MXPA03007672A

MXPA03007672A - Metodo para mejorar la funcion de crecimiento de un animal.

Info

Publication number: MXPA03007672A
Application number: MXPA03007672A
Authority: MX
Inventors: Elizabeth Andrew Marion
Original assignee: Univ Sydney
Priority date: 2001-02-26
Filing date: 2002-02-26
Publication date: 2004-11-12
Also published as: US20040170601A1; PL370310A1; WO2002067979A1; EP1372699A1; BR0207585A; EP1372699A4; CA2439116A1; JP2004528026A

Abstract

Un metodo y composiciones para mejorar la funcion de crecimiento de un animal mediante la administracion de una citocina o fragmento biologicamente activo, opcionalmente con un antibiotico. La citocina o fragmento activo se puede administrar como se codifica por una secuencia adecuada de acido nucleico.

Description

MÉTODO PARA MEJORAR LA FUNCIÓN DE CRECIMIENTO DE UN ANIMAL Campo de la Invención La invención se refiere en general a un método para mejorar la función de crecimiento de un animal. En particular, la presente invención se refiere a un método para mejorar la función de crecimiento de un animal, el cual comprende el paso de administrar a un animal, en necesidad del mismo, una cantidad promotora de crecimiento de una o más citocinas o fragmentos biológicamente activos de las mismas. Antecedentes de la Invención Con una demanda mundial de alimento en continuo aumento, existe apremio constante por incrementar la velocidad de producción de alimento. Un objetivo de la cría de animales domésticos es producir animales para el consumo que cumplan de forma consistente con las normas industriales especificadas con un mínimo gasto comercial . Para lograr este objetivo, el ambiente de la cría de animales domésticos debe ser tal que las condiciones proporcionadas en el mismo estén inclinadas hacia el logro de una función aceptable de crecimiento. En otras palabras, las condiciones deben ser suficientes para permitir una velocidad aceptable de crecimiento (la velocidad de ganancia unitaria en el peso en vivo) , eficiencia aceptable del uso del alimento (la cantidad de alimento requerido por ganancia EF: 149869 unitaria en el peso en vivo) y un peso final aceptable, de modo que a la matanza, cada animal muerto se caracterice por un peso aliñado y contenido de grasa que cumplen con una norma industrial específica. En los años anteriores a 1950, los investigadores descubrieron de manera inesperada que un ingrediente de antibiótico en la masa del pollo era un "factor de crecimiento" . El hallazgo cambió drásticamente las industrias granadera y avícola; y fue un beneficio económico para las compañías farmacéuticas. Los animales para consumo ahora se crían bajo condiciones altamente controladas y reciben alimento especializado con una variedad de aditivos promotores del crecimiento. La administración rutinaria de antibióticos a los animales ha llegado a ser casi universal desde el descubrimiento que la adición de pequeñas cantidades de antibióticos, tal como penicilina, tetraciclina y sulfametasina, al alimento para animales incrementa el crecimiento de cerdos y vacas. En 1979, cerca de 70% del ganado de engorde y terneras, del 90% del ganado porcino, y virtualmente 100% de los pollos tiernos para asar, criados en los Estados Unidos de América consumieron antibióticos como parte de su alimento diario. Este uso, que da cuenta de casi 40% de los antibióticos vendidos en los Estados Unidos de América, se estima que ahorra a los consumidores $3.5 billones de dólares en costos de alimento en un año. Los animales criados bajo condiciones modernas, optimizadas para la promoción de crecimiento, reciben raciones que contienen altas proporciones de proteína, usualmente en la forma de soya o harina de semilla de algodón (la carne y hueso o harina de sangre se usan de forma extensa en Australia) , y altos porcentajes de granos tal como maíz o milo, un tipo de sorgo (trigo o cebada en Australia) . Los aditivos alimenticios que se han usado incluyen hormonas tal como dietil-estilbesterol, que también incrementa la velocidad de ganancia de peso y tranquilizadores (no usados extensamente en cerdos) , que impide que los efectos de la tensión provocada por las condiciones de confinamiento provoquen enfermedad o pérdida de peso. El ganado requiere ordinariamente 5 kilogramos de alimento para producir 1 kilogramo de ganancia de peso. Bajo condiciones óptimas de promoción de crecimiento, y con alimento enriquecido, ganan 1 kilogramo con sólo 3 kilogramos de alimento. Aunque las hormonas y antibióticos han incrementado enormemente la velocidad de crecimiento de los animales para consumo, el uso de esos aditivos no ha estado libre de problemas . Una de las hormonas que se usa comúnmente como un estimulante de crecimiento, el dietil-estilbesterol o DES, se ha mostrado que es un carcinógeno y se ha prohibido su uso adicional en la mayoría de los países. Cuando se mezclan antibióticos en alimento para animales, los compuestos se esparcen completamente en el ambiente exponiendo los microorganismos a los antibióticos. La exposición constante de los microorganismos a los antibióticos pone presión biológica en los microorganismos para desarrollar una resistencia a los antibióticos. Esto puede dar por resultado que un microorganismo sea resistente a los antibióticos y hace especialmente severo y difícil tratar las infecciones. Un microorganismo resistente a antibióticos es potencialmente un patógeno serio debido a que es difícil controlarlo. Si el organismo provoca una infección en un animal o en el hombre, la infección no se puede controlar con antibióticos convencionales. Si la infección es seria, no hay momento para determinar que antibióticos son efectivos contra las bacterias de infección. El problema ha sido especialmente serio cuando se consumen por la gente organismos resistentes a antibióticos, quienes por sí mismos toman antibióticos para tratar enfermedades. Los antibióticos inhiben muchos de los microorganismos normales en los aparatos respiratorio y gastrointestinal. Esto permite que los organismos resistentes proliferen rápidamente y produzcan una enfermedad más seria. La combinación de organismos resistentes a antibióticos del alimento y el tratamiento inefectivo con antibióticos de las personas ha provocado la mayoría de las muertes debidas a la intoxicación del alimento por salmonela, informadas en los Estados Unidos de América en los últimos años . Como resultado de la aparición creciente de bacterias resistentes a antibióticos en los lotes de alimentos y varias epidemias serias provocadas por bacterias resistentes a antibióticos, existe un creciente apremio gubernamental para prohibir el uso de antibióticos en el alimento para animales. En realidad, la Organización Mundial de la Salud y el Gobierno Australiano han especificado la necesidad de usar métodos alternativos ambientalmente amigables para controlar la infección. La prohibición o retiro inminente de varios antibióticos del alimento del ganado y del agua probablemente va a (i) incrementar la incidencia de infección en los animales y reducir, en consecuencia, la función de crecimiento; (ii) reducir adicionalmente la salud, fertilidad y función reproductora de los animales. En consecuencia, existe una necesidad inmediata y creciente de nuevos estimuladores de crecimiento seguros y efectivos para los animales de consumo, así como una reducción en la enfermedad al mejorar la salud. Se han empleado varios intentos en la promoción de crecimiento de animales en el uso de antibióticos, muchos que usan medios elaborados y tortuosos . Estos han incluido implantes subcutáneos de hormonas o sales complejas que tienen cationes que se elaboran de complejos (ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 6,197,815; patente de los Estados Unidos No. 3,991,750; patente de los Estados Unidos No. 4,067,994). Ninguno de estos intentos ha probado ser simple o efectivo. Por consiguiente, existe aun una necesidad de un método para mejorar la función de crecimiento de los animales, sin que dependa del uso de antibióticos o de una metodología elaborada. El solicitante ahora ha encontrado, de forma sorprendente, que la administración- de ciertas citocinas y en particular de interleucinas, incrementa la función de crecimiento de los animales, en tanto que disminuye la cantidad requerida de antibióticos. En tanto que no se desea que se una a ninguna teoría partícula ni hipótesis, el solicitante considera que los incrementos en la función de crecimiento, observados en los animales a los cuales se les ha administrado citocinas, resultan de la interacción de cuatros efectos claves. Estos son : 1) . Efecto inmunomejorador; 2) . Efecto anti-parásito y anti-microbiano; 3) . Reducción de la tensión; y 4) . Efecto anti-inflamatorio . Cada uno de estos efectos, ya sea de forma individual o conjunta, tiene un impacto profundo en la salud y bienestar de los animales, que a su vez afecta la función de crecimiento de los animales, y de este modo, la calidad de la carne. Por ejemplo: 1. Efecto Inmunomejorador a) . Respuestas inmunitarias de TH1/TH2 Se presenta la interacción entre redes reguladoras de citocinas inmunitarias y los otros sistemas reguladores del cuerpo. Las respuestas inmunitarias a infecciones o antígenos pueden influenciarse entre si de forma aguda. La respuesta inmunitaria se puede generalizar por el tipo de respuesta de células T. Una respuesta del tipo auxiliar T 1 (TH1) está comprendida principalmente en la inmunidad mediada por células, en tanto que un patrón de respuesta de TH2 frecuentemente se asocia con inmunidad humoral . Los subconjuntos de células T tipo TH1 y TH2 se han implicado en la regulación de muchas respuestas inmunitarias definidas por patrones de citocinas . Las células TH2 expresan las citocinas, interleucina (IL)-4, IL-5, IL-10 e IL-13. La expresión de IL-3 es común tanto a células TH1 y TH2. Entre tanto, las células de TH1 expresan IL-2, IFN-gamma, y TNP-beta. Estas citocinas TH2 tienen influencia en el desarrollo de las células B y aumentan las respuestas humorales tal como la secreción de anticuerpos. Ambos tipos de células TH tienen influencia entre sí por las citocinas que segregan. Por ejemplo, las citocinas TH2 , tal como la IL-10, pueden d suprimir las funciones de TH1. También otras citocinas pueden tener influencia en el desarrollo de TH1 ó TH2 , tal como TGF-beta, conocido que regula descendentemente las respuestas de TH1. Las citocinas que regulan las respuestas de TH2 pueden tener influencia en los parámetros inmunitarios que resultan de la salud o productividad incrementadas . b) . Cambio de isotipo de anticuerpo Los anticuerpos se requieren para eliminar, o proteger contra, la infección. Las células B maduras se someten al proceso de cambio de la clase de anticuerpo después de la estimulación antigénica. Las células TH a través del contacto físico y las citocinas, referidas como factores de cambio, regulan el cambio de isotipo. Algunas de las citocinas que se conoce que están comprendidas en el cambio de isotipo, ya sea solas o en combinación, son IL-4, IL-5, TGF-beta, IL-1, IL-2, IL-6 e IL-13. La IL-4 e IL-5 tienen sinergia para mejorar las respuestas de IgGl. Por ejemplo, las respuestas óptimas de IgGl también requieren IL-2. La IL-1 puede mejorar la producción de IgA en la presencia de IL-5. El TGF-beta induce la producción de IgA. c) . Hematopoyesis La hematopoyesis es el proceso de la formación de células sanguíneas que incluyen las células sanguíneas rojas y las células inmunitarias (células sanguíneas blancas) . La médula ósea es la fuente principal de la generación post-natal de nuevas células sanguíneas. Se requieren factores de crecimiento hematopoyéticos para el mantenimiento de este proceso, para mantener las células madre hematopoyéticas , su proliferación, diferenciación y maduración en diferentes linajes críticos para el sistema inmunitario. Los factores de crecimiento hematopoyéticos incluyen varios factores de estimulación de colonias (tal como IL-3) , Epo, SCF, varias interleucinas (IL-1, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, IL-12) , LIF, TGF-beta, MlPl-alfa, TNF-alfa. Muchos de estos factores son multifuncionales . d) . Disfunción inmunitaria El potencial genético para la mayoría de los rasgos de producción se predetermina de nacimiento. Muchos factores (tensión, enfermedad, nutrición, inmunidad, etc.), determinan si se logra este potencial. El nivel y tipo de exposición a antígeno tiene influencia y establece una "predisposición" del sistema inmunitario. La mayoría de las respuestas inmunitarias se predisponen hacia un tipo que promueve la inmunidad contra bacterias o virus o un tipo que promueve la inmunidad contra muchos parásitos. En tanto que el genotipo de un animal puede tener influencia en esta predisposición, la experiencia anterior o del neonato a los antígenos y las infecciones puede ajustar la reactividad inmunitaria hacia uno u otro tipo. Esta predisposición se altera dependiendo de la exposición subsiguiente a antígenos. Los programas de reproducción basados en la selección para los datos de producción han aparecido a costa de y en perjuicio de la competencia o reactividad inmunitaria. Este cambio se ha exacerbado adicionalmente por el uso persistente de complementos antibióticos en el agua y alimento, que ha dado por resultado, presumiblemente, un potencial genético alterado para montar respuestas inmunitarias efectivas. e) Inmunidad de la mucosa Las áreas más pertinentes de infección en el ganado son los sitios de las mucosas, principalmente el tracto gastrointestinal y los pulmones. De esta manera, el sistema inmunitario de las mucosas es la primera línea de defensa contra patógenos y contra la enfermedad. Las citocinas, de forma notable la IL-5, IL-4, IL-6. e IL-10 juegan un papel significativo en la regulación y eficiencia de las respuestas inmunitarias en la mucosa. La IL-5 e IL-6 actúan en las sub-poblaciones Bl y B2 de linfocitos en el sistema inmunitario de las mucosas. Las deficiencias en ya sea la producción de IL-5 ó IL-6, o sus receptores da por resultado producción significativamente deteriorada de IgA, el isotipo de anticuerpo responsable de las respuestas protectoras en la mucosa. De manera similar, la IL-5, IL-6 y la quimiocina ???-1-alfa tienen la capacidad de incrementar la respuesta de IgA a las vacunas de la mucosa. La IL-4 tiene un papel inmunorregulador en los tejidos de la mucosa, principalmente al mejorar las respuestas de TH2, y de esta manera, al mejorar la producción de anticuerpos. La IL-4 se considera esencial ai desarrollo de respuestas inmunitarias de la mucosa en el pulmón, vía la implicación de las rutas de TH2. Tanto IL-4 como IL-5 operan al unísono en el pulmón, con la IL-4 que consigna a las células T sencillas a un fenotipo TH2 que en la activación subsiguiente segrega IL-5, dando por resultado acumulación de eosinófilos. Adicionalmente, la IL-4 y la IL-10 juegan un papel en la tolerancia de la mucosa, y de esta manera ayudan a regular y de calentar las respuestas tipo alérgico en el intestino y reducen la susceptibilidad de los animales a condiciones de inflamación crónica del intestino. La distribución de citocinas tal como IL-4, IL-5 e IL-10 puede mejorar la resistencia de los animales a los patógenos de la mucosa a un nivel sub-clínico, reduciendo de este modo los efectos perjudiciales de la enfermedad sub-clínica en el crecimiento y productividad del ganado. Al mejorar la inmunidad de la mucosa, también se pueden reducir el predominio de la enfermedad y los costos asociados de tratamiento y el uso profiláctico de antibióticos. 2. Efecto Anti-Parásito y Anti-Microbiano a) . Efecto anti-parásito Las respuestas inmunitarias adquiridas contra patógenos caen en general en uno de dos tipos, la mediada por células (TH1) o la mediada por anticuerpos (TH2) , y esto se controla por las citocinas . Las citocinas comprendidas en la respuesta de TH2 son objetivos terapéuticos atractivos, puesto que pueden proteger contra ectoparasitos y lombrices gastrointestinales y suprimen la inflamación inducida por las citocinas TH1. Las citocinas TH2 inducen eosinófilos, síntesis de IgE, y la producción de moco · que mejora la producción contra lombrices y otros parásitos intestinales. Por lo tanto, las citocinas, tal como IL-3, IL-4, IL-5, IL-6 y GM-CSF, que son importantes en el desarrollo de respuestas inmunitarias protectoras de la mucosa y son capaces de inducir eosinófilos, son candidatos potenciales en el control de infecciones parásitas . b) . Efectos anti-microbianos Las infecciones microbianas permanecen como un problema mundial en términos de impacto económico y salud, a pesar de los avances en nutrición, vacunas, productos químicos y antibióticos. La respuesta inmunitaria a los patógenos microbianos incorpora dos sistemas de reconocimiento. La primera línea de defensa es la inmunidad innata y esto se sigue, si se requiere, por la respuesta adaptable, resultante (respuestas de anticuerpos y mediada por células) . Las células tal como fagocitos llevan a cabo principalmente la respuesta inmunitaria innata. Las citocinas tal como IL-6, IL-15, IL-18 se elaboran por células innatas de manera temprana en la respuesta a la infección y otras citocinas regulan su desarrollo y función tal como G -CSF, G-CSF, SCF, IL-3, SCF, IL-6, IL-1, IL-4, IL-5. Estas citocinas pueden ser criticas a la detección temprana de patógenos y la dirección de respuestas inmunitarias protectoras, reduciendo de forma específica la duración y severidad de la infección así como el índice de nuevas infecciones especialmente por pre-tratamiento o tratamiento continuo con citocinas. 3. Reducción de tensión Muchas condiciones dentro de un ambiente comercial contribuyen a una reducción en la infección de alimento, velocidad de crecimiento y calidad del cuerpo. A pesar de los esfuerzos extensos de investigación para evaluar los mecanismos por los cuales los anti-estresantes afectan la función de muchas especies; los problemas antiguos dentro de las industrias ganaderas no se han aliviado. La tensión, particularmente la tensión temprana y sostenida, da como resultado disfunción inmunitaria, actividad Hipotalámica-Pituitaria-Adrenalcortical (HPA) y un desequilibrio de los productos químicos en el cerebro. Los sistemas nervioso e inmunitario se integran y forman una red neuroinmunitaria e interdependiente . La depresión, tensiones físicas o emocionales activan el sistema endocrino que altera la función inmunológica, que a su vez produce cambios fisiológicos y químicos en el cerebro. Las citocinas median las interacciones entre los sistemas inmunitario, endocrino y nervioso central . La tensión se creyó previamente que era inmunosupresora, y existe evidencia de soporte que la tensión induce un cambio en las respuestas inmunitarias de TH1/TH2 que dan por resultado desregulación inmunitaria en lugar de inmunosupresión . El potencial de las citocinas para afectar las rutas homeostáticas crea una necesidad de evaluar las actividades del sistema inmunitario. 4. Anti-Inflamación La inflamación crónica frecuentemente se ve en el ganado y se relaciona a activación inmunitaria accionada por infecciones persistentes y estímulos ambientales. La inflamación juega un papel importante en el inicio de las respuestas inmunitarias a la infección, sin embargo, la activación inmunitaria crónica, particularmente por infección persistente o carga microbiana, puede tener efectos perjudiciales en el crecimiento y en el desarrollo y puede reducir la efectividad de la vacunación. Las consecuencias de una activación inmunitaria excesiva incluyen la producción de citocinas inflamatorias, fiebre, falta de apetito, resorpción de aminoácidos del músculo y re-dirección de nutrientes alejados de la producción de carne. Las citocinas con función anti-inflamatoria pueden reducir la patología de la activación inmunitaria crónica. Esto puede incluir citocinas tal como IL-4 e IL-10. Sumario de la Invención En su aspecto más amplio, la presente invención proporciona un método para mejorar la función de crecimiento de un animal, que comprende el paso de administrar a un animal, en necesidad del mismo, una cantidad promotora de crecimiento de una o más citocinas o fragmentos biológicamente activos de las mismas. La presente invención también proporciona un método para mejorar la función de crecimiento de un animal, el cual comprende el paso de administrar a un animal, en necesidad del mismo, un compuesto o composición que incrementa o complementa los niveles endógenos de citocinas tal que se produce una cantidad promotora de crecimiento de una o más citocinas, en donde la función de crecimiento se mejora con relación a la función de crecimiento de un animal al cual no se le ha administrado el compuesto o la composición. De manera preferente, el compuesto o composición se administra antes de, junto con o subsiguiente a la administración de una cantidad promotora de crecimiento de una o más citocinas . La presente invención también proporciona un método para mejorar la función de crecimiento de un animal, el cual comprende el paso de administrar un animal en necesidad del mismo una composición que comprende una cítocina o fragmento biológicamente activo de la misma en unión con un antibiótico, opcionalmente en combinación con un portador farmacéutico, adyuvante o vehículo, en donde la composición logra un efecto sinérgico de promoción de crecimiento. De manera preferente, la citocina es cualquier citocina o combinación de citocina que es capaz de mejorar la función de crecimiento de un animal . De manera más preferente, la citocina incluye una o más de interleucina 1 (IL-1) , interleucina 2 (IL-2) , interleucina 3 (IL-3) , interleucina 4 (IL-4) , interleucina 5 (IL-5) , interleucina 6 (IL-6) , interleucina 7 (IL-7) , interleucina 10 (IL-10) , interleucina 11 (IL-11) , interleucina 12 (IL-12) , interleucina 13 (IL-13) , factor de estimulación de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CSF) , factor de estimulación de colonias de granulocitos (G-CSF) , factor de estimulación de colonias de. macrófagos (M-CSF) , eritropoyetina (Epo) , factor de células madre (SCF) , factor inhibidor de leucocitos (LIF) , factor-beta de crecimiento de tumor ( GFP) y factor-alfa de necrosis de tumor (TNFa) . De manera aun más preferente, la citocina se selecciona del grupo que consiste de interleucina 3 (IL-3) , interleucina 4 (IL-4) , interleucina 5 (IL-5) y factor de estimulación de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) . De manera más preferente, la citocina es ya sea interleucina 3 (IL-3) , interleucina 4 (IL-4) ó interleucina 5 (IL-5) . En una modalidad particular, una citocina se formula en una composición con una o más citocinas diferentes, portadores farmacéuticos, adyuvantes o vehículos y/o antibióticos. Cualquier portador farmacéutico conocido, adyuvante o vehículo se puede usar en tanto que no afecte de manera adversa los efectos promotores de crecimiento de la(s) citocina (s) . Por consiguiente, en un segundo aspecto, la presente invención proporciona una composición de promoción de crecimiento que comprende una o más citocinas o fragmentos biológicamente activos de las mismas y uno o más antibióticos. De manera preferente, la composición comprende una o más citocinas y un antibiótico. De manera más preferente, la composición . comprende una citocina, un antibiótico y un portador, adyuvante o vehículo farmacéutico. Las composiciones que comprenden antibióticos ayudan en la limitación de la carga microbiana en un animal, ayudando de este modo a la citocina a mejorar la función de crecimiento del animal . Los antibióticos particularmente preferidos son aquellos que ya están en uso en los ambientes convencionales de producción de animales. Sin embargo, en particular, el antibiótico preferido se selecciona a partir del grupo que consiste de amoxicilina, penicilina, procaína, ampicilina, cloxacilina, penicilina G, benzatina, benetamina, ceftiofur, cefalonio, cefuroxima, eritromicina, tilosina, tilmicosina, oleandomicina, citasamicina, lincomicina, espectinomicina, tetraciclina, oxitetraciclina, clortetraciclina, neomicina, apramicina, estreptomicina, avoparcina, dimetridazol , sulfonamidas (incluyendo trimetoprim y diaveridina) , bacitracina, virginiamicina, monensina, salinomicina, lasalocid, narasina y olaquindox o combinaciones de los mismos. De manera más preferente, el antibiótico es lincomicina, espectinocimina o amoxicilina. Dependiendo de la actividad de la citocina, la manera de administración, edad y peso corporal del animal, se pueden usar diferentes dosis de citocina. Bajo ciertas circunstancias, sin embargo pueden ser apropiadas mayores o menores dosis. La administración de la dosis se puede llevar a cabo ya sea por administración individual en la forma de una dosis unitaria individual o si no varias unidades de dosis más pequeñas y también por múltiples administraciones de dosis divididas a intervalos específicos. Sin embargo, se entenderá que el nivel específico de dosis para un animal particular dependerá de una variedad de factores que incluyen la actividad de la citocina especifica empleada, la edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, tiempo de administración y ruta de administración, velocidad de expresión y combinación de citocina o antibiótico. Sin embargo, en general, la ruta preferida de administración se selecciona del grupo que consiste de administración oral, tópica y parenteral. La administración parenteral incluye inyecciones subcutáneas, aerosol, inyección intravenosa, intramuscular, intratecal, técnicas de infusión o células encapsuladas . Las citocinas o composiciones de la invención también se pueden administrar como un aditivo al agua y/o alimento del animal. La función de crecimiento de un animal se puede determinar por cualquier medición conocida que incluye velocidad incrementada de crecimiento, eficiencia incrementada de uso de alimento, peso final incrementado, peso aliñado incrementado o _contenido disminuido de grasa. Además, se apreciará por aquellos expertos en la técnica que la función mejorada de crecimiento del animal puede resultar del inmunomejoramiento, o efecto anti-parásito o antimicrobiano, o efecto anti-inflamatorio o reducción de tensión. De manera más preferente, el inmunomejoramiento resultará de una respuesta inmunitaria de TH1/TH2 , cambio de isotipo de anticuerpo, hematopoyesis, mejora de función inmunitaria, inmunidad de la mucosa, efectos benéficos en procesos homeostáticos tal como apetito, procesos endocrinos o neural-endocrinos .

Se apreciará por aquellos expertos en la técnica que los métodos y composiciones descritas en la presente pueden ser útiles para cualquier animal para el cual sea un resultado deseable la mejora de la función de crecimiento. Sin embargo, la presente invención es particularmente útil para consumo, es decir aquellos animales que se crían rutinariamente en granja para la producción de carne. De manera preferente, el animal es un artiodáctilo superior o ave. Los artiodáctilos incluyen ganado vacuno, ganado porcino, ovejas, camellos, cabras y caballos. Las aves incluyen pollos, pavos, gansos y patos. De manera más preferente, la presente invención se refiere a animales seleccionados del grupo que consiste de vacas, cerdos, ovejas, camellos, cabras, caballos y pollos. De manera más preferente, los animales son vacas, cerdos u ovejas. En un tercer aspecto, la citocina se administra a un animal como una molécula de ácido nucleico que codifica para esta citocina, tal que en la expresión de la molécula de ácido nucleico en el animal se produce una cantidad promotora de crecimiento de la citocina. De esta manera, la presente invención proporciona un método para mejorar la función de crecimiento en un animal que comprende el paso de administrar a un animal en necesidad del mismo una molécula de ácido nucleico que codifica para una o más citocinas o fragmentos biológicamente activos de las mismas, en donde la expresión de la molécula de ácido nucleico produce una cantidad efectiva promotora de crecimiento de una o más citocinas. La molécula de ácido nucleico . puede ser ADN, ADNc, ARN o una molécula híbrida de las mismas. Se entenderá claramente que el término molécula de ácido nucleico abarca una molécula de longitud completa o un ~ fragmento biológicamente activo de la misma. De manera preferente, la molécula del ácido nucleico es una molécula de ADN que codifica para una interleucina. De manera más preferente, el ADN codifica para interleucina 3, interleucina 4 ó interleucina 5. La molécula de ácido nucleico puede integrarse en el genoma del animal, o "puede existir como un elemento extracromosómico . La molécula de ácido nucleico se puede administrar por cualquier método conocido; sin embargo, se inyecta de manera preferente de forma subcutánea, intravenosa o intramuscular o se administra como un aerosol . La cantidad de ácido nucleico que se administra dependerá de la ruta y sitio de administración así como de la citocina particular codificada por la molécula de ácido nucleico. Como se describe en la presente, la introducción de una cantidad de 200 µg de una molécula de ácido nucleico que codifica para una citocina es suficiente para mejorar la porción de crecimiento en un animal. De esta manera, de manera preferente, la cantidad de aproximadamente 200 g a 1000 g de una molécula de ácido nucleico que codifica para una citocina se introduce de manera preferente en un animal . La molécula de ácido nucleico también se puede distribuir en un vector tal como un vector de adenovirus porcino. También se puede distribuir como ADN desnudo. Por consiguiente, en otro aspecto, la presente invención proporciona una construcción para la distribución in vivo de una cantidad efectiva de citocina, que comprende: a) ¦ una secuencia de nucleótidos que codifica para una citocina o un fragmento biológicamente activo de la misma; b) un vector que comprende una secuencia de control en donde la secuencia de control es capaz del control de la expresión de la secuencia de nucleótidos de a) tal que se produzca una citocina o fragmento biológicamente activo de la misma que a su vez mejore la función de crecimiento en un animal . Se pueden producir formas modificadas y variantes en la construcción, in vitro, por medio de tratamiento químico o enzimático, o in vivo por medio de tecnología de ADN recombinante . Estas construcciones pueden diferir de aquellas, por ejemplo, en virtud de una o más sustituciones, supresiones o inserciones de nucleótidos, pero requieren sustancialmente la actividad biológica de la construcción o molécula de ácido nucleico de esta invención. Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 muestra el porcentaje de eosinófilos de células sanguíneas blancas ( BC) para cerdos individuales en grupos de tratamiento durante 4 días antes de y 12 días después del tratamiento con IL-5 distribuida usando varias estrategias de distribución. La Figura 2 muestra las cuentas absolutas de células sanguíneas blancas durante el tiempo para cerdos individuales tratados con IL-5 recombinante, o ADN de IL-5, distribuido por inyección IM o pistola génica. La Figura 3 muestra el índice de eosinófilos (análisis estadístico del porcentaje de eosinófilos de WBC) que compara diferentes métodos de distribución en el incremento de los eosinófilos. La Figura 4 muestra la ganancia total de peso del grupo durante 16 días para cerdos tratados con ya sea IL-5 recombinante, o IL-5 en pCI distribuida por varios medios . La Figura 5 muestra el peso total promedio ganado por cerdo en cada grupo de tratamiento para cerdos tratados con ya sea IL-5 recombinante, o IL-5 en pCI distribuida por varios medios . Las barras indican media de grupo y error estándar.

La Figura 6 muestra el peso promedio a los Días 0, 7, 11 y 16 de cerdos tratados con ya sea IL-5 recombinante, o IL-5 en pCI por varios medios. Las barras indican media de grupo y error estándar. La Figura 7 muestra una comparación estadística del porcentaje de eosinófilos promedios de WBC durante 11 días después de la administración de IL-5. La Figura 8 muestra el efecto de diferentes rutas de administración de IL-5 en el porcentaje de eosinófilos de WBC. La Figura 9 muestra el índice de eosinófilos (análisis estadístico) por diferentes rutas de la administración de IL-5. La Figura 10 muestra el peso total del grupo de tratamiento durante el periodo de post-destete, para cerdos tratados con ya sea IL-5 ó solución salina en la presencia o ausencia de complementacion de antibióticos en alimento. La Figura 11 muestra el peso promedio por cerdo durante el periodo de post-destete, en grupos tratados con ya sea IL-5 o solución salina en la presencia o ausencia de complementacion con antibióticos en alimento. La Figura 12 muestra los pesos individuales de cerdos en cada grupo al final del periodo de post-destete en cerdos tratados con ya sea IL-5 ó solución salina en la presencia o ausencia de complementacion de antibióticos en alimento . La Figura 13 muestra la pérdida de producción como se define por muertes provocadas por enfermedad infecciosa o una reducción en el peso de cerdos individuales por grupos tratados con ya sea IL-5 o solución salina en la presencia o ausencia de complementación con antibióticos en alimento. La Figura 14 muestra el porcentaje de eosinófilos de WBC para cerdos individuales en grupos tratados con ya sea IL-5 o solución salina en la presencia o ausencia de complementación con antibióticos en alimento. La Figura 15 muestra una gráfica de regresión del peso ganado durante el periodo de post-destete contra el cambio en los números absolutos de eosinófilos para cerdos tratados con ya sea solución salina (puntos abiertos) o IL-5 (puntos negros) en la presencia de antibióticos en alimento. La Figura 16 muestra la velocidad promedio de ganancia por cerdo durante el periodo de post-destete en grupos tratados con ya sea IL-5 ó solución salina en la presencia o ausencia de complementación con antibióticos en alimento. La Figura 17 muestra los pesos totales del grupo de tratamiento durante las fases de post-destete, crecimiento y pre-sacrificio para grupos tratados con ya sea IL-5 solución salina en la presencia o ausencia de complementación con antibióticos en alimento.

La Figura 18 muestra el peso promedio de cerdos a todo lo largo de la producción para los grupos tratados con ya sea IL-5 ó solución salina en la presencia o ausencia de complementacion con antibióticos en alimento durante el ensayo. Las barras indican media de grupo y error estándar. La Figura 19 muestra la comparación de las diferencias del peso promedio entre el tratamiento con IL-5 y el tratamiento con solución salina en la ausencia de antibióticos. La Figura 20 muestra la comparación de las diferencias del peso promedio entre el tratamiento con IL-5 y el tratamiento con solución salina en cerdos abastecidos con complementacion con antibióticos en alimento. La Figura 21 hace la comparación del tratamiento con solución salina a través de los dos niveles de medicación para ilustrar el efecto de los antibióticos en alimento en el peso . La Figura 22 muestra el peso final de cerdos individuales tratados con ya sea solución salina o IL-5 en la presencia o ausencia de complementacion con antibióticos. La Figura 23 muestra el porcentaje de aliñamiento promedio en los grupos de cerdos tratados con ya sea solución salina o IL-5 en la ausencia o presencia de complementacion con antibióticos . Las barras indican media de grupo y error estándar.

La Figura 24 muestra el peso promedio del cuerpo caliente para cerdos tratados con ya sea solución salina o IL-5 en la ausencia o presencia de complementación con antibióticos . Las barras indican media de grupo y error estándar. La Figura 25 muestra la comparación de los pesos promedios a todo lo largo del periodo de post-destete para cerdos de control con solución salina, con y sin complementos con antibiótico, de los dos ensayos emprendidos en un ambiente comercial de granjas de cerdos (Ejemplos 4 y 5) . Las barras indican media de grupo y error estándar. La Figura 26 muestra los pesos totales de grupo para el periodo de post-destete en cerdos tratados con ya sea IL-5 o solución salina en la ausencia de antibióticos en alimento . La Figura 27 muestra los pesos totales de grupo para el periodo de post-destete en cerdos tratados con ya sea IL-5 ó solución salina en la presencia de niveles reducidos de antibióticos en alimento. La Figura 28 muestra los pesos totales de grupo para el periodo de post-destete en cerdos tratados con ya sea IL-5 ó solución salina en la presencia de niveles normales de antibióticos en alimento. La Figura 29 muestra las pérdidas de producción como se define por muestras provocadas por enfermedad infecciosa o una reducción en el peso de cerdos individuales en cada grupo, en cerdos tratados con ya sea solución salina o IL-5 a tres diferentes niveles de complementación con antibióticos en alimento. La -Figura 30 muestra los pesos promedio a todo lo largo del periodo de post-destete para los grupos de cerdos tratados con ya sea IL-5 o solución salina en la ausencia de antibióticos en alimento. La Figura 31 muestra los pesos promedio a todo lo largo del periodo de. post-destete para grupos de cerdos tratados con ya sea IL-5 ó solución salina y abastecidos con niveles reducidos de antibióticos en alimento. La Figura 32 muestra los pesos promedio a todo lo largo del periodo de post-destete para grupos de cerdos tratados con ya sea IL-5 ó solución salina y abastecidos con niveles normales de antibióticos en alimento. La Figura 33 muestra la comparación de los pesos promedio a todo lo largo de la fase de post-destete para grupos de control tratados con solución salina abastecidos con tres diferentes niveles de complementación de antibióticos en agua o alimento. La Figura 34 muestra las ganancias promedio de peso de cerdos en cada grupo durante el periodo de post-destete. Las barras indican media de grupo y error estándar. La Figura 35 muestra las diferencia de peso promedio de los controles complementados con antibiótico al control complementado sin antibióticos. La Figura 36 muestra la diferencia promedio en peso entre los controles con solución salina y el tratamiento con IL-5 sin antibióticos. La Figura 37 muestra la diferencia promedio en peso entre el control con solución salina y tratamiento con IL-5 con antibióticos reducidos. La Figura 38 muestra la diferencia promedio del peso entre controles con solución salina y tratamiento con IL-5 con niveles normales de antibiótico. La Figura 39 muestra el valor promedio de P2 (medición de grasa posterior antes de la matanza) para cada grupo. Las barras indican media de grupo y error estándar. La Figura 40 muestra una gráfica de P2 contra el peso final para cerdos individuales tratados con IL-5 y controles sin antibióticos. La Figura 41 muestra el nivel absoluto promedio de eos'inófilos para cada grupo. La Figura 42 ilustra una línea de tiempo que muestra la secuencia de eventos para el experimento con citocina con estímulo de E. coli. La Figura 43 muestra la ingestión diaria de alimento por cerdo durante la estimulación con E. coli en cerdos tratados con solución salina, Apralan o IL-5.

La Figura 44 muestra E. coli cultivada de heces recolectadas de cerdos durante cinco días después de la estimulación inicial con E. coli. Los puntos de datos muestran media de grupo con errores estándar. La Figura 45 muestra las puntuaciones totales de cultivo fecal para los cinco días de la estimulación con E. coli. La Figura 46 muestra el porcentaje de reducción en las puntuaciones totales de cultivo fecal en comparación a los controles con solución salina. La Figura 47 muestra la incidencia de signos clínicos en la forma de diarrea y heces húmedas de cada grupo de cerdos durante los cinco días después de la estimulación con E. coli. Las barras muestran los registros totales para cada grupo; el registro máximo para cada grupo es 40. La Figura 48 muestra la reducción en los signos clínicos de diarrea y heces húmedas en los animales tratados con citocina en comparación a los controles con solución salina . La Figura 49 muestra las puntuaciones de cultivo de E. coli para el crecimiento bacteriano en agar con sangre de oveja de muestras tomadas en diferentes áreas a lo largo del tracto gastrointestinal a postmórtem. SI es intestinos delgados. Las barras muestran media de grupo y errores estándar.

La Figura 50 muestra las puntuaciones totales promedio de cultivo de E. coli tomadas de cerdo a postmórtem. Las barras muestran la media de grupo de las puntuaciones totales bacterianas individuales y los errores estándar. La Figura 51 muestra el porcentaje de cambio en las puntuaciones totales de cultivo de E. coli a postmórtem, en comparación a controles con solución salina. La Figura 52 muestra el porcentaje de cambio en las puntuaciones de cultivo de E. coli obtenidas del intestino anterior e intestino posterior, en comparación a los controles con solución salina. La Figura 53 muestra los niveles de extensión de espiroquetas en heces de cerdos después del tratamiento con IL-5, y Lincocina o solución salina y estímulo subsiguiente con disenteria porcina. La Figura 54 muestra la comparación del número de espiroquetas cultivadas del intestino ciego, colón anterior, colon posterior y heces a postmórtem. Las barras muestran la 'media de grupo y error estándar. La Figura 55 muestra la reducción en el número de espiroquetas cultivadas del intestino a postmórtem expresadas como un porcentaje en comparación a los controles tratados con solución salina. La Figura 56 muestra la manifestación de los signos químicos de la infección de disentería porcina indicada por condición fecal a postmórtem. Los signos indicativos de la disentería son heces húmedas y mucoide con sangre (dys) o húmeda o incapaz de retener la forma (húmeda) . Las barras muestran la incidencia dentro del grupo de 8 cerdos . La Figura 57 muestra la velocidad promedio de ganancia de los grupos durante el periodo de post-destete (es decir, periodo de tratamiento) . La Figura 58 muestra la comparación de los pesos promedios de cerdos en cada grupo durante el ensayo. La Figura 59 muestra el peso de promedio final de cerdos en cada grupo. La Figura 60 muestra los pesos individuales de cerdos en cada grupo . La Figura 61 muestra el porcentaje de aliñamiento promedio de cerdos en cada tratamiento . La Figura 62 muestra el peso promedio del cuerpo caliente de cerdos en cada grupo a la matanza. La Figura 63 muestra la comparación de los pesos totales de todos los cerdos vivos en los grupos tratados con antibióticos. La Figura 64 muestra la comparación de los niveles absolutos promedio de eosinófilos en sangre de cerdos que se les administró diferentes dosis de IL-3 con respecto al control . La Figura 65 muestra el Indice de eosinófilos (análisis estadístico) de cada grupo. La Figura 66 muestra el índice de basófilos '(análisis estadístico) de cada grupo. La Figura 67 muestra una gráfica de números absolutos promedios de eosinófilos en sangre de cerdos en cada grupo. La Figura 68 muestra el porcentaje de eosinófilos de cerdos individuales en cada grupo de tratamiento.' La Figura 69 muestra el porcentaje de eosinófilos promedio de WBC para cada grupo de tratamiento. La Figura 70 muestra la comparación del título de Ig total promedio en suero para cada grupo. La Figura 71 muestra la comparación del título promedio- de IgA en sueros para cada grupo. La Figura 72 muestra la comparación de los niveles de IgGl. La Figura 73 muestra la comparación de los niveles de IgG2. La Figura 74 muestra la ganancia de peso promedio en cerdos tratados con citocinas recombinantes, citocinas de plásmido, flunix o solución salina durante estímulo crónico con App. La Figura 75 muestra el peso total ganado durante el estímulo en 14 d con" App, en cerdos tratados con solución salina, flunix citocinas recombinantes o citocinas de plásmido . La Figura 76 muestra los niveles de TNFa en el suero del cerdo tratados con flunix, citocinas recombinantes o citocinas de plásmido y expuestos a estímulo de App. La Figura 77 muestra los niveles de IL-6 en sangre periférica medida por RT-PCR. Los cerdos tratados con flunix, citocinas recombinantes o citocinas de plásmido y estimulados con App . Los datos para el tratamiento con solución salina no estuvieron disponibles a los trece días después del estimulo con App. La Figura 78 muestra la presencia de signos clínicos de la enfermedad entre grupos de tratamiento en una base por visita durante 30 visitas en la primera semana de estímulo. La puntuación máxima por visita fue 8. La Figura 79 muestra el grado de pleuresía en la necropsia, expresado como puntuación de pleuresía (0-5) en cerdos tratados con; solución salina, flunix ó IL-4 y estimulados subsecuentemente con App. La Figura 80 muestra el grado de pleuroneumonía en la necropsia, expresado como % de pulmón afectado en peso, en cerdos tratados con citocinas anti-inflamatorias o flunix y estimulados con App. La Figura 81 muestra los niveles de extensión de espiroquetas en heces de cerdos después del tratamiento con IL-4, lincocina o solución salina y estímulo subsiguiente con disentería porcina. La Figura 82 muestra la comparación del número de espiroquetas cultivadas del intestino ciego, colón anterior, colón posterior y heces a postmórtem. Las barras muestran media de grupo y error estándar. La Figura 83 muestra la manifestación de signos clínicos de la infección de disentería porcina, indicados por condición fecal a postmórtem. Los signos indicativos de la disentería son heces húmedas y mucoides con sangre (dys) o húmedo e incapaz de retener la forma (húmedo) . Las barras muestran la incidencia dentro del grupo de 8 cerdos. La Figura 84 muestra los signos de la patología ordinaria asociada con infección con disentería porcina como se ve en el colón anterior a postmórtem. La patología fue clasificada como modelada por la presencia de rojez desigual o colitis moderada, o como severa con cambios en tejido contenidos comúnmente asociados con disentería tal como la presencia de sangre en los contenidos, y rojez extensiva e inflamación del tejido del intestino. La Figura 85 muest.ra los signos de patología ordinaria asociada con infección con disentería porcina como se ve en el colón posterior a postmórtem. La patología se clasificó como moderada por la presencia de rojez desigual o colitis moderada o como severa con cambios en tejido o contenidos comúnmente asociados con disentería tal como la presencia de sangre en los contenidos y rojez extensiva e inflamación del tejido del intestino. La Figura 86 muestra los pesos semanales de los cerdos durante el estímulo con disentería porcina. Las barras indican media de grupo y error estándar. La Figura 87 muestra el peso promedio de cerdos al final del estímulo con disentería porcina, 19 y 20 días después de la infección. Las barras indican media de grupo y error estándar. La Figura 88 muestra la ganancia de peso promedio durante la duración del ensayo con disentería porcina, desde 7 días antes del estímulo a la matanza en los días 19 y 20 después del estímulo. Las barras indican media de grupo y errores estándar. Descripción Detallada de la Invención La práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique de otro modo, biología molecular convencional, biología celular y técnicas de ADN recombinante dentro de la habilidad de la técnica. Estas técnicas son bien conocidas por los expertos en la técnica y se explican completamente en la literatura. Ver, por ejemplo, Sambrook y Russell "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2001) (Green Publishing, New York); Cloning; A Practical Approach, " Volumes I and II (D.N. Glover, ed. , 1985) (Green Publishing, New York); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait, ed. , 1984); "Nucleic Acid Hybridisation" (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds . , 1985); "Antibodies : A Laboratory Manual" (Harlow & Lane, eds . , 1988); "Transcription and Translation" (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds., 1984); "Animal Cell Culture" (R.I. Freshney, ed. , 1986); "Immobilised Cells and Enzymes" (IRL Press, 1986); B. Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning" (1984), y Sambrook, et al., "Molecular Cloning: a Laboratory Manual" (1989) . Ausubel, F. et al., 1989-1999, "Current Protocols in Molecular Biology" (Green Publishing, New York) . Antes de que se describan los presentes métodos y composiciones, se entiende que esta invención no se limita a los materiales y métodos particulares descritos, puesto que estos pueden variar. También se va a entender que la terminología usada en la presente es para el propósito de describir solo modalidades particulares y no se proponen para limitar el alcance de la presente invención que se limitará solo con las reivindicaciones anexas . Se debe señalar que como se usa en la presente y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen referencia plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De esta manera, por ejemplo, la referencia a "una citocina" incluye una pluralidad de estas citocinas, y la referencia a "un antibiótico" es una referencia a uno o más antibióticos y equivalentes de los mismos conocidos por aquellos expertos en la técnica, y así sucesivamente. A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen los mismos significados como se entiende comúnmente por un experto en la técnica a la cual corresponde esta invención. Aunque se puede usar cualquier material y método similar o equivalente a aquellos descritos en la presente, para practicar o probar la presente invención, ahora se describen los materiales y métodos preferidos . Todas las publicaciones mencionadas en la presente, se citan para el propósito de describir y dar a conocer los protocolos, reactivos y vectores que se reportan en las publicaciones y que se pueden usar con relación a esta invención. Nada en la presente se va a considerar como una misión que la invención no esta facultada para anteceder esta descripción en virtud de la invención anterior. Al describir la presente invención, se usa la siguiente terminología de acuerdo con las definiciones expuestas a continuación. Definiciones Los métodos y composiciones de la presente invención son útiles para mejorar la "función de crecimiento" de un animal . El término "función de crecimiento" se conoce en la técnica como una referencia a los criterios de la velocidad y eficiencia de crecimiento del uso del alimento de un animal, y también una referencia al peso final de un animal, y el peso aliñado y contenido de grasa del animal muerto del animal . La "velocidad de crecimiento" de un animal" es la velocidad de ganancia unitaria en el peso in vivo del animal y la "eficiencia del uso de alimento" es la cantidad de alimento requerida por ganancia unitaria en el peso in vivo del animal. El "peso final" de un animal es el peso del animal a la matanza a una edad específica y el "peso aliñado" es el peso de un animal muerto del cual se ha removido las viseras, patas, cascos o pesuñas. El "contenido de grasa" es la cantidad de grasa en el animal muerto, aliñado. Los métodos para medir los criterios de la velocidad de crecimiento, eficiencia de uso del alimento, peso final y peso aliñado y contenido de grasa de un animal muerto, se conoce por los expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, Manipulating Pig Production VI, VII & VIII. 1997, 1999 & 2001, Ed. P.D. Cranwell, Australia Pig Science Association, Werribee, Victoria; Australia. La velocidad de crecimiento se obtiene en mediciones sucesivas del peso in vivo durante el tiempo. La eficiencia de uso del alimento se tiene en medición sucesiva de la desaparición de alimento y el peso in vivo durante el tiempo. El contenido de grasa del animal muerto se asume tradicionalmente de una medición del espesor de la grasa posterior en milímetros en la posición P2. Por consiguiente, en la presente invención el término "función de crecimiento" significa una mejora en uno o más de los criterios de la velocidad de crecimiento, eficiencia de uso del alimento, peso final o aliñado y contenido de grasa de un animal muerto de un animal . El término "animal" como se usa en la presente significa cualquier animal del cual sea deseable un incremento en la función de crecimiento. Por ejemplo, los animales incluidos en la orden mamíferos, Artiodáctilos o en la clase avícola, Aves. Los artiodáctilos comprenden aproximadamente 150 especies vivientes distribuidas a través de nueve familias: cerdos (Suidae) , pécaris (Tayassuidae) , hipopótamos (Hippopotamidae) , camellos (Camelidae) , almizcleros (Tragulidea) , Jirafas y okapi (Giraffidae) , ciervos (Cervidae) , berrendos (Antilocapridae) , y vacas, ovejas, cabras y antílopes (Bovidae) . Muchos de estos animales se usan como animales para consumo en varios países . De manera importante, con respecto a la presente invención, muchos de los animales económicamente importantes tal como cabras, ovejas, vacas y cerdos tienen biología muy similar y comparten un alto grado de homología genómica. De manera más importante, es bien conocido que ciertos animales tal como cabras y ovejas y caballos y burros se pueden cruzar. Los términos "aves" y "aviar" como se usan en la presente, se proponen para incluir todas las especias aviar, incluyendo de manera enunciativa y sin limitación, pollos, pavos, patos, gansos, codornices y faisanes que se crian de forma comercial por huevo o carne. Este término también incluye tanto machos como hembras de cualquier especie aviar. Por consiguiente, el término "ave" y "aviar" se proponen de manera particular para abarcar gallinas, gallos y pollitos, pavos, patos, gansos, codornices y faisanes. Se prefieren pollos y pavos . Todos los artiodáctilos tienen sistema similar de citocinas, ya que poseen, por ejemplo, interleucinas , GM-CSF, interferón-alfa, beta y gamma. En la mayoría de las especies los genes que codifican para estas citocinas correlacionan a regiones particulares en ciertos cromosomas. Por ejemplo, en humanos, el gen de interleucina 5 correlaciona al cromosoma 5q23-31 en la misma área como los genes que codifican para GM-CSF, M-CSF, IL-3 e IL-4. De manera más importante, muchas de las citocinas tienen alto grado de homologías de secuencia de aminoácidos entre diferentes especies . Por ejemplo, es bien conocido en la técnica que la interleucina 5 porcina comparte tanto como 90 % de sus aminoácidos con animales tal como bovinos, ovinos y equinos (ver, por ejemplo Sylvin et al. (2000), Immunogenetics , 51: 59-64). En realidad, aun especies tan distintas como ratones y humanos comparten tanto como 70 % de identidades de secuencia de aminoácidos (ver, por ejemplo, Dictionary of Cytokines (1995) , Horst Ibelgaufts, VCH Publishers, Weinheim) . Además, se conoce que la IL-10 humana tiene un grado significativo de homología de secuencia con la IL-10 bovina, murina y ovina IL-10 (Dutia et al. (1994) Gene; 149:393-4). La tabla 1 muestra una lista de las identidades de secuencias de aminoácidos de IL-3, IL-4 e IL-5 a través de la bovina, ovina, humana y murina en comparación a la porcina. También se conoce en la técnica que varias citocinas tienen inter-reactividad entre especies. Por ejemplo, la IL-4 tiene reactividad inter-especie, en tanto que la IL-5 tiene un alto nivel de reactividad inter-especie, Dictionary of Citokines (1995) , Horst Ibelgaufts, VCH Publishers, Weinheim. Sin embargo, se debe señalar que la inter-reactividad descrita en la literatura de la técnica anterior se relaciona a ensayos in vitro y algunos experimentos in vivo, pero no se relaciona a la función de crecimiento. También se conoce que las citocinas regulan la expresión de los receptores de citocinas, ya sea de una manera estimuladora o inhibidora, controlando de este modo las actividades biológicas de las citocinas por otras citocinas . Algunas citocinas comparten sub-unidades comunes de receptor que pueden tener un efecto regulador. Tabla 1 Identidades de Secuencia de Aminoácidos a Secuencias Porcinas IL-3: bovina 48%, ovina 47%, humana 39%, murina 29% IL-4: bovina 80%, ovina 78%, humana 63%, murina 42% IL-5: bovina 90%, ovina 88%, humana 65%, murina 42% equina 83%. Las identidades se determinaron de búsquedas en GenBank (USA) Blast searches . Por ejemplo, el receptor de GM-CSF muestra homología significativas con otros reactores para factores de crecimiento Hematopoyéticos , que incluyen IL-2-beta, IL-3, IL-6, IL-7, Epo y los receptores de Prolactina (Ver, por ejemplo, Cytokines Online Pathfinder Encyclopaedia www. copewithcytokines . de) . También se conoce que la IL-3 es capaz de la regulación ascendente de la expresión de los receptores de GM-CSF en macrofagos de ratón, la IL-3 también regula ascendentemente la expresión del receptor de IL-1 en células de la médula ósea, humanas y murinas, la IL-4 regula ascendentemente la expresión del receptor tipo I de IL-1 y regula descendentemente la expresión del receptor de IL-2. Adicionalmente, la IL-7 regula ascendentemente la expresión del receptor de IL-4, y TNF-alfa regula ascendentemente tanto la expresión del receptor de IL-3 como de GM-CSF (Dictionary of Cytokines (1995) , Horst Ibelgaufts, VCH Publishers, Weinheim) . De esta manera, las citocinas por sí mismas pueden ser usadas potencialmente para regular la expresión endógena o actividad biológica de otras citocinas. De una manera similar a los Artiodáctilos , las aves tienen también sistemas comunes de citocinas, incluyendo interleucinas . Por consiguiente, el término "interleucina aviar" o "interleucina de aves" como se usa en la presente, significa cualquier interleucina que corresponda a una interleucina producida .por cualquier especie aviar. El término "aviar" se propone para abarcar varias especies de interleucina aviar, algunas de las cuales se conocen (Ver, por ejemplo, patente de los Estados Unidos No. 5,028,421 y 5,106,617; M. Baggiolini y K. Clemetson, Solicitud de PCT WO 90/06321; H. Aschauer y P. Peveri, Solicitud de PCT WO 89/04836) . En resumen, las interleucinas aviares se pueden obtener al recolectar linfocitos de un donador aviar (más convenientemente del vaso de un donador aviar) , cultivando los linfocitos en un medio (de manera preferente un medio libre de suero) que contiene un agente mitogénico y células T, tal como Concavalina A y opcionalmente al recuperar la interleucina del medio. La inter-reactividad de la IL-2 e IL-8 de varias especies aviares se puede determinar por rutina con procedimientos conocidos del ensayo que emplean células respondedoras IL-2 (Ver, por ejemplo, Gimbrone, et al., Science 246:1601, 1603 n. 14 (1989)). Aquellos expertos en la técnica serán capaces de seleccionar una composición apropiada de citocinas - para el ave que se trate en base a las inter-reactividades conocidas de las pruebas de detección de citocinas y simples conocidos por aquellos expertos en la técnica. En cuanto a lo que esta conciente este solicitante, aun no se han sintetizado análogos de interleucinas aviares. Sin embargo, en base a la inter-reactividad de varias IL-2 no aviares, se espera que análogos sintéticos de interleucinas aviares, cuando estén disponibles, se puedan seleccionar para la actividad de la presente invención por rutina y deben funcionar en la presente invención sustancialmente de la misma manera como las interleucinas que se presentan de forma natural . Dado el nivel de ascendencia común y biología para muchos de los animales para el consumo, el alto grado de homología de secuencia de aminoácidos para citocinas a través de varias especies tal como vacas, ovejas, cabras y cerdos y el nivel de reactividad interespecie de estas citocinas, un experto en la técnica apreciará que las composiciones y métodos descritos en la presente son aplicables a todos los animales para consumo y para todas las citocinas . Se apreciará además por aquellos expertos en la técnica que las composiciones y métodos descritos en la presente se pueden extrapolar directamente para abarcar otros aspectos de la invención. Por ejemplo, se presentan datos para citocinas específicas; sin embargo, estas no se van a considerar como que son limitantes de la invención. Además, la citocina descrita se refieren de manera especifica para ilustrar el alcance de la invención. Por ejemplo, la IL-5, IL-3 y GM-CSF son todas citocinas que son capaces de incrementar los niveles de eosinófilos. Las citocinas tal como IL-4 tienen funciones similares a IL-13 (Dictionary of Cytokines (1995), Horst Ibelgaufts, VCH Publishers, Weinheim) . Adicionalmente, muchas citocinas comparten receptores o sub-unidades de receptor. Por ejemplo, la IL-3, IL-5 y GM-CSF comparten una sub-unidad de receptor (Dictionary of Cytokines (1995) , Horst Ibelgaufts, VCH Publishers, Weinheim) . La IL-4 comparte una sub-unidad común con la IL-2 y la IL-7 (Dictionary of Cytokines (1995) , Horst Ibelgaufts, VCH Publishers, Weinheim) . Algunas citocinas tienen estructuras génicas similares y se agrupan en un cromosoma, por ejemplo, IL-3, IL-4, IL-5, GM-CSF e IL-13 en humanos y ratones (Dictionary of Cytokines (1995) , Horst Ibelgaufts, VCH Publishers, Weinheim) . La IL-1, 3, 4, 5, 6, 11 y 12 son factores de crecimiento, hematopoyéticos , conocidos. Los factores de crecimiento hematopoyéticos similares incluyen GM-CSF, G-CSF, M-CSF, Epo, factor de células madre (SCF) , LIF, TGFp y TNFoc (Dictionary of Cytokines (1995) , Horst Ibelgaufts, VCH Publishers, Weinheim) . La IL-5 es un factor específico de linaje de acción tardía, conocido tal como son Epo, M-CSF y G-CSF. Las citocinas que tienen la misma capacidad multipotencial de acción temprana tal como IL-3 e IL-4 incluyen GM-CSF (Dictionary of Cytokines (1995) , Horst Ibelgaufts, VCH Publishers, Weinheim) . Varias citocinas se considera con citocinas TH2 (TH2; células auxiliares CD4+) que tienen actividad en las células B. Estas incluyen IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10. La IL-3 se segrega tanto por TH1 como por TH2 (Dictionary of Cytokines (1995) , Horst Ibelgaufts, VCH Publishers, Weinheim) . La IL-5 también se conoce en otras especies como que regula ascendentemente las células de eosinófilos en circulación. Adicionalmente, la IL-5 es un regulador potente de las células progenitoras hematopoyéticas tempranas y estimula la proliferación, activación y diferenciación de los eosinófilos. La citocina IL-3 también se conoce que estimula la proliferación, activación y diferenciación de los eosinófilos. La IL-3 soporta la proliferación de casi todos los tipos de células progenitoras hematopoyéticas. Se considera que la IL-3 es un factor de acción temprana que ceba las células madre hematopoyéticas y muchas de las actividades de la IL-3 se mejoran' o dependen de las co-estimulación con otras citocinas . Se ha informado que otra citocina (GM-CSF) incrementa la producción de eosinófilos (Dictionary of Cytokines (1995) , Horst Ibelgaufts, VCH Publishers, Weinheim) . Igual que la IL-3, la GM-CSF da soporte a la proliferación de muchos tipos de células progenitoras hematopoyeticas y ceba las células madre. En otro ejemplo, se' ha mostrado que la IL-25 induce la expresión génica de IL-4, IL-5 e IL-13. La inducción de estas citocinas dan por resultado respuestas tipo TH2, marcadas por niveles séricos incrementados de IgE, IgG(l), e IgA, de los eosinófilos sanguíneos y cambios patológicos en los pulmones y tracto digestivo que incluyeron infiltrados eosinofílicos, producción incrementada de moco e hiperplasia/hipertrofia de células epiteliales. Además, estos datos mostraron que la IL-25 induce la producción de citocina tipo TH2 por células secundarias que son de la clase II de MHC (alta), CDllc(dull) y linaje(-) (Ver, por ejemplo, Fort ME et al (2001), Immunity, 15 (6) : 985-95) . Todo lo anterior es ilustrativo del alcance de la invención actualmente descrita con respecto a los tipos de animales abarcados. Sin embargo, se verá fácilmente que el término "citocina" también se va a considerar de forma amplia y no se limita a los datos experimentales descritos. Por ejemplo, el término "citocina" incluye una o más de IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, factor de estimulación de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) , -factor de estimulación de colonias de granulocitos (G-CSF) , factor de estimulación de colonia de macrófagos (M-CSF) , eritropoyetina (Epo) , factor de células madre (SCF) , factor de inhibidor de leucocitos (LIF) , factor-beta de crecimiento de tumor (TGFP) y factor-alfa de necrosis de tumor (TNFot) . Como se usa en la presente, el término "cantidad promotora de crecimiento" quiere decir una cantidad de una citocina de la presente invención efectiva para producir un incremento en la función de crecimiento como se define anteriormente. Por ejemplo, la velocidad incrementada de crecimiento, eficiencia de uso de alimento, peso final incrementado, peso incrementado de cuerpo aliñado o contenido reducido de grasa. Como se usa en la presente, el término "administración" se refiere al modo de distribución de una composición de la invención. El término también se refiere a la dosis de una composición. Dependiendo de la actividad de una citocina y la edad y peso corporal de un animal, variará la manera de administración y dosis de una citocina. Se entenderá que el nivel específico de dosis para cualquier animal particular dependerá de una variedad de factores que incluyen la actividad de la citocina específica empleada, la edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, tiempo de administración, ruta de administración, velocidad de excreción y combinación de citocina o antibiótico. Sin embargo, en general, la ruta preferida de administración se selecciona a partir del grupo que consiste de administración oral, tópica y parenteral . La administración parenteral incluye inyecciones subcutáneas, aerosol, inyección intravenosa, intramuscular, intratecal, o técnicas de infusión y células encapsuladas. Como se usa en la presente, el término "regular ascendentemente" o "regulación ascendente" se refiere a la inducción de un incremento de producción, secreción o disponibilidad (y de esta manera un incremento en la concentración) de una proteina o péptido. Un método para regular ascendentemente la interleucxna endógena en un animal o ave se refiere de esta manera a un método para inducir un incremento en la producción, secreción o disponibilidad de citocina en el animal o ave, en comparación a un animal o ave no tratado . El término "endógeno" significa que se origina dentro del sujeto, célula o sistema que se estudia. Por consiguiente, la complementación de los niveles endógenos de una citocina significa que un compuesto o compuestos se administra (n) a un animal tal que la cantidad total de una citocina en el animal es mayor que la normalmente presente.

El incremento de los niveles endógenos de una citocina significa que un compuesto o compuestos se administra (n) a un animal donde el compuesto o compuestos incrementa (n) la producción de una citocina por una célula o tejido del animal, incrementando de este modo de forma efectiva la cantidad total de una citocina en el animal . Los niveles endógenos de una citocina también se pueden incrementar de manera efectiva al disminuir la velocidad de producción de una citocina. Por ejemplo, un compuesto o compuestos de la invención cuando se administran a un animal pueden disminuir la velocidad de proteólisis de las citocinas endógenas al inhibir el efecto de las enzimas proteolíticas . Adicionalmente, un compuesto o compuestos pueden reducir los niveles endógenos de una citocina, proporcionando de este modo la necesidad de administrar citocinas para respuestas inmunitarias efectivas. Aunque muchas sustancias, particularmente extractos bacterianos o bacterias aniquiladas, o mitógenos no específicos de origen vegetal, son capaces de estimular la regulación ascendente de citocinas endógenas, incluyendo IL-3, IL-4, e IL-5, también estimula la regulación ascendente de los mediadores pro-inflamatorios de citocinas, que pueden tener efectos perj diciales en el crecimiento de productividad del . ganado. Sin embargo, los extractos de algunos parásitos, particularmente helmintos han mostrado que incrementan la producción de citocina (por ejemplo, referirse Ehigiator HN et al., (2000) Infection & Immunity. 68:4913-4922, Zang XX et al., (2000) Journal of Immunology. 165:5161-5169). Por ejemplo, la dieta que comprende sustancias tal como aceites de pescado, aceites grasos de omega 3, vitaminas E y A se ha asociado con respuestas inflamatorias reducidas, de esta manera, con expresión de citocinas. Por ejemplo: Cannabinoides Los ligandos sintéticos de baja afinidad de los cannabinoides, tal como (+) -HU-211 y DMH-11C, han mostrado que provocan efectos anti-inflamatorios , posiblemente a través de la medición de la producción y la acción de TNF-alfa y otras citocinas de fase aguda. Además, la supresión de TNF y otras citocinas tal como GM-CSF, IL-6, IFN-gamma, e IL-12 también se ha visto que después de la exposición a ligandos de alta afinidad y psicoactivos tal como marihuana y THC. Sin embargo, algunos de estos ligandos también se han mostrado que incrementan, en lugar de disminuir, las interleucinas tal como IL-1, IL-4, IL-10 e IL-6, citocinas tal como TNF-alfa y quimiocinas tal como IL-8, MIP-1 y ANTES. El ligando endógeno, anandamida, se ha mostrado que en cultivo ya sea suprime la respuesta de proliferación a prolactina o mejora la respuesta a citocina tal como IL-3 e IL-6. Este eicosanoide también se ha mostrado que incrementa la producción de interleucinas y otras citocinas . Los receptores de cannabinoides se han mostrado que están comprendidos en algunos efectos, pero no todos, (Klein et al. (2000) , Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 225: 1-8). Ácidos grasos Se conoce que los ácidos grasos poliinsaturados n-3 (PUFA) tienen efectos inmunomoduladores en humanos. Por ejemplo, el ácido alfa-linolénico (ALNA), el PUFA n-3 de cadena larga y el ácido eicosapentaeinoico (EPA) más el ácido docosahexanoico (DHA) . A la fecha la mayoría de los estudios ha examinado las funciones de las células inmunitarias ex vivo pero hay un número limitado de estudios que informan mediciones in vivo del estado/respuestas inmunitarias. Los altos niveles de ya sea ALNA o EPA más DHA disminuyen la quimiotaxis de los neutrófilos y monocitos, disminuyen la producción de especies de oxígeno reactivo o neutrófilos y monolitos, disminuye la producción de citocinas pre-inflamatorias por monolitos y linfocitos T, y deterioran la proliferación de linfocitos T. Se ha encontrado evidencia similar en roedores (Calder PC (1997) , Nutrition Research, 21: 309-341; Calder PC (1997), Annals of Nutrition and Metabolism, 41: 203-234). El ácido ascórbico y los tocoferóles ejercen efectos anti-inflamatorios en estudios en hombres y animales.

En general, los ácidos grasos poliinsaturados n-6 mejoran, y los PUFA n-3 y los ácidos grasos monoinsaturados suprimen, los aspectos de la inflamación mediados por las citocinas . Además, los PUFA n-6 y colesterol mejoran, y los PUFA n-3 suprimen la producción de citocinas (Grimble RF (1998), Nutrition Research, 18:1297-1317). Vitaminas La hormona de vitamina D estimula el factor de crecimiento de transformación, TGF-beta-1 y la producción de interleucina-4 (IL-4) , que a su vez puede suprimir la actividad de las células T inflamatorias (Deluca & Cantorna (2001), FASEB Journal, 15: 2579-2585). Una concentración incrementada de vitamina E en humanos da por resultado producción incrementada de IL-4 (Pallast EG et al. (1999), American Journal of Clinical Nutrition, 69:1273-1281). Ratones incrementados con una dieta con bajo contenido de proteínas tuvieron concentraciones menores de IL-4 e IL-5 en la mucosa del intestino delgado y pocas células que contiene IL-4 e IL-5 en la lamina propria (P < 0.05) . El acetato de retinilo (1 mg) restauró de manera significativa el nivel de IL-5 y el número de células que contienen IL-4 e IL-5. Después de la inmunización con 20 µg de toxina dé cólera (CT) , la mucosa intestinal de ratones con deficiencia en proteínas, contuvo significativamente menos IgA específica de CT en los ratones de control. El tratamiento con 1 mg de acetato de retinilo impidió la declinación del nivel anti-IgA de CT en los ratones con deficiencia de proteína, mejorando su proporción de supervivencia después de la exposición a 0.1 mg de CT. Estos resultados sugieren que grandes complementos orales de vitamina A pueden preservar el nivel de IgA de la mucosa durante una mala nutrición de proteínas, posiblemente al estimular la producción de citocina TH2 y de este modo inducir resistencia contra infección (Nikawa T et al, (1999), Journal of Nutrition, 129: 934-941). El ácido retinoico (RA) puede regular el cambio de isotipo al nivel de trascripción de línea germen y dirige el cambio a IgA con la ayuda de IL-5 e inhibe el cambio de IgGl (Tokuyama H & Tokuyama Y (1999) , Cellular Immunology, 192: 41-47). El término "fragmento biológicamente activo" se refiere a un segmento de una citocina que tiene un efecto biológico o fisiológico de un animal que es sustancialmente similar a la citocina completa o entera de la cual se deriva. Por ejemplo, un fragmento biológicamente activo de interleucina 3 puede ser cualquier porción de IL-3 que tenga más de aproximadamente 5 residuos de aminoácido que ya sea comprenda un epitope inmunitario u otro sitio biológicamente activo o en donde la porción retenga la actividad biológica de IL-3. Por ejemplo, si la porción de interleucina 3 retiene la capacidad para cebar células madre hematopoyéticas, como se analiza anteriormente, entonces esta porción es un "fragmento biológicamente activo" de la IL-3. En otro ejemplo, un fragmento de IL-5 necesitará retener una o más de las siguientes características. (i) Estimular la proliferación, activación y/o diferenciación de eosinófilos ; (ii) Inducir la proliferación y diferenciación de células B pre-activadas ; (iii) Promover la generación de células citotoxicas de los timocitos; (iv) Estimular la promoción y secreción de los anticuerpos IgM e IgA. Típicamente, este fragmento de IL-5 es uno capaz de inhibir de forma competitiva la unión de IL-5 al receptor de IL-5. También si se abarcan las variantes de la secuencia de aminoácidos de una citocina o fragmentos biológicamente activos de la misma. Por ejemplo, donde se adicionen uno o más residuos de aminoácido en el N- ó C-término de, o dentro de, la secuencia de citocina con sus fragmentos como se define anteriormente. Las variantes de las secuencias de aminoácidos de una secuencia de citocina con sus fragmentos, como se define anteriormente, en donde se suprimen uno o más residuos de aminoácidos de la secuencia de citocina o un fragmento de la misma, y se sustituye opcionalmente por uno o más residuos de aminoácidos; y derivados de las citocinas anteriores o fragmentos de las mismas, en donde se ha modificado de manera covalente un residuo de aminoácido de modo que el producto resultante es un aminoácido que no se presenta de forma natural. Nuevamente, todas estas variantes de citocinas se abarcan por el término "fragmento biológicamente activo" en tanto que las variantes de citocina retengan la actividad biológica de la citocina completa de la cual se derivan. Como se usa en la presente, un "portador, adyuvante o vehículo farmacéutico" es un solvente, agente de suspensión o vehículo f rmacéuticamente aceptable para la distribución de la citocina y/o antibiótico al animal . El portador puede ser líquido o sólido y se selecciona con la manera de administración planeada en mente. El término "sustancialmente homólogo" puede referirse tanto a ácido nucleico como a secuencias de aminoácidos, significa que una secuencia particular, por ejemplo, una secuencia mutante, varía de una secuencia de referencia por una o más sustituciones, supresiones o adiciones, el efecto neto del cual no da por resultado una diferencia funcional adversa entre las secuencias de referencia y objetivo. Para los propósitos de la presente invención, las secuencias que tienen actividad biológica equivalente y características equivalentes de expresión, se consideran sustancialmente homologas. Se consideran equivalentes las secuencias que tienen grados menores de identidad, cuya actividad comparable y características equivalentes de expresión. "Microbiano" se refiere a proteínas recombinantes elaboradas en sistemas de expresión bacterianos, f ngales (por ejemplo, levadura), virales (por ejemplo, baculovirus) , o vegetales. Como un producto, "microbiano recombinante" define una proteína animal esencialmente libre de sustancias endógenas nativas y no acompañadas por glicosilación masiva asociada. La proteína expresada en la mayoría de los cultivos bacterianos, por ejemplo E. coli, estará libre de modificaciones de glicosilación; la proteína expresada en levadura y células de insecto tendrá un patrón de glicosilación diferente de aquel expresado en célula de mamífero . Una "molécula de ácido nucleico" o "molécula de ácido polinucleico" se refiere en la presente a ácido desoxiribonucleico y ácido ribonucleico en todas sus formas, es decir, ADN individual o de doble hebra, ADNc, ARNm, y similares . Una "molécula de ADN de doble hebra" se refiere a la forma polimérica de desoxiribonucleótidos (adenina, guanina, timina o citocina) en su hélice normal de doble hebra. Este término se refiere solo a la estructura primaria y secundaria de la molécula, y no se limita a ninguna forma terciaria particular. De esta manera, este término incluye el ADN de doble hebra encontrado, inter alia, en moléculas lineales de ADN (por ejemplo fragmentos de restricción), virus, plásmidos y cromosomas. Al analizar la estructura de las moléculas particulares de ADN de doble hebra, se pueden describir las secuencias en la presente de acuerdo a la convención normal de dar solo la secuencia en la dirección 5' a 3' a lo largo de la hebra no transcrita de ADN (es decir, la hebra que tiene un homólogo de secuencia al ARNm) . Una secuencia de ADN "corresponde" a una secuencia de aminoácidos sin la traducción de la secuencia · de ADN de acuerdo con el código genético produce la secuencia de aminoácidos (es decir, la secuencia de ADN "codifica para" la secuencia de aminoácidos) . Una secuencia de ADN "corresponde" a otra secuencia de ADN si las dos secuencias codifican para la misma secuencia de aminoácidos. Dos secuencias de ADN son "sustancialmente similares", cuando al menos cerca de 85 %, de manera preferente cerca de al menos 90 %, de manera más preferente al menos cerca de 95 %, de los nucleotidos corresponden sobre la longitud definida de la secuencia de ADN. Las secuencias que son sustancialmente similares se pueden identificar en un experimento de hibridación Southern, por ejemplo, bajo condiciones severas como se define por este sistema particular. La definición de las condiciones apropiadas de hibridación esta dentro de la habilidad del conocimiento de la técnica. Ver, por ejemplo Sambrook et al., DNA Cloning, vols . I, II and III. Nucleic Acid Hybridization. Sin embargo, de forma ordinaria, "condiciones severas" para hibridación o fijación de moléculas de ácido nucleico son aquellas que (1) emplean baja concentración iónica y alta temperatura para el lavado, por ejemplo, NaCl 0.015 M/citrato de sodio 0.0015M/dodecilsulfato de sodio al 0.1 % (SDS) a 50°C, o (2) emplean durante la hibridación un agente de desnaturalización tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50% (vol/vol) con albúmina de suero bovino al 0.1%/FICI al 0.1%/polivinilpirrolidona al 0.1%/amortiguador de fosfato de sodio 50 mM pH 6.5 con NaCl 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42°C. Otro ejemplo es el uso de formamida al 50%, 5 X SSC (0.75 NaCl, citrato de sodio 0.075M), fosfato de sodio 50mM (pH 6.8), pirofosfato de sodio 0.1 %, solución de Denhardt 5 X, ADN de esperma de salmón tratado con sonido (50 µg/mL) , SDS al 0.1%, y sulfato de dextran al 10 % a 42°C, con lavados a 42 °C en 0.2 X SSC y SDS al 0.1%.

Una ' región o dominio "heterólogo" de una construcción de ADN es un segmento identificable de ADN dentro de una molécula de ADN más grande que no se encuentra en la naturaleza en asociación con la molécula más grande. De esta manera, cuando la región heterologa codifica para un gen de mamífero, el gen usualmente estará flanqueado por ADN que no flanquea el ADN genómico de mamífero en el genoma del organismo fuente. Otro ejemplo de una región heterologa es una construcción donde las secuencias de codificación misma no se encuentran en la naturaleza (por ejemplo un ADNc donde la secuencia de codificación genómica contiene nitrotes o secuencias sintéticas que tienen codones diferentes que el gen nativo) . Las variaciones alélicas o eventos de mutación que se presentan de manera natural no dan una región heterologa de ADN como se define en la presente . Una "secuencia de codificación" es una secuencia en cuadro de codones que corresponde a o que codifica para una secuencia de proteína o péptido. Dos secuencias de codificación corresponden entre sí las secuencias o sus secuencias complementarias codifican para las mismas secuencias de aminoácido. Una secuencia de codificación en asociación con secuencias reguladoras apropiadas se puede transcribir y traducir en un polipéptido in vivo. Una señal de poliadenilación y secuencia de terminación de trascripción usualmente se localizará 3' a la secuencia de codificación.

Una "secuencia promotora" es una región reguladora de ADN capaz de unir ARN-polimerasa en una célula e iniciar la trascripción de una secuencia de codificación en la dirección 3' (corriente abajo). Una secuencia de codificación esta "bajo el control" de la secuencia promotora en una célula cuando la ARN-polimerasa que une la secuencia promotora transcribe la secuencia de codificación en ARNm, que entonces a su vez se traduce en la proteína codificada por las secuencias de codificación. Para los propósitos de la presente invención, la secuencia promotora esta unida en su término 3' por el codon de inicio de traducción de una secuencia de codificación y se extiende en la dirección 5' para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la trascripción a niveles detectables por arriba del fondo. Dentro de la secuencia promotora se encontrará un sitio de inicio de trascripción (definido convenientemente al correlacionar con nucleasa SI) , así como dominios de unión a proteína (secuencias de consenso) responsables de la unión de la ARN-polimerasa. Frecuentemente los promotores eucarióticos contendrán, pero no siempre, secuencias "TATA" y secuencias "CAT" ; los promotores procarióticos contienen secuencias de S ine-Delgamo además de las secuencias de consenso -10 y -35. Una célula se ha "transformado" por ADN exógeno cuando este ADN exógeno se ha introducido dentro de la pared celular. El ADN exógeno se puede integrar o no (enlazar covalentemente) a ADN cromosomico que constituye el genoma de la célula. En las procariotas y levadura, por ejemplo, el ADN exógeno se puede mantener en un elemento episómico tal como un plásmido. Con respecto a células eucarióticas, una célula establemente transformada en una en la cual el ADN exógeno se hereda por las células fijas a través de la replicación cromosómica. Esta estabilidad se demuestra por la capacidad de la célula eucariótica para establecer líneas celulares o clones comprendidos de una población de células fijas que contienen el ADN exógeno. "Integración" del ADN se puede efectuar- usando recombinación no homologa después de la transferencia másica del ADN en las células usando microinyección, biolística, electroporación o lipofección. También se abarcan métodos alternativos tal como recombinación homologa y/o integración mediada por enzimas de restricción (REMI) o transposones y se puede considerar que son métodos mejorados de integración. Un "clon" es una población de células derivada de una célula única o progenitor común por mitosis. "Célula" , "célula hospedadora" , "linea celular" y "cultivo celular" se usan de manera indistinta en la presente y todos estos términos se deben entender que incluyen progenie. Una "línea celular" es un clon de una célula primaria que es capaz de crecimiento estable in vitro durante muchas generaciones. De esta manera, las palabras "transformar" y "células transformada" incluyen la célula sujeto primaria y cultivos derivados de la misma, sin considerar el número de veces que se haya pasado el cultivo. También se debe entender que toda la progenie no puede ser precisamente idéntica en el contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas . Se usan vectores para introducir una sustancia extraña, tal como ADN, ARN ó proteína, en un organismo. Los vectores típicos incluyen virus recombinantes (para ADN) liposomas (para proteínas) . Un "vector de clonación de ADN" es una molécula de ADN que se replica de manera autónoma, tal como plásmido, fago o cósmico. Típicamente, el vector de clonación de ADN comprende uno o un número pequeño de sitios de reconocimiento de endonucleasas de restricción en los cuales se pueden cortar estas secuencias de ADN de una manera determinable sin pérdida de una función biológica esencial del vector, y en los cuales un fragmento de ADN se puede unir a fin de producir su replicación y clonación. El vector de clonación también comprende un marcador adecuado para el uso en la identificación de células transformadas con el vector de clonación. Un "vector de expresión" es similar a un vector de clonación de ADN, pero contiene secuencias reguladoras que son capaces de dirigir la síntesis de proteina por una célula hospedadora apropiada. Esto usualmente significa un promotor para unir ARN-polimerasa e iniciar la trascripción de ARNm, así como sitios de unión a ribosoma y finales de inicio para dirigir la producción del ARNm ' con un polipéptido. La incorporación de una secuencia de ADN en un vector de expresión en el sitio apropiado y en el cuadro de lectura correcto, seguido por la transformación de una célula hospedadora apropiada por el vector, permite la producción de ARNm que corresponde a la secuencia de ADN, y usualmente una proteína codificada por la secuencia de ADN. Para los propósitos de la presente invención, la secuencia promotora se une en su término 3 ' por el codon de inicio de traducción de una secuencia de codificación, y se extiende en la dirección 5' para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la trascripción a niveles detectables por arriba del fondo. Dentro de la secuencia promotora se encontrará un sitio de iniciación de trascripción (definido convenientemente por correlación con nucleasa SI) , así como dominios de unión a proteína (secuencias de consenso) responsables de la unión de ARN-polimerasa. Un elemento "exógeno" es uno que es extraño a la célula hospedadora, o es homólogo a la célula hospedadora pero en una posición dentro de la célula hospedadora en la cual no se encuentra ordinariamente el elemento. "Digestión" de ADN se refiere a la escisión catalítica de ADN con una enzima que actúa solo en ciertas ubicaciones en el ADN. Estas enzimas se llaman enzimas de restricción o endonucleasas de restricción, y los sitios dentro del ADN donde estas enzimas se escinden se llaman sitios de restricción. Si existen múltiples sitios de restricción dentro del ADN, la digestión producirá dos o más fragmentos de ADN linealizados (fragmentos de restricción) . Las varias enzimas de restricción usadas en la presente están comercialmente disponibles y se usan sus condiciones de reacción, co-factores y otros requisitos como se establece por los fabricantes de enzimas . Las enzimas de restricción se designan comúnmente por abreviaciones compuestas de una letra A seguida por otras letras que representan el microorganismo del cual se obtuvo originalmente cada enzima de restricción y luego el número que designa la enzima particular. En general, cerca de 1 µ de ADN se digiere con aproximadamente 1-2 unidades de enzima en aproximadamente 20 µ? de solución de amortiguador. Los amortiguadores apropiados y cantidades de sustrato, para las enzimas particulares de restricción, se especifican por el fabricante, y/o son bien conocidos en la técnic . "Recuperación" o "aislamiento" de un fragmento dado de ADN de una digestión de restricción se logra típicamente al separar los productos de digestión, que se refieren como "fragmentos de restricción" en un gel de poliacrilamida o agarosa por electroforesis, identificando el fragmento de interés en base a su movilidad con relación a aquella de los fragmentos de ADN marcador de peso molecular conocido, removiendo la porción del gel que contiene el fragmento deseado y separando el ADN del gel, por ejemplo por electroelución. "Ligación" se refiere al proceso de formar los enlaces de fosfodiéster con dos fragmentos de ADN de doble hebra. A menos que se especifique de otro modo, la ligación se logra usando amortiguadores conocidos y condiciones con 10 unidades T4-ADN-ligasa por 0.5µg de cantidades aproximadamente equimolares de los fragmentos de ADN que se van a ligar. Los "oligonucleótidos" son polidesoxinucleótidos de hebra individual o doble de longitud corta que se sintetizan químicamente por métodos conocidos (comprendiendo, por ejemplo triéster, fosforamidita, o química de fosfonato) , tal como se describe por Engels, et al., Agnew. Chem. Int. Ed. Engl . 28:716-734 (1989). Luego, se purifican, por ejemplo por electroforesis por gel de poliacrilamida. "Reacción en cadena de la polimerasa" o "PCR" , como se usa en la presente se refiere en general a un método para la amplificación de una secuencia deseada de nucleótidos in vitro como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 4,683,195. En general, el método de PCR comprende ciclos repetidos de síntesis de extensión de cebador, usando dos cebadores de oligonucleotidos capaces de hibridizar de manera preferencial a un ácido nucleico de plantilla. Típicamente, los cebadores usados en el método de PCR serán complementarios a las secuencias de nucleótidos dentro de la plantilla en ambos extremos o que flanquea la secuencia de nucleótidos que se va a amplificar, aunque también se pueden usar cebadores complementarios a la secuencia de nucleótidos que se va a amplificar. Wang, et al., in PCR Protocols, pp.70-75 (Academic Press, 1990); Ochman, et al., in PCR Protocols, pp. 219-227; Triglia, et al., Nucí. Acids Res. 16 : 8186 (1988) . "Clonación por PCR" se refiere al uso del método de PCR para amplificar una secuencia específica, deseada de nucleótidos que esta presente entre los ácidos nucleicos de una célula adecuada o fuente de tejido, incluyendo ADN g gnómico total y ADNc trascrito de ARN celular, total. Frohman, et al., Proc . Nat. Acad. Sci . USA 85:8998-9002 (1988); Saiki, et al., Science 239:487-492 (1988); Mullís, et al., Meth. Enzymol . 155:335-350 (1987). Un "vector" o "construcción" se refiere a un plásmido o virus o integración genómica que comprende una unidad transcripcional con (1) un elemento o elementos genéticos que tienen un papel regulador de la expresión génica, por ejemplo, promotores o intensificadores, (2) una secuencia estructural o de codificación y se transcribe en AR m y se traduce en proteína, y (3) secuencias apropiadas de inicio y terminación de trascripción. Las unidades estructurales propuestas para el uso en levadura o sistemas de expresión eucarióticos incluirán una secuencia guía que permita la secreción extracelular de la proteína traducida · por una célula hospedadora. De manera alternativa, donde la proteína recombinante se exprese sin una secuencia guía o de transporte, puede incluir un residuo N-terminal de metionina. Este residuo se puede escindir de manera subsiguiente o no, de la proteína recombinante expresada para proporcionar un producto final. En general, los vectores de expresión recombinante incluirán orígenes de replicación y marcadores seleccionables que permitan la transformación de la célula hospedadora, y un promotor derivado de un gen altamente expresado para inducir la trascripción de una secuencia estructural en la dirección 3'. La secuencia estructural heteróloga se ensambla en la fase apropiada con las •secuencias de inicio y terminación de traducción, y de manera preferente, una secuencia guía capaz de dirigir la secreción de la proteína traducida en el espacio periplasmático o medio extracelular. De manera opcional, la secuencia heteróloga puede codificar para una proteína de fusión que incluye un péptido N-terminal de identificación que imparte las características deseadas, por ejemplo estabilización o purificación . simplificada del producto recombinante, expresado. Los vectores preferidos de expresión recombinante de la invención son vectores virales, por ejemplo vector adenoviral porcino, células de mamífero, por ejemplo células porcinas), células vegetales y células bacterianas. El término "respuesta inmunitaria" se propone para referirse a cualquier respuesta a un antígeno o determinante antigénico por el sistema inmunitario de un sujeto vertebrado. Las respuestas inmunitarias de ejemplo incluyen respuestas inmunitarias humorales (por ejemplo, producción de anticuerpos específicos de antígeno) y respuestas inmunitarias mediadas por células (por ejemplo proliferación de linfocitos) , como se describe posteriormente en la presente . El término "respuesta inmunitaria sistémica" se propone para referirse a una respuesta inmunitaria en tejidos linfoides asociados con módulos linfáticos, vaso o intestino, en donde las células, tal como los linfocitos B del sistema inmunitario se desarrollan. Por ejemplo, una respuesta inmunitaria sistémica puede comprender la producción de las IgG séricas. Adicionalmente, la respuesta inmunitaria sistémica se refiere a anticuerpos específicos del antígeno que circulan en la corriente sanguínea y células específicas del antígeno en tejido linfoide en compartimientos sistémicos tal como el vaso y nodulos linfáticos. En contraste, el tejido linfoide asociado con intestino (GALT) es un componente del sistema inmunitario de la mucosa puesto que las células específicas del antígeno se responden a los antígenos/patógenos del intestino se inducen y se pueden detectar en el GAL . Modalidades Preferidas En una modalidad particularmente preferida, la presente invención proporciona un método para incrementar la función de crecimiento, el cual comprende el paso de administrar a un animal en necesidad del mismo o una cantidad promotora de crecimiento de una o más citocinas o fragmentos biológicamente activos de las mismas. Puesto que las citocinas se expresan de manera endógena en todas- las especies de animales para consumo y puesto que muchas de estas tienen un alto grado de inter-reactividad, se deduce que en las citocinas de una especie se pueden administrar animales de una especie diferente o viceversa. Por ejemplo, cuando el animal es un cerdo, se pueden usar citocinas humanas tal como IL-5 en los métodos descritos. No hay requerimiento que la citocina particular sea idéntica a la citocina que se expresa de manera endógena en el animal .

El propósito de administrar una citocina a un animal es mejorar su función de crecimiento. La mejora de la función de crecimiento se observa en animales a los cuales se administra una o más citocinas o una o más citocinas junto con uno o más antibióticos en comparación con los animales a los cuales se les administran solo antibióticos. Como se analiza en la presente la función de crecimiento se puede medir; sin embargo, porque existe un incremento en la función de crecimiento es un poco más completo. En tanto que no se desea que se una por ninguna teoría particular o hipótesis, el solicitante cree que la administración de citocinas actúa de varias maneras complementarias que dan por resultado la función mejorada de crecimiento. Por ejemplo, el solicitante ha encontrado que al mejorar la inmunidad de los animales para consumo, se evitan pérdidas de animales y en consecuencia se mejora la función de crecimiento. De esta manera, la presente invención proporciona un método para reducir la susceptibilidad' de un animal a infección. El método es útil para reducir la susceptibilidad a infección por bacterias, virus o parásitos. El solicitante ha encontrado que la administración de una o más citocinas junto con uno o más antibióticos también mejora la función de crecimiento de un animal en tanto que se reduce la cantidad total de antibiótico usado. Se cree que el antibiótico limita la carga microbiana en el animal a un valor de umbral en el cual la citocina administrada entonces es capaz de ejercer un efecto en la función de crecimiento. Por consiguiente, el solicitante cree que el lugar es funcional como un promotor de crecimiento per se, aunque esto puede ser posible, se entenderá que la administración de las citocinas puede provocar función mejorada de crecimiento al activar los brazos humoral y celular de la respuesta inmunitaria que son capaces de ser activados por las citocinas. Por ejemplo, la IL-5 induce diferenciación de eosinófilos, proliferación y activación; secreción de IgA, disminuyendo de este modo la carga microbiana en el animal que de otro modo limitaría la función de crecimiento del animal. De manera específica, como se describe en la presente, no se observaron muertes en un grupo de animales a los cuales se administró IL-5 y antibiótico y se mantuvieron en un ambiente "comercial" de ganadería, y los animales de este grupo son en general de salud mejorada y condición mejorada en comparación con los animales en otros grupos que no reciben IL-5 y antibiótico. Los métodos de esta invención comprenden en una modalidad : (1) La administración de una o más citocinas, antes de, junto con, o subsiguiente a la administración de uno o más antibióticos; ó (2) La administración de una composición que comprende de una o más citocinas y uno o más antibióticos. (3) La administración de una o más citocinas sin ningún antibiótico. La(s) citocina(s) ó composición (es) de la invención se pueden administrar de forma oral, tópica o parenteral en formulaciones de dosis unitaria que contienen portadores, adyuvantes y vehículos convencionales, no tóxicos farmacéuticamente aceptables. El término parenteral como se usa en la presente incluye inyecciones subcutáneas, aerosol, inyección intravenosa, intramuscular, intratecal, intracraneal o técnicas de infusión. La presente invención también proporciona formulaciones farmacéuticas tópicas, orales y parenterales para el uso de los nuevos métodos para mejorar la función de crecimiento de la presente invención. Las composiciones de la presente invención se pueden administrar de manera oral como tabletas, suspensiones acuosas o aceitosas, pastillas, trociscos, polvos, gránulos, emulsiones, cápsulas, jarabe o elixires. La composición para el uso oral puede contener uno o más agentes seleccionados del grupo de agentes edulcorantes, agentes saborizantes , agentes colorantes y agentes conservadores a fin de producir separaciones farmacéuticamente estéticas y comestibles. Las tabletas contienen el ingrediente activo en mezcla con portadores, adyuvantes o vehículos no tóxicos farmacéuticamente aceptables . que son adecuados para la elaboración de las tabletas . Estos portadores, adyuvantes o vehículos pueden ser, por ejemplo, (1) diluyentes inertes, tal como carbonato de calcio, lactosa, fosfato de calcio o fosfato de potasio; (2) agentes de granulación y desintegración, tal como almidón de maíz o ácido algínico; (3) agentes de unión, tal como almidón, gelatina o acacia; y (4) agentes lubricantes, tal como estearato de magnesio, ácido esteárico y calcio. Estas tabletas pueden estar sin revestir o revisten por técnicas conocidas para reemplazar la desintegración y absorción en el tracto gastrointestinal y proporcionar de este modo una acción sostenida durante un periodo más prolongado. Por ejemplo, un material de retrazo de tiempo tal como monoestearatp de glicerilo o diestearato de glicerilo se puede emplear. También se puede realizar el revestimiento usando técnicas descritas en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,256,108; 4,160,452; y 4,265,874 para formar tabletas terapéuticas osmóticas para la liberación con control . Las citocinas, así como los antibióticos útiles en los métodos de la invención se pueden administrar, por aplicación in vivo, de forma parenteral por inyección, o por perfusión gradual durante el tiempo de forma independiente o conjunta. La administración puede ser de manera intravenosa, intraarterial , intraperitoneal , intramuscular, subcutánea, intracavidad o transdermica. Las preparaciones para la administración parenteral incluyen soluciones acuosas o no acuosas estériles, suspensiones y emulsiones. Los ejemplos de solventes no acuosos son propilenglicol , polietilenglicol , aceites vegetales tal como aceite de olivo, y ésteres orgánicos inyectables tal como oleato de etilo. Los portadores acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, formulaciones o suspensiones, incluyendo solución salina y medios amortiguados. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, los vehículos intravenosos de Ringer tratados con lactato incluyen reabastecedores de fluidos y nutrientes, reabastecedores de electrolitos (tal como aquellos basados en dextrosa de Ringer) y similares . También puede estar conservadores y otros aditivos tal como por ejemplo antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, factores de crecimiento y gases inertes y similares. La invención incluye varias composiciones útiles para mejorar la función de crecimiento. Las composiciones de acuerdo con una modalidad de la invención se preparan al poner una o más citocinas o fragmentos biológicamente activos de las mismas, con o sin uno o más antibióticos en una forma adecuada para la administración a un animal usando portadores, adyuvantes, vehículos o aditivos. Los antibióticos adecuados para el uso en este aspecto de la invención son aquéllos usados de manera convencional en la cría de animales como un aditivo para el agua y/o alimento para animales y para limitar la carga microbiana en el animal. Los ejemplos de estos antibióticos incluyen lincomicina, espectinomicina y amoxicilina. Un análisis detallado del uso de antibióticos para animales productores de alimentos, en Australia, se describe en "The use of antibiotics in food-producing animáis: antibiotc resistant bacteria in animáis and humans" . Report of the Joint Expert Advisory Committee on Antibiotic Resistance (JETACAR) , Commonwealth of Australia, 1999. Se puede administrar un antibiótico al animal en una cantidad que es la misma como la cantidad que se administrará de manera convencional al animal para el propósito de disminuir la carga microbiana en el animal . Estas cantidades de antibióticos se conocen por los expertos y se hace referencia en JETACAR. Los portadores, adyuvantes o vehículos frecuentemente usados incluyen carbonato de magnesio, dióxido de titanio, lactosa, manitol y otros azúcares, talco, proteína láctea, gelatina, almidón, vitaminas, celulosa y sus derivados, aceites de origen vegetal y animal, polietilenglicoles y solventes, tal como agua estéril, alcoholes, glicerol y alcoholes polihídricos . Los vehículos intravenosos incluyen reabastecedores de fluidos y nutrientes . Los conservadores incluyen agentes antimicrobianos, antioxidantes , agentes quelantes y gases inertes. Otros portadores farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones acuosas, excipientes no tóxicos, incluyendo sales, conservadores, amortiguadores y similares, como se describe por- ejemplo en Remington's Pharmaceutical Sciences, 15a ed. Easton: Mack Publishing Co. , 1405-1412, 1461-1487 (1975) y The National Formulary XIV., 14th ed. Washington: American Pharmaceutical Association (1975) , los contenidos del cual se incorporan de este modo como referencia. El pH y la concentración exacta de los varios componentes de la composición farmacéutica se pueden ajustar de acuerdo a la experiencia de rutina en la técnica. Ver, Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis for Therapeutics (7th ed.) . Las composiciones farmacéuticas de acuerdo a la invención se pueden administrar de manera local o sistémica en una cantidad promotora de crecimiento. Las cantidades efectivas para este uso dependerán, por supuesto, de la citocina y peso y estado general del animal. Típicamente, las dosis usadas in vitro pueden proporcionar guía útil de las cantidades útiles para la administración in situ, de las composiciones. Se describen varias consideraciones, por ejemplo, en Langer, Science, 249: 1527, (1990). Las formulaciones para el uso oral pueden estar en la forma de cápsulas de gelatina dura en donde el ingrediente activo está mezclado con un diluyente sólido inerte, por ejemplo, carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolín. También pueden estar en la forma de cápsulas de gelatina suave en donde el ingrediente activo está mezclado con agua o un medio de aceite, tal como aceite de cacahuate, parafina líquida o aceite de olivo. Las suspensiones acuosas contienen normalmente los materiales activos en mezcla con excipientes adecuados para la elaboración de suspensión acuosa. Estos excipientes pueden ser (1) agentes de suspensión tal como carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y goma de acacia; (2) agentes de dispersión o humectación que pueden ser (a) fosfátidos que se presentan de manera natural tal como lecitina; (b) un producto de condensación de un óxido de alquileno con un ácido graso, por ejemplo, estearato de polioxietileno; (c) un producto de condensación de óxido de etileno con un alcohol alifático de cadena larga, por ejemplo, heptadecaetilenoxietanol ; (d) un producto de condensación de óxido de etileno con un éster parcial derivado de un ácido graso y hexitol tal como monooleato de polioxietilen-sorbitol , o (e) un producto de condensación de óxido de etileno con un éster parcial derivado de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo, monooleato de polioxietilen-sorbitan. Las composiciones pueden estar en la forma de una suspensión acuosa o oleaginosa, inyectable, estéril. Esta suspensión se puede formular de acuerdo a métodos conocidos que usan estos agentes adecuados de dispersión o humectación y agentes de dispersión adecuados que se han mencionado con anterioridad. La preparación inyectable, estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable, estéril en un diluyente o solvente no tóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo, como una solución en 1 , 3-butanodiol . Entre los vehículos y solventes aceptables que se pueden emplear están agua, solución de inger y solución isotónica de cloruro de sodio. Además, se emplean de manera convencional aceites estériles, fijados como un medio de suspensión o solvente. Para este propósito, cualquier aceite fijado, blando se puede emplear incluyendo mono- o di-glicéridos sintéticos. Además, ácidos grasos tal como ácido oleico encuentran uso en la preparación de productos inyectables. Las citocinas y composiciones de la invención también se pueden administrar en la forma de sistemas de distribución de liposomas, tal como vesículas unilamelares pequeñas, vesículas unilamelares grandes y vesículas multilamelares . Los liposomas se pueden formar a partir de una variedad de fosfolipidos , tal como colesterol, estearilamina o fosfatidilcolinas . Los niveles de dosis de las citocinas o composiciones de la presente invención están en el orden de aproximadamente 1 microgramo a aproximadamente 50 microgramos por kilogramo de peso corporal , con un intervalo preferido de dosis entre aproximadamente 5 microgramos a aproximadamente 20 microgramos por kilogramo de peso corporal por dosis (podría ser múltiple o individual) (de aproximadamente 100 microgramos a aproximadamente 500 microgramos por animal por dosis) . La cantidad de citocina que se puede combinar con los materiales portadores para producir una dosis única variará dependiendo del animal y del modo particular de administración. Por ejemplo, una formulación propuesta para la administración intravenosa a un cerdo puede contener cerca de 20 a 1 g de citocina con una cantidad apropiada y conveniente de material portador que puede variar de aproximadamente 5 a 95 por ciento de la composición total. Las formas de unidad de dosis contendrán en general entre aproximadamente 5 /¿g a 500 mg de citocina. Sin embargo, se entenderá que el nivel específico de dosis para cualquier animal particular dependerá de una variedad de factores que incluyen la actividad de la citocina específica empleada, la edad, peso corporal, salud general, dieta, tiempo de administración, ruta de administración, velocidad de excreción y combinación con fármacos . En una modalidad particularmente preferida de la presente invención, la citocina o citocinas se expresan in vivo en lugar de que se administren de manera exógena. Por ejemplo, al insertar una secuencia de ADN estructural que codifica para una citocina junto con señales adecuadas de inicio y terminación de traducción en fase de lectura operable con un promotor funcional, se crea un vector de expresión que puede ser capaz de expresar la citocina in vivo El vector comprenderá uno o más marcadores fenotípicos seleccionables y un origen de replicación para asegurar la amplificación dentro del hospedador. Los hospedadores procarióticos adecuados para la transformación incluyen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhi urium y varias especies dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomonas; y Staphylococcus; aunque también se pueden emplear otros como una cuestión de elección. Después de la transformación de una cepa hospedadora adecuada y de la expresión, las células se cultivan durante un periodo adicional. Típicamente, las células se recolectan por centrifugación, se trituran por medio físico o químico, y el extracto crudo resultante se retiene para purificación adicional. También se puede emplear varios sistemas de cultivo de células de mamífero para expresar la proteína recombinante . Los ejemplos de sistemas de expresión de mamífero incluyen las líneas COS-7 de fibroblastos de riñon de mono, como se describe por Gluzman, Cell 23:175 (1981), y otras líneas celulares capaces de expresar un vector compatible, por ejemplo, las líneas celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK y por supuesto células porcinas . Los vectores de expresión de un mamífero comprenderán un origen de replicación, un promotor adecuado y un intensificador y también cualquier sitio necesario de unión a ribosoma, sitios de poliadenilación, sitios donadores y aceptores de empalme, frecuencias de terminación transcripcional y secuencias no transcritas de flanqueo en 5' . Las secuencias de ADN derivadas del genoma viral de SV40, por ejemplo, el origen SV40, promotor temprano, intensificador, empalme y sitio de poliadenilación se pueden usar para proporcionar los elementos genéticos no transcriptos, requeridos . La proteína recombinante producida en el cultivo bacteriano usualmente se aisla por extracción inicial de los sedimentos celulares, seguido por uno o más pasos de desplazamiento salino, intercambio iónico acuoso o cromatografía de exclusión de tamaño. Se pueden usar pasos de replegado de proteína conforme sean necesarios, al término de la configuración de la proteína madura. Finalmente, se puede emplear la cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC) para los pasos finales de purificación. Se pueden triturar las células microbianas empleadas en la expresión de las proteínas por cualquier método conveniente, incluyendo un ciclo de congelación-descongelación, tratamiento con sonido, disrupción mecánica o el uso de agentes de lisis celular. El uso de un sistema de expresión que expresa una secuencia de marca para la purificación simplificará la purificación. Los sistemas de expresión recombinante como se define en la presente expresarán la proteína heteróloga en la inducción de los elementos reguladores enlazados al segmento de ADN o gen sintético que se va a expresar. También se pueden emplear sistemas de traducción libres de células para producir citocinas porcinas usando los ARN derivados de las construcciones de ADN de la presente invención. Los vectores apropiados de clonación y expresión para el uso con los hospedadores procarióticos y eucarióticos se describen por aniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor, N.Y. , 1985), la descripción del cual se incorpora de este modo como referencia . El ácido nucleico que codifica para una citocina particular está de manera ventajosa en la forma de ADN de plásmido o un vector viral (vector que se deriva de un adenovirus, retrovirus, virus de viruela, en particular de un virus de vaccinia o un virus de MVA, virus de herpes, virus asociado a adenovirus, etc.). El ácido nucleico que codifica para una citocina particular se transporta por medio de una partícula viral infecciosa o en la forma de un vector sintético (lípido catiónico, liposoma, polímero catiónico, etc.) o una célula manejada genéticamente (célula que se transfectó o transdució con el ácido nucleico) o una célula no manejada (que contiene de forma natural el ácido nucleico) De acuerdo a una variante adicionalmente preferida, el ácido nucleico de interés se porta por un vector adenoviral que es defectuoso en la replicación (incapaz de replicarse de manera autónoma en una célula hospedadora) . La tecnología de los adenovirus se describe en el estado de la técnica (ver, por ejemplo Graham y Prevec en Methods in Molecular Biology, 1991, vol . 7, pp. 109-128, ed E. J. Murey, The Human Press Inc) . De manera ventajosa, el vector adenoviral que se usa dentro del contexto de la presente invención se deriva del genoma de un adenovirus, comprende al menos las ITR (repeticiones terminales invertidas) , y la secuencia de encapsidación y carece de toda o parte de la región adenoviral El. Además, puede carecer de toda o parte de la región adenoviral E3. Sin embargo, de acuerdo a una modalidad ventajosa, se da preferencia a la retención de la parte de la región E3 que codifica para los polipéptidos , en particular, la glicoproteína gpl9 k (Gooding et al., Critical Review of Immunology, 1990, 10: 53-71), que hace posible escapar del sistema inmunitario del hospedador. Adicionalmente, el vector puede contener supresiones o mutaciones adicionales que afectan, en particular, toda o parte de una o más regiones seleccionadas de las regiones E2, E4, Ll, L2, L3, L4 y L5 (ver, por e emplo solicitud internacional WO 94/28152) . A fin de ilustrar este punto, se puede hacer mención de la mutación sensible a la temperatura que afecta el gen DBP (que significa proteína de unión a ADN) de la región E2 A (Ensinger et al., J. Virol . , 1972, 10: 328-339) . Otra variante, o combinación atractiva, consiste de la supresión de la región E4 con la excepción de las secuencias que codifican para los cuadros de lectura abiertos (ORF) 6 y 7 (estas supresiones limitadas no requieren que se complemente la función E4) ; Ketner et al., Nucleic Acids Res., 1989, 17: 3037-3048). De manera preferente, el (los) gen(es) de interés se inserta (n) en el vector en lugar de las regiones adenovirales suprimidas, eri particular, la región El. Cuando se usan varios genes de interés, se pueden insertar en el mismo sitio o en diferentes sitios en el gen viral y pueden estar bajo el control de los mismos elementos reguladores o de elementos independientes, y donde es apropiado, algunos de los mismos pueden estar en la orientación opuesta a los otros, a fin de reducir al mínimo los fenómenos de interferencia al nivel de su expresión. El genoma del vector adenoviral recombinante se pueden preparar por técnicas de biología molecular o por recombinante homologa (ver WO 96/17070) . Los vectores adenovirales que se usan dentro del contexto de la presente invención se propagan en una línea celular complementaria que es capaz de suministrar la(s) funció (es) defectuosa (s) en trans a fin de producir los péptidos que se requieren para la formación de las partículas virales infecciosas. Por ejemplo, se hará uso de la línea celular 293 para complementar la función El (Graham et al., J. Gen. Virol., 1977, 36: 59-72) o de las líneas celulares descritas en la solicitud internacional WO 97/04119 para efectuar una complementación doble. También es posible emplear una línea celular apropiada y un virus auxiliar a fin de complementar todas las funciones defectuosas. Las particulares virales que se producen se recuperan del cultivo celular y si es necesario, se purifican usando las técnicas disponibles (gradiente con cloruro de cesio, pasos cromatográficos , etc.). El vector adenoviral que se usa dentro del contexto de la presente invención se puede derivar del genoma de un adenovirus de origen humano, canino, aviar, bovino, murino, ovino, porcino o simiesco o también de un híbrido que comprende fragmentos de genoma adenoviral de orígenes diferentes. Se puede hacer mención, de manera más específica, de los adenovirus CAV-1 ó CAV-2 de origen canino, de DAV de origen aviar, o también del tipo 3 Bad de origen bovino (Zakharchuk et al., Arch. Virol., 1993, 128: 171-176; Spigey y Cavanagh, J. Gen. Virol., 1989, 70: 165-172; Jouvenne et dd al., Gene, 1987, 60: 21-28; Mittal et al., J. Gen. Virol . , 1995, 76: 93-102) . Sin embargo, se dará preferencia a un vector adenoviral que es especifico para la especie animal particular que se estudia. Por ejemplo, los adenovirus porcinos (PAV) se administrarán a cerdos. A todo lo largo de la especificación, la palabra "comprende" y variaciones de la palabra, tal como "que comprende" y "comprenden" , significa "que incluye de manera enunciativa y sin limitación" y no se propone para excluir otros aditivos, componentes, partes completas o pasos. La invención ahora se describirá adicionalmente a manera de referencia sólo a los siguientes ejemplos no limitantes. Sin embargo, se debe entender que los ejemplos siguientes son sólo ilustrativos y no se deben tomar de ningún modo como una restricción de la generalidad de la invención descrita con anterioridad. Por ejemplo, en tanto que la mayoría de los ejemplos se refieren a cerdos, se va a entender que la invención también se puede aplicar a otros animales como se describe en la presente, incluyendo por ejemplo ovejas, vacas y pollos. Ejemplo 1.- Efecto en los niveles en circulación de eosinófilos en cerdos que se les administra IL-5 Este ensayo compara los efectos de la proteína IL-5 porcina recombinante y la IL-5 porcina distribuida por ADN en los números de eosinófilos en la sangre de cerdos.

Diseño experimental T a amientos Administrado 1. 100 de IL-5 Inyectado IM, pata trasera en dosis consecutivos (recIL-5x2) . 2. 100 g de IL-5 Inyectado IM, pata trasera en un día (recIL-5xl) 3. 200^g de ADN de pCI-IL5 Aguja IM, pata trasera 4. 10/xg de pCI-IL5 Pistola génica, en abdomen y patas traseras 5. 200µ9 de pCI control Aguja IM, pata trasera Nota: Pistola génica: ADN revestido en partículas de oro IM: Intramuscular - 6 cerdos por tratamiento, de aproximadamente 7-8 semanas de edad (post-destete) , peso promedio de aproximadamente 15 kg.

- El experimento se llevó a cabo usando alimento medicado Barastoc Ezi ean 150, luego, Bunge Grolean CREEP ad libitum en un ambiente experimental (instalaciones de contención PC2) . La IL-5 recombinante se expresó en E. coli y se purificó usando un sistema de marca de GST. (Ve, por ejemplo, Smith, D.B. y Jonson, K.S. (1988), Gene, 67:31-40). La IL-5 se escindió de la marca GST, se purificó y se probó en bioensayos para confirmar la actividad. El ADNc de IL-5 (que incluye la secuencia de señal) se clonó en el vector de ADN de pCI . El ADN se purificó usando el equipo Qiagen Giga Prept (Qiagen Inc. EUA) . Se contaron de portaobjetos las células blancas y eosinofilos totales. Protocolo Emprendido Día -4 Sangrado para hematología Día -3 Sangrado para hematología Día 0 Pesado y agrupación para estandarizar los pesos promedio Pre-sangrado para hematología y dosis con todos los tratamientos (1, 2, 3, 4, 5 como se muestra anteriormente) 8 horas después, sangrados para hematología Día 1 Tratamiento 1 de re-dosis, sangrado para hematología Día 2 Sangrado para hematología Día 3 Sangrado para hematología Día 4 Sangrado para hematología Día 7 Sangrado para hematología, pesado Día 9 Sangrado para hematología Día 11 Sangrado para hematología, pesado Día 16 Sangrado para hematología, pesado La Figura 1 muestra el porcentaje de eosinofilos en las cuentas de células sanguíneas blancas ( BC) de la sangre extraída de cerdos para cada grupo de tratamiento. Se puede observar fácilmente que la IL-5 recombinante da por resultado un incremento sostenido en los números de eosinófilos en la sangre durante varios días, con dos dosis que son más efectivas que una dosis. Existió una variación en las respuestas de eosinófilos entre cerdos con cada grupo de tratamiento, es decir, respondedores altos y bajos y una respuesta bifásica también fue evidente. Otra conclusión deducida fue que la IL-5 recombinante fue más efectiva que el ADN en el incremento de los números de eosinófilos . La Figura 2 muestra que no existió diferencia significativa entre los grupos en términos de cuentas de WBC, en tanto que la Figura 3 muestra el índice de eosinófilos (análisis estadístico) de los incrementos en el porcentaje de eosinófilos de las WBC en comparación al control revela que la IL-5 recombinante es más efectiva que el ADN en . el incremento de los eosinófilos, y dos dosis de proteína recombinante son más efectivas que 1. El análisis usó el paquete estadístico Prism que midió el área bajo la curva. Adicionalmente, la Figura 3 muestra que la distribución con pistola génica de IL-5 fue similar al control con plásmido de origen pCI en términos de respuestas de eosinófilos . Como se muestra en la Figura 4 existieron incrementos en la ganancia total de peso de grupo (durante 16 días después del tratamiento inicial) de todos los grupos tratados con IL-5 en comparación al grupo de control de ADN de pCI (incrementos de 5 a 20 %) . De manera interesante, la IL-5 distribuida por ADN parecía tener un efecto mayor en la ganancia de peso que la IL-5 recombinante . Este resultado sugiere que la administración continua de IL-5 mediada por la expresión de ADN de IL-5 pudiera ser más efectiva. Las Figuras 5 y 6 muestras que los cerdos tratados con IL-5 tuvieron pesos promedio mayores que los controles (pCI) . Esto se muestra como el peso promedio final (Figura 5) o a todo lo largo del ensayo (Figura 6) . Los incrementos en la ganancia de peso (durante 16 días después del tratamiento inicial (Figura 6) , fue más evidente con los cerdos tratados con ADN de IL-5, y todos los cerdos tratados IL-5 tuvieron una mayor ganancia final de peso promedio en comparación al grupo de control de ADN de pCI . El ensayo mostró claramente que la administración de IL-5 recombinante dio por resultado un incremento sostenido en los números de eosinófilos (porcentaje de WBC) y que dos dosis son mejor que una. Aunque la administración por ADN de la IL-5 no produjo el mismo nivel de respuesta como la proteína recombinante, el número de eosinófilos se incrementó con la distribución IM. El modo de administración puede ser importante puesto que la distribución por pistola génica distribuye ADN a la superficie de la piel e inmediatamente por debajo, en tanto que la IM es claramente en tejido (músculo) .

Aunque el experimento se llevó a cabo usando alimento medicado en un ambiente experimental, existieron mejoras ligeras a moderadas en la ganancia de peso de los cerdos (incremento de 5-20% en la ganancia de peso en comparación al control de pCI) . Este resultado indicó que la IL-5 puede actuar como un agente promotor, de crecimiento (puesto que no existió enfermedad o infección aparente, pero no se hizo una medición de la carga microbiana) . Las Figuras 4 a 6 muestran todas un incremento general en la ganancia de peso (durante 16 días) y los pesos totales para los grupos a los que se les administró IL-5, con una tendencia que la IL-5 administrada por ADN dio por resultado una ganancia incrementada de peso en comparación a la IL-5 recombinante, que a su vez es mayor que el control con ADN. El efecto de la IL-5 en los números de eosinofilos sanguíneos fue pasajero (varios días) . Ejemplo 2.- Efecto de alta dosis y dosis múltiple de IL-5 en los números de eosinofilos en sangre Este ensayo comparó dos dosis de IL-5 recombinante (100 µg/500 µg) y comparó múltiples inyecciones (xl/x2/x4) de una dosis (100 g) para elevar los números de eosinofilos. Diseño Experimental Tratamiento Administrado 1. 1 mi de solución salina IM, pata trasera DO 2. 100 µ de IL-5 rec IM, pata trasera DO 3. 500 µg de IL-5 rec IM, pata trasera DO 4. 100 µg de IL-5 rec IM, pata trasera DO, DI 5. 100 ig de IL-5 rec IM, pata trasera DO, DI, D4, D7 Nota: D es el día del experimento significa 6 cerdos/grupo de tratamiento. Se midió la hematología sanguínea y los pesos. El experimento se llevó a cabo usando alimento medicado Barastoc Ezi ean 150 luego Bunge Grolean CREEP ad libitum en un ambiente experimental (instalaciones de contención PC2) . Las cuentas diferenciales y totales sanguíneas se realizaron usando una máquina de hematología CellDyn 3700. Protocolo emprendido Día -4 Sangrado para hematología Día -3 Sangrado para hematología y pesado Día 0 Presangrado para hematología y dosis con todos los tratamientos (1, 2, 3, 4, 5 como se muestra anteriormente) , 8 horas después, sangrado para hematología Día 1 Sangrado para hematología, tratamientos 4 y 5 de re-dosificación Día 2 Sangrado para hematología Día 3 Sangrado para hematología Día 4 Sangrado para hematología, tratamiento 5 de redosis Día 7 Sangrado para hematología, tratamiento 5 de redosis Día 9 Sangrado para hematología Día 11 Sangrado para hematología Día 14 Pesado De la Figura 7 se puede ver que la administración de IL-5 incrementó los números de eosinófilos en sangre en términos del porcentaje de WBC. El análisis usó un paquete estadístico Prism que midió el área bajo la curva. La dosis mayor y múltiples dosis fueron estadísticamente significativas, con cuatro inyecciones de 100 /xg (Días 0, 1, 4, 7) que son más efectivas que una inyección única de una dosis mayor individual (500/ig) . 1 y 2 dosis de 100/zg de IL-5 fueron comparables en términos de elevar el porcentaje de eosinófilos en circulación. Ejemplo 3.- Efecto del modo de administración Este ensayo comparó una distribución de IL-5 como proteína recombinante o por ADN usando diferentes rutas de administración. Cada tratamiento se administró seis veces durante 2 semanas (día 0, 1, 3, 6, 8, 10). Diseño Experimental Tratamientos Administrado 1. 100 /xg de IL-5 recombinante IM, pata trasera 2. 100 /¿g de IL-5 recombinante Aspersión intranasal usando soplador 3. 200 /¿g de pCI : : IL-5 ADN, I , pata trasera 4. G fig de pCI::IL-5 IM, pistola génica, en abdomen y patas traseras 5. Solución salina IM, pata trasera. 6 Cerdos/grupo de tratamiento. La hematología sanguínea se midió. El experimento se llevó a cabo usando el alimento medicado Barastoc Ezi ean 150 luego Bunge Grolean CREEP ad libítu en un ambiente experimental (instalaciones de contención PC2) . Se realizaron las cuentas diferencial y total sanguínea usando una máquina de hematología CellDyn 3700. Protocolo Emprendido Día 0 Pesado, pre-sangrado para hematología y dosificación con todos los tratamientos (1, 2, 3, 4, 5) . Día 1 Sangrado para hematología, re-dosificación de todos los tratamientos Día 2 Sangrado para hematología Día 3 Sangrado para hematología, re-dosificación de todos los tratamientos Día 6 Sangrado para hematología, re-dosificación de todos los tratamientos Día 7 Sangrado para hematología, Dia 8 Sangrado para hematología, re-dosificación de todos los tratamientos Día 9 Sangrado para hematología, Día 10 Sangrado para hematología, re-dosificación de todos los tratamientos Día 13 Sangrado para hematología y suero Día 15 Sangrado para suero Día 21 Sangrado para hematología y suero Como se puede ver en la Figura 8, los efectos de la múltiple administración IM de IL-5 recombinante y de IL-5 con ADN, vía IM, fue un incremento en la duración y el nivel de los eosinófilos en sangre (porcentaje de BC) . La IL-5 recombinante y el ADN con IL-5 inyectados intramuscularmente seis veces durante 2 semanas elevaron significativamente (P<0.05 y P<0.01, respectivamente) los niveles en circulación de los eosinófilos. La distribución nasal de IL-5 recombinante y el ADN con IL-5 distribuido por pistola génica tuvieron incrementos ligeros en los números de eosinófilos en comparación al control de ADN pero no fue estadísticamente significativo (ver Figura 9) . Ejemplo 4.- Función mejorada de crecimiento e inmunidad mejorada de cerdos a los que se les administró IL-5 Este ensayo evaluó la capacidad de IL-5 para mejorar la función de crecimiento y la inmunidad de cerdos al comparar la velocidad de crecimiento y salud de cerdos post-destetados (28 días de edad de post-destete es el día 0 del ensayo y el periodo de post-destete continuó durante 42 días) hasta la etapa de pre-sacrificio (días 93 a 113) y matanza (133 días después de comenzar el ensayo) . Los cerdos fueron dosificados con citocina porcina recombinante , IL-5, y se usó solución salina como un control, con y sin agua medicada normal de post-destete y alimento en un ambiente comercial de granja de cerdos. Diseño Experimental Tratamientos Administrado Solución salina Inyección, aguja IM, músculo de cuello, dos veces por semana 100 µg de IL-5 (en solución salina) inyección, aguja IM, músculo del cuello, dos veces por semana 40 cerdos por tratamiento mezclados en grupos de 20, con 4 réplicas que contienen agua y alimento medicado normal y 4 réplicas sin agua o alimento medicado. Los pesos totales para cada grupo al comienzo del experimento fueron equivalentes . Todos los cerdos al inicio del ensayo (día 0) fueron cerdos post-destetados, machos, de 28 días de edad. Se proporcionó IL-5 en solución salina para inyectar 1 ml/cerdo.

Se midieron los pesos al inicio, semanalmente y al final del experimento. La propuesta de señal se diseñó para medir el peso durante .. el periodo de post-destete; sin embargo, debido a respuestas significativas de crecimiento con la administración de IL-5, la medición del peso continuó hasta la matanza (cerdos eran de 161 días de edad) . Muestras de sangre y suero se recolectaron al inicio (antes de los tratamientos) y al final del periodo de post-destete. La sangre y suero se tomaron antes de inyectar las muestras . La IL-5 porcina, recombinante se expresó en E. coli y se purificó usando un sistema de marca polyHist como se describe en Qiagen Inc., USA, Instructions and Clontech, USA, Manual instructions. La IL-5 se probó para la actividad biológica en un bioensayo antes del inicio del experimento. Protocolo emprendido Día 0 Pesados y agrupados en post-destetes de 28 días de edad Día 1 Sangrado. Inyectados de Grupos A, B Día 6 Inyectados de Grupos A, B Día 7 (semana 1) Pesado Día 9 Inyectado Grupos A, B Día 13 Inyectado Grupos A, B Día 14 (semana 2) Pesado Día 16 Inyectado Grupos A, B Día 20 Inyectado Grupos A, B Día 21 (semana Pesado Día 23 Inyectado Grupos A, B Día 27 Inyectado Grupos A, B Día 28 (semana Pesado Día 30 Inyectado Grupos A, B Día 34 Inyectado Grupos A, B Día 35 (semana Pesado Día 37 Inyectado Grupos A, B Día 41 Inyectado Grupos A, B Día 42 (semana Pesado. Sangrado final. Movidos a corrales de crecimiento (Día 42) Cerdos de grupos de crecimiento mayor y menor se probaron para puntuación de vocalización (Giles y Furley 1999: Proc. 26a Annual Conference of the (Días 42-93) Australasian Society for the Study of Animal Behaviour. University of New England, Armidale Australia. P. 17) para determiner la correlación. (Días 93-133) Etapa de crecimiento. Todos los cerdos se les dio alimento normal y permanecieron los grupos previos. Pesado durante (D73) y al final de la etapa de crecimiento (D93) Etapa de pre-sacrificio . Los cerdos se movieron a corrales individuales y la ingestión de alimentos se midió para la FCR (relación de conversión de alimento) . A todos los cerdos se les dio alimento normal de pre-sacrificio . Se pesó durante (D114) y al final de la etapa de pre- sacrificio (matanza D133) , se midió la grasa posterior, el peso del animal muerto, por ciento de aliñamiento Nota: + alimento y agua medicados (más antibióticos) - no medicados agua y alimento (sin antibióticos) A y B = tratamiento con citocina y tratamiento con solución salin . Al inicio del ensayo, se igualaron los pesos promedio y la variación para cada grupo. De esta manera, el incremento en los pesos total o promedio vistos en el grupo medicado con IL-5 se debió a la administración de IL-5 y no simplemente debido a las diferencias entre los pesos al inicio del ensayo . La Figura 10 muestra que los pesos totales de cada grupo durante el periodo de post-destete representaron una combinación del peso ganado y el número de cerdos que permanecen en cada grupo. Estos son posiblemente un reflejo de la resistencia a las infecciones puesto que todos los cerdos se sometieron a una exposición severa de patógenos (las muertes se presentaron a partir de H. parasuis "Glasser's", y disentería porcina) . Los cerdos medicados con antibióticos tuvieron consistentemente mayores pesos combinados que los cerdos sin medicar (peso de grupo sin medicar de solución salina es 89% del peso del grupo medicado con solución salina) . El grupo medicado con IL-5 tuvo un peso combinado total consistentemente y significativamente mayor que los grupos de control medicados (semana (W) 1 5.5%, W2 6.3%, 3 8.8%, W4 11.1%, W5 13.4%, W6 18.6% mayor que el grupo medicado con solución salina, que representa 89 kg durante 6 semanas para un grupo de 20 cerdos, es decir, durante el periodo de tratamiento. Las gráficas de los pesos de los grupos son indicativas que las diferencias de peso entre el grupo de IL-5 y los controles medicados de solución salina se incrementaron adicionalmente durante las etapas de crecimiento y de pre-sacrificio (ver resultados posteriormente) . La Figura 11 muestra el peso promedio de cerdos individuales en cada grupo durante el periodo de post-destete . Se debe señalar que las muertes usualmente se presentaron con cerdos de menores pesos, lo que dio por resultado pesos promedio ligeramente mayores en estos grupos. El grupo medicado con IL-5 tuvo un peso promedio consistentemente mayor durante el periodo de 6 semanas en comparación a los controles medicados de solución salina y pareció ser creciente con el tiempo (Wl 5.5%, 2 6.3%, W3 8.8%, W4 5.5%, 5 7.8%, W6 6.8%). El grupo medicado con IL-5 obtuvo un incremento consistente con respecto al control medicado de solución salina en términos de ganancia de peso por cerdo y velocidad de ganancia (ROG) durante la administración de IL-5 (ROG: Wl 45.6%, W2 19.6%, W3 18.2% W4 8.8%, W5 11.3%, W6 9.1). El grupo sin medicar con IL-5 tiene un incremento consistentemente pequeño en pesos promedio con respecto a los controles sin medicar de solución salina excepto para la última semana (semana 6) . La IL-5 tiene un efecto significativo cuando se combina con el alimento y agua medicados, presumiblemente accionado como un promotor de crecimiento. La IL-5 también puede actuar como un estimulante inmunitario puesto que no ha habido muertes en el grupo con antibióticos (descrito posteriormente) . La función de crecimiento de los cerdos en el grupo medicado con IL-5 no fue consistente con respecto a los otros grupos (intervalo más estrecho y pesos más altos en general, Figura 12) . Esto fue otro efecto benéfico de la administración de IL-5. . Parece que los pesos en cerdos más pequeños en particular se han incrementado con la administración de IL-5.

La pérdida de producción en términos de muertes por enfermedad infecciosa o pérdida de peso como se mide por el pesado semanal se . muestra en la Figura 13. No se presentaron muertes en el grupo medicado de IL-5 (Figura 13) , un factor que tiene influencia en el efecto positivo de la IL-5 en el incremento del peso total del grupo como se describe anteriormente (Figura 10) . La mayoría de las muertes también incluyó pérdida anterior de peso, pero se registraron como sólo muertes. Los grupos medicados de antibiótico tuvieron números reducidos de cerdos que perdieron peso durante una o más semanas durante el tiempo de post-destete en comparación a los grupos no medicados. La primer semana después de destete fue donde la mayoría (>80%) de los cerdos perdió peso. Una conclusión significativa de estos resultados fue que ningún cerdo del grupo de tratamiento de IL-5, medicado perdió peso o murió de enfermedad infecciosa. El tratamiento con IL-5 en los grupos sin medicar también redujo la pérdida de producción. La Tabla 2 muestra el informe de la autopsia para el ensayo anterior. Tabla 2 Resumen del Informe de Autopsia Grupos Muertes Solución salina, no medicado lx H. parasuis (enfermedad de Glasser) Solución salina, medicado lx H. parasuis, lx disentería porcina, lx trauma de sangrado IL-5, no medicado 2x H. parasuis IL-5, medicado No muertes ni tratamientos de intervención requeridos Las conclusiones de la Tabla 2 son que hubo sólo 6 muertes de los 80 post-destetados (5 de enfermedad infecciosa, y 1 de trauma por sangrado) . Los cerdos en el grupo medicado de IL-5 se informó que estuvieron en excelentes condiciones de salud en comparación a los otros grupos. Se tomó sangre el día después de los tratamientos de IL-5 y solución salina y representan sólo un punto único de tiempo. Como se muestra en la Figura 14, el tratamiento de IL-5 tiene un efecto sustancial en el por ciento de células de eosinófilos de WBC tanto en los grupos no medicados tanto como los medicados. Como una observación general, IL-5 más medicamento tuvieron mayores números de eosinófilos que la IL-5 sin antibióticos. Aunque la IL-5 incrementó el por ciento de eosinófilos de la sangre tanto en los tratamientos medicados como no medicados, una mejora en el crecimiento (medida como a la velocidad de crecimiento (ganancia diaria promedio o ganancia promedio de peso o peso total) con respecto a los controles con solución salina fue mayor para la IL-5 más antibióticos que para la IL-5 sin antibiótico. Esto indicó que un incremento en el por ciento de eosinófilos solos no puede ser el mecanismo de .promoción de crecimiento. La Figura 15 muestra que existe una relación positiva entre los números absolutos entre los eosinófilos y la velocidad de crecimiento . La velocidad de ganancia durante el periodo de post-destete se muestra en la Figura 15. Se observó que similar al peso promedio, peso total y ganancia de peso, la IL-5 incrementó consistentemente la velocidad de ganancia en los cerdos medicados . La velocidad de ganancia fue consistentemente mayor en los grupos medicados en comparación a los grupos no medicados, con la velocidad de ganancia para el grupo de IL-5 sin medicar en general mayor que en el control sin medicar de solución salina. Los pesos totales de todos los cerdos en los grupos de tratamiento durante el periodo completo de producción se muestran en la Figura 17. Es evidente que el grupo medicado de IL-5 tiene un incremento significativo a los pesos totales en comparación a todos los grupos. Este incremento parece ser una combinación de una ganancia mayor de peso promedio (o velocidad de ganancia o ganancia diaria promedio) y no se presentaron muertes para el grupo medicado de IL-5. El incremento en los pesos totales del grupo medicado de IL-5 al final del periodo de post-destete continuó hasta la matanza. Los pesos promedio de cerdos individuales en los grupos de tratamiento durante el ensayo se muestran en la Figura 18. El grupo medicado de IL-5 tuvo consistentemente mayores pesos promedio que todos los otros grupos en tanto que los otros cerdos medicados tienen en general mayores pesos promedio que los grupos no medicados . Las muertes se presentaron típicamente en cerdos de menor peso que el peso promedio lo que incrementó artificialmente el peso promedio de los grupos . Los cerdos tratados de IL-5 tuvieron mayores pesos promedio que los controles respectivos de solución salina con cada régimen de antibióticos en casi todos los puntos de tiempo (Figuras 19 y 20) . A pesar de los complementos con antibióticos, los cerdos tratados con IL-5 tuvieron consistentemente mayores ganancias de peso promedio durante los periodos de post-destete y crecimiento en comparación a los controles respectivos con solución salina. Esta tendencia no continúa durante el periodo de pre-sacrificio donde disminuyó la diferencia entre los pesos promedios. Los resultados también mostraron que los complementos con antibióticos dieron por resultado ganancias de peso promedio consistentemente mayores durante los periodos de post-destete, crecimiento y pre-sacrificio en comparación al control con solución salina sin complementos de antibióticos en el agua (Figura 21) . Nuevamente, estas diferencias en los pesos promedios también disminuyeron durante el periodo de pre-sacrificio. .La razón de ésto es desconocida; sin embargo, existen dos eventos combinados que pueden tener impacto . 1) Los antibióticos se retiraron durante sólo el periodo de pos -destete y se proporcionaron durante los periodos de crecimiento y de pre-sacrificio . Por-. lo tanto, los antibióticos pueden haber incrementado a la velocidad de crecimiento o salud de los cerdos en el grupo no medicado. 2) Los cerdos se transfirieron a corrales individuales al inicio del periodo de pre-sacrificio (E93) . Aunque esto no es práctica normal para granjas comerciales de cerdos, pero se emprendió para obtener los datos de la relación de conversión de alimento. El tratamiento con IL-5 redujo la variación en- los pesos de cerdos individúales hasta la matanza (Figura 22) , probablemente al aumentar el peso de cerdos más pequeños . Se encontró que el tratamiento con IL-5 tiene un aspecto estadísticamente significativo (p<0.045) en el porcentaje de aliñamiento del animal muerto en la matanza (Figura 23) . El tratamiento con IL-5 mejoró el porcentaje de aliñamiento a pesar de la administración de antibióticos. Los resultados para el peso del cuerpo caliente se muestran en la Figura 24. La IL-5 incrementó el peso del cuerpo caliente en comparación a los controles con solución salina cuando los cerdos se medicaron con antibióticos. Sin embargo, este aspecto de la IL-5 no fue tan obvio como en los cerdos sin antibióticos.

Estos resultados indican que el tratamiento con IL-5 tiene un efecto positivo en las características de la matanza al incrementar el porcentaje de aliñamiento bajo ambos regímenes de medicación y al incrementar el peso del cuerpo caliente en la presencia de la complementación con antibióticos. Ejemplo 5.- Repetición de la función de crecimiento y/o inmunidad de cerdos que se les administra IL-5 Este ensayo repite la evaluación de IL-5 para mejorar la función de crecimiento y/o inmunidad de cerdos al comparar la velocidad de crecimiento y salud de cerdos machos y hembras post-destetados (desde los 28 días de edad: semana 0 en el ensayo) a través de las etapas de post-destete (semanas 0-6) , crecimiento (semanas 6-13) y pre-sacrificio (semanas 13-19) hasta la matanza (semana 19) , que se les administró citocina porcina recombinante, IL-5 y se usó solución salina como un control, con y sin agua y alimento medicado normal de postdestete, y contenido reducido de antibióticos, en un ambiente comercial de granja de cerdos. Este ensayo (ensayo de post-destete/crecimiento/pre-sacrificio) se diseñó para investigar el efecto de la provisión de IL-5 y los controles (solución salina) desde el destete hasta la matanza con concentración normal, reducida de antibióticos y sin antibióticos en el suministro de agua. El experimento evalúa la capacidad de la IL-5 para reemplazar los antibióticos bajo condiciones comerciales de cría de cerdos y para determinar el efecto de la administración continua de la citocina a todo lo largo de la vida del cerdo en la función y característica del animal muerto. Procedimientos Experimentales El experimento se emprendió en un ambiente comercial donde los cerdos se destetaron a los 28 días de edad. Todas las inyecciones fueron de 1 mi. Hubo 16 cerdos por tratamiento, 8 machos y 8 hembras por tratamiento. El peso total de los cerdos en cada tratamiento fue similar al comienzo del experimento. Protocolo de Tratamiento Grupo Tratamiento Administración Alimento/ Medicado 1. Solución Post- destete/crecí - 0 salina miento/pre- sacrificio Solución Post- destete/crecí - Reducido salina miento/pre- sacrificio Solución Post- destete/crecí - Normal salina miento/pre- sacrificio IL-5 Post- destete/crecí - raiento/pre- sacrificio IL-5 Post-destete/creci - Reducido miento/pre- sacrificio IL-5 Post- des tete/crecí - Normal miento/pre- sacrificio IL-5 Post-destete (control) Normal El grupo 7 es una repetición del ensayo previo en la granja comercial de cerdos para comparación. Símbolos usados significa sin complementos de antibióticos en agua o alimento a todo lo largo del ensayo 0.5 significa antibióticos individuales usados a todo lo largo del ensayo a dosis normal + significa régimen normal de antibióticos usado a todo lo largo del ensayo IL-5+ significa IL-5 administrada durante los periodos de post-destete/crecimiento/pre-sacrificio IL-5+? significa IL-5 administrado durante sólo el periodo de post-destete . Tratamientos A. Inyección con solución salina, 1 mi IM, músculo del cuello B. 100 µg de inyección de IL-5, 1 mi IM, músculo del cuello Etapa de post-destete: 2 inyecciones por semana Etapa de crecimiento y pre-sacrificio, una inyección por semana . Los cerdos se destetaron y empezaron al inicio del experimento (DO, W0) y semanalmente hasta el final del periodo de post-destete (W6) , al final de las etapas de crecimiento (W13) y pre-sacrificio (W19) y una vez durante las etapas de crecimiento (W9) y pre-sacrificio (W16) . Se recolectaron muestras de sangre y suero al inicio (antes de los tratamientos) y al final de los periodos de post-destete, crecimiento y pre-sacrificio . Se tomaron sangre y suero antes de la inyección del tratamiento. Se realizó la hematología (totales y diferenciales) . Al inicio del ensayo, el peso promedio y la variación de todos los grupos se igualó para reducir la influencia confusa del peso de inicio. De esta manera, los efectos positivos en el crecimiento se debieron a los efectos del tratamiento. Desdichadamente, un estallido severo de diarrea de post-destete afectó todos los grupos de tratamiento. La causa más probable de la diarrea fue E. coli . El efecto de esta infección (es) dio por resultado ganancia reducida de peso en comparación al ensayo previo en la granja comercial de cerdos. La Figura 25 compara los pesos promedio de los controles con solución salina, con y sin antibióticos, de este experimento y el experimento previo. Esta figura muestra que los controles de solución salina de este ensayo iniciaron con un mayor peso promedio (0.7 kg) y terminaron al final la etapa de post-destete con un peso promedio menor para el grupo medicado de solución salina (casi 2 kg menos) . La enfermedad infecciosa (diarrea) afectó el grupo no medicado de solución salina en una etapa temprana en comparación al grupo medicado. Los pesos totales de los grupos con los diferentes regímenes de antibióticos se muestran en las Figuras 26, 27 y 28. Se tomaron los pesos desde el inicio al final del periodo de post-destete. Estos datos representan diferencias en el peso y el número de cerdos que permanecen en cada grupo de tratamiento. Se puede ver de los resultados que la administración de IL-5 tiene efectos benéficos en los pesos totales, especialmente con complementos con contenido reducido de antibióticos o sin antibióticos. Estos resultados muestran que la administración de IL-5 puede incrementar la velocidad de crecimiento de los cerdos por arriba de los controles en el afrontamiento a la enfermedad infecciosa. Este beneficio también se reflejó en la pérdida de producción como se mide por las muertes de enfermedad infecciosa, o pérdida de peso durante cualquier semana dada durante el periodo de post-destete (Figura 29) . Las muertes de H. parasuis se presentaron en IL-5+ (2 días en el periodo de post-destete, presumiblemente infectados antes del inicio del ensayo) . Todas las otras muertes fueron el resultado de la diarrea. La pérdida de peso se definió como una o más reducciones semanales de peso de los cerdos individuales. Los grupos de tratamiento de IL-5 tuvieron menos pérdida de producción en comparación a sus respectivos controles con solución salina. Los complementos con antibióticos también redujeron la pérdida de producción. La pérdida de peso puede haber sido también el resultado de la tensión, especialmente en el momento del destete cuando los cerditos se removieron de las cerdas, se transportaron, se mezclaron en diferentes grupos sociales y 'se alimentaron con alimento seco. Los grupos tratados con IL-5 tuvieron ganancias de peso promedio consistentemente mayores durante el periodo de post-destete (Figura 30) en comparación a los controles con solución salina sin complementos de antibióticos en agua o alimento. Los mayores pesos promedio fueron presumiblemente debidos a severidad reducida de la enfermedad y pérdida asociada de peso. Adicionalmente, la IL-5 se muestra que reduce los efectos clínicos de un estimo hemolítico de E. coli . El patrón de las mayores ganancias de peso promedio en los cerdos tratados con IL-5 se repitió con el nivel reducido y el nivel normal de complementación de antibióticos (Figura 31 y Figura 32, respectivamente). Sin embargo, el efecto positivo del tratamiento de IL-5 no fue tan pronunciado como aquel observado sin la complementación con antibióticos (Figura 30) . El peso promedio de cada grupo a todo lo largo del periodo de post-destete se muestra posteriormente en las Figuras 30, 31 y 32 y el peso promedio ganado durante el periodo de post-destete en la Figura 31. Los cerdos tratados con IL-5 mostraron mayores pesos promedio que los controles respectivos con solución salina con cada régimen de antibióticos en casi todos los puntos de tiempo (Figuras 30-32) . Las barras de error (desviación estándar/sqrt (que permanece en números) no se traslapan para la citocina y control con solución- salina para ambos regímenes sin antibióticos y con antibióticos normales y fue indicativa de los implementos significativos en los pesos promedio para los tratamientos de IL-5. Adicionalmente, los pesos promedio de todos los grupos tratados con citocina- fue mayor que todos los grupos de control con solución salina, demostrando los efectos benéficos de la IL-5 en la función de crecimiento y/o salud. No hubo tendencias obvias o significativas en los pesos promedio entre machos y hembras (datos no mostrados) . La Figura 33 muestra los efectos de tres diferentes regímenes de antibióticos en los pesos promedio de cerdos tratados con solución salina a todo lo largo del ensayo. La complementación con antibióticos incrementó claramente la ganancia promedio de peso en cerdos en este ensayo y demuestra la necesidad de la promoción de crecimiento y/o estimulación inmunitaria para incrementar la salud y productividad. Los cerdos en los grupos tratados con IL-5 tuvieron consistentemente mayores ganancias de peso promedio durante el periodo de post-destete en comparación a los controles respectivos con solución salina con o sin complementos con antibióticos en agua o alimento (Figura 34) . Estos resultados también mostrarán que los complementos con antibióticos dan resultado ganancias consistentemente mayores de peso promedio durante el periodo de post-destete en comparación al control con solución salina sin complementos con antibióticos en el agua. La Figura 35 muestra la ganancia de peso promedio durante el periodo de post-destete en comparación al control sin antibióticos de solución salina. Las conclusiones extraídas fueron que los complementos de antibióticos dieron por resultado pesos promedio consistentemente mayores que el control con solución salina (sin antibiótico) durante los periodos de post-destete, crecimiento y pre-sacrificio . También que un contenido reducido de antibióticos - incrementó el peso promedio final de 6.6 kg/cerdo (aproximadamente 8%), en tanto que un contenido normal de antibióticos dio por resultado un peso promedio final incrementado de 10.1 kg/cerdo (aproximadamente 12%) . Como se muestra en la Figura 36, la administración de IL-5 (sin antibióticos) dio por resultado pesos promedio consistentemente mayores que el control durante los periodos de post-destete, crecimiento y pre-sacrificio . La IL-5 incrementó el peso promedio final de 12.3 kg (aproximadamente 15%) con respecto a los controles con solución salina. Los pesos promedio en comparación al control con solución salina con antibióticos reducidos (solución salina 0.5) se muestran en la Figura 37. La administración de IL-5 (con antibióticos reducidos) dio por resultado consistentemente mayores pesos promedio que el control con solución salina (con antibióticos reducidos) durante los periodos de post-destete, crecimiento y pre-sacrificio. La IL-5 también incrementó el peso promedio final de 6 kg (aproximadamente 7%) con respecto a los controles con solución salina. La Figura 38 muestra los pesos promedios en comparación al control con solución salina con antibióticos normales (solución salina+) . La administración de IL-5 (con antibióticos normales) dio por resultado pesos promedio consistentemente mayores que el control salino (con antibióticos normales) desde el final del periodo de postdestete (W6) al final del periodo de crecimiento ( 13) . Se administró IL-5+ durante los periodos de W, G, F, en tanto que se administró IL-5+? durante sólo el periodo de post-destete. La IL-5+ disminuyó el peso promedio final de 1.3 kg (aproximadamente desde -1.5%), en tanto que la IL-5+p incrementó el peso promedio final de 1.7 kg (aproximadamente 2%) . En consecuencia, los cerdos en los grupos tratados con IL-5 tuvieron ganancias de peso promedio consistentemente mayores durante los periodos de post-destete, crecimiento y pre-sacrificio en comparación al control con solución salina sin complementos con antibióticos en agua o alimento. Los resultados también mostraron que los complementos de antibióticos dan por resultado ganancias consistentemente mayores de peso promedio durante los periodos de post-destete, crecimiento y pre-sacrificio en comparación al control con solución salina sin complementos de antibióticos en agua. El tratamiento de IL-5 fue comparable a los complementos de antibióticos en términos de ganancia de peso y muertes reducidas por enfermedad infecciosa. Dentro de los grupos con concentración normal de antibióticos, el control con solución salina tuvo pesos promedio reducidos en comparación a todos los tratamientos con citocina desde el final del periodo de post-destete al final del periodo de crecimiento. Esta tendencia no continúa durante el periodo de pre-sacrificio, donde los pesos promedio finales de todos los grupos con concentración normal de antibióticos fueron similares. La razón de este cambio no se conoce y se observa para el ensayo previo en una granja comercial de cerdos. Esto se resaltó con la diferencia de 6 kg en los pesos promedio entre IL-5+ y el control con solución salina durante el periodo de pre-sacrificio (IL-5+ fue 4.7 kg mayor en la semana 13 y 1.3 kg menor en la semana 19) . Esta discrepancia también se resaltó por la diferencia entre IL-5+ e IL-5+? (IL-5+ fue 1.3 kg mayor en la semana 13 y 2 kg en la semana 19 en comparación a IL-5+?) . La Figura 39 muestra que los tratamientos con citocinas tuvieron valores similares de grasa posterior como se mide por lo valores P2, excepto para los grupos no medicados . Una gráfica de P2 contra peso final para cerdos individuales mostró la diferencia principal entre los grupos con solución salina y con IL-5 que era debida a los pesos individuales menores del grupo con solución salina (Figura 40) . Se midió la FCR en cada periodo y no se detectaron diferencias obvias (datos no mostrados) . También se determinaron los niveles de eosinófilos para todos los grupos y estos se muestran en la Figura 41. La hematología y diferenciales se emprendieron en varios puntos de tiempo durante el ensayo. No hubo cambios significativos entre los grupos para estos parámetros excepto para los niveles de eosinófilos (Figura 41) . La IL-5 incrementó de manera significativa los niveles de eosinófilos en sangre (ambos en términos de números absolutos y diferenciales) . La administración de IL-5 - incrementó substancialmente los pesos promedios de cerdos en comparación a los controles con solución salina. Esto fue particularmente evidente en los grupos sin complementos con antibióticos (IL-5; un peso promedio final incrementado de 12.3 kg ó aproximadamente 15%) . Aunque hubo una diferencia en los grupos con concentración normal de antibiótico entre el control con solución salina y los tratamientos con citocinas, en los periodos de post-destete y de crecimiento, no continuó hasta el final del periodo de pre-sacrificio . Al final del periodo de crecimiento, los cerdos tratados con IL-5 y concentración normal de antibióticos tuvieron pesos promedio incrementados en comparación al control con solución salina. Estos incrementos en la ganancia de . peso fueron substanciales, pero no se tradujeron a ganancia incrementada de peso en la matanza. La IL-5 pareció reducir la pérdida de producción durante el periodo de post-destete en todos los grupos del tratamiento con antibióticos. La IL-5 se mostró que reduce los efectos perjudiciales del estímulo con E. coli. La IL-5 puede incrementar la resistencia a la infección, especialmente con estímulo natural, con o sin complementos con antibióticos en agua o alimento. La IL-5 pareció proteger a los cerdos del estímulo infeccioso y posiblemente tenga efectos promotores de crecimiento en los cerdos sin estímulo de enfermedad severa. La administración de IL-5 también pareció reducir la variación en los pesos o ganancia de peso. La IL-5 redujo los efectos del estímulo de la enfermedad e incrementó de forma consistente los pesos promedio en ausencia de antibióticos en comparación a controles no medicados. La administración de IL-5 tiene efectos substanciales en los incrementos del peso promedio durante el ensayo y no hubo diferencias significativas entre los grupos dada IL-5 durante el post-destete o de manera continua a todo lo largo de los periodos de post-destete, crecimiento y pre-sacrificio . Resumen de los Ensayos de IL-5 Los complementos de antibióticos al agua y alimento a niveles sub-terapéuticos dio por resultado peso promedio mayor (>10%) , ganancia mayor de peso o pesos totales mayores durante el periodo de post-destete (ambos ensayos) . La función de crecimiento incrementado en los grupos medicados de antibióticos al final del periodo de post-destete se tradujo en una productividad incrementada (2-10%) del proceso en la matanza (ambos ensayos) (también peso de cuerpo caliente, primer ensayo) . Este incremento puede haber sido mayor si también se retiraron los complementos de antibióticos desde los periodos de crecimiento y pre-sacrificio en el primer ensayo (todos los cerdos se medicaron durante estos periodos) . Hubo diferencias significativas (P<0.001) entre los controles con solución salina sin antibióticos y con concentración normal de antibióticos en términos de los pesos promedio en la matanza en el segundo ensayo. La IL-5 incrementó de manera significativa los eosinófilos en circulación en sangre (ambos ensayos) . Los efectos benéficos de la IL-5 más medicamento en la función de crecimiento y salud fueron sobresalientes en el primer ensayo. Esto fue evidente a partir del incremento de 18% en el peso total, el incremento de 9% en la ganancia de peso o el 7% en el peso promedio al final del periodo de tratamiento en comparación al grupo de control medicado de solución salina (primer ensayo) . Este resultado se repitió en el segundo ensayo donde IL-5 más grupos de medicación normal tuvieron un incremento de 11% en la ganancia de peso y un incremento de 7% en los pesos promedio con respecto al control medicado de solución salina, respectivo (machos y hembras usados) durante el periodo de post-destete . Los complementos de antibióticos redujeron la pérdida de producción en términos de la pérdida de peso de los cerdos durante el periodo de post-destete (a bos ensayos) . La IL-5 también reduce la pérdida de producción en comparación a los controles respectivos con solución salina (ambos ensayos) . Hubo severo estímulo de enfermedad y mortalidad de 10-20% en todos los grupos excepto para el grupo medicado con IL-5 (primer ensayo) . La IL-5 también redujo la pérdida de producción en términos de pérdida de peso y puede tener resistencia mejorada a la infección en el grupo medicado que no fue evidente para el grupo no medicado. Hubo una severa diarrea post-destete en el segundo ensayo y los complementos con concentración completa de antibióticos y/o IL-5 ó IL-IRAP redujeron la pérdida de producción.

Además de la función incrementada de crecimiento y la pérdida disminuida de producción con la administración de IL-5, hubo variabilidad reducida en el tamaño y crecimiento de los cerdos durante el periodo de post-destete cuando se les administró IL-5. Esta tendencia continuó para el grupo de IL-5 hasta el peso final (D133) . Aunque hubo una tendencia similar en el segundo ensayo con la administración de IL-5, no fue tan significativa la variabilidad reducida. Los grupos tratados con IL-5 obtuvieron pesos promedio significativamente mayores y la ganancia promedio de peso en comparación a los controles respectivos con solución salina (segundo ensayo) . Esto fue particularmente importante para reducir el uso de antibióticos o para incrementar la velocidad de crecimiento de los cerdos criados sin complementos de antibióticos. Esto se resaltó por el hecho que todos los grupos con tratamientos de citocinas (con, sin y con regímenes con contenido reducido de antibióticos) tuvieron mayores pesos promedio y mayor ganancia de peso promedio que cada grupo de control con solución salina, es decir, los grupos de tratamiento de IL-5 sin ningún complemento de antibiótico tuvieron pesos promedio equivalentes o mayores que el grupo con solución salina con medicamento completo. Uno de los parámetros de producción más pertinentes es el peso del animal muerto procesado (peso del cuerpo caliente, visceras, pezuñas y cabeza) . Los cerdos con solución salina, medicados con antibióticos tuvieron un peso promedio de cuerpo caliente de casi 3 kg mayor que el grupo de solución salina sin medicar. En contraste, los cerdos tratados con IL-5, medicados incrementaron el peso promedio del cuerpo caliente por 6 kg con respecto al control medicado de solución salina. Todos los grupos tratados de IL-5 tuvieron pesos promedio equivalentes o mayores del cuerpo caliente, sin vida, al control no medicado de solución salina. Se midieron varios parámetros inmunitarios y de hematología. Aunque la tendencia más obvia comprendió los eosinófilos con la administración de IL-5, todos los parámetros y rasgos de producción se analizaron para la diferencia estadística por una fuente independiente. La Tabla 3 muestra el número de muertes durante el ensayo (días 42 y 133) . Inició con 20 por grupo. Tabla 3 Número de muertes durante ensayo Tratamiento : Solución Solución salina+ IL-5+ salina- IL-5- Post-destete: 3 0 1 2 Final : 4 0 2 3 Las conclusiones sacadas de la Tabla 3 son que no hubieron muertes en el grupo medicado de IL-5 durante el ensayo. También hubieron muertes en los otros grupos que varían desde 10 a 20% al final del ensayo, con la mayoría de las muertes que se presentan durante el periodo de post-destete . Los cerdos medicados de IL-5 y los cerdos con IL-5 sin medicar tendieron a tener un intervalo más consistente de peso que los otros grupos, de modo que es un beneficio económico para algunas granjas de cerdos (Figura 22) . Sólo los grupos con IL-5 medicados tuvieron todos pesos individuales por arriba de 90 kg (se señala que el grupo con IL-5, medicado no tuvo muertes y que las muertes en los otros grupos comprendieron en general cerdos de menor peso) . Como se muestra en la Figura 23, los cerdos tratados con IL-5 tuvieron un por ciento de aliñamiento significativamente que los controles respectivos con solución salina, (p, 0.045). Los cerdos de los grupos medicados tuvieron un mayor % de aliñamiento que los grupos sin medicar. Los cerdos con IL-5, medicados tuvieron un peso substancialmente mayor del cuerpo caliente sin vida que el control con solución salina, medicado. Los grupos medicados tuvieron .mayores pesos del cuerpo caliente sin vida que los grupos sin medicar (Figura 24) . Ejemplo 6.- Distribución de IL-5 recombinante a cerdos post-destetados, infectados con E. coli hemorrágica Este estudio determinó si la IL-5 fue capaz de mejorar la salud de cerdos expuestos a infecciones, tal como E. coli hemorrágica. Una finalidad fue determinar si la IL-5 puede mejorar el crecimiento en cerdos infectados con E. coli en el destete. Una finalidad principal fue determinar si la IL-5 puede reducir las proporciones de infección y mejorar las salud en cerdos infectados con E. coli. Finalmente, se tuvo la esperanza que una valoración del potencial profiláctico o terapéutico, de IL-5 contra infecciones de E. coli en cerdos post-destetados se puede determinar con relación a los actuales tratamientos con antibióticos. Cerdos post-destetados machos, con un peso medio de 5.4 kg se asignaron a grupos de 8, con el peso medio que se iguala entre los grupos. Los grupos se alojaron en corrales de grupo. A los cerdos se les proporcionó alimento granulado y agua ad libitum. Los cerdos se trataron con citocinas o el antibióticos Apralan y se estimularon con E. coli de acuerdo al programa resumido en la Figura 42. Se distribuyeron E. coli de forma oral en una dosis de 8 mi que contiene 10a cfu/ml. Se muestreó la sangre de los cerdos por punción en vena a los -2 días, día 0 y +6 días desde el estímulo inicial con E. coli como se resume en la Figura 42. Se analizó la sangre para los parámetros inmunológicos como se describe de manera previa. Los cerdos se pesaron en el día -2 y al final del ensayo en el día 7. Se tomaron muestras fecales de cada cerdo diariamente desde el día 2 al día 6 después del estímulo; estas muestras se cultivaron en agar en sangre de oveja para cuantificar la carga de E. coli. La condición de las heces en cada día del estímulo se . notó como normal, húmeda o diarrea, como una indicación de los signos clínicos. A la conclusión del experimento, se les practicó la eutanasia a los cerdos y se tomaron muestras de diferentes áreas en el tracto gastrointestinal, incluyendo el intestino delgado (25%, 50%, 75% a lo largo del intestino delgado) , el intestino ciego y el colon y de las heces . Las muestras postmórtem también se colocaron en placa en agar de sangre y oveja para cuantificar la carga de E. coli. El cultivo en agar de sangre de oveja se clasificó de 0 a 5 veces (donde 0 fue sin crecimiento, 1 significó crecimiento en inoculo primario, 2 significó crecimiento en la primera banda, 3 significó crecimiento en la segunda banda, 4 significó crecimiento en la tercera banda y 5 significó crecimiento de E. coli en la banda final) , y la media del grupo y los errores estándar se calcularon. La Tabla 4 muestra los tratamientos y dosis aplicados en el experimento con citocinas. Tabla 4 Tratamientos y dosis Aplicadas en el Experimento con Citocinas (n=8 por grupo) Tratamiento Dosis de tratamiento Solución salina 1 mi IL-5 200 /¿g en 1 mi Apralan 12 mg/kg en 2 mi La Figura 42 muestra la secuencia en línea de tiempo de los eventos para el experimento con citocinas con el estímulo de E. coli. Se puede ver que los cerdos que se trataron con IL-5 o Apralan mejoraron el apetito en comparación a los cerdos tratados con solución salina (Figura 43) . Esta mejora en la escisión no altera la eficiencia de conversión de alimento (datos no mostrados) . El apetito incrementado fue indicativo de salud mejorada y respuestas inflamatorias reducidas. Debido a la corta duración del estímulo, no hubo diferencia significativa entre los grupos de tratamiento para la ganancia de peso durante el periodo de estímulo de 5 días. Los cerdos tratados con IL-5 ? Apralan mostraron extensión disminuida de E. coli en las heces en comparación a los cerdos de control tratados con solución salina (Figura 44) . Los cerdos tratados con Apralan o IL-5 tuvieron extensión bacteriana reducida desde el día 2 al día 5. En el día 6 después del estímulo, la extensión bacteriana de todos los grupos fue igual. En conjunto, el grupo tratado con Apralan exhibió la menor distensión bacteriana de todos los tratamientos. Las puntuaciones fecales contadas durante el periodo completo de estímulo para cada grupo mostraron una disminución de 80% en la extensión fecal para los cerdos tratados con Apralan en comparación a los controles tratados con solución salina, en tanto que los cerdos tratados con IL-5 mostraron una reducción de 43% en la infección bacteriana en comparación a los controles tratados con solución salina (Figuras 45 y 46) . En situaciones comerciales, la extensión bacteriana reducida de cerdos infectados reducirá adicionalmente la re-infección en otros miembros del rebaño o corral, mejorando de este modo la salud de los post-destetados, y mejorando el potencial de crecimiento en las fases tardías . Los signos clínicos, registrados como la presencia de heces húmedas o diarrea, se disminuyeron en cerdos tratados con IL-5 o Apralan (Figura 47) . Los cerdos tratados con IL-5 tuvieron menos casos registrados de heces húmedas y diarrea que los controles con solución salina o tratamiento con Apralan.

Los cerdos tratados con Apralan tuvieron menos registros de heces húmedas que los controles con solución salina, pero también exhibieron un incremento menor en el predominio de la diarrea en el periodo de pre-estímulo (Figura 47) . Cuando estos signos clínicos se describieron como una reducción del porcentaje de los síntomas en comparación a los controles con solución salina, se encontró que el tratamiento con IL-5 produjo una reducción de 64% en los signos clínicos, en tanto que el Apralan provocó que se redujeran por 27% los síntomas clínicos (Figura 48) . Los resultados para los síntomas clínicos demostraron que la IL-5 y el Apralan fueron capaces ambos de reducir los signos exteriores de la infección con E. coli. En esta medida de la salud, la IL-5 se desempeñó también como el Apralan, el tratamiento actual con antibiótico para infecciones de E. coli. Los tratamientos tanto con Apralan como de IL-5 dieron por resultado carga bacteriana reducida en la mayoría de las áreas del tracto gastrointestinal (GIT) en comparación con los controles tratados con solución salina (Figura 49) . El efecto del tratamiento con IL-5 fue más perceptible en el intestino delgado. Cuando todas las puntuaciones de cultivo se contaron para cada cerdo y se usaron para calcular las puntuaciones totales promedio de grupo (Figura 50) , y los cerdos tratados con IL-5 clasificaron menos de 15 de un 30 posibles, en comparación con 17/30 para los cerdos tratados con solución salina, y de 12/30 para cerdos tratados con Apralan. Cuando estos datos se expresaron como una reducción de porcentaje en las puntuaciones de cultivo de E. coli en comparación a los controles con solución salina (Figura 51) , la aplicación profiláctica de IL-5 dio por resultado una reducción de 15% en la cantidad de E. coli en el tracto gastrointestinal. Estos resultados ilustraron que la carga bacteriana se redujo en cerdos tratados con IL-5 en comparación con los controles con solución salina, enfatizando adicionalmente el valor de esta preparación para el control de E. coli hemorrágica en cerdos jóvenes. Cuando los resultados postmortem para cultivos de E. coli se separaron en base a la ubicación en el intestino, se pueden ver diferencias en la acción de IL-5 y Apralan (Figura 52) . La carga bacteriana de E. coli en el intestino delgado (intestino anterior) correlaciona con la severidad de la enfermedad, puesto que el intestino delgado es el sitio en el cual se manifiesta la diarrea secretoria. El tratamiento con IL-5 redujo la carga bacteriana en el intestino delgado por 36% en comparación a los controles con solución salina, en tanto que el Apralan provocó una reducción de 32% en la carga bacteriana en el intestino delgado. En el área del intestino posterior (intestino ciego y colon) . Las cargas bacterianas registradas para Apralan fueron las más bajas de todos los tratamientos (Figura 49) . La capacidad de la IL-5 para reducir la carga bacteriana en el intestino anterior sugiere que el tratamiento pueda reducir la severidad de la enfermedad asociada con infección hemorr gica por E. coli. De esta manera, la IL-5 puede ser un reemplazo o adjunto potencial para los antibióticos actualmente administrados en la industria porcina para el control de efectos perjudiciales de esta enfermedad en la producción de cerdos . Conclusiones La IL-5 mejoró la salud de los cerdos, es decir, redujo los signos clínicos de la enfermedad, en términos de los cambios fecales asociados con diarrea hemorrágica en la presencia de infección hemorrágica por E. coli. También mejoró el apetito durante el estímulo. La mejora en la salud producida por el tratamiento con IL-5 fue en algunos casos mayor que la producida por el tratamiento con el antibiótico Apralan, el método actual de tratamiento de E. coli hemorrágica en cerdos. El tratamiento con IL-5 dio por resultado extensión bacteriana disminuida en heces durante el transcurso de la infección en comparación con los controles tratados con solución salina. Los cerdos tratados con IL-5 mostraron una extensión bacteriana significativamente menor que los controles tratados con solución salina en los días 3/5 después del estímulo. Estos resultados sugirieron que bajo condiciones comerciales, las velocidades de infección se puedan reducir al disminuir la carga bacteriana en el ambiente . El efecto de la administración de IL-5 dio por resultado números disminuidos de bacterias en la mayoría de las áreas de GIT en comparación con los controles tratados con solución salina. De manera significativa, la IL-5 provocó una reducción de 36% en la carga bacteriana en el intestino delgado (intestino anterior) , sitio en el cual normalmente se localiza la diarrea secretoria durante el transcurso de la infección por E. coli. Puesto que la carga bacteriana en el intestino delgado está asociada con la severidad de la infección, la IL-5 puede tener un efecto terapéutico significativo en el progreso y patología de la enfermedad. El tratamiento con IL-5 se desempeña también como el Apralan, el tratamiento actual con antibiótico es usado en la industria, al reducir los signos clínicos en la enfermedad, niveles de E. coli presentes en el intestino a postmórtem, además de E. coli presente en el sitio crucial del intestino delgado . Un resumen de los efectos comparativos de la IL-5 y Apralan en la extensión bacteriana, signos clínicos y carga bacteriana a postmórtem que incluye en la Tabla 5.

Tabla 5 Apralan para el Control de Infecciones Hemorrágicas por E. coli en Cerdos Post-destetados Jóvenes. Las Flechas Oscuras Muestran Efectos Positivos, en tanto que las Flechas Claras Muestran Efectos Negativos en Este Ejemplo Ejemplo 7.- Distribución de IL-5 recombinante como un profiláctico a cerdos expuestos a estímulo de disentería porcina Una finalidad de este ejemplo fue determinar si la IL-5 puede mejorar la salud de cerdos infectados con un patógeno inflamatorio entérico que provoca disentería porcina, Brachyspira (Serpulina) hyodysenteriae. Una finalidad adicionalmente fue determinar si la IL-5 puede mejorar la velocidad de crecimiento de cerdos bajo condiciones de estímulo con disentería porcina. Cerdos machos con un peso promedio de inicio de 6.5 kg, se asignaron a grupos de tratamiento que consisten de ocho cerdos (Tabla 6) . Los cerdos se alojaron en corrales de grupo, con cada corral que contiene una réplica de cada uno de los grupos de tratamiento . Un grupo de 8 cerdos se aloj ó en un cuarto separado y se dejó sin infectar para actuar como controles no tratados. A los cerdos se les proporcionó alimento granulado y agua ad libitum. Antes del estímulo con disentería porcina, los cerdos se trataron con IL-5 recombinante o solución salina, como se describe en la Tabla 6. Se distribuyeron citocinas y el antibiótico, lincomicina, por inyección intramuscular a los intervalos resumidos en la Tabla 7. Los cerdos se infectaron con Brachyspira hyodysenteriae los días 0, día 1 y día 2, dado como un bolo oral de 120 mi de cultivo de espiroquetas en la fase logarítmica de crecimiento, que contiene aproximadamente 108 células. Se tomaron tampones fecales y muestras sanguíneas de cada cerdo a los intervalos descritos en la Tabla 7. Los tampones fecales se cultivaron para la presencia de las espiroquetas. Se analizaron las muestras sanguíneas para los parámetros inmunológicos como se describe en el Ejemplo 1 anterior. Los cerdos se pesaron a intervalos semanales a todo lo largo del experimento, que se terminó por eutanasia en los días 19 y 20 después del estímulo inicial. Los tampones postmórtem de las áreas del intestino posterior se cultivaron para la presencia de espiroquetas y se señaló la condición patológica ordinaria del tejido gastrointestinal.

Tabla 6 Resumen de Grupos de Tratamiento para Ensayo de Estímulo para Analizar la Eficiencia de IL-5 como un Tratamiento Profiláctico para Infección por Disentería Porcina (n=8 por grupo) Tratamiento Dosis de tratamiento Solución sal 1 mi IL-5 1 mi @200 µg/ml Lincocina 2 mi (tal como por instrucciones del fabricante) No tratado No tratado, sin estímulo Tabla 7 Protocolo para Procedimientos Experimentales para Analizar la Eficiencia de IL-5 como un Tratamiento Profiláctico para Infección por Disentería Porcina Todos los grupos de cerdos infectados con disentería porcina se propagaron en espiroquetas en las heces desde el día 5 después del estímulo como se detectó por el cultivo fecal (Figura 53) . Los cerdos tratados con IL-5 mostraron niveles descendentes de extensión de espiroquetas por el día 14 después del estímulo, en comparación al grupo de control tratado con solución salina, sugiriendo que los animales tratados con IL-5 resolvieron su infección más rápidamente que los controles tratados con solución salina. Los cerdos tratados con el antibiótico, lincocina, no mostraron signos de extensión de espiroquetas fecales por el día 14. Los cultivos de espiroquetas tomados del intestino posterior a postmortem mostraron que el tratamiento de cerdos con IL-5 redujo el número de espiroquetas que residen en el intestino en comparación a los controles con solución salina (Figura 54) . La IL-5 fue capaz de reducir las puntuaciones de cultivo de espiroquetas en el intestino ciego, colon anterior, colon posterior y heces en comparación a los controles tratados con solución salina. De manera importante, el efecto de la IL-5 en la reducción de la carga de espiroquetas a postmortem fue comparable con aquella mostrada por el antibiótico lincocina. Aunque se logró un resultado similar como lincocina para la carga de espiroquetas, el tratamiento con IL-5 dio por resultado variación reducida, que implica que resultados más consistentes de tratamiento son posibles con la aplicación de IL-5. En comparación a los cerdos tratados con solución salina, el tratamiento con IL-5 dio por resultado una reducción de 60% en el número de espiroquetas en el intestino ciego, una reducción del 63% en el colon anterior, 47% en el colon posterior y 68% de reducción en las espiroquetas fecales (Figura 55) . El tratamiento con lincocina produjo reducción es respectivas de 93%, 89%, 88% y 100% para la carga de espiroquetas a postmortem. Además de una reducción en el número de espiroquetas en el intestino, el tratamiento con IL-5 también redujo los signos clínicos asociados con la infección indicada por la condición fecal. La Figura 56 muestra que los cerdos tratados con IL-5 mostraron menos signos de heces afectadas con disentería (húmedos y mucoides con sangre) o heces húmedos (heces anormalmente húmedos incapaces de retener la forma) en comparación a los controles tratados por solución salina. De los 8 cerdos tratados con solución salina, 7 mostraron manifestación clínica de disentería porcina determinada por condición fecal, 3 de los cuales fueron de naturaleza mucoide disentérica y sangrienta. El tratamiento con IL-5 redujo la incidencia de los signos clínicos en heces a 3 de 8 cerdos infectados (Figura 56) . Los cerdos tratados con el antibiótico lincomicina tuvieron signos clínicos insignificantes de infección con sólo uno de los 8 cerdos en este grupo que mostró heces húmedas, que fue un resultado comparable con los cerdos de control no infectados.

El tratamiento de los cerdos con IL-5 redujo el número de espiroquetas presentes en el intestino posterior y las heces a postmórtem en comparación con el tratamiento con solución salina. La IL-5 redujo la manifestación clínica de la infección de disentería porcina como se detecta por la condición fecal, en comparación con controles con solución salina. La salud mejorada, como se determina por la condición fecal mejorada, y la presencia reducida de espiroquetas en el intestino y heces a postmórtem con el tratamiento de IL-5, fue comparable a los resultados obtenidos usando el antibiótico lincocina, el terapéutico actual para la infección de disentería porcina en manadas de cerdos . Ejemplo 8.- Administración de IL-3 a cerdos Este ensayo evaluó la capacidad de IL-3 para mejorar la función de crecimiento y la inmunidad de cerdos al comparar la velocidad de crecimiento y salud de cerdos post-destetados (post-destetados de 28 días de edad es el día 0 del ensayo y el periodo de post-destete continúa durante 42 días) hasta la etapa de pre-sacrificio (días 93 a 113) y matanza (133 días después de comenzar el ensayo) , que se administraron con la citocina porcina recombinante, IL-3, y se usó solución salina como un control, con y sin agua y alimento medicado de post-destete, normal en un ambiente comercial de granja de cerdos.

Diseño Experimental Tratamientos Administrado Solución salina Inyección, aguja IM, músculo de cuello, lml dos veces por semanas durante 6 semanas lOO^g IL-3 (en solución salina) inyección, aguja IM, músculo del cuello, dos veces por semana durante 6 semanas de 100 9 de IL-5 en 1 mi de solución salina Se mezclaron 40 cerdos por tratamiento en grupos, con 4 réplicas que contienen agua y alimento medicado normal y 4 réplicas sin agua o alimento medicado. Fueron equivalentes los pesos totales para cada grupo al inicio del experimento . Todos los cerdos al inicio del ensayo (día 0) fueron cerdos post-destetados , machos, de 28 días de edad. La IL-3 se proporciona a la solución salina para inyectar 1 ml/cerdo. Se midieron los pesos al inicio, a todo lo largo del experimento y al final del experimento . El ensayo continuó durante 133 días después del comienzo, es decir, los pesos finales se determinaron y los animales se mataron 133 días después del inicio del periodo del destete. Destete, Días 0-42, Periodo de crecimiento, Días 42-93, Periodo de Pre-sacrificio Días 93-133. Los tratamientos se administraron durante solo el periodo de post-destete.

Las muestras de sangre y suero se recolectaron al inicio (antes de los tratamientos) y al final del periodo de post-destete . Se tomaron sangre y suero antes de la inyección de las muestras . Materiales y Métodos La IL-3 porcina, recombinante se expresó en E. coli y se purificó usando un sistema de marca polyHis como se describe en el Ejemplo 4. La IL-3 se probó para la actividad biológica en un ensayo antes del inicio del experimento . Protocolo emprendido Día 0 Cerdos post-destetados de 28 días de edad pesados y agrupados Día 1 Sangrado . Inyectado grupos Día 6 Inyectado grupos Día 7 (semana 1) Pesado Día 9 Inyectado grupos Día 13 Inyectado grupos Día 14 (semana 2) Pesado Día 16 Inyectado grupos Día 20 Inyectado grupos Día 21 (semana 3) Pesado Día 23 Inyectado grupos Día 27 Inyectado grupos Día 28 (semana 4) Pesado Día 30 Inyectado grupos Día 34 Inyectado grupos Día 35 (semana 5) Pesado Día 37 Inyectado grupos Día 41 Inyectado grupos Día 42 (semana 6) Pesado. Sangrado final. Pasados a corrales de crecimiento (Días 42-93) Etapa de crecimiento. A todos los cerdos se les dio alimento normal y permanecieron en los grupos previos . Pesados durante (D93) y al final de la etapa de crecimiento (D93) (Días 93-133) Etapa de pre-sacrificio . Los cerdos se pasaron a corrales individuales y la ingestión de alimento se midió para la FCR (relación de conversión de alimentos) . A todos los cerdos se les dio alimento normal de pre-sacrificio . Pesado durante (día de experimento (D) 114) y al final de la etapa de pre- sacrificio (matanza D133) . Peso final medido, grasa posterior P2 Notas : + Alimento y agua medicados (antibióticos) Alimento y agua no medicados (sin antibióticos) . Al inicio del ensayo, los pesos promedio y varianza se igualaron entre los grupos. La Figura 57 muestra que la IL-3 implemento la velocidad de ganancia con respecto a los controles medicados y no medicados de solución salina, con la velocidad de ganancia consistentemente mayor en los grupos medicados en comparación a los grupos no medicados . La Figura 58 muestra que el grupo medicado de IL-5 mostró consistentemente mayores pesos promedio que todos los otros grupos . También mostró que los cerdos medicados tienen en general mayores pesos promedio que los grupos no medicados. El peso promedio de los cerdos que se les administró IL-3 en el grupo medicado fue más de 3.5 kg mayor que el peso promedio del control medicado de solución salina.

Los grupos medicados tienen pesos promedio mayores que los grupos no medicados (una diferencia de aproximadamente 3.5 kg entre los controles de solución salina medicados y no medicados) (Figura 59) . La Figura 60 muestra que los cerdos medicados de IL-3 tienen un intervalo más consistente de peso que los otros grupos, lo que es un beneficio económico a las granjas de cerdo, especialmente que requiere menos variación en los pesos finales o animal muerto. Los cerdos no medicados de IL-3 tuvieron un por ciento de aliñamiento substancialmente mayor que el control respectivo con solución salina no medicado y de este modo una mejor calidad del animal muerto (Figura 61) . El peso promedio del cuerpo caliente en la matanza también fue mejor para los cerdos medicados y no medicados tratados con IL-3 que los controles respectivos con solución salina (aproximadamente 4 kg/cerdo y 2 kg/cerdo) (Figura 62) . Los grupos medicados también tuvieron mayores pesos de cuerpo caliente que los grupos no medicados. La FCR para la solución salina y los cerdos medicados tratados con IL-3 fueron similares por ejemplo FCR solución salina+ 2.50 e IL-3+2.52 (barras de error se traslapan) . La Figura 63 muestra que el grupo medicado de IL-3 tuvo un incremento sustancial en el peso total (aproximadamente 10% de incremento) de todos los cerdos en comparación al grupo medicado de solución salina. Aunque el incremento en los pesos totales no fue tan evidente durante el periodo de tratamiento (periodo de post-destete, dias 0-42) , la duración de la respuesta continuó más allá del periodo de tratamiento. Ejemplo 9.- Examen de los, efectos de la IL-3 porcina en poblaciones de células sanguíneas Este ensayo examinó el efecto de la administración de la proteína IL-3 porcina recombinante en las poblaciones celulares en la sangre de los cerdos .

Protocolo emprendido El experimento se llevó a cabo usando alimento medicado (Barastoc EziWean 150 luego Bunge Grolean) ad libitum en un ambiente experimental (instalaciones de contención PC2) . Diseño Experimental Tratamiento Administrado Grupo 1 4 cerdos se les dio diariamente 100 µ< de IL-3 recombinante durante 5 días (días 0, 1, 2, 3, 4) Grupo 2 4 cerdos se les dio 500 µg de IL-3 recombinante en el día 0 Grupo 3 3 cerdos se les dio solución salina en el día 0 Las inyecciones se administraron de manera intramuscular en la pata trasera. Los cerdos eran de 9 semanas de edad al comienzo del ensayo. Se tomaron muestras sanguíneas para hematología los días 0, 1, 2, 3, 4, 7, 9, 11, 15 y 17. Se realizó el análisis completo de hematología, usando el Abbott Cell-Dyn 3700 y el examen de las manchas seleccionas se realizó por confirmación. No hubo cambios o tendencias significativas en las cuentas totales de células sanguíneas blancas, linfocitos, monolitos, plaquetas, neutrófilos o cuentas de células sanguíneas rojas (datos no mostrados). La Figura 64 muestra que existe un incremento en los eosinófilos en cerdos a los que se les dio diariamente IL-3 e incrementos más pequeños en cerdos a los que se les dio una dosis alta única de IL-3. Los Indices (calculados del área bajo la curva) mostraron las diferencias en la media de grupo; aunque hubo una tendencia biológica no fue estadísticamente significativa (Figura 65) . Pareció haber un incremento en el número de eosinófilos en los grupos tratados con IL-3, particularmente el grupo que recibió una alta dosis única, aunque esto puede ser biológicamente significativo no fue estadísticamente significante (Figura 66) . Ejemplo 10.- Examen de los defectos de IL-3 porcina en poblaciones celulares durante una duración más prolongada Este ensayo compara los efectos de la proteína IL-3 porcina recombinante en los números de eosinófilos en la sangre de cerdos durante 8 semanas . Protocolo emprendido El experimento se llevó a cabo usando alimento medicado (Barastoc EziWean 150 luego Bunge Grolean) ad libitum en un ambiente experimental (instalaciones de contención PC2) .

Diseño Experimental Tratamientos Administrado Grupo 1 6 cerdos que se les dio dos veces por semana 100 /¿g de IL-3 recombinante durante 2 semanas (días 0, 3, 7, 10) Grupo 2 6 cerdos se les dio solución salina dos veces por semana durante 2 semanas (día 0, 3, 7, 10) Se administraron inyecciones de manera intramuscular en la pata trasera. Los cerdos eran de 5 semanas de edad al comienzo del ensayo. Se tomaron muestras sanguíneas para hematología en los días 0 (antes de inyección), 1, 2, 3, 4, 7, 8, 10, 11, 15, 22, 29 y 57. Se analizó en análisis completo de hematología usando el Aboott Cell-Dyn 3700. El examen de las manchas seleccionadas se realizó para confirmación. En un experimento más grande con 6 cerdos por grupo, hubo un incremento estadísticamente significativo en los eosinófilos en términos de los números absolutos de eosinófilos en la sangre periférica (Figura 67) para una duración prolongada después de la administración de la citocina . No se observaron tendencias estadísticamente significativas en este experimento para otros tipos celulares medidos (cuentas totales de células sanguíneas blancas, linfocitos, monocitos, plaquetas, neutrófilos o cuentas de células sanguxenas rojas, (datos no mostrados). Ejemplo 11.- Efectos sinérgicos de IL-5 e IL-3 en producción de eosinófilos La finalidad de este ejemplo fue determinar si los efectos de IL-3 e IL-5 actúan de manera sinérgica para incrementar los niveles de eosinófilos y la producción de anticuerpos . Puesto que IL-3 estimula la proliferación de células B-preactivas antes de los efectos de IL-5, se cree que la administración tanto de IL-3 como de IL-5 tendrá un mayor impacto en la producción de eosinófilos que la administración de ya sea citocina sola. Se emprendió un experimento usando cerdos criados bajo condiciones PC2 limpias con pisos elevados. Hubo 5 tratamientos con 6 cerdos por tratamiento. Los cerdos eran de 5-6 semanas de edad. Los animales se inyectaron de manera intramuscular en los días 0, 3, 7 y 10 del experimento con ya sea citocinas recombinantes o solución salina. Los tratamientos incluyen IL-5 e IL-3 sola y se dan ya sea conjuntamente al mismo tiempo en diferentes sitios o al mismo animal pero con IL-3 que se administra una semana antes de IL-5. Los tratamientos fueron como sigue: Grupo 1 - 100 µ9 de IL-3 Grupo 2 - 100 g de IL-5 Grupo 3 - 100 µ de IL-3 + 100/zg de IL-5 (sitios separados) Grupo 4 - 100 µg de IL-3 (semana 1) ; 100zg de IL-5 (semana 2) Grupo 5 - Solución salina Los cerdos se sangraron 4 veces por semana durante las 2 primeras semanas y una vez por semana durante las siguientes 2 semanas y la hematología se midió usando una máquina CellDyn. Se recolectaron los sueros también cada semana y se probaron para los niveles de anticuerpos. Los análisis de los números totales de eosinófilos y los eosinófilos como un por ciento de las células sanguíneas blancas se muestran en las Figuras 68 y 69. Estas figuras muestran que IL-3 sola no incrementó de manera significativa el porcentaje de eosinófilos, en tanto que la IL-5 sola provocó un incremento significativo en los niveles de eosinófilos. El porcentaje de eosinófilos de BC se incrementó con dada dosis repetida de IL-5 y después de cada inyecciones de aproximadamente 10 veces el valor original. No pareció haber ninguna sinergia con IL-3 e IL-5 distribuidas con untamente en la producción de eosinófilos (ni mayor que los cerdos tratados con IL-5) sin embargo, el tratamiento de la primera semana con 2 dosis de IL-3 cebada para una respuesta a IL-5 distribuida en la segunda semana, de modo que 2 dosis equivalentes de IL-5 estimularon los niveles de eosinófilos que fueron equivalentes a 4 dosis de IL-5 (en los cerdos tratados sin IL-3) . La IL-3 es una citocina hematopoyética que actúa de forma temprana en las células madre produciendo células precursoras que incluyen precursores de eosinófilos . Estos resultados indicaron que la IL-3 incrementa las células precursoras de eosinófilos mejorando los efectos subsecuentes de la IL-5. Las Figuras 70-73 muestran las tendencias detectadas en los títulos promedio para cada isotipo de anticuerpo investigado . Las barras de error se traslaparon en cada caso y no se incluyeron. En general, la IL-3 + IL-5 tuvieron un efecto estimulador mayor en células B como se mide por la producción de anticuerpos de lo que lo hizo la IL-5 ó IL-3 sola, sugiriendo un efecto aditivo. Este patrón se dio para los isotipos totales de Ig (Figura 70) , IgA (Figura 71) IgGl (Figura 72) e IgG2 (Figura 73) , pero no para IgM (datos no mostrados) . Conclusiones La IL-5 incrementó drásticamente las células de circulación de eosinófilos, en tanto que la IL-3 produjo incrementos menores en comparación. La IL-3 y la IL-5 no parecen actuar de manera sinérgica cuando se administran conjuntamente con respecto a la producción de eosinófilos; sin embargo, la IL-3 parece cebar la respuesta a IL-5 en términos de los niveles en circulación de eosinófilos. La IL-3 y la IL-5 parecen incrementar de manera sinérgica la producción de anticuerpos, aunque no se detectaron cambios significativos en los niveles de anticuerpos en los sueros con los cerdos mantenidos en condiciones experimentales limpias. Se señala de la literatura que la IL-5 incrementa la producción de IgA sólo con endotoxina bacteriana (por ejemplo LPS) .

Presumiblemente, un ambiente comercial de granja de cerdos ofrecerá un estímulo natural de altos niveles de endotoxina. Ejemplo 12.- Distribución de plásmidos y citocinas recombinantes para mejorar el crecimiento en cerdos infectados con Actinobacillus pleuroneumonae El siguiente experimento se diseñó para determinar si IL-4 puede mejorar el crecimiento de cerdos inmunológicamente estimulados en comparación a controles tratados por solución salina y controles positivos tratados con Flunix, un fármaco anti-inflamatorio, no esteroidal (NSAID) . También se contempló determinar si IL-4 se puede distribuir vía plásmidos . Diseño Experimental Cerdos macho, con un peso promedio de inicio de 52 kg, se asignaron a 5 grupos de tratamiento (Tabla 8) . Los cerdos se alojaron en corrales de grupo, con cada corral que contiene una réplica de cada uno de los grupos de tratamiento. Los cerdos se abastecieron con alimento en granulo y agua ab libitum. La IL-4 recombinante y la solución salina se administraron como dosis de 2 mi, dadas subcutáneamente por detrás de la oreja. Los plásmidos se administraron en dosis de 1 mi, dadas intramuscularmente en la pata trasera. El Flunix se administró como una dosis de 2 mi de acuerdo a las instrucciones del fabricante y se distribuyó intramuscularmente en el cuello. La tabla de tiempo de administración se resume en la Tabla 9 a continuación.

Tabla 8 Tratamientos y Dosis Aplicadas en experimento con Citocinas (N=4 Por Grupo) Tratamiento Dosis de Tratamiento Solución salina 2 mi Flunix 2.2 mg/kg IL-4 100 µg Control con plásmido 100 g IL-4 de Plásmido 100 µ<3 Tabla 9 Protocolo para Procedimientos Experimentales para Valorar la Eficacia de IL-4 como un Tratamiento Profiláctico para la Infección con Actinobacillus Pleuropnemonae Debido a la disponibilidad intermitente de Actinobacillus pleuropneumoniae (App) , el estímulo con App se realizó de manera separada en los dos cuartos, dando por resultado diferentes programas de tiempo de cada cuarto, como se resume en la Tabla 9. Antes de cada estímulo, los cerdos se trataron con citocinas recombinantes, Flunix o plásmidos, como se describe anteriormente; el cronometraje de los tratamientos con respecto al estímulo se describe en la Tabla 9. Los cerdos se anestesiaron y se infectaron de manera intra-traqueal con 7.5 x 108 pfu en el día 0.

Se muestrea la sangre de los cerdos por punción en vena a 0 horas, 24 horas y 14 días después del estímulo. Se analizó la sangre para los parámetros inmunológicos como se describe previamente . En resumen, se realizaron ensayos en muestras sanguíneas usando técnicas normales, que incluyen: cuentas de células sanguíneas blancas realizadas usando un contador celular automatizado; cuentas diferenciales de células realizadas manualmente en manchas sanguíneas teñidas; enumeración de subconjuntos de linfocitos vía citometría de flujo; función de neutrófilos determinada por citometría de flujo; proliferación de linfocitos determinada usando un ensayo de incorporación de timidina y una respuesta a mitógenos; los niveles totales de IgG e IgA se identificaron usando ELISA de intercalación indirecta; niveles de AR m para citocinas pro-informatorias se determinaron por RT-PC . Los niveles de TNF se midieron adicionalmente en suero por bioensayo usando células objetivo L929. Los cerdos se pesaron semanalmente a partir de la distribución de plásmidos y durante 2 semanas después del estímulo. Durante las semanas de estímulo, la IL-4 mejoró el crecimiento de los cerdos (Figura 74) en comparación a los controles tratados con solución salina. Los cerdos tratados con solución salina, Flunix, o plásmido de control mostraron pérdida de peso, en tanto que los cerdos tratados con IL-4 ó IL-4 en plásmido mostraron un crecimiento positivo durante la semana del estimulo. En la semana después del estímulo, todos los grupos de cerdos ganaron peso. Los cerdos tratados con solución salina se recuperaron de manera significativa, en tanto que los cerdos tratados con IL-4 continuaron ganando peso. Los cerdos tratados con plásmidos o flunix tuvieron el crecimiento m s pobre de todos los grupos en la segunda semana de estimulo. La ganancia de peso durante el periodo de 2 semanas después del estímulo con App (Figura 75) mostró que el tratamiento con IL-4 recombinante incrementó la ganancia de peso en comparación a los controles tratados con solución salina, aunque este resultado no fue estadísticamente significativo. Existe una diferencia en el peso en la matanza. El flunix fue el tratamiento con el desempeño más pobre en términos de crecimiento, en comparación a los controles tratados con solución salina. Los cerdos tratados con el plásmido de IL-4 tuvieron un crecimiento considerablemente mejorado durante el periodo completo de estímulo de 2 semanas en comparación a sus controles tratados con plásmido (Figura 75) pero equivalente el crecimiento de los controles tratados con solución salina. Las citocinas pro-inflamatorias, T F a e IL-6 se elevaron en varios grupos después del estímulo con App, en comparación a los niveles de pre-estímulo. De manera interesante, el NSAID Flunix, falló en inhibir la producción de TNFQ (Figura 76) , que ayuda a explicar el pobre crecimiento visto en este grupo. La IL-4, el control con plásmido y el plásmido con IL-4 tuvieron niveles reducidos de producción de TNF de lo que lo tuvo los controles tratados con solución salina y tratados con Flunix en el día 13 después del estímulo. Todos los tratamientos redujeron la producción de IL-6 24 horas después del estímulo en comparación con los controles tratados con solución salina (Figura 77) . Desdichadamente, los datos de IL-6 no se pueden recuperar para el tratamiento con solución salina a los 13 días después del estímulo con ATP debido a un error de muestreo. Después de 13 de estímulo, los cerdos tratados con IL-4 como ya sea plásmido o recombinante, tuvieron niveles reducidos de la citocina pro-inflamatoria, IL-6, en comparación a los cerdos tratados con Flunix. La IL-4 en plásmido no redujo la producción de IL-6 en comparación al control con plásmido. La IL-4 recombinante redujo la producción de IL-6 a niveles indetectables en el día 13 después del estímulo con App. En tanto que los tratamientos con citocina anti-inflamatoria provocan reducciones en los niveles de las citocinas pro-inflamatorias en la circulación, y eh algunos casos mejora el crecimiento, la relación entre las citocinas pro-inflamatorias y el crecimiento deteriorado aún no es clara. Sin embargo, de forma importante, los grupos de cerdos con niveles reducidos de citocinas pro-inflamatorias fueron típicamente los grupos que también tuvieron la menor inhibición de crecimiento en la primera semana después del estímulo. Además de mejorar el crecimiento de cerdos, se encontró que el tratamiento con citocina puede mejorar la salud de los cerdos expuestos a estímulo con App. Los datos en la Figura 78 muestran puntuaciones clínicas promedio por visita durante 30 visitas llevadas a cabo durante la primera semana de estímulo. La severidad de los síntomas exhibidos por cada cerdo, tal como letargo, ataque de tos y parámetro de respiración se clasificaron de 0-8, de cerdos que murieron o se les practicó la eutanasia se les dio arbitrariamente una puntuación de 8 a cada visita subsiguiente. Los cerdos tratados . con IL-4 recombinante tuvieron signos clínicos de enfermedad ligeramente reducidos en comparación a los controles tratados con solución salina (Figura 78) . La IL-4 distribuida como un plásmido también dio por resultado síntomas clínicos reducidos en comparación a los cerdos de control con plásmido y solución salina. La IL-4 distribuida como un recombinante provocó una reducción de 36% en la presencia de síntomas clínicos en comparación a los cerdos tratados con solución salina, en tanto que la IL-4 distribuida en forma de plásmido produjo una reducción de 62% en comparación a los controles tratados con solución salina (reducción de 45% en comparación a los controles tratados con plásmido) . La IL-4 distribuida como plásmido recombinante fue más efectiva que el Flunix en la reducción de los síntomas clínicos de infección de App. A la conclusión del ensayo, se les practicó la eutanasia a los cerdos y los pulmones se removieron para el examen postmórtem. Los pulmones se clasificaron por pleuresía de 0-5 (Figura 79) y se determinó el grado de pleuropneumonía al pesar el pulmón afectado y se expresa como un porcentaje del peso total del pulmón (Figura 80) . Los cerdos tratados con Flunix tuvieron menos pleuresía que los controles con solución salina. Los cerdos tratados con IL-4 tuvieron el mismo nivel de pleuresía como los controles tratados con solución salina. Aunque los cerdos tratados con IL-4 distribuida como plásmido tuvieron menos pleuresía que sus controles tratados con plásmidos, su nivel de pleuresía no fue menor que aquel de los controles tratados con solución salina (Figura 79) . El porcentaje del pulmón afectado por las lesiones de App se redujo grandemente en cerdos tratados con Flunix, IL-4 recombinante o IL-4 en plásmido en comparación con controles tratados con solución salina (Figura 80) . Conclusiones La IL-4 recombinante fue capaz de incrementar enormemente el crecimiento de cerdos en comparación a los controles tratados con solución salina durante la primera semana de estímulo de App. Los cerdos tratados con IL-4 fueron subsecuentemente 4.8 kg más pesados al término del experimento, después de 2 semanas de estímulo que sus semejantes tratados con solución salina, lo que representa una mejora en el crecimiento de 73%. Los cerdos tratados con Flunix tuvieron el crecimiento más bajo durante el periodo de estimulo de 2 semanas . La IL-4 en plásmido fue capaz de mejorar el crecimiento de los cerdos en comparación a los controles tratados con solución salina y los controles tratados con plásmido durante la primera la semana de estímulos de App. En la conclusión del ensayo de estímulo de 2 semanas, los cerdos tratados con IL-4 en plásmido fueron más pesados que sus contrapartes tratados con plásmido, pero iguales en peso a los cerdos tratados con solución salina. La IL-4 recombinante, control con plásmido e IL-4 en plásmido fueron capaces de reducir la producción de las citocinas pro-inflamatorias TNFa e IL-6 que están asociadas con pobre función de crecimiento. El Flunix fue capaz de reducir la producción de solo IL-6. La IL-4 redujo la severidad de los síntomas clínicos de la enfermedad durante el estímulo, puesto que la IL-4 se distribuyó como plásmido. El Flunix fue capaz de reducir el nivel de pleuresía visto a postmórtem. El Flunix, la IL-4 recombinante y la IL-4 en plásmido redujeron todos el porcentaje de pulmón afectado por lesiones de App, en comparación a los controles tratados con solución salina y tratados con plásmido. Ejemplo 13.- Distribución de IL-4 recombinante como un profiláctico La finalidad de este ejemplo fue determinar si la IL-4 puede mejorar la salud de cerdos infectados con un patógeno inflamatorio entérico que provoca disentería porcina, Brachyspira (Serpulina) hyodysenteriae. Una finalidad adicional fue determinar si la IL-4 puede mejorar la velocidad de crecimiento de los cerdos bajo condiciones de estímulo con disentería porcina. Diseño de Experimento Cerdos macho con un peso promedio de inicio de 6.5 kg, se asignaron a grupos de tratamiento que consisten de ocho cerdos (Tabla 10) . Los cerdos se alojaron en corrales de grupo, con cada coral que contiene una réplica con cada uno de los grupos de tratamiento. Un grupo de 8 cerdos se alojó en un cuarto separado y se dejó sin infectar para actuar como controles no tratados. A los cerdos se les proporcionó alimento en granulo y agua ad libitum. Antes del estímulo con disentería porcina, los cerdos se trataron con IL-4 recombinante o solución salina, como se describe en la Tabla 3. Se distribuyeron citocinas y el antibiótico, lincocína, por inyección intramuscular a los intervalos resumidos en la Tabla 11. Los cerdos se infectaron con Brachyspira hyodysenteriae en el día 0, día 1 y día 2, se les dio como un bolo oral de 120 mi de cultivo de espiroquetas en la fase logarítmica de crecimiento, que contiene aproximadamente 108 células. Se tomaron tampones fecales y muestras sanguíneas de cada cerdo a los intervalos descritos en la Tabla 11. Los tampones fecales se cultivaron para la presencia de espiroquetas . Las muestras sanguíneas se valoraron para los parámetros inmunológicos como se describe en el Ejemplo 1 anterior. Los cerdos se infectaron a intervalos semanales a todo lo largo del experimento, que se terminó por eutanasia los días 19 y 20 después del estímulo inicial. Los tampones a postmórtem de las áreas del intestino posterior se cultivaron para la presencia de espiroquetas, y se señaló la condición patológica ordinaria del tejido gastrointestinal. Tabla 10 Resumen de Grupo de Tratamiento para Ensayo de Estímulo para Valorar la Eficacia de IL-4 como un Tratamiento Profiláctico para Infección por Disentería porcina (N=8 por Grupo) Tratamiento Dosis de Tratamiento Solución salina 1 mi IL-4 10 mi @200 Mg/ml Lincocina 2 mi (tal como instrucciones de fabricantes) No tratado No tratamiento, no estímulo Tabla 11 Protocolo para Procedimientos Experimentales para Valorar la Eficacia de IL-4 como un Tratamiento Profiláctico para Infección por Disentería porcina Todos los grupos de cerdos infectados con disenteria porcina tuvieron extensión de espiroquetas en las heces desde el día 5 después del estímulo como se detecta por cultivo fecal (Figura 81) . Los cerdos tratados con IL-4 mostraron niveles disminuidos de extensión de espiroquetas por el día 14 después del estímulo, en comparación al grupo de control tratado con solución salina, sugiriendo que los animales tratados con IL-4 resolvieron más rápidamente que los controles tratados con solución salina. Los cerdos tratados con el antibiótico lincocina no mostraron signos de extensión de espiroquetas fecales por el día 14. Los cerdos sin estímulo no extendieron ninguna espiroqueta durante la duración del ensayo (Figura 81) . Los cultivos de espiroquetas tomados del intestino posterior a postmortem mostraron que el tratamiento de los cerdos con IL-4 redujo significativamente el número de espiroquetas que residen en el intestino en comparación a los controles con solución salina (P<0.05; Figura 82) . La IL-4 fue capaz de reducir las puntuaciones de cultivo de espiroquetas en el intestino ciego, colon anterior, colon posterior y heces en comparación a los controles tratados con solución salina. De manera importante, la IL-4 se desempeñó también como el tratamiento con antibiótico lincocina en la reducción de un número de espiroquetas en el intestino ciego y colon a postmortem. Como se esperó, los cerdos que no se estimularon con disentería porcina no tuvieron espiroquetas en su intestino posterior o heces a postmortem.

En comparación a los cerdos tratados con solución salina, el tratamiento con IL-4 dio por resultado una reducción de 91 % del número de espiroquetas en el intestino ciego, una reducción de 93 % en el colon anterior, 84 % en el colon posterior y 86 % de reducción en las espiroquetas fecales . Además de una reducción en el número de espiroquetas en el intestino, el tratamiento con IL-4 también redujo los signos clínicos asociados con infección, indicado por condición fecal. La Figura 83 muestra que los cerdos tratados con IL-4 mostraron menos signos de heces afectadas por disentería (húmedas y mucoides con sangre) o heces húmedas (heces anormalmente húmedas incapaces de retener la forma) en comparación a controles tratados con solución salina. De los 8 cerdos tratados con solución salina, 7 mostraron manifestación clínica de disentería porcina determinada por condición fecal, 3 de los cuales fueron de naturaleza mucoide disentérica y sangrienta. El tratamiento con IL-4 redujo la incidencia de signos clínicos en heces en 3 de 8 cerdos infectados, con solo 1 cerdo que muestra signos de heces sangrientas y mucoides asociadas con infección severa con disentería porcina (Figura 83) . Los cerdos tratados con el antibiótico Lincomicina tuvieron signos clónicos de infección imperceptibles con sólo 1 de los 8 cerdos en este grupo que muestra heces húmedos, que fue un resultado comparable con los cerdos de control no infectados. Como se espera con la diferencia en el número de espiroquetas y la presencia de signos químicos señalados entre los grupos de tratamiento, también hubo diferencias en el grado de patología asociada a infección, vista en el intestino a postmórtem (Figuras 84 y 85) . El tratamiento con IL-4 redujo los signos de patología asociada con disentería, y la severidad de la patología en comparaciones en solución salina en el cual el anterior, y previno completamente el desarrollo de la patología en el colon posterior. El tratamiento con Lincocina redujo la incidencia de síntomas patológicos en el colon anterior y posterior, en tanto que redujo la severidad de los cambios patológicos en el intestino ciego (datos no mostrados) . Estos resultados confirmaron que la IL-4 y Lincocina fueron ambos capaces de reducir el efecto perjudicial de la infección por disentería porcina en la salud de los cerdos. La IL-4 se conoce que tiene efecto antiinflamatorio en el sistema inmunitario, de esta manera, una reducción en los cambios patológicos inflamatorios en el intestino asociado con disentería no se puede atribuir tanto a propiedades anti-inflamatorias de esta citocina como una carga reducida de espiroquetas (como se ve en la figura 82) . Además de reducir la severidad de la infección por disentería porcina en cerdos, el tratamiento con IL-4 fue capaz de mejorar la velocidad de crecimiento de los cerdos durante la fase de estimulo (Figura 86) , peso final en matanza (Figura 87) y peso ganado (Figura 88) . Antes del estímulo o tratamiento, los grupos mostraron el mismo peso promedio de 6.5 kg (Figura 86, días -7) . Al final del ensayo en los días 19 y 20, los cerdos tratados con IL-4 pesaron 15.1 kg en comparación con 13.6 kg para cerdos tratados con solución salina (Figura 87) , una mejora de 11 % en el peso final. De manera comparable, al final del ensayo, el peso de los cerdos tratados con Lincocina fue de 12.2 kg, y el peso de los cerdos no estimulados fue de 12.1 kg. El peso total ganado durante el periodo de estímulo para cerdos atados con IL-4 fue de 8.5 kg en comparación con 6.9 kg para tratamientos tanto con solución salina como con Lincomicina y 6.5 kg para cerdos no estimulados (Figura 88). La mejora en la ganancia durante el periodo de ensayo producida por el tratamiento con IL-4 en comparación al tratamiento con solución salina o antibiótico fue de 24 %, desde el día 7 antes del estímulo a la matanza en los días 19 y 20 (Figura 88) . De manera inesperada, los cerdos no estimulados mostraron la función más pobre de crecimiento de todos los grupos, que puede ser el resultado de que se alojaron en un cuarto separado para prevenir la contaminación cruzada, y de esta manera, no se pueden eliminar los efectos del cuarto. Aunque no hubo diferencias significativas entre los grupos de tratamiento para el peso, el tratamiento con IL-4 redujo la variabilidad al incrementar el peso ganado por los cerdos más pequeños. En la experiencia previa con modelos de estimulo, y en realidad en situaciones de campo, los cerdos más susceptibles a infección tienden a ser los de menor peso. La capacidad de la IL-4 para aumentar el peso de los cerdos más pequeños bajo condiciones de estimulo puede ser capaz de reducir la susceptibilidad de estos animales más pequeños a infecciones vistas en condiciones comerciales. Conclusiones El tratamiento de cerdos con IL-4 redujo de manera significativa el número de espiroquetas presentes en el intestino posterior y las heces a postmórtem en comparación con el tratamiento con solución salina. La IL-4 redujo la manifestación clínica de la infección por disenteria porcina como se detecta por condición fecal, en comparación con controles con solución salina. Los cerdos tratados con IL-4 o Lincocina mostraron signos reducidos de patología urinaria, normalmente asociados con disentería porcina en comparación a los cerdos tratados con solución salina. La mejora en la salud, como se determina por los signos químicos reducidos, patologías reducidas y-presencia reducida de espiroquetas en el intestino y las heces, con el tratamiento de IL-4, fue comparable a los resultados obtenidos usando el antibiótico Lincocina, el producto terapéutico actual para la infección por disentería porcina en manadas de cerdos . El tratamiento de cerdos con IL-4 dio por resultado crecimiento mejorado en comparación a todos estos grupos de tratamiento. Al final del ensayo, los cerdos tratados con IL-4 fueron 12% más pesados que sus contrapartes tratadas con solución salina, y 15% más pesados que los cerdos tratados con Lincocina. El peso ganado durante el periodo experimental fue 24% mayor en el grupo tratado con IL-4 en comparación a los tratamientos con solución salina o Lincocina; el incremento en peso fue más notable en cerdos con un peso de inicio más pequeño . La IL-4 como profiláctico para mejorar el crecimiento y salud de los cerdos expuestos a infección. Se ha mostrado que la IL-4 mejora la salud de cerdos en dos modelos de infección: Actinohacillus pleuropneumoniae (App) y Brachyspira (Serpulina) hyodysenteriae (disentería porcina) . Y las mejoras en la salud en ambos modelos se describieron por síntomas clínicos reducidos durante la infección de una reducción en la patología asociada a infección a postmórtem. En el modelo de disentería porcina, también se notó extensión reducida de espiroquetas. La capacidad del tratamiento profiláctico con IL-4 para mejorar la salud de los cerdos fue comparable al desempeño de las normas industriales actuales del tratamiento con antibióticos. De esta manera, la IL-4 tiene un potencial como una alternativa, o complemento con, tratamiento con antibióticos o preventiva, para App y disenteria porcina en cerdos. El potencial de la IL-4 como un promotor de salud se puede mejorar adicionalmente por la aplicación concurrente con productos terapéuticos de antibióticos. Adicionalmente, se mostró que la IL-4 mejora la función de crecimiento de cerdos bajo ambos modelos de estímulo con enfermedad. Este efecto no se vio en los grupos a los cuales se les administró los antibióticos terapéuticos actuales usados para tratar estas infecciones . De esta manera, la IL-4 exhibe no sólo propiedades de promoción de salud sino también potencial de promoción de crecimiento . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES
Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Uso de una composición que comprende : (a) una cantidad promotora de crecimiento de una o más citocinas o fragmentos biológicamente activos de las mismas; y/o (b) un agente que incrementa o complementa el nivel de una o más citocinas endógenas a un nivel promotor del crecimiento, tal que la función de crecimiento del animal se incrementa con respecto a la lograda en la ausencia del agente; composición o agente que se administra de manera. opcional en combinación con uno o ambos de : (i) un portador, adyuvante o vehículo farmacéutico, y (ii) un antibiótico. 2. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde la composición se administra en combinación con el antibiótico .
3. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el agente se administra al animal.
4. El uso de conformidad con la reivindicación 4, en donde la composición y el agente se administran, con el agente que se administra antes de, junto con, o subsiguiente a la administración de la composición.
5. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde la citocina de la composición o la citocina endógena se selecciona del grupo que consiste de interleucina 1 (IL-1) , interleucina 2 (IL-2) , interleucina 3 (IL-3) , interleucina 4 (IL-4) , interleucina 5 (IL-5) , interleucina 6 (IL-S) , interleucina 7 (IL-7) , interleucina 10 (IL-10) , interleucina 11 (IL-11) , interleucina 12 (IL-12) , interleucina 13 (IL-13) , factor de estimulación de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) , factor de estimulación de colonias de granulocitos (G-CSF) , factor de estimulación de colonias de macrófagos (M-CSF) , eritropoyetina (Epo) , factor de células madre (SCF) , factor de inhibidor de leucocitos (LIF) , factor-beta de crecimiento (TGFp) y factor alfa de necrosis de tumor (TNFoc) .
6. El uso de conformidad con la reivindicación 3, en donde la citocina de la composición o la citocina endógena se selecciona del grupo que consiste de IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, Epo, SCF, LIF, TGFp y TNF .
7. El uso de conformidad con la reivindicación 5, en donde la citocina de la composición o la citocina endógena se selecciona del grupo que consiste de IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, 1L-11, IL-12, IL-13, G -CSF, G-CSF, M-CSF, Epo, SCF, LIF, TGF Y TNFa.
8. El uso de conformidad con la reivindicación 7, en donde la citocina se selecciona del grupo que consiste de IL-3, IL-4, IL-5 y GM-CSF.
9. El uso de conformidad con la reivindicación 8 , en donde la citocina es ya sea IL-3, IL-4 o IL-5.
10. El uso de conformidad con la reivindicación 3, en donde la administración del antibiótico es antes de o subsiguiente a la administración de la composición.
11. El uso de conformidad con la reivindicación 6, en donde la administración del antibiótico es antes de ó subsiguiente a la administración de la citocina.
12. El uso de conformidad con la reivindicación 7, en donde: (i) la citocina es IL-3, IL-4, IL-5 ó GM-CSF ; y (ii) el antibiótico se administra antes de o subsiguiente a la administración de la composición.
13. El uso de conformidad con la reivindicación 11, en donde la citocina es IL-3, IL-4 ó IL-5.
14. El uso de conformidad con la reivindicación 4, que incluye la administración del antibiótico.
15. El uso de conformidad con la reivindicación 5, que incluye la administración del antibiótico.
16. El uso de conformidad con la reivindicación 6, en donde el antibiótico se selecciona a partir del grupo que consiste de amoxicilina, penicilina, procaína, ampicilina, cloxacilina, penicilina G, benzatina, benetamina, ceftiofur, cefalonio, cefuroxima, eritromicina, tilosina, tilmicosina, oleandomicina, quitasamicina, lincomicina, espectinomicina, tetraciclina, oxitetraciclina, clortetraciclina, neomicina, apramicina, estreptomicina, avoparcina, dimetridazol , una sulfonamida, bacitracina, virginiamicina, monensina, salinomicina, lasalocid, narasina, olaquindox y combinaciones de cualquiera de los antibióticos anteriores .
17. El uso de conformidad con la reivindicación 16, en donde el antibiótico es (i) lincomicina, (ü) espectinomicina, (iii) amoxicilina o (iv) una combinación de cualquiera de dos o más de (i) - (iii) .
18. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde la administración es oral, tópica, o parenteral .
19. El uso de conformidad con la reivindicación 3, en donde la administración es oral, tópica, o parenteral.
20. El uso de conformidad con la reivindicación 4, en donde la administración es oral, tópica, o parenteral.
21. El uso de conformidad con la reivindicación 6, en donde la administración es oral, tópica, o parenteral.
22. El uso de conformidad con la reivindicación 8, en donde la administración es oral, tópica, o parenteral.
23. El uso de conformidad con la reivindicación 22, en donde la administración parenteral es por (a) inyección subcutánea, (b) instilación por aerosol, (c) inyección o infusión intravenosa, (d) inyección intramuscular, (e) inyección o infusión intratecal, (f) inyección intraesternal , (g) infusión por una ruta diferente de (c) ó (e) , o (h) al proporcionar células encapsuladas .
24. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde la administración de uno o más de la composición, agente, y antibiótico, es por ya sea una unidad de dosis única o unidad de dosis múltiple.
25. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde la administración de uno o más de la composición, agente, y antibiótico es oral como un aditivo o en el agua para beber, alimento o ambos.
26. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde la función de crecimiento del animal se mide o determina por uno o más de los siguientes criterios : (a) un incremento en la velocidad de crecimiento, (b) un incremento en la eficiencia del uso del alimento. (c) un incremento del peso final, (d) un incremento en el peso aliñado, o (e) una disminución en el contenido de grasa.
27. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde la función mejorada de crecimiento del animal resulta de o está asociada con (i) inmuno-mejoramiento, (ii) efectos antiparásitos, (iii) otros efectos anti-microbianos (iv) efectos anti-inflamatorios o (v) reducción de tensión.
28. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el animal es ya sea un Artiodáctilo o un ave.
29. El uso de conformidad con la reivindicación 28, en donde el animal es un Artiodáctilo seleccionado del grupo que consiste de un bovino, un porcino, un ovino, un camélido, un caprino y un equino.
30. El uso de conformidad con la reivindicación 28, en donde el animal es un ave seleccionada del grupo que consiste de un pollo, un pavo, un ganso y un pato.
31. Una composición promotora de crecimiento, caracterizado porque comprende: (a) una o más citocinas o un fragmento biológicamente activo de las mismas; (b) uno o más antibióticos; y (c) opcionalmente, un portador, adyuvante o vehículo farmacéutico.
32. Una composición promotora de crecimiento de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque la citocina se selecciona del grupo que consiste de IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, GM-CSP, G-CSF, M-CSF, Epo, SCF, LIF, TGF y TNFa.
33. Una composición promotora de crecimiento de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque la citocina es IL-3, IL-4, IL-5 ó GM-CSF. 3 . Una composición promotora de crecimiento de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque la citocina es IL-3, IL-4 ó IL-5.
34. Una composición promotora de crecimiento de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque el antibiótico se selecciona del grupo que consiste de amoxicilina, penicilina, procaína, ampicilina, cloxacilina, penicilina G, benzatina, benetamina, ceftiofur, cefalonio, cefuroxima, eritromicina, tilosina, tilmicosina, oleandomicina, quitasamicina, lincomicina, espectinomicina, tetraciclina, oxitetraciclina, clortetraciclina, neomicina, apramicina, estreptomicina, avoparcina, dimetridazol , una sulfonamida, bacitracina, virginiamicina, monensina, salinomicina, lasalocid, narasin, olaquindox y combinaciones de cualquiera de dos o más de los antibióticos anteriores . 36. una composición promotora de crecimiento de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque el antibiótico es (i) lincomicina, (ii) espectinomicina, (iii) amoxicilina o (iv) una combinación de cualquiera de (i) - (iii) - 37. El uso de una o más moléculas de ácido nucleico que codifican para una o más citocinas o que codifican para un fragmento biológicamente activo de las mismas, en la elaboración de una composición promotora de crecimiento, en donde la expresión de la molécula de ácido nucleico o moléculas, da por resultado la presencia en el animal de una cantidad promotora de crecimiento de la citocina o fragmentos . 38. El uso de conformidad con la reivindicación 37, en donde la molécula de ácido nucleico se administra por inyección subcutánea, inyección intravenosa o infusión, inyección intramuscular o en la forma de un aerosol . 39. El uso de conformidad con la reivindicación 37, en donde la molécula de ácido nucleico se administra en una cantidad de aproximadamente 1 µg a aproximadamente 2000 µ9 por dosis. 40. El uso de conformidad con la reivindicación 37, en donde la molécula de ácido nucleico se administra en una cantidad de aproximadamente 5 µ a aproximadamente 1000 µg por dosis. 41. El uso de conformidad con la reivindicación 37, en donde la molécula de ácido nucleico se administra en una cantidad de aproximadamente 6 µg a aproximadamente 200 µg por dosis. 42. El uso de conformidad con la reivindicación 37, en donde la molécula de ácido nucleico se administra en o como un vector o como ADN desnudo. 43. Un método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el vector es un vector de adenovirus porcino . 44. Una construcción para distribuir in vivo una cantidad efectiva de una o más citocinas o un fragmento biológicamente activo de las mismas, caracterizada porque comprende : (a) una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican para la citocina o citocinas o el fragmento biológicamente activo; (b) una o más secuencias de control capaces de controlar la expresión de las secuencia o secuencias de nucleótidos tal que la secuencia de codificación se exprese in vivo dando por resultado la promoción de una cantidad promotora de crecimiento del fragmento de citocina que es efectiva en la mejora de la función del crecimiento de un animal .