MXPA04001534A - Peptidos arginales y metodos para el tratamiento de la coagulacion intravascular diseminada. - Google Patents
Peptidos arginales y metodos para el tratamiento de la coagulacion intravascular diseminada.Info
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Abstract
La invencion se refiere a la coagulacion intravascular diseminada. Mas particularmente, la invencion se refiere a una intervencion medica para la coagulacion intravascular diseminada. La invencion ofrece nuevos peptidos arginales, nuevos y mejores compuestos y metodos para el tratamiento de la coagulacion intravascular diseminada. Los compuestos y metodos de conformidad con la presente invencion tienen una accion inhibidora sobre la trombina unida a coagulos y factor Xa y son tambien inhibidores contra activadores de plasminogeno y plasmina.
Description
i
PÉPTIDOS ARGINALES Y MÉTODOS PARA EL TRATAMIENTO DE LA
COAGULACIÓN INTRAVASCULAR DISEMINADA ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a la coagulación intravascular diseminada. Más particularmente, la invención se refiere a una intervención médica para tratar la coagulación intravascular diseminada. COMPENDIO DE LA TÉCNICA RELACIONADA La coagulación intravascular diseminada (DIC) es una enfermedad secundaria y puede ser la consecuencia de un gran número de enfermedades primarias (Véase Bick, Disseminated Intravascular Coagulation and Related Síndromes [Coagulación Intravascular Diseminada y Síndromes Relacionados] , CRC Press, Boca Ratón, (1983))· Entre sus características se encuentra la activación sistemática de la coagulación sanguínea que resulta en la generación y depósito de fibrina, provocando trombos microvasculares en varios órganos y contribuyendo al desarrollo de falla de múltiples órganos . Bick y colaboradores, Clin. Appl. Trombosis Hemostasis 1_: 3-23 (1995) enseñan que una característica adicional de DIC es la plasmina en circulación sistémica, y una enzima proteolítica global que puede biodegradar varias proteínas de plasma (factores, hormonas, etc.), y puede disociar fibrinógeno/fibrina para producir productos de degradación de fibrinógeno/fibrina. Estos productos afectan de manera negativa la hemostasis y provocan hemorragias . La forma clínica más seria de DIC se caracteriza por un consumo extenso de proteínas de coagulación, depósitos significativos de fibrina, y sangrado. Pacientes con trauma se encuentran en riesgo incrementado de DIC, especialmente cuando existen amplias áreas de daño tisular (especialmente el cerebro) , sepsis y falla de órganos múltiples . El trauma en la cabeza es una causa particularmente de DIC en infantes y niños debido al alto contenido de tromboplastina del cerebro y la proporción relativamente incrementada de área superficial de la cabeza en comparación con el área superficial completa del cuerpo. La sepsis puede ocurrir en aproximadamente el 40% de todos los pacientes con trauma y es una causa primaria importante de DIC en todos los pacientes. La condición clínica es empeorada por fibrinólisis secundaria, que resulta en la formación de FDP' s (productos de degradación de fibrinógeno/fibrina) o bien "D-dímeros" que interfieren con la formación normal de fibrina y función plaquetaria. El depósito de fibrina en DIC puede provocar disfunción adicional de órganos. DIC es una causa mayor de insuficiencia renal aguda y contribuye también a falla de múltiples órganos sistémicos. Al contrario, es también cierto con órganos dañados contribuyendo a DIC.
Hoy en día, el único tratamiento aceptado para DIC se limita a intentar mitigar el padecimiento primario. Sin control, la DIC prosigue a pesar de formas de terapia dirigidas a corregir el sangrado o el problema trombótico. En algunos casos en los cuales existe un sangrado significativo, la terapia de reemplazo con plasma congelado fresco, componentes plasmáticos (por ejemplo, anti-trombina III), crioprecipitado y/o concentrados de plaquetas pueden ser de utilidad hasta el control del problema primario, pero esas terapias son excesivamente costosas. El uso de heparina en DIC es altamente controversial y no se utiliza generalmente en pacientes con un problema subyacente de trauma. Por consiguiente, existe la necesidad de nuevos y mejores compuestos y métodos para el tratamiento de DIC [Véase también, por ejemplo, Jonge y colaboradores, Drugs 55: 767-777 (1998) y Levi y colaboradores, Trombosis and Haemostasis [Trombosis y Hemostasis] 82: 695 (1999)]. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La invención ofrece nuevos y mejores compuestos y método para el tratamiento de la DIC. Se ha encontrado de manera sorprendente que los compuestos anticoagulantes que tienen una acción inhibidora sobre la trombina libre y la trombina unida en coágulos y factor Xa y también una acción inhibidora contra activadores de plasmina y plasminógeno pueden ser útiles para el tratamiento de la DIC.
En un primer aspecto, la invención ofrece una composición de materia que comprende un peptidil arginal de la fórmula (I) Xaa-Xbb-Arg-H (I) en donde Xaa representa un residuo de ácido carbónico sustituido en posición alfa de la fórmula (II) Q-CH(R)-CO (II) en donde Q representa un grupo alquiloxicarbonilamino de 1 a 3 átomos de carbono, un grupo metilamino, o un grupo hidroxilo, y R representa un grupo cicloalquilmetilo de 7 a 9 átomos de carbono, o un grupo cicloalquilo de 5 a 7 átomos de carbono o un grupo 1-adamantilmetilo, y Xbb representa un residuo de L-prolina o ácido L-acetidin-2-carboxilico, y las sales de adición de ácido del mismo formadas con ácido orgánico o ácido inorgánico -En modalidades particularmente preferidas tales compuestos pueden tener las estructuras siguientes: 1 (etoxicarbonil-D-cicloheptilalanil-L-prolil-L-arginina aldehido, Eoc-D-cHpa-Pro-Arg-H) , o bien 2 (N-metil-D-cicloheptilalanil-L-prolil-L-arginina aldehido, N-Me-D-cHpa-Pro-Arg-H) , o bien 3 (D~ cicloheptillactil-L-propil-L-arginina aldehido, D-cHpl-Pro-Arg-H) , o bien 4 (N-metil-D-ciclohexilglicil-L-acetidin-2-carbonil-L-arginina aldehido, N-Me-D-Chg-Aze-Arg-H) , que corresponden a la fórmula (I) en donde Xaa representa un residuo de ácido alquilcarbónico sustituido en posición alfa de la fórmula (II) en donde R representa un grupo cicloheptilmetilo y ciclohexilo, respectivamente, representa un grupo etoxicarbonilamino, metilamino, hidroxilo, respectivamente, y Xbb representa un residuo de L prolina y ácido L-acetidinil-2-carboxilico, respectivamente.
En un segundo aspecto, la invención ofrece una composición farmacéutica que comprende un peptidil arginal anticoagulante o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de conformidad con el primer aspecto de la invención y un vehículo fa macéuticame te aceptable, excipiente o diluyente. En un tercer aspecto, la invención ofrece un método para el tratamiento de la coagulación intramuscular diseminada, el método comprende la administración a un paciente que tiene coagulación intramuscular diseminada de un anticoagulante peptidil arginal que corresponde a la fórmula (I) Xaa-Xbb-Arg-H (I) en donde Xaa representa un residuo de ácido carbónico sustituido en posición alfa de la fórmula (II) Q-CH(R)-CO (II) en donde Q representa un grupo alquiloxicarbonilamino de 1 a 3 átomos de carbono, un grupo metilamino, o un grupo hidroxilo, y R representa un grupo cicloalquilmetilo de 7 a 9 átomos de carbono, o un grupo de 1-adamantilmetilo o un grupo cicloalquilo de 5 a 7 átomos de carbono, y Xbb representa un residuo de L-prolina o de ácido acetidin-2-carboxílico, o una sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable del mismo. En modalidades particularmente preferidas, tales compuestos pueden tener las estructuras siguientes 1 (etoxicarbonil-D-cicloheptilalanil-L-prolil-L-arginina aldehido, Eoc-D-cHpa-Pro-Arg-H) , o bien 2 (N-metil-D-cicloheptilalanil-L-prolil-L-arginina aldehido, N-Me-D-cHpa-Pro-Arg-H) , o bien 3 (D-cicloheptillactil-L-propil-L-arginina aldehido, D-cHpl-Pro-Arg-H) , o bien 4 (N-metil-D-ciclohexilglicil-L-acetidin-2-carbonil-L-arginina aldehido, N-Me-D-Chg-Aze-Arg-H) , que corresponden a la fórmula (I) en donde Xaa representa un residuo de ácido alquilcarbónico sustituido en posición alfa de la fórmula (II) en donde R representa un grupo cicloheptilmetilo y un grupo ciclohexilo, respectivamente, Q representa un grupo etoxicarbonilamino, metilamino, y un grupo hidroxilo, respectivamente, y Xbb representa un residuo de L prolina y residuo de ácido L-acetidinil-2-carboxilico, respectivamente .
O 4
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS La invención se refiere a la coagulación intravascular diseminada. Más particularmente, la invención se refiere a intervención médica para la coagulación intramuscular diseminada. La invención ofrece nuevos y mejores compuestos y método para el tratamiento de la DIC. Los compuestos de conformidad con la invención tienen una acción inhibidora tanto sobre la trombina libre como unida en coágulos y factor Xa, asi como sobre activadores de plasmina y plasminógeno . Las patentes y publicaciones citadas aquí reflejan el conocimiento de la técnica y se incorporan por referencia en su totalidad. Cualquier inconsistencia entre estas patentes y publicaciones y la presente divulgación debe resolverse a favor de la presente divulgación. En un primer aspecto, la invención ofrece una composición de materia que comprende un peptidil arginal que tiene la fórmula (I) Xaa-Xbb-Arg-H (I) en donde Xaa representa un residuo de ácido carbónico sustituido en posición alfa de la fórmula (II) Q-CH(R)-CO (II) en donde Q representa un grupo alguiloxicarbonilamino de 1 a 3 átomos de carbono, un grupo metilamino, o un grupo hidroxilo, y R representa un grupo cicloalquilmetilo de 7 a 9 átomos de carbono, o un grupo de 1-adamantilmetilo o un grupo cicloalquilo de 5 a 7 átomos de carbono, y Xbb representa un residuo de L-prolina o residuo de ácido L-acetidinil-2-carboxílico, y las sales de adición de ácido del mismo formados con ácido orgánico o inorgánico. Una modalidad particularmente preferida de conformidad con este aspecto de la invención corresponde a la estructura 1 (etoxicarbonil-D-cicloheptilalanil-L-arginina-aldehido, Eoc-D-cHpa-Pro-Arg-H) :
Otra modalidad particularmente preferida de conformidad con este aspecto de la invención, corresponde a la estructura 2 (N-metil-D-cicloheptilalanil-L-propil-L-arginina aldehido, N-Me-D-cHpa-Pro-Arg-H) :
Otra modalidad particularmente preferida de conformidad con este aspecto de la invención corresponde a la estructura 3 (D-cicloheptillactil-L-prolil-L-arginina aldehido, D-Hpl, Pro-Arg-H) : Una modalidad adicional particularmente preferida de conformidad con este aspecto de la invención, corresponde a la estructura 4 (N-metil-D-ciclohexilglicil-L-azetidina-2-carbonil-L-arginina aldehido, N-Me-D-Chg-Aze-Arg-H) :
4
Los compuestos de conformidad con las fórmulas 1, 2, 3 y 4 se prepara por ejemplo, mediante la condensación del componente de ácido de los residuos N u O-protegido con una L-arginina lactama, protegida en el grupo guanidino con un grupo benciloxicarbonilo y reduciendo la lactama de tripéptidos obtenida en el aldehido tripéptido protegido, removiendo el grupo de protección del grupo guanidino de arginina y el caso en el cual Q = metilamino o hidroxilo en la fórmula (II) también del grupo terminal metilamino o hidroxilo, y aislando el derivado de péptido de la fórmula (I) como su sal de adición formada con un ácido orgánico o inorgánico. Los compuestos representados por la fórmula (I) se preparan y se utilizan en forma de sales de adición de ácido debido a la mayor estabilidad de las formas de sal. En las sales de adición de ácido del compuesto de la fórmula (I) la actividad se encuentra en la base y el ácido es de menor importancia aún cuando para propósitos terapéuticos es preferible utilizar sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables. Ejemplos de tales ácidos adecuados incluyen (a) ácidos minerales: ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico, ácido metafosfórico y ácido sulfúrico, (b) ácidos orgánicos: ácido tartárico, ácido acético, ácido cítrico, ácido málico, ácido láctico, ácido fumárico, ácido benzoico, ácido glicólico, ácido glucónico, ácido succínico, ácido pamoíco y ácido aril-sulfónico, por ejemplo ácido p-toluensulfónico. Una sal de adición de ácido preferida es el sulfato, especialmente sal de hemisulfato. Las sales de adición de ácido se preparan de manera convencional por ejemplo, mediante neutralización de la forma de base libre del compuesto de la fórmula (I) con el ácido. El componente de ácido de dos residuos puede mostrarse como D-Xaa, en donde Xaa representa un residuo de ácido carboxílico sustituido en posición alfa de la fórmula Q-CH(R)-CO, en donde Q significa un grupo alcoxicarbonilamino de 1 a 3 átomos de carbono, R representa lo definido arriba, y Xbb representa un residuo de L-prolina o ácido L-acetidin-2-carboxilico. Cuando Xaa, ácido alquilico sustituido en posición alfa es un alfa-metilamino o alfa-hidroxi ácido, es decir, Q representa un grupo metilamino o un grupo hidroxilo, el componente de ácido de dos residuos puede mostrarse como P-D-Xaa-Xbb en donde P representa un grupo de protección N por ejemplo benciloxicarbonilo (Z) o bien un grupo terc-butoxicarbonilo (Boc) o un grupo de protección 0, de preferencia un grupo tetrahidropiranilo (THP) . El dipéptido de acilo utilizado como material inicial para los compuestos que contienen residuo de alfa-amino o alfa-metilamino ácido se preparan mediante la acilación del alfa-aminoácido con el éster de ácido cloroformico correspondiente para proporcionar alcoxicarbonilaminoácido y benciloxicarbonilaminoácido de 1 a 3 átomos de carbono, que son después acoplados a L-prolina o ácido L-acetidin-2-carboxilico para proporcionar D-Xaa-Xbb y Z-aminoacilo Xbb que es N-metilado para proporcionar el P-D-Xaa-Xbb requerido. D-Xaa, requerido para el acoplamiento con Xbb, puede prepararse de manera provechosa por acetilación del compuesto de DL-Xaa racémico, convirtiendo el DL-acetilaminoácido en su éster metílico y resolviendo enzimáticamente el éster racémico acetil-DL-Xaa-OMe. El acetil-D-Xaa-OMe obtenido de esta forma es entonces saponificado y desacetilado y después convertido en D-aminoácido N-protegido requerido. El D-alfa-hidroxi ácido requerido puede ser obtenido de manera provechosa a partir del D-alfa-aminoácido correspondiente. Es entonces convertido en su forma 0-protegida y acoplado a Xbb para proporcionar el P-D-Xaa-Xbb requerido. En un segundo aspecto, la invención ofrece una composición farmacéutica que comprende un peptxdil arginal de conformidad con el primer aspecto de la invención y un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. Las formulaciones farmacéuticas comprenden una cantidad efectiva de un compuesto de la fórmula general (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y vehículos, materiales de relleno, diluyentes y/u otros excipientes farmacéuticos farmacéuticamente aceptables conocidos. Los vehículos, diluyentes o materiales de relleno antes mencionados pueden ser agua, alcoholes, gelatina, lactosa, sacarosa, almidón, peptina, estearato de magnesio, ácido esteárico, talco, varios aceites de origen animal o vegetal, además glicoles, por ejemplo, propilenglicol o polietilenglicol . Los excipientes farmacéuticos pueden ser conservadores, varios emulsificantes naturales o sintéticos, agentes de dispersión o humectantes, materiales colorantes, agentes saborizantes, amortiguadores, materiales que promueven la desintegración y otros materiales que mejoran la biodisponibilidad del ingrediente activo. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden prepararse en formulaciones habituales tales como composiciones orales (administradas por la boca tales como tabletas, cápsulas, polvos, pildoras, grageas, o granulados) asi como composiciones parenterales (fármacos administrados evitando el sistema gastrointestinal como por ejemplo inyecciones, infusiones, supositorios, emplastos e ungüentos) . En un tercer aspecto, la invención ofrece un método para el tratamiento de un paciente que tiene coagulación intravascular diseminada, el método comprende la administración a un paciente que tiene coagulación intravascular diseminada de un peptidil arginal que corresponde a la fórmula Xaa-Xbb-Arg-H (I) , en donde Xaa y Xbb son de conformidad con lo definido arriba, o bien una sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable del mismo. Los peptidil arginales se conocen también como derivados de peptidil arginina aldehido. De conformidad con este aspecto de la invención, la invención ofrece un método para el tratamiento de la coagulación intravascular diseminada, el método comprende la administración a un paciente animal, incluyendo un paciente humano, de peptidil arginales de conformidad con la presente invención. En el método de conformidad con este aspecto de la invención, una cantidad terapéuticamente efectiva de un peptidil arginal de conformidad con la presente invención es administrada durante un periodo de tiempo terapéuticamente efectivo a un animal, incluyendo un ser humano, que tiene una coagulación intravascular diseminada en su cuerpo. De preferencia, dicha administración es preferentemente intravenosa o subcutánea, muy especialmente intravenosa- La administración de las composiciones terapéuticas puede efectuarse empleando procedimientos conocidos en dosificaciones y durante periodos de tiempo eficaces para reducir los síntomas o marcadores de DIC. Cuando se administra sistémicamente, la composición terapéuticas se administra de preferencia de una dosificación suficiente para lograr un nivel sanguíneo de peptidil arginales de aproximadamente 6 µ? a aproximadamente 100 µ?. De preferencia, una dosificación total estará dentro de un rango de aproximadamente 0.1 mg a aproximadamente 50 mg de peptidil arginal por kg de peso corporal por día. Puede ser deseable administrar simultánea o secuencialmente una cantidad terapéuticamente efectiva de una o varias de las composiciones terapéuticas de la invención a un individuo en un solo episodio de tratamiento. Los ejemplos siguientes se contemplan para ilustrar adicionalmente algunas modalidades particularmente preferidas de la invención y no se contemplan para limitar el alcance de la invención. Excepto cuando se indique lo contrario, para los experimentos siguientes, trombina humana (3,000 NIH U/mg) , albúmina humana y fibrinogeno humano se obtuvieron de Sigma Aldrich ft (Budapest, Hungría) y factor Xa humana (8 µg/U) de Enzyme Research Laboratories (Swansea, Reino Unido) . El reactivo APTT fue obtenido de REANAL (Budapest, Hungría) y el reactivo PT, Simplastin D, fue comprado de ORGANON, TEKNI A (Eppelheim, Alemania) . Las abreviaturas de los aminoácidos, péptidos, sustituyentes y reactivos se emplean de conformidad con las convenciones UIPAC-IUB. Las abreviaturas que aparecen en esta solicitud son las siguientes: Arg = L-arginina, Boc = terc-butoxi-carbonilo, Bzl = bencilo; Chg = L-ciclohexilglicina, DCHA = diciclohexilamina, DHP = dihidropirano, Eoc = etoxicarbonilo, Gly = glicina, Me = metilo, MePhe = N-metil-L-fenilalanina, Moc = metoxicarbonilo, Pro = L-prolina, pNA = p-nitroanilino, TFA = ácido trifluoroacético, THP = tetrahidropira ilo, Tos = p-toluensulfonilo, Z = benciloxicarbonilo, RT = temperatura ambiente. Las abreviaturas de ácidos no usuales utilizados en esta solicitud son Ada = adamantil-L-alanina, Aze = ácido L-acetidin-2-carboxílico, N-Me-D-cHpa = N-metil-D-cicloheptilalanina, D-cHpa = D-cicloheptilalanina o bien ácido (R) -2-amino-3-cicloheptilpropiónico, D-Hla = ácido D-ciclo-heptilláctico o bien ácido (R) -2-hidroxi-3-cicloheptilpropiónico . Los valores R£ registrados en los ejemplos fueron determinados por cromatografía en capa delgada empleando gel de sílice como adsorbente (DG-Alufolien ieselgel 6OF254 Merck, Darmstadt) , en los sistemas de revelado siguientes. Los números de los sistemas utilizados se proporcionan entre paréntesis después de la abreviatura Rf. 1. Acetato de etilo 2. Acetato de etilo - n-hexano (1 : 4) 3. Acetato de etilo - n-hexano (1:1) 4. Acetato de etilo - ciclohexano (15:85) 5. Cloroformo - acetona (95:5) 6. Acetato de etilo - piridina - ácido acético - agua (960:20:6:11) 7. Acetato de etilo - piridina - ácido acético - agua (480:20:6:11) 8. Acetato de etilo - piridina - ácido acético - agua (240:20:6:11) 9. Acetato de etilo - piridina - ácido acético - agua (120:20: 6:11) 10.Acetato de etilo - piridina - ácido acético - agua (90:20: 6:11) 11.Acetato de etilo - piridina - ácido acético - agua 60:20:6:11) 12. cetato de etilo - piridina - ácido acético - agua (45:20:6:11) 13.Acetato de etilo - piridina - ácido acético - agua (30:20: 6:11) Los factores de capacidad (k") especificados en los ejemplos fueron determinados con el aparato "Pharmacia LKB Analytical HPLC System Two" de conformidad con lo siguiente: Columna: LiChropher RP-18:12 um 240x4 mm Temperatura de la columna: ambiente Eluyentes: Solvente A, TFA 0.15%/agua, Solvente B, TFA 0.1%/acetonitrilo Perfil de gradiente: 0— L5 min, 30—>-60% B, después isocrático B 60%. Régimen de flujo de solvente: 1 mi/min. Detector: Monitor de UV LKB 2141; longitud de onda: 214 nm. Inyector: Rheodyne 7125. Bucle de muestra: 100 µ?. Bombas: Tipo 2 LKB 2148. Sistema de control: LKB HPLC Manager. Concentración de muestra: 1 mg/ml en solvente A, volumen inyectado 25 L. Tiempo de análisis: 40 minutos. Los acil-arginina aldehidos están presentes en estructuras en equilibrio, es decir, en aldehido, hidrato de aldehido, y dos formas de aminociclol. Durante el análisis HPLC, el hidrato de aldehido y una o ambas formas de aminociclol aparecen como dos o tres picos separados. Los acilarginina aldehidos descritos en los ejemplos son especificados por dos o tres valores cada k' . Espectrometría de masa: Las mediciones de ionización positiva FAB fueron efectuadas en los aparatos Finnigan MAT 8430. Las muestras fueron disueltas en una matriz de alcohol m-nitrobencílico (NBA) e introducida directamente en la fuente de iones. En el espectro de peptidil-arginina aldehidos, un ion molecular adicional fue detectable, el ion del compuesto de adición formado con NBA: [M+H]+ y [M+H+NBA] +. En los ejemplos, los datos de espectro FAB fueron especificados de manera correspondiente. Las mediciones de ionización positiva ESI fueron efectuadas en un aparato VG Quattro (Fisons) . Las muestras fueron disueltas en una mezcla de acetonitrilo-agua (1:1) que contenía 1% (v/v) de ácido fórmico y fueron introducidas con un bucle de muestra de 10 mi en la fuente de iones a un régimen de flujo de 15-25 ml/min. Ejemplo 1 Síntesis de hemisulfato de etoxicarbonil-D-cicloheptilalanil-L-arginina aldehido Paso 1: Etoxicarbonil-D-ciclohepotilalanil-L-propil-NG-benziloxicarbonil-L-arginina lactama 7.85 g (20.1 mM) de teirc-butiloxicarbonil-NG-benciloxicarbonil-L-arginina lactama [Bajusz y colaboradores, J. Med. Chem. 33,1729 (1990] fue suspendida en 20 mi de cloroformo, después se agregó 20 mi de acetato de etilo saturado con gas HCl (0.11-0.15 g/ml) con agitación y enfriamiento con hielo. La disociación del grupo Boc fue monitoreada por cromatografía en capa delgada [Rf (11) = 0.5 (compuesto libre); 1.0 (compuesto Boc)]. Al final de la reacción, la suspensión fue diluida con 40 mi de éter dietílico, la masa de cristal formada fue filtrada, lavada con 10 mi de acetona y 10 mi de éter dietílico, y secada bajo presión reducida en KOH. El hidrocloruro de Nü-benciloxicarbonil-L-arginina lactama fue disuelto en 20 mi de dimetilformamida, enfriado a una temperatura de -20° C y se agregó al anhídrido mixto siguiente. 7.12 g (20.1 mM) de etoxicarbonil-D-cicloheptilalanil-L-prolina (Ejemplo 1, paso J) fue disuelto en 20 mi de dimetilformamida, enfriados a -15° C, y después con agitación, se agregaron 2.23 mi (20.1 mM) de N-metil-morfolina y 2.65 mi (20.1 mM) de cloroformato de isobutilo. Después de 10 minutos de agitación, la solución de dimetilformamida arriba de N^-benciloxicarbonil-L-arginina lactama fue agregada después trietilamina en una cantidad para ajusfar el pH de la mezcla de la reacción a 8 (se requería aproximadamente 2.8 mi). La mezcla de la reacción fue agitada a -10° C durante 30 minutos, después a 0o C durante 1 hora. Después, las sales fueron removidas por filtración y el filtrado fue diluido con 100 mi de acetato de etilo. La solución resultante fue lavada con 3 x 25 mi de agua, 10 mi de KHS04 1 M y 3 x 10 mi de agua, secada en Na2S04 anhidro, y evaporada a 2.0-2.5 kPa. El producto obtenido fue sometido a cromatografía en columna en gel de sílice utilizando 200 g de Kieselgel 60 (0.040-0.063 mm) como adsorbente y acetato de etilo como eluyente. Las fracciones que contenían solamente el producto puro [Rf (1) = 0.60] fueron combinadas y evaporadas a 2.0-2.5 kPa. El residuo de evaporación fue cristalizado a partir de éter diisopropílico . Rendimiento 10.84 g (86.1%), Rf (1) = 0.55-0.65. El espectro de masa FAB (627 [M+H]+) confirmó la estructura estimada . Paso 2: Etoxicarbonil-D-cicloheptilalanil-L-NG-benziloxicarbonil-L-arginina aldehido 8.02 g (12.8 mM) de etoxicarbonil-D-cicloheptilalanil-L-prolil-NG-benziloxicarbonil-L-arginina lactama (Ejemplo 1, Paso 1) fue disuelta en 15 mi de tetrahidrofurano, y después con agitación y a una temperatura no mayor de -50° C, s agrego una solución de 3.6 mM de LiAlH disuelta en tetrahidrofurano. El progreso de la reducción fue monitoreado por cromatografía en capa delgada (solvente 7) como solvente de revelado y, en caso requerido, una porción adicional de LiAlH4 fue agregada. A esta mezcla de la reacción se agregó KHSO4 0.5 M gota a gota con agitación constante y enfriamiento hasta alcanzar pH 3, después 35 mi de agua. La solución resultante fue extraída con 2 x 15 mi de hexano, después con 3 x 20 de diclorometano . Los extractos de diclorometano fueron combinados, lavados con 3 x 15 mi de agua, 15 mi de una solución de hidrogencarbonato de sodio al 5% fría y otra vez con 15 mi de agua, secados en Na2SO<! anhidro, y evaporados a 2.0-2.5 kPa. El residuo de evaporación fue tratado con éter diisopropilico, filtrado y secado bajo presión reducida. Rendimiento 7.08 g (88%), Rf (8) = 0.40-0.50. El espectro de masa EñB (629 [M+H]+, 782 [M+H+NBA] +) confirmó la estructura estimada. Paso 3: Hemisulfato de etoxicarbonil-D-cicloheptilalanil-L-prolil-arginina aldehido Se disolvieron 6.91 (11.0 mM) de etoxicarbonil-D-cicloheptilalanil-L-proplil-NG-benziloxicarbonil-L-arginina aldehido (Ejemplo 1, Paso 2) en 85 mi de etanol y 11.25 mi de ácido sulfúrico 0.5 M, después se agregó 0.7 g de catalizador Pd-C suspendido en 14 mi de agua y la mezcla fue hidrogenada a una temperatura de aproximadamente 10° C. El progreso de la reacción fue monitoreada por cromatografía en capa delgada. Después de terminar la reacción (aproximadamente 15 minutos), el catalizador fue filtrado y el filtrado fue concentrado a aproximadamente 7-9 mi a 2.0-2.5 kPa. El residuo fue diluido con 80 mi de agua, extraído con 4 x 15 mi de diclorometano y la solución acuosa fue de ada para que repose a una temperatura de 20-22° C durante 24 horas. La solución fue extraída con 3 x 15 mi de diclorometano otra vez y el pH fue ajustado a 3.5 con resina de intercambio de iones Dowex AG 1-X8 (HO) , después la solución fue liofilizada. Rendimiento: 4.90 g (82%). Rf (11) = 0.35-0.45 [a]D2ü = -77.6° (c = 1.018; agua) . HPLC: k' = 1.695 y 2.328. El espectro de masa FAB (495 [M+H]+, 648 [M+H+NBA] +) confirmó la estructura estimada. Síntesis de los materiales iniciales: Etoxicarbonil-D-ciclo eptilalanil-L-prolina Paso A: l-cicloh.eptilacetil-2, 5-dimetilpirazol Se disolvieron 58.6 g (375 mM) de ácido cicloheptilacético [Protiva y colaboradores, Collect. Czech, C em., Commun., 55:1278-1289 (1990)] en 375 mi de tetrahidrofurano, se enfrío a -15° C, y después con agitación se agregaron 41.3 mi (375 mM) de N-metilmorfolina, 49.50 mi (375 mM) de cloroformato de isobutilo y, después de 10 minutos de agitación a -10° C, una solución de 37.85 g (393.75 mM) de 3, 5-dimetilpirazol en 300 mi de tetrahidrofurano a una temperatura de -10° C. La agitación prosiguió a una temperatura de -10° C durante 30 minutos, a 0o C durante 1 hora, y a temperatura ambiente durante 3 horas . Después las sales fueron removidas por filtración, el filtrado fue evaporado bajo presión reducida, y el residuo fue disuelto en 900 mi de acetato de etilo. La solución resultante fue lavada sucesivamente con 3 x 80 mi de NaOH 1M, 89 mi de agua, 3 x 80 mi de HC1 1M y con agua hasta neutralización. (los lavados básicos fueron combinados y acidificados para regenerar ~5.8 g, 37.1 mM, de ácido cicloheptilacético) . La solución de acetato de etilo fue secada en Na2S04 anhidro, después evaporada a 2.0-2.5 kPa. El producto aceitoso resultante fue tratado con 1-cicloheptilacetil-2, 5-dimetilpirazol 340 mM, y utilizado para el paso sin purificación adicional. Rf (2) = 0.8-0.9 (ácido: 0.3-0.4) . Paso B: 1-cicloheptilacetaldehído A 350 mi de tetrahidrofurano enfriado a -30° C, se agregaron 12.83 g (338 mM) de LiAlH4. Después se introdujo gota a gota una solución del producto aceitoso (Ejemplo 1, Paso A) en 250 mi de tetrahidrofurano frió bajo agitación a -25° C. La reacción fue seguida por TLC. En caso requerido, se agregó 30-40 mi de una solución de LiAlH en tetrahidrofurano (3 g/100 mi) . Después de terminar la reducción, la mezcla ría fue acidificada con HC1 6 M, y diluida con acetato de etilo (500 mi) . La fase acuosa fue extraída con acetato de etilo, la soluciones orgánicas fueron combinadas, lavadas con agua hasta neutralidad, secadas en Na2SC>4 anhidro y después evaporadas a 2.0-2.5 kPa. El producto aceitoso resultante fue 1-cicloheptilacetaldehído crudo contaminado con 2,5-dimetilpirazol (DMP) . Rf (2) = 0.7-0.8 (DMP: 0.25-0.35). Al producto aceitoso resultante (62.6 g) disuelto en 350 mi de metanol, se agregó con agitación una solución de 36.4 g de NaHS03 en 70 mi de agua. La mezcla de la reacción fue mantenida en refrigerador durante la noche. El material precipitado fue removido por filtración, lavado con una mezcla fría de 35 mi de metanol y 7 mi de agua, después con éter dietilico, y secado. El material sólido es el aducto de bisulfito de sodio (73.87 g, 302.38 mM) , Rf (14) = 0.55-0.65), que fue agregado a una mezcla en 450 mi de cloruro de etileno y 450 mi de agua que contenia 47.7 g (450 mM) de Na2C03. La mezcla de la reacción fue agitada durante la noche. Las dos fases fueron separadas, la fase orgánica fue lavada con cloruro de metileno (2 x 100 mi) . Las capas orgánicas combinadas fueron lavadas con agua, secadas en Na2S04, evaporadas a 2.0-2.5 kPa. El producto aceitoso resultante (36.97 g, 263.64 mM) fue 1-cicloheptil-acetaldehido puro que fue utilizado directamente para la reacción siguiente- Rf(2) = 0.7-0.8. Paso C: 5-cicloheptilmetilhidantoina A una solución de aldehido (Ejemplo 1, Paso B) en etanol acuoso al 50% (857 mi; 3.25 ml/mM) , se agregaron con agitación a una temperatura de 50-55° C 15.5 g (290 mM; 1.1 equiv.) de cloruro de amonio, 27.87 g (659 mM, 2.5 equiv. ) de carbonato de amonio, y 18.9 g (290 mM; 1:1 equiv) de cianuro de potasio, y la agitación prosiguió durante 48 horas a una temperatura de 50° C. El material precipitado fue removido por filtración, lavado con etanol al 50% (100 mi) , y secado en una secadora al vacio. Como primer producto obtenido, se obtuvieron 42.26 g (206.97 mM) de material. El etanol de licor madre fue removido por destilación, el residuo fue extraído con acetato de etilo (1 x 250 mi y 2 x 100 mi), las soluciones orgánicas fueron combinadas, lavadas con agua (3 x 50 mi), secadas en Na2SC>4 anhidro, y después evaporadas a 2.0-2.5 kPa. El residuo fue triturado con éter diisopropílico, filtrado y secado. Como segundo producto, se obtuvieron 3.6 g (17.12 mM) de material; rendimiento total 45.86 g (218 mM, 82.5%) de 5-cicloheptilmetilhidantoina se obtuvieron. Punto de fusión: 240.9° C. Rf (6) = 0.73-0.78. Análisis para ?a?18?202 (210.28). Calculado para: C% = 62.83; H% = 8.63; N% = 13.32. Encontrado: C% = 63.09%; H% = 8.67; N = 13.25. Paso D: Hidrocloruro de DL-cicloheptilalanina Se disolvieron 87 g (1.55 M) de KOH en 435 mi de n-butanol con agitación y calentamiento, y 45.71 g (217.4 mM) de 5-cicloheptilmetilhidantoina (Ejemplo 1, Paso C) se agregó. La solución obtenida de esta manera fue sometida a reflujo durante 72 horas, después diluida con agua y evaporada bajo presión reducida. El residuo fue disuelto en 220 mi de agua, acidificada a pH 2 con ce HC1 (-130 mi) , y mantenido en refrigerador durante la noche. El material precipitado fue removido por filtración, lavado con 50 mi de agua, y secado en secadora al vacio. El producto obtenido de esta manera (106.5 g) fue tomado como 217 mM de DL-cicloheptilalanina, y utilizado para reacciones adicionales. Rf (11) = 0.2-0.3. Paso E: Hidrocloruro de éster metílico de DL-cicloheptilalanina Se introdujeron gota a gota 23.65 mi (325.25 mM) de SOC12 en 217 mi de metanol a una temperatura comprendida entre 0o C y -5o C con agitación. Después, se agregó DL-cicloheptilalanina (217 mM del Ejemplo 1, Paso D) y se agitó durante 24 horas. La conversión fue seguida por TLC Rf (11) = 0.75-0.85 (éster), (0.3-0.4 (ácido) . Cuando se pudo detectar aminoácidos sin reaccionar, la mezcla de la reacción fue enfriada a -5° C, se introdujeron gota a gota 11.8 mi de S0C12, y la mezcla de la reacción fue agitada durante 24 horas adicionales. Después, las sales no disueltas fueron removidas por filtración, lavadas con metanol (2 x 50 mi) , y las soluciones de metanol combinadas fueron evaporadas . El residuo fue redisuelto en metanol y evaporado otra vez . Finalmente, el residuo fue triturado con éter diisopropílico, removido por filtración, lavado con éter diisopropílico y secado en secadora al vacío en KOH y P2O5. Se obtuvieron 33.68 g (142.85 mM) de hidrocloruro de éster metílico de DL-cicloheptilalanina. Rf (11) = 0.5-0.6, punto de fusión 95.4-96.5° C. Paso F: Éster metílico de acetil-DL-cicloheptilalanina A una solución de 33.68 g (142.85 mM) de hidrocloruro de éster metílico de DL-cicloheptilalanina (Ejemplo 1, Paso E) en 140 mi de piridina, se agregó anhídrido acético (16.2 mi, 171.43 mM) gota a gota durante 1 hora bajo agitación y enfriamiento en un baño de hielo-agua. La mezcla de la reacción fue agitada durante 24 horas a temperatura ambiente y después evaporada bajo presión reducida. El residuo fue disuelto en 300 mi de acetato de etilo, lavada con HS04 1M (3 x 50 mi) y agua (3 x 50 mi), secada en Na2S04 anhidro, y después evaporada a 2.0-2.5 kPa. El producto aceitoso resultante fue triturado con éter diisopropílico para obtener un material sólido que fue removido por filtración, lavado con éter diisopropílico y después agua, y secado en una secadora. Se obtuvieron 24.36 g (100.94 mM, 70.4%) de acetil-DL-cicloheptilalaninato de metilo (acetil-DL-éster) . Rf(l) = .55-0.65. Punto de fusión 69-71° C. 7Análisis para C13H23 O3 (241.332). Calculado para C% = 64.70; H%, 9.61; N% = 5.80. Encontrado: C% = 64.75; H% = 9.76%, N% = 5.85. Paso G: Éster metílico de acetil-D-cicloheptilalanina (resolución enzimática de éster metílico de acetil-DL-cicloheptilalanina) A una solución de 8.69 g (36 mM) de éter metílico de acetil-DL-cicloheptilalanina, acetil-DL-éster, (Ejemplo 1, Paso F) en 36 mi de tolueno, se agregaron 72 mi de agua y 36 mg de Subtilisin Carlsberg (Proteasa Tipo VIII, Sigma) . La hidrólisis enzimática del L-enantiómero, acetil-L-éster, se llevó a cabo a un pH de 7.0, el cual fue mantenido a través de un auto-triturador, llenado con NaOH 3M. Cuando se detuvo el consumo de NaOH (a 5.8 mi, 17.4 mM) , la mezcla de la reacción fue diluida con 36 mi de tolueno y las dos capas fueron separadas. La fase acuosa fue lavada con 2 x 30 mi de tolueno. Las soluciones de tolueno combinadas contenían el acetil-D-éster y las soluciones acuosas combinadas contenían la sal sódica del acetil-L-ácido. Después de secar en a2SÜ anhidro, las soluciones de tolueno combinadas fueron evaporadas bajo presión reducida para proporcionar 3.8 g {15.75 mM) de acetil-D-ésterr Rf (1) -0.55-0.65, que fue utilizada directamente en el paso siguiente. Las soluciones acuosas combinadas fueron acidificadas y extraídas con 3 x 30 mi de acetato de etilo. Las soluciones combinadas de acetato de etilo fueron lavadas con agua, secadas en a2S04 anhidro, y evaporadas bajo presión reducida para proporcionar 4.0 g (17.6 mM) de acetil-L-ácido, Rf (7) = 0.38-0.42. Una preparación similar empezando a partir de 9.65 g (40 mM) de acetil~DL-éster (Ejemplo 1, Paso F) proporcionó 4.6 g (19.06 mM) de acetil-D-éster y 4.44 g (19.55 mM) de acetil-i-ácido.
Paso H: Hidrocloruro de D-cicloheptilalanina 7.24 g (30 niM) de acetil-D-éster (Ejemplo 1, Paso G) fueron suspendidos en 120 mi de HCl 6M y sometidos a reflujo durante 3 horas. El aminoácido libre fue separado como cristales. La mezcla de la reacción fue enfriada, mantenida en un refrigerador durante la noche, filtrada, lavada con agua fría, y éter, y después secada en una secadora al vacio. Se obtuvieron 5.9 g (26.69 mM, 89%) de hidrocloruro de D-cicloheptilalanina. Rf(12) = 0.10-0.15. [oc]D20 = -11° (c = 0.4; HCl al 1 M) . Análisis para Ci0Hi9NO2. HCl (221.728). Calculado: C% = 54.17; H% = 9.09; N% = 6.32; Cl% = 15.99. Encontrado: C% = 54.27; H% = 9.27; N% = 6.30; Cl% = 16.2. Paso I : Etoxicarbonil-D-cicloheptilalanina A una solución de 4.43 g (20 ,;) de hidrocloruro de D-cicloheptilalanina (Ejemplo 1, Paso H) en 20 mi de dimetilformamida se agregaron 5.6 mi (40 mM) trietilamina y 3.95 g (21 mM) de carbonato de (N-hidroxisuccinimidil) -etilo * . Después de agitar a temperatura ambiente durante 3 horas la mezcla de la reacción fue evaporada, el residuo disuelto en 40 mi de acetato de etilo fue lavado con 2 x 30 mi de KHSO4 1 M, y con agua hasta neutralidad. Después, la capa orgánica fue secada en Na2S04 anhidro, después evaporada a 2.0-2.5 kPa. El producto aceitoso resultante (4.47 g, ~17 mM) fue etoxicarbonil-D-cicloheptilalanina [Rf (7) = 0.85-0.90], que fue utilizado directamente en el paso siguiente. [CX]D20 = +6.3° (c = 1, metanol) . * Preparación de carbonato de (N-hidroxisuccinimidil) -etilo Se disolvieron 11.5 g (100 mM) de N-hidroxisuccinimida en 100 mi de tetrahidrofurano, se enfrió a una temperatura de -10°C, después, bajo agitación, se agregaron 15.4 mi (110 mM) de trietilamina y 10.45 mi (110 mM) de clorocarbonato de etilo. Después de 2 horas de agitación a temperatura ambiente, la mezcla fue filtrada y el filtrado fue evaporado bajo presión reducida. El residuo aceitoso se cristalizó al enfriarse. El material cristalino fue suspendido en éter de petróleo ligero, removido por filtración y secado en una secadora al vacio. Rendimiento 12.78 g (68.3%). Punto de fusión; 39.4-39.7°C. Análisis para C7H9N05 (187.15). Calculado: C, 44.29; H, 4.85; N, 7.48. Encontrado: C% = 44.67; H% = 4.81; N% = 7.27. Paso J: Etoxicarbonil-D-cicloheptilalanil-L-prolina Una solución de etoxicarbonil-D-cicloheptilalanina (~ 17 mM,
Ejemplo 1, Paso I) en 17 mi de THF fue combinado con 3.74 g (20 mM) de N-hidroxisuccinimida, enfriada a 10°C, y combinada con una solución de 4.12 g (20 moles) de 1,3-diciclohexilcarbodiimida en aproximadamente 20 mi de THF. La mezcla fue agitada durante aproximadamente 5 horas a una temperatura de 22° C después de lo cual se determinó por TLC que la formación del éster activo había terminado. Se agregó L-Prolina (1.95 g, 17 mM) a la mezcla de al reacción agitada seguida por adición de 2.3 mi (17 mM) de trietilamina. La mezcla de la reacción fue agitada a una temperatura de 22° C durante aproximadamente 15 horas después de lo cual se determinó por TLC que el consumo del éster activo había terminado. La mezcla de la reacción fue filtrada, la torta de filtro fue lavada con 10 mi de THF, y el filtrado fue evaporado. El residuo fue disuelto en 30 mi de acetato de etilo y 30 mi de agua. La fase acuosa fue lavada con 2 x 20 mi de acetato de etilo, acidificada con 20 mi de 1 KHSO4 M, y extraída con 3 x 20 mi de acetato de etilo. Las soluciones combinadas de acetato de etilo fueron lavadas con agua hasta tornarse neutrales, secadas en Na2S04 anhidro, y después evaporadas a 2.0-2.5 kPa. Al ser triturado con éter diisopropílico, el residuo se cristalizó. Esta suspensión de cristal fue enfriada en un refrigerador, filtrada con éter de petróleo ligero, y secada en una secadora al vacío. Se obtuvieron 4.2 g (11.85 mM, 70%) de etoxicarbonil-D-cicloheptilalanil-L-prolina. Rf (7) = 0.45-0.55. Análisis para C18H30N2O4 (351.45). Calculado: C, 60.99; H, 8.53; Nf 7.90. Encontrado: C% = 60.14; H% = 8.55; N% = 7.38. El espectro de masa FAB (355 [ +H]+) confirmó la estructura estimada.
Ejemplo 2 Síntesis de N-metil-D-cicloheptilalanil-L-propil-L-arginina aldehido Paso 1 : Benciloxicarbonil-N-metil-D-ciclohptilalanil-L-prolil-NG-bencil-oxicarbonil-L-arginina lactama 3.93 g (10 mM) de texc-butiloxicarbonil-I^-benciloxicarbonil-L-arginina lactama [ (Bajusz y colaboradores, J. Med. Chem. 33, 1729 (1990)] fueron suspendidos en 10 mi de cloroformo, después se agregaron 10 mi de acetato de etilo saturado con gas HC1 (0.11-0.15 g/ml) con agitación y enfriamiento con hielo. La disociación del grupo Boc fue monitoreada por cromatografía en capa delgada [Rf (11) = 0.5 (compuesto libre); 1.0 (compuesto Boc)]. Al final de la reacción, la suspensión fue diluida con 20 mi de éter dietílico, la masa de cristal formada fue filtrada, lavada con 5 mi de acetona y 5 mi de éter dietílico, y secada bajo presión reducida en OH. El hidrocloruro de í -benciloxicarbonil-L-arginina lactama resultante fue disuelto en 10 mi de dimetilformamida, enfriada a una temperatura de —20°C y agregado al anhídrido mixto siguiente. Se disolvió 4.32 g (10 mM) de benciloxicarbonil-N-metil-D-cicloheptilalanil-L-prolina (Ejemplo 2, Paso C) fue disuelta en 10 mi de dimetilformamida, enfriada a una temperatura de -15°C, y después con agitación se agregaron 1.12 mi (10.1 mM) de N-metil-morfolina y 1.33 mi (10.1 mM) de clorofórmate de isobutilo. Después de 10 minutos de agitación de la solución de dimetilformamida arriba de Ntí benciloxicarbonil-L-arginina lactama se agregó trietilamina en una cantidad para ajustar el pH de la mezcla de la reacción a 8 (se requirió aproximadamente 1.4 mi) . La mezcla de la reacción fue agitada a una temperatura de -10°C durante 30 minutos, después a 0°C durante una hora. Después que las sales fueron removidas por filtración y el filtrado fue diluido con 100 mi de acetato de etilo. La solución resultante fue lavada con 3 x 15 mi de agua, 6 mi de KHS04 1 M, y 3 x 6 mi de agua, secada en Na2S04 anhidro, y evaporada a 2.0-2.5 kPa. El producto obtenido fue sometido a cromatografía en columna en gel de sílice utilizando 100 g de Kieselgel 60 (0.040-0.063 mm) como adsorbente y acetato de etilo como eluyente. Las fracciones que contenían solamente el producto puro [ (Rf (1) = 0.70] fueron combinadas y evaporadas a 2.0-2.5 kPa. El residuo de la evaporación fue cristalizado a partir de éter diisopropílico . Rendimiento 6.0 g (85%), Rf (1) = 0.65-0.75. El espectro de masa E¾B (703 [M+H]+ confirmó la estructura estimada. Paso 2 : Benciloxicarbonil-N-metil-D-cicloheptilalanil-L-prolil-NG-benciloxicarbonil-L-arginina aldehido 5.62 g (8 mM) de benciloxicarbonil-N-metil-D-cicloheptilalanil-L-prolil-lsr^-benciloxicarbonil-L-arginina lactama (Ejemplo 2, Paso 1) fueron disueltos en 10 mi de tetrahidrofurano, y después con agitación y a una temperatura no mayor de -50°C se agregó una solución de 2.25 mM de LiAlH4 disuelto en tetrahidrofurano. El progreso de la reducción fue monitoreado por cromatografía en capa delgada (solvente 7) conforme se reveló el solvente, y en caso requerido, se agregó una porción adicional de LiAlH4. ? esta mezcla de la reacción se agregó gota a gota KHS0 con 0.5 M con agitación constante y enfriamiento hasta lograr un pH de 3, después 25 mi de agua. La solución resultante fue extraída con 2 x 10 mi de hexano, después con 3 x 15 mi de diclorometano . Los extractos de diclorometano fueron combinados, lavados con 3 x 15 mi de agua, 15 mi de una solución fría de NaHCÜ3 al 5% y otra vez con 15 mi de agua, secados en Na2S04 anhidro, y evaporados a 2.0-2.5 kPa. El residuo de la evaporación fue tratado con éter diisopropílico, filtrado y secado bajo presión reducida. Rendimiento 4.95 g (88%), Rf (1) = 0.20-0.25. El espectro de masa FAB (705 [M+H] 858 [?+?+???]+) confirmó la estructura estimada. Paso 3: Sulfato de N-metil-D-cicloheptilalanil-L-prolil-arginina aldehido Se disolvieron 4.6 g (6.5 mM) de benciloxicarbonil-N-metil-D-cicloheptilalanil-L-prolil-Nü-benciloxicarbonil-L-arginina aldehido (Ejemplo 2 Paso 2) fue disuelto en 65 mi de etanol y 13.5 mi de ácido sulfúrico 0.5 M, después se agregó 0.4 g de catalizador Pd-C suspendido en 10 mi de agua y la mezcla fue sometida a hidrogenación a una temperatura de aproximadamente 10°C. El progreso de la reacción fue monitoreado por cromatografía en capa delgada. Después de terminar la reacción (aproximadamente 15 minutos) , el catalizador fue filtrado y el filtrado fue concentrado a aproximadamente 5-7 mi a 2.0-2.5 kPa. El residuo fue diluido con 50 mi de agua, extraído con 4 x 10 mi de diclorometano y la solución acuosa fue dejada para que reposara a una temperatura de 20-22°C durante 24 horas. La solución fue extraída con 3 x 10 mi de diclorometano otra vez y el pH fue agitado a 3.5 con resina de intercambio de iones Dowex AG 1-X8 (HO) , después la solución fue liofilizada. Rendimiento 2.85 g (82%) , Rf (9) = 0.35-0.45. [OÍ]d20 = -79.6°C (c = 1/ agua) . El espectro de masa FAB (437 [M+H]+, 590 [M+H+NBA] +) confirmó la estructura estimada. Síntesis de los materiales iniciales: Benciloxicarbonil-N-metil-D-cicloheptilalanil-L-prolina Paso A. Síntesis de N-benciloxicarbonil-D-cicloheptilalanina Se combinó hidrocloruro de D-cicloheptilalanina (Ejemplo 1, Paso H) (11.09 g, 50 mM) con 40 mi de THF y 40 mi de agua a 0°C. La mezcla agitada fue ajustada a pH 10 aproximadamente por adición de una solución de NaOH 5M. Se agregó cloroformato de bencilo (8.22 mi, 55.4 mM) a la mezcla de la reacción mientras se mantenía a una temperatura de aproximadamente 3°C y pH aproximadamente 10 por adición de NaOH 5M según lo requerido. Al terminar la adición de cloroformato de bencilo, la mezcla de la reacción fue agitada durante 1 hora a 0°C y mantenida a un pH de aproximadamente 10. La agitación prosiguió durante la noche a temperatura ambiente y la culminación de la reacción fue revisada por TLC (7) . En caso requerido, se agregó una cantidad adicional de cloroformato de bencilo (1-2 x 0.75 mi, 5 mM) a la mezcla de la reacción mientras se mantenía la temperatura a aproximadamente 3°C y el pH a aproximadamente 10 por adición de NaOH 5M. Se agregó éter metílico de t-Butilo (25 mi) , y la mezcla agitada fue calentada a una temperatura de 22°C. La fase acuosa fue separada y lavada con una segunda porción de 25 mi de éter metílico de t-butilo. El contenido de la fase orgánica fue revisado por TLC y, en caso requerido, la fase orgánica fue retro-extraída con 25 mi de agua. Las fases acuosas y 25 mi de acetato de etilo fueron combinados y ajustados a pH 2 con HC1 concentrado. Las fases fueron separadas, y la fase acuosa fue extraída con una segunda porción de 25 mi de acetato de etilo. La fase orgánica combinada fue lavada con 20 mi de KHS04 l M y 2 x 30 mi de agua, secada en Na2S04 anhidro, y evaporada a 2.0-2.5 kPa. El residuo de la evaporación fue disuelto en 45 mi de THF, y esta solución de benciloxicarbonil-D-cicloheptilalanina fue guardada para su uso en el paso siguiente sin purificación adicional . Paso B: Benciloxicarbonil-D-cicloheptilalanil-L-prolina La solución de TFA de benciloxicarbonil-D-cicloheptilalanina obtenida en el E emplo 2, Paso A fue combinado con 5.9 g (51.24 mM) de N-hidroxisuccinimida, enfriada a 10°C, y combinada con una solución de 11 g (53.3 mM) de 1,3-diciclohexicarbodi-imida en aproximadamente 25 mi de THF. La mezcla fue agitada durante aproximadamente 4.5 horas a una temperatura de 22°C después de lo cual se determinó mediante TLC que la formación del éster activo había terminado. Se agregó L-Prolina (5.9 g, 51.24 mM) a la mezcla de la reacción agitada seguido por adición de 7.2 mi (51.24 mM) de trietilamina. La mezcla de la reacción fue agitada a 22°C durante aproximadamente 15 horas después de lo cual se determinó por TLC que el consumo del éster activo había terminado. La mezcla de la reacción fue filtrada, la torta de filtro fue lavada con 25 mi de THF, y el filtrado fue vaporado. El residuo fue disuelto en 50 mi de acetato de etilo y 50 mi de agua. La fase acuosa fue lavada con 2 x 20 mi de acetato de etilo, acidificada con 20 mi de de KHSO4 1 M, y extraída con 3 x 40 mi de acetato de etilo. Las soluciones combinadas de acetato de etilo fueron lavada con agua hasta tornarse neutrales, secadas en Na2S04 anhidro, y después evaporadas a 2.0-2.5 kPa . El residuo, benciloxicarbonil-D-cicloheptilalanil-L-prolina, fue disuelto en 60 mi de THF, y fue utilizado en el paso siguiente sin purificación adicional. Paso C: Benciloxicarbonil-N-metil-D-cicloheptilalanil-L-prolina Se agregó yodometano (17.95 mi, 288 m) a la solución de THF de benciloxicarbonil-D-cicloheptilalanil-L-prolina del Ejemplo 2, Paso B. Esta solución fue enfriada a 8°C y transferida junto con un enjuague de 20 mi de THF a una pasta agitada de 4.75 g (199 mM) de hidruro de sodio al 60% en 35 mi de THF mientras se mantenía la temperatura por debajo de 13°C. La mezcla de la reacción fue agitada a 11°C durante 24 horas . El exceso de hidruro de sodio fue descompuesto por adición cautelosa de 1.6 mi de agua a la reacción mientras se mantenía la temperatura por debajo de 13°C y se controlaba la formación de espuma. La mezcla de la reacción apagada fue agitada durante aproximadamente 20 minutos a una temperatura de 22°C y después concentrada a aproximadamente 40 mi bajo presión reducida a una temperatura inferior a 30°C. Se agregó agua (70 mi) al residuo seguido por 30 mi de éter metílico de t-butilo. Las fases fueron separadas, y la fase acuosa fue lavada otra vez con 30 mi de éter metílico de t-butilo. La fase acuosa del producto fue combinada con 40 mi de acetato de etilo y ajustada a pH 2.2 con una solución de ácido sulfúrico 3M. Las fases fueron separadas y la fase acuosa fue retroextraida con 40 mi de acetato de etilo. La fase orgánica combinada fue lavada con 70 mi de una solución de tiosulfato de sodio al 5%. Las fases fueron separadas y la fase orgánica fue concentrada a un pequeño volumen bajo vacio de presión reducida (33 -45 kPa) mientras se mantenía la temperatura a un nivel inferior a 50°C. El residuo fue combinado con 18.6 mi de THF y 100 mi de agua y ajustado a pH 8.5 con ciclohexilamina. La pasta resultante fue concentrada a 100 mi bajo presión reducida (9-33 kPa) a una temperatura comprendida entre 25 y 55°C, ajustada a 25°C, diluida con 71.5 mi de agua y agitada durante aproximadamente 10.5 horas. La pasta fue filtrada, lavada con agua y secada en aire a 45°C para proporcionar 16.72 g de la sal de ciclohexilamina de benciloxicarbonil-N-metil-D-cicloheptilalanil-L-prolina (rendimiento del 63% a partir de D-cicloheptilalanina. Rf (8) = 0.55 - 0.65. Ejemplo 3 Síntesis de hemisulfato de D-cicloheptillactil-L-prolil-L-arginina aldehido Paso 1 : Tetrahidropiranil-D-cicloheptillactil-L-prolil-NG-benciloxicarbonil-L-arginina lactama Se suspendieron 5.08 g (13 mM) de terc-butoxicarbonil-NG-benciloxicarbonil-L-arginina lactama [[Bajusz y colaboradores, J. Med. Chem. 33, 1729 (1990)] en 13 mi de cloroformo, después se agregaron 13 mi de acetato de etilo saturado con gas HC1 (0.11-0.15 g/ml) con agitación y enfriamiento con hielo. La disociación del grupo Boc fue monitoreada por cromatografía en capa delgada [Rf (11) = 0.5 (compuesto libre); 1.0 (compuesto Boc)]. Al final de la reacción, la suspensión fue diluida con 25 mi de éter dietílico, la masa de cristal formada fue filtrada, lavada con 7 mi de acetona y 7 mi de éter dietilico, y secada bajo presión reducida en hidróxido de potasio. El idrocloruro de NG-benciloxicarbonil-L-arginina lactama resultante fue disuelto en 13 mi de dimetilformamida, enfriado a -20°C y agregado al anhídrido mixto siguiente. La solución de sal de trietil-amonio de tetrahidropiranil-D-cicloheptillactil-L-prolina obtenida en el paso I del Ejemplo 3 (12 iriM) fue enfriada a una temperatura de -20°C y después con agitación se agregaron 1.6 mi (12 mM) de cloroformato de isobutilo. Después de 10 minutos de agitación, la solución de dimetilformamida antes mencionada de Nb-benciloxicarbonil-L-arginina lactama fue agregada y después trietilamina en una cantidad para ajustar el pH de la mezcla de la reacción a 8 (se requirió aproximadamente 1.8 mi. La mezcla de la reacción fue agitada a -10°C durante 30 minutos, después a 0°C durante 1 hora. Después, las sales fueron removidas por filtración y el filtrado fue diluido con 65 mi de acetato de etilo. La solución resultante fue lavada con 3 x 25 mi de agua, 7 mi de hidrogensulfato de potasio 1 M y 3 x 7 mi de agua, secada en Na2SC>4 anhidro y evaporada a 2.0-2.5 kPa. El producto obtenido fue sometido a cromatografía en columna en gel de sílice utilizando 130 g de ieselgel 60 (0.040-0.063 mm) como adsorbente y acetato de etilo como eluyente. Las fracciones que contenían solamente el producto puro [ (Rf (1) = 0.60] fueron combinadas y evaporadas a 2.0-2.5 kPa. El residuo de la evaporación fue cristalizado a partir de éter diisopropílico . Rendimiento 5.0 g (7.8 mM, 64%), ¾ (1) = 0.6 El espectro de masa ?7?? (640 [M+H+] confirmó la estructura estimada. Paso 2 : Tetrahidropiranil-D-cicloheptillactil~L-prolil-NG-benciloxicarbonil-L-arginina aldehido 4.8 g (7.51 mM) de tetrahidropiranil-D-cicloheptillactil-L-prolil-N^-benciloxicarbonil-L-arginina lactama (Ejemplo 3, Paso 1) fueron disueltos en 15 mi de tetrahidrofurano, y después con agitación a una temperatura no mayor de -50°C se agregó una solución de hidruro de litio aluminio 3-6 mM disuelto en tetrahidrofurano. El progreso de la reducción fue monitoreado por cromatografía en capa delgada con solvente de revelado No. 8, y en caso requerido, una porción adicional de hidruro de litio aluminio se agregó. A esta mezcla de la reacción, se agregó gota a gota ácido sulfúrico 0.5 M con agitación constante y enfriamiento hasta obtener un pH 3, después se agregaron 35 mi de agua. La solución resultante fue extraída con 2 x 15 mi de hexano, después con 3 x 20 de diclorometano . Los extractos de diclorometano fueron combinados, lavados con 3 x 5 mi de agua, 15 mi de una solución fría de hidrogencarbonato de sodio al 5% y otra vez con 15 mi de agua, secados en sulfato de sodio anhidro y evaporados a 2.0-2.5 kPa. El residuo de la evaporación fue tratado con éter diisopropílico, filtrado y secado bajo presión reducida. Rendimiento 3.9 g (6.07 mM, 81%), Rf (8) = 0.40 [a] D2Ü = +16.0° (c = 1, tetrahidrofurano) . El espectro de masa FAB (642 [M+H+, 795 [M+H+NBA] +) confirmó la estructura estimada. Paso 3: Hemisulfato de D-cicloheptillactil-L-prolil-L-arginina aldehido 3.21 g (5 mM) de tetrahidropiranil-D-cicloheptillactil-L-prolil-NG-benciloxicarbonil-L-arginina aldehido (Ejemplo 3, Paso 2) fueron disueltos en 40 mi de etanol y 5 mi de ácido sulfúrico 0.5 M, después se agregó 0.3 g de catalizador Pd-C suspendido en 6 mi de agua y la mezcla fue hidrogenada a una temperatura de aproximadamente 10°C. El progreso de la reacción fue monitoreado por cromatografía en capa delgada. Después de terminar la reacción (aproximadamente 15 minutos), el catalizador fue removido por filtración y el filtrado fue concentrado a aproximadamente 4-6 mi a 2.0-2.5 kPa. El residuo fue diluido con 40 mi de agua, extraído con 4 x 7 mi de diclorometano y la solución acuosa fue dejada para que reposara durante 24 horas a una temperatura de 20-22°C. La solución fue extraída con 3 x 15 mi de diclorometano otra vez y el pH fue ajustado a 3.5 con resina de intercambio de iones Dowex AG 1-X8 (HO) , después la solución fue liofilizada. Rendimiento 1.65 g (3.5 mM, 70%) [a]DZ0 = -94.7° (c = 1, agua) HPLC: k' = 2.702 y 3.010. El espectro de masa FAB (424 [M+H]+, 577 [M+H+NBA] +) confirmó la estructura estimada. Síntesis de los materiales iniciales: Sal de trietilamonio de tetrahidropiranil-D-cicloheptillactil-L-prolina Paso A: Ester metílico de cloroacetil-DL-cicloheptilalanina A una solución de 15.2 g (65 mM) de hidrocloruro de éster metílico de DL-cicloheptilalanina (Ejemplo 1, Paso E) en 65 mi de diclorometano, se agregaron 9.1 mi (65 mM) de trietilamina y 14.9 g (78 mM) de (N-hidroxisuccinimidil) -cloroacetato* . Después de agitar a temperatura ambiente durante 3 horas, la mezcla de la reacción fue diluida con 65 mi de diclorometano y sucesivamente lavada con 3 x 30 mi de agua, KHSO4 1 M, agua, NaHC03 al 5% y finalmente con agua hasta alcanzar neutralidad. Después la capa orgánica fue secada en Na2S04 anhidro, después evaporada a 2.0-2.5 kPa. El producto aceitoso resultante fue triturado con éter de petróleo ligero. El material sólido fue removido por filtración, lavado con éter de petróleo ligero, y secado en una secadora al vacio. Se obtuvieron 17.54 g (63.6 mM, -98%) de éster metílico de cloroacetil-DL-cicloheptilalanina, que se utilizó directamente para la reacción siguiente. Rf (7) = 0.73-0.83. Punto de fusión: 78-80°C. Análisis para C13H22NO3CI (275.777). Calculado: C% = 56.62; H% = 8.04; N% = 5.08; Cl% = 12.86. Encontrado: C% = 55.65; H% = 7.83; N% = 5.06; Cl% = 12.72. ^Preparación de cloroacetato de (N-hidroxisuccinimidilo) Se agregaron 32 mi (450 mM) de cloruro de cloroacetilo a 23 g (200 mM) de N-hidroxisuccinimida y la mezcla fue sometida a reflujo durante 10 minutos y después vaciada en hielo triturado, filtrado, lavada con agua fría, y secada en una secadora al vacío. Rendimiento 20.23 g (105.9 mM, 53%) . Punto de fusión: 113.3-113.7°C. Análisis para C6H6N04C1 C7H9NO5 (191.55). Calculado: C% = 37.62, H% = 3.16; N% = 7.31; Cl% = 18.51. Encontrado: C% = 37.37; H% = 3.16; N% = 7.23; Cl% = 18.35. Paso B: Éster metílico de cloroacetil-D-cicloheptilalanina (resolución enzimática de éster metílico de cloroacetil-DL-cicloheptilalanina) A una solución de 8.71 (31.6 moles) de éster metílico de cloroacetil-DL-cicloheptilalanina, DL-éster, (Ejemplo 3, Paso A) en 30 mi de tolueno, se agregaron 70 mi de agua y 50 mg de Subtilisin Carlsberg (Proteasa Tipo VIII; Sigma) . La hidrólisis enzimática del L-enantiómero, L-éster, se llevó a cabo a pH 7.0, el cual fue mantenido a través de un autotitulador, llenado con NaOH 3 M. Cuando se detuvo el consumo de NaOH (a 5.522 mi, 16.57 mM) la mezcla de la reacción fue diluida con 30 mi de tolueno, y las dos capas fueron separadas. La fase acuosa fue lavada con 2 x 20 mi de tolueno. La solución de tolueno combinadas contenían el D-éster y las soluciones acuosas combinadas contenían la sal sódica del -ácldo. Después de secar en Na2S04 anhidro, las soluciones de tolueno combinadas fueron evaporadas bajo presión reducida para proporcionar 4.18 g (15.16 mM) de D-éster. Rf (7) = 0.73-0.83, que fue utilizada directamente para la preparación de D-cicloheptilalanina. Las soluciones acuosas combinadas fueron acidificadas y extraídas con 3 x 30 mi de acetato de etilo. Las soluciones combinadas de acetato de etilo fueron lavadas con agua, secadas en Na2S04 anhidro, y evaporadas bajo presión reducida para proporcionar 3.46 g (13.22 mM) de L-ácldo [Rf (7) -0.45-0.50], que fue utilizado directamente para la preparación de L-cicloheptilalanina . Una preparación similar empezando a partir de 8.25 g (30 mM) de DL-éster (Ejemplo 2, Paso A) proporcionó 4.08 g (14.79 mM) de D-éster y 3.23 g (12.34 mM) de L-ácido.
Paso C: Hidrocloruro de D-cicloheptilalanina 8.27 g (30 mM) de D-éster (Ejemplo 3, Paso B) fueron suspendidos en 120 mi de HCl 6 M y sometidos a reflujo durante 3 horas. El aminoácido libre fue separado como cristales. La mezcla de la reacción fue enfriada, mantenida en un refrigerador durante la noche, filtrada, lavada con agua fría y éter, y después secada en una secadora al vacio. Se obtuvieron 5.9 g (26.69 mM, 89%) de hidrocloruro de D-cicloheptilalanina. Rf (12) = 0.10-0.15. [a]O¿0 = -11 °C (c = 0.4; 1 M HCl) . Análisis para Ci0Hi9NO2.HCl (221.728). Calculado: C% = 54.17; H% = 9.09; N% = 6.32; Cl% = 15.99. Encontrado: C% = 54.27; H% = 9.27; N% = 6.30; Cl% = 16.2 Paso D: sal de diciclohexilamonio de ácido D-cicloheptilláctico 5.78 g (26.15 mM) de hidrocloruro de D-cicloheptilalanina (Ejemplo 3, Paso C) fueron disueltos en 26 mi de agua, diluidos con 105 mi de agua y 52.5 mi de ácido acético glacial, y enfriados a 5°C. A esta mezcla se agregó gota a gota una solución de 18.0 g (261 mM) de NaN<_>2 en 30 mi de agua con agitación y enfriamiento. La agitación prosiguió a una temperatura de 5°C durante 1 hora y a temperatura ambiente durante la noche. Al dia siguiente, la mezcla de la reacción fue acidificada con 25 mi de ce HCl con agitación. Después, la mezcla fue evaporada a sequedad a una temperatura de 50°C bajo presión reducida. El residuo fue disuelto en 100 mi de agua y evaporado similarmente, triturado con tolueno y evaporado otra vez. El residuo final fue disuelto en 50 mi de acetato de etilo y 50 mi de agua. La fase acuosa fue lavada con acetato de etilo, y las soluciones combinadas de acetato de etilo fueron lavadas con agua hasta neutralidad, secadas en Na2S04 anhidro, y evaporadas bajo presión reducida. El sólido obtenido fue disuelto en 20 mi de éter diisopropilico . A esta solución, se agregaron 5 mi (25 mM) de diciclohexílamina, después de lo cual se separó la sal cristalina. Después de enfriamiento, los cristales fueron removidos por filtración, lavados con éter frió y secados en una secadora al vacio para proporcionar 5.5 g (14.96 mM, 57.2%) de sal de diciclohexilamida de ácido D-cicloheptilláctico, D-cHla.DCHA. Rf (7) = 0.53-0.50. [o¡]D¿0 '= +19.5° (c = 1; metanol) . Punto de fusión: 147-150°C. Análisis para C10H18O3 (C22H1NO3) . Calculado: C% = 71.89; H% = 11.24; N% = 3.81. Encontrado: C% = 71.57; H% = 11.34; N% = 3.83. La conversión de 0.35 g (1 mM) de D-cHla.DCHA en ácido -hidroxi libre proporcionó 0.15 g (0.8 mM] de D-cHla, [a]DZu = +10.1° (c = 1; metanol); Punto de fusión: 125-127°C. Análisis para CioHi803 (186.252). Calculado: C% = 64.48; H% = 9.74. Encontrado: C% = 64.54; H% = 9.86. Paso E: Ester bencílico de ácido D-cicloheptilláctico A una solución de 11.21 g (30.5 mM) de sal de diciclohexilamonio de ácido D-cicloheptilláctico (Ejemplo 3, Paso D) en 30 mi de dimetilformamida, se agregaron 3.57 mi (30 mM) de bromuro de bencilo. La mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante 24 horas y después filtrada y evaporada a 2.0-2.5 kPa. El residuo fue disuelto en 20 mi de hidrogencarbonato de potasio 0.5 M y 60 mi de éter dietilico. La fase orgánica fue sucesivamente lavada con 20 mi de agua, KHSOa 0.5 M, y agua y después secada en sulfato de sodio anhidro y evaporada bajo presión reducida. El residuo aceitoso fue 8.3 g (~30 mM) de éster bencílico de ácido D-cicloheptilláctico [Rf (3) = 0.2-0.3], que se utilizó directamente en el Paso F. Paso F: Éster bencílico de ácido tetrahidropiranil-D-cicloheptilláctico A una solución de 8.29 g (30 mM) de éster bencílico de ácido D-cicloheptilláctico (Ejemplo 3, Paso E) en 30 mi de diclorometano, se agregaron 3.01 mi (33 mM) de 3,4-dihidro-2H-pirano y 0.3 mi de HC1 ~3 M en acetato de etilo, y la mezcla fue dejada para que reposara a temperatura ambiente durante 16 horas. Después la mezcla de la reacción fue diluida con 40 mi de diclorometano, lavada con 3 x 20 mi de agua, y secada en sulf to de sodio anhidro y evaporada a 2.0-2.5 kPa. El residuo fue sometido a cromatografía en gel de sílice utilizando 200 g de Kieselgel 60 (0.040-0.063 mm) como adsorbente y una mezcla 85:15 de ciclohexano y acetato de etilo como eluyente. Las fracciones que contenían solamente el producto puro [Rf (4) = 0.60-0.70] fueron combinadas y evaporadas a 2.0-2.5 kPa. El residuo aceitoso fue 7.9 g (21.9 mM, 73%) de éster bencílico de ácido tetrahidropiranil-D-cicloheptilláctico que fue utilizado directamente en el paso siguiente . Paso G: Sal de trietilamonio de ácido tetrahidropiranil-D-cicloheptilláctico Se disolvieron 7.21 g (20 mM) de éster bencílico de ácido tetrahidropiranil-D-cicloheptilláctico (Ejemplo 3, Paso F) en 20 mi de dimetilformamida, se agregó 2.8 mi (20 mM) de trietilamina y se hidrogenó en presencia de 0.1 g de catalizador Pd/C. El progreso de la reacción fue monitoreado por cromatografía en capa delgada [Rf (1) = 0.30 (éster), 0.00 (ácido)]. Después de terminada la reacción, el catalizador fue removido por filtración y lavado con 2 x 5 mi de dimetilformamida. El filtrado y los lavados fueron combinados y utilizados en el paso siguiente como una solución de 20 mM de sal de trietilamonio de ácido tetrahidropiranil-D-cicloheptilláctico. Paso H: Éster bencílico de tetrahidropiranil-D-cicloheptillactil-L-prolina La solución de sal de trietilamonio de ácido tetrahidropiranil-D-cicloheptilláctico obtenido en el paso G del Ejemplo 3 (20 mM) fue enfriada a una temperatura de +5°C, y con agitación se agregaron 2.7 g (20 mM) de 1-hidroxibenzotriazol, 4.83 g (20 mM) de hidrocloruro de éster bencílico de L-prolina, y 4.12 g (20 mM) de diciclohexilcarbodiimida. La mezcla de la reacción fue mantenida a temperatura ambiente durante la noche y después filtrada y evaporada a 2.0-2.5 kPa. El residuo fue disuelto en 50 mi de acetato de etilo y lavado con 20 mi de agua e hidrogencarbonato de sodio al 5%, secado en Na2S04 anhidro, y evaporado bajo presión reducida. El residuo fue sometido a cromatografía en gel de sílice utilizando 200 g de ieselgel 60 (0.040-0.063 mm) como adsorbente y una mezcla 1:1 de n-hexano y acetato de etilo como eluyente. Las fracciones que contenían solamente el producto puro [Rf (3) = 0.3-0.4] fueron combinados y evaporados a 2.0-2.5 kPa. El residuo aceitoso fue de 5.95 g (13 mM, 65%) de éster bencílico de tetrahidropiranil-D-cicloheptillactil-L-prolina que se utilizó directamente en el paso siguiente. Paso I : Sal de trietilamonio de tetrahidropiranil-D-cicloheptillactil-L-prolina Se disolvieron 5.5 g (12 mM) de éster bencílico de tetrahidropiranil-D-cicloheptillactil-L-prolina (Ejemplo 3, Paso H) en 12 mi de dimetilformamida, se agregaron 1.68 mi (12 mM) de trietilamina y se hidrogenó en presencia de 0.1 g de catalizador Pd/C. El progreso de la reacción fue monitoreado por cromatografía en capa delgada [Rf (1) = 0.30 (éster) , 0.00 (ácido)]. Después de terminar la reacción, el catalizador fue removido por filtración y lavado con 2 x 2 mi de dimetilformamida. El filtrado y los lavados fueron combinados y utilizados como una solución que contenía 12 mM de sal de trietilamonio de tetrahidropiranil-D-cicloheptillactil-L-prolina. Ejemplo 4 Síntesis de hemisulf to de N-metil-D-ciclohexilglicil-L-acetidin-2-carbonil-L-arginína aldehido Paso 1: Benciloxicarbonil-N-metil-D-ciclohexilglicil-L-acetidin-2-carbonil-NG-benciloxicarbonil-L-arginina lactama Se suspendieron 1.97 g (5 mM) de terc-butiloxicarbonil-NG-benciloxicarbonil-L-arginina lactama [ (Bajusz y colaboradores, J. Med. Chem. 33, 1729 (1990)] en 5 mi de cloroformo, después se agregaron 5 mi de acetato de etilo saturado con gas HC1 (0.11-0.15 g/ml) con agitación y enfriamiento con hielo. La disociación del grupo Boc fue monitoreado por cromatografía en capa delgada [Rf (11) = compuesto libre); 1.0 (compuesto Boc)]. Al final de la reacción, la suspensión fue diluida con 1 mi de éter dietílico, la masa de cristal formada fue filtrada, lavada con 3 mi de acetona y 3 mi de éter dietílico, y secada bajo presión reducida en KOH. El hidrocloruro de NG-benciloxicarbonil-L-arginina lactama fue disuelto en 5 mi de dimetilformamida, enfriado a una temperatura de -20°C y agregado al anhídrido mixto siguiente. 1.95 g (5 mM) de ácido benciloxicarbonil-N-metil-D-ciclohexilgilicil-L-acetidin-2-carboxílico (Ejemplo 4, Paso B) fueron disueltos en 5 mi de dimetilformamida, enfriados a -15°C, y después con agitación se agregaron 0.56 mi (5.05 mM) de N-metil-morfolina y 0.665 mi (5.05 mM) de clorofórmate de isobutilo. Después de 10 minutos de agitación, la solución de dimetilformamida arriba de I^-benciloxicarbonil-L-arginina lactama fue agregada, después trietilamina en una cantidad suficiente para ajustar el pH de la mezcla de la reacción a 8 (se requirió aproximadamente 0.7 mi). La mezcla de la reacción fue agitada a una temperatura de -10°C durante 30 minutos, después a una temperatura de 0°C durante 1 hora. Después las sales fueron removidas por filtración y el filtrado fue diluido con 50 mi de acetato de etilo. La solución resultante fue lavada con 3 x 7 mi de agua, 3 mi de HSO4 1 M y 3 x 3 mi de agua secada en Na2S04 anhidro, y evaporada a 2.0-2.5 kPa. El producto obtenido fue sometido a cromatografía en columna en gel de sílice utilizando 50 g e Kieselgel 60 (0.040-0.063 mm) como adsorbente y acetato de etilo como eluyente. Las fracción que contenían solamente el producto puro [ (Rf (1) = 0.70] fueron combinadas y evaporadas a 2.0-2.5 kPa. El residuo de la evaporación fue cristalizado a partir de éter diisopropílico.
Rendimiento 2.3 g (71%), Rf (1) = 0.45-0.55 El espectro de masa E¾B (661 [M+H]+) confirmó la estructura estimada . Paso 2 : Benciloxicarbonil-N-metil-D-ciclohexilglicil-L-acetidin-2-carbonil-NG-benciloxicarbonil-L-arginina aldehido 2.15 g (3.25 mM) de benciloxcarbonil-N-metil-D-ciclohexilglicil-L-acetidin-2-carbonil-NG-benciloxicarbonil-L-arginina lactama (Ejemplo 4, Paso 1) fueron disueltos en 5 mi de tetrahidrofurano, y después con agitación y a una temperatura no mayo de -50°C, se agregó una solución de 2.25 mM de LiAlH4 disuelto en tetrahidrofurano . El progreso de la reducción fue monitoreado por cromatografía en capa delgada (solvente 7) como solvente de revelado y, en caso requerido, se agregó una porción adicional de LiAl¾. A esta mezcla de reacción, se agregó gota a gota y con agitación constante y enfriamiento KHS04 0.5 M hasta obtener un pH de 3, y después se agregaron 13 mi de agua. La solución resultante fue extraída con 2 x 5 mi de hexano, después con 3 x 7 mi de diclorometano . Los extractos de diclorometano fueron combinados, lavados con 3 x 7 mi de agua, 7 mi de una solución fría de NaHC03 al 5% y otra vez con 7 mi de agua, secados en Na2S(¾ anhidro, y evaporados a 2.0-2.5 kPa. El residuo de la evaporación fue tratado con éter diisopropílico, filtrado y secado bajo presión reducida. Rendimiento 1.6 (74%), Rf (7) = 0.33-0.43 El espectro de masa FAB (663 [M+H]+) confirmó la estructura estimada. Paso 3: Sulfato de N-metil-D-ciclohexilglicil-L-acetidin-2-carbonil-L-arginina aldehido Se disolvieron 1.53 g (2.3 mM) de benciloxicarbonil-N-metil-D-ciclohexilglicil-acetidin-2-carbonil-NG-benciloxicarbonil-L-arginina aldehido (Ejemplo 4, Paso 2) en 23 mi de etanol y 4.8 mi de ácido sulfúrico 0.5 M, y después se agregó 0.15 g de catalizador Pd/C suspendido en 3.5 mi de agua y la mezcla fue hidrogenada a una temperatura de aproximadamente 10°C. El progreso de la reacción fue monitoreado por cromatografía en capa delgada. Después de terminar la reacción (aproximadamente 15 minutos) el catalizador fue filtrado y el resultado fue concentrado a aproximadamente 2-3 mi a 2.0-2.5 kPa. El residuo fue diluido con 50 mi de agua, extraído con 4 x 4 mi de diclorometano y la solución acuosa fue dejada para que reposara a una temperatura de 20-22°C durante 24 horas. La solución fue extraída con 3 x 4 mi de diclorometano otra vez y el pH fue ajustado a 3.5 con una resina de intercambio de iones Dowex AG 1-X8 (HO) , después la solución fue liofilizada. Rendimiento 1.02 g (90%), Rf (12) = 0.40. El espectro de masa FAB (395 [M+H]+, 548 [M+H+NBA] +) confirmó la estructura estimada. Síntesis de los materiales iniciales:
Ácido benciloxicarbonil-N-metil-D-ciclohexilglicil-L-acetidin-2-carboxilico Paso A: Síntesis de éster 2, 4, 5-triclorofenílico de benciloxicarbonil-D-ciclohexilglicina A una suspensión agitada de 5.42 g (20 mM) de sal de trifluoroacetato de D-ciclohexilglicina y 5.6 mi (40 mM) de trietilamina en 50 mi de dimetilformamida, se agregaron 8.8 g (22 mM) de carbonato de bencil-pentaclorofenilo [Anteunis y colaboradores: Bul. Soc. Chim. Belg. 96, 775 (1987)] y 6.16 mi (44 mM) de trietilamina. Después de 3 horas de agitación, la mezcla de la reacción fue evaporada bajo presión reducida, el residuo fue disuelto en 60 mi de éter dietílico y 60 mi de agua. Las fases fueron separadas, la fase orgánica fue lavada con agua y las fases acuosas combinadas fueron lavadas con éter dietílico, acidificadas con KHS04 1 M hasta alcanzar el pH 3, y después extraídas con 3 x 30 mi de acetato de etilo. La fase orgánica fue lavada con agua hasta neutro, secada en a2S04 anhidro, y evaporada a 2.0-2.5 kPa, El residuo de la evaporación es benciloxicarbonil-D-ciclohexilglicina que fue disuelto en 20 mi de tetrahidrofurano y 4.54 g (22 mM) de 2, , 5-tricloro-fenol y 4.54 g (22 mM) de diciclohexilcarbodiimida combinados. Tres horas después, la mezcla de la reacción fue filtrada, el filtrado y los lavados fueron combinados y evaporados bajo presión reducida. El residuo sólido fue purificado por cromatografía en columna en gel de sílice utilizando 140 g de Kieselgel 60 (0.040-0.063 mm) como adsorbente y una mezcla 95:5 de cloroformo y acetona como eluyente. Las fracciones que contenían solamente el producto puro [Rf (5) = 0.7-0.8] fueron combinadas y evaporadas a 2.0-2.5 kPa. El residuo aceitoso fue triturado con éter dietílico, filtrado, lavado con éter dietílico y secado. Rendimiento, 8.34 g (88.5%) de éster 2, 4, 5-triclorofenílico de benciloxicarbonil-D-ciclohexilglicina puro. Paso B: Síntesis de ácido benciloxicarbonil-N-metil-D-ciclohexilglicil-L-acetidin-2-carboxílico Se agregaron ácido L-acetidin-2-carboxílico (1.01 g, 10 mM) y trietilamina (1.4 mi, 10 mM) a una solución de éster 2,4,5-triclorofenílico de benciloxicarbonil-D-ciclohexilglicina (5.18 g, 11 mM, del Ejemplo 4, Paso A) en 10 mi de piridina. Después de agitar durante la noche, la mezcla de la reacción fue evaporada bajo presión reducida y el residuo fue disuelto en 50 mi de NaHCÜ3 al 5% y 50 mi de éter dietílico. La fase orgánica fue lavada con agua y las fases acuosas combinadas fueron lavadas con éter dietílico, acidificadas con KESO4 1 M a pH 3 y después extraídas con 3 x 50 mi de acetato de etilo. Los extractos de acetato de etilo fueron combinados, lavados con agua hasta alcanzar un carácter neutro, secados en Na2S04 anhidro, y evaporados a 2.0-2.5 kPa. El residuo de evaporación es ácido benc.i.loxicarboni.l-D-ciclohexilglicil-L-acetidin-2-carboxílico que fue disuelto en 10 mi de tetrahidrofurano y combinado con 5.0 mi (80 mM) de yodometano y enfriado a 0°C. A esta solución, se agregaron 1.2 g (30 mM) de hidruro de sodio al 60% y la mezcla de la reacción fue agitada a temperatura ambiente durante la noche. El exceso de hidruro de sodio fue sometido a descomposición mediante adición cautelosa de 0.4 mi de agua. La mezcla de la reacción apagada fue concentrada a aproximadamente 10 mi bajo presión reducida a una temperatura inferior a 30°C. El residuo fue diluido con 15 mi de agua y 10 mi de éter metílico de t-butilo. Las fases fueron separadas, y la fase acuosa fue lavada otra vez con 10 mi de éter metílico de t-butilo. La fase acuosa de producto fue combinada con 15 mi de acetato de etilo y ajustada a pH 2.2 con una solución de ácido sulfúrico 3M. Las fases fueron separadas, y la fase acuosa fue retroextraida con 10 mi de acetato de etilo. La fase orgánica combinada fue lavada con 15 mi de una solución al 15% de tiosulfato de sodio. Las fases fueron separadas y la fase orgánica fue evaporada bajo presión a una temperatura inferior a 40°C. El residuo aceitoso es 3.75 g de ácido benciloxicarbonil-N-metil-D-ciclohexilglicil-L-acetidin-2-carboxílico (9.65 mM, Rf (7) = 0.85-0.95), que fue disuelto en 9.65 mi de tetrahidrofurano y conservado para su uso en el Paso 1 del Ejemplo 4. El espectro de masa FAB (403 [M+H]+) confirmó la estructura estimada. Ejemplo 5 Inhibición de coagulación por peptidil arginales El efecto inhibidor sobre la coagulación del plasma fue evaluado en ensayo de tiempo de trombina (TT) , tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT) y tiempo de protrombina (PT) mediante la utilización de plasma humano citrado como sustrato [Bagdy, D. y colaboradores: Thromb. Haemostas. 67, 325 (1992)]. El ensayo de TT mide la inhibición de un solo paso, la coagulación de fibrinógeno sobre la acción de trombina exógena (concentración final 2.5 NIH U/ml) . La coagulación de plasma en los ensayos de APPT y PT fue inducida por recalcificación. La trombina endógena generada pudo teóricamente estar presente en la concentración final de hasta 50 NIH U/ml (APTT, PT) . Estos ensayos detectan la suma de las acciones inhibidoras sobre formación de fibrina y generación de trombina, que incluye varias reacciones proteoliticas mediadas ya sea por trombina o por otras enzimas, por ejemplo fXa. La actividad anticoagulación es expresada en CT2, que es la concentración (nM) que se requiere para duplicar el tiempo de coagulación. TABLA 1 Actividades inhibidoras de los compuestos de la fórmula (I) de la invención (1-4), el compuesto de origen, Efegatran (C) y peptidil arginales relacionadas adicionales (Cl, C2) sobre la coagulación del plasma (Columna A) , trombina unida en coágulos y factor Xa (columna B) y enzimas fibrinoliticas (Columna C) Peptidil arginales : A B Xaa-Xbb-Arg-Ha CT2 (nM)b ICS0 (nM)
No Xaa-Xbb TT APT PT Trombos Factor T n Xa
1 Eoc-D-cHpa- 147 331 1839 103 118 Pro 2 N-Me-D-cHpa- 118 315 876 93 102 Pro 3 D-cHla-Pro 86 281 1082 95 117
4 N-Me-D-Chg- 101 622 2915 245 457 Aze
D-MePhe-Pro 87 622 2915 375 1000
Cl D-cHga-Pro 120 333 1254 524 200
C2 Eoc-D-Cba-Pro 114 349 1148 390 702 TABLA 1 (continuación... ) Peptidil arginales: C Xaa-Xbb-Arg-Ha LA50, ]MC No Xaa-Xbb PL tPA UK T 1 Eoc-D-cHpa- 18 10 14 Pro N-Me-D-cHpa- 16 14 18 Pro D-cHla-Pro 21 10 85 N-Me-D-Chg- 32 12 16 Aze
D-MePhe-Pro 54 132 82
Cl D-cHga-Pro 83 74 120 C2 Eoc-D-Cba-Pro 27 27 120 a Abreviaturas. Eoc = etoxicarbonilo; cHpa = clcloheptilalanil; cHla = cicloheptillactilo; MePhe = N-metilfenilalanil; cHga = ciclo eptilglicolilo; Chg = ciclohexilglicilo . b CT2 = concentración requerida para duplicar los tiempos de coagulación en los ensayos de TT (tiempo de trombina) , APTT (tiempo de tromboplastina parcial activada) , y PT (tiempo de protrombina) . c LA50 = concentración requerida para la reducción del área lisada al 50% del control en el ensayo de placa de fibrina; PL = plasmina, tPA = activador de plasminógeno tisular, UK = uroquinasa. Varios de estos compuestos fueron superiores a Efegatran (C, D-MePhe-Pro-Arg-H, el péptido arginal de origen) en cuanto a su capacidad de prolongar el tiempo de coagulación (véase Tabla 1) . La columna A de la Tabla 1 presenta las actividades anticoagulantes de los compuestos de la fórmula (I) de la invención (1-4) en comparación con las actividades de Efegatran (C) , un anticoagulante conocido [Bajusz, S. y colaboradores: J. Med. Chem. 33, 1729 (1990); Patente norteamericana No. 4,703,036 (1982); Badgy, D. y colaboradores: Thromb. Haemostas. 61_, 357 y 68, 125 (1992); Jackson, C.V. y colaboradores: Clin. Appl. Thrombosis/Hemostasis 2, 258 (1996)] y peptidil arginales relacionados adicionales (por ejemplo Cl y C2) [Bajusz y colaboradores: Bioorg. & Med. Chem. 3^ 1079 (1995); Patente norteamericana No. 6,121,241 (2000); PCT publicación No. WO 97/46576] . El ensayo de TT muestra que los nuevos análogos son estrechamente tan eficaces como Efegatran para inhibir la reacción trombina-fibrinógeno. El ensayo APTT, por otra parte, indica que los nuevos péptidos son más eficaces que Efegatran para inhibir los pasos de coagulación de generación de trombina precedentes . Ej emplo 6 Inhibición de trombina y factor Xa La inhibición enzimática fue examinada en coágulos de plasma ricos en plaquetas mediante la utilización de sustratos cromogénicos, es decir, Tos-Gly-Pro-Arg-pNA (SI) para trombina y Moc-D-Chg-Gly-Arg-pNA (S2) para factor Xa, de conformidad con lo publicado (Bajusz, S. y colaboradores: PCT Pub. No. O 07/46576) de manera resumida. Los ensayos fueron efectuados a temperatura ambiente en tubo de vidrio y placas de microtitulación de 96 pozos. Soluciones . (i) Amortiguador A: fosfato de sodio 0.1 M/NaCl 0.05 (pH 8.5). (ii) Inhibidores: Soluciones 0.1, 1.0 y 10 mg/ml en amortiguador A que contiene albúmina humana 0.02%. (iii) Sustratos: 1 mM de SI y 2 mM de S2 en agua destilada.
(b) Preparación de coágulos de plasma. Muestras de plasma rico en plaquetas (200 µ?) colocadas en tubos de vidrio fueron incubadas a temperatura ambiente con 80 µ? de CaCl2 40 mM durante 60 minutos. Los coágulos fueron lavados con alícuotas de 2 mi de solución salina (NaCl al 0.9%) con agitación suave para remover las enzimas no unidas . En caso de lavado exitoso, la densidad óptica de la mezcla de la reacción de lavado y SI es inferior que 5% del control. El coágulo de plasma obtenido de esta manera fue conservado en solución salina en el tubo hasta su uso. (c) Evaluación de la inhibición enzimática en los coágulos. Después de la remoción de la solución salina, el coágulo de plasma fue incubado a una temperatura de 37°C con 400 µ? de inhibidor (o bien amortiguador A como control negativo) durante 5 minutos, y con 100 µ? de sustrato SI ó S3 durante 30 minutos, después la reacción fue detenida con 100 µ? de ácido acético al 50%. Porciones de 150 µ? de las mezclas de la reacción fueron colocadas en los pozos de una placa de microtitulación y leídas a 405 nm (ELISA READER 800, Bio-Tek Instruments Inc. Winooski, VT, EUA) . Valores IC50 fueron generados gráficamente a partir de datos de extinción. Los resultados se muestran en la Columna B de la Tabla 1. Los compuestos 1, 2, 3 y 4 son los únicos análogos que pueden superar Efegatran en la inhibición de la trombina unida en coágulo pero, en la inhibición del factor Xa unido en coágulo, cada uno de los análogos es mejor que Efegatran. Por consiguiente 1, 2, 3, y 4 son más inhibidores para ambas enzimas unidas en coágulos. Ej emplo 7 Actividad anti-fibrinolítica Los efectos inhibidores de los compuestos de la invención sobre la plasmina (PL) y generación de plasmina por activadores de plasminógeno (Plogen) , como por ejemplo activador de plasminógeno tisular (tPA) , y uroquinasa (UK) , fueron examinados a través del ensayo de placa de fibrina. (Véase, por ejemplo, Bagdy, D., Barabás, E., Bajusz, S. y Szell, E., Thromb. Haemostas., 67: 325-330 (1992); Barabás, E. Szell, E. y Bajusz, S. Blood Coagulation and Fibrinolysis [Coagulación Sanguínea y Fibrinólisis] , 4: 243 (1993)). Los resultados se muestran en la Tabla 1, Columna C. Con algunas excepciones, los análogos son relativamente más inhibidores que Efegatran contra las tres enzimas fibrinolíticas . Las excepciones son Cl contra PL, y Cl, C2 contra UK, mientras que 3 es casi equi-activo con Efegatran contra UK. Ejemplo 8 Modelo de conejo para coagulación intravascular diseminada Los compuestos 1 y 3 de la presente invención y los demás peptidil arginales de la Tabla 1 asi como C3 fueron investigados para su actividad inhibidora de DIC en conejos tratados con endotoxina (lipopolisacárido, LPS) , de conformidad con lo descrito [Scherer, M. U. y colaboradores: Lab. Anim. Sel., 45, (1995)]. El procedimiento de ensayo duró 4 horas. La endotoxina fue administrada en dosis de 80 y 40 µg/kg en inyección de bolos i.v. a 0 y 120 minutos, respectivamente, mientras que los peptidil arginales 1, 3 y C-C3 (0.25 y/o 0.5 mg/kg/h) fueron infusados durante todo el experimento. Un grupo de control de animales fue tratado con solución salina al 0.9%. Parámetros hemostáticos fueron determinados a 0, 120 y 240 minutos. A pesar del tratamiento cuidadoso, se observó una letalidad en el 31%, muy probablemente debido a la alta sensibilidad de los conejos a la endotoxina [Semerano, N. y colaboradores: Int. J. Clin. Lab. Res. 21, 214 (1992)]. TifflLA 2 Efecto de compuestos 1 y 3 de la invención, el compuesto de origen Efegatran (C) , arginales adicionales (Cl y C2) y heparina (H) sobre la letalidad de conejos tratados con endotoxinas Letalidad No . de animales muertos/tratados y %
Agentes3 2 horas 4 horas No. g. ? No. "5 Salsol (NaCl 0.9%) 0/10 0 0/10 0 Endotoxina 0/13 0 4/13 31
+ 1, 0.5 mg/kg/h 0/12 0 2/12 17
+ 1, 0.25 mg/kg/h 0/19 0 3/19 16
+ 3, 0.25 mg/kg/h 0/22 0 4/22 18
+ C, 0.5 mg/kg/h 1/15 7 6/15 40
+ C, 0.25 mg/kg/h 1/14 7 5/14 36
+ Cl, 0.5 mg/kg/h 0/16 0 5/16 31
+ C2, 0.5 mg/kg/h 0/12 0 5/12 42
+ C3, 0.5 mg/kg/h 1/18 6 10/18 56
+ H, 100 U/kg/h 0/19 0 7/19 37
+ H, 50 U/kg/h 0/17 0 6/17 35
a Véase Tabla 1 para las estructuras de los peptidil arginales 1, 3, C, Cl y C2, C3 = hPla-Pro-Arg-H en donde hPla = ácido 2-hidroxi-4-fenil-butirico . Como lo muestran los datos de la Tabla 2, los compuestos 1 y 3 reducen significativamente la letalidad de conejos tratados con endotoxina, mientras que los demás anticoagulantes no tienen ningún efecto sobre la letalidad (Cl) o bien causan un cierto incremento de la letalidad, el valor más alto, ~1.8 veces, se obtiene con C3. Vale la pena observar a partir de los datos de la Tabla 1 que en cuanto a la reducción de letalidad 1 y 3 son más inhibidores contra la trombina unida en coágulo asi como factor Xa, e inhiben también eficientemente tanto la coagulación plasmática como las enzimas fibrinoliticas, plasmina y activadores de plasminógeno . Ejemplo 9 Modelo de rata para la coagulación intravascular diseminada Entre las consecuencias más serias de DIC se encuentran depósito de fibrina en varios órganos, cambios de células sanguíneas, por ejemplo reducción de número de plaquetas, y cambios en cuanto a los productos de degradación de fibrina. Los efectos del compuesto 1 de la invención y dos anticoagulantes de control, Efegatran (C) y heparina (H) sobre tales fenómenos fueron examinados en ratas tratadas con endotoxina [Ford, A. J. y Longridge, D. J. : Br. J. Pharmacol. 110, Suppl . 131P (1993); Hasegawa, N. ; y colaboradores: Am. J. Respectivamente. Crit. Care Med. 153, (1996); Dichneite, G. y colaboradores: Thromb. Res.22' 357 (1995)]. Ratas machos fueron tratadas con una inyección de bolo i.v. de 10 mg/kg de endotoxina. Esta inyección fue seguida por una infusión i.v. de solución salina o de los compuestos de prueba durante 4 horas. Entre los compuestos 1 y 3 , se administró 0.25 mg/kg como una inyección de bolo inicial seguido por una infusión de 0.25 mg/kg/h i.v. durante 4 horas. Heparina (H) fue aplicada similarmente, 50 Ul/kg como inyección de bolo inicial seguido por una infusión de UI/kg/h i.v. durante 4 horas. Un grupo de animales de control fue tratado con solución salina al 0.9%. El depósito de 12üI-fibrina fue investigado en órganos seleccionados (hígado y riñon) . 125I-fibrinógeno fue inyectado 30 minutos antes de la inyección de endotoxina. Las radioactividades en las muestras de tejido fueron medidas en un contador gamma (Wallac Wizard 1470) . La formación de microtrombos en los órganos fue evaluada empleando la proporción entre actividad 12oI en el órgano y actividad de 125I total inyectado, que se define como el índice de microtrombos . Los cambios en cuanto estos parámetros se expresan en porcentaje en comparación con el grupo salino. El número de conteo de plaquetas fue determinado en un dispositivo automático (Sysmex F-800) y se relacionó con valores de control. Se determinó FDP (productos de degradación de fibrina) por ensayo de precipitación Aggristin (Ristocetin) . Los animales fueron sacrificados cuatro horas después de la administración de endotoxina.
Los hallazgos se resumen en la Tabla 3. TABLA 3 Efectos del compuesto 1 de la presente invención, el péptido de origen, Efegatran (C) , y heparina (H) sobre el depósito de 125I-fibrina y sobre cambios en cuanto a conteo de plaquetas y productos de degradación de fibrina (FDP) en ratas tratadas con endotoxina. Deposición de 125I-fibrina Agentes Hígado Riñon Endotoxina, 10 mg/kga 36% 36% + 1, 0.25 mg/kg/hb 13% 26%
+ C, 0.25 mg/kg/hb 30% 33% + H, 50 NIH U/kg/hfc 22% 28%
Tabla 3 (Continuación. ) Cambio en conteo Cambio en de plaquetas FDP Agentes Endotoxina, 10 mg/kga 62% 2.56 + 1, 0.25 mg/kg/hb 48% 1.66
+ C, 0.25 mg/kg/hfa 52% 1.94 + H, 50 NIH U/kg/hb 43% 2.37 a Inyección de bolo I.V. b Inyección de bolo I.V. + infusión I.V. Los datos de la Tabla 3 indican que el potencial inhibidor de DIC de 1 fue más pronunciado que el potencial inhibidor de DIC ya sea de heparina o de Efegatran Ejemplo 10 Examen de la supervivencia en un modelo de rata para coagulación intravascular diseminada Ratas del sexo masculino fueron tratadas con un bolo i.v. de 30 mg/kg LPS (endotoxina) . Péptidos en dosis de 0.5 y/o 0.75, 1.0 y 1.5 mg/kg fuero administrados en forma de un inyección de bolo inicial seguido por la infusión durante 8 horas inmediatamente después de la administración de LPS . La mortalidad fue registrada 4, 5, 6, ?, 8 horas después de LPS. Los datos de la Tabla 4 indican que el tratamiento con LPS redujo la tasa de supervivencia de las ratas en 20% al final del experimento (8 horas) . Todos los nuevos peptidil arginales investigados prolongaron el tiempo de supervivencia y redujeron la mortalidad en comparación con el grupo LPS. Los compuestos 1, 2, 3 y 4 fueron más eficaces que el compuesto de referencia C. TABLA 4 Efectos de los compuestos 1, 2, 3 y 4 de la presente invención y del compuesto de origen C sobre la letalidad de ratas tratadas con LPS Tiempo Tasa de supervivencia % (horas) Control C, mg/g 1, mg/kg 0 0.75 1.0 1.5 0.75 1.0 1.5
0 100 100 100 100 100 100 100 4 76 93 83 100 100 100 100
5 72 73 83 100 100 100 100
6 37 67 66 100 100 100 100
7 24 33 58 92 90 90 100
8 20 27 50 92 70 90 100 Tabla 4 (continuación...) Tiempo Tasa de supervivencia % (horas) 2, mg/g 3, mg/kg 0.75 1.0 1.5 0.75 1.0 1.5 0 100 100 100 100 100 100 4 86 100 100 100 100 100 5 78 100 100 100 100 100 6 57 100 100 100 100 100 7 57 90 100 100 100 100 8 50 90 100 80 92 92 Tabla 4 (continuación...) Tiempo Tasa de supervivencia % (horas) 4, mg/g 0.75 1.0 1.5 0 100 100 100 4 93 100 100 5 87 100 100 6 87 100 100 7 87 92 100 8 80 85 100 Ratas de sexo masculino fueron tratadas con un bolo i.v. de 30 mg/kg de LPS. Los compuestos de prueba fueron administrados como un bolo inicial seguido por una infusión i.v. durante 8 horas inmediatamente después de la administración de LPS. La mortalidad fue registrada 4, 5, 6, 7 y 8 horas después de LPS.
Claims (1)
- REIVINDICACIONES Un compuesto que tiene la fórmula (I) Xaa-Xbb-Arg-H (I ) en donde Xaa representa un residuo de ácido carbónico sustituido en posición alfa de la fórmula (II) Q-CH(R)-CO (II) en donde Q representa un grupo alquiloxicarbonilamino de 1-3 átomos de carbono, un grupo metilamino, un grupo hidroxilo, y R representa un grupo cicloalquilmetilo de 7-9 átomos de carbono, un grupo 1-adamantilmetilo, o un grupo cicloalquilo de 5-7 átomos de carbono, y Xbb representa una L-prolina o un residuo de ácido L-acetidin-2-carboxilico, y las sales de adición de ácido del mismo formadas con ácido orgánico o inorgánico. Un compuesto que tiene la estructura 1 : y las sales de adición de ácido del mismo. Un compuesto que tiene la estructura 2 : y las sales de adición de ácido del mismo, 4. Un compuesto que tiene la estructura 3: y las sales de adición de ácido del mismo. Un compuesto que tiene la estructura 4: y las sales de adición de ácido del mismo. 6. Una formulación farmacéutica que comprende un compuesto de conformidad con la reivindicación 1. 7. Una formulación farmacéutica que comprende un compuesto de conformidad con la reivindicación 2. 8. Una formulación farmacéutica que comprende un compuesto de conformidad con la reivindicación 3. 9. Una formulación farmacéutica que comprende un compuesto de conformidad con la reivindicación 4. 10 -Una formulación farmacéutica que comprende un compuesto de conformidad con la reivindicación 5. 11 -El compuesto etoxicarbonil-D-cicloheptilalanil-L- prolil-ls^-benciloxicarbonil-L-arginina aldehido . 12 -El compuesto tetrahidropiranil-D-cicloheptil-lactil-L- prolil-NG-benciloxicarbonil-L-arginina aldehido . 13.El compuesto benciloxicarbonil-N-metil-D-cicloheptil- alanil-L-prolil-Ií -benciloxicarbonil-L-arginina aldehido . 14. El compuesto N-metil-D-ciclohexilglicil-L-acetidin-2- carbonil-L-arginina aldehido. 15. La formulación farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 6-10 en donde dicha formulación comprende una tableta, cápsula, polvo, pildora, gragea, granulo, solución, infusión, supositorio, emplasto o ungüento . 16.Un método para el tratamiento de un paciente que tiene coagulación intravascular diseminada, el método comprende la administración al paciente de un peptidil arginal que tiene una acción inhibidora sobre la trombina unida en coágulo, factor Xa, plasmina y activadores de plasminógeno. Un método para el tratamiento de un paciente que tiene coagulación intravascular diseminada, el método comprende la administración a un paciente de un peptidil arginal que tiene la fórmula (I) Xaa-Xbb-Arg-H (I) en donde Xaa representa un residuo de ácido carbónico sustituido en posición alfa de la fórmula (II) Q-CH(R)-CO (II) en donde Q representa un grupo alquiloxicarbonilamino de 1-3 átomos de carbono, un grupo metilamino o un grupo hidroxilo y R representa un grupo cicloalquilmetilo de 6-9 átomos de carbono, un grupo 1-adamantilmetilo, o un grupo cicloalquilo de 5-7 átomos de carbono y Xbb representa una L-prolina o un residuo de ácido L-acetidin-2-carboxilico, o sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables del mismo. .Un método para el tratamiento de un paciente que tiene coagulación intravascular diseminada, el método comprende la administración al paciente de un peptidil arginal que tiene la estructura 1: o sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables del mismo. 19.Un método para el tratamiento de un paciente que tiene coagulación intravascular diseminada, el método comprende la administración al paciente de un peptidil arginal que tiene la estructura 2: o sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables del mismo. 20. Un método para el tratamiento de un paciente que tiene coagulación intravascular diseminada, el método comprende la administración al paciente de un peptidil arginal que tiene la estructura 3: o sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables del mismo. 21.Un método para el tratamiento de un paciente que tiene coagulación intravascular . diseminada, el método comprende la administración al paciente de un peptidil arginal que tiene la estructura 4: o sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables del mismo. 22. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el paciente recibe de aproximadamente 0.1 mg a aproximadamente 50 g/kg de un peptidil arginal con base en el peso corporal del paciente. 23. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el paciente recibe un peptidil arginal en una dosificación suficiente para lograr un nivel sanguíneo de peptidil arginales de aproximadamente 6 uM a aproximadamente 100 uM. El método de conformidad con las reivindicaciones 7 u 8, en donde la administración de peptidil arginal es simultánea o secuencial.
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