MXPA04006861A - Deteccion de polimorfismos de nucleotidos individuales utilizando guias de onda planas. - Google Patents
Deteccion de polimorfismos de nucleotidos individuales utilizando guias de onda planas.Info
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Abstract
La presente invencion se refiere a un metodo para detectar polimorfismos de nucleotidos individuales en un gen que interese. Se inmoviliza una pluralidad de sondas un una guia de onda plana. Las sondas consisten en secuencias complementarias para una secuencia tipo nativa del gen que interese y complementarias para una secuencia de un SNP conocido en el gen que interese. Se hace fluir sobre la guia de onda plana un analito con etiqueta fluorescente. La union entre el analito etiquetado y cada una de las sondas provoca un cambio en la senal de fluorescencia. El SNP se detecta al comparar la cinetica de hibridacion del analito con cada una de las sondas. Tambien se describe un metodo para detectar los polimorfismos de nucleotidos individuales en un gen que interese mediante la secuenciacion por hibridacion.
Description
DETECCIÓN DE POLIMORFISMOS DE NUCLEOTIDOS INDIVIDUALES UTILIZANDO GUÍAS DE ONDA PLANAS
DERECHOS DE LICENCIA 5 La investigación que apoya esta invención fue otorgada en parte por el Instituto Nacional de Salud, donación HL32132. El Gobierno de Estados Unidos tiene " ""algún derecho en esta-invención .— - --¦ - -
10 REFERENCIA A LA SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reclama el beneficio ante la solicitud provisional US No. 60/350,633, presentada el 18 de enero de 2002.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la invención. La presente invención se refiere al análisis de muestras utilizando biosensores de onda evanescente. Más específicamente, la presente invención se refiere a la detección de polimorfismos
20 individuales de nucleótidos en muestras de DNA utilizando biosensores de ondas evanescentes.
Estado de la técnica. Durante la última década se ha utilizado la biología molecular para comprender las bases 25 moleculares de las.. enfermedades heredadas. Mediante la
identificación del gen o genes responsables de una enfermedad, los genes de una persona que padece la enfermedad se comparan con los de una persona que no la padece. En múltiples enfermedades la única diferencia entre los genes de la persona afectada y la no afectada es un polimorfismo de nucleótidos individual ("SNP") en la secuencia del DNA. Con base en este SNP o mutación, en ocasiones- es-posible -tamizar para- la- enfermedad.' Algunas" enfermedades que se han investigado por los biólogos moleculares incluyen enfermedades cardiovasculares heredadas como displasia arritmogénica de ventrículo derecho, cardiomiopatía hipertrófica familiar, fibrilación ventricular idiopática, síndrome QT largo y síndrome de Marfan. De estas enfermedades cardiovasculares, la cardiomiopatía hipertrófica familiar ( "HCM" ) , el síndrome QT largo ("LQTS") y el síndrome de Marfan ("MFS") son los mejor comprendidos a nivel molecular. La herencia de estas enfermedades es dominante autosómica y los individuos afectados están en riesgo de muerte cardiaca repentina, con frecuencia sin síntomas previos. Dado que muchos de los genes responsables de estos trastornos cardiacos, y un número de mutaciones de estos genes, se ha identificado, puede ser posible utilizar diagnóstico molecular para tamizar los individuos que pueden estar en riesgo de muerte cardiaca repentina.- .. _ . - .
Cuatro genes han sido implicados en LQTS incluidos KVLQT1, HERG, SCN5A y KCNE1. Se han catalogado numerosas mutaciones en estos genes, incluidas 75 mutaciones en KVLQT1, 84 en HERG, 8 en SCN5A y 7 en KCNE1. de los cuatro genes, el gen KVLQT1 es de gran interés porque ha sido implicado en casi 50% de los casos observados de LQTS en los cuales se ha determinado el genotipo de los individuos afectados, -un número significativo de mutaciones con sentido erróneo y deleciones se han identificado en este gen secuenciando el DNA de los1, individuos afectados, y el desarrollo de ensayos de.1 cribado de alto rendimiento para este gen puede tener un impacto significativo en el tratamiento y los efectos en el paciente. El gen KVLQT1 codifica para un canal de: potasio en músculo cardiaco, o al menos la subunidad alfa> del canal . Los numerosos SNP que ocurren en KVLQT1 han sido asociados con LQTS. El gen KVLQT1 contiene 16 exones que abarcan en tamaño desde 47 pares de bases para el exón 14 hasta 386 pares de bases para el exón 1. Se ha observado un número desproporcionado de estos SNP en el exón 7 , sugiriendo que el exón 7 puede ser un punto candente mutacional . No obstante, se han observado SNP en otros exones. Dn polimorfismo es G760A que se observa en el exón 3 de KVLQT1, en el cual la guanina (G) en la posición 760 en la—secuencia de nucleótidos es sustituida
por adenina (A) . Esta mutación da origen a la sustitución de metionina por valina en la posición 254 en la secuencia de aminoácidos de la proteína KVLQTl.
La estimación de los polimorfismos en humanos actualmente incluye el aislamiento del gen que interesa de los individuos afectados utilizando la reacción en -cadena de la -polimerasa ("PCR"); la secuenciación- de Ios- genes y luego la catalogación de cualquier polimorfismo o mutaciones observadas. No obstante, este procedimiento es." demasiado costoso y tardado para ser utilizado en cribado habitual de pacientes. Estas desventajas dan origen al desarrollo de pequeños fragmentos de DNA que contienen cientos o miles de moléculas sonda de ácido nucleico? inmovilizadas a 'un solo sustrato en un arreglo^ bidimensional . Estas sondas de ácido nucleico corresponden a las mutaciones conocidas, como pueden ser las mutaciones con sentido erróneo o deleciones, que ya han sido catalogadas. Se conoce a las sondas de ácido nucleico como oligonucleóticos específicos del alelo ("ASO"). No obstante, el cribado de pacientes con el pequeño fragmento de DNA todavía incluye el aislamiento y amplificación del (los) gen(es) que interesan a partir del DNA del paciente utilizando la PCR y luego permitiendo que -el (los) producto(s) de la PCR se una ai pequeño ~
fragmento de DNA. Luego se lava el pequeño fragmento y se detecta la hibridación del DNA, por lo regular por fluorescencia, utilizando microscopio de epifluorescencia ó confocal. Este proceso de detección también es tardado 5 porque se forma la imagen en sucesión de cada elemento en el arreglo ASO durante algunos segundos o más. En otras palabras, la detección no es en tiempo real. Además, los instrumentos necesarios para leer los pequeños -fragmentos de DNA son muy costosos, su costo representa entre 10 100,000 y 200,000 dólares para un equipo común.
Aunque algunos polimorfismos incluyen cambios de múltiples pares de bases, otros polimorfismos solo incluyen el cambio de un solo par de bases, conocido como
15 un SNP. Por ejemplo, muchas de las mutaciones identificadas en el gen KVLQTl son mutaciones con sentido erróneo que involucran un solo par de bases mal apareadas . Hasta ahora las bases mal apareadas se distinguían realizando una reacción de hibridación a una
20 temperatura por debajo de la temperatura de fusión, Tm, del homoduplo (híbrido de dos oligonucleótidos tipo nativo) pero por encima de la Tm del heteroduplo (híbrido de los oligonucleótidos tipo nativo y mutantes) . No obstante, la temperatura de fusión de un duplo de DNA
25- determinado varía con su contenido de pares de bases A-T.
Por tanto, es difícil encontrar una temperatura que sea óptima para los cientos o miles de oligonucleótidos inmovilizados para el pequeño fragmento de DNA.
Una solución a este problema es adicionar sales de tetrametilamonio ("TMA"), como puede ser cloruro de TMA, o betaína al búfer para hibridación. Se piensa que estos compuestos llevan al- mínimo- las diferencias en la' temperatura de fusión debido al contenido de A-T, permitiendo por este medio que todas las reacciones de hibridación sean realizadas a una sola temperatura que sea la óptima para distinguir bases mal acopladas. No obstante, se necesitan elevadas concentraciones (1-2M) de estos compuestos que los hace muy viscosos. Esta viscosidad conduce a problemas de manipulación y las elevadas concentraciones pueden interferir con las reacciones enzimáticas. Otra solución incluye utilizar nucleótidos modificados para aumentar la estabilidad de los pares de bases A-T ó disminuir la de los pares de bases G-C. Otra variante de este enfoque es adicionar algunas bases universales (5-nitroindoles) al final de un oligonucleótido rico en A-T para aumentar su estabilidad. Otra solución es permitir que la reacción de hibridación proceda hasta su grado máximo a una temperatura fría (por - ejemplo -20°C) y luego aumentar lentamente la' temperatura
del pequeño fragmento de DNA hasta 60°C. Esto permite medir una curva de fusión independiente para cada duplo de DNA que se haya formado en el pequeño fragmento. Aunque este enfoque es el más riguroso, también es muy lento y necesita varias horas para obtener una curva de fusión completa.
Aunque las técnicas de hibridación- que - utilizan* sondas ASO se utilizan para detectar mutaciones conocidas en el gen, se necesita una técnica alternativa para-, detectar mutaciones que no hayan sido identificadas ni catalogadas. La técnica actual para detectar mutaciones desconocidas es muy laboriosa e involucra una técnica denominada polimorfismo conformacional monocatenario . ("SSCP"). En esta técnica se utiliza la PCR para amplificar la región que interesa, por lo regular un exón. El producto de la PCR luego se desnaturaliza y se corre en un gel de electroforesis . En el estado monocatenario, la secuencia de nucleótidos del producto de la PCR afecta su movilidad, de modo que un oligonucleótido que contiene una mutación migra a una velocidad diferente sobre el gel en comparación con la secuencia tipo nativa. El oligonucleótido que contiene la mutación entonces se aisla del gel y se determina su secuencia en cuanto a -la posición y composición de la
mutación. No obstante, la electroforesis y los pasos de secuenciación son muy tardados .
Otro enfoque para detectar mutaciones desconocidas en genes es secuenciación por hibridación ( "SBH" ) . En la SBH de novo, un fragmento de DNA genómico (por lo regular 80-200 nucleótidos de longitud) se expone a un microarreglo de oligonucleótidos cortos- (por 1?· regular de- 6 a 8 bases 'de longitud) que contienen todas las permutaciones de secuencias posibles. La SBH también se ha utilizado- para, volver a secuenciar .una porción del gen, de secuencia desconocida, que contenga un polimorfismo genético en el cual se sintetiza una serie de oligonucleótidos sobrepuestos y se inmovilizan sobre un microarreglo (o se, sintetizan in situ sobre el pequeño fragmento) . La' secuencia de cada uno de estos oligonucleótidos es complementaria para el gen que interesa y se desplaza por una posición en relación con el oligonucleótido precedente en la serie. Se han descrito dos estrategias para determinar (o "denominar") la secuencia de la(s) base(s) que ha cambiado por la mutación. En la primera estrategia de denominación, cada posición en el gen que interesa se sondea mediante cuatro oligonucleótidos diferentes de 25 bases de longitud, cada uno de los cuales es sustituido con uno de los cuatro nucleótidos en ia posición media (13ava) .
La segunda estrategia de denominación utiliza dos tipos de sondas de oligonucleótidos , una serie individual de oligonucleótidos de captura superpuestas y una mezcla de cuatro diferentes oligonucleótidos seouenciadores etiquetados con fluorescencia. Cada uno de los oligonucleótidos seouenciadores etiquetados con fluorescencia contiene un nucleótido único en la posición 5' pero es degenerado en las-otras cuatro posiciones. La resecuenciación se lleva a cabo primero hibridando oligonucleótidos procedentes del gen que interesa para el microarreglo y luego adicionando la mezcla de los oligonucleótidos secuenciadores etiquetados con fluorescencia. Los oligonucleótidos secuenciadores etiquetados con fluorescencia por lo regular son demasiado cortos para hibridar por sí mismos, pero pueden hibridar en un modo en cascada o en tándem inmediatamente junto a uno de los oligonucleótidos de captura, formando un DNA dúplex estable, pero desnudo. Aunque este duplo desnudo ha demostrado ser estable termodinámicamente , los oligonucleótidos de captura y secuenciadores etiquetados con fluorescencia también pueden ser ligados utilizando polinucleótido ligasa para mejorar la estabilidad.
En ambientes de diagnóstico e investigación por lo regular se utilizan sensores ópticos, como los
biosensores de onda evanescente, para detectar las diferentes sustancias, o analitos. Por ejemplo, el biosensor BIACORE® , disponible de Biacore AB (Uppsala, Suecia) se basa en la resonancia de plasmón superficial y se utiliza para supervisar interacciones biomoleculares en tiempo real sin utilizar etiquetas fluorescentes o de radio. Los sensores de afinidad (Cambridge, Inglaterra)*, —una "división "de Thermo BioAnalysis Corp., prepara un sistema similar denominado IAsys® que utiliza la geometría óptica ligeramente) diferente denominada "espejos resonantes" . Estos sistemas responden a cambios en un índice de refracción en una onda evanescente . Los cambios suceden cuando un ligando, con un índice de refracción mayor que el del agua, se une a una molécula de captura inmovilizada sobre la superficie del sensor. Los ejemplos de una unión como esta incluyen antígenos solubles que se unen a los anticuerpos inmovilizados y los productos de la PCR monocatenarios que se unen a oligonucleótidos inmovilizados. Los dispositivos producidos por Biacore AB y Affinity Sensors son sensores de masas porque las señales cambian en proporción a la masa unida dentro del campo evanescente. Biacore AB y Affinity Sensors han modelado la cinética de la masa que se une al sensor y han determinado la relación entre l concentración del
ligando en una solución a granel y la velocidad de unión .
La resonancia superficial del plasmón y los sensores de espejo resonante representan una aplicación especializada de una técnica óptica sensible superficial más general denominada reflexión total - atenuada ( "ATR" ) que--de " preferencia interroga la muestra unida a la interfaz sólido/líquido a través de la onda evanescente. En la mayoría de las geometrías» ATR la radiación interrogante es confinada a una vía de onda gruesa en la que la luz se propaga en un modelo de zig-zag sencillo. En una primera aproximación, la interacción de la onda evanescente con una muestra unida en la superficie aumenta linealmente con el número de reflexiones por centímetro (N) de la luz en la interfaz de la solución de la guía de onda. Este número puede calcularse utilizando la expresión sencilla N = cot T2/0, donde D y T son el espesor de la guía de onda y el ángulo de propagación de modo, respectivamente (Figura B.l) . Así pues, para una medición óptica superficial determinada en un ángulo de reflexión especificado, una guía de onda de vidrio de 1 µp? de espesor puede ser 150 veces más sensible que un cubreobjetos de - vidrio de 150 µp?"-?ß espesor, y 1000
veces más sensible que un portaobjetos de vidrio para microscopio de 1 mm de espesor.
Los biosensores de ondas evanescentes también incluyen guías de ondas de fibra y planas las cuales son tan delgadas que la luz inacoplada y ano se propaga como un rayo de luz sencillo. En cambio, cuando el espesor de la guía de onda es - en - el - orden de~ mieras ,— la- luz inacoplada forma patrones de interferencia constructivos y destructivos. Los modos guiados son una serie diminuta-de patrones de interferencia constructivos que permiten que la luz propague la guía de onda. En general, más de 95% de la luz guiada está confinada a la propia guía de onda. La onda evanescente se refiere al 5% restante, o menos, de intensidad de luz que penetra solo algunas': decenas de mieras en el medio con índice de refracción menor junto a la superficie de la guía de onda.
Se conocen en la técnica guías de onda planas y son de configuración generalmente plana que comprenden dos superficies planas separadas por una anchura. En la técnica se conocen diferentes tipos de sensores de guía de onda plana que incluyen las guías de onda de película gruesa moldeadas por inyección y guías de onda de película delgada ópticas integradas ("IOW"). Las guías de
onda planas están descritas en las patentes US Nos. 5,512,495, 5,677,196, 5,846,842 y 6,222,619 (todas publicadas para Herrón y col.) y las Patentes US Nos. 8,832,165, 5,814,565 (todas publicadas para Reichert y col . ) , las cuales se incorporan en la presente como referencia .
Los biosensores de ondas evanescentes " están" diseñados para funcionar con o sin etiquetas fluorescentes. Como ya se mencionó, la resonancia de plasmón superficial y otros sensores ópticos sin etiquetas responden a los cambios másicos en la onda evanescente. No obstante, los sensores de masas tienen al menos dos limitaciones sobre los sensores fluorescentes. En primer lugar, un sensor de masa responde a cualquier;, molécula unida dentro de la onda evanescente, bien sea que esté específicamente unida o no específicamente unida. Por esta razón, la unión no específica ("NSB") es un problema importante con los sensores de masas . Biacore AB y Affinity Sensors han hecho esfuerzos importantes para desarrollar químicas de inmovilización con NSB baja. La segunda limitación es que los sensores de masas necesitan un área sensora significativamente más grande para medir una determinada concentración del analito en comparación con un sensor ^fluorescente porque la
detección de la masa es menos sensible que la detección fluorescente. Por tanto, para detectar bajas concentraciones de un analito se prefiere la sensibilidad de la detección de fluorescencia.
Por el contrario, la detección en un biosensor fluorescente se lleva a cabo por la unión específica de una molécula "indicadora" "etiquetada cori" fluorescenci al complejo de la molécula de captura- ligando. La unión específica se lleva a cabo a través de una interacción de afinidad que incluye, pero no se limita a, la unión de los antígenos solubles a los anticuerpos inmovilizados o los productos de la PCR monocatenarios a las sondas de oligonucleótidos inmovilizadas. De otro modo, un analito etiquetado con fluorescencia o molécula ligando se une directamente a la molécula de captura inmovilizada. Esta última situación es preferible para ensayos de hibridación de ácidos nucleicos porque la etiqueta fluorescente se incorpora directamente en la molécula del analito utilizando la PCR. En cualquiera de estos casos, la NSB es solo un aspecto con la molécula etiquetada con fluorescencia, en lugar de con cualquier molécula que pueda estar en la onda evanescente. Por tanto, la fluorescencia es un método de detección preferido.
Más específicamente, los biosensores ópticos se utilizan para llevar a cabo ensayos de sondas de ácidos nucleicos, también conocidos como diagnóstico molecular o ensayos MDx. Se sabe que la cinética de hibridación del DNA heterodúplex es más lenta y alcanza un valor menor en el estado estacionario en comparación con la del DNA homodúplex. Además, la variabilidad en el contenido de A-T y la longitud del oligonucleótido afecta la cinética de hibridación. Es posible controlar estos factores utilizando pares de sondas de tipo nativo y imitantes y: tomar la relación de las dos velocidades de hibridación normalizando por este medio el contenido de A-T y la longitud del oligonucleótido.
Aunque una mayor parte de los biosensores conocidos en la técnica son sensores de fibra óptica fluorescentes o sensores de resonancia del plasmón superficial sin etiqueta, se han descrito otros formatos de onda evanescente sin etiqueta que incluye la interferometría, difractometría y dispersión de luz con iluminación evanescente. En fechas recientes se ha descrito el uso de biosensores de ondas evanescentes en aplicaciones clínicas. En Nilsson y col. (Nilsson, P., B. Persson, A. Larsson, M. Uhlen y P. A. Nygren "Detection of mutations in PCR products from clinical" simples by surface" plasmon
resonante" J Mol recognit 10, 7-17 (1997)), se utiliza resonancia de plasmón superficial para detectar la presencia del gen p53 supresor de tumor humano en material de la biopsia de un tumor de mama. Los SNP en las muestras de DNA clínicas se detectan comparando la velocidad de hibridación de los productos de la PCR con la velocidad de hibridación del tipo nativo. Los --productos de la PCR, que contenian~bases "mal apareadas dieron niveles reducidos de hibridación en relación con el tipo nativo.
En Pilevar y col. (Pilevar, S., C. C. Davis y F. Portugal "Tapered optical fiber sensor using near- infrared fluorophores to assay hybridization" Anal Chem, 70, 2031-7 (1998)), se detectan niveles de 25 pM de RNA< de Helicobater pylori utilizando un_ sensor de fibra óptica fluorescente, mostrando que los sensores de ondas evanescentes fluorescentes son capaces de llevar a cabo ensayos MDx altamente sensibles.
Schneider y col., Clinical Chemistry, 43(9): 1757- 1763 (1997) describe el uso de un interferómetro de Hartman para detectar la hibridación en tiempo real de los ácidos nucleicos. El interferómetro de Hartman es un sensor óptico que utiliza' una "sola ond plana " de luz
linealmente polarizada para detectar la hibridación de los ácidos nucleicos diana a una sonda monocatenaria complementaria. El ensayo puede diferenciar entre secuencias con mal acoplamiento de 4 pares de bases.
En Stimpson y col., Genetics Analysis: Biomolecular Engineeríng, 13: 73-80 (1996), se utiliza una guía de onda óptica para -detectar —los - "SNP~ supervisando la cinética de unión y disociación de los complejos oligonucleótidos a las sondas de oligonucleótidos . Los . SNP se detectan mediante una señal que produce un conjugado de selenio.
Jensen y col., Biochemistry, 36: 5072-5077 (1997) describe el uso de la cinética de hibridación para detectar los SNP entre miméticos de ácido nucleico, como pueden ser los dúplex de ácido nucleico péptido ("PNA")-DNA y PNA-RNA. Los SNP se detectan utilizando la resonancia de plasmón superficial.
En Bianchi y col., Clinical and Diagnostic Virology, 8: 199-208 (1997), se utiliza la resonancia de plasmón superficial en un ensayo de hibridación de ácido nucleico para detectar mutaciones en las secuencias genómicas del VIH-1. Los ensayos utilizan cin'ética de
hibridación y supervisión en tiempo real para detectar las mutaciones.
Abel y col., Anal. Chem. 68: 2905-2912 (1996) describen el uso de ensayos de hibridación de nucleótidos para detectar pequeñas variaciones en las secuencias del ácido nucleico. Las variaciones se detectan por fluorescencia utilizando un sensor de " fibra óptica'. ~
La publicación WO 99/47705 describe el uso de una-, guía de onda plana en un ensayo de hibridación de ácido, nucleico para detectar un polinucleótido diana. El ensayo utiliza fluorescencia para detectar la hibridación.
Las publicaciones WO 96/35940, WO 95/33197 y WO- 95/33198 describen ensayos que utilizan al menos una guía de onda plana para detectar cuantitativamente un analito de interés de un fluido opaco. Los ensayos utilizan colorantes fluorescentes para determinar la hibridación del ácido nucleico y obtener datos en tiempo real.
Así pues, sigue siendo necesario un método mejorado para detectar los SNP utilizando un sensor de onda evanescente . Además sería conveniente un método para detectar los SNP que utilice una guía 'de onda plana en un
ensayo de fluorescencia. De preferencia, el método reduce el tiempo del ensayo supervisando la fluorescencia en tiempo real. También es necesario un ensayo de cribado genético de alto rendimiento para detectar mutaciones conocidas y desconocidas en un gen que interese.
BREVE COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La" presente invención' se 'refiere" a" un método para detectar un SNP en un gen que interese. Una pluralidad de sondas de tipo nativo y SNP se inmovilizan sobre una guía de onda plana. Un analito etiquetado con fluorescencia entonces se hace fluir sobre la guía de onda plana. La unión del analito a las sondas de tipo nativo y SNP se detectan en tiempo real y se comparan las cinéticas de hibridación. La sonda de tipo nativo consiste en una secuencia de nucleótidos complementaria para una secuencia de tipo nativo del gen que interesa, mientras que la sonda SNP consiste en una secuencia de nucleótidos complementaria para una secuencia que contiene un SNP de la secuencia de tipo nativo.
La presente invención también describe un método para detectar los SNP en un gen que interesa secuenciando por hibridación.
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra la unión de anti T3 etiquetado con Cy5 a algunas sondas de captura diferentes . Círculos blancos: unión no específica a avidina inmovilizada. Cuadros claros: unión no específica a neutravidina . Diamantes oscuros: unión no específica al complejo biotina-anti-T3/neutravidina inmovilizado. Círculos oscuros: hibridación" para el *" complejo biotina-T3/neutravidina inmovilizado;
La Figura 2 es una curva patrón para la hibrida.ción de Cy5-anti-T3 a T3 inmovilizado. La sensibilidad del ensayo de hibridación T3/anti-T3 utilizando las guías de onda de película gruesa moldeadas por inyección se investigó sembrando anti-T3 etiquetado con Cy5 humano en, PBS. La velocidad de unión se gráfico contra concentración de Cy5-anti-T3 para construir la curva patrón. Para el ensayo se determinó un valor de 1.4 pM de la sensibilidad analítica (definida como 2a/pendiente, donde s es la desviación estándar de la velocidad cero) ;
La Figura 3 muestra la cinética de hibridación de los dos oligonucleótidos etiquetados con Cy5 (PSA &. hGK2) a un oligonucleótido inmovilizado (anti PSA) . PSA y anti-PSA son perfectamente complementarios y mostraron una
velocidad de hibridación elevada (1.5 x 106 unidades del sensor por minuto) . Los oligonucleótidos hGK2 y anti-PSA tienen bases mal apareadas en 7 de las 20 posiciones y mostraron una velocidad de hibridación mucho menor (2800 SU/min) ;
La Figura 4 muestra una guía de onda plana ejemplar con un campo evanescente- creado por la luz refractada, abarcando -120 nm a partir de la superficie de la guia de onda para excitar los analitos con etiqueta fluorescente;
La Figura 5 muestra las curvas de respuesta del biosensor comparando el tiempo para el equilibrio de un DNA dúplex perfectamente acoplado (gráfica A) y un solo ¦ par de bases mal acoplado (gráfica B) . Ambos 21-meros estuvieron en una concentración de 1E-10, corrieron a 32 °C en una solución de NaCl 74 mM, KC1 80 m , MgCl2 1 mM y CaCl2 1 mM, Tris 10 mM a un pH de 8.5. Las lecturas se tomaron cada 20 segundos;
La Figura 6 muestra una gráfica despiezada de los primeros 21 puntos (5 minutos) de la Figura 5 ;
La Figura 7 muestra un mapa del contorno que representa la respuesta común del sensor del dúplex del
DNA perfectamente acoplado 2°C por debajo del punto de fusión del dúplex. Las concentraciones de gCl2 y KC1 fueron variables mientras que la concentración de NaCl se mantuvo fija a 0 M (superior) , 10 mM (medio) ó 100 mM ( inferior) ;
La Figura 8 es un mapa de contorno que muestra el punto de fusión de - un dúplex - de DNA'" perfectamente acoplado conforme cambia con la concentración de las sales. Las concentraciones de MgCl2 y KC1 fueron' variables mientras que la concentración de NaCl se mantuvo fija a 0 M (superior) , 10 mM (medio) ó 100 mM (inferior) ;
La Figura 9 es un mapa de contorno que representa la diferencia entre el punto de fusión del DNA dúplex perfectamente acoplado y el del DNA dúplex con un par de bases mal acoplado (en °C) . Las concentraciones de MgCl2 y KC1 fueron variables, mientras que la concentración de NaCl se mantuvo fija a 0 M (superior) , 10 mM (medio) ó 100 mM (inferior);
La Figura 10 muestra la respuesta del biosensor contra la concentración del DNA inyectado, se observa el cálculo del límite de detección del sensor. Las
condiciones fueron Tris 10 mM, NaCl 40 mM, MgCl2 1.5 mM, pH 8.8 y a 25°C. La pendiente de la curva es 3.3E+16 molar/AU, y la desviación estándar del cero es 9E+3 AOI, dando el límite de detección en 66 picomolar; y
0
La Figura 11 muestra las curvas de cinética de hibridación para secuenciar por hibridación de la posición media (11") de la sonda del analito Pl . La sonda de captura (C10PO ) [sic] contenía un grupo 5' fosfato. Se utilizaron cuatro diferentes sondas de secuenciación etiquetadas con Cy5 degeneradas (pe, pt, pg, pa) . La gráfica 1 es la cinética de hibridación de la sonda de secuenciación tipo nativa (CXXXX-Cy5) . Las Gráficas 2-4
son la cinética de hibridación para acoplamientos equivocados de una sola base en los cuales el nucleótido 5' de la sonda de secuenciación fueron A, G y T, respectivamente; la Figura 11B muestra las curvas de la cinética de hibridación para secuenciar por hibridación la posición media (11*) de la sonda del analito Pl. La sonda de captura (CIO) contenía un grupo 5' hidroxilo en — este -caso. Se- utilizaron cuatro •diferentes ~ sondas ~de secuenciación etiquetadas con Cy5 degeneradas (pe, pt, pg, pa) . La Gráfica 1 es la cinética de hibridación de lat sonda de secuenciación tipo nativa (CXXXX-Cy5) . Las Gráficas 2-4 son cinéticas de hibridación para acoplamientos erróneos de una sola base en los cuales el nucleótido 5' en la sonda de secuenciación fueron A, G y 5 T, respectivamente.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a la detección de los SNP en un gen que interese en muestras de DNA etiquetadas con fluorescencia. La tecnología de los biosensores fluorescentes de guías de onda planas se utilizan para detectar los SNP utilizando un ensayo de hibridación de ácido nucleico, en donde una pluralidad de sondas SNP y sondas de tipo nativo se inmovilizan sobre 5 - la gu-ía- de onda . El SNP se detecta supervisando en tiempo
real la cinética de hibridación de la muestra de DNA que se une a las sondas de SNP y tipo nativo.
La presente invención también se refiere a la detección de los SNP en muestras de oligonucleótidos sintéticos utilizando biosensores de ondas evanescentes. La sonda de captura que consiste en una secuencia de nucleótidos complementaria para' un gen que' "interese se inmoviliza sobre una guía de onda plana. Se sintetizan dos analitos y se etiquetan con fluorescencia. Un analito1 tipo nativo consiste en una secuencia de nucleótidos complementaria para la secuencia de la sonda de captura. Un analito SNP consiste en una secuencia con un SNP en comparación con la secuencia del analito tipo nativo. El SNP se detecta supervisando en tiempo real la cinética de-hibridación de los analitos que se unen a la sonda de captura .
También se describe un método para detectar los SNP por SBH. Una sonda de captura se inmoviliza sobre la guía de onda plana y se sintetizan cuatro diferentes sondas de secuenciación degeneradas etiquetadas con fluorescencia (AXXXX-Cy5, CXXXX-C 5, GXXXX-Cy5 y TXXXX-Cy5) . La resecuenciación se lleva a cabo mediante la hibridación de las sondas del analito" " procedentes del gen que
interesa a la sonda de captura. Entonces se adicionan las sondas de secuenciación. Cada una de las combinaciones de la sonda del analito, la sonda de captura y la sonda de secuenciación dan una velocidad de hibridación diferente. La sonda del analito que tiene el nucleótido mutante medio que se acopla con el nucleótido en la sonda de secuenciación tiene la velocidad de hibridación más alta, mientras que los pares mal apareados muestrán menorés velocidades (rechazos) . Para la resecuenciación también pueden sintetizarse y utilizarse cuatro diferentes sondas; de secuenciación no degeneradas, etiquetadas con fluorescencia.
En una modalidad, es posible inmovilizar una pluralidad de sondas SNP sobre una guía de onda plana. Una pluralidad de sondas tipo nativo, cada una de las cuales consiste en una secuencia complementaria para una secuencia tipo nativo de un gen que interese, también pueden inmovilizarse sobre la guía de onda plana. Las secuencias de la sonda tipo nativo SNP pueden diferir en una sola base. Entonces puede hacerse fluir o pasar una solución que contenga un analito etiquetado con fluorescencia sobre la guía de onda plana. La unión entre el analito y cada una de las sondas tipo nativo y SNP pueden provocar un cambio detectablé en la señal de
fluorescencia. La cantidad de fluorescencia dependerá del nivel de unión entre el analito y la sonda SNP y el analito y la sonda de tipo nativo. La presencia del SNP en el analito puede detectarse comparando la cinética de eliminación del analito con la sonda SNP y la cinética de hibridación del analito con la sonda tipo nativo.
- El analito puede consistir "en una muestra de" DNA," como puede ser un producto de la PCR monocatenario o DNA aislado de un paciente. El analito puede ser un gen que, interese, o una región de éste, aislado de un paciente.. Durante la optimización del ensayo, también se contempla que pueden utilizarse dos analitos. Estos dos analitos pueden ser oligonucleótidos sintéticos que se asemejen a. los oligonucleótidos monocatenarios aislados y amplificados del DNA del paciente. Uno de los analitos, un analito tipo nativo, es complementario a la sonda de tipo nativo, mientras que el segundo analito, un analito SNP, es complementario a la sonda SNP .
El analito puede estar etiquetado con un colorante fluorescente que sea estimulado a emitir la fluorescencia por la longitud de onda de la luz emitida por una fuente luminosa. Por ejemplo, si la fuente luminosa emite luz roja, el analito puede _ser etiquetado" en su extremo 5'
con un colorante fluorescente cuya fluorescencia sea estimulada por la excitación con longitudes de onda en la región espectral roja. Un colorante como este es Cy5, un colorante fluorescente que emite rojo, disponible, de Biological Detection Systems, Inc. (Pittsburg, PA) ó Amersham Biosciences. No obstante, también se contempla el uso de otros colorantes cuya fluorescencia puede ser estimulada por excitación- con -longitudes -de onda' en" la región espectral roja. Los analitos pueden prepararse por PCR y pueden utilizarse cebadores etiquetados con Cy5-.' para iniciar la síntesis del DNA. Así pues, el producto; de la PCR puede contener el colorante Cy5 en su extremo 5' .
La sonda SNP puede consistir en una secuencia de. nucleótidos que sea complementaria (en una unión sentido) a una secuencia de un SNP conocido en el gen que interesa. En otras palabras, la sonda del SNP puede ser complementaria a una secuencia que contenga un SNP de a secuencia tipo nativo. Las sondas SNP y tipo nativo pueden estar inmovilizadas sobre la guía de onda plana por medios conocidos en la técnica. De preferencia, las sondas SNP y tipo nativo se inmovilizan sobre la guía de onda utilizando un recubrimiento resistente a las proteínas, como puede -ser avidin ó neutravidina . Las
sondas SNP y tipo nativo también son conocidas como sondas de oligonucleótidos específicos del alelo ("ASO"). Las sondas SNP y tipo nativo pueden ser de 15-25 nucleótidos de longitud, con el sitio de mutación ubicado casi a la mitad de la secuencia.
En otra modalidad se contempla que una sonda, una sonda de -captura, puede ser inmovilizada sobre" la'guía de onda plana. La sonda de captura puede consistir en una secuencia de nucleótidos complementaria para el gen que interesa, o región de éste. Se sintetizan dos analitos, un analito tipo nativo y un analito SNP, en lugar de obtener el DNA o los productos de la PCR de un paciente. El analito tipo nativo consiste en una secuencia de nucleótidos complementaria para la secuencia de la sonda de captura. El analito SNP consiste en una secuencia casi idéntica a la del analito tipo nativo, excepto por un solo par mal apareado en una posición.
Las guías de onda planas de la presente invención pueden consistir en las guías de película gruesa moldeadas por inyección ó IOW. El sustrato de la guía de onda plana puede ser un portaobjetos o cubreobjetos de microscopio, de vidrio, cuadrados o rectangulares. Otros materia-Ies para el sustrato pueden incluir, pero no se
limitan a, vidrio con elevado contenido de plomo, cuarzo o plástico óptico. Las guías de onda de película gruesa moldeadas por inyección están a la disposición de Opkor, Inc. (Rochester, NY) . Puesto que estas guías de onda son desechables y relativamente económicas, pueden ser las preferidas en el desarrollo de ensayos para mutaciones conocidas y desconocidas en un gen que interese. Los IOW utilizados en la presente invención se "basan" en" un diseño"" patentado y están a la disposición del Dr. Reichert (Duke University, Dirham, NO . Los IOW pueden utilizarse cuando? se necesitan cientos o miles de ensayos de hibridación de oligonucleótidos .
Para proporcionar la característica de cribado de alto rendimiento de la presente invención, la densidad de las ondas de hibridación inmovilizadas sobre la guía de onda plana puede aumentarse drásticamente. Para aumentar la densidad, las sondas pueden ser modeladas sobre las guías de onda planas por diferentes técnicas. Algunos métodos de modelado son conocidos para inmovilizar microarreglos de las sondas de hibridación de las superficies sólidas, incluye la impresión, estampado y fotomodelado . En la impresión, las sondas de hibridación pueden ser rociadas sobre la superficie de la guía de onda plana utilizando una impresora" de
inyección de tinta. En el estampado, las sondas de hibridación pueden ser distribuidas sobre la superficie de la guía de onda plana utilizando un arreglo de espigas o micropipetas . La impresión y estampado pueden permitir que 100-200 elementos del arreglo sean modelados sobre una sola guía de onda plana. Para modelar 1000+ elementos del arreglo, puede utilizarse el ¦ fotomodelado o fotolitografía-.* — *
Las guías de onda planas se utilizan junto con una celda de flujo desarrollada por los Drs . Herrón, Christensen y Reichert. Las celdas de flujo se construyen a partir de dos piezas separadas, una placa superior y una inferior, que se fabrican de aluminio. La placa superior es maquinada para producir uno, dos o tres cámaras de flujo paralelas, cada una con puertos de entrada y salida pequeños. El interior de la placa inferior se maquina para soportar la guía de onda y proporcionar una vista clara de su base. Toda la celda de flujo se anodiza para que sea negro mate. La placa superior se sella contra la guía de onda utilizando una junta compuesta con una capa de Teflón® con índice de refracción bajo junto a la guía de onda y una capa de caucho de silicio junto a la placa superior. La presión mecánica para sellar el sistema se produce apretando
cuatro pernos moleteados ubicados en las cuatro esquinas de la celda de flujo.
Para inyectar las muestras en la cámara de flujo se utiliza una bomba jeringa de 3 cilindros controlada por computadora, disponible de Cavro Scientific Instruments, Inc. El volumen de la muestra de cada cámara es de 100 µ??: La temperatura de la celda ~ de" flujo ~se" regula" mediante un dispositivo Peltier regulado por computadora que se monta en la placa superior de la celda de flujo.' La temperatura varía sobre un intervalo de -10°C a 80°C. Tanto la bomba jeringa como el dispositivo Peltier se controlan mediante un programa de control del instrumento y adquisición de datos que se escribió en el lenguaje macro de Lab View. Este software corre en las plataformas-MacOS y Windows .
La disponibilidad de las diferentes placas superiores (de 1, 2 ó 3 cámaras) produce flexibilidad en el diseño experimental. Por ejemplo, el producto de la PCR obtenido de un solo paciente puede ser cribado para un número grande de mutaciones en el gen que interese utilizando una celda de flujo de una sola cámara, o los productos de la PCR obtenidos de tres pacientes diferentes pueden ser cribados para un" número" más pé"queñó
de mutaciones utilizando una celda de flujo de 3 cámaras. De otro modo, es posible utilizar cámaras adicionales para propósitos de calibración. Por ejemplo, el producto de la PCR obtenido del paciente se inyecta en una cámara, mientras que los controles positivos y negativos se inyectan en las otras dos cámaras .
Es posible utilizar cualquier' medio para detectar el cambio de fluorescencia causado por la hibridación del analito a las sondas SNP y tipo nativo. El detector puede contener un fotodetector útil para detectar luz en la región de la longitud de onda de la fluorescencia emitida, como se sabe en la técnica. De preferencia, el cambio de la fluorescencia se supervisa en tiempo real utilizando una cámara con dispositivo acoplado por carga ( "CCD" ) .
Es posible examinar la cinética de hibridación en diferentes condiciones experimentales optimizando los factores como la longitud del oligonucleótido, temperatura del ensayo y búfer de hibridación. En las condiciones normales el analito puede hibridar con las sondas de SNP y tipo nativo, con diferentes cinéticas de reacción y concentraciones del dúplex en equilibrio. Como ya se describió, se sabe que la cinética' de hibridación
del DNA heterodúplex (híbrido de los oligonucleótidos tipo nativo y imitantes) es más lenta que la del DNA homodúplex (híbrido de dos oligonucleótidos tipo nativo) . Por tanto, la velocidad de hibridación del analito a la sonda SNP es más lenta que la velocidad de hibridación del analito a la sonda tipo nativo. Dado que las secuencias de las dos sondas difieren por un par de bases-, el SNP puede ser detectado "comparando las" velocidades de hibridación.
En vista de que las sondas tipo nativo y SNP difieren solo por una base, se espera un nivel importante de hibridación entre el analito con ambas sondas, especialmente a temperaturas muy por debajo de sus. temperaturas de fusión. Para aumentar más las diferencias entre la cinética de hibridación, o diferenciar la cinética de hibridación, pueden alterarse las condiciones de hibridación como temperatura, pH y concentración de los contraiones. La diferenciación deseada en la velocidad de hibridación puede lograrse adicionando sales de TMA ó betaína al búfer de hibridación. Además, pueden utilizarse nucleótidos modificados para aumentar la estabilidad de los pares de bases A-T . También se sabe que los híbridos de PNA y DNA pueden ser más estables que los- dúplex DNA/DNA y que las bases mal apareadas" tienen
un efecto desestabilizador más grande sobre la temperatura de fusión de los híbridos PNA/DNA comparado con el DNA dúplex. Por tanto, también se contempla que las sondas de hibridación de la presente invención pueden ser sustituidas con sus equivalentes PNA.
La cinética de hibridación también puede utilizarse como -un medio para optimizar la temperatura " del ensayo y la longitud de la sonda de hibridación. Durante la optimización del ensayo un par de analitos modelo' etiquetados con fluorescencia pueden utilizarse en lugar del DNA del paciente amplificado por PCR. Pueden ser necesarios dos analitos diferentes para cada mutación. Por ejemplo, un analito, el analito tipo nativo, contiene la secuencia tipo nativa, mientras que el segundo analito, el analito SNP, contiene el SNP. Los analitos modelo pueden ser oligonucleótidos sintéticos que se asemejen a la secuencias de nucleótidos monocatenarias aisladas y amplificadas del DNA del paciente utilizando la PCR. Los analitos modelo pueden estar etiquetados en el extremo 5' con Cy5 y pueden ser análogos a los productos de la PCR que fueron producidos utilizando los cebadores de iniciación etiquetados en el extremo 5' con colorantes fluorescentes. Una -vez que se han optimiz'ádo las
condiciones del ensayo y los procedimientos de modelado de la guía de onda, la naturaleza multicanal de la tecnología de la guía de onda plana puede permitir la inmovilización de cientos de sondas sobre una guía de onda plana.
Las mediciones de la fluorescencia se toman con un fluorómetro formador de imágenes "por" ondas evanescentes" Mark 1.5 que fue construido por el Dr. Douglas Christensen en la Universidad de Utah. Las guías de ondai planas se montan en la celda de flujo para formar el montaje sensor, como ya se describió. El montaje sensor entonces se enclava _ en una placa de montaje sobre el fluorómetro Mark 1.5 que proporciona la alineación. precisa de la guía de onda para la luz de excitación.. Un» diodo láser que emite 12 mW de luz roja a 635 nm se utiliza como la fuente luminosa. La salida de este láser se forma en un haz laminar utilizando una serie de lentes colimadoras y luego se refleja con un espejo hacia la re difractora del IOW (o las lentes de acoplamiento en el caso de las guías de onda de película gruesa) . Una vez atrapada dentro de la guía de onda plana, la luz rebota de lado a lado de la guía de onda estableciendo un campo evanescente en cada punto de reflexión.
Este campo evanescente decae aproximadamente 100 n en la solución de la celda de flujo y excita los analitos con etiquetas Cy5 que estén hibridados para las sondas de captura. La emisión de la fluorescencia emana en todas direcciones. La porción de la emisión de fluorescencia que viaja a través de la guía de onda plana, y a través de una ventana en la parte inferior de la celda de flujo, se recolecta y forma una' "imagen"" mediante la cámara "CCD (Santa Barbara Instruments Group) . Esta cámara está equipada con una lente de 55 mmf/2.8 macro (Micon) para; enfocar la luz, y un filtro de interferencia de pasabanda de 570 nm (Orion) para rechazar la luz dispersada. La imagen CCD se recolecta y procesa por el programa de control del instrumento y adquisición de datos antes mencionado que está escrito en el lenguaje macro de Lab'-View. Este software "guarda" la imagen en diferentes zonas del sensor espacialmente resueltas y también utiliza una rutina de ajuste de mínimos cuadrados no lineal para calcular la velocidad promedio de hibridación de una serie de datos durante un periodo de 5 minutos del ensayo .
En todavía otra modalidad es posible detectar los SNP en el gen KVLQT1. Como ya se describió, muchas de las mutaciones en KVLQT1 " sórt SNP. Puesto que la presencia de
los SNP altera la hibridación de dos secuencias de nucleótidos, el SNP en el gen KVLQT1 puede detectarse supervisando la cinética de hibridación, como ya se describió. Para detectar los SNP en KVLQT1 es posible sintetizar un par de sondas de captura para cada uno de los SNP conocidos en KVLQT1. Una de las sondas de captura puede ser la sonda SNP y puede contener una secuencia de nucleótidos' " complementaria para " la"~ secuencia" "del" SNP conocido en KVLQT1. La segunda sonda puede ser la sonda tipo nativo y contener una secuencia complementaria para KVLQT1, o una región de este. De preferencia, las secuencias de las dos sondas difieren por un nucleótido. Cada una de las sondas puede ser biotinilada en el extremo 5' e inmovilizada a una guía de onda plana recubierta con neutravidina . Luego se hace pasar una-solución que contenga una muestra de DNA obtenida de un paciente sobre la guía de onda plana para determinar si la muestra de DNA tiene el SNP conocido. Dado que el LQTS es dominante autosómico, la mayor parte de los individuos afectados son heterocigotos para la mutación y pueden tener un alelo tipo nativo y uno mutante. Los individuos que son homocigotos para la secuencia tipo nativa pueden tener una relación de hibridación baja, con aproximación a cero, mientras que los individuos heterocigotos pueden tener una relación qü'e se aproxime a la unidad. Los pocos
individuos que sean homocigotos para la mutación pueden tener una relación mucho mayor que uno.
Aunque es posible utilizar la aproximación de la hibridación específica del alelo para detectar pacientes para mutaciones conocidas en el gen KVLQT1, puede ser necesaria la SBH para identificar las mutaciones en el - KVLQT1 que todavía 'no "hayan*" sido" catalogadas. "La "SBH" puede ser compatible con el formato del sensor IOW, aunque una instrumentación completa para el gen KVLQT1" puede necesitar un arreglo de las sondas de hibridación, de aproximadamente 2000 decanucleótidos (10-meros) inmovilizados a la guía de onda. Aunque el número de las- sondas de hibridación está dentro de las capacidades de" los sensores IOW, puede ser demasiado grande para un estudio de factibilidad.
Para determinar si la SBH puede dar buenos resultados en un ensayo de cribado de alto rendimiento, pueden ser detectadas secuencias cortas (de 5-10 nucleótidos de longitud, de preferencia 4-8 nucleótidos de longitud) que contengan una sola mutación puntual. Además, es posible sintetizar una serie de analitos modelo que incluyan la secuencia tipo nativa y todas las "" mutaciohes " posibles én_"ca"da~ una" dé "las" "posiciones "que
vaya a ser secuenciada. El biosensor de la guía de onda plana puede utilizarse para supervisar la velocidad de hibridación para resecuenciar la posición que interese del gen que interesa y que contiene el polimorfismo individual. Una sonda de captura 10-mero puede ser inmovilizada sobre la guía de onda plana y pueden sintetizarse cuatro diferentes sondas de secuenciación -degeneradas · etiquetadas - con— fluorescencia" (AXXXX-Cy5, CXXXX-Cy5, GXXXX-Cy5 y TXXXX-Cy5) . La resecuenciación puede llevarse a cabo primero hibridando las sondas del- analito (21-meros) , las cuales se obtienen del gen que interesa, a la sonda de captura sobre la superficie de la guía de onda. Luego pueden adicionarse las sondas de secuenciación. Cada una de las sondas del analito, las- cuales estarán sustituidas con uno de los cuatro nucleótidos en la posición media (11"), puede dar una velocidad de hibridación diferente. La sonda del analito que tiene el nucleótido mutante medio en acoplamiento con el nucleótido en la sonda de secuenciación, puede dar la velocidad de hibridación más alta, mientras que los pares mal apareados pueden mostrar velocidades más bajas (rechazos) . También es posible sintetizar y utilizar para la resecuenciación cuatro diferentes sondas de secuenciación no degeneradas, etiquetadas con — fluorescencia. · — ¦¦
Dado que el buen resultado de la SBH depende de la buena diferenciación de las velocidades de hibridación para la formación de homodúplex y heterodúplex, la diferenciación deseada puede necesitar la adición de sales de DNA o betaina al búfer de hibridación, la modificación de los nucleótidos o el uso de las sondas DNA, como ya se describió.
Si la SBH tiene buenos resultados en estas secuencias cortas, las regiones más grandes del gen, como puede ser una región transcrita individual (exón) del gen KVLQTl puede ser resecuenciada antes de que se vuelva a secuenciar el gen KVLQTl completo. Dado que los cebadores nucleótidos utilizados para aislar el gen KVLQTl (y otros genes LQTS) del DNA del paciente se organizan a nivel del exón, pueden hacerse arreglos resecuenciadores que correspondan con los diferentes exones dentro del KVLQTl. Por tanto, la resecuenciación de cualquiera de estos exones puede llevarse a cabo con un arreglo de densidad media de las sondas de captura.
Como ya se mencionó, se ha mapeado un gran número de SNP para el exón 7 de KVLQTl y el exón 7 puede ser un punto candente mutacional. Por tanto, el exón 7 puede ser un buen candidato para" determinar la" viabilidad de la
SBH. Puesto que el exón 7 es de solo 111 pares de bases de longitud, puede necesitar un arreglo resecuenciador de aproximadamente 400 oligonucleótidos utilizando el primer método de llamada, pero solo aproximadamente 100 oligonucleótidos utilizando el segundo método de llamada. No obstante, también se contempla que pueden utilizarse los SNP en otros exones .
La resecuenciación del gen completo puede llevarse a cabo primero hibridando los oligonucleótidos, que pueden ser de 80-200 nucleótidos de longitud y ser obtenidos del gen KVLQTl, al microarreglo y luego adicionando la mezcla de las sondas de secuenciación. Las sondas de secuenciación (5-meros) son demasiado cortas para hibridar por sí mismas pero pueden hibridar en un modo en cascada' inmediatamente junto a una de las sondas de captura (10-meros) , formando un DNA dúplex estable, pero desnudo, que sea de 15 nucleótidos de longitud. Aunque este DNA dúplex desnudo ha mostrado ser termodinátnicamente estable, las sondas de captura y secuenciación pueden estar ligadas utilizando polinucleótido ligasa para mejorar la estabilidad. Dado que la redundancia en esta estrategia radica en la secuenciación y no en las sondas de captura, una detección genética completa del KVLQTl puede necesitar aproximadamente 2000 sondas de captura. "
Además de detectar los SNP en KVLQTl, estas técnicas pueden adaptarse para detectar los SNP en los tres genes restantes (HERG, SCN5A y KCNE1) que han sido implicados en los LQTS. Además, es posible utilizar las técnicas simultáneamente para detectar los SNP en los cuatro genes. Además, aunque se ha descrito la detección de los SNP en los genes implicados en las enfermedades cardiovasculares heredadas," esta tecnología" 'puede adaptarse para detectar los SNP en los genes implicados en cualquier enfermedad. Por tanto, esta técnica es muy adecuada para casi cualquier aplicación de detección de alto rendimiento en diagnóstico molecular.
La invención además se explica mediante los siguientes ejemplos.
EJEMPLOS Ejemplo 1 Para supervisar la hibridación de dos oligonucleótidos en tiempo real, el sitio promotor RNA polimerasa de T3 se eligió como un sistema modelo. El sitio T3 es una región que abarca 20 bases con la siguiente secuencia: 5' AATTACCCTCACTAAAGGG 3' SEQ. ID. NO: 1. Los cebadores oligonucleótidos para la secuencia T3 y su - secuencia complementaria, áftti T3 , es'tán a la
disposición en el comercio. Estas también han sido etiquetadas con fluorescencia y utili2adas en la secuenciación de ácidos nucleicos.
Se utilizó el sistema avidina/biotina para inmovilizar el oligonucleótidos T3 a la guía de onda basándose en observaciones anteriores que la avidina adsorbió igualmente bien para las guías de onda ópticas" integradas y las guías de onda moldeadas por inyección. El 20-mero T3 fue biotinilado en el extremo 5' mediante un separador de 6 carbonos y luego fue inmovilizado a las guías de onda planas, moldeadas por inyección u ópticas integradas, que ya habían sido recubiertas con avidina o neutravidina. El 20 mero T3 fue etiquetado en el extremo 5' con Cy5, un colorante fluorescente que emite el rojo. El analito etiquetado con Cy5 resultante fue muy semejante a los analitos que pueden utilizarse en ensayos MDx clínicos.
La respuesta sin ética del biosensor moldeado por inyección para la reacción de hibridación de T3/anti T3 se muestra en la Figura 1, junto con tres controles. Se inyectó una solución antiT3 etiquetadas con Cy5 ???? en la celda de flujo en los cuatro casos, pero en cada caso se- examinó una molécula de captura diferente, o
complejo. La unión no especifica de Cy5-antiT3 para avidina o neutravidina está representada en círculos claros y cuadros claros, respectivamente. Es interesante señalar que se observó un nivel significativo de NSB con avidina, pero no con neutravidina. Tal vez esto es por qué la avidina tiene un valor pl elevado y tiene carga positiva a pH 7.4, lo cual puede conducir a interacciones electrostáticas con el oligonucleótidos indicador con carga negativa. Con base en esta observación, se utilizó neutravidina en lugar de avidina en los estudios ulteriores. El tercer control examinó si hubo alguna unión no específica entre dos oligonucleótidos con la misma secuencia de nucleótidos. En este caso, el antiT3 biotinilado fue inmovilizado a la guía de onda recubierta con neutravidina (diamantes oscuros) . La unión entre oligonucleótidos semejantes fue insignificante. Por último, la hibridación entre oligonucleótidos complementarios se examinó inmovilizando T3 biotinilado a una guía de onda recubierta con neutravidina (círculos oscuros) . Se observó unión muy fuerte, alcanzando 107 unidades del sensor en menos de dos minutos. También se obtuvieron resultados semejantes utilizando los IO como las guías de onda planas (no se muestran los datos) .
Tiempo (min) Figura C.7 Unión de anti T3 etiquetado con Cy5 a diversas moléculas (o complejos) de captura diferentes. Círculos claros : unión no específica a avidina inmovilizada. Cuadros claros : unión no específica a neutravidina . Diamantes oscuros : unión no específica al complejo biotina-anti T3 /neutravidina inmovilizado. Círculos oscuros : hibridación al complejo biotina-T3 /neutravidina inmovilizado .
Ejemplo 2 Se realizaron ensayos de hibridación T3/antiT3 a temperatura ambiente para numerosas concentraciones de antiT3 etiquetado con Cy5, abarcando desde 10 pM hasta 1-0-0 nM. Se gr fico la" velocidad "de unión contra la
concentración del oligonucleótido indicador en la Figura 2. Se utilizó una gráfica doble logarítmica debido al amplio intervalo dinámico (de cuatro órdenes de magnitud) del ensayo. Los mismos datos se graficaron en los ejes lineales en el inicio. Se encontró que los datos se ajustan a un modelo de Michaelis-Menton con una constante de Michaelis de aproximadamente 78 nM (los parámetros de ajuste -de' la curva tambié se muestran en la" figura) ." Se calculó para estos datos un valor de sensibilidad analítica de 1.4 pM. Estos resultados mostraron que el biosensor es una plataforma ideal para llevar a cabo ensayos MDx porque es sensible (niveles picomolares bajos) y rápido (ensayos de cinco minutos) y ofrece la ventaja adicional de poder supervisar las reacciones de hibridación en tiempo real.
3.
Figura C.8. Curva patrón para la hibridación de Cy5-Anti T3 a T3 inmovilizado. La sensibilidad de nuestro ensayo de hibridación T3/anti T3 utilizando guías de onda de película gruesa, moldeada por inyección se investigó sembrando anti T3 etiquetada con Cy5 humano en PBS. Se gr fico la velocidad de unión contra la concentración de Cy5-anti T3 para construir la curva patrón. Para el ensayo se "determinó un valor de "1.4" p " para' la" sensibilidad analítica (definida como 2 s/pendiente, donde s es la desviación estándar de la velocidad cero) .
Ejemplo 3 Para determinar si las bases mal apareadas provocan un cambio en la cinética de hibridación, se utilizó un-.. sistema modelo de antígeno específico de próstata ("PSA") . El PSA muestra un elevado grado de homología para la proteína humana, kalikreína glandular (hGK2) , que también es secretada por la glándula prostática. Por tanto, en los estudios de hibridación es importante que la sonda de hibridación inmovilizada se una sólo al cDNA procedente del mensaje del PSA, y no al procedente del mensaje de hGK2. Una región en el Exón 4 del gen de P. S. A. consiste en una secuencia que difiere de hGk2 en 7 de 20 posiciones. Una sonda de hibridación (5'-GGGGCAAAAGCACCTGCTCG-3"'") (SEQ ID NO: 2) , conocida como
anti-PSA, que reconoce su secuencia se sintetizó y biotiniló en el extremo 5' . Se sintetizaron dos oligonucleótidos adicionales, etiquetados con CY5, y se utilizaron como analitos modelo. Uno de estos oligonucleótidos (5' CGCGCAGGTGCTTT TGCCCC-3') (SEQ ID NO: 3), conocido como P. S. A. se obtuvo que la secuencia de cD A del PSA. El otro oligonucleótido (5'CCA CAA GTGTCTTTACCAC-3 ' ) (SEQ ID NO: " 4) , conocido como hGK2~ se obtuvo de la secuencia de cDNA de hGK2.
La sonda anti-PSA biotinilada se inmovilizó a una guía de onda moldeada por inyección, recubierta con neutravidina .' En la celda de flujo se inyectó una solución 1 nM de PSA etiquetado con Cy5 ó hGK2 etiquetado. con Cy5. En la Figura 3 se muestran las curvas de cinética de hibridación para estas reacciones. Se observó una velocidad de hibridación muy alta para el homoduplex (mostrado como círculos claros) , mientras que la velocidad observada para el heterodúplex (mostrada como cuadros claros) no fue estadísticamente por encima del fondo. Con esta gran diferencia en la velocidad de hibridación con siete bases mal apareadas puede observarse una diferencia significativa para una sola mutación.
2 3
Figura C.9. Cinética de hibridación de dos. oligonucleótidos etiquetados con Cy5 (PSA & hGK2) a un oligonucleótido inmovilizado (anti PSA) . PSA y anti PSA son perfectamente complementarios y mostraron una elevada velocidad de hibridación (1.5 x 106 unidades del sensor por minuto) . Los oligonucleótidos hGK2 y anti PSA tienen bases mal apareadas en 7 de 20 posiciones y mostraron una velocidad de hibridación mucho menor (2800 US/min) . en realidad, es velocidad no es significativamente diferente de la velocidad de unión no específica de este ensayo (513 ± 1416 US/min) .
Ejemplo 4 El polimorfismo G760A ocurre en el exón 3 del gen
KVLQT1. Para detectar este polimorfismo se sintetizó una sonda de captura 5' biotinilada. La sonda de captura fue de 21 nucleótidos de longitud y complementaria para las posiciones número 750-770 del gen KVLQT1. La secuencia de la sonda de captura se da a continuación:
Sonda de captura: 5 ' -biotina-ATGAAGACCACGGAGCCCAGG-3' SEQ ID NO: 5.
Durante el desarrollo del ensayo y la prueba de factibilidad los oligonucleótidos sintéticos fueron utilizados como analitos en lugar de los productos de la PC obtenidos de fuentes humanas. El anali o fue de 21 nucleótidos de longitud y etiquetado 5' con Cy5, obtenido de Amersham Biotechnology . Las secuencias de los analitos correspondieron a las posiciones 750-770 del gen KVLQT1, excepto para la posición 760 (la posición 11 en los analitos sintéticos) , que contenía una G (analito tipo nativo) ó A (analito polimórfico G760A) . Las secuencias de los analitos tipo nativo y SNP se dan a continuación:
Analito tipo nativo: 5 ' -C 5-CCTGGGCTCCGTGGTCTTCAT SEQ ID NO: 6 Analito G760A: 5' -Cy5-CCTGGGCTCCATGGTCTTCAT SEQ ID NO: 7
Ambos analitos fueron sintetizados por una planta de síntesis de péptidos y ácidos nucleicos en la Universidad de Utah. Los productos fueron entonces purificados utilizando cromatografía líquida de alta resolución para retirar las sales en exceso y los oligonucleótidos "n-1" que tuvieron deleción de una base. El espectro de masas entonces se llevó a cabo en cada uno de los productos "para comprobar la pureza. Los productos con 'espectro" dé masas deficiente fueron nuevamente sintetizados, purificados y corridos hasta que todos los productos fueron puros .
El ensayo de hibridación se representa como un esquema en la Figura 4. Se inmovilizó una pluralidad de sondas de captura monocatenarias sobre la guia de onda plana y los analitos solubles, monocatenarios se marcaron con fluorescencia en sus extremos 5' con Cy5. Los analitos se difunden a través de la solución a granel y se hibridan con sondas de captura. Aunque el tamaño del DNA dúplex formado por la hibridación varía con el tamaño del analito, el DNA dúplex generalmente es más pequeño que la profundidad de penetración (aproximadamente 110 nm) del campo evanescente del sistema biosensor. Una vez hibridados, los analitos se excitan selectivamente por el campo evanescente, "produciendo una señal fluorescente. La
señal se recolecta a través de un filtro de interferencia (670 nm, Omega) y se detecta por la cámara CCD (Modelo ST-6 Opto-head, Santa Barbara Instruments) orientada de modo que su eje de recolección sea normal al plano de la 5 guía de onda .
Los sensores de guías de onda planas moldeados por inyección * fueron f bricados""de" poliestireno por Opkor, Inc. (Rochester, NY) . Estos sensores fueron dispositivos
10 ópticos integrados consistentes en una guía de onda plana de 25 x 25 x 0.5 mm y una lente de acoplamiento de luz (inclinada a aproximadamente 20° al plano de la guía de onda), ambas moldeadas en una sola pieza. La fuente luminosa fue un láser semiconductor de 15 mW que emitió a
15 638 nm. La luz láser se formó en un haz laminar (20 mm ?· 1 mm) con una lente de longitud focal negativa y acoplada en la guía de onda mediante las lentes de acoplamiento integradas. Una vez acoplada, la luz atravesó la longitud de la guía de onda plana, rebotando hacia atrás y
20 adelante entre las superficies superior e inferior de la guía de onda. En cada punto de reflexión la luz crea una onda estacionaria dentro de la guía de onda plana. Esta onda estacionaria no tiene un contorno exacto en la superficie de la guía de onda, sino en cambio tuneliza
25 algunos "cientos de nanómétros hacia el medid" circundante .
La intensidad de este denominado campo evanescente decae en forma exponencial a medida que penetra en el medio circundante .
Los biosensores de guía de onda plana tienen el potencial de la adquisición de datos continua en tiempo real. No obstante, el procedimiento de recopilación de - " datos (que se describe más "adelante) tuvo un periodo" de" muestreo de 6 segundos, permitiendo recolectar aproximadamente 10 puntos de datos por minuto. Aunque- no fue continua, esta fue adecuada- para supervisar la cinética de hibridación en el intervalo de concentraciones nanomolar. Otra ventaja de las mediciones cinéticas es que permiten un mayor grado de- precisión del que podría lograrse con una sola medición en el punto final. Las mediciones cinéticas también proporcionan información acerca de la forma (es decir, el perfil de la cinética) de la curva de hibridación, que puede ser explotada para detectar bases mal apareadas en el DNA dúplex. Por último, las mediciones de la cinética son inherentemente insensibles a la fluorescencia natural del material de la guía de onda de poliestireno, reduciendo por este medio una fuente de ruido del ensayo.
El ciclo de recopilación de datos consistió en los siguientes cuatro pasos. La computadora de control (Power Macintosh Performa Modelo 6360, Apple Computer) primero instruyó a la cámara CCD a tomar una "imagen oscura" de 5 la guía de onda plana con el obturador cerrado y la fuente luminosa apagada. Esta imagen oscura se utilizó para corregir el ruido de fondo. Luego se tomó una "imagen clara" de" la guía de onda "con el obturador abierto y la fuente luminosa encendida. La imagen oscura 0 luego se sustrajo de la imagen clara para dar la señal. Se sumaron los píxeles individuales ( "binned" ) sobre · los tres canales de la guía de onda para obtener un valor de intensidad para cada 2ona. Este ciclo se repitió 20 veces en intervalos de 6 segundos, obteniendo 21 puntos de 5 datos en solo dos minutos. Se utilizó el programa Lab View versión 4.0.1 (National Instruments Corp. 1996) para todas las operaciones de control de los instrumentos.
Los datos cinéticos se sometieron a un procedimiento 0 de ajuste para la curva no lineal de dos parámetros para obtener la intersección (A0) y la velocidad de hibridación promedio (Ai) de la curva de cinética de hibridación. El siguiente modelo cinético se encontró para ajustar los datos de hibridación donde Y es la S~~ intensidad de" la fluorescencia, k es un factor de forma
de la curva definido por el usuario (0.3 para todos los experimentos, tmid es el tiempo en el punto medio del intervalo de recolección de datos y t es tiempo) :
Para cada solución se realizaron varias reacciones de hibridación, cada una a una temperatura diferente. La pendiente o velocidad de la reacción de hibridación se gráfica contra la temperatura, y se utiliza para extrapolar una temperatura "pendiente cero" o punto de fusión para una secuencia específica.
Como se muestra en la Figura 5, la formación del dúplex para los analitos tipo nativo (Gráfica A) y el G760A (Gráfica B) tienen diferentes termodinámicas, pero cinéticas semejantes. Las curvas de cinética de hibridación comunes para la unión de los analitos etiquetados con Cy5 100 p a las sondas de captura inmovilizadas a 32°C se muestran en esta Figura. La forma de la curva es indicio de una reacción de primer orden en cuanto a que la velocidad de hibridación inicial es elevada pero disminuye en forma continua conforme la
reacción se acerca al equilibrio. En particular, la concentración en el equilibrio del DNA bicatenario (la respuesta del sensor es proporcional a la concentración del DNA bicatenario) es mayor para el homodúplex que para el heterodúplex, pero ambas reacciones necesitan aproximadamente la misma cantidad de tiempo para llegar al equilibrio. La reacción de hibridación es de seudoprimer orden porque" la concentración "de lá^sólución de DNA analito es limitante puesto que la sonda de captura está presente en un exceso de más de 100 veces molar sobre los analitos. La curvatura es más pronunciada en tiempos mayores de 2 minutos o temperaturas elevadas (no se muestran los datos) . Como se muestra en la Tabla 1, hay buena diferenciación entre los analitos tipo. nativo (gráfica A) y el G760A (gráfica B) en tiempos muy · cortos o tiempos muy largos. No obstante, en los periodos de tiempos cortos hay mala exactitud por la sobredependencia en los primeros puntos .
Tabla 1: Efecto del tiempo de evaluación (tmid) en Ai (velocidad de hibridación) para los datos que se muestran en la Figura 5. Los valores de k y A0 fueron independientes de tmia. Para la gráfica A: k = 0.21, A0 = 3.86E+6; para la gráfica B: k = 0.30, A0 = 3; 10E+6.
Tipo nativo SNP Alm/A (Gráficá^A) (Gráfica B)~" tmid — 0 7, .10E+05 3. .73E+05 1. .90 1 5. .73E+05 5. .0OE+05 1. .15
2.5 4. , 1SE+05 3. .21E+05 1. .30 12.5 4. .91E+04 1. .66E+04 2. .96
25 3. .40E+03 407 8. , 35
Debido a la . naturaleza de seudoprimer orden de las curvas cinéticas, se obtuvo un modelo de primer orden (Ecuación 1) , basándose en la suposición de la concentración limitante del analito para ajustar los datos de intensidad de fluorescencia contra tiempo. La Ecuación 1 tiene tres parámetros: intersección de intensidad A0, velocidad de hibridación Ai y constante de velocidad técnica k. Esta última también puede observarse como un factor de la forma empírica, k, que describe el grado de curvatura de la curva de cinética. Conforme k se aproxima a cero, la línea se vuelve lineal. El valor de
la intersección (A0) es la respuesta inicial de la intensidad del sensor (inmediatamente después de que se inyecta el analito en la celda de flujo) . Este se debe a factores como la fluorescencia natural de la guia de onda, fuga de la luz láser dispersada a través del filtro de interferencia y excitación del analito etiquetado con Cy5 no unido en la solución a granel por la luz láser dispersada. Aunque no es relevante para la reacción de hibridación que se supervisa, puede utilizarse para proporcionar información del control de calidad acerca de las guías de onda y/o el sistema de recolección de luz. El valor de la velocidad de hibridación (Ai) es un valor de la velocidad promedio (basándose en todos los puntos de los datos) evaluado en un tiempo en el punto medio (tmid) de la curva. La Ecuación 1 se ajustó para la serie de datos de la cinética de hibridación que se muestran en la Figura 5 utilizando mínimos cuadrados no lineales. Los resultados se muestran en la Tabla 1 utilizando diferentes puntos medios para evaluar Ai. La diferenciación más grande entre la unión tipo nativo y SNP es en tiempos muy cortos o muy largos. En tiempos muy cortos hay una elevada dependencia en los primeros puntos, dando origen a una precisión disminuida. No obstante, tener que esperar tiempos más largos va contra el propósito de un ensayo rápido. Un buen compromiso de
tiempo y precisión del ensayo es al minuto en un ensayo de dos minutos .
El ajuste de la curva no lineal es un procedimiento numérico y requiere de algunos segundos para que las iteraciones sucesivas converjan. Así pues, este no es realmente conveniente para ajustes de tiempo real de los datos de la cinética de hibridacióñ Ño obstante, la Ecuación 1 puede ser linealizada ajustando el factor de forma y definiendo la variable del tiempo paramétrico (Z) como se muestra en las ecuaciones nos 2 y 3 siguientes:
Para la constante k, Z = e (2)
Con el fin de que esta linealización sea exitosa, el factor de forma k necesita ser perfectamente uniforme entre series de datos o solo débilmente acoplado a la velocidad de hibridación Ai. Las gráficas A y B de la Figura 5 mostraron valores k de 0.21 min"1 y 0.30 min"1, respectivamente. La gráfica B mostró más curvatura, pero logró una menor respuesta del sensor en el equilibrio. Sobre un intervalo más amplio de series de datos, el
factor de forma varió de 0 a 0.5. Así pues, no fue particularmente constante entre series de datos.
El grado de acoplamiento entre el factor de forma y la velocidad de hibridación se examinó en la Figura 5 y las Tablas 1 y 2. Las gráficas que se muestran en la Figura 6 son vistas despiezadas de los primeros 5 minutos de las curvas de cinética de hibridación presentadas en la Figura 5. Para obtener un ensayo SNP rápido (<5 minutos) , los primeros 5 minutos de la reacción se-enfocaron en saber porque la cinética de hibridación de las secuencias tipo nativo y polimórficas están bien diferenciadas durante este periodo. En la Tabla 2 se muestran tres parámetros reales (Ao, A1( k) que ajustan ambas series de datos (homodúplex y heterodúplex) .
Tabla 2: Efecto del factor de forma (k) en el valor calculado para la velocidad de hibridación para los datos mostrados en la Figura 7. En todos los casos se utilizó un tiempo del punto medio (tmia) de 2.5 minutos. k A¡ Erraren A¡ r2
Tipo nativo Ajuste de 3 parámetros 0.26 3.82E+06 4.04E+05 0.9996 k =0.1 0.10 3.99E+06 4.17E+05 3.2% 0.9935
¿ =0.2" "0:20 "' ""3~88E+06 "4.12E+05 "" 2.0 ?.9987
¡fc =0.3 0.30 3.79E+06 3.98E+05 1.5% 0.9993 k =0.4 0.40 3.70E+06 3.75E+05 7.2% 0.9957 i =0.5 0.50 3.63E+06 3.47E+05 14.1% 0.9885
SNP Ajuste de 3 parámetros 0.37 3.05E+06 3.03E+05 0.9991 i = 0.1 0.10 3.27E+06 3.26E+05 7.6% 0.9827 i = 0.2 0.20 3.18E+06 3.24E+05 6.9% 0.9927 k = 0.3 0.30 3.11E+06 3.14E+05 3.6% 0.9980
¿ = 0.4 0.40 3.03E+ 6 2.98E+05 1.7% 0.9990
A = 0.5 0.50 2.96E+06 2.77E+05 9.4% 0.9962
Luego se analizaron dos series de datos utilizando el ajuste de dos parámetros (Ecuación 3) para algunos valores preseleccionados de k entre 0.1 y 0.5.
Los resultados de la Tabla 2 muestran que aunque ningún valor k individual da resultados perfectos, un valor de 0.3 fue un buen compromiso, dando un error del 'peor caso" de 3.6% e"ñ la velocidad de hibridación. Así
pues, parece ser que la velocidad de hibridación se acopla solo débilmente al factor de forma. Por esta razón, el factor de forma k se fijó en 0.3 en todos los experimentos ulteriores. Asimismo con solo dos variables para calcular fue posible realizar un cálculo en tiempo real de la pendiente .
Los datos que se muestran en la Figura 5 se obtuvieron en un búfer de PCR normal a 32 °C, el cual estuvo muy por debajo de las temperaturas de fusión del homodúplex (aproximadamente 55 °C) y el heterodúplex (aproximadamente 53 °C). Para obtener un ensayo más rápido y más preciso, las condiciones del ensayo se optimizaron para mayor diferenciación entre los analitos tipo nativo y G760A. Dado que la velocidad de hibridación es dependiente de la concentración del contraión y el intervalo de temperatura de fusión, ambos factores fueron optimizados. La velocidad de hibridación y la temperatura de fusión del DNA dúplex son dependientes de la concentración del ión. El efecto de la concentración del ión en la velocidad de hibridación se muestra en la Figura' 7. El efecto de la concentración iónica en la temperatura de fusión se muestra en la Figura 8. En cada " una de estas figuras los efectos de sodio solo se muestran en tres valores, mientras que los efectos de
magnesio y potasio son continuos en el intervalo especificado.
Con mezclas de contraiones, los resultados pueden ser diversos e impredecibles . Algunas veces la adición de un ión enmascara los efectos del otro ión (Figura 9, gráfica B, el sodio atenúa el efecto del magnesio en ??„) ; en ocasiones dos iones tuvieron un efecto sinérgico (Figura 7, gráfica B, pendiente más grande en potasio 1 M y magnesio 100 µ?) , y en ocasiones estos compitieron entre sí (Figura 7, gráfica C, la adición de magnesio y potasio en una relación 1:1000 no tuvo efecto sobre la pendiente) . En algunas concentraciones parece ser que un ión determinó principalmente la temperatura de fusión: (Figura 8, gráfica B, magnesio), mientras que el otro determinó la velocidad de hibridación (Figura 7, gráfica B, potasio) . Los mecanismos de los efectos iónicos sobre la hibridación del DNA son múltiples, desde la estabilización del esqueleto hasta los iones que forman un puente entre los enlaces de hidrógeno de las hebras que forman zipers o no forman zipers.
La velocidad de hibridación disminuyó con, varios factores que incluyen la concentración del DNA etiquetado, la concentración del contraión y la
temperatura. A medida que la señal decaía, también se degradó la señal a ruido, produciendo datos menos confiables. El límite de detección de un ensayo de hibridación puede determinarse a partir de una curva patrón de la velocidad de hibridación contra la concentración del oligonucleótido analito y con el ruido de fondo (desviación estándar del punto de la concentración cero) según se define por NCCLS . Una determinación como esta se muestra en la Figura 10 para un ensayo de hibridación para el analito tipo nativo, llevado a cabo en las condiciones que comúnmente se utilizan en las reacciones de la PC : Tris 10 mM, NaCl 40 mM, gCl2 1.5 mM, pH 8.8 y a 25°C. En estas condiciones el límite de detección calculado fue 34 picomolar.
El buen resultado relativo de una serie determinada de concentraciones del contraión se evaluó midiendo la diferencia entre los puntos de fusión de los homo- y heterodúplex. Múltiples búfers normales (como los búfers de la PCR) dan resultados buenos. Para aumentar la diferencia en las temperaturas de fusión (??„) se utilizó el programa de optimización MultiSimplex para modificar sistemáticamente las concentraciones de NaCl, KC1 y MgCl2. Después de varias iteraciones se identificó un
intervalo de concentraciones iónicas que nos dieron principalmente valores ATm diferentes de cero.
Se utilizó el programa ECHIP para generar mapas de contornos de ATm contra la concentración del contraión. Estas gráficas son más informativas que la simple determinación de la Tm máxima absoluta porque proporcionan información sobre las relaciones inherentes entre Tm y la concentración del contraión. Los parámetros para el cálculo ECHIP fueron como sigue. Los intervalos-de concentración para KC1 fueron 0-1000 mM, para NaCl fueron 0-100 mM y para MgCl2 fueron 0-1000 µ?. El análisis de los datos obtenidos para ECHIP se ajustaron a una ecuación cúbica parcial. La ecuación cúbica parcial necesitó datos adicionales de otro tipo para probar interacciones más complejas entre las variables (concentraciones iónicas) .
Los resultados de los experimentos con ECHIP se muestran en la Figura 9. Estas gráficas son representaciones tridimensionales de ATm. Una concentración iónica se mantuvo constante en cada una de las tres gráficas, mientras que el efecto sobre ATm se muestra en relación con las otras dos. Para simplificación, los valores de ATm menores que 0.5°C se
establecieron a cero, en vista de que estábamos intentando llevar al máximo ATm. El valor ??„ más grande observado dentro del intervalo de concentraciones del contraión examinado fue aproximadamente 2.5°C.
En ausencia de sodio (Figura 9 A) , ATm aumentó en forma constante con el aumento en la concentración de magnesio en concentraciones bajas ó altas de potasio. En concentraciones intermedias de potasio, el magnesio tuvo poco efecto. En una concentración baja de sodio (10 µ?) , como se muestra en la Figura 9B, el magnesio de nuevo pareció tener poco efecto sobre ??„, la cual dependió principalmente de la concentración de potasio. No obstante, a mayores concentraciones de sodio (100 µ?, que se muestra en la Figura 9C) , la curva ATm tuvo una forma cóncava. En concentraciones intermedias de magnesio y potasio, el efecto competitivo entre los iones pareció enmascarar cualquier diferencial del punto de fusión entre las secuencias tipo nativa y polimórfica. Solo fue en concentraciones muy altas o muy bajas que se obtuvo diferenciación significativa de los dos valores de Tm.
El intervalo de temperaturas que produjo resultados óptimos para este ensayo fue importante, como también lo fue el limite de detección. A medida que aumenta la
velocidad de hibridación también mejora el límite de detección. La Figura 7 muestra la velocidad de hibridación del dúplex perfectamente apareado 2 grados por debajo de la temperatura de fusión. La comparación de la Figura 7 con la Figura 9, que son diferentes aspectos de los mismos datos, muestra que las concentraciones iónicas pueden tener diferentes efectos sobre la velocidad de hibridación y el cambio en la temperatura de fusión.
La velocidad de hibridación del oligonucleótido SNP y el tipo nativo fueron comparables (dentro de un factor de 10) entre sí solo un grado por debajo del punto de fusión del tipo nativo. En otras palabras, a menos de un grado por debajo del punto de fusión del SNP hubo poca o ninguna diferenciación.
EJEMPLO 5 Se utilizó la SHB para resecuenciar regiones del gen KVLQT1. En los experimentos se utilizaron los siguientes búfers. Salina amortiguada con fosfatos ("PBS") (fosfato 40 mM, cloruro de sodio 100 mM, azida de sodio 0.02%, pH 7.4) se utilizó para recubrir neutravidina sobre las superficies de poliestireno en la guía de onda plana. Para los pasos de lavado se utilizó Tris EDTA ("TE")
(Tris base 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7.4) . Se utilizó el búfer de unión del DNA (TE con cloruro de potasio 800 mM, cloruro de sodio 74 mM, cloruro de calcio 1 mM y cloruro de magnesio 1 mM, pH 8.5). Se utilizó TE con 0.1% de trealosa para el recubrimiento posterior de las superficies de a guía de onda plana. Estos reactivos todos fueron adquiridos a Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) .
Todas las muestras de DNA fueron sintetizadas en las instalaciones para la síntesis de DNA y péptidos en la Universidad de Otah, con la dirección del Dr. . W. Schackmann. La sonda de captura se sintetizó con la siguiente secuencia:
Sonda de captura: 5 ' -GGAGCCCAGG-3 ' -biotina (CIO) SEQ ID NO: 8
Se sintetizaron cuatro sondas de analitos obtenidos de la porción del gen LQTS . Las sondas de los analitos tienen las siguientes secuencias: 5'-CCT GOO CTC CGT OGT CTT CAT-3' (Pl) SEQ.ID.NO:9 5 -CCT GGG CTC CAT GGT CTT CAT-3' (P2) SEQ.ID.NO: 10 5'-CCT GGG CTC CCT CGT CTT CAT-3' (P3) SEQ.ID.NO: 1 1 5'-CCT GGG CTC CTT GGT CTT CAT-3' (P4) SEQ.ID.NO: 12
Se sintetizaron las sondas de secuenciación, etiquetadas con Cy5, con las siguientes secuencias. Sondas degeneradas: X = mezcla equivalente de A, C, G, T)
CXXXX-cy5 (pe) SEQ.ID.NO: 13 TXXXX-cy5 (pt) SEQ.ID.N0: I4 GXXXX-cy5 (pg) SEQ.ID.NO:15 AXXXX-cy5 (pa) SEQ.ID NO:16 sondas no degeneradas: SEQ.ID.N0:I7 ' CACCA-cy5 (spc)- - - - SEQ.ID.N0:I8 _ TACCA-cy5 (spt) SEQ.1D.NO: 19 GACCA-cy5 (spg) SEQ.ID.NO:20 AACCA-cy5 (spa) SEQ.ID.NO:21
Las guías de onda planas de poliestireno limpio (1 x 1"), con una lente frontal integrada para luz de excitación con una lente posterior en soporte de cuchilla para la prevención de la reflexión posterior de la luz, se recubrieron con neutravidina (1.5e-7 , PBS) a temperatura ambiente durante 60 minutos con la ayuda de una junta. Después de tres lavados con TE, la guía de onda plana se recubrió con CIO (le -7 M, TE) a temperatura ambiente durante otros 60 min. Después de dos lavados con TE, la superficie de la guía de onda plana se recubrió posteriormente con TE con 0.1% de trealosa a temperatura ambiente durante 30 min. La solución del recubrimiento posterior se desechó y se secó la guía de onda plana en una cámara de vacío con la junta unida.
La sonda de captura (CIO) (SEQ ID NO: 8) inmovilizada a través de neutravidina sobre la superficie de la guía de onda se incubó con una de las cuatro sondas de los analitos (Pl, P2 , P3 ó P4 (SEQ . ID NOS: 9-12, respectivamente) , 5E-10 M, búfer de unión, 4°C, 10 min) . Para comenzar el ensayo se inyectó en la celda de flujo una solución de la sonda de secuenciación etiquetada. Tan pronto como comenzó la hibridación, el colorante fluorescente capturado sobre la superficie de la guía de onda dentro del espesor del campo evanescente comenzó a emitir fluorescencia bajo la excitación del láser. La emisión de la fluorescencia se detectó utilizando un sistema óptico y una cámara CCD. La cámara CCD registró las imágenes de la guía de onda en intervalos de 15 segundos durante un periodo de 5 min. Se utilizó un programa operativo escrito en Lab Vie software' (Assay StandAlone 1.2 side) para operar la inyección de la muestra con una bomba Cavro, el registro de la imagen de fluorescencia mediante la cámara CCD y la transferencia de los datos. Los datos que reflejan el rápido aumento de la fluorescencia que cambia no linealmente con el tiempo fueron el resultado de la velocidad promedio de la unión del analito (Rts) en un punto del tiempo específico (Ti) , dado por la ecuación 1:
donde I(t) es la respuesta de la intensidad de la fluorescencia del sensor. Dna vez que la velocidad promedio se había calculado, pudo utilizarse para construir una curva patrón. En general, la ecuación de Michaelis-Menton podría utilizarse para los datos de velocidad de unión contra la concentración del analito.
Kd + L donde Rc fue la velocidad de hibridación observada para el oligonucleótido en concentración C, R„,ax fue la velocidad de hibridación máxima posible, R0 fue la velocidad en ausencia del analito, Kd fue la constante de Michaelis aparente. Cuando C<<Kd, esta ecuación se simplifica a una expresión lineal para las concentraciones de los analitos:
Rc=R0 +Zm C (3)
Las hibridaciones entre la sonda de captura CIO y las sondas de los 4 analitos obtenidas de la porción del
gen LQTS, Pl, P2, P3 ó P4 son las mismas. El SNP es la 11* posición. Para Pl, el SNP es G, de modo que dos de las 8 sondas de secuenciación, CXXXX-Cy5, (pe) (degenerado) ó CACCA-Cy5 (spe) (no degenerado) , constituyen el DNA dúplex 15 -mero complementario, completo. Este es el acoplamiento perfecto para todos los pares de bases. Al mismo tiempo, Pl no daría híbridos completos entre CIO y las demás sondas de secuenciación. En estos casos, los pares estarían mal apareados. Las mediciones de la fluorescencia emitida durante la hibridación sobre las superficies de la guía de ondas mostraron que los pares acoplados perfecto siempre dan una mayor velocidad de reacción y un aumento neto de la fluorescencia (en número de cuentas de fotones) .
Las Figura lia y b muestran curvas típicas del proceso de hibridación expresado en el aumento neto medido de la fluorescencia en cuentas de fotones contra tiempo, medido en minutos.
El grado de la reducción de la hibridación de un par mal apareado comparado con un par apareado perfecto puede expresarse en porcentaje, teniendo el par perfecto la hibridación de 1. El porcentaje se conoce como rechazo. Las Tablas 3 y 4 muestran los rechazos de CIO con las
cuatro sondas de analitos con sondas de secuenciación mal apareadas comparadas con los casos de apareado perfecto.
Tabla 3. Velocidades de hibridación para SBH de la posición media (11") de las cuatro sondas de analitos (P1-P4) . La sonda de captura inmovilizada (CIO) contenía un grupo 5' hidroxilo y se utilizaron las sondas de secuenciación degeneradas (pe, pa, pg, pt) . Los factores de rechazo se obtuvieron de la comparación de las velocidades de los pares mal apareados con el par apareado perfecto. Vel. promedio % Desv.est. Rechazo
C10/Pl/pc* 1960174 29% C10 Pl/pa 1431129 28% 0.73
ClO/Pl/pg 1591074 31% 0.81
C10 Pl/pt 937559 35% 0,48
C10/P2/pt* 2616848 25% C10 P2/pa 732486 11% 0.28
C10/P2/pc 1221310 25% 0.47
C10/P2 pg 2091414 44% 0.80
C10/P3/pg* 1843953 1% C10/P3/pa 1420362 35% 0.77
C10/P3/pc 1841401 15% 1.00
C10/P3/pt 2211113 32% 1.20
C10/P4/pa* 1922302 33% C10/P4/pc 1325066 16% 0.69
C10/P4/pg 1416990 32% 0.74
C10/P4/pt 714500 14% 0.37
?Apareación perfecta de los pares
Tabla 4. Velocidades de hibridación para secuenciación mediante hibridación de la posición media (11a) de los cuatro oligonucleótidos analitos diferentes (P1-P4) . La sonda de captura (CIO) contenía un grupo 5' hidroxilo en cada caso. Las sondas de secuenciación no degeneradas (spc, spa, spg, spt) se utilizaron en este caso. Los factores de rechazo se obtuvieron a partir de la comparación de las velocidades de los pares mal apareados con el par apareado perfecto.
Vel. promedio % Desv.est. Rechazo
C10/Pl/spc 598358 19% C10/Pl/spa 576064 5% 0.96 C10/Pl/spg 480554 29% 0.80 C10/Pl/spt 86181 26% 0.14 C10/P2/spt 1309221 34% C10 P2/spa 338359 19% 0.26 C10/rP2/spc 818384 12% 0.63 C10 P2/spg 513525 55% 0.39 C10 P3/spg 913465 40% C10/P3/spa 326183 34% C10 P3/spc 470079 25% C10/P3/spt 614313 49% C10/P4/spa 1032881 20% C10/P4/spc 214920 17% 0.21 C10/P4/spg 463645 18% 0.45 C10/P4/spt 214049 19% 0.21
También se examinó el efecto de la fosforilación de la sonda de captura CIO. La sonda de captura CIO y C10PO4 tienen la misma secuencia, pero C10PO4 tiene un grupo fosfato en su extremo 5' . Aunque el grupo fosfato puede utilizarse para la ligación con las sondas de secuenciación 5-meros, la reacción de ligación necesita incubación a 4°C - durante..12 horas y el procedimiento presente supervisó la hibridación sólo durante 5 minutos. Por tanto, el efecto de la fosforilación de la sonda de captura se examinó en las condiciones recién descritas. Al comparar los aumentos netos en la fluorescencia y las velocidades de reacción a los dos minutos se demostró que C10PO4 da una fuerte respuesta de hibridación y una mayor velocidad. El grupo fosfato puede ayudar en la hibridación debido a que se forma un enlace de hidrógeno, aunque no se forma ningún enlace covalente final como en el caso de la ligación. En la Tabla 5 y la Tabla 6 se muestran las velocidades a los dos minutos de la hibridación para C10PO4 con las sondas de analitos y las sondas de secuenciación, y los rechazos correspondientes.
Tabla 5. Velocidades de hibridación para SBH de la posición media (11") para cuatro sondas de analito (Pl-P4) . La sonda de captura (C10PO4) contenia un grupo 5' fosfato en este caso. Se utilizaron sondas de secuenciación degeneradas (pe, pa, pg, pt) . Los factores de rechazo se obtuvieron de la comparación de las velocidades de los pares mal apareados con el par apareado perfecto. Vel. promedio % Desv.est. Rechazo
P04/Pl/pc 4316220 10% P04/Pl/pa 1774543 24% 0.41 P04 Pl/pg 2385418 11 % 0.55 P04/Pl/pt 2832229 23% 0.66 P04/P2/pt 3099725 15% P04/P2/pa 1802958 20% 0.58 P04 P2/pc 2076006 22% 0.67 P04/P2/pg 1982273 16% 0.64 P04/P3/pg 3974225 13% P04 P3/pa 1310945 23% 0.33 P04/P3/pc 2327110 21% 0.59 P04/P3/pt 1502286 24% 0.38 P04 P4/pa 2726077 11% P04/P4/pc 1119316 9% 0.41 P04 P4/pg 1348100 19% 0.49 P04/P4/pt 1691061 24% 0.62
Tabla 6. Velocidades de hibridación para secuenciar por hibridación la posición media (11') para cuatro sondas de analito (P1-P4) . La sonda de captura (C10PO4) contenía un grupo 5' fosfato. Se utilizaron sondas de secuenciación no degeneradas (spc, spa, spg, spt) . Los factores de rechazo se obtuvieron de la comparación de las velocidades- de los. pares mal _apareados con el par apareado perfecto. Vel. promedio % Desv.est. Rechazo
P04/Pl/spc 73529 5% P04/Pl/spa 17416 93% 0.237
POtflPl/spg 33836 20% 0.460
P04/Pl/spt · 37274 11 % 0.507
P04/P2/spt 123098 19% P04/P2/spa 26588 19% 0.216
P04/P2/spc 25566 24% 0.208
P04 P2/spg 49364 29% 0.401
P04/P3/spg 93682 29% P04/P3/spa 39763 9% 0.424
P04/P3/spc 20010 11% 0.214
P04/P3/spt 31770 31% 0.339
P04/P4/spa 104966 56% P04/P4/spc 41392 42% 0.394
P04/P4/spg 25050 64% 0.239
PQ4 P4/spt 44766 70% 0.426
En resumen, para las sondas de captura CIO y C10PO4, cada - una de —estas, .creó _32_ oligonucleótidos dúplex hibridados con las cuatro sondas de analitos 21-meros y
las 8 sondas de secuenciación etiquetadas con Cy5. Estos dúplex están en 16 grupos. En cada grupo hay un caso apareado perfecto y tres mal apareados que tienen una diferencia de una sola base o SNP. Utilizando el factor de rechazo para expresar la discriminación, el factor de rechazo promedio de 0.5 mostró claramente que se detectó el SNP. Al - comparar - las . dos .sondas de captura CIO y C10PO4, el factor de rechazo promedio con la sonda de captura CIO (0.58) fue levemente mayor que en el caso de C10PO4 (0.43) lo cual mostró que el grupo fosfato puede ayudar en la hibridación a través de la posible formación de una clase de enlace de hidrógeno. Las sondas de secuenciación degeneradas tienen cuatro bases, cada una de las cuales es, con igual probabilidad, uno de los cuatro ácidos nucleicos (A, C, G ó T) . Para una secuencia de la sonda de DNA particular hay solo 1-256 oportunidades para que la secuencia se aparee. Así pues, la concentración de la sonda degenerada (le-8M) utilizada en el procedimiento de detección es aproximadamente 100 veces mayor que la concentración de las sondas no degeneradas (le-10M) . No obstante, dado que las sondas degeneradas tienen aceptación mucho mayor para más sondas de DNA y mostraron respuestas mucho más fuertes que las sondas no degeneradas, se utilizan con preferencia sondas de secuenciación degeneradas .
EJEMPLO 6 En el sentido de detección de un nuevo muíante utilizando esta secuenciación por el método de hibridación, si las sondas de secuenciación fueran etiquetadas con cuatro diferentes colorantes fluorescentes y la guía de onda plana tuviera un arreglo - de diferentes . capturas, este método desarrollado en nuestro laboratorio es definitivamente un método muy conveniente y rápido.
Aunque la invención puede ser susceptible a diversas modificaciones y formas alternativas, se han mostrado modalidades específicas por medio de ejemplo en los dibujos y se han descrito con detalle en la presente. No obstante, debe entenderse que la invención no está destinada para estar limitada a las formas específicas descritas. En cambio, la invención cubre todas las modificaciones, equivalentes y alternativas que entren dentro del espíritu y alcance de la invención como se define por las siguientes cláusulas anexas.
LISTA DE SECUENCIAS <110> University of Utah Research Foundation <120> Detección de Polimorfismos de Nucleótidos Individuales Utilizando Guias de Onda Planas <130> 0274-524J3PC <140> PCT/US03/01600 <141> 2003-01-17 <150> US 06/350,633 <151> 2002-01-18 -<160> 20. <170> Patentln versión 3.2 - - - <210> 1 <211> 20 <212> ADN <2I3> <220> <223> El promoter de ARN polimerasa T3 <400> 1 aattaaccct cactaaaggg 20
<210> 2 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Secuencia del exón 4 del gen PSA <400> 2 ggggcaaaag cacctgctcg <210> 3 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Sonda de hibridación derivada de la secuencia ADNc del gen PSA
<400> 3 - ¦ ' ¦ ¦ -¦ _ _ . __ cgagcaggtg cttttgcccc
<213> Artificial <220> <223> Derivado de la secuencia ADNc de hGK2 <400> 4 ccacaagtgt ctttaccac <210> 5 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Sonda de captura para el polimorfismo G760A en el exón 3 de KVLQTl <400> 5 atgaagacca cggagcccag g —.21.
<210> 6 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Analizado tipo silvestre para el polimorfismo G760A <400> 6 cctgggctcc gtggtcttca t <210> 7 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Analizado G760A para el polimorfismo A en el exón 3 del gen KVLQTl
<400> 7 cctgggctcc atggtcttca t <210> 8 <211> 10 <212> ADN <213> Artificial <220> - <223>_ ^Sonda de captura <400> 8 ggagcccagg <210> 9 <211> 21
<212> ADN <213> Artificial <220> <223> Sonda del analizado <400> 9 cctgggctcc gtggtcttca t 21
<210> 10 <211> 21 <212> ADN <213>' Artificial <220> <223> Sonda del anal <400> 10 cctgggctcc atggtcttca <210> 11 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Sonda del analizado <400> 11 cctgggctcc ctggtcttca <210> 12 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Sonda del analizado <400> 12 cctgggctcc ttggtcttca t 21
<210> 13 <211> 5 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Sonda de secuenciación <220> <221> misc_feature <222> (2) .. (5)
<223> n es cualquier nucleótido
<100> 13 cnnnn <210> 14 <211> 5 <212> ADN '' r. <213> Artificial <220> <223> Sonda de secuenciación
<220> <221> misc_feature <222> (2).. (5) <223> n es cualquier nucleótido
<400> tnnnn <210> 15 <211> 5 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Sonda de secuenciación
<220> <221> misc_feature <222> (2) .. (5) <223> n es cualquier nucleótido
<400> 15 gnnnn <210> 16 <211> 5 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Sonda de secuenciación
<220> .'.? : misc_feature <222> (2) .. (5) <223> n es cualquier nucleótido
<400> 16 annnn
<210> 17 <211> 5 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Sonda de secuenciación no degenerada
<400> cacea <210>, 18 <211> 5 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Sonda de secuenciación no degenerada
<400> 18 tacca <210> 19 <211> 5 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Sonda de secuenciación no degenerada
<400> 19 gacca <210> 20 <211> 5 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Sonda de secuenciación no degenerada
<400> 20 aacca
Claims (1)
- R E I V I N D I C A C I O N E S 1. Un método para detectar un polimorfismo de nucleótidos individual ("SNP") en un gen que interese, que consiste en: inmovilizar una pluralidad de sondas tipo nativo y una pluralidad de sondas SNP en una guía de onda plana; hacer fluir un analito sobre. la guía de onda plana; detectar la unión del analito a la pluralidad de sondas tipo nativo y el analito a la pluralidad de las sondas SNP; comparar la cinética de hibridación del analito con la sonda SNP contra la cinética de hibridación del analito con la sonda tipo nativo; y detectar el SNP en el gen que interesa. 2. El método de la reivindicación 1, en donde la inmovilización de una pluralidad de sondas tipo nativo en una guía de onda plana consiste en inmovilizar una pluralidad de secuencias de nucleótidos complementarias a una secuencia tipo nativa del gen que interesa. 3. El método de las reivindicaciones 1 y 2, en donde la inmovilización de una pluralidad de sondas SNP sobre una guía de onda plana consiste en inmovilizar una" pluralidad de secuencias de nucleótidos complementarias para una secuencia que contiene un SNP de la secuencia tipo nativa. 1. El método de las reivindicaciones 1-3, en donde la detección de la unión del analito a la pluralidad de sondas tipo nativo y del analito a la pluralidad de sondas SNP consiste en detectar la unión en tiempo real. 5. El método de las reivindicaciones 1-4, en donde la detección del SNP en el gen que interesa consiste en detectar el SNP en un gen KVLQT1. 6". El método de. las. reivindicaciones 1-5, en donde la detección del SNP en el gen que interesa consiste en detectar un cambio de guanina a adenina en la posición 760 del gen KVLQT1. 7. El método de la reivindicación 1, en donde la detección de la unión del analito a la pluralidad de sondas tipo nativo y del analito a la pluralidad de sondas SNP consiste en detectar cambios en la fluorescencia. 8. El método de la reivindicación 1, en donde el flujo de un analito sobre la vía de onda plana consiste en hacer fluir una solución que contenga una muestra de DNA etiquetada con fluorescencia o producto de la PCR sobre la guia de onda plana. 9. El método de la reivindicación 1, además consiste en: lograr la diferenciación entre "una velocidad- de _ hibridación del analito a la pluralidad de sondas tipo nativo y una velocidad de hibridación del analito a la pluralidad de sondas SNP. 10. Un método para detectar un polimorfismo de nucleótidos individual ("SNP") en un gen que interese secuenciando por hibridación ("SBH") : inmovilizar una sonda de captura sobre una guia de onda plana; incubar una serie de sondas de analito con la sonda de captura; hacer fluir una solución de una serie de sondas de secuenciación sobre la guia de onda plana; formar un DN¾ complejo entre la sonda de captura, cada sonda de analito de la serie de sonda de analitos y cada sonda de secuenciación de . la serie de sondas de secuenciación; y detectar un SNP en el gen que interesa comparando las velocidades de hibridación entre la sonda de captura, cada sonda de analito de la serie de sondas de analitos y cada sonda de secuenciación de la serie de sondas de secuenciación . 11. El método de la reivindicación 10, en donde la inmovilización de una sonda de captura sobre una guia de onda plana consiste en inmovilizar una secuencia de 10 nucleótidos sobre la guia de onda plana. " - - 12. El método de las reivindicaciones 10 y 11, en donde el gen que interesa es KVLQT1. 13. El método de las reivindicaciones 10-12, en donde la incubación de una serie de sondas de analitos con la sonda de captura consiste en incubar cada sonda de analito de la serie de sondas de analitos con la sonda de captura, cada sonda de analito obtenida del gen que interesa y que contiene una secuencia de nucleótidos que difiere en una posición. 14. El método de las reivindicaciones 10-13, en donde hacer fluir una" solución de una serie de_ sondas de secuenciación sobre la guia de onda plana consiste en hacer fluir cada sonda de secuenciación de la serie de sondas de secuenciación sobre la guia de onda plana, cada sonda de secuenciación consiste en un 5-mero. 15. El método de las reivindicaciones 10-14, en donde hacer fluir una solución de una serie de sondas de secuenciación sobre la guia de onda plana consiste en hacer fluir cada sonda de secuenciación de la serie de sondas de secuenciación sobre la guia de onda plana, cada sondad de secuenciación consistente en un nucleótido único en una posición 5' y siendo degenerado en las posiciones restantes.
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