MXPA04006367A - Tira de prueba para determinar la concentracion de analitos multiples en una muestra de un solo fluido. - Google Patents

Abstract

Una tira de muestra multicapa (20) que mide concentraciones de analitos multiples de una sola muestra de sangre completa (58). La tira de prueba (20) incluye una matriz de prueba (36) de varias capas mantenidas juntas en contacto constante por un sujetador de la tira de prueba (22). La invencion se caracteriza porque no tiene partes moviles lo cual hace posible el uso novedoso de una capa de gasto alargada (38) que dispersa la sangre a traves de toda su longitud, a pesar de tener capas (40). 110) con propiedades capilares conocidas adyacentes a y en contacto con esta (38). Puesto que la invencion depende principalmente del formato de flujo vertical, la tira de prueba (20) es, de manera ventajosa, muy compacta. Con una sola muestra de 35 microlitros (58) de sangre aplicada a esta, la tira de prueba novedosa (20) puede proporcionar lecturas de colesterol total, colesterol de lipoproteinas de alta densidad y trigliceridos HDL. De esas, las lipoproteinas de baja densidad LDL pueden ser calculadas proporcionando por lo tanto un "panel de lipidos" completo. Otros analitos como la glucosa y las cetosas pueden ser incluidos en la tira de prueba (20) ademas de o en lugar de uno o mas de otros analito.

Description

TIRA DE PRUEBA PARA DETERMINAR LA CONCENTRACION DE ANALITOS MULTIPLES EN UNA MUESTRA DE UN SOLO FLUIDO CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona, de manera general con la prueba de fluidos corporales para la concentración de analitos, y de manera más particular, con la prueba de una sola muestra de analitos múltiples.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION El nivel de ciertos analitos en la sangre y otros fluidos corporales puede predecir una enfermedad o riesgo de la misma. Por ejemplo, el colesterol en la sangre es un indicador significativo de riesgo de enfermedad cardiaca coronaria. El "colesterol total" incluye las lipoproteínas de baja densidad (LDL) , 1 poproteínas de densidad muy baja (VLDL) y lipoproteínas de alta densidad (HDL) . Está bien establecido de estudios epidemiológicos y clínicos que existe una correlación positiva entre los niveles de colesterol de LDL y VLDL (colesterol "malo") y la enfermedad cardiaca coronaria y una correlación negativa entre los niveles de colesterol de HDL (colesterol "bueno") y la enfermedad cardiaca coronaria. El nivel total de colesterol en la sangre, el cuales una medida de la suma total de HDL, LDL, VLDL y quilomicrones , no es considerado, de manera general, un indicador adecuado del riesgo de enfermedad cardiaca coronaria debido a que los niveles totales de colesterol total no revelan las proporciones relativas de HDL, LDL y VLDL. Para evaluar mejor el riesgo de enfermedad cardiaca, es deseable determinar la cantidad de HDL, LDL y triglicéridos además del colesterol total. Los médicos comúnmente ordenan lo que se conoce en la técnica como un "panel de lípidos totales" para sus pacientes. Un panel de lípidos incluye la concentración de colesterol total, colesterol de HDL, colesterol de LDL y triglicéridos. Existen dispositivos de prueba conocidos que pueden determinar el nivel de analitos individuales múltiples, pero ellos requieren, de manera indeseable una tira de prueba separada y una muestra de fluido separada para cada analito a ser determinada. Si la muestra de fluido es sangre completa, la batería de pruebas requiere, de manera indeseable, tomar muestras múltiples de sangre, o tomar una muestra única indeseablemente en grande y entonces depositar por separado porciones de la misma sobre tiras de prueba individuales. Por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 5,597,532 describe un aparato excelente para la evaluación oftoelectrónica de tiras de papel de prueba para usarse en la detección de ciertos analitos en la sangre u otros fluidos corporales. La tira de prueba comprende una parte de plástico alargada que incluye una porción articulada para permitir que una primer porción sea doblada sobre una segunda porción. Una serie de capas de tiras de prueba son depositadas entre las porciones dobladas encima de la tira de prueba. El método implica proporcionar una tira coloreada separada y un módulo de memoria correspondiente por cada prueba. Por ejemplo, las tiras y módulos de colesterol total pueden ser coloreadas de rojo, mientras que las tiras y módulos de glucosa pueden ser coloreadas de amarillo, y así sucesivamente. Sin embargo, debe ser usada una muestra separada y conducirse una prueba separada para cada analito para el cual va a ser determinada la concentración. Un problema en el diseño de una tira de analitos múltiples reside en la separación de las células sanguíneas, dado que la mayoría de las tiras de prueba en fase seca separan las células sanguíneas rojas por un esquema de flujo lateral. Por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 4,816,224 (Rittersdorf et al.) describe una matriz de fibra de vidrio para la separación de células sanguíneas en la cual una muestra de sangre es colocada sobre la matriz y resulta un movimiento lateral a todo lo largo de la matriz. Las células sanguíneas rojas y el plasma migran ambos lateralmente a través de la matriz de fibra, pero las células rojas sanguíneas migran a una velocidad más lenta que el plasma. Además, eventualmente ocurre algo de hemolisis en la capa de fibra de vidrio. Además, muchos dispositivos de flujo lateral comercialmente disponibles están configurados de modo que la capa de reacción no sea puesta en contacto por transporte de fluido con la capa de fibra de vidrio hasta que la capa de fibra de vidrio sea llenada completa con plasma. Esto ocurre a un tiempo predeterminado y exacto después de que una cantidad adecuada de plasma, pero no de células sanguíneas rojas, ha migrado a un lugar designado sobre la capa de fibra de vidrio. Además, la determinación de las concentraciones de ciertos analitos en sangre completa, por ejemplo, HDL, requiere múltiples pasos de proceso, y la técnica anterior conocida por la solicitante enseña que muchos o todos esos pasos de proceso tienen que ser conducidos vía esquemas de flujo lateral. Por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 5,426,030 (Rittersdorf et al.) y su progenie describen tiras de prueba para la precipitación y separación de colesterol no HDL de colesterol HDL en muestras de plasma. Esta tecnología de separación implica dos capas en contacto entre sí. La primera capa que está constituida de una capa de fibra de vidrio hidrofílica impregnada con un agente precipitante que precipita no HDL pero no HDL. La segunda capa es preferiblemente una capa de fibra de vidrio en forma de malla con fibras de un diámetro de 0.2 a 10.0 µ?t? que actúa como un medio transparente. La precipitación de colesterol no HSDL ocurre en la primera capa y la separación de precipitantes no HDL del plasma ocurre cuando el plasma que tiene no HDL precipitado migra a través de la segunda capa. Nuevamente, sin embargo, la solicitante comprende que el paso de separación debe ser una técnica cromatográfica que la solicitante cree puede limitarla versatilidad de la prueba. Por ejemplo, puede ser difícil diseñar e implementar una tira de prueba en fase seca que utilice dos operaciones de flujo lateral, una para separar sangre y la otra para precipitar y retener no HDL . Un dispositivo de tira de prueba en fase seca conocidas por las solicitantes para medir analitos múltiples en una sola muestra de sangre completa es descrita en la Patente Estadounidense No. 5,213,965 (Jones) . Este dispositivo mide la concentración de colesterol de HDL y otros analitos de una muestra de sangre completa, pero el dispositivo es más complejo. El dispositivo incluye un pozo en el cual la muestra de sangre completa es depositada y entonces extraída a través de un capilar hasta una almohadilla de tamizado hecha de material fibroso. La almohadilla de tamizado logra la separación inicial de las células sanguíneas del plasma sobre la base de la velocidad de migración más lenta de las células sanguíneas a su través. La almohadilla de tamizado está cubierta con una membrana microporosa la cual filtra aún más las células sanguíneas. La cubierta de la membrana porosa es una membrana reservoria de reactivo que contiene agentes precipitantes para no HDL sobre un lado de la misma. Sobre el otro lado del reservorio de reactivo, no existen agentes precipitantes. En la parte superior y que se extiende lateralmente más allá del reservorio de reactivo se encuentra una matriz alargada la cual distribuye la muestra lateralmente después de que abandona el reservorio. Finalmente, una o más almohadillas de prueba son colocadas encima y desviadas de la matriz alargada. El plasma sale de la membrana de filtración y entra al reservorio de reactivo donde son precipitados los no HDL sobre el interior de la misma y entonces fluye desde el reservorio y miga lateralmente a través de un lado de la matriz alargada. De manera similar, el plasma que entra al otro lado del reservorio de reactivo no encuentra agentes precipitantes, y este plasma sale del lado de la matriz alargada opuesto al lado por el que sale el plasma que contiene no HDL precipitados. A un tiempo deseado, las almohadillas de prueba pueden ser oprimidas de modo que estén en comunicación fluídica con la matriz alargada. Las almohadillas de prueba que entran en contacto con un lado de la matriz alargada miden la concentración de HDL, mientras que las almohadillas de prueba que entran en contracto con el lado opuesto de la matriz alargada miden el colesterol total. De manera indeseable, el dispositivo descrito por la patente "965 depende no de una, sino de dos operaciones cromatográficas o esquemas de flujo lateral separados, siendo el primero la separación de la sangre en la almohadilla de tamizado, y siendo el segundo la separación de no HDL a través de la matriz alargada. Además, el dispositivo descrito por la patente '965 es indeseablemente complejo. Por ejemplo, se requiere también, un tubo capilar, dos capas para separar sangre, y dos capas para precipitar y entonces separar no HDL. Finalmente, las almohadillas de prueba deben ser mantenidas separadas de la matriz alargada hasta que toda la operación sea apropiadamente sincronizada, después de lo cual la placa de prueba que tenga las almohadillas de prueba sobre ella pueda ser oprimida contra la matriz alargada. Las almohadillas de prueba son mantenidas centra la matriz alargada durante un tiempo predeterminado, y entonces removidas para controlar fuertemente el volumen de muestras recibido por las almohadillas de prueba. Por supuesto, la opresión y elevación posterior de la almohadilla de prueba requieren pasos de proceso y estructuras asociadas para llevar a cabo esos pasos. Es deseable evitar los esquemas de flujo lateral, operaciones cromatográficas , dispositivos complejos y operaciones de temporizacion o sincronización delicadas que son requeridas por la técnica anterior descrita anteriormente. De manera general, es deseable proporcionar una tira de prueba para medir la concentración de analitos múltiples de una sola muestra que sea más confiable, económica, más fácil de usar y menos propensa a errores que los dispositivos de la técnica anterior discutidos anteriormente.

SUMARIO DE LA INVENCION La presente invención es una tira de prueba multicapa que mide concentraciones de analitos múltiples de una sola muestra de sangre completa. La tira de prueba incluye una matriz de prueba de varias capas mantenidas juntas en contacto constante por un sujetador de la tira de prueba. La invención se caracteriza porque no tiene partes móviles, lo cual hace posible un uso novedoso de una capa de gasto alargada que dispersa sangre a través de toda su longitud, a pesar de tener capas con propiedades capilares conocidas adyacentes a y en contacto con esta. Puesto que la invención depende principalmente de un esquema de flujo vertical, la tira de prueba es, de manera ventajosa, muy compacta. En una forma de la misma, la presente invención proporciona un aparato para medir la concentración de analitos múltiples en una muestra de sangre completa. El aparato comprendé una matriz de prueba, la cual comprende además una capa de gasto alargada, al menos una capa de separación de sangre adyacente al lado inferior de la capa de gasto, y al menos dos pilas alineadas verticalmente separadas y adyacentes al lado inferior de al menos una capa de separación de sangre. El aparato comprende además un sujetador de la tira de prueba que tiene porciones superior e inferior manteniendo a la matriz a prueba entre ellas, manteniendo por lo tanto las capas en contacto entre sí. La porción superior del sujetador de la tira de prueba tiene una ventana de aplicación de muestra que expone una superficie superior de la capa de gasto, donde la porción inferior del sujetador de la tira de prueba tiene al menos una ventana de lectura de prueba que expone ambas superficies de la primera y segunda pilas.

Una ventaja sorprendente de la presente invención es que evita la necesidad de mantener cualquiera de sus capas separadas, alejadas de cualesquier otras capas. En su lugar, todas las capas de la matriz de prueba inventiva de la presente invención son mantenidas juntas en contacto constante. Esto evita la necesidad de partes móviles y la estructura para proporcionar ese movimiento. De este modo, las tiras de prueba de acuerdo con la presente invención pueden ser producidas de manera más económica y confiable que las tiras de la técnica anterior que requieren partes móviles. Esta es una ventaja mayor en términos de proporcionar una tira de prueba a precio competitivo a todos los mercados o puestos ( "OTC" ) y de punto de cuidado ("POC" ) . En relación con esto, otra ventaja de la presente invención es que depende principalmente del flujo vertical, y es esencialmente un dispositivo de flujo vertical, caracterizado porque la ventana de aplicación de muestra no está desviada verticalmente de la periferia externa definida por las ventanas de lectura de prueba. En modalidades preferidas, la ventana de aplicación de muestra está colocada en el centro con respecto a la longitud de la tira, lo cual permite que las tiras de prueba se vuelvan más compactas. En el dispositivo de las solicitantes, la separación de sangre y fraccionamiento de colesterol se llevan a cabo en una dirección que es a través de las capas, no transversalmente a ellas, en contraste rígido con las enseñanzas de la técnica anterior discutida anteriormente . Otra ventaja más de la presente invención es que proporciona un "panel de lípidos completo" con solo una muestra de sangre de 35 microlitros . La tira de prueba tiene pilas las cuales miden directamente el colesterol total, triglicéridos y colesterol de HDL. Una vez que las concentraciones de esos tres analitos son conocidas, puede ser calculada la LDL por el cálculo de Friedewald bien conocido.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las mencionadas anteriormente y otras ventajas de la presente invención, y la forma de obtenerlas, se volverán más evidentes y la invención en sí será mejor comprendida con referencia a la siguiente descripción de las modalidades de la invención tomadas en conjunto con los dibujos acompañantes, donde: La Figura 1 es una vista en perspectiva mirando hacia abajo sobre una tira de prueba montada y cerrada de acuerdo con la presente invención; La Figura 2 es una vista en perspectiva del despiece de un sujetador de tira de prueba de acuerdo con la presente invención, siendo la vista tomada desde el fondo del sujetador de la tira de prueba; La Figura 3 es una vista en perspectiva de un sujetador de la tira de prueba de acuerdo con la presente invención, el sujetador de la tira de prueba tiene sus porciones superior e inferior desdobladas y siendo mostrado el componente interno de la tira; La Figura 4 es una vista en perspectiva del despiece de un sujetador de la tira de prueba de acuerdo con la presente invención, que ilustra las capas y pilas de la matriz de prueba en relación con las porciones superior e inferior del sujetador de la tira de prueba; La Figura 5 es una vista en corte lateral de una matriz de prueba ejemplar de acuerdo con una modalidad de la presente invención; La Figura 6 es una vista en corte lateral de una matriz de prueba ejemplar de acuerdo con otra modalidad de la presente invención; La Figura 7 es una vista en perspectiva que ilustra el esquema de flujo vertical ilustrado por las pilas y la capa de separación de sangre de la presente invención ; Las Figuras 8-10 ilustran varias modalidades de capas "alineadas verticalmente" , como es usado el término en esta especificación; Las Figuras 11-13 ilustran curvas estándar para colesterol, HDL y triglicéridos , respectivamente; Las Figuras 14-16 son gráficas las cuales grafican el valor medido de la concentración contra el valor de referencia de HDL, colesterol total y triglicéridos, respectivamente; y Las Figuras 17-19 ilustran curvas estándar para el colesterol, HDL y glucosa, respectivamente. Los caracteres de referencia correspondientes indican partes correspondientes a través de las diferentes vistas.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Las modalidades de la presente invención descritas a continuación no pretenden ser exhaustivas o limitar la invención a las formas precisas descritas en la siguiente descripción detallada. Más bien, las modalidades se eligieron y describieron de modo que otros expertos en la técnica puedan apreciar y comprender los principios y prácticas de la presente invención.

Definiciones "HDL" se refiere a lipoproteína de alta densidad; "LDL" se refiere a lipoproteína de baja densidad. "VLDL" se refiere a lipoproteína de densidad muy baj a . "No HDL" se refiere a LDL, VLDL y quilomicrones , es decir, lipoproteínas diferentes a HDL que reaccionarán con la membrana de reacción de colesterol convencional. "PTA" se refiere al ácido fosfotúngstico . "Capa de fraccionacion de HDL" se refiere a una capa de tira de prueba seca seleccionada de materiales adecuados e impregnada con uno o más reactivos de modo que el colesterol no HDL (es decir, VLDL y LDL) en una muestra de fluido depositada sobre la capa se ha precipitado y retenido sustancialmente dentro de la capa, pero las HDL en solución en la muestra permanezcan en solución y sean capaces de pasar a través de la capa de fraccionacion . "Plasma" se refiere a la porción no celular de la sangre de la cual son excluidos componentes celulares como las células rojas sanguíneas. "Suero" técnicamente difiere del plasma, en que no incluye fibrinógeno. Sin embargo, para los propósitos de esta solicitud "suero" y "plasma" son algunas veces usados de manera intercambiable. "Alineado verticalmente" se define con respecto a las Figuras 8-10 y el texto acompañante de esta especificación . Una "pila" se refiere a una o más capas de prueba de membranas colocadas sobre la parte superior de otra en una relación alineada verticalmente. Una "capa de gasto" es una capa alargada que recibe una muestra de sangre sobre un lado de la misma, a su través y a través de toda su longitud, y proporciona una muestra de sangre uniforme a través de toda su longitud hasta el otro lado, proporcionando la distribución uniforme de la sangre a una capa o capas adyacentes a o en contacto con su lado inferior.

Dispositivo de Prueba Refiriéndose ahora a la Figura 1, la tira de prueba 20 incluye el sujetador de la tira de prueba 22 el cual es formado preferiblemente por moldeo por inyección. El sujetador de la tira de prueba 22 incluye un asa 24 y una porción superior 26 (Figuras 2 y 3) la cual está unida de manera preferiblemente articulada por una porción articulada 28 a la porción inferior 30, mostrada separada en la Figura 2. Con referencia a la Figura 3, la porción superior 26 puede doblarse alrededor de la porción articulada 28 sobre la porción inferior 30 como se muestra. La porción superior 26 incluye una abertura 32, mientras que la porción inferior 30 incluye tres aberturas separadas 34. La abertura 32 es preferiblemente una forma oval alargada para facilitar el gasto de sangre, pero puede ser formada alternativamente como una abertura redonda del mismo tamaño que las aberturas 34. Cuando la porción superior 26 es doblada sobre la porción inferior 30, la abertura 32 es alineada centralmente sobre las aberturas 34. En su posición doblada, la abertura 32 en el sujetador 22 define una ventana o área de aplicación de muestra para depositar una muestra de fluido corporal mientras que las aberturas 34 definen ventanas de lectura de prueba a través de las cuales son conducidas mediciones optoelectrónicas de reacciones de prueba químicas. Opcionalmente, las aberturas 34 pueden ser configuradas con ventanas transparentes, aunque eso no es necesario. La tira de prueba particular descrita aquí es adecuada para usarse con un instrumento optoelectrónico modificado vendido bajo la marca comercial de CardioChek, disponible de Polimer Technology Systems, Inc., Indianapolis , IN. Refiriéndose ahora a la Figura 4, las porciones superior e inferior 26 y 30 del sujetador de la tira 22 emparedan una matriz de prueba 36 entre ellas, de modo que las capas de la matriz 36 estén en contacto constante entre sí. La matriz de prueba 36 está constituida en una capa de gasto superior, una capa de separación de sangre 40, pilas 42, y una capa adhesiva 44 que tiene aberturas 46 que se alinean con las aberturas 34 y los fondos de las pilas respectivas 42 cuando las capas son montadas. Las pilas 42 están constituidas además de una o más capas alineadas verticalmente, la función y características específicas de las cuales son descritas con mayor detalle aquí más adelante. Cuando son montadas y cerradas, las capas de las pilas 42, y las capas 38, 40 y 44 son todas prensadas juntas. La abertura 32 expone una parte de la superficie superior o capa de gasto 38 y las aberturas 34 y 46 exponen la superficie inferior de las capas inferiores de las pilas 42. Se ha encontrado que únicamente es necesaria una fuerza mínimamente compresiva proporcionada por el sujetador de la tira 22 para emparedar las capas de la matriz de prueba 36. Hasta este punto, las porciones 26 y 30 tienen indentaciones o cavidades en forma de I complementarias 48 (Figuras 2 y 3) en las cuales es recibida la matriz en forma de I correspondiente 36. Las cavidades 48 permiten que las porciones 26 y 30 sean colocadas juntas a presión en un acoplamiento hermético a presión como se muestra en la Figura 1 aunque ejerciendo aún una fuerza mínimamente compresiva sobre la matriz 36. Como se muestra en las Figuras 2 y 3, la porción superior 26 incluye receptáculos 50 que incluyen patas 54 que se colocan vía locación por fricción en las aberturas cilindricas de acoplamiento 56 formadas en los resaltos 52. Las pilas 42 incluyen todas el mismo número de capas o al menos tienen aproximadamente el mismo espesor, de modo que las superficies inferiores de las pilas 42 estén sustancialmente coplanares. Esta estructura coplanar ayuda a mantener la presión compresiva apropiada sobre la matriz 36 por el sujetador 22. Deberá comprenderse que al momento de escribir la presente, se creía que una fuerza mínimamente compresiva ejercida sobre la matriz 36 es preferible. Sin embargo, la cantidad de presión con la cual la matriz 36 va a ser presionada junta es una variable de diseño que puede ser ajustada (1) ajustando la profundidad de las cavidades 48; (2) ajustando el acoplamiento entre los receptáculos 50 y los resaltos 52; (3) ajustando la altura de las patas 54 y/o la profundidad de las aberturas cilindricas 56. Refiriéndose a la Figura 5, pueden apreciarse las capas individuales y las químicas de diagnóstico de la matriz 36. La capa superior 38 de la matriz 36 es una capa de gasto o dispersión capaz de dispersar eficientemente la muestra de sangre 58 a través de toda su longitud, de modo que la muestra de sangre sea depositada verticalmente a la siguiente capa sobre toda la longitud de la capa 38. (Véanse las flechas de referencia en la Figura 5) . Un número significativo de la presente invención fue la identificación de un material adecuado para efectuar esa dispersión. Fueron probados muchos materiales candidatos con resultados inaceptables. Por ejemplo, una malla como una malla de poliestireno funciona bien para tiras de prueba solas, como aquellas descritas en la Patente Estadounidense No. 5,597,532. Sin embargo, cuando esa malla es usada en un intento por dispersar sangre a través de una matriz alargada como la matriz 36, la sangre inevitablemente es llevada hacia la capa inferior de la malla (capa 40) antes de ser propagada a los extremos externos de la capa 38. El problema de que la sangre sea jalada hacia la capa 40 desde la capa 38 presentó un obstáculo de diseño serio. El problema es causado en gran parte por la capa 40, la cual es un filtro profundo de fibra de vidrio que está adyacente a y en contacto con la capa 38. Cuando está en contacto con la capa 38, la capa 40 ejerce un efecto capilar sobre la capa 38, tendiendo a jalar sangre hacia la capa 40 en su centro antes de que la sangre pueda ser dispersada suficientemente hacia los extremos de la capa de gasto alargada 38. La muestra de sangre suficiente es proporcionada la parte media de la capa 40, pero no en sus extremos. Esto da como resultado una deposición impredecible y no uniforme del filtrado de sangre sobre las pilas 85 y 98, lo cual a su vez da como resultado resultados de prueba impredecibles . Una forma de evitar este problema de capilaridad es mantener la capa 38 separada del resto de las capas hasta que la muestra de sangre 58 se dispersa a través de la capa 38. Sin embargo, este método necesita una tira de prueba sin partes móviles y requiere una operación sincronizada, como es enseñado por la patente de la técnica anterior 5,213,965, discutida anteriormente. Este método implica pasos y estructuras de proceso que los inventores de la presente invención desean evitar. De manera notable, la capa de gasto o dispersión 38 de la presente invención dispersa la muestra de sangre 58 (Figura 5) eficiente y suficientemente a través de toda la longitud de la capa 38 como es mostrado por las flechas de referencia - aún con la capa 40 estando en contacto constante con esta. Este es un logro significativo, dado que proporciona una tira de prueba en fase seca multianalitos que usa solo una muestra de 35 microlitros de sangre, que no tiene además partes móviles.

Sin desear atarse a una teoría específica, se cree que la capa 38 opera por un mecanismo de dos etapas, aunque deberá comprenderse que los pasos pueden no ocurrir secuencialmente, sino que pueden ocurrir simultáneamente en un cierto grado. En el primer paso, la muestra de sangre 58 (Figura 5) se dispersa naturalmente dentro de la capa 38; en el segundo paso, la muestra es depositada verticalmente la capa 40. Nuevamente, deberá esperarse que la segunda capa pueda estar en la porción central de la capa 30 antes de que se encuentren los extremos de la capa 38, pero inicialmente ocurren dos funciones, siendo la primera la dispersión de la muestra de sangre a través de toda la longitud de la capa 38, y siendo la segunda la liberación de la muestra de sangre uniformemente a la siguiente capa sobre toda la longitud de la capa 38. De manera sorprendente, se ha encontrado que las capas usadas como almohadillas conjugadas en equipos de prueba de embarazo funcionan muy bien como la capa 38. La capa 38 es una capa de células abiertas capaz de dispersar rápida y efectivamente la muestra de fluido. Un material adecuado para la capa 38 está disponible bajo el nombre de "Accuflow Plus-P" , Schleicher & Schuell, Inc. Otro material adecuado para la capa 38 se encuentra disponible bajo el nombre de "Accuwik" , Pall Biochemicals . La capa 38 es construida preferiblemente de poliéster hidroxilado. Las superficies de la fibra han sido modificadas para ser inherente y permanentemente humectables con agua. La membrana 38 proporciona una velocidad capilar excelente y una capacidad de retención de volumen alta, lo cual permite que la sangre se disperse lateralmente a través de toda la longitud de la membrana . Generalmente, la capa 38 debe proporcionar características de flujo extremadamente consistentes, ser intrínsecamente humectable con agua, y exhibir una capacidad de retención de volumen suficiente, de modo que la muestra se disperse a través de toda la longitud de la capa, aún a través de otra capa, como la capa 40 que actúe como capilar colocada en contacto constante debajo de esta. Se anticipó que otras capas que poseen las características anteriores funcionarían para la capa 38. Como se aclarará con referencia a la siguiente discusión, la dispersión lateral sustancial ocurre únicamente en la capa gasto 38 de la matriz 36. En las capas restantes, se cree que la dirección del flujo de fluido neto es sustancialmente vertical, o normal al plano de las capas. Por ejemplo, con referencia a la Figura 7, la gota de muestra de fluido 60 es depositada sobre la capa 62 (la cual podría ser la capa de separación de sangre 40 o una de las capas de una de las pilas 42) . La capa 62 define un plano 64 que está sustancialmente paralelo a este. La transferencia de un fluido a través de la capa 62 es normal o perpendicular al plano 64, o en dirección del vector V, mostrado en el número de referencia 66. De este modo, no existe migración sustancial de fluido de un lado de la capa 62 a otra. El flujo de fluido es a través de la capa 62, no transversalmente a este. En relación con esto, también deberá apreciarse, que aún cuando ocurra la dispersión lateral de la muestra en la capa 38, la ventana de aplicación de muestra 32 está alineada de manera sustancialmente vertical con o se proyecta al menos parcialmente sobre las ventanas de lectura de prueba 34 como se muestra en la Figura 4. La longitud relativa de prueba 20 es gobernada por la dimensión periférica de las pilas 42. Como se muestra en la Figura 4, la pila de prueba 42 define una periferia "P" a lo largo, mientras que la ventana de aplicación de prueba define una periferia "p" a lo largo. Con la presente invención, la ventana de prueba 32 puede ser colocada siempre dentro de la periferia P definida por las pilas 42 como se muestra en la Figura 4. Esto permite una tira de prueba más compacta que en un dispositivo de flujo lateral, donde la ventana de prueba 32 sería colocada fuera de la periferia P a lo largo, requiriendo de este modo una tira más larga. Además, debido a que no ocurre flujo lateral en ninguna de las otras capas que la capa 38, las capas pueden ser "alineadas verticalmente" , como se muestra en las Figuras 8-10. Con referencia particular a la Figura 8, las capas de tamaño igual 68, 70 y 72 de la pila 74 son alineadas directamente una sobre otra. Aunque esa alineación directa es preferible y ventajosa debido a que es más compacta, deberá comprenderse que otras variaciones menores de la alineación vertical no evitan el alcance de la presente invención. Por ejemplo, la Figura 9 describe una pila 76 en la cual la capa media 80 es más grande que y se proyecta ligeramente desde las capas 78 y 82. De manera similar, la pila 84 mostrada en la Figura 10 es descrita como curva, donde las capas de la misma no están colocadas directamente una sobre otra. Sin embargo, siempre que el flujo de ' fluido sea sustancialmente a través de las capas mostradas en los Figuras 9 y 10, y no transversalmente a ellas, las pilas 76 y 84 están no obstante "unidas verticalmente" para propósitos de esta especificación. Regresando a la Figura 5, la capa de separación de sangre 40 está alineada, con y en contacto con el lado inferior de la capa 38 y esta es generalmente una matriz de fibra de vidrio. Un material comercial adecuado para la capa 40 es el Ahlstrom Grado 144, con un espesor de 0.378 mm, disponible de Ahlstrom Filtration, Inc., Mt . Holly Springs, PA. Podrían ser sustituidas otras matrices de fibra de vidrio. Generalmente, la capa 40 deberá incluir fibras de vidrio con un diámetro de 0.5 a 2 micrómetros y una densidad de 0.1 a 0.5 g/cm3, de manera más preferible de 0.1 a 0.2 g/cm3. La capa 40 está hecha del mismo material que se describió en nuestra solicitud de patente de utilidad copendiente y comúnmente otorgada titulada Tira de Prueba para Determinar la Concentración de HDL. La capa 40 está impregnada con una sal y un agente humectante, como se expone en los ejemplos más adelante .

Pila de Medición de HDL Con referencia a la Figura 5, la pila media 92 que tiene las capas 94 y 96 está adyacente a y en comunicación fluídica con el lado inferior de la capa 40. La pila 92 toma fluido de la capa 40 y produce una respuesta coloreada en la capa de reacción 90 que es proporcionar a la concentración de colesterol de HDL. Como se describe en la solicitud copendiente comúnmente otorgada de Pila de Prueba para Determinar la Concentración de HDL, la capa 40 no separa el 100% de las células sanguíneas rojas. En su lugar aproximadamente 20% de las células sanguíneas rojas escapan a las capa 88, 94 y 100. De este modo, las capas 88, 94 y 100 separan y retienen las células sanguíneas rojas que pasaron a ellas desde la capa 40. Como se hizo notar anteriormente, la técnica anterior generalmente enseña que son necesarias dos capas y dos procesos asociados para precipitar y separar no HDL del plasma. De acuerdo al método de la técnica anterior, la precipitación de no HDL se lleva a cabo en la primera capa y los precipitantes pasan entonces a través de esta primera capa a una segunda capa. En la segunda capa, la migración de precipitantes es más lenta que del plasma, y el plasma alcanza la membrana antes que los precipitantes. Véanse, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses Nos. 5,426,030; 5,580,743; 5,786,164; 6,171,849; 6,214,570; 5,451,370; 5,316,916; 5,213,965; y 5,213,964. En contraste, los inventores de la presente invención han encontrado que la separación de no HDL de HDL puede ser lograda en una capa única, sustancialmente uniforme , 94. Además, se ha encontrado que la precipitación y separación toman lugar en una dirección que es sustancialmente normal al plano establecido por la capa 94. Es decir, que mientras ocurra el movimiento de fluido en todas las direcciones dentro de la capa 94, no existirá una migración tangencialmente significativa del fluido de un lado de la capa 94 al otro. En realidad, de manera muy similar a lo anotado anteriormente por la técnica anterior, la presente invención no incorpora o depende de diferentes velocidades de migración de plasma y no HDL precipitados a través de la capa 9 . Esto se debe a que el transporte de fluido es a través de la capa 94, no transversalmente a esta. Pueden ser usados muchos materiales adecuados para la capa 94, como papel filtro o acetato de celulosa en combinación con fibras de vidrio. Muchos ejemplos de capas adecuadas son proporcionados en la solicitud de Tira de Prueba para Determinar la Concentración de HDL copendiente. Una membrana adecuada para la capa 94 es la membrana CytoSep® grado 1660, de 0.32 mm (12.9 milésimas de pulgada) de espesor disponible de Pall Specialty Materials, Port Washington, NY . Otra membrana adecuada para la capa 94 es papel grado 595, con un espesor de 0.180 mm (7.1 milésimas de pulgada) disponible de Schleicher & Schuel, eene, NH. Además, la capa 94 es sustancialmente uniforme a su través o simétrica. Es decir, que aunque la matriz de la capa 94 incluye poros de tamaños diferentes, la matriz es consistente a través de toda la capa. La capa 94 está impregnada con una solución descrita aquí más adelante en los ejemplos. Además se hace referencia a nuestra solicitud copendiente "Tira de Prueba para Determinar la concentración de Colesterol de HDL" .

Pila de Medición de Colesterol Total Con referencia adicional a la Figura 5, la pila del extremo 86 está separada de la pila media 92 y está adyacente a y en comunicación fluídica con la capa 40. La pila 86 toma fluidos de la capa 40 y produce una respuesta coloreada en la capa de reacción 90 que es proporcionar a la concentración del colesterol total en la muestra 58. La pila 86 también incluye una capa sin tratar o separadora 88 cuyo propósito principal es mantener el espesor relativo de todas las pilas aproximadamente igual y, al hacer esto, mejora la compresión total ejercida sobre la matriz 36 por las porciones superior e inferior 26 y 30 del sujetador de la tira 22. La capa sin tratar 88 también retiene las células en líneas residuales que pasaron a esta desde la capa 40. Para los propósitos de esta especificación, el término "capa sin tratar" se refiere a una capa como la capa 88 cuyo propósito principal es mantener todas las pilas sustancialmente con el mismo espesor. La capa sin tratar 40 no está cargada con ningún reactivo, pero puede ser impregnada con un agente humectante para mejorar el flujo de fluido o puede ser impregnada con un cromógeno en aplicaciones donde sean empleadas dos membranas de prueba. Un ejemplo de funcionamiento específico de una pila de medición de color total 88 se expone en los ejemplos aquí más adelante.

Pila de Triglicéridos Con referencia adicional a la Figura 5, la pila 98 está separada de la pila 92 y adyacente a y en comunicación fluídica con la capa 40. La pila 98 toma plasma de la capa 40 y produce una respuesta coloreada en la capa de reacción 102 que es proporcional a la concentración de triglicéridos en la muestra 58. La pila 98 también incluye una capa sin tratar o separadora 100, que en esta modalidad es la misma capa sin tratar 88. Un ejemplo de una pila de medición de triglicéridos 92 se expone en los ejemplos aquí más adelante. Deberá comprenderse que una vez determinada la concentración de HDM, colesterol total y las concentraciones de triglicéridos son determinadas de las pilar 86, 92 y 98, respectivamente, el colesterol LDL puede ser calculado por la relación bien conocida: colesterol de LDL = colesterol total -triglicéridos/5-colesterol de HDL Una ecuación lineal simple como la anterior puede ser programada fácilmente en el instrumento que lea optoelectrónicamente las pilas de prueba, proporcionando de este modo la concentración de un analito adicional que no fue medido directamente. De este modo, ahora puede apreciarse que una sola matriz de prueba 36 como la llave escrita puede ser configurada para concentraciones de prueba de analitos múltiples.

Capas de separación de sangre múltiples La matriz 36' mostrada en la Figura 6 incluye tres pilas 104, 106 y 108 que están separadas y adyacentes a y en comunicación fluídica con la capa de gastos 38. Cada pila tiene su propia capa de separación de sangre 110 como su capa superior. La diferencia entre la matriz 36' y la matriz 36 es que la matriz 36' tiene capas de separación de sangre separadas 110 para cada pila. De otro modo, la matriz 36' es la misma matriz 36 descrita con referencia a la Figura 5. Al momento de esta solicitud, la modalidad mostrada en la Figura 6 era la modalidad preferida debido a que reduce el volumen de sangre necesario en comparación con la capa 40 en la modalidad descrita en la Figura 5.

Otras pilas Los principios de la presente invención pueden ser usados para combinar varias otras pilas adyacentes a la capa de separación de sangre separadas lado a lado. Por ejemplo, glucosa y cetona (beta-hidroxi-butirato) representan analitos para los cuales podrían ser configuradas las pilas.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos permitirán a un experto en la técnica practicar completamente la presente invención .

Ejemplo 1 Solución para la impregnación de la capa de separación de sangre 40. Se usó la siguiente solución de impregnación: Agua desionizada 800.00 mL D-Sorbitol 75.00 gm Cloruro de Sodio 10.00 gm Ajustar el volumen a 1 litro con agua desionizada.

Ejemplo 2 Impregnación de la capa de separación de sangre 40 con la solución del Ejemplo 1: Una membrana de fibra de vidrio (Ahlstrom Tuffglass) de 15.24 centímetros (6.00" (pulgadas) ) de ancho fue sumergida en un baño de recirculación de solución de impregnación del Ejemplo 1 a una velocidad de 0.15 m/min (0.5 ft/min) . Esta es introducida entonces un túnel de aire caliente soplante (36.66-41.11° Celsius) (98-106° Fahrenheit) y baja humedad (<5% de humedad relativa (HR) ) para secar completamente. Esta fue entonces dividida en tiras de 2.03 centímetros (0.80" (pulgadas)) en preparación para el montaje.

Ejemplo 3 Impregnación de la capa de separación de sangre 40 con la solución del Ejemplo 1: Una membrana de fibra de vidrio (Scheicher y Schuell) de 15.24 centímetros 6.00" (pulgadas ) de ancho fue sumergida en un baño de recirculación de solución de impregnación del Ejemplo 1 a una velocidad de 0.15 m/min (0.5 ft/min) . Esta es introducida entonces un túnel de aire caliente soplante (36.66-41.11° Celsius) (98-106° Fahrenheit) y baja humedad (<5% de humedad relativa (HR) ) para secar completamente. Esta fue entonces dividida en tiras de 2.03 centímetros (0.80" (pulgadas)) en preparación para el montaje.

Ejemplo 4 Solución para la impregnación de la Membrana de Fraccionación de HDL (capa 94) : Fue usada la siguiente solución de impregnación: Agua desionizada 800.00 mL Sulfato de Magnesio 5.00 gm Acido fosfotúngstico 45.00 gm Sorbitol 10.00 gm Ajustar el pH con NaOH o HCl pH 6.40-6.60 Ajusta el volumen a 1 litro con agua desionizada.

Ejemplo 5 Impregnación de la capa 24 con la solución del Ejemplo 4: Medios compuestos de fibra sintética (Pall Cytosep grado 1660) de 0.32 mm (12.9 (mils) ) de espesor, 14.98 centímetros (5.90" (pulgadas)) de ancho fue sumergida en un baño de recirculación de solución de impregnación a una velocidad de 0.15 m/min (0.5 ft/min) . Entonces se introdujo en un túnel de aire caliente soplante (36.66-41.11° Celsius) (98-106° Fahrenheit) y una humedad baja (<5% de HR) para secar completamente. Esta fue entonces dividida en tiras de 0.50 centímetros (C.20" (pulgadas)) en preparación para el montaje.

Ejemplo 6 Impregnación de la capa 94 con la solución del Ej emplo 4 : Medios compuestos de fibra sintética (Pall Cytosep grado 1661) de 0.18 mm (7.1 (mils) ) de espesor, 15.24 centímetros (6.0" (pulgadas)) de ancho fue sumergida en un baño de recirculación de solución de impregnación a una velocidad de 0.15 m/min (0.5 ft/min) . Entonces se introdujo en un túnel de aire caliente soplante (36.66-41.11° Celsius) (98-106° Fahrenheit) y una humedad baja (<5% de HR) para secar completamente. Esta fue entonces dividida en tiras de 0.50 centímetros (0.20" (pulgadas)) en preparación para el montaje.

Ejemplo 7 Impregnación de la capa 94 con la solución del Ej emplo 4 ·. Un papel para propósitos generales (Schleider y Schuell 595) 15.24 centímetros (6.0" (pulgadas)) de ancho fue sumergida en un baño de recirculación de solución de impregnación a una velocidad de 0.15 m/min (0.5 ft/min) . Esta se introdujo entonces en un túnel de aire caliente soplante (36.66-41.11° Celsius) (98-106° Fahrenheit) y una humedad baja (<5% de HR) para secar completamente.

Esta fue entonces dividida en tiras de 0.50 centímetros (0.20" (pulgadas)) en preparación para el montaje.

Ejemplo 8 Solución para la impregnación de la capa de reacción de triglicéridos (capa 102): Fue usada la siguiente solución de impregnación: Agua desionizada 800.00 mL Triton X-100 1.00 gm CHAPS 0.70 gm Base de Citrato de Klucel 575.20 gm *véase más adelante 10% de Gantrez A 139 20.80 gm Cloruro de calcio, Anhidro 0.20 gm Sucrosa 25.20 gm Na2ATP 32.00 gm Ajustar el PH con NaOH o HCL pH 5.70 +/- 0.10 MAOS 6.25 gm G3P Oxidasa 250.00 kU Peroxidasa 750.00 kU Lipoproteína Lipasa 625.00 kU Glicerol Cinasa 358.40 kU 4-amino antipirina 5.55 g *Base de Citrato de Klucel Agua desionizada 800.00 mL Citrato de sodio 20.60 gm Molibdato de Acido Cítrico 6.30 gm Cloruro de Magnesio 1. 3 gm Polvo de BSA Std. 20.00 gm Benzoato de sodio 2.0 gm Klucel EXF 10.00 gm Ajustar pH a 5.5-5.7 Ajustar el volumen a 1 litro con agua desionizada Ejemplo 9 Impregnación de la capa de reacción de triglicérido 102 con la solución del Ejemplo 8: Una membrana de nylon (Pall Biodyne A) con un tamaño de poro de 0.45 µ??, de 15.24 centímetros (6.0" (pulgadas) ) de ancho fue sumergida en un baño de recirculación de solución de impregnación a una velocidad de 0.30 m/min (1.0 ft/min) . Esta se introdujo entonces en un túnel de aire caliente soplante (36.66-41.11° Celsius) (98-106° Fahrenheit) y una humedad baja (<5% de HR) para secar completamente. Esta fue entonces dividida en tiras de 0.50 centímetros (0.20" (pulgadas)) en preparación para el montaje.

Ejemplo 10 Solución para la impregnación de las capas de reacción de colesterol (capas 90 y 96) . Se usó la siguiente solución para impregnar las capas 90 y 96: Nota: Aún cuando sea usada la misma solución de impregnación para las capas 90 y 96, el resultado obtenido en la capa 90 es proporcional a la concentración del colesterol de HDL (puesto que no han sido removidos los no HDL) , mientras que el resultado obtenido en la capa 96 es proporcional a la concentración del colesterol total : Agua desionizada 200.00 mL Tritón X-100 0.77 gm Base de Colesterol 532.0 gm *véase más abajo Polvo de BSA Std. 13.88 gm 10% de Gantrez (p/v) 95.61 CHAPS 19.82 gm Sucrosa 37.01 gm Ajustar pH con NaOH o HCL pH 5.00+/-0.10 Ferrocianida de Potasio 0.11 gm TOOS 0.37 gm MAOS 4.63 gm Colesterol Oxidasa 74.00 kU Peroxidasa 231.30 kU Colesterol Esterasa 240.60 kU 4-Amino Anti-Pirina 4.16 gm Ajustar el pH si es necesario a 5.3-5.5 Ajustar el volumen a 1 litro con agua desionizada *Base de Colesterol Agua desionizada 800.00 mL Hidruro de Citrato de Potasio 30.00 gm PVP K-30 60.00 gm Acido Benzoico 2.00 gm Polvo de BSA Std. 4.00 gm EDTA, dihidrato disódico 1.47 gm Ajustar el pH con NaOH o HCL pH 5.40-5.60 Ajustar el volumen a 1 litro con agua desionizada Catalasa 0.50 kU Ejemplo 11 Impregnación de las capas de reacción de colesterol (capas 90 y 96) : Una membrana de nylon (Pall Biodyne A) , con un tamaño de poro de 0.45 µp?, de 15 centímetros (6.0" (pulgadas) ) de ancho fue sumergida en un baño de recicurlación de solución de impregnación a una velocidad de 1.0 pies/min. Esta se introdujo entonces en un tubo de aire caliente soplante 36.6-41.1°C (98-106°F) y una humedad baja (<5% de HR) para secar completamente. Esta fue dividida entonces en 0.5 centímetros (0.20" (pulgadas)) en preparación para el montaje.

Ej emplo 12 Capa de gasto 38 Una membrana de poliéster (Accuwik, Pall Biochemicals) de 0.33-0.35 mm (13.0-14.0 milésimas de pulgada) de espesor, de 15 centímetros (6.0" (pulgadas)) de ancho es dividida a 2.03 cm (0.8") de ancho y colocada sobre carretes con un núcleo de 7.6 cm (3.0") en preparación para el montaje.

Ejemplo 13 Capa de gasto 38 Una membrana de poliéster (Accuflow Plus-, Scheicher & Schuell) de 0.33-0.35 mm (13.0-14.0 milésimas de pulgada) de espesor, de 15 centímetros (6.0" (pulgadas)) de ancho es dividida a 2.03 cm (0.8") de ancho y colocada sobre carretes con un núcleo de 7.6 cm (3.0") en preparación para el montaje.

Ejemplo 14 Capa adhesiva 44 Un material de soporte con adhesivo (G&L 187) es dividido a 2.03 cm (0.8") de ancho y colocada entonces en una matriz perforadora para perforar 3 (tres) orificios con un diámetro de 0.35 cm (0.140"), separados verticalmente a 0.54 cm (0.215") y 0.96 cm (0.378") horizontalmente y colocados sobre carretes con un núcleo de 7.6 cm (3.0") en preparación para el montaje.

Ejemplo 15 Montaje de la Matriz de Prueba 36 y el Sujetador 22 Todos los materiales listados en los ejemplos 1-15 son colocados sobre una máquina estratificadora la cual consolida las membranas precortadas o separadas en un formato apilado que consiste de: Capa de Gasto 38 Capa de Separación de Sangre 40 Capa de fraccionación de HDL 88/capas no tratadas 94/100 Capa de Reacción de Colesterol 90/96/Capa de Reacción de Triglicéridos 102 Capa Adhesiva 44 La tira de prueba montada recién descrita mide las concentraciones de HDL, colesterol total y triglicéridos. Como se discutió anteriormente, las capas 90, 96 y 102 están alineadas sobre los orificios 46 en la capa de soporte 44, los cuales a su vez están alineados sobre las aberturas 34 en la porción inferior 30 del sujetador de la tira de prueba 22. Un color azul proporcional a la concentración del analito respectivo puede ser observado en cada una délas aberturas respectivas 34. Se contempló que la capa de soporte podría ser removida en modalidades comerciales, puesto que la capa de soporte funciona para retener las otras capas en su lugar hasta que las tiras sean montadas.

Ejemplo 16 Curvas de Calibración Varias muestras de sangre completa de concentraciones conocidas de HDL, colesterol total y triglicéridos, fueron medidas de la siguiente manera: 1. Aplicando una muestra de 35-40 microlitros a la abertura 32 de las tiras de prueba 20, 2. Leyendo la reflectancia de color azul sobre las capas de reacción (como se ven a través de las aberturas 34) sobre un analizador de sangre completa portátil (instrumento BioScanner Plus, Polymer Technology Systems, Indianápolis , IN) . Las Figuras 11-13 muestran las curvas de calibración generadas graficando las concentraciones de muestras de sangre contra los valores de por ciento de reflectancia (%R) leídos en un instrumento BioScanner Plus. Las Figuras 14-16 muestran gráficas de HDL, colesterol total y triglicéridos medidos, respectivamente, contra concentración conocida. Como se muestra, el coeficiente de correlación R2 en cada caso es muy bueno . Los siguientes ejemplos ilustran la construcción de pila para glucosa y cetonas, las cuales podrían ser sustituidas por o agregadas a la matriz 36 descrita anteriormente .

Ejemplo 17 La siguiente estructura fue construida como para el Ejemplo 15 para una tira de prueba de analitos múltiples 20 que proporciona la concentración de colesterol total, colesterol de HDL y glucósida. Capa de Gasto 38 (Accuflow Plus P) Capa de Separación de Sangre 40 (Tuff Glass ' Ahlstrom) Capa de fraccionación de HDL 88/capas no tratadas 94/100 (capas 88, 94 y 100 todas hechas de CytoSep 1660) Capa de Reacción de Colesterol 90/96/Capa de Reacción de Glucosa Capa Adhesiva 44 Solución para la impregnación de una capa de reacción de glucosa. Se usó la siguiente solución: Agua desionizada 397.20 g Base de glucosa 537.30 g *véase más adelante Gantrez (10%) 19.40 g Ferrocianuro de potasio 23.40 g Ajustar el pH a 4.7 con ácido cítrico MAOS 4.67 g Peroxidasa 700.90 ku Glucosa oxidasa 467.20 ku 4-amino antipirina 4.21 g Ajustar el pH a 4.7-4.9. Ajustar el volumen a 1 litro con agua desionizada. * Base de glucosa Agua desionizada 800.00 g Tritón x-100 1.86 g Acido cítrico, monohidrato 4.00 g Citrato de sodio, dihidrato 54.00 g EDTA potásico 1.30 g PVP (40,000 daltons) 60.00 g Seroalbúmina bovina 20.00 g Ajustar el pH a 4.7-4.9 Catalasa 50 U Ajustar el volumen a 1 litro con agua desionizada.

Ejemplo 18 Impregnación de la capa de reacción de glucosa El proceso es el mismo que se usó para las capas de reacción de colesterol 90 y 96 y la capa de reacción de triglicérido 102. Una membrana adecuada para la capa de reacción de glucosa 102 es la Thermopore de Pall Specialty Products.

Ejemplo 19 Curvas de Calibración Las curvas de calibración para los tres compuestos químicos (colesterol total, colesterol de HDL y glucosa) fueron generadas como en el Ejemplo 16. Varias muestras de sangre completa de concentraciones conocidas de HDL, colesterol total y glucosa, fueron medidas de la siguiente manera: 1. Aplicando una muestra de 35-40 microlitros a la abertura 32 de las tiras de prueba 20, 2. Leyendo la reflectancia de color azul sobre las capas de reacción (como se ven a través de las aberturas 34) sobre un analizador de sangre completa portátil (instrumento CardioChek PA, Polymer Technology Systems, Indianápol is , IN) .

Las Figuras 17-19 muestran las curvas de calibración generadas graficando las concentraciones de muestras de sangre contra los valores de por ciento de reflectancia (%R) leídos en un instrumento Cardio Chek PA.

Ejemplo 20 Solución para la impregnación de una capa de reacción de cetona: Se usó la siguiente solución: Agua desionizada 493.78 g Igepal 660 0.99 g Base de cetona 493.78 g *véase más adelante Cloruro de sodio 5.77 g Acido oxámico, sal sódica 0.55 g Sucrosa 24.96 g Ajustar el pH a 7.9-8.1 NBT 5.46 g Diaforasa 264.67 kU Hidroxibutirato deshidrogenasa 88.22 kU Ajustar el pH a 4.7-4.9. * Base de cetona Agua desionizada 800.00 g Citrato de sodio, dihidrato 24.00 g Seroalbúmina bovina 13.50 g PVP (30,000 daltons) 50.00 g Ajustar el pH a 7.9-8.1 Ajustar el volumen a 1 litro con agua desionizada.

Ejemplo 21 Impregnación de la Membrana de Cetona El proceso y la membrana son las mismos que se usaron para la membrana de glucosa de acuerdo a lo descrito con referencia al ejemplo 18.

Método de Prueba Una muestra de sangre de aproximadamente 30-50 microlitros es puesta en contacto con el centro de la superficie superior de la capa de gasto alargada 38 de la tira de prueba 20. Esto se efectúa preferiblemente dispersando la muestra de la punta de una micropipeta hacia la ventana de aplicación 32. La muestra de sangre se dispersa entonces sustancialmente a través de toda la longitud de la capa de gasto 32. Como un segundo paso, aunque no necesariamente secuencial del paso de dispersión, la muestra de sangre es liberable uniformemente desde sustancialmente toda la longitud de la superficie inferior de la capa de gasto 38 a la capa de separación de sangre 40, la cual se cree retiene aproximadamente el 80%-90% de las células rojas sanguíneas. El fluido que tiene aproximadamente 20% de las células sanguíneas rojas restantes es entonces proporcionado a las pilas 86, 92 y 98 (Figura 5) . A medida que la muestra se mueve verticalmente a través de esas pilas, las capas sin tratar 88 y 100 retienen cualesquier células sanguíneas rojas que escapen de la capa 40 mientras que la capa 94, adicionalmente , precipita y retiene colesterol no HDL. Nuevamente, el fluido se mueve a través de las pilas en una dirección que es sustancialmente normal al plano definido por las pilas. Aunque se cree que el movimiento del fluido es sustancialmente completo dentro de 10-20 segundos, toma más tiempo que se desarrolle el color en las capas 90, 96 y 100. En aproximadamente dos (2) minutos, el desarrollo de color en el fondo de cada pila ha alcanzado sustancialmente un punto final, y la reflectancia de cada capa 90, 96 y 100 puede ser medida y correlacionada con la concentración de colesterol como se describió anteriormente. La reflectancia puede ser leída y convertida automáticamente a concentración por un instrumento optoeléctrico disponible como un CardioChek PA, disponible de Polymer technology Systems, Inc. Indianápolis , Indiana. Se prefiere hacer la capa de separación de sangre en una pluralidad' de capas 110 como la capa superior en cada pila como se muestra en la Figura 6, lo cual reduce la cantidad de sangre consumida en comparación con la modalidad mostrada en la Figura 5. En una modalidad descrita anteriormente aquí, las tres pilas 90, 96 y 100 miden el colesterol total, colesterol de HDL y triglicéridos . Esos valores medidos, pueden ser calculada la concentración de colesterol de LDL por el cálculo de Friedewald. El instrumento CardioChek PA anotado anteriormente puede ser programado para hacer automáticamente el cálculo y presentar la concentración de LDL. Aunque ha sido descrita aquí anteriormente una modalidad preferida que incorpora los principios de la presente invención, la presente invención no se limita a las modalidades descritas. En su lugar, esta aplicación pretende cubrir cualesquier variaciones, usos, o adaptaciones de la invención usando sus principios generales. Además, esta solicitud pretende cubrir las desviaciones de la presente invención descrita que caigan dentro de la práctica conocida o acostumbrada en la técnica en la cual está invención pertenece y que caigan dentro de los límites de las reivindicaciones anexas.

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES 1. Un aparato para medir al concentración de analitos múltiples en una muestra de sangre completa, caracterizado porque comprende: una matriz de prueba, que comprende además: una capa de gasto alargada; al menos una capa de separación de sangre adyacente a la superficie inferior de la capa de gasto; al menos dos pilas alineadas verticalmente separadas y adyacentes a la superficie inferior de al menos una capa de separación de sangre; el aparato comprende además un sujetador de la tira de prueba que tiene porciones superior e inferior emparedando la matriz de prueba entre ellas, la porción superior del sujetador de la tira de prueba tiene una ventana de aplicación de muestra que expone una superficie superior de la capa de gasto, y la porción inferior del sujetador de la tira de prueba tiene al menos una ventana de lectura de prueba que expone las superficies inferiores de la primera y segunda pilas. 2. El aparato de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la ventana de aplicación de muestra está colocada dentro de la periferia [P] definida por las pilas. 3. El aparato de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las superficies inferiores de las pilas son sustancialmente coplanares. 4. El aparato de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la capa de separación de sangre comprende una matriz de fibra de vidrio . 5. El aparato de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la primera de las pilas comprende además: una capa de fraccionación que contiene un agente precipitante para colesterol no HDL, la capa de f accionación adyacente a y en contacto con la superficie inferior de al menos una capa de separación de sangre; y una capa de reacción adyacente a y en contacto con la superficie inferior de la capa de fraccionación, la capa de reacción contiene un agente para determinar el colesterol, por lo que la primera pila mide la concentración de HDL. 6. El aparato de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la segunda de las pilas comprende una capa sin tratar adyacente a y en contacto con la superficie inferior de al menos una capa de separación de sangre y una segunda capa de reacción que contiene un agente para determinar colesterol adyacente a y en contacto con la superficie inferior de la capa sin tratar, por lo que la segunda pila mide la concentración de colesterol total. 7. El aparato de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque una tercera de las pilas comprende una segunda capa sin tratar adyacente a y en contacto con la superficie inferior de al menos una capa de separación de sangre y una tercera capa de reacción que contiene un agente para determinar triglicéridos adyacente a y en contacto con la superficie inferior de la segunda capa sin tratar, por lo que la tercera pila mide la concentración de trigl icéridos . 8. El aparato de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la tercera de las pilas comprende una segunda capa sin tratar adyacente a y en contacto con la superficie inferior de al menos una capa de separación de sangre y una tercera capa de reacción que contiene un agente para determinar glucosa adyacente a y en contacto con la superficie inferior de la segunda capa sin tratar, por lo que la tercera pila mide la concentración de glucosa. 9. El aparato de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque al menos una capa de separación de sangre comprende una pluralidad de capas de separación de sangre, cada una de las capas de separación de sangre de la pluralidad correspondiendo a una de las pilas y estando aliviada verticalmente con éstas . 10. El aparato de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque al menos una capa de separación de sangre comprende una sola capa de separación de sangre que tiene dimensiones sustancialmente iguales a la capa de gasto. 11. Un método para determinar concentraciones de al menos dos analitos de una sola muestra de sangre, el método se caracteriza porque comprende: (a) poner en contacto la única muestra de sangre con la superficie superior de una capa de gasto alargada y dispersar la muestra sustancialmente a través de toda la longitud de la capa de gasto; (b) proporcionar la muestra de sangre desde sustancialmente toda la longitud de la superficie inferior de la capa de gasto hasta una pluralidad de pilas colocadas adyacentes a y en contacto con la capa de gasto ; (c) mover la muestra a través de las pilas en una dirección sustancialmente normal al plano definido por las pilas; (d) producir una respuesta coloreada en el fondo de cada pila que es proporcional a la concentración de uno de los analitos. 12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque comprende hacer pasar la muestra de sangre a través de al menos una capa de separación de sangre emparedada entre las pilas y la capa de gasto, por lo que el filtrado que tiene células sanguíneas rojas removidas es proporcional a las pilas. 13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque al menos una capa de separación de sangre es una matriz de fibra de vidrio la cual filtra sangre a través de su profundidad. 1 . El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque al menos una capa de separación de sangre comprende una pluralidad de capas de separación de sangre que comprenden además una capa superior de cada pila, estando cada capa de separación de sangre alineada verticalmente con su pila respectiva. 15. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el paso (a) comprende además poner en contacto la muestra en un lugar sobre la parte superior de la capa de gasto que está dentro de una periferia [P] definida por las pilas. 16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la dirección neta de flujo para los pasos (a) - (d) es sustancialmente normal al plano definido por las capas. 17. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la primera de las pilas mide el colesterol de HDL y una segunda de las pilas mide uno del colesterol y glucosa totales. 18. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la primera de las pilas mide el colesterol de HDL, una segunda de las pilas mide el colesterol total y una tercera de las pilas mide los trigl icéridos . 19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque comprende además calcular la concentración de colesterol de LDL. 20. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la primera de las pilas mide el colesterol de HDL, la segunda de las pilas mide el colesterol total, y la tercera de las pilas mide uno de los triglicéridos , la glucosa y cetonas.