamiento que consistan de agentes capaces de bloquear tanto la expresión del TF (anticuerpos anti-TF) como de agentes capaces de bloquear la síntesis de TF, por ejemplo anti-sentido. El pretratamiento de los islotes antes de transplante tendría beneficios clínicos claros puesto que no tendría efectos adversos sobre la hemostasis del receptor. Una fuente potencial de TF portado por la sangre son los leucocitos los cuales se sabe producen TF unido a micropartículas . Los descubrimientos en individuos normales de un incremento en la actividad de la vía del TF en respuesta a la infusión de glucosa indica fuertemente que la actividad del TF es iniciada por un mecanismo sensible a la glucosa, alternativo, la liberación de TF junto con insulina daría una relación cercana en individuos sin ningún proceso inflamatorio en curso aparente. Las placas arterioescleróticas rotas contienen TF y la cantidad de TF se correlaciona con la trombogenicidad de la placa. Puesto que la concentración de TF se incrementa cerca de la superficie luminal de la placa, se ha propuesto que el TF asociado con la placa es derivado de la sangre. Para apoyar este descubrimiento, el TF portado por la sangre se une a las placas arterioescleróticas las cuales posteriormente son capaces de iniciar el desarrollo de una trombosis arterial local. El presente estudio sugiere que al menos una fracción del TF portado por la sangre s origina de células de lotes pancreáticos. Considerando el incremento de la generación de trombina en respuesta a la hiperglicemia en pacientes diabéticos en pacientes diabéticos del tipo 2 y posiblemente en otros individuos con resistencia a la insulina e hiperinsulemia, es probable que esté presente TF más activo y sea capaz de unirse a las placas arterioescleróticas. Esto incrementaría el riesgo de trombosis en pacientes con esas condiciones. De acuerdo a un aspecto más de la invención, la producción del TF y/o liberación del mismo puede ser inhibida por la administración de insulina u otras sustancias, lo cual reducirá la producción de insulina. Se ha descubierto que los pacientes a los que se les ha dado insulina exhibirán una tasa significativamente menor de enfermedad cardiovascular. Una explicación propuesta es que, debido a que el TF está estrechamente asociado con la insulina en los islotes de Langerhan, donde es producida la insulina, la tasa de liberación de TF de los islotes se reducirá concomitantemente con la reducción de la liberación de insulina; Un mecanismo propuesto implicado es que la insulina reducirá el nivel de glucosa en la sangre, y el sistema detector de glucosa notará este nivel de glucosa reducido, y en consecuencia no activará más la liberación de insulina de los islotes, reduciendo por lo tanto la liberación del TF. Actualmente los pacientes que padecen de diabetes tipo 2 no son tratados con insulina. En su lugar, a ellos se les dan medicamentos que activan la liberación de insulina de;, los islotes, con la liberación acompañante de TF, incrementando el riesgo de que ocurra CHD. Esto significa que la insulina puede ser usada para la prevención de la CHD en pacientes sometidos a un riesgo de ataque de CHD, por ejemplo pacientes que tienen diabetes del tipo 2 y su condición prodromal , resistencia a la insulina. En consecuencia, la invención proporciona un método novedoso para el tratamiento de esos pacientes, que comprende la administración de una sustancia la cual puede ser caracterizada por reducir la producción y/o liberación de insulina, pero actuar vía la inhibición de TF. Otro descubrimiento importante más dentro del alcance de la invención es que existe un enlace entre la hiperinsulinemia y la enfermedad cardiovascular en pacientes que padecen de diabetes el tipo 2. De este modo, el descubrimiento de un enlace de la expresión del TF en los islotes de Langerhan y el incremento del riesgo bien conocido de enfermedad cardiaca coronaria (CHD) en pacientes con diabetes del tipo 2, puede ser usada dentro del alcance de la presente invención, para el propósito de proporcionar medicamentos y tratamientos. La hiperinsulinemia es una característica que es común a ambas de la diabetes tipo 2 y su condición prodromal, resistencia a la insulina. En ambas condiciones, las células ß de los islotes pancreáticos producen mayores cantidades dé insulina para controlar una hiperglicemia relativa que es el resultado de un incremento progresivo de resistencia a la insulina. Ambas de esas condiciones están asociadas con un incremento en el riesgo de CHD. Por lo tanto, el riesgo de infarto al miocardio en pacientes con diabetes del tipo 2 en otras circunstancias sanos es tan alto como en pacientes que ya han sufrido de algún infarto. En varias publicaciones se ha reportado que la activación de la coagulación ocurre después de un alimento. Esos descubrimientos han sido apoyados además por reportes de que la infusión de glucosa induce un incremento transitorio en la generación de FVIIa, reflejando la activación de la vía de TF, y en la generación de trombina en sujetos normales. El efecto es aún más pronunciado en pacientes con diabetes mellitus del tipo 2, quienes experimentan periodos prolongados de hiperinsulinemia/hiperglicemia . De interés particular es la observación de que el mismo nivel de hiperglicemia, cuando se combina con la infusión simultánea de insulina para reducir la secreción de insulina endógena, es capaz de abrogar la actividad de la vía del TF, indicando que la producción endógena de insulina es un prerrequisito para la activación de la coagulación. La unión del TF unido a micropar ículas a las plaquetas parece ser importante para el progreso de un trombo. En particular, el TF portado por la sangre se. incrementa significativamente en pacientes con infarto al miocardio agudo y angina inestable. La producción local de TF en islotes humanos y la excreción en respuesta a periodos prolongados de hiperglicemia proporciona una explicación tentativa para la activación de la vía sistémica de TF durante la hiperinsulinemia . Las placas arterioescleróticas que contienen TF, y la cantidad de TF se correlaciona con la trombogenicidad de la placa. El origen de TF en esas placas no es completamente comprendido, pero se sabe que ambas de las células de músculo liso y las células espumosas en el núcleo lipídico de la placa producen TF. La placa arterioesclerotica puede activar la formación de trombos de dos maneras: ya sea que la placa se rompa y exponga su núcleo lipídico que contiene TF, o que la superficie endotelial de la placa sea desnudada, y el tejido subyacente induzca la formación de trombos. En el último caso, el TF portado por la sangre podría adherirse a la superficie subendotelial y activar la trombosis. Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto de la presente invención la lista de inhibidores del TF incluye sustancias que son capaces de reducir la secreción de insulina y en consecuencia disminuiría la liberación de TF de los islotes de Langerhans . Los ejemplos de esas sustanciase incluyen tiazolindionas, la cual reduce la resistencia a la insulina, y/o insulina exógena, o análogos de la insulina, nativos o recombinantes .

Materiales y métodos Aislamiento de los islotes Aislamos islotes como se describe en otra parte de cadáveres humanos donadores (aprobados por el comité de ética) , usando una perfusión de Liberase seguida por una purificación en gradiente de densidad de ficoll continuo en una centrífuga COBE 2991 refrigerado (COBE Blood Component Technology, Lakewood, CO, EUA) . Las preparaciones de islotes fue mantenida en medio de cultivo (CMRL 1066; ICN Biomedicals, Costa Mesa, CA) a 37°C (C02 5%) durante 1-7 días. El volumen y pureza fueron determinados por dimensionamiento microscópico después de teñir con difeniltiocarbazona . La viabilidad fue evaluada como secreción de insulina en respuesta a un desafío con glucosa en un sistema de perfusión dinámica (en 1.67, 16.7 y nuevamente a 1.67 µG???/L de glucosa) .

Anticuerpos anti-TF Los anticuerpos contra factor tisular humano (Acm #4509, #4503 y poliAc #4502) fueron comprados de American Diagnostica Inc. (Greenwich, CT, EUA).

Tinción inmunohistoquímica Se recolectaron piezas de páncreas completas e islotes aislados en un medio de inclusión (Tissue-Tek; Miles, Eckhart, IN) y se congeló inmediatamente en nitrógeno líquido. Las muestras fueron cortadas y teñidas con Acm #4509 seguido por anti-Ig de ratón de cerdo conjugado con HRP (DAKO A/S, Glostrup, Dinamarca) .

Inmunoprecipitación del TF de islotes humanos purificados Se lavaron dos rail islotes cinco veces por centrifugación a 9x g a temperatura ambiente (TA) con PBS que contenía EDTA 5 mM, benzamidina 10 mM, 0.1 mg/ml de inhibidor de tripsina de soya, y PMSF 1 mM. El seguimiento fue incubado en 0.5 mi del mismo amortiguador suplementado con 1% de Tritón X-100 (Sigma) , a 37°C durante 30 min. Posteriormente, los restos celulares fueron removidos por centrifugación . a 10000 x g durante 5 min. Se incubaron tres µg de Acm #4509 ó #4503 con 250 µ? de lisado celular durante 30 min a 37°C y se precipitaron con Proteína G Sepharose (Pharmacia Upjohn, Estocolmo, Suecia) . Las muestras fueron sometidas a SDS-PAGE y análisis de electroinmunotransferencia Western usando poliAc #4502 de conejo y anticuerpos conjugados con HRP contra inmunoglobulin s de conejo (Dako A/S) .

Microscopía electrónica Para el análisis ultraestructural , fueron muestreados especímenes de tejido pancreático normal de dos pacientes masculinos y los islotes aislados de dos donadores de páncreas. Ninguno de los pacientes o los donadores padecía de ninguna enfermedad metabólica, todos los páncreas fueron macro y microscópicamente normales y no mostraron ningún depósito amiloide. Para preservar la antigenicidad, los especímenes fueron procesados con el método a baja temperatura. Los cortes ultradelgados colocados sobre rejillas de níquel fueron marcados inmunológicamente con la técnica inmunológica con oro. Los anticuerpos Acm #4509, #4503 y pAc #4502, dilución 1:25 (véase también la Tabla 1) , y partículas de oro coloidal de 10 ó 15 nm fueron usadas como marcadores densos en electrones. Los cortes fueron contrastados con acetato de uranilo y citrato de plomo antes de examinarse en un microscopio electrónico Philips 201.

Tiempo de coagulación El tiempo de coagulación en plasma fue medido en un reómetro oscilante libre de cuatro canales, ReoRox4 , de GHI (Global Haemostasis Institute B, Linkóping, Suecia) .

Anillos tubulares como modelo Usamos una modificación de un modelo anteriormente descrito. Los anillos hechos de tubería de PVC (diámetro = 6.3, longitud 390 rnm) fueron provistos con la superficie de heparina de Corline (Corline, Uppsala, Suecia) de acuerdo a la recomendación del fabricante. Cuatro µL (-4,000 IEQ) de islotes lavados (dos veces en CMRL 1066) fueron preincubados con 15 µ? de Acm #4509, Acm control #4503 o con PBS durante diez minutos a temperatura ambiente. Después de tres pasos de lavado los islotes fueron resuspendidos en 150 µ]1? de CMRL 1066 y colocados en los anillos, posteriormente se agregó sangre humana compatible a ABO fresca (5 mL) . Para generar un flujo de sangre de aproximadamente 100 mL/min los colocamos en un dispositivo agitados, colocado en un incubador a 37°C durante 30 minutos. También incluimos un anillo control que contenía sangre suplementada con 150 µ??? de CMRL 1066 pero sin islotes. Antes de la perfusión y a los 5, 15 y 30 minutos recolectamos sangres de muestra en EDTA (4.1 mM, concentración final) para el análisis adicional.

Análisis de la sangre y el plasma Las plaquetas y los leucocitos diferenciales en la sangre fueron contados usando un analizador diferencial Coulter Act (Beckman Coulter, FL, EUA) . Los niveles de plasma del fragmento de Protrombina 1+2 (Fl+2) y el complejo Trombina-antitrombina (TAT) fueron cuantificados usando equipos de EIA comercialmente disponibles (Enzygnost® Fl+2 y TAT, Dade Behring, Marburg, Alemania) . El complejo de FXIa-AT en plasma fue cuantificado de acuerdo a Sánchez et al. La ß-tromboglobulina (ß-TG) fue analizada usando Asserachom (Diagnostica Stago, Asniéres-sur-Seine, Francia) . Los productos de activación de complemento C3a y sC5b-9 fueron determinados como se describió anteriormente.

Análisis de RT-PCR Los ARN citoplásmicos de los islotes fueron aislados como se describe. Los ADNc de una sola hebra fueron preparados usando cebado con olivo (dT) (Amersham Pharmacia) . Los cebadores de PCR fueron combinados para generar productos de PCR que abarcan dos o más exones del transcripto de TF para amplificar ADNc únicamente y no cantidades en trazas de ADN genómico. Las RT-PCR fueron conducidas durante 35 ciclos usando componentes de PCR de alta fidelidad (Expand, Boehringer-Mannheim, Alemania) , posteriormente los productos fueron analizados sobre geles de agarosa al 3% con 0.5 µg/ml de bromuro de etidio.

Análisis estadístico Todos los resultados fueron expresados como la media +SE . Los valores medios son comparados usando la ANOVA de Friedman. La significancia fue determinada a ct=0.05.

Tabla 1 Anticuerpos usados Origen 1. Anticuerpo anti-factor tisular humano Ratón monoclonal (#4509) 2. Anticuerpo anti-factor tisular humano Conejo policlonal (#4502) Tabla 1 (continuación) Anticuerpos usados Origen 3. Anticuerpo anti-factor tisular humano Ratón monoclonal (#4503) 4. Anti-insulina humana monoclonal (XX) Ratón 5. Anti-ratón de cabra policlonal/Au de 10 nm Cabra (GAM-G10) 6. Anti-conejo de cabra policlonal/Au de 15 nm Cabra (GAR-G15) 1,2,3, y 4: American Diagnostica Inc., Greenwich, CT, EUA 5 y 6: Amersham International, Amersham, Bucks, Inglaterra Inhibición de la síntesis y secreción de TF Los islotes fueron cultivados durante 24 h en medio CMRL que contenia Nicotinamida 10 mM, el cual es el medio estándar usado para .el cultivo de islotes. El medio fue intercambiado posteriormente a medio CMRL sin Nicotinamida. Después de un periodo basal de otras 24 h, los islotes fueron retirados manualmente para el análisis del contenido de TF. El cultivo se continuó durante 48 h con el medio que contenia agentes que se sabe afectan la expresión de TF en monocitos y células endoteliales . Esos fueron, L-Arginina, Ciclosporina A, Enalapril, acetilcisteina y nicotinamida. Los islotes fueron cosechados, el contenido de TF analizado usando un equipo de EIA comercial y los islotes probados en el modelo de anillo ín vi tro. El cultivo de los islotes junto con nicotinamida y vitamina B produjo la síntesis y secreción del factor tisular. Cuando los islotes fueron cultivados junto con nicotinamida a concentraciones que fluctúan de 0 a 50 mM la producción del factor tisular fue inhibida independientemente de la dosis en los islotes (Figura 1A) . De manera similar, cuando se probaron en un sistema de anillo in vi tro en contacto con sangre humana, el contenido intracelular del TF se correlacionó con la activación de la coagulación de acuerdo a lo reflejado por la generación de TAT (Figura IB) . Esto demostró que el contenido de la TF de las células de los islotes y la secreción de TF fue inhibido por la nicotinamida en una forma independiente de la dosis. Se obtuvieron efectos similares con el fármaco inmunosupresor ciclosporina A (Figura 2), el aminoácido L-Arg (Figura 2), el inhibidor de la enzima que convierte la angiotensina Enalapril (Figura 2) , y el antioxidante acetilcisteína (no mostrado) . Las Figuras 6-8 ilustran el efecto de la nicotinamida . Los islotes fueron cultivados durante 48 h en medio que contenía 0, 10, 25 y 50 mM de Nicotinamida y se evaluó la concentración intracelular de TF, véase la Figura 6. Los islotes también fueron expuestos a sangre compatible ABO humana fresca en el modelo del anillo in vitro. Las muestras fueron recuperadas después de 5, 15, 30 y 60 min y analizadas para TAT, véase la Figura 7. Los islotes fueron cultivados durante 48 h en medio que contenía Enalapril (40 µ9/p?1) , Ciclosporina A (10 µG???/L) , L-Arginina (1 mmol/L) , Nicotinamida (10 mmol/L) y se evaluó la concentración intracelular de TF. La concentración de TF se expresó como el porcentaje del control sin tratar, véase la Figura 8. También se notó que la nicotinamida tiene propiedades antioxidativas , las cuales se cree son un factor importante en el mecanismo responsable de su actividad. De este modo, se anticipó que otros compuestos dentro de este grupo de sustancias son útiles de acuerdo con la invención. Los ejemplos adicionales de esos compuestos, no hacen exhaustiva la enumeración, son la vitamina E, glutation, acetilcisteína, ditiocarbamato de pirrolidina, piritiona, pentoxifilina, Hemoxigenasa-l/CO-bilirrubina, Prostaglandina Al. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. El uso de un inhibidor o antagonista contra el factor tisular, TF, en la producción de un fármaco para el tratamiento o prevención de la diabetes o enfermedades relacionadas con la diabetes.
2. 2. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en la producción de un fármaco para la administración en asociación con el transplante de células productoras de insulina a pacientes con diabetes mellitus insulina dependiente, IDDM.
3. 3. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en la producción de un fármaco para el tratamiento de. enfermedades cardiovasculares y/o arterioesclerosis.
4. 4. El uso de conformidad con la reivindicación 3, para el tratamiento de pacientes con diabetes del tipo II o preetapas de la misma.
5. 5. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el inhibidor o antagonista contra el TF es un anticuerpo anti-TF que tiene efecto biológico sobre la unión del TF.
6. 6. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde el inhibidor es una sustancia que inhibe la producción y/o liberación del TF de los islotes de Langerhan.
7. 7. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde el inhibidor o antagonista contra el TF es un agente capaz de bloquear la síntesis de TF.
8. 8. El uso de conformidad con la reivindicación 7, donde el agente es un plásmido recombinante antisentido que bloquea el gen del TF.
9. 9. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde la sustancia tiene la producción y/o liberación del TF se caracteriza por la disminución de la producción de insulina en los islotes de Langerhans.
10. 10. El uso de conformidad con la reivindicación 9, donde la sustancia es insulina o un análogo de la insulina.,
11. 11. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el inhibidor o antagonista contra el TF es usado en combinación con un anticoagulante como una heparina o fracciones o derivados de la misma.
12. 12. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el inhibidor o antagonista contra el TF es usado en combinación con un inhibidor de trombina.
13. 13. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el inhibidor o 35 antagonista contra el TF es usado en combinación con un inhibidor plaquetario.
14. 14. Un método para el tratamiento o prevención de la diabetes o enfermedades relacionadas con la diabetes, caracterizado porque comprende la administración de un inhibidor o antagonista contra el factor tisular, TF, a un sujeto que necesite del mismo.