MXPA02012733A

MXPA02012733A - Extrusturas recombinantes y su uso en la reduccion de la expresion de genes.

Info

Publication number: MXPA02012733A
Application number: MXPA02012733A
Authority: MX
Inventors: Anthony J Kinney
Original assignee: Du Pont
Priority date: 2000-06-23
Filing date: 2001-06-22
Publication date: 2003-05-14
Also published as: US7897383B2; EP1297163B1; HUP0302320A3; EP1297163A2; US20090142829A1; HUP0302320A2; BR0111839A; US20060247202A1; DE60144517D1; US20030036197A1; CA2408326A1; ATE507300T1; WO2002000904A3; JP2004512020A; WO2002000904A2; US7456014B2; AU2001272977A1

Abstract

Se describen estructuras recombinantes utiles para reducir las expresion de un ARNm endogeno y cualquier ARNm endogeno substancialmente similar. En particular, un estructura recombinante que comprende, inter alia, una secuencia adecuada de acido nucleico y su complemento inverso, se puede usar para alterar la expresion de algun ARN homologo, endogeno (esto es, el ARN objetivo) que esta en proximidad con esta secuencia adecuada de acido nucleico.

Description

ESTRUCTURAS RECO BINANTES Y SU USO EN LA REDUCCIÓN DE LA EXPRESIÓN DE GENES.

Campo de la Invención. Esta invención se refiere a la reducción de la expresión de genes y en particular, a estructuras recombinantes útiles para reducir la expresión del ARNm endógeno y cualquier ARNm endógeno substancialmente similar. Antecedentes de la Invención. El desarrollo de plantas es un proceso complejo fisiológico y bioquímico, que requiere la expresión coordinada de muchos genes . La producción de nuevas variedades de plantas con características nutricionales mejoradas o resistentes a las enfermedades, se puede alcanzar al modificar este patrón coordinado de la expresión de genes. Las técnicas recombinantes del ADN, han hecho posible alterar los patrones de expresión de genes de plantas específicos, individuales, sin afectar directamente la expresión de otros genes de plantas. De esta manera, el patrón de expresión de un gen individual, se puede aumentar o disminuir en la planta completa, en tejidos específicos, o en etapas de desarrollo. Así, es ahora de rutina construir t'ransgenes con promotores y terminadores definidos y expresarlos en una diversidad de organismos . Sin embargo, existen algunos reportes en la literatura REF: 143303 de que algunos transgenes introducidos, no tienen los patrones de expresión esperados. Estos patrones de expresión inesperados, se observan en organismos tan diversos como los nemátodos y las plantas. Por ejemplo, algunas plantas que reciben copias transgénicas de un gen endógeno bajo el control de un promotor fuerte, fallan algunas veces al acumular el ARNm para ese gen. Adicionalmente, todo el AR?m de los genes endógenos que tienen homología de secuencia con el transgen, también fallan al acumular el ARNm, eliminando efectivamente la expresión del producto de genes endógenos.

Esto se descubrió originalmente cuando los transgenes de la chalcona sintasa en la petunia, ' provocaron la supresión de los genes endógenos de la chalcona sintasa (?apoli et. al. (1990) Plant Cell 2:279-289). El fenómeno se refiere como "co-supresión" ya que la expresión del gen endógeno y el transgen introducido se suprimieron (para revisiones ver Vaucheret et . al. (1998) Plant J 16:651-659; y Gura (2000) ?ature 404:804-808). La tecnología de co-supresión, constituye la materia objeto de la patente de E.U.A. número 5,231,020, concedida a Jorgensen et . al de Julio 27 de 1999. La co-supresión también se refiere como "silenciamiento de genes" o silenciamiento de genes post-transcripcional (PTGS) por los biólogos de plantas, la "interferencia del ARN" por aquellos que estudian los gusanos y moscas (Montgomery y Fire (1998) TIG 14:255- 258; Fire et al (1998) Nature 391:806-811; Hammond et al (2000) Nature 404:293-296; y Solicitud PCT No . WO 99/32619 publicada el 1 de julio de 1999) y "la represión" por investigadores que trabajan con los hongos (Romano y Macino (1992) Mol Microbiol 6:3343-3353). Los mecanismos por los cuales se inhibe la expresión de un gen específico, por genes de ARN de sentido o de antisentido, no se entiende claramente y las frecuencias de obtención de la sub-regulación deseada en una planta transgénica, son generalmente bajas y varían con el gen, la resistencia de su promotor y especificidad, el método de transformación, y la complejidad de los eventos de inserción del transgen (Grant (1999) Cell 96:303-306; y Selker (1999) Cell 97:157-160) . La especulación es que el PTGS es un mecanismo de autodefensa antiguo, que evolucionó para combatir infecciones por virus y transposones . Parece que esta resistencia derivada del patógeno, se activa por la presencia en las células del hospedador de AR? de hebra doble (dsAR?) o de algún otro ácido nucleico aberrante, que es indicador de un asalto viral. Normalmente, el ARN que se mueve libremente alrededor de una célula, debe ser un ARN mensajero de hebra simple (ARNm) que es el intermediario entre los genes hospedadores y las proteínas que codifican. Cuando el AR? aberrante invade, se apagan entonces algunos AR?m que corresponden con la secuencia invasora de ácido nucleico. Si la activación es homologa para una parte de la secuencia genética del hospedador, entonces los genes hospedador y viral se silencian (Baulcombe (1996) Plant Cell 8:1833-1844). La WO 99/15682 que se publicó el 1 de Abril de 1999 y WO 98/36083 que se publicó el 20 de Agosto de 1998, describen materiales y métodos para el silenciamiento de genes. Estas publicaciones describen, inter alia, el silenciamiento de la expresión de genes genómicos de plantas, al introducir estructuras de expresión que contienen secuencias de ácido nucleico viral de plantas, acopladas con secuencias de genes, completas o parciales, homologas para los genes objetivo a ser silenciados . La WO 99/53050 que se publicó el 21 de Octubre de 1999, describe estructuras quiméricos que codifican moléculas de ARN, dirigidas hacia un ácido nucleico objetivo, que comprende secuencias de sentido y antisentido, tales que el ARN expresado, es capaz de formar una estructura intramolecular de ARN de hebra doble. La expresión de estos ARN en organismos transgénicos, resulta en un silenciamiento de genes de todas las secuencias homologas del ácido nucleico objetivo dentro de la célula. La patente de E.U.A. número 5,942,657, concedida a Bird et al., el 25 de Agosto de 1999, y la WO 93/23551, que se publicó el 25 de Noviembre de 1993, describen la inhibición coordinada de la expresión de genes de plantas, en la cual se inhiben dos o más genes al introducir un gen de control sencillo, que tiene regiones diferentes de ADN homologas con cada uno de los genes objetivo, y un promotor operable en plantas adaptadas para transcribirse a partir de tales ARN de regiones diferentes, que inhiben la expresión de cada uno de los genes objetivo. La presente invención describe el uso de secuencias adecuadas de ADN o de secuencias de ARN derivadas de las mismas, como se discute a continuación, en formas que no se han descrito previamente hasta ahora. Estas secuencias y sus complementos inversos, se pueden usar para reducir la expresión de cualquier secuencia genómica endógena, que comparte una similitud substancial con el fragmento de ácido nucleico que está en proximidad con la secuencia de ADN o secuencia de ARN derivada del mismo. Los detalles de este fenómeno se describen en la presente . Breve Descripción de la Invención. Esta invención se refiere a un estructora recombinante que comprende un promotor ligado operativamente a una secuencia de ADN la cual cuando se expresa por un hospedador produce un ARN que tiene: (a) homología con al menos un ARNm objetivo expresado por el hospedador. (b) Dos regiones complementarias de ARN que no se relacionan con ningún ARN endógeno en el hospedador, y que están en proximidad con (a) , en donde el AR? expresado reduce la expresión del AR?m objetivo o cualquier AR?m endógeno substancialmente similar. En una segunda modalidad, esta invención se refiere a un estructora recombinante que comprende un promotor ligado operativamente a una secuencia de AD? que, cuando se expresa por un hospedador, produce un AR? que tiene: (a) homología con al menos un ARNm objetivo expresado por el hospedador. (b) una región de AR? no relacionada con ningún AR? endógeno en el hospedador y localizada 5' con (a) y (c) el complemento inverso del AR? en (b) localizado 3' con (a) , en donde el AR? expresado reduce la expresión del mAR? objetivo o cualquier AR?m substancialmente similar endógeno.

En una tercera modalidad, esta invención se refiere a un estructura recombinante que comprende un promotor ligado operativamente a una secuencia de AD? la cual , cuando se expresa por un hospedador, produce un AR? que tiene: (a) homología con al menos un ARNm objetivo expresado por el hospedador. (b) dos regiones complementarias de ARN que no están relacionadas con ningún AR? endógeno en el hospedador, y que se localizan 5' con (a), en donde el ARN expresado reduce la expresión del ARNm objetivo o cualquier ARNm endógeno substancialmente similar.

En una cuarta modalidad, esta invención se refiere a un estructura recombinante que comprende un promotor ligado operativamente a una secuencia de ADN la cual, cuando se expresa por un hospedador, produce un ARN que tiene: (a) homología con al menos un ARNm objetivo expresado por el hospedador. (b) dos regiones complementarias de ARN que no están relacionadas con ningún ARN endógeno en el hospedador, y que se localizan 3' con (a), en donde el AR? expresado reduce la expresión del AR?m objetivo o cualquier AR?m endógeno substancialmente similar.

En una quinta modalidad, esta invención se refiere a un estructura recombinante que comprende un promotor ligado operativamente a una secuencia de AD? la cual, cuando se expresa por un hospedador, produce un AR? que tiene: (a) homología con al menos un AR?m objetivo expresado por el hospedador, y (b) dos regiones complementarias de AR? que no están relacionadas con ningún AR? endógeno en el hospedador, y que se localizan dentro de (a) , en donde el AR? expresado reduce la expresión del ARNm objetivo o cualquier AR?m endógeno substancialmente similar. En otro aspecto de alguno de los estructuras recombinantes anteriores, la región o regiones de ARN que no están relacionadas con ningún ARN endógeno en el hospedador, comprenden una secuencia de AR? que no se presenta naturalmente, sintética. Todavía en otro aspecto de alguno de los estructura recombinantes anteriores, la región o regiones de AR? que no están relacionadas con ningún AR? endógeno en el hospedador, no comprenden un AR? viral de planta. En una sexta modalidad, esta invención se refiere a un método para reducir la expresión de un ARNm objetivo o cualquier AR?m endógeno substancialmente similar que comprende : a) transformar un hospedador con alguno de los consestructuras recombinantes antes descritos; y b) seleccionar hospedadores que tienen una expresión reducida del ARNm objetivo o algún ARNm endógeno substancialmente similar. En una séptima modalidad, esta invención se refiere a un estructura recombinante que comprende un ARN que tiene : (a) homología con al menos un AR?m objetivo expresado por el hospedador. (b) Dos regiones complementarias de AR? que no se relacionan con ningún AR? endógeno en el hospedador, y que están en proximidad con (a) , en donde el AR? cuando se introduce dentro del hospedador, reduce la expresión del ARNm objetivo o de cualquier AR?m endógeno substancialmente similar. En una octava modalidad, esta invención se refiere a un estructura recombinante que comprende un AR? que tiene: (a) homología con al menos un AR?m objetivo expresado por el hospedador. (b) una región de AR? no relacionada con ningún AR? endógeno en el hospedador que se localiza 5' con (a) , y (c) el complemento inverso del AR? en (b) localizado 3' con (a) . en donde el AR? cuando se introduce en el hospedador, reduce la expresión del AR?m objetivo o cualquier AR?m endógeno substancialmente similar. En una novena modalidad, esta invención se refiere a un estructura recombinante que comprende un AR? que tiene : (a) homología con al menos un AR?m objetivo expresado por el hospedador. (b) una región de AR? no relacionada con ningún AR? endógeno en el hospedador que se localiza 5' con (a) , en donde el AR? cuando se introduce en el hospedador, reduce la expresión del AR?m objetivo o cualquier AR?m endógeno substancialmente similar. En una décima modalidad, esta invención se refiere a un estructura recombinante que comprende un AR? que tiene: (a) homología con al menos un AR?m objetivo expresado por el hospedador. (b) una región de ARN no relacionada con ningún ARN endógeno en el hospedador que se localiza 5' con (a), en donde el ARN cuando se introduce en el hospedador, reduce la expresión del ARNm objetivo o cualquier ARNm endógeno substancialmente similar. En una décima primera modalidad, esta invención se refiere a un estructura recombinante que comprende un ARN que tiene : (a) homología con al menos un ARNm objetivo expresado por el hospedador. (b) dos regiones complementarias de ARN no relacionadas con ningún ARN endógeno en el hospedador que se localiza 5' con (a) , en donde el ARN cuando se introduce en el hospedador, reduce la expresión del ARNm objetivo o cualquier AR?m endógeno substancialmente similar. En otro aspecto de alguno de los AR? anteriores, la región o regiones de ARN que no están relacionadas con ningún ARN endógeno en el hospedador, comprenden una secuencia de AR? que no se presenta naturalmente, sintética. Todavía en otro aspecto de alguno de los estructuras recombinantes anteriores, la región o regiones de AR? que no se relacionan con ninguno de los ARN endógenos en el hospedador, no comprenden un ARN viral de planta.

En una décimo segunda modalidad, esta invención se refiere a un método para reducir la expresión de un ARNm objetivo, o cualquier ARNm endógeno substancialmente similar que comprende : (a) introducir en un hospedador cualquiera de los ARN antes descritos; y (b) seleccionar hospedadores que tengan una expresión reducida del ARNm objetivo o cualquier ARNm endógeno substancialmente similar. En una décimo tercera modalidad, esta invención se refiere a un estructura recombinante que comprende un promotor ligado operativamente a una secuencia de ADN que, cuando se expresa por un hospedador produce un ARN que tiene : (a) homología con al menos un AR?m objetivo expresado por el hospedador . (b) dos regiones complementarias de ARN, que se codifican por cualquier secuencia de ácido nucleico en el genoma del hospedador, con tal de que la secuencia no codifique el AR?m objetivo o alguna secuencia que sea substancialmente similar al AR?m objetivo y las regiones estén en proximidad con (a) . en donde el ARN expresado reduce la expresión del ARNm objetivo o cualquier AR?m endógeno substancialmente similar.

En una décimo cuarta modalidad, esta invención se refiere a un estructura recombinante que comprende un promotor ligado operativamente a una secuencia de ADN la cual, cuando se expresa por un hospedador produce un ARN que tiene : (a) homología con al menos un ARNm objetivo expresado por el hospedador. (b) una región de AR? codificada por alguna secuencia de ácido nucleico en el genoma del hospedador, con tal de que la secuencia no codifique el AR?m objetivo, o alguna secuencia que sea substancialmente similar al AR?m objetivo y se localiza 5' con (a) , y (c) el complemento inverso del ácido nucleico en (b) localizado 3' con (a), en donde el ARN expresado reduce la expresión del AR?m objetivo o cualquier AR?m endógeno substancialmente similar. En una décimo quinta modalidad, esta invención se refiere a un estructura recombinante que comprende un promotor ligado operativamente a una secuencia de AD?, la cual cuando se expresa por un hospedador produce un AR? que tiene: (a) homología con al menos un AR?m objetivo expresado por el hospedador. (b) dos regiones complementarias de AR? que se codifican por alguna secuencia de ácido nucleico en el genoma del hospedador, con tal de que la secuencia no codifique el mAR? objetivo o alguna secuencia que sea substancialmente similar al ARNm objetivo y cuyas regiones se localicen 5' (a) , en donde el ARN expresado reduce la expresión del ARNm objetivo o cualquier ARNm endógeno substancialmente similar.

En una décimo sexta modalidad, esta invención se refiere a un estructura recombinante, que comprende un promotor ligado operativamente a una secuencia de ADN la cual, cuando se expresa por un hospedador produce un ARN que tiene : (a) homología con al menos un ARNm objetivo expresado por el hospedador. (b) dos regiones complementarias de ARN que se codifican por alguna secuencia de ácido nucleico en el genoma del hospedador, con tal de que la secuencia no codifique el mARN objetivo o alguna secuencia que sea substancialmente similar al ARNm objetivo y cuyas regiones se localicen 3' en (a), ' en donde el AR? expresado reduce la expresión del AR?m objetivo o cualquier AR?m endógeno substancialmente similar.

En una décimo séptima modalidad, esta invención se refiere a un estructura recombinante, que comprende un promotor ligado operativamente a una secuencia de AD? la cual, cuando se expresa por un hospedador produce un AR? que tiene : , (a) homología con al menos un AR?m objetivo expresado por el hospedador. (b) dos regiones complementarias de AR? que se codifican por alguna secuencia de ácido nucleico en el genoma del hospedador, con tal de que la secuencia no codifique el ARN objetivo o alguna secuencia que sea substancialmente similar al ARNm objetivo y cuyas regiones se localicen dentro de (a) , en donde el ARN expresado reduce la expresión del ARNm objetivo o cualquier AR?m endógeno substancialmente similar.

En otro aspecto de algunos de los estructuras recombinantes anteriores, la región o regiones de AR? que no se relacionan con alguno de los ARN endógenos en el hospedador, comprenden una secuencia de AR? que no se presenta naturalmente, sintética. Todavía en otro aspecto de alguno de los estructuras recombinantes anteriores, la región o regiones de AR? que no se relacionan con alguno de los ARN endógenos en el hospedador, no comprenden un ARN viral de planta. En una décimo octava modalidad, esta invención se refiere a un método para reducir la expresión de un ARNm objetivo, o cualquier AR?m endógeno substancialmente similar que comprende : (a) transformar un hospedador con alguno de los estructuras recombinantes antes descritos; y (b) seleccionar hospedadores, que tengan una expresión reducida del ARNm objetivo o algún AR?m endógeno substancialmente similar. En una décimo novena modalidad de esta invención, se refiere a un ARNm que comprende: (a) homología con al menos un ARNm objetivo expresado por un hospedador, (b) dos regiones complementarias de ARN, que se codifican por cualquier secuencia de ácido nucleico en el genoma del hospedador, con tal de que la secuencia no codifique el ARNm objetivo, o cualquier secuencia que sea substancialmente similar al ARNm objetivo y cuyas regiones estén en proximidad con (a) , En donde el ARN, cuando se introduce en el hospedador, reduce la expresión del ARNm objetivo o cualquier ARNm endógeno substancialmente similar. En una vigésima modalidad, esta invención se refiere a un AR? que comprende : (a) homología con al menos un ARNm objetivo expresado por un hospedador, (b) una región de AR? codificada por cualquier secuencia de ácido nucleico en el genoma del hospedador, con tal de que la secuencia no codifique el ARNm objetivo o alguna secuencia que sea substancialmente similar al AR?m objetivo y se localice 5' con (a), y (c) el complemento inverso del AR? en (b) localizado 3' para (a) , en donde el ARN, cuando se introduce en el hospedador, reduce la expresión del AR?m objetivo, o cualquier AR?m endógeno substancialmente similar.

En una vigésima primer modalidad, esta invención se refiere a un ARN que comprende : (a) homología con al menos un ARNm objetivo expresado por un hospedador, (b) dos regiones complementarias de ARN, que se codifican por cualquier secuencia de ácido nucleico en el genoma del hospedador, con tal de que la secuencia no codifique el ARNm objetivo, o cualquier secuencia que sea substancialmente similar al AR?m objetivo y cuyas regiones estén se localicen 5' con (a), en donde el ARN expresado reduce la expresión del AR?m objetivo o cualquier AR?m endógeno substancialmente similar.

En una vigésima segunda modalidad, esta invención se refiere a un ARN que comprende : (a) homología con al menos un AR?m objetivo expresado por un hospedador, y (b) dos regiones complementarias de AR?, que se codifican por cualquier secuencia de ácido nucleico en el genoma del hospedador, con tal de que la secuencia no codifique el AR?m objetivo, o cualquier secuencia que sea substancialmente similar al AR?m objetivo y cuyas regiones se localicen 3' con (a), en donde el AR? expresado reduce la expresión del AR?m objetivo o cualquier AR?m endógeno substancialmente similar. En una vigésima tercera modalidad, esta invención se refiere a un ARN que comprende : (a) homología con al menos un ARNm objetivo expresado por un hospedador, (b) dos regiones complementarias de ARN, que se codifican por cualquier secuencia de ácido nucleico en el genoma del hospedador, con tal de que la secuencia no codifique el ARNm objetivo, o cualquier secuencia que sea substancialmente similar al AR?m objetivo y cuyas regiones se localicen dentro de (a) , en donde el ARN expresado reduce la expresión del ARNm objetivo o cualquier AR?m endógeno substancialmente similar.

En otro aspecto de alguno de los AR? anteriores, la región o regiones de AR? que no se relacionan con algún AR? endógeno en el hospedador, comprenden una secuencia de AR? sintética que no se presenta naturalmente. Todavía en otro aspecto de alguno de los estructuras recombinantes anteriores, la región o regiones de AR? que no se relacionan con algún AR? endógeno en el hospedador, no comprenden el AR? viral de planta. En una vigésima cuarta modalidad, esta invención se refiere a un método para reducir la expresión de un AR?m objetivo, o cualquier ARNm endógeno substancialmente similar que comprende : (a) introducir dentro del hospedador cualquiera de los AR? antes descritos; y (b) seleccionar hospedadores que tengan una expresión reducida del ARNm objetivo o cualquier ARNm endógeno substancialmente similar. En una vigésima quinta modalidad, esta invención se refiere a un método para identificar o separar por exclusión un gen de planta esencial que comprende: (a) transformar una célula de planta con un estructura recombinante, que comprende un promotor constitutivo, en donde el estructura es capaz de reducir la expresión de un gen esencial de planta con un alto grado de frecuencia. (b) cuantificar todas las células de planta transformadas de la etapa (a) ; (c) cuantificar todas las células de plantas transformadas de un control , que no reduce la expresión de un gen esencial de planta; y (d) comparar la cuantificación de las células de planta transformadas seleccionadas de la etapa (b) , con la cuantificación de las células de plantas transformadas seleccionadas de la etapa (c) , en donde la cuantificación de las células de plantas transformadas seleccionadas de la etapa (c) , debe superar substancialmente la cuantificación de las células de planta transformadas de la etapa (b) . En una vigésimo sexta modalidad, la invención se refiere a un método para la identificación o separación por exclusión de un gen esencial de planta que comprende: (a) transformar una célula de planta con cualquiera de los estructuras recombinantes de la invención, que comprende un promotor ligado operativamente a una secuencia de ADN, y que comprende además un promotor constitutivo que es capaz de reducir la expresión de un gen esencial de planta con un alto grado de frecuencia; (b) cuantificar todas las células de planta transformadas de la etapa (a) ; (c) cuantificar todas las células de plantas transformadas de un control, que no reduce la expresión de un gen esencial de planta; y (d) comparar la cuantificación de las células de planta transformadas seleccionadas de la etapa (b) , con la cuantificación de las células de plantas transformadas seleccionadas de la etapa (c) , en donde la cuantificación de las células de plantas transformadas seleccionadas de la etapa (c) , debe superar substancialmente la cuantificación de las células de planta transformadas de la etapa (b) . Breve Descripción de los Dibujos y los Listados de Secuencia. La invención se puede entender más completamente a partir de la siguiente descripción detallada y los dibujos anexos y el listado de secuencias, que forman una parte de esta solicitud. La Figura 1, detalla los resultados del quimerismo en experimentos en una "co-supresión clásica" antisentido, y una reducción de la región complementaria, de la expresión del gen de la soya Fad2, una desaturasa de ácido graso. El quimerismo es una medida del porcentaje de individuos aislados en líneas individuales transformadas, que muestran una característica de fenotipo de la característica deseada.

La figura 2 muestra los azúcares de soya totales visualizados después de la separación TLC. Los azúcares de rafinosa y de estaquiosa son la banda más baja en cada pista. La pista "baja 4" se aisla de una línea de soya que se conoce que tiene niveles muy bajos de azúcares de rafinosa/estaquiosa. Las dos líneas "GAS-EL" tienen ambas niveles más bajos de rafinosa/estaquiosa que los que se encuentran en las líneas circundantes, indicando que los fragmentos GAS1/GAS2 contenidos dentro del estructura EL suprimen la actividad de la galactinol sintasa en estas líneas . El listado de secuencias anexo (SEQ ID Nos: 1-35) describe secuencias de oligonucleótidos utilizadas en el diseño de diversos plásmidos aquí descritos, o las secuencias de las regiones complementarias que se encuentran en algunos de los plásmidos. La SEQ ID NO: 1, es la secuencia de un cebador de oligonucleótido utilizado en una amplificación de reacción en cadena de polimerasa (PCR) del gen de la soya Fad2-1 para su inserción en el plásmido pKS67 para producir el plásmido pKS91. La SEQ ID NO: 2, es la secuencia de un cebador oligonucleótido usado en una amplificación PCR del gen de la soya Fad2-1 para su inserción en el plásmido pKS67 para producir el plásmido pKS91. La SEQ ID NO: 3, es la secuencia de un cebador oligonucleótido usado en una amplificación PCR del gen de la soya Fad2-1 para su inserción en el plásmido pKS67 para producir el plásmido pKS91. La SEQ ID NO: 4, es la secuencia de un cebador oligonucleótido usado en una amplificación PCR del gen de la soya Fad2-1 para su inserción en el plásmido pKS67 para producir el plásmido pKS91. La SEQ ID NO: 5, es la secuencia de un cebador oligonucleótido usado en una amplificación PCR del gen de la soya Fad2-1 para su inserción en el plásmido pKS67 para producir el plásmido pKS91. La SEQ ID NO: 6, es la secuencia de un cebador oligonucleótido usado en una amplificación PCR del gen de la soya Fad2-1 para su inserción en el plásmido pKS67 para producir el plásmido pKS91. La SEQ ID NO: 7, es un oligonucleótido ligador usado para insertar diversas enzimas de restricción en los sitios dentro del plásmido pKS17 para formar el plásmido pKS102. La SEQ ID NO: 8, es la secuencia de un cebador oligonucleótido usado en la amplificación PCR de un gen de soya Cer3 para su inserción en el plásmido pKS67 para formar el plásmido pKSlOO. La SEQ ID NO: 9, es la secuencia de un cebador oligonucleótido usado en la amplificación PCR de un gen de soya Cer3 para su inserción en el plásmido pKS67 para formar el plásmido pKSlOO. La SEQ ID NO: 10, es la secuencia de un cebador oligonucleótido usado en la amplificación PCR de un gen de soya Cer3 para su inserción en el plásmido pKS67 para formar el plásmido pKSlOO. La SEQ ID NO: 11, es la secuencia de un cebador oligonucleótido usado en la amplificación PCR de un gen de soya Cer3 para su inserción en el plásmido pKS67 para formar el plásmido pKSlOO. La SEQ ID NO: 12, representa la repetición complementaria IX designada ELVISLIVES que se encuentra en los plásmidos pKS106 y pKS124. La SEQ ID NO: 13, representa la repetición complementaria 2X designada ELVISLIVES que se encuentra en los plásmidos pKS133. La SEQ ID NO: 14, es la secuencia de un cebador oligonucleótido usado en una amplificación PCR en la región complementaria ELVISLIVES. La SEQ ID NO: 15, es la secuencia de un cebador oligonucleótido usado en una amplificación PCR en la región complementaria ELVISLIVES. La SEQ ID NO: 16, es la secuencia de un cebador oligonucleótido usado en una amplificación PCR del gen de soya Fad2 para producir un fragmento de 599 nucleótidos insertado dentro del plásmido pKS106 para producir el plásmido pKSlll . La SEQ ID NO: 17, es la secuencia de un cebador oligonucleótido usado en una amplificación PCR del gen de soya Fad2 para producir un fragmento de 599 nucleótidos insertado dentro del plásmido pKS106 para producir el plásmido pKSlll. La SEQ ID NO: 18, es la secuencia de un cebador oligonucleótido común 5' usado en una amplificación PCR del gen de soya Fad2-1 para su uso en los requerimientos de tamaño de prueba para las secuencias objetivo. La SEQ ID NO: 19, es la secuencia de un cebador oligonucleótido 3' usado en una amplificación PCR del gen de soya Fad2 para la producción de un fragmento de 25 pares base. La SEQ ID NO: 20, es la secuencia de un cebador oligonucleótido 3' usado en una amplificación PCR del gen de soya Fad2 para la producción de un fragmento de 75 pares base. La SEQ ID NO: 21, es la secuencia de un cebador oligonucleótido 3' usado en una amplificación PCR del gen de soya Fad2 para la producción de un fragmento de 150 pares base. La SEQ ID NO: 22, es la secuencia de un cebador oligonucleótido 3' usado en una amplificación PCR del gen de soya Fad2 para la producción de un fragmento de 300 pares base. La SEQ ID NO: 23, es la secuencia de un cebador oligonucleótido 3' usado en una amplificación PCR del gen de soya Fad2 para la producción de un fragmento de 600 pares base. La SEQ ID NO: 24, representa una región de repetición complementaria 2X ELVISLIVES a partir de pBS68 que contiene regiones complementarias 2X ELVISLIVES que rodean al fragmento Notl del Fad2-1 de 599 nucleótidos a partir de pKSlll y un fragmento de 969 nucleótidos de un delta 9 de desaturasa de soya. La SEQ ID NO: 25, es la secuencia de un cebador oligonucleótido 5' usado en una amplificación PCR del promotor Lea. La SEQ ID NO: 26, es la secuencia de un cebador oligonucleótido 3' usado en una amplificación PCR del promotor Lea. La SEQ ID NO: 27, es la secuencia de un cebador oligonucleótido 5' usado en una amplificación por PCR del extremo 3' de la faseolina. La SEQ ID NO: 28, es la secuencia de un cebador oligonucleótido 3' usado en una amplificación por PCR del extremo 3' de la faseolina. La SEQ ID NO: 29, representa la región de repetición complementaria 2X ELVISLIVES a partir de pKS149, que contiene fragmentos de 2 genes de la galactinol sintasa de la soya GAS1 y GAS2 (411 y 435 nucleótidos respectivamente) . La región se coloca funcionalmente a un promotor tardío del embrión de la soya (LEA) y una región del terminador 3' de la faseolina. Esta región completa se clona después en el sitio BamHl de pKS136, que contiene una región de repetición complementaria 2X ELVISLIVES controlada por un promotor de la soya Kti y una región del terminador. ' La SEQ ID NO: 30, representa la secuencia de ADN del gen GAS1 de la galactinol sintasa de la soya. La SEQ ID NO: 31, representa la secuencia de ADN del producto de traducción supuesto de la SEQ ID NO: 30, el gen de la galactinol sintasa de la soya GAS1. La SEQ ID NO: 32, representa la secuencia de ADN del gen de la galactinol sintasa GAS2 de la soya. La SEQ ID NO: 33, representa la secuencia de ADN del producto de traducción supuesto de SEQ ID NO: 32, el gen de la galactinol sintasa de la soya GAS2. La SEQ ID NO: 34, representa la región complementaria SHH3 del plásmido PHP17962, usado en la construcción del plásmido PHP17894 que contiene el fragmento de la fitoeno desaturasa. Las regiones complementarias son desde 8-212 y 305-509, respectivamente. Los sitios de la endonucleasa de restricción para EcoRV, Kpnl, KspI , Sphl, y Ncol se pueden usar como sitios de clonación entre las regiones complementarias . La SEQ ID ?O: 35, representa la secuencia de AD? del gen de la acetolactato sintasa de la soya (ALS) . La SEQ ID NO : 36, es la secuencia de un cebador 3' oligonucleótido usado en una amplificación PCR del gen de la soya Fad2-1 para la producción del fragmento de 50 pares base . Descripción Detallada de la Invención. En el contexto de esta descripción, se deben utilizar diversos términos . El término "hospedador" se refiere a cualquier organismo o célula del mismo, ya sea humana o no humana, dentro de la cual se puede introducir establemente o transitoriamente un estructura recombinante, con objeto de reducir la expresión de genes . Como se usa en la presente, un "fragmento aislado de ácido nucleico" es un polímero de AR? o AD? que es de hebra sencilla o doble, que contiene opcionalmente bases de nucleótidos alteradas o no naturales, sintéticas. Un fragmento aislado de ácido nucleico, en forma de un polímero de ADN puede comprender uno o más segmentos del ADNc, ADN genómico o ADN sintético. Los nucleótidos (que se encuentran usualmente en su forma de 5' monofosfato) se refieren por su designación con una sola letra como sigue : "A" para adenilato o desoxiadenilato (para ADN o ARN respectivamente) , "C" para citidilato o desoxicitidilato, "G" para guanilato odesoxiguanilato, "U" para uridilato, "T" para desoxitimidilato, "R" para purinas (A o G) , "Y" para pirimidinas (C o T) , "K" para g o T, "H" para A o C o T, "I" para inosina, y "N" para cualquier nucleótido. Los términos "subfragmento que es funcionalmente equivalente" y "subfragmento funcionalmente equivalente" se usan intercambiablemente en la presente. Estos términos se refieren a una porción o subsecuencia de un fragmento aislado de ácido nucleico en el cual la capacidad de alterar la expresión de genes, o de producir un cierto fenotipo, se conserva ya sea que el fragmento o subfragmento codifique o no a una enzima activa. Por ejemplo, se puede usar el fragmento o subfragmento en el diseño de genes quiméricos para producir el fenotipo deseado en una planta transformada. Se pueden diseñar los genes quiméricos para su uso en la co-supresión o antisentido al ligar un fragmento o subfragmento de ácido nucleico del mismo, ya sea que codifique o no una enzima activa, en la orientación adecuada con relación a una secuencia promotora de planta. Los términos "homología" , "homólogo" , "substancialmente similar" , y "substancialmente correspondiente" se usan intercambiablemente en la presente . Se refieren a fragmentos de ácido nucleicos en donde los cambios en una o más bases de nucleótidos no afecta la capacidad del fragmento de ácido nucleico, para mediar la expresión de genes o para producir un cierto fenotipo. Estos términos también se refieren a modificaciones de los fragmentos de ácido nucleico de la presente invención, tal como la eliminación o inserción de uno o más nucleótidos, que no alteran substancialmente las propiedades funcionales del fragmento resultante de ácido nucleico, con relación al fragmento inicial no modificado. Se entiende por lo tanto, como lo apreciarán aquellos expertos en la técnica, que la invención abarca más que las secuencias ejemplares específicas. Adicionalmente, el técnico experto reconoce que las secuencias de ácido nucleico substancialmente similares, abarcadas por esta invención, también se definen por su capacidad para hibridizar, bajo condiciones moderadamente severas (por ejemplo, 0.5 X SSC, 0.1% SDS, 60 °C) con las secuencias ejemplificadas en la presente, o a cualquier porción de las secuencias de nucleótidos reportadas en la presente, y que son funcionalmente equivalentes para el promotor de la invención. Las condiciones de severidad se pueden ajustar para separar por exclusión fragmentos moderadamente similares tales como frecuencias homologas de organismos lejanamente relacionados, a fragmentos altamente similares, tales como genes que duplican las enzimas funcionales a partir de organismos cercanamente relacionados. Los lavados posteriores a la hibridación determinan las condiciones de severidad. Un conjunto de condiciones preferidas, involucra una serie de lavados que comienza con 6X SSC, 0.5% SDS a temperatura ambiente por 15 min, después se repite con 2X SSC, 0.5% SD? a 45 °C por 30 min, y después se repite dos veces con 0.2X SSC, 0.5% SDS a 50 °C por 30 min. Un conjunto más preferido de condiciones de severidad, involucra el uso de temperaturas superiores en las cuales los lavados son idénticos con aquellos anteriores, excepto porque la temperatura de los dos lavados finales de 30 min en 0.2X SSC, 0.5% SDS se incrementa a 60°C. Otro conjunto preferido de condiciones altamente severas involucra el uso de dos lavados finales en 0. IX SSC, 0.1% SDS a 65°C. Con respecto al grado de similitud substancial entre el ARNm objetivo (endógeno) y la región de ARN en el estructura que tiene homología con el ARNm objetivo, tales secuencias deben tener al menos 25 nucleótidos de longitud, preferiblemente al menos 50 nucleótidos de longitud, más preferiblemente al menos 100 nucleótidos de longitud, nuevamente más preferiblemente al menos 200 nucleótidos de longitud y más preferiblemente al menos 300 nucleótidos de longitud; y deben de ser al menos 80% idénticas, más preferiblemente al menos 90% idénticas y más preferiblemente al menos 95% idénticas. Las alineaciones de secuencias y los cálculos de porcentaje de similitud, se pueden determinar usando una diversidad de métodos de comparación diseñados para detectar secuencias homologas, que incluyen pero no se limita al programa Megalign del conjunto de cómputo de bioinformática LASARG?NE (DNASTAR Inc., Madison, Wl) . La alineación múltiple de las secuencias se lleva a cabo usando el método Clustal de un alineación (Higgins y Sharp (1989) CABIOS. 5:151-153) con los parámetros por omisión (PENALIZACIÓ? DE ESPACIO=10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE ESPACIO=10) . Los parámetros por omisión para alineaciones por pares y el cálculo de porcentaje de identidad de las secuencias de proteínas usando el método Clustal son KTUPLE=1, PENALIZACIÓN DE ESPACIO=3 , VENTANA=5 y DIAGONALES GUARDADAS=5. Para los ácidos nucleicos estos parámetros son KTUPLE=2 , PENALIZACIÓN DE ESPACIO=5, VENTANA=4 y DIAGONALES GUARDADAS=4. "Gen" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa una proteína específica, incluyendo secuencias regulatorias precedentes (secuencias que no codifican 5') y siguientes (secuencias que no codifica 3') de la secuencia de codificación. "El gen de origen" se refiere a un gen como se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias regulatorias. "Gen quimérico" se refiere a cualquier gen que no es un gen de origen, que comprende secuencias regulatorias y de codificación, que no se encuentran en conjunto en la naturaleza. De esta manera, un gen quimérico puede comprender secuencias regulatorias y secuencias de codificación, que se derivan de fuentes diferentes, o secuencias regulatorias y secuencias de codificación derivadas de la misma fuente, pero configuradas de una forma diferente a la que se encuentra en la naturaleza. Un gen "externo" se refiere a un gen que no se encuentra normalmente en el organismo hospedador, pero que se introduce en el organismo hospedador por transferencia de genes . Los genes externos pueden comprender genes de origen insertados en un organismo que no es de origen, o genes quiméricos. Un "transgen" es un gen que se ha introducido en el genoma por un proceso de transformación. El término "genes esenciales de plantas" como se usa en la presente, se refieren a genes que codifican un producto que se requiere para el crecimiento normal de plantas, desarrollo y/o viabilidad. Además del ALS, los ejemplos esenciales de genes de plantas incluirían pero no se limitan a, enzimas limitantes de la relación en aminoácidos, ácidos nucleicos o biosíntesis de lípidos. También se cree que muchos genes con función desconocida pueden ser esenciales. La supresión de los genes esenciales de plantas por medios guímicos o genéticos, resultará en un crecimiento y/o desarrollo alterado. Si un gen esencial es único en el genoma de la planta, la supresión puede conducir a una muerte de la planta, que es la base para muchos herbicidas de plantas. "Secuencia de Codificación" se refiere a una secuencia de ADN que codifica una secuencia específica de aminoácidos. "Secuencias Regulatorias" se refiere a secuencias de nucleótidos localizadas en la dirección ascendente (secuencias no codificadoras 5')/ dentro, o en la dirección descendente (secuencias no codificadoras 3 ' ) , de una secuencia de codificación, y que tienen influencia en la transcripción, procesamiento o estabilidad del ARN, o traducción de una secuencia de codificación asociada. Las secuencias regulatorias pueden influir, pero no se limitan a, promotores, secuencias líder de la traducción, intrones y secuencias de reconocimiento de la poliadenilación. "Promotor" se refiere a una secuencia de ADN capaz de controlar la expresión de una secuencia de codificación o de un ARN funcional . La secuencia del promotor consiste de elementos en la dirección ascendente más dístales y proximales, los últimos elementos se refieren a menudo como potenciadores. De esta manera, un "potenciador" es una secuencia de AD? que puede estimular la actividad del promotor, y puede ser un elemento innato del promotor o un elemento heterólogo insertado para potenciar el nivel o especificidad de tejido de un promotor. Los promotores se pueden derivar en su totalidad de un gen de origen, o componerse de elementos diferentes derivados de promotores diferentes que se encuentran en la naturaleza, o que comprenden aun fragmentos sintéticos del ADN. Se entiende por aquellos expertos en la técnica, que los promotores diferentes pueden dirigir la expresión de un gen en tejidos diferentes o tipos de células, o en etapas diferentes de desarrollo, o en respuesta a condiciones ambientales diferentes. Los promotores que provocan que se exprese un gen en la mayoría de los tipos de células la mayor parte del tiempo, se refieren comúnmente como "promotores constitutivos" . Nuevos promotores de diversos tipos útiles en las células de plantas, se descubren constantemente, ejemplos numerosos se pueden encontrar en la compilación por Okamuro y Goldberg, (1989) Biochemistry of Plants 15:1-82. Se reconoce además que ya que en la mayoría de los casos, no se han definido completamente las fronteras exactas de las secuencias regulatorias, los fragmentos de ADN de alguna variación pueden tener una actividad idéntica de promotor. Un "intrón" es una secuencia interventora en un gen, que no codifica una porción de la secuencia de proteína. Así, tales secuencias se transcriben dentro del ARN, pero se extirpan después y no se traducen. El término también se usa • para las secuencias extirpadas de ARN. Un "exón" es una porción de la secuencia de un gen que se transcribe y se encuentra en un ARN mensajero maduro, derivado del gen, pero que no es necesariamente una parte de la secuencia que codifica el producto final de gen. La "Secuencia Líder de Traducción" se refiere a una secuencia de ADN localizada entre la secuencia del promotor de un gen y la secuencia codificadora. La secuencia líder de la traducción, está presente en el ARNm completamente procesado, en la dirección ascendente de la secuencia de partida de la traducción. La secuencia líder de la traducción, puede afectar el procesamiento del transcripto primario al AR?m, la estabilidad del AR?m o la eficiencia de la traducción. Los ejemplos de las secuencias líder de traducción se han descrito (Turner, R. y Foster, G. D. (1995) Molecular Biotechnology 3:225) . Las "secuencias no codificadoras 3'" se refieren a secuencias de AD? localizadas en la dirección descendente de una secuencia codificadora, e incluyen secuencias de reconocimiento de la poliadenilación y otras secuencias que codifican señales regulatorias, capaces de afectar el procesamiento del AR?m o la expresión de genes . La señal de poliadenilación, se caracteriza usualmente por afectar la adición de extensiones del ácido poliadenílico, al extremo 3' del precursor AR?m. El uso de secuencias diferentes no codificadoras 3' se ejemplifica por Ingelbrecht et al, (1989) Plant Cell 1:671-680. EL "transcripto de ARN" se refiere al producto que resulta de la transcripción catalizada por polimerasa de ARN de una secuencia de ADN. Cuando el transcripto de ARN es una copia complementaria perfecta de la secuencia de ADN, se refiere como el transcripto primario, o puede ser una secuencia de ARN derivada del procesamiento post transcripcional del transcripto primario, y se refiere como el AR? maduro. El "AR? mensajero (AR?m)" se refiere al ARN que está sin intrones y que se puede traducir en la proteína por la célula. El "AD?c" se refiere a un AD? que es complementario y se sintetiza de una plantilla de AR?m usando la enzima de la transcriptasa inversa. El AD?c puede ser de hebra simple o convertirse en una forma de hebra doble usando el fragmento Klenow de la polimerasa 1 de AD?. ARN de "Sentido" , se refiere a un transcripto de AR? que incluye el AR?m y se puede traducir en proteína dentro de una célula o in vitro. "AR? Antisentido" se refiere a un transcripto de AR? que es complementario con todo o una parte del transcripto primario objetivo o el AR?m, y que bloquea la expresión de un gen objetivo (patenté de EUA número 5,107,065). La complementariedad del ARN antisentido, puede estar con cualquier parte del transcripto de gen específico, esto es, en la secuencia no codificadora 5', secuencia no codificadora 3', intrones o la secuencia codificadora. El "ARN Funcional" se refiere a un AR? antisentido, AR? de ribozima, u otro AR? que no se puede traducir pero que tiene todavía un efecto en los procesos celulares . Los términos "complemento" o "complemento inverso" se usan intercambiablemente en la presente con respecto a los transcriptos de ARNm, y significa que definen el AR? antisentido del mensaje. El término "AR? Objetivo" se refiere a cualquier ARNm cuya expresión en el hospedador se va a reducir. El término "AR? endógeno" se refiere a cualquier AR? que se codifica por alguna secuencia de ácido nucleico presente en el genoma del hospedador, previo a la transformación con el estructura recombinante de la presente invención, ya sea que se presente naturalmente o no naturalmente. Esto es, se introduce por medios recombinantes, mutagénesis etc. El término "que no se presenta naturalmente" significa artificial, que no es consistente con lo que se encuentra normalmente en la naturaleza. El término "ligado operativamente" se refiere a la asociación de secuencias de ácido nucleico en un fragmento sencillo de ácido nucleico, de manera de que la función de uno se regula por el otro. Por ejemplo, un promotor se liga operativamente con una secuencia codificadora, cuando puede regular la expresión de esa secuencia codificadora (esto es, que la secuencia codificadora está bajo el control transcripcional del promotor) . Las secuencias codificadoras pueden ligarse operativamente a las secuencias reguladoras en una orientación de sentido o antisentido. En otro ejemplo, las regiones complementarias de ARN de la invención, se pueden ligar operativamente, ya sea directa o indirectamente, 5' al ARNm objetivo, o 3' al ARNm objetivo, o dentro del AR?m objetivo, o una primera región complementaria es 5' y su complemento es 3 ' al AR?m objetivo. El término "expresión", como se usa en la presente, se refiere a la producción de un producto final funcional. La expresión de un gen involucra la transcripción del gen y la traducción del ARNm dentro de una proteína precursora o madura. "Inhibición Antisentido" se refiere a la producción de transcriptos antisentido de AR?, capaces de suprimir la expresión de la proteína objetivo. La "Co-supresión" se refiere a la producción de transcriptos de AR? de sentido, capaces de suprimir la expresión de genes endógenos o externos idénticos o substancialmente similares (patente de E.U.A. número 5,231,020). La proteína "madura" se refiere a un polipéptido procesado post traduccionalmente, esto es, uno del cual se ha removido cualquiera de los pre- o propéptidos presentes en el producto de traducción primario . La proteína "precursora" se refiere al producto primario de la traducción del AR?m; esto es, con pre- y propéptidos todavía presentes. Los pre- y propéptidos, pueden ser pero no se limitan a señales de localización intracelular. La "Transformación estable" se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico dentro de un genoma de un organismo hospedador, incluyendo genomas nucleares y organelares, que resultan en una herencia genéticamente estable. En contraste, la "transformación transitoria" se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico en el núcleo, o un organelo que contiene ADN, de un organismo hospedador que resulta en una expresión de genes sin la integración o herencia estable. Los organismos hospedadores que contienen los fragmentos transformados de ácido nucleico, se refieren como organismos "transgénicos". El método preferido de transformación de células de arroz, maíz y otras monocotiledóneas, es el uso de tecnología de transformación de "pistola de genes" o acelerada por partículas (Klein et al. (1987) ?ature (Londres) 327:70-73; patente de E.U.A. número 4,945,050), o un método mediado por Agrobacterium que usa un plásmido adecuado Ti que contiene el transgen (Ishida Y. Et al. 1996, ?ature Biotech. 14:745-750).

Las tecnologías estándar de AD? recombinante y de clonación molecular usadas en la presente, son bien conocidas en el arte y se describen más completamente en Sambrook, J. , Fritsch, E.F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual ; Cold Spring Harbor Laboratory Press : Cold Spring Harbor, 1989 (de aquí en adelante "Sambrook"). El término "recombinante" se refiere a una combinación artificial de dos segmentos de secuencias separados de otra manera, por ejemplo, por síntesis química o por la manipulación de segmentos aislados de ácidos nucleicos por técnicas de ingeniería genética. . La "PCR" o "Reacción en cadena de Polimerasa" es una técnica para la síntesis de grandes cantidades de segmentos específicos de ADN, que consiste de una serie de ciclos repetitivos (Perkin Elmer Cetus Instruments, ?orwalk, CT) . Típicamente, el AD? de hebra doble se desnaturaliza por calor, los dos cebadores complementarios con las fronteras 3' del segmento objetivo, se combinan en sus pares base complementarios a una temperatura baja, y se prolongan después a una temperatura intermedia. Un conjunto de estas tres etapas consecutivas se refiere como un ciclo. Los términos "estructura recombinante" , "estructura de expresión" y "estructura de expresión recombinante" se usan intercambiablemente en la presente. Tal estructura puede ser por sí mismo o se puede usar en conjunto con un vector. Si se usa un vector, entonces la elección del vector depende del método que se usará para transformar las plantas hospedadoras, como se conoce bien por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, se puede usar un vector plásmido. El técnico experto está bien consciente de los elementos genéticos que deben estar presentes en el vector, con objeto de transformar, seleccionar y propagar exitosamente las células hospedadoras que comprenden cualquiera de los fragmentos aislados de ácido nucleico de la invención. El técnico experto también reconocerá que resultarán diferentes eventos de transformación independientes en niveles diferentes y patrones de expresión (Jones et al, (1985) EMBO J. 4:2411-2418; De Almeida et al, (1989) Mol. Gen. Genetics 218:86), y así, que se deben separar por exclusión eventos múltiples con objeto de obtener líneas que desplieguen el nivel de expresión deseado y el patrón. Tal separación por exclusión se puede lograr por un análisis Southern del ADN, análisis Northern de la expresión de ARNm, análisis Western de la expresión de proteínas o análisis fenotípico. Los estructuras de co-supresión en plantas, se han diseñado previamente al focalizar una sobreexpresión de una secuencia de ácido nucleico que tiene homología con un ARNm endógeno, en la orientación de sentido, que resulta en la reducción de todos los AR? que tienen homología con la secuencia expresada (ver Vaucheret et al (1998) Plant J 16:651-659; y Gura (2000) ?ature 404:804-808). La eficiencia global de este fenómeno es baja, y el grado de la reducción del AR? es ampliamente variable. El trabajo reciente ha descrito el uso de estructuras de "horquilla" que incorporan todo o una parte de una secuencia codificadora de ARNm en una orientación complementaria que resulta en una estructura potencial "circuito-madre" para el AR? expresado (publicación PCT WO 99/53050 publicado el 21 de Octubre de 1999) . Esto incrementa la frecuencia de la co-supresión en plantas transgénicas recuperadas . Otra variación describe el uso de secuencias virales de plantas para dirigir la supresión, o silenciar las secuencias codificadoras de ARNm proximales (publicación PCT WO 98/36083 publicada el 20 de Agosto de 1998) . Ambos de estos fenómenos co-supresores no se han obtenido mecánicamente, aunque ha comenzado una evidencia genética reciente para descubrir esta situación compleja (Elmayan et al (1998) Plant Cell 10:1747-1757). Sorprendente e inesperadamente, se ha encontrado que las secuencias adecuadas de ácido nucleicos y su complemento inverso, se pueden usar para alterar la expresión de cualquier ARN endógeno, homólogo (esto es, el ARN objetivo) que está en proximidad con la secuencia adecuada de ácido nucleico y su complemento inverso. Como se discute a continuación, la secuencia adecuada de ácido nucleico y su complemento inverso, no se puede relacionar con algún AR? endógeno en el hospedador, o se puede codificar por alguna secuencia de ácido nucleico en el genoma del hospedador, con tal de que la secuencia de ácido nucleico no codifique ningún AR?m objetivo o- alguna secuencia que sea substancialmente similar al ARNm objetivo. Así, la presente invención presenta un enfoque muy eficiente y robusto para lograr una co-supresión de genes sencilla o múltiple, usando una transformación sencilla de plásmidos. Como se discute con mayor detalle a continuación, los estructuras se componen de promotores ligados a las regiones codificadoras de ARNm, o fragmentos de las mismas, que se dirigen por supresión, y secuencias complementarias cortas que no se relacionan con los objetivos. Las secuencias complementarias se pueden orientar 5' ambas, 3' ambas, o en cualquier lado de la secuencia objetivo. Las secuencias complementarias se prefiere que sean de 40 a 50 nucleótidos de longitud, o más preferiblemente de 50 a 100 nucleótidos de longitud, o más preferiblemente al menos o más de 100-300 nucleótidos . Las secuencias complementarias no están relacionadas con el objetivo, pero pueden venir de cualquier otra fuente. Las modalidades preferidas de estas secuencias incluyen pero no se limitan a, secuencias de plantas, secuencias bacterianas, secuencias animales, secuencias virales o de fagos, o secuencias completamente artificiales, esto es que no se presentan naturalmente, que no se sabe que se presenten en ningún organismo (ver "ELVISLIVES" a continuación) . Se pueden comparar todas las secuencias con otras secuencias conocidas, o una con la otra usando cualquiera de diversos programas de alineación de secuencias como se establecen a continuación en el ejemplo 4. El término "alto grado de frecuencia" como se usa en la presente, con respecto a la eficiencia de la supresión, se •refiere al porcentaje de líneas transformadas que muestran el fenotipo objetivo suprimido. Los porcentajes de alta frecuencia se esperan que estén en un rango de al menos 15-95% y cualquier porcentaje entero que se encuentre en este rango. Las modalidades preferidas incluirían al menos 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% , y 95%. La presente invención se refiere a un estructura recombinante que comprende un promotor ligado operativamente a una secuencia de ADN la cual cuando se expresa por un hospedador, produce un ARN que tiene: a) homología con al menos un AR?m objetivo expresado por el hospedador, b) dos regiones complementarias de AR? que no están relacionadas con ningún AR? endógeno en el hospedador y que están en proximidad con (a) , en donde el ARN expresado reduce la expresión del AR?m objetivo o cualquier AR?m endógeno substancialmente similar. En otro aspecto, la presente invención se refiere a un estructura recombinante que comprende un promotor ligado operativamente a una secuencia de AD? que cuando se expresa por un hospedador produce un AR? que tiene: a) homología con al menos un ARNm objetivo expresado con el hospedador, b) dos regiones complementarias de ARN que se codifican por cualquier secuencia de ácido nucleico en el genoma del hospedador, con tal de que la secuencia no codifique el ARNm del objetivo o cualquier secuencia que sea substancialmente similar con el ARNm objetivo y las regiones están en proximidad con (a) , en donde el ARN expresado reduce la expresión del ARNm objetivo o cualquier ARNm endógeno substancialmente similar.

Se puede usar cualquier promotor para practicar la invención. Se puede mencionar un promotor de beta conglicinina , un inhibidor de tripsina de la soya Kunitz (KSTI o Kti) promotor, un promotor Gly m Bd 28K, promotor T7, un promotor 35S y un promotor de beta- faseolina. El promotor preferido es aquél de la a' -subunidad de la beta conglicinina (referido en la presente como promotor beta conglicinina) .

Las plantas co-suprimidas que contienen estructuras de expresión recombinantes con el promotor de la subunidad a' de la beta conglicinina, mostrarán a menudo la supresión de las subunidades a y a' de la beta conglicinina (como se describe en la publicación PCT número WO 97/47731, publicada el 18 de Diciembre de 1997, la descripción de la cual se incorpora en la presente como referencia) . Los promotores particularmente preferidos, son aquellos que permiten una expresión específica de semillas. Esto puede ser especialmente útil, ya que las semillas son la fuente primaria de proteínas y aceite de consumo, y también ya que la expresión específica de semillas evitará cualquier efecto potencial perjudicial en tejidos que no son de semilla. Los ejemplos de los promotores específicos de semillas incluyen pero no se limitan a, los promotores de proteínas de almacenamiento de semillas, que pueden representar hasta el 90% de la proteína total de semilla en muchas plantas. Las proteínas de almacenamiento de semillas, se regulan estrictamente, y se expresan casi exclusivamente en semillas en una forma específica por etapas y altamente específica de tejidos (Higgins et al, (1984) Ann Rev. Plant Physiol. 35:191-221; Goldberg et al, (1989) Cell 56:149-160). Además, se pueden expresar diferentes proteínas de almacenamiento de semillas en diferentes etapas del desarrollo de semillas. La expresión de los genes específicos de semillas, se ha estudiado en gran detalle (ver revisiones por Goldberg et al, (1989) Cell 56:149-160 y Higgins et al, (1984) Ann Rev. Plant Physiol. 35:191-221). Hay actualmente ejemplos numerosos de expresión específica de semillas para genes de proteína de almacenamiento de semilla en plantas transgénicas dicotiledóneas . Estos incluyen genes de plantas dicotiledóneas para la ß- faseolina del frijol (Sengupta-Gopalan et al, (1985) Proc. Nati. Acad. Sci USA 82: 3320- 3324; Hoffman et al, (1988) Plant Mol. Biol. 11: 717-729), lectina del frijol (Voelker et al, (1987) EMBO J. 6: 3571- 3577), lectina de la soya (Okamuro et al, (1986) Proc. Nati.

Acad. Sci. USA 83: 8240-8244), inhibidor de la tripsina Kunitz de la soya (Perez-Grau et al, (1989) Plant Cell 1: 095-1109) , b-conglícinina de la soya (Beachy et al, (1985) EMBO J. 4: 3047-3053; vicilina del chícharo (Higgins et al, (1988) Plant Mol. Biol. 11:683-695), convicilina del chícharo (Nwebigin et al, (1990) Planta 180:461-470), legumina del chícharo (Shirsat et al, (1989) Mol. Gen. Genetics 215:326- 331) , napina de semilla de colza (Radke et al, (1988) Theor.

Appl. Genet. 75:685-694), así como genes de plantas monocotiledóneas tales como zeina del maíz 15 kD (Hoffman et al, (1987) EMBO J. 6:3213-3221), oleosina del maíz 18kD (Lee et al., (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:6181-6185), ß-hordeina de la cebada (Marris et al, (1988) Plant Mol. Biol. 10:359-366) y glutenina del trigo (Colot et al, (1987) EMBO J. 6:3559-3564) . Además, los promotores de genes específicos de semillas, ligados operativamente a secuencias codificadoras heterólogas en estructuras quiméricos de genes, también conservan su expresión temporal y espacial en un patrón en plantas transgénicas. Tales ejemplos incluyen el uso del promotor del gen de la proteína de almacenamiento de la semilla 2S de la Arabidopsis thaliana para expresar péptidos de encefalina en semillas de Arabidopsis y Brassica napus (Vandekerckhove et al, (1989) Bio/technology 7:929-932) , lectina del frijol, y promotores de la ß-faseolina del fijol para expresar la luciferasa (Riggs et al, (1989) Plant Sci. 63:47-57), y promotores de la glutenina del trigo para expresar la cloranfenicol acetil transferasa (Colot et al, (1987) EMBO J. 6:3559-3564). Como se observa arriba, se puede usar para practicar la invención cualquier tipo de promotor tal como promotores inducibles o preferidos de tejido, constitutivos. Los ejemplos de los promotores constitutivos, incluyen el virus mosaico de la coliflor (CaMV) en la región de inicio de la transcripción 35S, el promotor 1' o 2' derivado del ADN-T de Agrobacterium tumefaciens, el promotor de ubicuitina 1, el promotor Smas, el promotor de la deshidrogenasa de alcohol de cinamilo (patente E.U.A. número 5,683,439), el promotor Nos, el promotor pEmu, el promotor rubisco, el promotor GRP1-8 y otras regiones de inicio de la transcripción a partir de diversos genes de plantas que se conocen por aquellos con experiencia. Los ejemplos de los promotores inducibles son el promotor Adhl que se induce por hipoxia o tensión en frío, el promotor Hsp70 que se induce por tensión de calor y el promotor PPDK que se induce por la luz . También son útiles los promotores que se inducen químicamente. Los ejemplos de promotores bajo control en desarrollo, incluyen promotores que inician la transcripción preferiblemente en ciertos tejidos, tales como hojas, raíces, frutas, semillas o flores. Un promotor ejemplar es el promotor específico de la antera 5126 ( patente de E.U.A. número 5,689,049 y 5,689,051). Además de aquellos antes mencionados, otros ejemplos de promotores específicos de semillas incluyen pero no se limitan a, el promotor 27 kD gama de la zeina y el promotor ceroso, Boronat, A., Martínez, M C, Reina, M. , Puigdomenech, P. y Palau, J. ; Isolation and sequencing of a 28 kD glutelin-2 gene maize: Common elements in the 5' flanking regions among zein and glutelin genes; Plant Sci. 47, 95-102 (1986) y Reina, M. , Ponte, I., Guillen , P., Boronat, A. y Palau, J. , Sequence analysis of a genomic clone encoding a Zc2 protein from Zea mays W64 A, Nucleic Acids Res 18 (21) , 6426 (1990) . Ver el siguiente sitio con relación al promotor ceroso: Kloesgen, R. B., Gierl, A., Schwarz-Sommer, Z. S. y Saedler, H., Molecular analysis of the waxy locus of Zea mays, Mol. Gen. Genet. 203, 237-244 (1986) . Los promotores que se expresan en el embrión, pericarpio y endosperma se describen en la solicitud PCT número WO 00/11177 publicada el 2 de Marzo de 2000 y solicitud PCT número WO 00/12733 publicada el 9 de Marzo de 2000. Las descripciones de cada una de estas se incorporan en la presente como referencia en su totalidad. Los promotores heterólogos o no heterólogos (esto es endógenos) se pueden usar para practicar la invención. El promotor se liga después operativamente, usando medios convencionales bien conocidos para aquellos expertos en la técnica, para una secuencia de ADN la cual cuando se expresa por un hospedador, produce un ARN que satisface ciertos criterios. El hospedador puede ser cualquier organismo o célula del mismo, dentro del cual el estructura recombinante de esta invención se puede introducir estable o transitoriamente, con objeto de alterar la expresión de genes. Los ejemplos de los hospedadores adecuados, incluyen pero no se limitan a, una planta, animal protozoario, bacteria, virus, u hongo. La planta puede ser una monocotiledónea, dicotiledónea o gimnosperma; el animal puede ser un vertebrado o invertebrado . Los microbios preferidos son aquellos usados en la agricultura o por la industria. Los hongos incluyen organismos en las morfologías de moho y levadura. Las plantas incluyen Arabidopsis; cosechas de campo (por ejemplo, alfalfa, cebada, frijol, maíz, algodón, lino, chícharo, colza, arroz, centeno, girasol, sorgo, soya, cártamo, tabaco y trigo) ; cosechas de vegetales (por ejemplo, espárrago, betabel brócoli, col, zanahoria coliflor, apio pepino, berenjena, lechuga cebolla, pimiento, papa, calabaza, rábano, espinaca calabacita, taro, tomate, y zuccini) ; cosechas de frutas y nueces (por ejemplo, almendra, manzana, albaricoque, plátano, zarzamora, mora azul, cacao, cereza, coco, arándano, dátil, fajoa, avellana, uva, toronja, guayaba, kiwi, limón, lima, mango, melón, nectarina, naranja, papaya, maracuyá, durazno, cacahuate, pera, pina, pistache, ciruela, frambuesa, fresa, tangerina, nuez de nogal, y sandía) ; etc. Los ejemplos de los animales vertebrados humanos o no humanos incluyen mamíferos, peces, ganado, cabras, cerdos, ovejas, roedores, hámster, ratón, rata, conejillos de indias, conejos y primates; los animales invertebrados incluyen nemátodos, otros gusanos, Drosophila y otros insectos. Los órdenes representativos de los insectos Coleóptera, Díptera, Lepidoptera, y Homoptera . La secuencia de ADN expresada por el hospedador, produce un ARN que tiene : a) homología con al menos un AR?m objetivo expresado por el hospedador, bl) dos regiones complementarias de AR? que no se relacionan con ningún AR? endógeno en el hospedador, y que están en proximidad con el AR?m objetivo, en donde el AR? expresado reduce la expresión del AR? objetivo o de cualquier AR?m endógeno substancialmente similar o, b2) dos regiones complementarias del AR? que se codifican por cualquier secuencia de ácido nucleico en el genoma del hospedador, con tal de que la secuencia no codifique el ARNm objetivo, o cualquier secuencia que sea substancialmente similar al ARNm objetivo y las regiones estén en proximidad con (a) . Las regiones complementarias del ARN, pueden comprender cualquiera de los siguientes : a) cualquier secuencia de ácido nucleico que no esté normalmente presente en el genoma de un hospedador, esto es, no se relaciona con ningún ARN endógeno en el hospedador o, b) cualquier secuencia de ácido nucleico en el genoma del hospedador, que codifica las regiones complementarias, con tal de que la secuencia no codifique un ARNm objetivo, o cualquier secuencia que sea substancialmente similar al ARNm objetivo. Con respecto al inciso (a) , cualquier secuencia de ácido nucleico que no está normalmente presente en el genoma de un hospedador, la región o regiones de ARN que no se relacionan con ningún ARN endógeno en el hospedador, pueden comprender una secuencia sintética de ARN que no se presenta naturalmente. Todavía en un aspecto adicional, esta región o regiones de ARN, pueden o no comprender opcionalmente un ARN viral de planta. Con respecto a (b) , cualquier secuencia de ácido nucleico en el genoma del hospedador, que codifica las regiones complementarias, con tal de que la secuencia no codifique el ARNm objetivo, o cualquier secuencia que sea substancialmente similar al ARNm objetivo, esta secuencia comprende las secuencias transcritas o no transcritas de ácido nucleico, que pueden estar presentes en el genoma del hospedador, esto es, esta secuencia puede o no expresarse por el hospedador . Las regiones complementarias del ARN descritas en la presente, están en proximidad con el ARNm objetivo. El término "en proximidad" significa que las regiones complementarias se ligan operativamente 5' al ARNm objetivo, o 3' al ARNm objetivo', o dentro del ARNm objetivo, o 5' y 3' al AR?m objetivo, esto es, las regiones o secuencias complementarias se pueden encontrar en cualquier extremo del AR?m objetivo. Las regiones complementarias de AR? pueden ser de cualquier tamaño que sea adecuado para alterar la expresión del ARNm objetivo. Las secuencias complementarias se prefieren que sean de alrededor de 40-50 nucleótidos de longitud, o más preferiblemente 50-100 nucleótidos de longitud, o más preferiblemente más de 100-300 nucleótidos. Estas secuencias complementarias, se pueden sintetizar usando medios convencionales bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Ejemplos de regiones de ARN adecuadas complementarias, que se pueden utilizar para la práctica de la invención incluyen pero no se limitan a SEQ ID NO: 12 y 13 , secuencias bacterianas, secuencias de medusas, o cualquiera secuencias que se presentan artificial o naturalmente. En otra modalidad, esta invención se refiere a un método para reducir la expresión de un ARNm objetivo, o cualquier ARNm endógeno substancialmente similar que comprende: a) introducir en un hospedador cualesquiera de los esttructuras recombinantes discutidos en la presente, y b) seleccionar hospedadores que tengan una expresión reducida del ARNm objetivo o cualquier AR?m endógeno substancialmente similar. Se discuten arriba los métodos de .transformación y son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. La selección del hospedador que tiene el fenotipo deseado, dependerá del AR?m objetivo, cuya expresión se altera. Como se observa arriba, el AR?m objetivo puede ser cualquier AR?m cuya expresión en el hospedador se vaya a alterar. Típicamente, debe compartir homología con el AR? producido por el hospedador transformado con un estructura recombinante de la invención. La expresión de más de un AR?m objetivo, se puede reducir con tal de que estos objetivos compartan homología con el AR?m producido por el hospedador transformado con un estructura recombinante de la invención.

Todavía en otra modalidad, esta invención se refiere a un estructura recombinante que comprende un ARN en lugar de una secuencia de ADN. Así, este ARN comprende: a) homología con al menos un ARNm objetivo expresado por un hospedador, b) dos regiones complementarias de ARN que no se relacionan con ningún ARN endógeno en el hospedador, y que están en proximidad con (a) , en donde el ARN, cuando se introduce al hospedador, reduce la expresión del ARNm objetivo o cualquier ARNm endógeno substancialmente similar. En otro aspecto, esta invención se refiere a un estructura recombinante que comprende un AR? en lugar de una secuencia de AD? en la cual el ARN comprende : a) homología con al menos un ARNm objetivo expresado por un hospedador, b) dos regiones complementarias de AR? que se codifican por cualquier secuencia de ácido nucleico en el genoma del hospedador, con tal de que la secuencia no codifique el ARNm objetivo o cualquier secuencia que sea substancialmente similar al AR?m objetivo, y cuyas regiones estén en proximidad con (a) , en donde el AR?, cuando se introduce al hospedador, reduce la expresión del ARMm objetivo o cualquier AR?m endógeno substancialmente similar. Como se discute arriba las regiones complementarias de AR? pueden comprender cualquiera de las siguientes : a) cualquier secuencia de ácido nucleico que no esté normalmente presente en el genoma de un hospedador, esto es, no se relaciona con ningún ARN endógeno en el hospedador o, b) cualquier secuencia de ácido nucleico en el genoma del hospedador, que codifica las regiones complementarias, con tal de que la secuencia no codifique un ARNm objetivo, o cualquier secuencia que sea substancialmente similar al AR?m objetivo. Con respecto al inciso (a) , cualquier secuencia de ácido nucleico que no está normalmente presente en el genoma de un hospedador, la región o regiones de ARN que no se relacionan con ningún ARN endógeno en el hospedador, pueden comprender una secuencia sintética de AR? que no se presenta naturalmente. Todavía en un aspecto adicional, esta región o regiones de AR?, pueden o no comprender opcionalmente un AR? viral de planta. Con respecto a (b) , cualquier secuencia de ácido nucleico en el genoma del hospedador, que codifica las regiones complementarias, con tal de que la secuencia no codifique el ARNm objetivo, o cualquier secuencia que sea substancialmente similar al AR?m objetivo, esta secuencia comprende las secuencias transcritas o no transcritas de ácido nucleico, que pueden estar presentes en el genoma del hospedador . Las regiones complementarias del AR? descritas en la presente, están en proximidad con el AR?m objetivo. El término "en proximidad" significa que las regiones complementarias se ligan operativamente 5' al ARNm objetivo, o 3' al ARNm objetivo, o dentro del ARNm objetivo, o 5' y 3' al ARNm objetivo, esto es, las regiones o secuencias complementarias se pueden encontrar en cualquier extremo del ARNm objetivo. Además de estos ARN, se pueden usar en el método para reducir la expresión de un ARNm objetivo o cualquier ARNm endógeno substancialmente similar que comprende: a) introducir en el hospedador cualquiera de los ARN aquí descritos; y b) seleccionar hospedadores que tengan una expresión reducida del ARNm objetivo o cualquier ARNm endógeno substancialmente similar. Todavía en un aspecto similar, la presente invención se refiere a un método para la identificación o separación por exclusión de un gen esencial de planta que comprende: a) transformar una célula de planta con un estructura recombinante que comprende un promotor constitutivo, en donde el estructura es capaz de reducir la expresión de un gen esencial de planta con un alto grado de frecuencia. b) cuantificar todas las células de plantas transformadas de la etapa (a) , c) cuantificar todas las células de plantas transformadas a partir de un control que no reduce la expresión de un gen esencial de planta; y d) comparar la cuantificación de las células de planta transformadas seleccionadas de la etapa (b) , con la cuantificación de las células de plantas transformadas seleccionadas de la etapa (c) , en donde la cuantificación de las células de planta transformadas seleccionadas de la etapa (c) , debe superar substancialmente la cuantificación de la células de planta transformadas seleccionadas de la etapa (b) . Cualquier gen esencial de planta, se puede identificar o separar por exclusión usando el método de la invención. Un aspecto importante de este método, es el uso de un promotor constitutivo y un estructura recombinante capaz de reducir la expresión de un gen esencial de planta con un alto grado de frecuencia. Los genes esenciales de planta se definen arriba. Los promotores constitutivos se definen arriba. Preferiblemente, el promotor constitutivo es un promotor constitutivo fuerte o de alto nivel, en donde la expresión del gen bajo control del promotor, resulta en la producción de altos niveles de ARNm. Cualquier estructura recombinante que comprenda un promotor constitutivo que sea capaz de reducir la expresión de un gen de planta esencial con un alto grado de frecuencia, se puede usar para practicar la invención. En una modalidad preferida, el estructura recombinante puede ser cualquiera de los estructuras recombinantes de la invención que comprenden un promotor ligado operativamente a una secuencia de ADN con tal de que el promotor sea un promotor constitutivo. El término alto grado de frecuencia se define arriba. Se pueden transformar cualesquiera células de plantas usando métodos estándar de transformación como se describen arriba . El número de células de plantas transformadas con un estructura recombinante que comprende un promotor constitutivo, en donde el estructura recombinante se diseña para reducir la expresión de un gen esencial de planta, se cuantifica y compara con el número de células de planta transformadas usando un control en el cual la expresión del gen esencial de planta no se reduce. Si el número de células de planta transformadas con el control supera substancialmente el número de células de planta transformadas con el estructura recombinante diseñado para reducir la expresión de un gen esencial de planta, entonces un gen esencial de planta se ha identificado/separado por exclusión. Por "supera substancialmente" significa al menos una diferencia de cinco veces, y preferiblemente una diferencia de diez veces. También preferida sería una diferencia de 4 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, o más de 10 veces. Así, el número de células de plantas transformadas con el control, debe de ser al menos cinco veces mayor que el número de células de planta transformadas con el estructura recombinante diseñado para reducir la expresión de un gen esencial de planta. EJEMPLOS La presente invención se define además en los siguientes ejemplos, en los cuales todas las partes y porcentajes están en peso y los grados son Celsius, a menos que se establezca de otra manera. Se deberá entender que estos ejemplos, aunque indican modalidades preferidas de la invención, se dan solamente a manera de ilustración. A partir de la discusión anterior y de estos ejemplos, alguien experto en la técnica puede determinar las características esenciales de esta invención, sin alejarse del espíritu y alcance de la misma, y puede hacer diversos cambios sin modificaciones de la invención para adaptarla a diversos usos y condiciones. Las descripciones contenidas dentro de las referencias usadas en la presente, se incorporan por lo tanto como referencia. EJEMPLO 1 Transformación de Cultivos de Embriones Somáticos de Soya. Protocolo de Transformación de Soya Estable Genérico; Se mantienen cultivos en suspensión embriogénicos de soya en un medio líquido de 35 ml (SB55 a SBP6) en un agitador rotatorio, 150 rpm, a 28°C con luces fluorescentes e incandescentes y un programa/noche de 16:8h. Los cultivos se subcultivan cada cuatro semanas,- al inocular aproximadamente 35 mg de tejido en 35 ml de medio líquido. TABLA 1 Soluciones de reserva SB55 (por Litro,pH 5.7) Reserva Sulfato MS 100X 10 ml cada reserva MS MgS04 7H20 37.0 1 ml B5 reserva de vitaminas MnS04 H20 1.69 0.8 g NH4N03 ZnS04 7H20 0.86 3.033 g KN03 CuS045H20 0.0025 1 ml 2,4-D (lOmg/mL reserva) Reserva MS Haluros IQOx 60 g sacarosa CaCl22H20 44.0 0.667 g asparagina Kl 0.083 SBP6 CoCl2 6H20 0.00125 igual a SB55 excepto 0.5 ml 2,4-D KH2P04 17.0 SB103 (por Litro. PH 5.7) H3BÓ3 0.62 Sales IX MS Na2Mo042H2o 0.025 6% maltosa Reserva MS FeEDTA 100X 750 mg MgCl2 Na2EDTA 3.724 0.2% Gelrite FeS04 7H20 2.784 SB71-l(por Litro, pH 5.7) Reserva de Vitamina B5 IX B5 sales 10 g m-inositol 1 ml reserva de vitaminas B5 lOOmg ácido nicotínico 3% sacarosa 100 mg HCl piridoxina 750 mg MgCl2 1 g tiamina 0.2% Gelrite Los cultivos en suspensión embriogénicos de soya, se transforman con pTC3 por el método de bombardeo de pistola de partículas (Klein et al (1987) Nature 327:70). Se usa para estas transformaciones un instrumento PDS1000/HE DuPont Biolistic (retroajuste de helio) . A 50 ml de una suspensión de partículas de oro 1 µm de 60 mg/ml se agrega (en orden) 5 µl DNA (1 µg/µl) , 20 µl de espermidina (0.1 M) , y 50 µl CaCl2 (2.5 M) . La preparación de partículas se agita por 3 minutos, se hace girar en una microcentrífuga por 10 segundos y se separa el sobrenadante. Las partículas recubiertas con ADN se lavan después una vez en 400 µl de etanol al 70% y se vuelven a suspender en 40 µl de etanol anhidro. La suspensión de partículas de ADN se sónica tres veces por un segundo cada una. Se cargan después cinco µl de partículas de oro recubiertas con AD? en cada disco macroportador. Para la selección, un plásmido que le otorga resistencia a la higromicin fosfotransferasa (HPT) puede co-bombardear con el estructura silente de interés. Se colocan aproximadamente 300-400 mg de un cultivo en suspensión de cuatro semanas de edad en una caja petri vacía de 60x15 mm, y el líquido residual se separa del tejido con una pipeta. Para cada experimento de transformación, se bombardean normalmente aproximadamente 5-10 placas de tejido. La presión de ruptura de la membrana se fija a 1000 psi (70 kg/cm2) y la cámara se evacúa hasta un vacío de 28 pulgadas (711.2 mm) de mercurio. El tejido se coloca aproximadamente 3.5 pulgadas (88.9 mm) alejado del tamiz de retención y se bombardea tres veces. Después del bombardeo, el tejido se coloca de vuelta en el líquido y se cultiva como se describe arriba . Once días posteriores al bombardeo, se intercambian los medios líquidos con SB55 fresco que contiene 50 mg/ml de higromicina. Los medios selectivos se renuevan semanalmente. Siete semanas después del bombardeo, el tejido crudo transformado, se observa creciendo de los grupos embriogénicos necróticos sin transformar. El tejido crudo aislado se elimina e inocula dentro de matraces individuales para generar nuevos cultivos de suspensión embriogénica transformados, clonalmente propagados. Así, cada línea nueva se trata como un evento de transformación independiente. Estas suspensiones se pueden mantener como suspensiones de embriones que se conservan en una etapa de desarrollo inmaduro o se regeneran en plantas enteras por maduración y germinación de embriones somáticos individuales. Las líneas independientes de los grupos embriogénicos transformados, se separan del cultivo líquido y se colocan en medios sólidos de agar (SB 103) que no contienen hormonas o antibióticos. Los embriones se cultivan por cuatro semanas a 26°C con luces fluorescentes e incandescentes mezcladas en un programa de día/noche de 16:8 h. Durante este periodo, se separan los embriones individuales de los grupos y se separan por exclusión para alteraciones en sus composiciones de ácidos grasos (ejemplo 3) . La co-supresión de Fad2 resulta en una reducción de los ácidos grasos poliinsaturados y en un incremento en el contenido de ácido oleico. Se debe observar que cualquier fenotipo detectable, que resulte de la co-supresión de un gen objetivo, se puede separar en esta etapa. Esto incluiría pero no se limita a, alteraciones en el contenido de las proteínas, contenido de carbohidratos, tasa de crecimiento, viabilidad o la capacidad de desarrollarse normalmente en una planta de soya. EJEMPLO 2 Transformación de Maíz:. Protocolo de Transformación de Maíz Estable Genérico. La transformación del ADN plásmido en cepas de Hi-II maíz, sigue el protocolo de transformación de bombardeo estándar Hi-II (Songstad D. D. et al. (1996) In Vitro Cell Dev. Biol. Plant 32:179-183). Las células se transforman al cultivar embriones inmaduros de maíz (aproximadamente 1-1.5 mm de longitud) sobre un medio 560P que contiene sales ?6,vitaminas de Erikkson, 0,69 g/1 prolina, 2 mg/l 2,4-D y 3% de sacarosa. Después de 4-5 días de incubación en la obscuridad a 28 °C, se eliminan los embriones de un medio 560P y se cultivan, con el órgano escutiforme hacia arriba, sobre un medio 560Y que es equivalente a 560P pero contiene 12% de sacarosa. Se dejan aclimatar los embriones en este medio por 3 horas previo a la transformación. La superficie escutelar de los embriones inmaduros, se ataca usando bombardeo de partículas, con una mezcla que contiene plásmidos UBI :moPAT:pinII+UBI : GUS:pinll, o con una combinación de estos dos plásmidos, más cualquiera de los esructuras de la presente invención (UBI es el promotor de la ubicuitina-1 Christensen et al (1989) Plant Mol Bio 12:619-632; moPAT se refiere a fosfinotrizin aciltransferasa optimizada de monocotiledóneas, un gen que le otorga resistencia al herbicida de glufosinato de amonio, al que se hace referencia en la solicitud PCT número WO 98/30701 publicada el 16 de Junio de 1998; el terminador pinll (inhibidor de proteinasas) se describe en An et al (1989) Plant Cell 1:115-122; y el gen GUS (beta-glucuronidasa) se describe en Jefferson et al (1986) PNAS 83:8447-8451). Se transforman los embriones usando la pistola de helio PDS-1000 a partir de Bio-Rad, en un tiro por muestra usando discos de ruptura 650PSI (45.70 kg/cm2) . El ADN suministrado por tiro promedia 0.1667 µg. Se bombardea un número igual de embriones por mazorca con un ADN de control (PAT/GUS) o la mezcla del control con cualquiera de los estructuras de la presente invención. Después del bombardeo, se cultivan todos los embriones y se mantienen en un medio 560L (sales N6 vitaminas Eriksson, 0.5 mg/l de tiamina, 20 g/1 de sacarosa, 1 mg/l 2,4-D 2.88 g/1 prolina, 2.0 g/1 de gelrite y 8.5 mg/l nitrato de plata) . Después de 2-7 días posteriores al bombardeo, todos los embriones de ambos tratamientos se transfieren sobre un medio de base N6 que contiene 3 mg/l de medio bialafos Pioneer 560P antes descrito, sin prolina y con 3 mg/l de bialafos) . Se conservan las placas a 28 °C en la obscuridad y se observan para la recuperación de la colonia con transferencias al medio fresco que suceden cada dos semanas . Ensayos transitorios de Maíz ; Se mantiene un callo del tipo II alto, al subcultivar un medio fresco 560P cada dos semanas. El callo saludable se impulsa a través de una malla de nailon de 0.77 mm2 y se vuelve a suspender en un medio de cultivo MS con 2 mg/l de 2,4-D a una densidad de 3 gramos de tejido/40 ml de medio. La suspensión de células se pipetea después en alícuotas de 4 ml (cada una contiene aproximadamente 300 mg de células) sobre papeles filtro de vidrio para bombardeo usando un aparato a vacío. Estos filtros se colocan después en un medio 560P y se cultivan en la obscuridad a 26°C. Después de 2-4 días, se separan los filtros del medio de cultivo, y se separa el líquido en exceso usando un aparato a vacío. Los filtros con células se disparan de (usando la pistola DuPont Biolistics PDSIOOO/He) según los métodos establecidos (ver el ejemplo arriba) usando un 1 µm de partículas de oro y discos de ruptura de 650 psi (45.70 kg/cm2) . Inmediatamente después del bombardeo, se regresan los filtros al medio de cultivo 560P y se cultivan en la obscuridad a 26°C. Se ajustan todos los ADN para obtener una concentración final de un 1 µg/ADN de control/tubo de preparación de partícula (6 tiros) . El experimento típico se dispara como sigue: ADN GUS + ADN control + ADN de luciferasa ADN GUS + ADN del estructura silenciador + ADN de luciferasa. Dos días después del bombardeo de las células, se raspan de los filtros y se extrae la proteína, y se determina la actividad de la enzima usando los ensayos de luciferasa detallados en el protocolo de ensayo del reportero Dual de Luciferasa (Promega Corp., Madison, Wl) . El mismo extracto se usa también para llevar a cabo ensayos fluorométricos GUS usando el protocolo de Rao y Flynn (1990) Biotechniques 8:38-40. Los datos que se presentan en el ejemplo 8 a continuación, se grafican como la relación de unidades GUS/luciferasa . EJEMPLO 3 El Fenotipo de los Embriones Somáticos de la soya Transgénicos, se predice de los Fenotipos de Semillas a partir de Plantas regeneradas resultantes . Los embriones maduros de soya somáticos, son un buen modelo para los embriones cigóticos . Aunque en el estado embrión globular en el cultivo líquido, los embriones somáticos de soya contienen muy pocas cantidades de triacilglicerol o proteínas de almacenamiento típicas de embriones maduros, de soya cigóticos . En esta etapa de desarrollo, la relación del triacilglicérido total con los lípidos polares totales (fosfolípidos y glicolípidos) es de alrededor de 1:4, ya que es típico de los embriones de soya cigóticos en la etapa de desarrollo a partir de la cual se inicia el cultivo de embriones somáticos. También en la etapa globular, los ARNm para las proteínas de semillas prominentes, la subunidad a' de ß-conglicinina, el inhibidor 3 de la tripsina de Kunitz, y la lectina de la semilla están esencialmente ausentes. Con la transferencia a un medio libre de hormonas para permitir la diferenciación de estado de embrión somático maduro, se vuelve el triacilglicerol la clase del lípido más abundante. También, los ARNm para la a' subunidad de ß-conglicinina, el inhibidor 3 de la tripsina Kunitz y la lectina de semilla, se vuelven mensajes muy abundantes en la población total de AR?m. Sobre esta base un sistema somático de embrión de soya se comporta muy similarmente con los embriones maduros de soya cigóticos in vivo, y es por lo tanto un sistema de un modelo rápido y bueno para analizar los efectos fenotípicos de la modificación de la expresión de genes, en la trayectoria de biosíntesis de ácidos grasos. De manera más importante, el sistema del modelo también es predictivo de la composición de ácido graso de las semillas de plantas derivadas de embriones transgénicos. Esto se ilustra con dos diferentes estructuras antisentido, en dos diferentes tipos de experimentos que se construyeron siguiendo los protocolos establecidos en la publicación PCT números W093/11245 y WO 94/11516. Los embriones líquidos globulares de cultivo, se transformaron con un gen quimérico que comprende una desaturasa microsomal ?15 de soya, como se describe en la solicitud PCT número WO 93/11245, que se publicó el 10 de junio de 1993, la descripción de la cual se incorpora en la presente como referencia (experimento 1) , o una desaturasa microsomal de soya ?12 como se describe en la solicitud PCT número WO 94/11516 que se publicó el 26 de Mayo de 1994, la descripción de la cual se incorpora en la presente como referencia (experimento 2) . Ambos estructuras de genes se introdujeron en una orientación antisentido bajo el control de un promotor específico de la semilla (promotor de ß-conglicinina) y dieron lugar a embriones maduros. El contenido de ácido graso de los embriones somáticos maduros a partir de líneas transformadas solamente con el vector (control) , y el vector que contiene los genes quiméricos antisentido, así como de las semillas de plantas regeneradas de ellos se determinó. Se analizó un conjunto de embriones a partir de cada línea para su contenido de ácido graso, y se regeneró otro conjunto de embriones de esa misma línea en las plantas. El análisis de ácido graso de los embriones sencillos se determinó por una transesterificación directa de las semillas individuales en 0.5 mL de H2S04 metanólico (2.5%) o por extracción de hexano de muestras de semillas en volumen seguido por la transesterificación de una alícuota en 0.8 mL de metóxido de sodio al 1% en metanol. Se extrajeron los esteres de metilo de ácidos grasos de las soluciones metanólicas en hexano, después de la adición de un volumen igual de agua. En todos los casos, si hubo un contenido reducido de 18:3 en la línea de embriones transgénicos cuando se compara con un control sin transformar, entonces se observó también una reducción correspondiente en el contenido 18:3 en las semillas segregadas de la planta derivadas de esa línea transformada (Tabla 2) . TABLA 2 Contenido del Porcentaje 18:3 de los Embriones y Semillas de Control y Líneas de Soya Transgénicas de un Estructura Antisentido ?15.

Línea Transformante Promedio de Promedio de Embrión (SD, n=10) Semilla (SD, n=10) Control 12.1 (2.6) 8.9 (0.8) ?15 línea antisentido 1 5.6 (1.2) 4.3 (1.6) ?15 línea antisentido 2 8'9 (2"2) 2-5 (1-8) ? AIS -l.i.nea anti .sen.t.i.d^o 3 7-3 (1-1} 4-9 (1-9) ?15 línea antisentido 4 7.0 (1.9) 2.4 (1.7) ?15 línea antisentido 5 8.5 (1.9) 4.5 (2.2) ?15 línea antisentido 6 7.6 (1.6) 4.6 (1.6) * (Las semillas que se segregaron con el fenotipo de tipo silvestre y sin una copia de transgen no se incluyen en estos promedios) . Además, se usaron líneas diferentes que contienen el mismo estructura antisentido, para un análisis de ácido graso en los embriones somáticos y para la regeneración en plantas. Alrededor del 55% de las líneas de embrión transformadas, mostraron un contenido incrementado 18:1 cuando se comparan con las líneas de control (tabla 3) . Las semillas de soya de las plantas regeneradas a partir de líneas de embriones somáticas diferentes que contienen el mismo estructura antisentido, tuvieron una frecuencia similar (53%) de los transformantes de alto oleato como los embriones somáticos (tabla 3) . De vez en cuando, una línea de embrión puede ser quimérica. Esto es, 10-70% de los embriones en una línea pueden no contener al transgen. Los embriones restantes que contienen el transgen, se han encontrado en todos los casos que son clónales. En tal caso, las plantas con fenotipos de tipo silvestre y transgénicos se pueden regenerar a partir de una línea transgénica sencilla, aun si la mayoría de los embriones analizados de esa línea tuvo un fenotipo transgénico. Un ejemplo de estos se muestra en la tabla 4, en la cual, de 5 plantas regeneradas de una línea de embrión sencilla, 3 tienen un fenotipo oleico alto y dos fueron de tipo silvestre. En la mayoría de los casos, todas las plantas regeneradas a partir de una línea transgénica sencilla, tendrán semillas que contienen el transgen. Así, se concluyó que un fenotipo de ácido graso alterado observado en una línea de embrión somático maduro, transgénico, es predictiva de una composición alterada de ácido graso de las semillas de las plantas derivadas de esa línea. TABLA 3 Niveles de Oleato en Embriones Somáticos y Semillas de Soyas Regeneradas Transformadas con o sin, el Estructura Antisentido de ?12 Desaturasa. Número de Número de Promedio Líneas de Lineas con %18 : 1 Vector Alto 18:1 Embriones Somáticos Control 19 12.0 ?12 antisentido 20 11 35.3 Semillas de Plantas regeneradas Control 18.2 ?12 antisentido 17 44.4 *Promedio de 18:1 de transgénicos es el promedio de todos los embriones o semillas transformadas con el estructura antisentido ?12 en el cual al menos un embrión o semilla de esa línea tuvieron un contenido 18:1 superior a dos desviaciones estándar del valor del control (12.0 en embriones, 18:2 en semillas). El promedio de control, es el promedio de los embriones o semillas que no contienen ningún ADN transgénico, pero que han sido tratados de una forma idéntica con los transgénicos . TABLA 4 Análisis de Semillas de Cinco Plantas Independientes que se segregan de la Línea de Planta 4. Número de Planta Semilla Promedio Semilla más Alta 18:1% 18:1% 18.0 26.3 33.6 72.1 13.6 21.2 9 32.9 57.3 11 24.5 41.7 Media de 15-20 semillas a partir de 5 plantas diferentes regeneradas de una línea de embrión sencilla. Solamente las plantas # 2,9 y 11 tuvieron semillas con un alto fenotipo 18:1. EJEMPLO 4 Análisis de la Secuencias de Ácido Nucleico.

Las secuencias de ácido nucleico que comprenden las regiones objetivo o las regiones complementarias, se analizan al llevar a cabo un BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al (1993) J. Mol. Biol. 215:403-410; búsqueda de similitud de secuencia contenidas en la base de datos BLAST "nr" que comprenden todas las traducciones no redundantes del GenBank CDS, secuencias derivadas de una estructura tridimensional del Brookhaven Protein Data Bank, la ultima liberación principal de la base de datos de secuencia de proteínas SWISS-PROT, EMBL, y bases de datos DDBJ) . Las secuencias de nucleótidos se analizan por similitud para todas las secuencias de ADN públicamente disponibles contenidas en la base de datos "nr" usando el algoritmo BLASTN suministrado por el Centro Nacional para Información de Biotecnología (NCBI) . Las secuencias de ADN, se pueden también traducir en todas las estructuras de lectura, y compararse por similitud con todas las secuencias de proteínas públicamente disponibles, contenidas en la base de datos "nr" , usando el algoritmo BLASTX (Gish y States (1993) Nat. Genet. 3:266-272) suministrado por la NCBI . Por conveniencia, el valor P (probabilidad) de observar una correspondencia de una secuencia de ADNc con una secuencia contenida en las bases de datos buscadas, meramente por casualidad como se calcula por BLAST, se reporta en la presente como los valores "pLog" , que representan la negativa del logaritmo del valor P reportado. De esta manera, entre mayor sea el valor pLog, mayor la probabilidad de que la secuencia de ADNc y el "golpe" BLAST represente proteínas homologas . EJEMPLO 5 Una Comparación de la Expresión Reducida Fad2, usando una Co- supresión Antisentido vs "Clásica" vs una Co-Supresión de "Región Complementaria" . Las siguientes son algunas comparaciones, de la co-supresión "clásica" antisentido, y la co-supresión de "región complementaria" (CRC) en experimentos similares que involucran una desaturasa de soya de ácido graso (Fad) . El Fad2-1 es un lugar de genes que codifica una desaturasa ?-12 de la soya, e introduce un doble enlace en la cadena lateral del ácido oleico, para formar un ácido graso poliinsaturado. La reducción en la expresión de Fad2-1, resulta en la acumulación del ácido oleico (18:1, o un extremo de ácido graso de 18 carbones con un doble enlace sencillo) y una correspondiente disminución en el contenido de ácido graso poliinsaturado Los estructuras antisentido tienen todos o una porción, de la región codificadora Fad2-1 en una orientación inversa detrás de un promotor fuerte. Se cree que la expresión del ARN "antisentido" interfiere con la traducción normal del gen endógeno homólogo por medio de un evento de hibridación. El estructura de co-supresión clásica tiene todo, o una porción del Fad2-1 en la orientación de sentido normal detrás de un promotor fuerte. Se cree que la expresión del ARN co-supresor, activa un mecanismo no caracterizado, que resulta en la eliminación parcial o total, del ARN introducido, así como todos los ARN que tienen secuencias substancialmente similares. El estructura CRC usado contiene una porción de la región codificadora Fad2-1 (300 pb) , duplicado en la orientación inversa del complemento, que forma una región complementaria específica para Fad2-1. Los plásmidos usados en estos experimentos, se hicieron usando métodos de clonación estándar bien conocidos por aquellos expertos en la técnica (Sambrook et al (1989) Molecular Cloning, CSHL Press, New York) . Un plásmido de partida pKS18HH (patente E.U.A. número 5,846,784, los contenidos de la cual se incorporan en la presente como referencia) contiene una higromicina B fosfotransferasa (HPT) obtenida de una cepa de E. coli W677 bajo el control de un promotor T7 y el promotor del virus mosaico de la coliflor 35S. El plásmido pKS18HH contiene así al promotor T7/HPT/casete terminador T7 para la expresión de la enzima HPT en ciertas cepas de E. coli, tal como NovaBlue (DE3) [de Novagen] , que son lisogénicas para lambda DE3 (que lleva el gen de polimerasa de ARN T7 bajo el control lac V5) . El plásmido pKS18HH también contiene el cásete 35S/HPT/NOS para la expresión constitutiva de la enzima HPT en plantas tales como la soya. Estos dos sistemas de expresión, permiten la selección para el crecimiento en presencia de higromicina, para usarse como un medio de identificación de células que contienen el plásmido, en sistemas bacterianos y de plantas. El PKS18HH también contiene tres sitios únicos de endonucleasas de restricción, adecuados para la clonación de otros genes quiméricos en este vector. El plásmido ZBL100 (solicitud PCT número WO 00/11176 publicada el 2 de Marzo de 2000) , es un derivado de pKS18HH con un terminador reducido NOS 3'. El plásmido pKS67, es un derivado ZBL100 con la inserción del promotor de beta-conglicinina, frente a un sitio de clonación ?otl, seguido por un terminador 3' de faseolina (descrito en la solicitud PCT número WO 94/11516, publicada el 26 de Mayo de 1994) . El PKS91 es un derivado de pKS67 con un fragmento de horquilla de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) del gen de soya Fad2 insertado dentro del sitio ?otl . Los cebadores usados en las reacciones con el AD? de soya Fad2-1 como siguen (todas las secuencias son 5' hasta 3' ) : PCR (A) GAATTCGCGGCCGCATGGGAGGTAGAGGTC SEQ ID ?O: 1 GGAAAACCATGCAACCCATTGGTACTTGCT SEQ ID ?O : 2 PCR (B) AGCAAGTACCAATGGGTTGCATGGTTTTCC SEQ ID NO: 3 AGCAAGTACCAATGGATACTTGTTCCTGTA SEQ ID NO : 4 PCR (A/AS) TACAGGAACAAGTATCCATTGGTACTTGCT SEQ ID NO: 5 GAATTCGCGGCCGCATGGGAGGTAGAGGTC SEQ ID NO : 6 Los productos de las tres reacciones (A) + (B) + (A/AS) se ligan en conjunto, se digieren con la enzima de restricción Not I, y el fragmento 1.3 kb se clona dentro del sitio ?ot I de KS67. El plásmido pKS91 se usa en los experimentos presentados en esta sección. El plásmido pKS17 de 2.5 kb contiene pSP72 (obtenido de Promega Biosystems) y el promotor T7/HPT/región del terminador 3' de T7 , y es el vector original dentro del cual el fragmento BamHI-Sall de 3.2 kb que contiene el cásete de 35S/HPT/NOS, se clona para formar pKS18HH. El plásmido pKS102 es un derivado de pKS17, que se digiere con Xhol y Salí, se trata con una nucleasa del frijol de mezcla para generar puntas romas, y se liga al inserto el siguiente ligador: GGCGCGCCAAGCTTGCATCCGTCGACGGCGCGCC SEQ ID ?O : 7 El plásmido pKS83 tiene el fragmento BamHl de 2.3 kb de ML 70, que contiene el promotor Kti 3 NotIKti3 3' región del terminador (descrito en la solicitud PCT número WO 94/11516 publicada el 26 de Mayo de 1994) , ligado en un sitio BamHl de pKS17. El plásmido pKS103 es un derivado de pKS83 con un fragmento Notl de 1.3 kb de pKS91 (que contiene la secuencia complementaria Fad2) ligada en el sitio Notl. Con objeto de tener números comparables de líneas antisentido, para comparar los estructuras de co-supresión más numerosos, fue necesario incluir experimentos antisentido en los cuales el Fad 6 se co-bombardeo con el Fad 2-1. El Fad 6 es un gen que codifica la ?-12 desaturasa que se encuentra en plástidos (lo opuesto a Fad2 , que se encuentra en el compartimiento microsomal) . Se cree que la supresión de Fad2 y Fad6, pudiera tener simultáneamente un fenotipo más fuerte o diferente, que solamente la supresión de Fad2. Sin embargo, ya que se ha determinado que el Fad6 no produce un fenotipo, por lo tanto los fenotipos obtenidos de los experimentos antisentido con Fad2 y Fad6, solamente reflejan cambios en el contenido Fad2. Los embriones de control (286 individuos) tuvieron un promedio de un contenido de 18:1 de 9% con una desviación estándar (SD) de 6.2% (rango actual 4-22%) . Así, se escogió un contenido del ácido oleico del 25%, para representar una reducción positiva en Fad2.1, lo que resulta en un 18:1 incrementado que es más de 2 desviaciones estándar de la media, y superior al valor más elevado de control observado. Si una línea tiene al menos un embrión con un contenido 18:1 de 25% o más, se cuenta como un evento antisentido o de co-supresión. Se combinaron dos experimentos para generar alrededor de 30 líneas. TABLA 5 Líneas Transformadas Positivas con una Expresión Reducida Fad2 -1.

Otro punto a considerar cuando se analizan plantas transgénicas con expresión reducida debido al antisentido o la co-supresión, es el quimerismo. En los experimentos de antisentido y de co-supresión anteriores, las líneas de eventos positivos detectadas pueden tener solamente contenido un embrión sencillo de cada diez, con un contenido aumentado de ácido oleico. Ya que todos estos experimentos tuvieron diez embriones por línea analizados, es posible representar gráficamente los datos de quimerismo al graficar los números actuales de embrión contra el contenido oleico (mayor o menor del 25%, que sería indicativo de un transformante reducido en la expresión ?-12) . Por lo tanto, si una línea no tiene quimerismo o tiene muy poco, entonces todos sus embriones tendrán un fenotipo suprimido en lo opuesto a los tipos silvestres. Los datos parecen ser bastantes convincentes de que los transformantes CRC (el recuadro gris) dan contenidos de ácido oleico o consistentemente superiores con menos eventos quiméricos . Otra cuestión es la eficiencia con la cual una línea muestra el fenotipo de expresión reducida. Los resultados de los experimentos en la presente y en el ejemplo 6, confirman que los estructuras que contienen las regiones complementarias en proximidad con la secuencia objetivo, fueron más efectivos al producir un contenido muy elevado de 18:1 en embriones que la co-supresión antisentido o clásica (esto es, lo opuesto a la región complementaria que contiene la co-supresión de CRC) . El nivel de supresión alcanzado en un experimento, se refleja en el incremento correspondiente del contenido del ácido oleico en las plantas . Entre mayor sea el promedio del contenido 18:1 mayor el grado de supresión. La región complementaria que contiene los estructuras tuvieron contenidos de ácido oleico del 50% que es superior a 5 SD de la media de control . TABLA 6 Líneas Positivas Transformadas con una Reducción de Alta Eficiencia en la Expresión Fad2-1.

Parece que el CRC es la forma más eficiente y efectiva de producir un alto contenido 18:1 en embriones con un contenido reducido Fad2-1. Como se muestra en el ejemplo 3, hay una correlación fenotípica entre el contenido de ácido oleico de los embriones y el contenido de ácido oleico de las semillas de las plantas transgénicas. Así, los experimentos que producen líneas embriónicas con más del 51%, son más deseables ya que parecen garantizar una semilla oleica de más del 80%. Se observa que la mayoría de las líneas de semillas positivas detectadas, están cercanas a (o superiores a) 80% oleico. Aquellas pocas que no parecen derivarse de las líneas de embriones con un contenido oleico máximo en el rango de 30 a 50%. Hasta la fecha ningunas líneas que tuvieran un fenotipo positivo que tuvieran un contenido máximo de embriones de ácido oleico menor al 30%, y líneas en el sistema de producción con 51% o más de contenido de ácido oleico, no habían dado nunca lugar a mejores fenotipos de semillas. Adicionalmente, las cinco líneas superiores de embriones de la producción (todas superiores a 50% oleico) dieron el mejor fenotipo en las semillas (superior al 80%) y las cuatro líneas de embriones del fondo (todos menos de 50% oleico en embriones) todos dieron menos del 80% del contenido de ácido oleico en la semilla. EJEMPLO 6 Secuencias Objetivo y Complementarias que pueden Ambas co Suprimir sus Homólogos Endógenos . La inclusión de una región complementaria en la región objetivo de un estructura de co-supresión, resulta en la mejora de la eficiencia y uniformidad en los transformantes resultantes (ejemplo 5) . La siguiente etapa es para probar si se puede suprimir más de un gen usando este enfoque . Los resultados preliminares que usan una región complementaria de 300 nucleótidos del Fad2-1 que rodea a un objetivo de 600 nucleótidos del gen de tioesterasa de soya, resulta en la supresión de ambos genes. Este resultado fue interesante por dos razones. Primero la región complementaria de Fad2 , se interrumpe con la secuencia de tioesterasa, a diferencia del estructura presentado en el ejemplo 5. En segundo lugar, la secuencia objetivo no complementaria (tioesterasa) se inhibió en todas las líneas que muestran una reducción Fad2 de la expresión, implicando que hubo una eficiencia igual de la reducción de la región complementaria y objetivo de la expresión. Para probar además si alguna expresión de secuencia objetivo se puede reprimir eficientemente con alguna región complementaria, se hizo un estructura usando Fad2-1 como el objetivo, en combinación con una región complementaria a partir del lugar eceriferum3 de soya (cer3) . El Cer3 codifica uno de los 21 productos de genes que se sabe que están involucrados en la biosíntesis de cera en Arabidopsis thaliana (Hanoufa et al (1996) Plant J 10:459-67). La inhibición de un gen sencillo cer3 , no tiene un gen o tipo visible en la soya. También, el cer3 esta involucrado en una trayectoria biosíntetica que no tiene interacciones conocidas con la trayectoria metabólica de ácidos grasos que contiene la actividad Fad2. El plásmido pKSlOO es un derivado de pKS67. Las reacciones por PCR se operan con los siguientes cebadores (orientación de 5 '-3') y el ADN cer3 : PCR (A+B) GAATTCGCGGCCGCGGCACGAGATTTGAGG SEQ ID NO : 8 TTGCCCAATGTTTATGCATATGTAGAACTG SEQ ID NO : 9 PCR (A/AS) CAGTTCTACATATGCATAAACATTGGGCAA SEQ ID NO : 10 GAATTCGCGGCCGCGGCACGAGATTTGAGG SEQ ID NO : 11 El producto de las dos reacciones se liga en conjunto, se digiere con Notl y se clona en el sitio Notl de pKS67. A continuación, el fragmento de Seal de 516 pares base del Fad2-1 de la soya, se liga dentro de un pKSlOO digerido con FspI (dentro del ADN Cer3 , una porción pequeña de la secuencia complementaria) para formar pBS58. Las digestiones de las enzimas de restricción se usaron para seleccionar el plásmido que contiene el fragmento Fad2 en la orientación de sentido y antisentido. Se cree que la expresión Fad2 se reduce eficientemente en todos los estructuras probados en las soyas . EJEMPLO 7 Supresión de la soya en Fad2 por la región de Complementariedad ELVISLIVES Se han hecho ahora estructuras que tienen "regiones sintéticas complementarias" (SCR) . Ya que el objetivo CR Fad2/TE2 suprime ambos genes endógenos en la línea examinada, y ya que los estructuras Cer3/Fad2 suprimen el Fad2, se deduce que puede ser posible usar cualquier secuencia complementaria para reducir la expresión de un objetivo. En este ejemplo, la secuencia objetivo se coloca entre las secuencias complementarias que no se sabe que sean parte de algún gen o genoma derivado biológicamente (esto es, las secuencias que son "sintéticas" o ideadas por la mente del inventor) . El ADN objetivo estaría por lo tanto en la orientación sentido o antisentido y el ARN complementario no se relacionaría con ninguna secuencia conocida de ácido nucleico. Es posible designar un "vector de supresión" estándar dentro del cual se puedan arrojar piezas de cualquier gen objetivo para supresión. Los plásmidos pKS106, pKS124 y pKS133 ejemplifican esto. Alguien experto en la técnica apreciará que todos los vectores plásmidos contienen genes de selección de antibióticos tales como, pero no limitados a, higromicin fosfotransferasa con promotores tales como el promotor inducible T7. El pKS106 usa el promotor de la beta-conglicina, mientras que los plásmidos pKS124 y 133 usan el promotor Kti, ambos promotores muestran una fuerte expresión específica de tejidos en las semillas de soya. El pKS106 usa una región de terminación 3' del gen de faseolina, y el pKS124 y 133 usa una región de terminación Kti-3'. El pKS106 y 124 tienen copias sencillas de la secuencia de 36 nucleótidos Eagl-ELVISLIVES, que rodea a un sitio Notl (los aminoácidos dados en paréntesis se traducen de nuevo de la hebra complementaria) : SEQ ID ?O: 12.

Eagl E L V I S L I V E S ?otl CGGCCG GAG CTG GTC ATC TCG CTC ATC GTC GAG TCG GCGGCCGC (S) (E) (V) (I) (L) (S) (I) (V) (L) (E) Eagl CGA CTC GAC GAT GAG CGA GAT GAC CAG CTC CGGCCG PKS133 tiene 2X copias de ELVISLIVES que rodean al sitio Notl : SEQ ID NO : 13 .

Eagl E L V I S L I V E S Eagl E L V I S cggccggagctggtcatctcgctcatcgtcgagtcg gcggccg gagctggtcatctcg L I V E S Notl (S) (E) (V) (I) (L) (S) (I) (V) (L) (E) Eagl ctcatcgtcgagtcg gcggccgc cgactcgacgatgagcgagatgaccagctc cggccgc (S) (E) (V) (I ) (L) (S) (I ) (V) (L) (E) Eagl cgactcgacgatgagcgagatgaccagctc cggccg • La idea es que el ligador sencillo EL (SCR) se pueda duplicar para incrementar las longitudes de las células madre en incrementos de aproximadamente 40 nucleótidos. Una serie de vectores cubrirán las longitudes SCR entre 40 pares base y 300 pares base. También están bajo evaluación diversas longitudes de genes objetivo. Se cree que ciertas combinaciones de las longitudes objetivo y las longitudes de la región complementaria, darán una supresión óptima del objetivo, aunque los resultados preliminares indicarían que el fenómeno de supresión trabaja bien sobre un amplio rango de tamaños y secuencias . También se cree que las longitudes y relaciones que proporcionan una supresión óptima, pueden variar de alguna forma dadas las secuencias objetivo diferentes y/o las regiones complementarias . El plásmido pKS106 se hace al colocar el fragmento Eagl de ELVISLIVES (SEQ ID NO: 12) dentro del sitio Notl de pKS67. El fragmento ELVISLIVES se hace por PCR usando dos cebadores y ningún otro ADN: 5 ' -GAATTCCGGCCGGAGCTGGTCATCTCGCTCATCGTCGAGTCGGCGGCCGCC GACTCGACGATGAGCGAGATGACCAGCTCCGGCCGGAATTC-3' SEQ ID NO: 14 5'-GAATTCCGGCCGGAG-3' SEQ ID NO: 15 El producto de la reacción por PCR se digiere con Eagl (5' -CGGCCG-3' ) y después se liga dentro del pKS67 digerido con Notl. El pKSlll, se hace al insertar un fragmento de 599 nucleótidos del gen delta 12 desaturasa (Fad2 , -nucleótidos 399-997) , en una orientación antisentido dentro del sitio Notl de pKS106. El fragmento Fad2 se hace por PCR usando los siguientes cebadores y el ADN Fad2 como plantilla: GAATTCGCGGCCGCTGAGTGATTGCTCACGAGT SEQ ID NO: 16 GAATTCGCGGCCGCTTAATCTCTGTCCATAGTT SEQ ID NO: 17 El producto por PCR se digiere con (5' -GCGGCCGC-3 ' ) Notl y se liga dentro del pKS106 digerido con Notl. La longitud total de la secuencia complementaria es de 47 nucleótidos (con los 8 nucleótidos del sitio Notl y 3 bases adicionales de flanqueo). La co-supresión de Fad2 , resulta en una disminución en la producción de ácidos grasos poliinsaturados, y un incremento correspondiente en la acumulación de ácido oleico (18:1) en las soyas. (Ver ejemplo 3 arriba) . Las concentraciones de ácido oleico en 18 de las 22 líneas transformadas con pKSlll fueron de 2-5 veces aquellas encontradas por los controles solamente del vector, indicando una co-supresión en 82% de las plantas transgénicas recuperadas. Parece que la colocación de un PCR sencillo (ELVISLIVES o EL) que rodea a un segmento corto de Fad2 (600 bp) , es suficiente para dar la co-supresión a eficiencias iguales a las eficiencias alcanzadas usando los estructuras CRC del ejemplo 5. El término "ELVISLIVES" y "EL" se usan intercambiablemente en la presente . Se pueden usar plásmidos adicionales para probar este ejemplo. Por ejemplo, pKS121 contiene el promotor Kti3/fragmento terminador Notl/Kti3 3' análogo al pKS83, insertado dentro del pKS102 digerido con BamHI-SalI. El sitio de clonación ELVISLIVES digerido con Eagl, se hace de SEQ ID NO: 14 y 15, se inserta dentro del sitio Notl de pKS121 para formar pKS124. El fragmento Fad2 del pKSlll, se liga en el pKS124 digerido con Notl para formar pKS132. El producto por PCR de EL digerido con Eagl, se puede ligar dentro del pKS124 digerido con Notl, para formar 2XEL pKS133. Un vector adicional 2XEL, pKS151, es similar pKS133 excepto por la adición de un segundo gen de higromicin fosfotransferasa, con un promotor 35S-CaMV. Cualquier secuencia sintética, o secuencia que se presente naturalmente, se puede usar de una forma análoga. La adición del fragmento Fad2 de soya de 599 pares base de pKSlll dentro del pKS133 digerido con Notl produce pKS136. La eficiencia de la supresión de Fad2 usando 1XEL (pKS132) se comparó con la supresión de Fad2 usando el estructura 2XEL (pKS136) . Las líneas resistentes a la higromicina de los embriones de soya, se aislaron de experimentos independientes de transformación con pKS132 y pKSÍ36. De las 98 líneas que contienen pKS132, el 69% desplegó el fenotipo oleico elevado. De 54 líneas que contiene pKS136, el 70% desplegó el fenotipo alto de ácido oleico. Así, los estructuras IX y XEL, suprimen eficientemente el gen objetivo Fad2. EJEMPLO 8 Longitud de la Secuencia Objetivo Fad2, Afecta la Eficiencia de la Supresión. Se probó la longitud del objetivo, para determinar el efecto en la eficiencia de la supresión en un estructura EL. Se llevaron a cabo reacciones por PCR, usando los cebadores mostrados en la tabla 7, para crear 25, 50, 75, 150, 300, y 600 de fragmentos de Fad2 , para colocarse entre las regiones complementarias 2XEL. Los productos por PCR, se cortaron con Notl y se ligaron dentro de pBluescript, y se verificó la secuencia de los fragmentos . Los fragmentos digeridos con Notl, se ligaron después dentro del Notl de pKS151. TABLA 7 Cebadores para PCR del Fad2 de Soya.

TABLA 8 Efecto de la Longitud Objetivo en la supresión por 2XEL Los resultados en la tabla 8 , muestran una correlación clara entra la longitud objetivo y la eficiencia de la supresión. El fragmento más largo (600 bp) de Fad2 , es casi dos veces tan probable que se suprima en el estructura EL que un fragmento de 300 pares base, mientras que no son efectivos los fragmentos más cortos y de 50 pares base.

EJEMPLO 9 Secuencias Objetivo Múltiples se pueden Suprimir por 2XEL. Se ensambló un estructura para probar si se pueden usar secuencias objetivo múltiples entre las secuencias complementarias EL para lograr una supresión simultánea. Un fragmento de 969 pares base de una delta 9 desaturasa de soya, se insertó dentro de pKS136 junto al fragmento Fad2 de 599 pares base para formar pKS68. Ambos fragmentos de desaturasa se flanquearon por las regiones complementarias 2XEL (2XEL- Fad2- Delta 9- 2XEL la secuencia de la cual se muestra en SEQ ID NO: 24) . La delta 9 desaturasa, cataliza el doble enlace en la posición 9 de los ácidos grasos de 18 carbones para formar el ácido oleico (18:1) del ácido esteárico (18:0), análogo con la delta-12 Fad2 que cataliza el doble enlace en la posición 12 que convierte el ácido oleico a ácido linolénico (18:2) . La supresión del gen particular Fad2 , resulta en una acumulación del ácido oleico a costa de los ácidos grasos poliinsaturados. La supresión de las delta 9 desaturasas, resulta en una acumulación de ácido esteárico, a costa de todos los ácidos grasos insaturados. Sin embargo, existen diversas delta 9 desaturasas en la soya (al menos 3) entonces no está clara la forma en que la supresión de un miembro afectaría la composición del aceite. Los protocolos de transformación y los análisis de composición del aceite, se llevaron a cabo como se detallaron previamente en los ejemplos 1 y 3 respectivamente. La transformación de la soya con pBS68, resulta en 113 líneas resistentes a la higromicina. De estas, 72 muestran cierto fenotipo de aceite (64%) . Los fenotipos de las 72 líneas suprimidas fueron: 18 fueron altos en estearato, 23 fueron altos en oleato, y 31 fueron tanto altos en oleato como altos en estearatos. Por lo tanto, se pueden suprimir eficientemente objetivos múltiples por un estructura sencillo EL. EJEMPLO 10 Supresión de los Genes de Soya de Galactinol Sintasa en Estructuras ELVISLIVES. Los sacáridos de rafinosa son un grupo de derivados de oligosacáridos que contienen D-galactosa de la sacarosa que se distribuye ampliamente en las plantas. Los sacáridos de rafinosa, se caracterizan por la fórmula general [O-ß-D-galactopiranosil- (1— 6) n-a-glucopiranosil- (l-»2) -ß-D-fructofuranósido en donde n=0 hasta n=4, se conocen respectivamente como sacarosa, rafinosa, estaquiosa, verbascosa y ajugosa. Aunque son abundantes en muchas especies, los sacáridos de rafinosa son un obstáculo para la utilización eficiente de algunas especies de cosecha económicamente importante . Los sacáridos de rafinosa no se digieren directamente por los animales, principalmente por que no está presente la alfa galactosidasa en la mucosa intestinal [Gitzelmann et al (1965) Pediatrics 36:231-236; Rutloff et al (1967) Nahrung 11:39-46] . Sin embargo, la microflora en el intestino inferior, esta lista para fermentar los sacáridos de rafinosa, que resultan en una acidificación del intestino y la producción de bióxido de carbono, metano y gases de hidrógeno [Murphy et al (1972) J. Agr. Food. Chem. 20:813-817; Cristofaro et al (1974) in Sugars in Nutrition, H. L. Sipple y K. W. McNutt, Eds. Academic Press, New York, Chap. 20, 313-335; Reddy et al (1980) J. Food Science 45:1161-1164] . La flatulencia resultante, puede limitar severamente el uso de plantas leguminosas en animales, particularmente en las dietas de humanos . Es desafortunado que la presencia de los' sacáridos de rafinosa, restrinjan el uso de las legumbres en las dietas de los humanos, debido a que muchas de estas especies son de otra manera excelentes fuentes de proteína y de fibra soluble. Serian más valiosas las variedades de bayas comestibles libres de sacáridos de rafinosa, para las dietas humanas y animales, y se facilitaría un acceso más amplio a las calidades nutricionales deseables de las plantas leguminosas comestibles . La biosíntesis de los sacáridos de rafinosa ha estado bien caracterizada (ver Dey (1985) in Biochemistry of Storage Carbohydrates in Green Plants, P. M. Dey and R. A. Dixon, Eds. Academic Press. London, pp. 53-129]. La reacción comprometida de la biosíntesis del sacárido de rafinosa, involucra la síntesis de galactinol a partir de UDP-galactosa y mio-inositol. La enzima que cataliza esta reacción es la galactinol sintasa (inositol 1-alfa-galactosiltransferasa; EC 2.4.1.123). La síntesis de la rafinosa y de homólogos superiores en la familia de los sacáridos de la rafinosa, a partir de sacarosa, se cree que se cataliza por diferentes galactosil transferasas (por ejemplo, la rafinosa sintasa y la estaquiosa sintasa) . Los estudios en muchas especies, sugieren que la galactinol sintasa es la enzima clave que controla el flujo de carbón reducido dentro de la biosíntesis de sacárido de rafinosa [Handley et al (1983) J. Amer. Soc. Hort. Sci. 108:600-605; Saravitz, et al (1987) Plant Physiol. 83:185-189]. Al alterar la actividad de la galactinol sintasa, ya sea como resultado de una sobreexpresión o a través de una inhibición antisentido, se cambiaría la cantidad de sacáridos de rafinosa producidos en un tejido dado. Los genes de galactinol sintasa relacionados, que ya se conocen en la técnica, incluyen las secuencias descritas en la patente de E.U.A. número 5,773,699 y 5,648,210, Kerr et al, "Nucleotide Sequences of Galactinol Synthase from Zucchini and Soybean" y Sprenger y Keller (2000) Plant J 21:249-258. Las secuencias presumiblemente desarrolladas también se describen en la publicación PCT número WO 98/50553, Lightner "Corn Glycogenin" . Se han identificado previamente dos genes que codifican la galactinol sintasas de la soya (SEQ ID Nos: 30 y 32, con los productos de traducción predichos que se muestran en SEQ ID Nos: 31 y 33; presentados en la patente de E.U.A. número 60/196550, solicitud provisional de E.U.A. número 60/196550, presentada el 11 de Abril de 2000) . A diferencia del gen de la soya particular de Fad2 , se conoce que hay múltiples genes de la galactinol sintasa en la soya. Debido a que hay múltiples genes que codifican las galactinol sintasas, se cree que la supresión de más de un gen se puede requerir para detectar un efecto en los niveles de azúcar de rafinosa. Se ensambló un estructura de plásmido que contiene los fragmentos de dos genes de soya de la galactinol sintasa (390 pares base desde 13-402 de SEQ ID ?O : 30) y Gas2 (399 pares base, desde 129-527 de SEQ ID ?O: 32) clonados en el sitio ?otl del cásete 2XEL. La región del promotor fue un promotor de embrión tardío (Lea) de la soya. El promotor Lea (Lee et al (1992) Plant Physiol 100:2121-2122; ?o. Acceso al Genbank M97285) se amplificó del AD? de soya genómico A2872 con los siguientes cebadores : SEQ ID ?O:25 5 ' -ATT AC CTC AAT TCT TCT AAG (posición 25-45 of M97285) SEQ ID NO: 26 5' -TTC AAA GAT CAA TTA TTT CC (posición 995- 1112 M97285) y una terminación en 3 ' de faseolin (amplificada con los cebadores que se muestran en SEQ ID Nos: 27 y 28) se agregó. El promotor completo de Lea -2XEL -Gasl -Gas2 -2XEL -terminación 3' de faseolin en cásete, se clonó después en el sitio BamHl de pKS136 para crear el vector pKS149 (la secuencia de la región completa EL de pKS149 se muestra en SEQ ID NO: 29) . Cuando se introduce en las plantas, el pKS136 inhibirá a Fad2 (controlado por el promotor Kti) y los genes Gas (controlados por el promotor Lea) . Ya que el promotor Kti es activo en los embriones, es posible separar por exclusión los embriones para un fenotipo alto oleico, como se describe en los ejemplos previos. De las 119 líneas aisladas como resistentes a la higromicina, se encontró que un 65% tenia un fenotipo alto oleico. Estas líneas suprimidas, también deben contener el cásete de supresión Gas, que permite el ensayo de los azúcares de rafinosa en las plántulas (el Lea no está activo durante la etapa temprana de embriones) . Se pueden detectar los azúcares de rafinosa (galactinol, rafinosa, estaquiosa, etc) usando cromatografía de capa delgada. Las muestras de plantas se extraen con hexano y 'después se secan. El material seco se vuelve a suspender después en metanol al 80%, se incuba a temperatura ambiente por 1 ó 2 horas, se centrifuga y se hacen manchados de 1 ó 2 de microlitros del sobrenadante en una placa TLC (Kieselgel 60 CF, de EM Scientific, Gibbstown, NJ; catálogo no. 13749-6) . La TLC se opera en etilacetato : isopropanol : ácido acético al 20% (3:4:4) por 1-1.5 horas. Las placas secadas al aire, se rocían con ácido sulfúrico 2% y se calientan hasta que se detectan los azúcares quemados. Como se muestra en la figura 2, las dos líneas etiquetadas como GAS-EL muestran niveles reducidos de azúcares de rafinosa (la banda más baja) cuando se comparan con un control conocido por tener azúcares de muy baja rafinosa (bajo 4) . Se estima que hay una reducción del 60% de los azúcares de rafinosa en estas líneas cuando se compara con una soya de tipo silvestre. EJEMPLO 11 Se puede usar Estructuras ELVISLIVES para separar por Exclusión Genes de Planta Esenciales. La acetolactato sintasa (ALS) , también conocido como acetohidroxiácido sintasa (AHAS) , cataliza la primera etapa común en la biosíntesis de los aminoácidos de cadena ramificada, isoleucina, leucina y valina (Keeler et al, Plant Physiol 1993 102: 1009-18). La inhibición de la planta nativa ALS por diversas clases de herbicidas estructuralmente no relacionados, que incluyen sulfonilureas, imidazolinonas, y triazolopirimidinas, es letal (Chong CK Choi JD Biochem Biophys Res Commun 2000 279:462-7). De esta manera, la supresión del ALS que codifica genes en la soya también debe ser letal. Así, un objetivo herbicida bien validado como el ALS, se puede insertar dentro de los vectores EL para probar si el proceso de separación 'por exclusión de transformación se puede usar para identificar genes esenciales de plantas . Si se hace así, se puede seleccionar otros genes de plantas esenciales en un método de alta producción, para identificar objetivos novedosos potenciales de herbicidas. El término "genes de plantas esenciales" como se usa en la presente, se refiere a genes que codifican un producto, que se requiere para el crecimiento normal de plantas, desarrollo y/o viabilidad. Además del ALS, los ejemplos de los genes de plantas esenciales incluirían pero no se limitan a, enzimas que limitan la velocidad en la biosíntesis de aminoácidos, ácidos nucleicos o lípidos. También se cree que muchos genes con una función desconocida pueden ser esenciales . Si se expresa un estructura de soya EL-ALS-EL durante la selección con higromicina, se deben recuperar muy pocos eventos, aunque esté presente el gen HPT. Si no se expresa la unidad transcripcional EL-ALS-EL, hasta embriogénesis tardía, entonces la recuperación de los eventos de transformación, debe ser similar en el número de eventos obtenidos con los controles del vector, que contienen solamente el gen HPT. La expresión constitutiva de EL-ALS-EL se puede lograr al usar un promotor 35S (pKS161) . La expresión de EL-ALS-EL se restringe a una embriogénesis tardía/germinación que se puede lograr con el promotor LEA previamente descrito (pKS163) .

Para hacer KS161, el ligador EL (SEQ ID NO: 12) se clonó en el sitio Notl de pKS50 para producir pKS137 (una región complementaria sencilla EL con un promotor 35S CaMV de 1 kb y un extremo en 3' de nos de 700 pares base en un plásmido con 2 genes HPT, uno con un promotor T7 y el segundo con un promotor 35S. Un fragmento de 208 pb Hind III/EcoR I de un gen de soya ALS (SEQ ID NO: 35; el fragmento está desde la posición 891-1114) se clonó después dentro de los sitios Hind IIl/EcoR I de pKS137 para producir pKS161. Para hacer pKS163, el ligador EL (SEQ ID NO: 12) se clonó dentro del sitio Notl de pKS127 para producir KS139 (una región complementaria sencilla de EL con el promotor LEA y la terminación 3' de faseolin del ejemplo 10 en un plásmido con dos genes HPT, uno con un promotor T7 y el segundo con un promotor 35S) . El fragmento de 208 pares base Hind IIl/EcoR I del gen de soya de ALS (SEQ ID NO: 35, el fragmento HindIIl/EcoRI está desde la posición 896-1103) se clonó después dentro de los sitios Hind III/EcoR I de KS139 para producir KS163. El KS161 y KS163 se transformaron en el tejido 821 (ejemplo 1) . La eficiencia de transformación para este tejido está normalmente en el rango de 200-500 clones/gramo del tejido. Los resultados de los dos experimentos de transformación separados con KS161 y KS163, cuatro semanas después del bombardeo y transferencia al medio que contiene higromicina son: Expt . 1 KS161 (35S ALS EL) 16 clones/gramo de tejido KS163 (LEA ALS EL) 247 clones/gramo de tejido Expt . 2 KS161 (35S ALS EL) 43 clones/gramo de tejido KS163 (LEA ALS EL) 467 clones/gramo de tejido En ambos experimentos, el vector 35S EL-ALS resultó en una disminución de >90% en los números de clones, presumiblemente debido a la supresión del gen endógeno ALS a través de las etapas de formación de los embriones. Por lo tanto, la diferencia en los números de clones obtenidos para un fragmento novedoso de genes insertado en el estructura 35S-EL (KS137) y el estructura LEA-EL (KS139) , se pueden usar como una medida de si es esencial o no el gen endógeno correspondiente, y así ver si hay un objetivo o no herbicida potencial . El efecto de un fragmento desconocido de genes en la eficiencia de transformación, se puede medir dentro de unas cuantas semanas del bombardeo de partícula y así este es un medio rápido de identificación de nuevos candidatos objetivo para herbicidas. Una selección típica consiste de un bombardeo de tejidos con KS137 y KS139 como controles de vectores vacíos, KS161 como un control positivo (ALS) y diversos fragmentos de genes, amplificados por PCR para contener los sitios Hind III y EcoR I, clonados dentro de los sitios HinlIl/EcoRI de KS137 y KS139. La frecuencia mejorada de la supresión alcanzada con los estructuras EL, permite la posibilidad de un método de separación por exclusión confiable. Un porcentaje importante de los eventos de transformación recuperados con higromicina, se debe suprimir por la secuencia objetivo contenida dentro de pKS137 o pKS139, con objeto de que haya una diferencia estadísticamente definitiva entre los dos experimentos. El término "alto grado de frecuencias" como se usa en la presente con respecto a la eficiencia de supresión, se refiere al porcentaje de líneas transformadas que muestran el fenotipo suprimido del objetivo. Se espera que los porcentajes de alta frecuencia estén en un rango de al menos de 15-95%, y cualquier porcentaje de enteros se encuentre dentro del rango. Las modalidades preferidas incluirían al menos 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% y 95%. EJEMPLO 12 Supresión de la sintasa de Celulosa en maíz usando los Estructuras EL. Los genes de celulosa sintasa, codifican una familia de proteínas involucradas en la formación de celulosa en plantas (Pear, et al, Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 93, 12637-12642; Saxena, et al, (1990), Plant Molecular Biology 15, 673-684).

Diversos genes del maíz que codifican sintasa de celulosas (cesA) se han clonado recientemente y caracterizado (publicación PCT número WO 00/09706, publicada el 24 de Febrero de 2000) . Los fragmentos de cuatro de estos genes, cesAl, cesA4, cesA5, y cesA8 , se usaron para probar si el 1XEL puede dirigir la supresión de estos genes en el maíz. Se clonaron fragmentos de un kb a partir de la terminación 5' de los clones ADNc (incluyendo 5 'UTR y las secuencias ORF) para cesAl, cesA4, cesA5 y cesA8, separadamente dentro del sitio interno ?otl de los estructuras 1XEL (SEQ ID ?O : 12) . Cada uno de estos casetes "EL-cesA-EL" , se insertó dentro de un plásmido que contiene un promotor f3.7 (un promotor constitutivo débil que muestra alguna preferencia por la expresión específica del pedúnculo), un inhibidor de proteinasa en la terminal 3' (pinll de la papa An et al (1989) Plant Cell 1: 115-122), y un marcador de selección 35S :BAR:pinII . Un plásmido de control que contiene un promotor I?2 que impulsa un gen GUS con una terminación pinll 3' también se hizo. Los resultados de los experimentos de transformación del maíz con cada uno de estos estructuras se muestran en la tabla 9. Se aislaron veinticinco líneas de cada uno de los cuatro estructuras de genes cesA y se aislaron 18 líneas para el control. La altura de las plantas y el diámetro del pedúnculo estuvieron en promedio más pequeños en las líneas que contenían los estructuras de supresión que en las de control . Las alturas de las mazorcas fueron más cortas en las líneas que contenían cesAl y cesA5. El porcentaje promedio de celulosa de la materia seca total es normalmente de 46% en las plantas de control . Todos los estructuras cesA tuvieron líneas que están debajo del 46% de celulosa con cesAl>cesA5>cesA8>cesA4. Las líneas que muestran bajos porcentajes de celulosa se probaron por análisis de manchado Southern de ADN para determinar cuales contienen una inserción de transgen de copia sencilla. Todas tuvieron al menos una línea que tenia un transgen de baja celulosa y sencillo. TABLA 9 Resumen de la Supresión CesA por los Estrucutas EL.

Estos resultados muestran que los niveles de celulosa se alteran en plantas que contienen fragmentos del gen cesA contenido dentro de los estructuras 1XEL. Esto se interpreta como un significado de que la supresión cesA en el maíz tiene un fenotipo detectable, y de que la supresión controlada EL está activa en el maíz. Se debe observar que el promotor f3.7 es un promotor débil comparado con otros usados en esta solicitud (35S-CaMV, Kti, etc.) y que el cesA es una familia grande de multigenes. Estos factores pueden tener un efecto en la frecuencia y/o grado de la supresión. EJEMPLO 13 Supresión Transitoria de GFP en Maíz usando la Región Complementaria de GUS. Todos los casetes de expresión usados en este ejemplo, comprenden un promotor de la ubicuitina de maíz (nt 1-899) , una secuencia líder no traducida 5' de la ubicuitina de maíz (nt 900-982) y un intrón 1 de la ubicuitina de maíz (nt 983- 1992) . En el plásmido PHP7921, la secuencia de codificación (nt 2015-2731) es GFP ( proteína verde fluorescente) con codones optimizados para la expresión en el maíz. En el plásmido PHP3953, la secuencia de codificación (nt 2013-3821) es GUS. Ambos casetes incluyen la secuencia de la señal de poliadenilación del gen inhibidor II de la proteinasa de S. tuberosum (PINII TERM, nt 2737-3047 en PHP7921 y nt 3883-4192 en PHP3953) . Las metodologías de ADN recombinante estándar bien conocidas por aquellos expertos en la técnica, se usaron a través de la construcción de los casetes de expresión para este trabajo. Las orientaciones de las inserciones de fragmentos y las estructuras finales de los estructuras de plásmidos, se determinaron usando un análisis estándar de gel de agarosa y/o la formación de secuencias de plásmidos. El plásmido PHP7921 se usó para crear una región de complementariedad (CR) de una porción pequeña de la secuencia codificadora GFP como sigue: el ADN de plásmido se digirió con Xhol y se trató con un fragmento Klenow de la polimerasa I de ADN para liberar un fragmento terminado en puntas romas de 244 pares base, que representa un 2436-2675 cerca de la terminación 3' de la secuencia codificadora GFP. Este fragmento sé inserta después de vuelta en el PHP7921 en el sitio Hpal (nt 2735) justo en la dirección descendente del codón de detención de GFP. Se identifica un plásmido recombinante que tenia en fragmento insertado en la orientación inversa con relación a la secuencia original . Este plásmido se designó como PHP16391. Los casetes de expresión para GUS que contienen un GFP-CR heterólogo se construyeron como siguen: el GFP-CR completo de PHP16391 se aisló como un fragmento BsrGI (nt 2464-2947, 483 pb) . Este fragmento contiene secuencias capaces de formar un CR con una célula madre de 214 pares base y un circuito de 55 nt . El fragmento resulta con puntas romas como anteriormente usando el Klenow y se inserta dentro del cásete de expresión GUS de PHP3953 en tres sitios diferentes. El plásmido PHP16561 tiene el GFP-CR insertado en el sitio de BamHl (lleno) de PHP3953 (nt 2006), justo 5' con el codón de partida. El plásmido PHP16562 tiene el GFP-CR insertado en el sitio Pací (tratado con polimerasa T4 para hacerlo de puntas romas en nt 3919 de PHP3953 justo 3' con el codón de detención. Similarmente, el plásmido PHP16563 tiene el GFP-CR insertado en el sitio SnaBI a 2398 de PHP3953 dentro de la secuencia de codificación GUS. Los callos de alto tipo II se mantuvieron por subcultivo en un medio 560P fresco (sales N6, vitaminas Erikkson, 0,69 g/1 prolina, 2 mg/l 2,4-D y 3% de sacarosa) cada dos semanas. Los callos saludables se extruyeron a través de una malla de nailon de 0.77 mm2, se pesó y se volvió a suspender en un medio de cultivo MS con 2 mg7l 2,4-D a una densidad de 3 gramos de tejido/40 ml de medio. Las células se suspendieron uniformemente por pipeteado de la solución arriba y abajo a través de una pipeta de orificio grande, y se conectaron después aliquotas de 4 ml (300 mg) en papeles filtro de vidrio usando un aparato a vacío. Estos filtros, que contenía cada uno aproximadamente 300 mg de células, se colocaron después en un medio 560P y se cultivaron en la obscuridad a 26°C. Después de 2-4 días se separaron los filtros del medio de cultivo y se separó el líquido en exceso usando un aparato al vacío. El ADN se suministró después en las células usando una pistola de partículas DuPont Biolistics y un protocolo de transformación de bombardeo estándar de Hi-II (Songstad D. D. et al, in Vitro Cell Dev. Biol. Plant 32:179-183, 1996) modificada con el uso de partículas de oro 1 um. Inmediatamente después del bombardeo, se regresaron los filtros al medio de cultivo 560P y se cultivaron en la obscuridad a 26°C. Todos los ADN se combinaron en relaciones iguales para obtener una concentración final de 1 ug de la preparación total de ADN/partículas ( 0.33 ug de cada ADN combinado en cada tubo de preparación se usó por 6 disparos) . El experimento se disparó como sigue: A partir de cada tratamiento se bombardearon 10 placas (5 de cada dos preparaciones de ADN) .

Tratamiento ADN #1 Control PHP3953 (GUS) PHP10256 (rLuciferasa) + PHP7921 (GFP) #2 GUS c/5'CRC PHP3953 (GUS) + PHP10256 (rLuciferasa) + PHP16561 (CR-GUS) #3 GUS c/3' CRC PHP3953(GUS) + PHP10256 (rLuciferasa) + PHP16562 (GUS-CR) #4 GUS c/CRC en cds PHP3953 (GUS) PHP10256 (rLuciferasa) + PHP16563 (GU-CR-S) Para el análisis, las placas dentro de un tratamiento se agruparon en 5 pares (cada par contiene placas disparadas con diferentes preparaciones de ADN para el mismo tratamiento del plásmido) . Dos días después del bombardeo, se combinaron todos los tejidos de las placas en dos pares y se volvieron a suspender en 5 ml de medio de cultivo. Después de mezclar con una pipeta de orificio amplio, una alícuota de 1 ml se transfirió en un tubo Eppendorf de 1.5 ml . Se centrifugaron las células a 1000 RPM por 2 minutos en una microcentrífuga y se decantó el sobrenadante (medio de cultivo) . Se agregó a cada tubo, 150 ul de "Solución Amortiguadora de Lisis Pasiva de Luciferasa Promega" , se equilibró la temperatura sobre hielo, y se separaron las células usando un triturador de plástico de tubo Kontes energizado de perforador manual (extracción y ensayos de luciferasa posteriores seguidos por un protocolo de Ensayo Reportero de Luciferasa Dual Promega (Boletín Técnico#TM040) . Los desechos celulares se peletizaron por centrifugación en una microcentrífuga a 3000 RPM por 3 minutos se pipeteó completamente el sobrenadante.

Se usaron las alícuotas de este extracto para la cuantificación fluorométrica del GUS y la luciferasa ( 50 y 20 ul respectivamente) . Se determinó la actividad de la enzima GUS como una medición de la velocidad entre 10 y 40 minutos después de agregar los substratos, y se expresaron los datos como pmol MU7min/ml/extracto (pendiente) . Los ensayos fluorométricos GUS se llevaron a cabo en un equipo LabSystems FLUOROSKAN Ascent FL, según el protocolo de Rao y Flynn (Biotechniques 1990 8:38-40). El análisis fluorométrico de la actividad de la luciferasa fue recolectado usando un Monolight 2010 de Laboratorio de Luminiscencia Analítica, siguiendo las instrucciones del fabricante y el protocolo Promega. Al evaluar los marcadores para cada replicado se suministra un control interno (luciferasa) contra el cual se puede calificar la actividad relativa GUS. Así, se graficaron los datos como la relación de las unidades GUS/Luciferasa (debido a que las unidades fluorométricas absolutas para la luciferasa Renilla fueron muy elevadas, todos los valores crudos para la actividad de la luciferasa se dividieron por 10 antes de usar la actividad GUS para normalizar) . TABLA 10 Regiones Complementarias de la Actividad GUS Objetivo con Reducción GFP en una Orientación 3' (#3) e Interna (#4) .

Experimento de Repetición Parece a partir de los resultados (ver Tabla 10) de estos experimentos de expresión transitorios, que la colocación de la región complementaria 5' al objetivo, no reduce la expresión del gen objetivo. Sin embargo, se cree que bajo condiciones optimizadas, o en un experimento de transformación estable, la colocación de una región complementaria 5' a un objetivo, es suficiente para reducir la expresión del objetivo. EJEMPLO 14 Supresión del PDS de Maíz por una Región Complementaria de la Soya Modificada Se creó un estructura de supresión adicional, usando un fragmento de 205 pares base de HindIII-BstEII, a partir del promotor Kti de la soya, como la región complementaria que rodea un sitio de clonación múltiple. Se ligaron dos copias del fragmento Kti en una configuración de repetición invertida, y modificada posteriormente por PCR para eliminar los sitios de restricción inconsistentes, y agregar sitios de clonación en ambos extremos y en la región entre las dos secuencias complementarias para formar el cásete SHH3 (ver la SEQ ID NO: 34) . El plásmido resultante (PHP17962) se usó como una fuente de la secuencia de SHH3. La secuencia Kti no se encuentra normalmente en el genoma del maíz, por lo tanto no se espera una supresión de los genes endógenos del maíz a partir solamente de la región SHH3. Sin embargo, cuando se inserta una porción de una secuencia endógena objetivo dentro de los sitios de clonación entre las secuencias complementarias Kti, se debe afectar el transcripto del gen endógeno homólogo . Para probar la utilidad del SHH3 al silenciar un gen endógeno, se trató un fragmento Nhel de 1385 pares base que representa alrededor del 80% de la secuencia codificadora del gen de la fitoen desaturasa (PDS-1) de la Z. mays (Pioneer EST cnlcz91R, No. Acceso al Banco de Genes No. L39266) , con la enzima Klenow como se describió previamente para resultar los extremos en puntas romas y ligarse después en el sitio EcoRV de SHH3 para generar PHP17894. El fragmento SHH3-PDS se movió después como un fragmento Hpal de 1865 pares base en un estructura de un vector intermedio para colocarlo bajo el control del promotor de ubicuitina: intrón 1 de ubicuitina (patentes E.U.A. 5,510,474 y 5,614,399) con señales de poliadenilación proporcionadas por el terminador pinll (an et al (1989) Plant Cell 1:115-122) . La unidad de transcripción de la planta resultante, se movió en un vector binario (PHP15578) , que contiene un elemento marcador seleccionable CaMV35S-bialafos, para generar el PHP17914. Este estructura se trató por electroforesis en células competentes de la cepa Agrobacterium tumefaciens LBA4404, llevadno el plásmido superbinario pSBl (Ishida et al (1996) Nature Biotech 14:745-750) . Este proceso genera un plásmido cointegrado que comprende las secuencias combinadas de PHP17914 y pSBl . Este plásmido cointegrado, designado como PHP17939, se usó para transformar los embriones inmaduros de la Z. mays como sigue. Transformación del Maíz mediada por Agrobacterium. Los embriones inmaduros recientemente aislados de maíz, alrededor de 10 días después de la polinización (DAP) se incubaron con el Agrobacterium. El genotipo preferido para la transformación es el genotipo Hi-II altamente transformable (Armstrong (1991) Maize Gen Coop Newsletter 65:92-93). Se puede también usar un híbrido Fl creado por la cruza con un Hi-II con un endogámico de élite. Después del tratamiento del Agrobacterium con los embriones inmaduros, se cultivaron los embriones en un medio que contiene niveles tóxicos del herbicida. Solamente aquellas células que reciben el gen de resistencia al herbicida, y los genes ligados, crecieron en el medio selectivo. Los eventos transgénicos así seleccionados se propagaron y regeneraron las plantas completas, produjeron semilla y transmiten los transgenes a la progenie . Preparación de Agrobacterium El LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens preparado por ingeniería, se construyó por la patente de E.U.A. 5,591,616, para contener el gen PDS suprimido por la región complementaria mostrada en la SEQ ID NO: 34 y un gen marcador seleccionable. Típicamente se puede usar como un marcador seleccionable el BAR (D'Halluin et al (1992) Methods Enzymol 216:415-426) o PAT (Wohlleben et al (1988) Gene 70:25-37). Para usar el estructura preparado por ingeniería en la transformación de plantas, se preparó primero una placa maestra de colonias bacterianas sencillas, al inocular las bacterias en un medio mínimo AB [el medio mínimo AB contiene los siguientes ingredientes: 850.000 ml de agua desionizada; 50.000 ml de solución de reserva 800A; 9 g de Phytagar que se agrega después C.S. al volumen; 50.000 ml de solución de reserva 800B#; 5.000 g de glucosa#; y 2.000 ml de espectinomicina 50/mg/ml de reserva #. Las direcciones son: disolver los ingredientes en agua desionizada purificada en secuencia; C.S. al volumen con agua desionizada purificada de menos de 100 ml por litro; esterilizar y enfriar a 60°C. Los ingredientes designados con #, se agregan después de esterilizar y enfriar a temperatura. La solución de reserva 800A contiene los siguientes ingredientes: 950.000 ml de agua desionizada, 60.000 g de fosfato dibásico de potasio K2HP04; y 20.000 g de fosfato monobásico de sodio, hidratado. Las •indicaciones son: disolver los ingredientes en agua desionizada purificada en secuencia; ajustar el pH hasta 7.0 con hidróxido de potasio; C.S. a volumen con agua purificada desionizada después de ajustar el pH; y esterilizar y enfriar a 60 °C. La solución de reserva 800B contiene los siguientes ingredientes: 950.000 ml de agua desionizada; 20.000 g de cloruro de amonio; 6.000 g de sulfato de magnesio 7-H20, MgS04, 7H20; 3.000 g de cloruro de potasio; 0.200 g de cloruro de calcio (anhidrato) y 0.050 g de 7-hidrato de sulfato ferroso. Las indicaciones son: disolver los ingredientes en agua desionizada purificada en secuencia; C.S. hasta un volumen con agua desionizada purificada, y esterilizar y enfriar a 60 °C] y después incubar la placa de bacterias invertida a 28 °C en la obscuridad por alrededor de 3 días. Se preparó después una placa de trabajo al seleccionar una colonia sencilla de la placa de un medio mínimo A (el medio mínimo A contiene los siguientes ingredientes: 950.000 ml de agua desionizada, 10.500 g de fosfato de potasio dibásico K2HP04; 4.500 g de fosfato monobásico de potasio KH2P04; 1.000 g de sulfato de amonio; 0.500 g de dihidrato de citratp de sodio; 10.000 ml de solución de sacarosa al 20% #; y 1.000 ml de sulfato de magnesio ÍM #. Las indicaciones son: disolver los ingredientes en agua desionizada purificada en secuencia; C.S. a volumen con agua desionizada; esterilizar y enfriar a 60°C. Los ingredientes designados con un # se agregan después de esterilizar y enfriar a temperatura] y marcando vetas a través de una placa con medio YP [medio mínimo YP contiene los siguientes ingredientes: 950.000 ml de agua desionizada; 5.000 g de extracto de levadura (Difco); 10.000 g de peptona (Difco); 5.000 g de cloruro de sodio; 15.000 g de bacto-agar, que se agregan después C.S. hasta volumen; y 1.000 ml de espectinomicina de un lote de 50 mg/ml #. Las indicaciones son: disolver los ingredientes en agua desionizada purificada en secuencia; ajustar el pH hasta 6.8 con hidróxido de potasio; C.S. a volumen con agua purificada desionizada después de ajustar el pH; y esterilizar y enfriar a 60°C. Los ingredientes designados con un # se agregan después de esterilizar y enfriar a temperatura. La placa bacteriana del medio YP se incuba después invertida a 28 °C en la obscuridad por 1-2 días. El Agrobacterium para la transfección y co-cultivo de plantas se preparó 1 día antes de la transformación. Se colocaron dentro de 30 ml de un medio mínimo A en un matraz, 50 µg/ml de espectinomicina, lOOµM de acetosiringona y alrededor de 1/8 completo en el circuito de Agrobacterium de una placa de trabajo de 1 ó 2 días de edad. El Agrobacterium se hizo crecer después a 28°C a 200 rpm en la obscuridad durante la noche (alrededor de 14 horas) . En la fase mid-log, se cosechó el Agrobacterium y se volvió a suspender a 3 hasta 5 X 108 CFU/ml en un medio 561Q + 100 µM de acetosiringona usando técnicas microbianas estándar y curvas estándar. Preparación de Embriones Inmaduros De nueve a diez días después de la polinización controlada de una planta de maíz, • el desarrollo de los embriones inmaduros es opaco, y son de 1-15. mm de longitud y son del tamaño apropiado para la Agro-infección. Se esterilizaron las mazorcas con cascara en un blanqueador comercial al 50% y una gota de Tween por 30 minutos, y se enjuagaron después dos veces con agua estéril. Los embriones inmaduros se separaron asépticamente de la cariopsis y se colocaron en 2 ml de una solución de retención estéril que comprende un medio de 561Q + 100 µM de acetosiringona [el medio 561 Q contiene los siguientes ingredientes: 950.000 ml de agua D-I, filtrada; 4.000 g de Sales Básales Chu (N6) (Sigma C-1416); 1.000 ml de mezcla de vitaminas Eriksson (1000xSigma-1511) ; 1.250 ml de clorohidrato de tiamina 4 mg/ml; 3.000 ml de 2,4-D de 0.5 mg/ml (No. 2A) ; 0.690 g de L-prolina; 68.500 g de sacarosa; y 36.000 g de glucosa. Las indicaciones son: disolver los ingredientes en agua desionizada purificada en secuencia; ajustar el pH hasta 5.2 con hidróxido de potasio; C.S. a volumen con agua purificada desionizada después de ajustar el pH; y esterilizar con filtro ( sin autoclave) ] . Infección de Agrobacterium y Co-cultivo de embriones Se decantó la solución de retención de embriones inmaduros extirpados, y se reemplazaron con Agrobacterium preparado. Después de una mezcla e incubación suave por alrededor de 5 minutos, se decantó el Agrobacterium a partir de los embriones inmaduros . Los embriones inmaduros se movieron después a una placa de un medio 562P [el medio 562 P contiene los siguientes ingredientes: 950.000 ml de agua D-I, filtrada; 4.000 g de Sales Básales Chu (N6) (Sigma C-1416); 1.000 ml de mezcla de vitaminas Eriksson ' (1000xSigma-1511) ; 1.250 ml de clorohidrato de tiamina 4 mg/ml; 4.000 ml de 2,4-D de 0.5 mg/ml (?o. 2A) ; 0.690 g de L-prolina; 30.000 g de sacarosa; y 3.000 g de Gelrite, que se agregan después C.S. a un volumen; 0.425 ml de nitrato de plata 2 mg/ml#; y 1.000 ml de aceto siringona 100 mM# .. Las indicaciones son: disolver los ingredientes en agua desionizada purificada en secuencia; ajustar el pH hasta 5.8 con hidróxido de potasio; C.S. a volumen con agua purificada desionizada después de ajustar el pH; y esterilizar y enfriar a 60°C. Los ingredientes designados con un # se agregan después de la esterilización y enfriamiento a temperatura] , con la superficie del órgano escutiforme hacia arriba, e incubados a 20°C por 3 días en la obscuridad, seguido por la incubación a 28 °C por 3 días en la obscuridad con medio 562P + 100 mg/ml de carbenecilina (ver patente de E.U.A. 5,981,840). Selección de los Eventos Transgénicos Después de la incubación, se transfirieron los embriones inmaduros a un medio 563 O. [el medio 563 0 contiene los siguientes ingredientes: 950.000 ml de agua D-I, filtrada; 4.000 g de Sales Básales Chu (N6) (Sigma C-1416); 1.000 ml de mezcla de vitaminas Eriksson (1000xSigma-1511) ; 1.250 ml de clorohidrato de tiamina 4 mg/ml; 30.000 g de sacarosa; 3.000 ml de 2,4-D de 0.5 mg/ml (No. 2A) ; 0.690 g de L-prolina; 0.500 g de solución amortiguadora Mes; 8.000 g de agar (Sigma A-7049, purificado), que se agregan después C.S. a un volumen; 0.425 ml de nitrato de plata 2 mg/ml#; 3.000 ml de bialafos 1 mg/ml#, y 2.000 ml de Agribio Carbenicilina 50 mg/ml#.. Las indicaciones son: disolver los ingredientes en agua desionizada purificada en secuencia; ajustar el pH hasta 5.8 con hidróxido de potasio; C.S. a volumen con agua purificada desionizada después de ajustar el pH; y esterilizar y enfriar a 60 °C. Los ingredientes designados con un # se agregan después de la esterilización y enfriamiento a temperatura] para la selección de eventos. El ADN transformante posee un gen de resistencia al herbicida, en este ejemplo el gen BAR, que le otorga resistencia al bialafos. A intervalos de 10-14 días, se transfirieron los embriones a un medio 563 O. Fue visible el tejido embriogénico transgénico supuesto de crecimiento activo en 6- 8 semanas . EJEMPLO 15 Supresión del PDS del Maíz por una Regeneración de la Región Complementaria de Soya Modificada a las Plantas T0 Se transfirieron los tejidos embriogénicos transgénicos a un medio 288 W [el medio 288 W contiene los siguientes ingredientes: 950.000 ml de agua D-I, filtrada; 4.300 g de Sales MS; 0.100 g de mio-inositol; 5.000 ml de una solución de reserva de vitaminas MS (No. 36J) ; 1.000 ml de Zeatin.5 mg/ml; 60.000 g de sacarosa; 8.000 g de Agar (Sigma A-7049, purificada), que se agregan después C . S . a un volumen; 2.000 ml de IAA 0.5 mg/ml#; 1.000 ml de ABA 0.1 Mm #; 3.000 ml de Bialafos 1 mg/ml #; y 2.000 ml de Agribio Carbenicilina. Las indicaciones son: disolver los ingredientes en agua desionizada purificada en secuencia; ajustar el pH hasta 5.6; C.S. a volumen con agua purificada desionizada después de ajustar el pH; y esterilizar y enfriar a 60°C. Agregar 3.5 g/L de Gelrite - para biología de células . Los ingredientes designados con un # se agregan después de la esterilización y enfriamiento a temperatura] y se incuban a 28°C en la obscuridad hasta que maduran los embriones somáticos, o alrededor de 10 a 18 días. Los embriones somáticos madurados individuales con un órgano escutiforme bien definido y coleóptilo, se transfieren a un medio de germinación de 272 embriones [el medio 272 contiene los siguientes ingredientes: 950.000 ml de agua D-I, filtrada; 4.300 g de Sales MS; 0.100 g de mio-inositol; 5.000 ml de un solución de reserva de vitaminas MS; 40.000 g de sacarosa; y 1.500 g de Gelrite, que se agregan después C.S. a un volumen. Las indicaciones son: disolver los ingredientes en agua desionizada purificada en secuencia; ajustar el pH hasta 5.6; C.S. a volumen con agua purificada desionizada después de ajustar el pH; y esterilizar y enfriar a 60°C] e incubar a 28°C en la luz. Después de que aparecen las raíces y los retoños, se colocan las plantas individuales en tierra y se endurecen completamente usando métodos típicos de horticultura. Se evalúan entonces las plantas para el fenotipo silenciado con PDS. La fitoen desaturasa cataliza una etapa limitante de la velocidad en la biosíntesis de carotenoides en plantas. (Misawa et al The Plant Journal (1993) 4 (5) : 833-840) . Es un objetivo conocido de herbicidas de blanqueo tal como el norflurazon. La co-supresión de la fitoen desaturasa por la PDS1 flanqueada por SHH3 introducida, da un fenotipo similar blanqueado cuando las plantas jóvenes se incuban en la luz (Thomas, et al (2001) The Plant Journal 25 (4) : 417-425 ; Kumagi et al (1995) PNAS USA 92:1679-1683; Ruiz et al (1998) Plant Cell 10:937-946) . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Un estructura recombinante caracterizado porque comprende un promotor ligado operativamente a una secuencia de ADN la cual cuando se expresa por un hospedador produce un ARN que tiene: (a) homología con al menos un ARNm objetivo expresado por el hospedador. (b) dos regiones complementarias de ARN que no se relacionan con ningún ARN endógeno en el hospedador, y que están en proximidad con (a) , en donde el ARN expresado reduce la expresión del ARNm objetivo o cualquier AR?m endógeno substancialmente similar.
2. Un estructura recombinante caracterizado porque comprende un promotor ligado operativamente a una secuencia de AD? que, cuando se expresa por un hospedador, produce un ARN que tiene: (a) homología con al menos un ARNm objetivo expresado por el hospedador. (b) una región de AR? no relacionada con ningún AR? endógeno en el hospedador y localizada 5' con (a) y (c) el complemento inverso del AR? en (b) localizado 3' con (a) , en donde el ARN expresado reduce la expresión del mARN objetivo o cualquier ARNm substancialmente similar endógeno.
3. Un estructura recombinante caracterizado porque comprende un promotor ligado operativamente a una secuencia de ADN la cual, cuando se expresa por un hospedador, produce un ARN que tiene : (a) homología con al menos un ARNm objetivo expresado por el hospedador . (b) dos regiones complementarias de ARN que no están relacionadas con ningún ARN endógeno en el hospedador, y que se localizan 5' con (a) , en donde el AR? expresado reduce la expresión del AR?m objetivo o cualquier AR?m endógeno substancialmente similar.
4. Un estructura recombinante caracterizado porque comprende un promotor ligado operativamente a una secuencia de AD? la cual, cuando se expresa por un hospedador, produce un AR? que tiene: (a) homología con al menos un ARNm objetivo expresado por el hospedador. (b) dos regiones complementarias de ARN que no están relacionadas con ningún ARN endógeno en el hospedador, y que se localizan 3' con (a), en donde el ARN expresado reduce la expresión del AR?m objetivo o cualquier AR?m endógeno substancialmente similar.
5. Un estructura recombinante caracterizado porque comprende un promotor ligado operativamente a una secuencia de ADN la cual, cuando se expresa por un hospedador, produce un AR? que tiene : (a) homología con al menos un AR?m objetivo expresado por el hospedador, y (b) dos regiones complementarias de ARN que no están relacionadas con ningún ARN endógeno en el hospedador, y que se localizan dentro de (a) , en donde el ARN expresado reduce la expresión del AR?m objetivo o cualquier ARNm endógeno substancialmente similar.
6. El estructura recombinante de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque, la región o regiones de AR? que no están relacionadas con ningún AR? endógeno en el hospedador, comprenden una secuencia de ARN que no se presenta naturalmente, sintética.
7. El estructura recombinante de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque, la región o regiones de ARN que no están relacionadas con ningún ARN endógeno en el hospedador, no comprenden un ARN viral de planta.
8. Un método para reducir la expresión de un AR?m objetivo o cualquier AR?m endógeno substancialmente similar caracterizado porque comprende: a) transformar un hospedador con alguno de los estructuras recombinantes de las reivindicaciones 1-5; y b) seleccionar hospedadores que tienen una expresión reducida del ARNm objetivo o algún ARNm endógeno substancialmente similar.
9. Un método para reducir la expresión de un ARNm objetivo o cualquier ARNm endógeno substancialmente similar caracterizado porque comprende: a) transformar un hospedador con el estructura recombinante de la reivindicación 6; y b) seleccionar hospedadores que tienen una expresión reducida del AR?m objetivo o algún AR?m endógeno substancialmente similar.
10. Un método para reducir la expresión de un ARNm objetivo o cualquier AR?m endógeno substancialmente similar caracterizado porque comprende: a) transformar un hospedador con el estructura recombinante de la reivindicación 7; y b) seleccionar hospedadores que tienen una expresión reducida del AR?m objetivo o algún AR?m endógeno substancialmente similar.
11. Un AR? caracterizado porque comprende: (a) homología con al menos un ARNm objetivo expresado por el hospedador. (b) dos regiones complementarias de AR? que no se relacionan con ningún ARN endógeno en el hospedador, y que están en proximidad con (a) , en donde el ARN cuando se introduce dentro del hospedador, reduce la expresión del ARNm objetivo o de cualquier ARNm endógeno substancialmente similar.
12. Un AR? caracterizado porque comprende: (a) homología con al menos un AR?m objetivo expresado por el hospedador. (b) una región de ARN no relacionada con ningún AR? endógeno en el hospedador que se localiza 5' con (a) , y (c) el complemento inverso del AR? en (b) localizado 3' con (a) . en donde el AR? cuando se introduce en el hospedador, reduce la expresión del ARNm objetivo o cualquier AR?m endógeno substancialmente similar.
13. Un AR? caracterizado porque comprende: (a) homología con al menos un AR?m objetivo expresado por el hospedador, y (b) dos regiones complementarias de ARN no relacionadas con ningún AR? endógeno en el hospedador que se localiza 5' con (a) , en donde el ARN cuando se introduce en el hospedador, reduce la expresión del AR?m objetivo o cualquier AR?m endógeno substancialmente similar.
14. Un AR? caracterizado porque comprende: (a) homología con al menos un AR?m objetivo expresado or el hospedador, y (b) dos regiones complementarias de ARN no relacionadas con ningún ARN endógeno en el hospedador que se localiza 3' con (a) , en donde el ARN cuando se introduce en el hospedador, reduce la expresión del ARNm objetivo o cualquier ARNm endógeno substancialmente similar.
15. Un ARN caracterizado porque comprende: (a) homología con al menos un ARNm objetivo expresado por el hospedador, y (b) dos regiones complementarias de ARN no relacionadas con ningún AR? endógeno en el hospedador que se localiza dentro de (a) , en donde el AR? cuando se introduce en el hospedador, reduce la expresión del AR?m objetivo o cualquier AR?m endógeno substancialmente similar.
16. El ARN de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 11-15, caracterizado porque, la región o regiones de AR? que no están relacionadas con ningún ARN endógeno en el hospedador, comprenden una secuencia de AR? que no se presenta naturalmente, sintética.
17. El ARN de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 11-15, caracterizado porque, la región o regiones de ARN que no se relacionan con ninguno de los ARN endógenos en el hospedador, no comprenden un AR? viral de planta.
18. Un método para reducir la expresión de un ARNm objetivo, o cualquier ARNm endógeno substancialmente similar caracterizado porque comprende: (a) introducir en un hospedador cualquiera de los ARN de las reivindicaciones 11-15; y (b) seleccionar hospedadores que tengan una expresión reducida del ARNm objetivo o cualquier AR?m endógeno substancialmente similar.
19. Un método para reducir la expresión de un ARNm objetivo, o cualquier ARNm endógeno substancialmente similar caracterizado porque comprende: (a) introducir en un hospedador el estructura recombinante de la reivindicación 16; y (b) seleccionar hospedadores que tengan una expresión reducida del ARNm objetivo o cualquier ARNm endógeno substancialmente similar.
20. Un método para reducir la expresión de un ARNm objetivo, o cualquier ARNm endógeno substancialmente similar caracterizado porque comprende: (a) introducir en un hospedador el estructura recombinante de la reivindicación 17; y (b) seleccionar hospedadores que tengan una expresión reducida del ARNm objetivo o cualquier AR?m endógeno substancialmente similar.
21. Un estructura recombinante caracterizado porque comprende un promotor ligado operativamente a una secuencia de ADN que, cuando se expresa por un hospedador produce un ARN que tiene : (a) homología con al menos un ARNm objetivo expresado por el hospedador. (b) dos regiones complementarias de ARN, que se codifican por cualquier secuencia de ácido nucleico en el genoma del hospedador, con tal de que la secuencia no codifique el ARNm objetivo o alguna secuencia que sea substancialmente similar al ARNm objetivo y las regiones estén en proximidad con (a) . en donde el ARN expresado reduce la expresión del ARNm objetivo o cualquier ARNm endógeno substancialmente similar.
22. Un estructura recombinante caracterizado porque comprende un promotor ligado operativamente a una secuencia de ADN la cual, cuando se expresa por un hospedador produce un ARN que tiene : (a) homología con al menos un ARNm objetivo expresado por el hospedador, y (b) una región de AR? codificada por alguna secuencia de ácido nucleico en el genoma del hospedador, con tal de que la secuencia no codifique el AR?m objetivo, o alguna secuencia que sea substancialmente similar al AR?m objetivo y se localice 5' con (a) , y (c) el complemento inverso del ácido nucleico en (b) localizado 3' con (a), en donde el ARN expresado reduce la expresión del AR?m objetivo o cualquier ARNm endógeno substancialmente similar.
23. Un estructura recombinante caracterizado porque comprende un promotor ligado operativamente a una secuencia de ADN, la cual cuando se expresa por un hospedador produce un ARN que tiene: (a) homología con al menos un AR?m objetivo expresado por el hospedador, y (b) dos regiones complementarias de AR? que se codifican por alguna secuencia de ácido nucleico en el genoma del hospedador, con tal de que la secuencia no codifique el mAR? objetivo o alguna secuencia que sea substancialmente similar al AR?m objetivo y cuyas regiones se localicen 5' con (a), en donde el AR? expresado reduce la expresión del ARNm objetivo o cualquier AR?m endógeno substancialmente similar.
24. Un estructura recombinante, caracterizado porque comprende un promotor ligado operativamente a una secuencia de AD? la cual, cuando se expresa por un hospedador produce un ARN que tiene: (a) homología con al menos un AR?m objetivo expresado por el hospedador, y (b) dos regiones complementarias de AR? que se codifican por alguna secuencia de ácido nucleico en el genoma del hospedador, con tal de que la secuencia no codifique el mARN objetivo o alguna secuencia que sea substancialmente similar al ARNm objetivo y cuyas regiones se localicen 3' en (a), en donde el ARN expresado reduce la expresión del ARNm objetivo o cualquier ARNm endógeno substancialmente similar.
25. Un estructura recombinante, caracterizado porque comprende un promotor ligado operativamente a una secuencia de ADN la cual, cuando se expresa por un hospedador produce un ARN que tiene: (a) homología con al menos un ARNm objetivo expresado por el hospedador, y (b) dos regiones complementarias de ARN que se codifican por alguna secuencia de ácido nucleico en el genoma del hospedador, con tal de que la secuencia no codifique el mARN objetivo o alguna secuencia que sea substancialmente similar al ÁRNm objetivo y cuyas regiones se localicen dentro de (a) , en donde el ARN expresado reduce la expresión del ARNm objetivo o cualquier ARNm endógeno substancialmente similar.
26. Los estructuras recombinantes de conformidad con las reivindicaciones 21-25, caracterizados porque, la secuencia de ácido nucleico en el genoma del hospedador, es una secuencia que no se expresa por el hospedador.
27. Los estructuras recombinantes de conformidad con las reivindicaciones 21-25, caracterizados porque, la secuencia de ácido nucleico en el genoma del hospedador, es una secuencia que se expresa por el hospedador.
28. Un método para reducir la expresión de un ARNm objetivo, o cualquier ARNm endógeno substancialmente similar caracterizado porque comprende : (a) transformar un hospedador con alguno de los estructuras recombinantes de las reivindicaciones 21-25; y (b) seleccionar hospedadores, que tengan una expresión reducida del ARNm objetivo o algún ARNm endógeno substancialmente similar.
29. Un método para reducir la expresión de un AR?m objetivo, o cualquier AR?m endógeno substancialmente similar caracterizado porque comprende: (a) transformar un hospedador con alguno de los estructuras recombinantes de la reivindicación 26; y (b) seleccionar hospedadores, que tengan una expresión reducida del ARNm objetivo o algún ARNm endógeno substancialmente similar.
30. Un método para reducir la expresión de un ARNm objetivo, o cualquier ARNm endógeno substancialmente similar caracterizado porque comprende: (a) transformar un hospedador con alguno de los estructuras recombinantes de la reivindicación 27; y (b) seleccionar hospedadores, que tengan una expresión reducida del ARNm obj etivo o algún AR?m endógeno substancialmente similar.
31. Un AR? caracterizado porque comprende: (a) homología con al menos un ARNm objetivo expresado por un hospedador, (b) dos regiones complementarias de ARN, que se codifican por cualquier secuencia de ácido nucleico en el genoma del hospedador, con tal de que la secuencia no codifique el ARNm objetivo, o cualquier secuencia que sea substancialmente similar al AR?m objetivo y cuyas regiones estén en proximidad con (a) , en donde el AR?, cuando se introduce en el hospedador, reduce la expresión del ARNm objetivo o cualquier ARNm endógeno substancialmente similar.
32. Un ARN caracterizado porque comprende: (a) homología con al menos un ARNm objetivo expresado por un hospedador, (b) una región de ARN codificada por cualquier secuencia de ácido nucleico en el genoma del hospedador, con tal de que la secuencia no codifique el AR?m objetivo o alguna secuencia que sea substancialmente similar al AR?m objetivo y se localice 5' con (a) , y (c) el complemento inverso del AR? en (b) localizado 3' para (a) , en donde el AR?, cuando se introduce en el hospedador, reduce la expresión del ARNm objetivo, o cualquier ARNm endógeno substancialmente similar.
33. Un ARN caracterizado porque comprende: (a) homología con al menos un ARNm objetivo expresado por un hospedador, (b) dos regiones complementarias de ARN, que se codifican por cualquier secuencia de ácido nucleico en el genoma del hospedador, con tal de que la secuencia no codifique el ARNm objetivo, o cualquier secuencia que sea substancialmente similar al ARNm objetivo y cuyas regiones se localicen 5' con (a) , en donde el ARN, cuando se introduce en el hopedador reduce la expresión del, ARNm objetivo o cualquier ARNm endógeno substancialmente similar.
34. Un ARN caracterizado porque comprende: (a) homología con al menos un ARNm objetivo expresado por un hospedador, y (b) dos regiones complementarias de ARN, que se codifican por cualquier secuencia de ácido nucleico en el genoma del hospedador, con tal de que la secuencia no codifique el ARNm objetivo, o cualquier secuencia que sea substancialmente similar al AR?m objetivo y cuyas regiones se localicen 3' con (a), en donde el AR?, cuando se introduce ne el hopedador, reduce la expresión del AR?m objetivo o cualquier ARNm endógeno substancialmente similar.
35. Un ARN caracterizado porque comprende: (a) homología con al menos un AR?m objetivo expresado por un hospedador, (b) dos regiones complementarias de ARN, que se codifican por cualquier secuencia de ácido nucleico en el genoma del hospedador, con tal de que la secuencia no codifique el AR?m objetivo, o cualquier secuencia que sea substancialmente similar al ARNm objetivo y que se localicen dentro de (a) , en donde el AR?, cuando se introduce en el hospedador reduce la expresión del AR?m objetivo o cualquier AR?m endógeno substancialmente similar.
36. Los AR? de conformidad con las reivindicaciones 31-35, caracterizados porque, la secuencia de ácido nucleico en el genoma del hospedador, es una secuencia que no se expresa por el hospedador .
37. Los AR? de conformidad con las reivindicaciones 31-35, caracterizados porque, la secuencia de ácido nucleico en el genoma del hospedador, es una secuencia que se expresa por el hospedador .
38. Un método para reducir la expresión de un AR?m objetivo, o cualquier AR?m endógeno substancialmente similar caracterizado porque comprende: (a) introducir dentro del hospedador cualquiera de los ARN de las reivindicaciones 31-35; y (b) seleccionar hospedadores que tengan una expresión reducida del AR?m objetivo o cualquier AR?m endógeno substancialmente similar.
39. Un método para reducir la expresión de un ARNm objetivo, o cualquier ARNm endógeno substancialmente similar caracterizado porque comprende: (a) introducir dentro del hospedador el ARN de la reivindicación 36; y (b) seleccionar hospedadores que tengan una expresión reducida del ARNm objetivo o cualquier ARNm endógeno substancialmente similar.
40. Un método para reducir la expresión de un ARNm objetivo, o cualquier ARNm endógeno substancialmente similar caracterizado porque comprende: (a) introducir dentro del hospedador el ARN de la reivindicación 37; y (b) seleccionar hospedadores que tengan una expresión reducida del ARNm objetivo o cualquier ARNm endógeno substancialmente similar.
41. Un método para identificar o separar por exclusión un gen de planta esencial caracterizado porque comprende: (a) transformar una célula de planta con un estructura recombinante, que comprende un promotor constitutivo, en donde el estructura es capaz de reducir la expresión de un gen esencial de planta con un alto grado de frecuencia. (b) cuantificar todas las células de planta transformadas de la etapa (a) ; (c) cuantificar todas las células de plantas transformadas de un control, que no reduce la expresión de un gen esencial de planta; y (d) comparar la cuantificación de las células de planta transformadas seleccionadas de la etapa (b) , con la cuantificación de las células de plantas transformadas seleccionadas de la etapa (c) , en donde la cuantificación de las células de plantas transformadas seleccionadas de la etapa (c) , debe superar substancialmente la cuantificación de las células de planta transformadas de la etapa (b) .
42. Un método para la identificación o separación por exclusión de un gen esencial de planta caracterizado porque comprende : (a) transformar una célula de planta con uno de los estructuras recombinantes de cualesquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende además un promotor constitutivo que es capaz de reducir la expresión de un gen esencial de planta con un alto grado de frecuencia; (b) cuantificar todas las células de plantas transformadas de la etapa (a) ; (c) cuantificar todas las células de plantas transformadas de un control, que no reduce la expresión de un gen esencial de planta; y (d) comparar la cuantificación de las células de planta transformadas seleccionadas de la etapa (b) , con la cuantificación de las células de plantas transformadas seleccionadas de la etapa (c) , en donde la cuantificación de las células de plantas transformadas seleccionadas de la etapa (c) , debe superar substancialmente la cuantificación de las células de planta transformadas de la etapa (b) .
43. Un método para la identificación o separación por exclusión de un gen esencial de planta caracterizado porque comprende : (a) transformar una célula de planta con el estructura recombinante de la reivindicación 6, que comprende además un promotor constitutivo que es capaz de reducir la expresión de un gen esencial de planta con un alto grado de frecuencia; (b) cuantificar todas las células de plantas transformadas de la etapa (a) ; (c) cuantificar todas las células de plantas transformadas de un control, que no reduce la expresión de un gen esencial de planta; y (d) comparar la cuantificación de las células de planta transformadas seleccionadas de la etapa (b) , con la cuantificación de las células de plantas transformadas seleccionadas de la etapa (c) , en donde la cuantificación de las células de plantas transformadas seleccionadas de la etapa (c) , debe superar substancialmente la cuantificación de las células de planta transformadas de la etapa (b) .
44. Un método para la identificación o separación por exclusión de un gen esencial de planta caracterizado porque comprende : (a) transformar una célula de planta con el estructura recombinante de la reivindicación 7, que comprende además un promotor constitutivo que es capaz de reducir la expresión de un gen esencial de planta con un alto grado de frecuencia; (b) cuantificar todas las células de planta transformadas de la etapa (a) ; (c) cuantificar todas las células de plantas transformadas de un control, que no reduce la expresión de un gen esencial de planta; y (d) comparar la cuantificación de las células de planta transformadas seleccionadas de la etapa (b) , con la cuantificación de las células de plantas transformadas seleccionadas de la etapa (c) , en donde la cuantificación de las células de plantas transformadas seleccionadas de la etapa (c) , debe superar substancialmente la cuantificación de las células de plantas transformadas de la etapa (b) .
45. El estructura recombinante de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque las secuencias de ADN que codifican las dos secuencias complementarias de ARN, están comprendidas dentro de cualesquiera de las secuencias establecidas en SEQ ID Nos : 12, 13 ó 34.