MXPA02008219A

MXPA02008219A - Peptidos que enlazan hla y sus usos.

Info

Publication number: MXPA02008219A
Application number: MXPA02008219A
Authority: MX
Inventors: John Sidney
Original assignee: Epimmune Inc
Priority date: 2000-02-23
Filing date: 2000-02-23
Publication date: 2005-06-30
Also published as: CA2400215A1; EP1263775A1; BR0017136A; EP1263775A4; WO2001062776A1; CN1452634A; JP2003524016A; AU2000232427A1

Abstract

La presente invencion proporciona los medios y metodos para seleccionar peptidos inmunologicos y las composiciones de peptido inmunogenico capaces de unir especificamente glicoproteinas codificadas por alelos HLA y activacion de celulas T de induccion en celulas T restringidas por el alelo. Los peptidos son utiles para producir una respuesta inmune contra un antigeno deseado.

Description

PÉPTIDOS QUE ENLAZAN HIA Y SUS USOS DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente solicitud es una continuación en parte de USSN 08/205, 713 presentada el 4 de marzo de 1994. La presente solicitud también se relaciona a USSN 09/017,735, USSN 08/753,622, USSN 08/822,382, USSN 60/013,980, USSN 08/589,108, USSN 08/454,033, USSN 08/349,177, USSN 08/073,205, y USSN 08/027,146. La presente solicitud también se relaciona a USSN 09/017,524, USSN 08/821,739, USSN 60/013,833, USSN 08/758,409, USSN 08/589,107, USSN 08/451,913 y a USSN 08/347,610, USSN 08/186,266, USSN 08/159,339, USSN 09/116,061, USSN 08/103,396, USSN 08/027,746, y USSN 07/926,666. La presente solicitud también se relaciona a USSN 09/017,743; USSN 08/753,615; USSN 08/590,298; USSN 08/452,843; USSN 09/115,400; USSN 08/344,824; y USSN 08/278,634. La presente solicitud también se relaciona a USSN 08/197,484 y USSN 08/815,396. Todas las solicitudes anteriores se incorporan en la presente para referencia. La presente invención se refiere a composiciones y métodos para prevenir, tratar o diagnosticar un número de estados patológicos tales como enfermedades virales y cánceres. En particular, proporciona péptidos novedosos capaces de enlazar moléculas dei complejo de histocompatibilidad (MHC) principales seleccionadas e inducir una respuesta inmune.

Clase I o Clase II. Las moléculas MHC de Clase II se expresar, principalmente en células involucradas en iniciar y sostener respuestas inmunes, tales como linfocitos T, linfocitos 3, macrófagos, etc. Las moléculas MHC de Clase II se reconocer, por los linfocitos T asistentes e inducen la proliferación de linfocitos T asistentes y amplificación de la respuesta inmune al péptido inmunogénico particular que se muestra. Las moléculas MHC de Clase I se expresan en casi todas las células nucleadas y se reconocen por linfocitos T citotóxicos (los CTL), que destruyen después las células que llevan antigeno. Los CTL son particularmente importantes en el rechazo de tumor y para combatir infecciones virales. Los CTL reconocen el antigeno en la forma de un fragmento peptidico enlazado a las moléculas de Clase I de MHC más que el antigeno extraño en si mismo. El antigeno debe ser común y endógenamente sintetizado por la célula, y una porción del antígeno de proteina se degrada en fragmentos peptidicos pequeños en el citoplasma. Algunos de estos pequeños péptidos se translocan dentro de un compartimiento pre-Golgi e interactúan con cadenas pesadas de clase I para facilitar el doblado apropiado y la asociación con subunidad de la microglobulina ß2. El complejo péptido-MHC clase I se dirige después a la superficie de la célula para expresión y reconocimiento potencial por los CTL específicos.

Las investigaciones de la estructura cristalina de la molécula de clase I de MHC humana, HLA-A2.1, indica que se crea un surco de enlace peptidico por el doblado de los dominios al y a2 de la clase I de cadena pesada (Biorkmen et al., Nature 329:506 (1987). En estas investigaciones, sin embargo, la identidad de los péptidos enlazados ai surco no se determinó. Buus et al., Science 242:1065 (1988) describió primero un método para la elusión ácida de péptidos enlazados a partir de MHC. Subsecuentemente, Rammensee y sus colaboradores (FaLk et al., Nature 351:290 (1991) han desarrollado una metodología para caracterizar péptidos naturalmente procesados enlazados a moléculas de clase I . Otros investigadores han logrado exitosamente la secuenciación de aminoácidos directa de los péptidos más abundantes en diversas fracciones de HPLC por secuenciación automatizada convencional de péptidos eluidos a partir de moléculas de clase I del tipo B (Jardetzky, et al., Nature 353:326 (1991) y del tipo A2.1 por espectrometría de masa (Hunt, et al., Science 225:1261 (1992). Una revisión de la caracterización de los péptidos naturalmente procesados en MHC Clase I se ha presentado por Rótzschke and Falk (Rótzschke and Falk, Immunol . Today 12:447 (1991). Sette et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:3296 (1989) mostró que motivos específicos del alelo MHC podrían usarse para predecir la capacidad de enlace de MHC. Schaene: et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:4649 (1989) mos ro que el enlace de MHC estaba relacionado a la inmunogenicidac. Diversos autores (De Bruijn et ai., Eur. J. Inmuno1. , 21:2963-2970 (1991); Pamer et al., 991 Nature 353:852-955 (1991)) han proporcionado evidencia preliminar que los motivos de enlace de clase I pueden aplicarse a la identificación de péptidos inmunogénicos potenciales en modelos animales. Los motivos de Clase I específicos para un número de alelos humanos de un isotipo de ciase I dado aún pueden describirse. Es deseable que las frecuencias combinadas de estos diferentes alelos sea suficientemente alta para cubrir una fracción grande o tal vez la mayoría de la población producida por mezcla de razas humana. A pesar del desarrollo en la técnica, la técnica anterior tiene que proporcionar aún una vacuna basada en péptido humano útil o agente terapéutico basado en ese trabajo. La presente invención proporciona éstas y otras ventajas. La presente invención proporciona composiciones que comprenden péptidos inmunogénicos que tiene motivos de enlace para las moléculas HLA-A2.1. Los péptidos inmunogénicos, que se enlazan al alelo MHC apropiado, son preferiblemente de 9 a 10 residuos de longitud y comprenden residuos conservados er. algunas posiciones tales como las posiciones 2 y 9. .Además, los péptidos no comprenden residuos de enlace negativos come se define en la presente en otras posiciones tales como las posiciones 1, 3, 6 y/o 7 en el caso de péptidos de 9 aminoácidos de longitud y posiciones 1, 3, 4, 5, 7, 8 y/o 9 en el caso de péptidos de 10 aminoácidos de longitud. La presente invención define posiciones dentro de un motivo que permite la selección de péptidos que se enlazarán eficientemente a HLA A2.1. Los motivos de las invenciones incluyen péptidos de 9 aminoácidos que tienen un primer residuo conservado en la segunda posición a partir del término N seleccionado a partir del grupo que consiste de I, V, A y T y un segundo residuo conservado en la posición C-terminal seleccionada a partir del grupo que consiste de V, L, I, A y M. Alternativamente, los péptidos pueden tener un primer residuo conservado en la segunda posición a partir del término N seleccionado a partir del grupo que consiste de L, M, I, V, A y T; y un segundo residuo conservado en la posición C-terminal seleccionada a partir del grupo que consiste de A y M. Si el péptido tiene 10 residuos contendrá un primer residuo conservado en la segunda posición a partir del término N seleccionado a partir del grupo que consiste de L, M, I, V, A, y T; y un segundo residuo conservado en la posición C-terminal seleccionada a partir del grupo que consiste de V, I, L, A y M; en donde el primer y segundo residuos conservados se separan por 7 residuos . Los epitopes sobre un número de proteínas objetiv inmunogénicas pueden identificarse usando ios pépticos de la invención. Los ejemplos de antígenos adecuados incluyen antígeno específico de cáncer de próstata (PSA) , antígeno de membrana específico de próstata (PSM) , antigenos de núcleo y superficie de hepatitis B (HBVc, HBVs) antígenos de hepatitis C, antígenos del virus Epstein-Barr, antígenos del virus de inmunodeficiencia tipo-1 (HIV1), del virus herpes sarcoma de Kaposi (KSHV) , antígenos del virus del papiloma humano (VPH), virus Lassa, mycobacterium tuberculosis (MT) , p53 y p53 de murino (mp53) , CEA, antígeno de superficie de tripanosoma (TSA) , familias de proteína relacionadas a tirosinas (TRP) , y Her2/neu. Los péptidos son útiles así en composiciones farmacéuticas para aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico in vivo y ex vivo. La presente invención también proporciona composiciones que comprenden péptidos inmunogénicos que tiene motivos de enlace para moléculas de MHC Clase I . Los péptidos inmunogénicos están típicamente entre aproximadamente 3 y aproximadamente 11 residuos y comprenden residuos conservados involucrados en enlazar proteínas codificadas por el alele MHC apropiado. Un número de motivos específicos de alelo se han identificado. Por ejemplo, el motivo para HLA-A3.2 comprende del término ? hasta el término C un primer residuo conservado de L, M, I, V, S, A, T y F en la posición 2 y un segundo residuo conservado de K, R o Y en el extremo C-terminal. Otros primeros residuos conservados son C, G o D y alternativamente E. Otros segundos residuos conservados son H o F. Los primero y segundo residuos conservados se separan preferiblemente por 6 a 7 residuos. El motivo para HLA-A1 comprende a partir del término N hasta el término C un primer residuo conservado de T, S o M, un segundo residuo conservado de D o E, y un tercer residuo conservado de Y. Otros segundos residuos conservados son A, S o T. El primero y segundo residuos conservados están adyacentes y están preferiblemente separados a partir del tercer residuo conservado por 6 a 7 residuos. Un segundo motivo consiste de un primer residuo conservado de E o D y un segundo residuo conservado de Y en donde el primer y segundo residuos conservados se separan por 5 a 6 residuos. El motivo para HLA- ll comprende a partir del término N hasta el término C un primer residuo conservado de T, V, M, L, I, S, A, G, N, C D, o F en la posición 2 y un residuo conservado C-terminal de K, R, Y o H. El primero y segundo residuos conservados se separan preferiblemente por 6 o 7 residuos. El motivo para HLA-A24.1 comprende a partir del término N hasta el término C un primer residuo conservado de Y, F o W en la posición 2 y un residuo conservacc ce _a -terminal de F, I, W, M o L. El primero y segundo residuos conservados se separan preferiblemente por ó a 7 residuos. Los epítopes sobre un número de proteínas objetivo potenciales pueden identificarse en esta forma. Ejemplos de antígenos adecuados incluyen antigeno específico de próstata (PSA) , antígeno de membrana específico de próstata (PSM), antígenos de núcleo de superficie de hepatitis 8 (H3Vc, HBVs ) antígenos de hepatitis C, antígeno de melanoma maligno (MAGE-1) antígenos del virus Epstein-Barr, virus de inmunodeficiencia humana del tipo-1 (HIV1), antígenos del virus de papiloma, virus de Lassa, mycobacterium tuberculosis (MT), p53 y p53 de murino (mp53), CEA, y Her2/neu, y los miembros de las familias de proteínas relacionadas a tirosinasa (TRP) . Los péptidos son útiles así en composiciones farmacéuticas para aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico in vivo y ex vivo. La presente invención tambié proporciona composiciones que comprenden péptidos inmunogénicos que tienen motivos de enlace para alelos HLA sin A. Los péptidos inmunogénicos son preferiblemente de aproximadamente S a 10 residuos de longitud y comprenden residuos conservados en algunas posiciones tales como prolina en la posición 2 y un residuo aromático (por ejemplo, Y, W, F) o residuo hidrofóbico (por ejemplo, L, I, v, M, o A) en el término Q carboxi. En particular, una ventaja de los péptidos de 1= invención es su capacidad para enlazarse a dos o més diferentes alelos de HLA. Los epitopes sobre un número de proteínas objetivo potenciales pueden identificarse en esta forma. Ejemplos de antígenos adecuados incluyen antigeno específico de próstata (PSA) , antígenos de núcleo y superficie de hepatitis B (HBVc, HBVs) antígenos de hepatitis C, antígeno de melanoma maligno (MAGE-1) antígenos del virus Epstein-Barr, virus de inmunodeficiencia humana de tipo-1 (HIV1), antígenos del virus de papiloma, virus de Lassa, mycobacterium tuberculosis (MT) , p53, CEA, y Her2/neu. Los péptidos son así útiles en composiciones farmacéuticas para aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico in vivo y ex vivo. Definiciones El término "péptido" se usa intercambiablemente con "oligopéptido" en la presente especificación para designar una serie de residuos, típicamente L-aminoácidos, conectados uno con otro típicamente por enlaces peptídicos entre los grupos alfa-amino y carbonilo de aminoácidos adyacentes. Los oligopéptidos de la invención tienen menos de aproximadamente 15 residuos de longitud y consisten comúnmente de entre aproximadamente 8 y aproximadamente 11 residuos, preferiblemente 9 ó 10 residuos. Un "péptido inmunogénico" es un péptido que 1 o comprende un motivo especifico de alelo tal que el péprido se enlazará a una molécula MHC e inducirá una respuesta CTL. Los péptidos inmunogénicos de la invención son capaces de enlazarse a una molécula ELA-A2.1 apropiada e inducir una respuesta de célula T citotóxica en contra del antígeno a partir del cual el péptido inmunogénico se deriva. Los péptidos inmunogénicos se identifican convenientemente usando los algoritmos de la invención. Los algoritmos son procedimientos matemáticos que producen una puntuación que permite la selección de péptidos inmunogénicos. Típicamente uno usa la puntuación algorítmica con un "umbral de enlace" para permitir la selección de ios péptidos que tienen una alta probabilidad de enlace a una cierta afinidad y serán a su vez inmunogénicos. El algoritmo se basa sobre los efectos sobre el enlace MHC de un aminoácido particular en una posición particular de un péptido o los efectos en el enlace de una sustitución particular en un péptido que contiene motivo. Un "residuo conservado" es un aminoácido que ocurre en una frecuencia significativamente mayor que la que se esperaría por la distribución aleatoria en una posición particular en un péptido. Típicamente un residuo conservado es uno en donde la estructura MHC puede proporcionar un punto de contacto con el péptido inmunogénico. Al menos de uno a tres o más, preferiblemente dos, residuos conservados dentrc de un péptido de longitud definida definen un motivo para ur. péptido inmunogénico . Estos residuos están típicamente er. contacto estrecho con el surco de enlace peptídico, con sus cadenas laterales encerradas, huecos específicos de la ranura en sí misma. Típicamente, un péptido inmunogénico comprenderé hasta tres residuos conservados, más comúnmente dos residuos conservados . Como se usa en la presente, "residuos de enlaces negativos" son aminoácidos que si están presentes en algunas posiciones (por ejemplo, las posiciones 1, 3 y/o 7 de un 9-mer) resultarán en un péptido que es un no enlazante o deficiente enlazante y a su vez fallarán para ser inmunogénicos es decir, inducirá una respuesta de CTL. El término "motivo" se refiere al patrón de residuos en un péptido de longitud definida, comúnmente de aproximadamente 8 hasta aproximadamente 11 aminoácidos, que se reconoce por un alelo MHC particular. Los motivos peptídicos son típicamente diferentes para cada alelo MHC humano y difiere en el patrón de los residuos altamente conservados y residuos negativos. El motivo de enlace para un alelo puede definirse con crecientes grados de precisión. En un caso, todos los residuos conservados están presentes en las posiciones correctas en un péptido y no existen residuos negativos en las posiciones 1,3 y/o 7.

Las frases "aislado" o "biológicamente puro" se refieren a material que está sustancial o esencialmente libre de componentes que comúnmente lo acompañan como se encuentra en su estado nativo. Asi, los péptidos de esta invención no contienen materiales comúnmente asociados con su ambiente in situ, por ejemplo, moléculas de MHC I sobre células que presentan antigeno. Aún donde se ha aislado una proteína para una banda homogénea o dominante, existen contaminantes traza en el rango de 5-10% de la proteína nativa que co-purifica con la proteína deseada. Los péptidos aislados de esta invención no contienen tal proteína co-puri icada endógena. El término "residuo" se refiere a un aminoácido o aminoácido mimético incorporado en un oligopéptido por un enlace de amida o enlace de amida mimética. I. Motivo HLA-A2.1 La presente invención se refiere a la determinación de motivos peptídicos específicos de alelo para subtipos ce alelo MHC Clase I humano (algunas veces referidas como HLA) , en particular, motivos peptídicos reconocidos por alelos HLA-A2.1. Estos motivos se usan después para definir epítopes de células T a partir de cualquier antígeno deseado, particularmente aquellos asociados con enfermedades virales, cánceres o enfermedades autoin unes humanas, para los cuales se conoce la secuencia de aminoácidos de ios objetives antígeno o autoantígeno potenciales.

Los epitopes sobre un número de proteínas objetive-potenciales pueden identificarse en esta forma. Ejemplos de antígenos adecuados incluyen antígeno específico de próstata (PSA) , antígeno de núcleo y superficie de hepatitis 3 (HBVc, HBVs) antígenos de hepatitis C, antígenos del virus Epstein-Barr, antígenos de melanoma (por ejemplo, MAGE-i), antígeno del virus de inmunodeficiencia humana (HIV) , antígeno del virus de papiloma humano (VPH) , virus Lassa, mycobacterium tuberculosis (MT) , p53, CEA, antígeno de superficie de tripanosoma (TSA) y Her2/neu. Los péptidos que comprenden los epitopes a partir de estos antígenos se sintetizan y se prueban después por su capacidad para enlazarse a las moléculas MHC apropiadas en pruebas que usan, por ejemplo, moléculas de clase I purificadas y péptidos radioyodado y/o células que expresan-moléculas de clase I vacías por, por ejemplo, tinción inmunofluorescente y microfluorometría de flujo, prueba de ensamble de clase I dependiente de péptido, e inhibición del reconocimiento CTL por competición peptídica. Aquellos péptidos que se enlazan a la molécula de clase I que varían adicionalmente por su capacidad para servir como objetivo para los CTL derivados a partir de individuos infectados o inmunizados, así como por su capacidad para inducir respuestas CTL primarias in vivo o in vitro que pueden dar origen a poblaciones CTL capaces de reaccionar con células objetivo viralmente infectadas o células tumor ies cerno agentes terapéuticos potenciales. Los antígenos de MHC clase I se codifican por los antígenos HLA-A, B, y sitios C. Los antígenos HLA-A y B se expresan en la superficie de la célula en aproximadamente densidades iguales, mientras que la expresión de HLA-C es significativamente menor (tal ves tanto como 10 veces menor) . Cada uno de estos sitios tiene un número de alelos. Los motivos que enlazan péptidos de la invención son-relativamente específicos para cada subtipo alélico. Para las vacunas basadas en péptido, ios péptidos de la presente invención comprenden preferiblemente un motivo reconocido por una molécula MHC I que tiene una amplia distribución en la población humana. Puesto que los alelos MHC ocurren a diferentes frecuencias dentro de diferentes grupos étnicos y razas, la selección del alelo MHC objetivo puede depender de la población objetivo. La Tabla 1 muestra la frecuencia de diversos alelos en los productos del sitio HLA-A entre razas diferentes. Por ejemplo, la mayoría de la población caucasoide puede cubrirse por péptidos que se enlazan a cuatro subtipos de alelo HLA-A, específicamente HLA-A2.1, Al, A3.2, y A24.1. Igualmente, la mayoría de la población asiática está abarcada con la adición de péptide que se enlazan a un quinto alelo HLA-A11.2.

TABLA 1 Subtipo/Alelo A N(69)* A(54) C(502) Al 10.1(7) 1.8(1) 27.4(138) A2.1 11.5(8) 37.0(20) 39.8(199) A2.2 10.1(7) 0 3.3(17) A2.3 1 4(1) 5.5(3) 0.8(4) A2.4 - - A2.5 - - A3.1 1.4(1) 0 0.2(0) A3.2 5.7(4) 5.5(3) 21.5(108) Al l.l 0 5.5(3) 0 Al 1.2 5.7(4) 31.4(17) 8.7(44) A11.3 0 3.7(2) 0 A23 4.3(3) - 3.9(20) A24 2.9(2) 27.7(15) 15.3(77) A24.2 - - A24.3 - - A25 1-4(1) - 6.9(35) A26.1 4.3(3) 9.2(5) 5.9(30) A26.2 7.2(5) 1.0(5) A26V - 3.7(2) -A28.1 10.1(7) - 1.6(8) A28.2 1-4(1) - 7.5(38) A29.1 1.4(1) - 1.4(7) A29.2 10.1(7) 1.8(1) 5.3(27) A30.1 8.6(6) 4.9(25) A30.2 1-4(1) 0.2(1) A30.3 7.2(5) - 3.9(20) A31 4-3(3) 7.4(4) 6.9(35) A32 2.8(2) 7.1(36) Aw33.1 8.6(6) 2.5(13) A 33.2 2.8(2) 16.6(9) 1.2(6) A 34.1 1-4(1) - Aw34.2 14.5(10) - 0.8(4) Aw36 5.9(4) - Tabla compilada a partir de B. DuPont, Iitimunobiology of HLA, Vol . I, Histocompatibility Testing 1987, Springer-Verlag, New York 1989. * N - negroide; A = asiático; C = Caucasoide. Los números en paréntesis representan el número de individuos incluidos en 1 O los análisis. La nomenclatura usada para describir los compuestos peptidicos sigue la práctica convencional en donde el grupo amino se presenta a la izquierda (el término N) y el grupo carboxilo a la derecha (el término C) de cada residuo de aminoácido. En las fórmulas que representan modalidades especificas seleccionadas de la presente invención, ios grupos amino y carboxilo terminales, aunque no específicamente mostrados, están en la forma que asumirían a valores de pH fisiológico, a menos que se especifique lo contrario. En las fórmulas de estructura de aminoácido, cada residuo se representa generalmente por designaciones de tres letras o letra sencilla estándar. La forma L de un residuo de aminoácido se representa por una sola letra mayúscula o una primera letra mayúscula de un símbolo de tres letras, y la forma D para aquellos aminoácidos que tienen formas D se representa por una sola letra minúscula o un símbolo de tres letras minúsculas. La glicina no tiene átomo de carbono asimétrico y se refiere simplemente como "Gly" o G. Los procedimientos usados para identificar los péptidos de la presente invención siguen generalmente los métodos descritos en Falk et al., Nature 351:290 (1991) que se incorpora en la presente para referencia. Brevemente, les métodos involucran el aislamiento a gran escala de moléculas MHC clase I, típicamente por inmunoprecipitsción o cromatografía de afinidad, a partir de la célula o línea de células apropiadas. Los ejemplos de otros métodos para aislamiento de la molécula HC deseada igualmente bien-conocidos al artesano incluyen cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de lectina, exclusión de tamaño, cromatografía de ligandos de alta resolución, y una combinación de todas las técnicas anteriores. En el caso típico, se usa inmunoprecipitación para aislar el alelo deseado. Puede usarse un número de protocolos, dependiendo de la especificidad de los anticuerpos usados. Por ejemplo, los reactivos mAb específicos de alelo pueden usarse para la purificación de afinidad de las moléculas HLA-A, HLA-B1, y HLA-C. Diversos reactivos mAb para el aislamiento de las moléculas HLA-A están disponibles. El monoclonal BB7.2 es adecuado para aislar moléculas HLA-A2. Las columnas de afinidad preparadas con estos mAbs que usan técnicas estándar se usan exitosamente para purificar los productos de alelo HLA-A respectivos . Además de los mAbs específicos de alelo, los mAbs anti-HLA-A-, B, C ampliamente reactivos tales como 6/32 y B9.12.1, y un anti-HLA-B, C mAb, Bl.23.2 podrían usarse en protocolos de purificación de afinidad alternativos como se describe en solicitudes previas. Los péptidos enlazados al surco de enlace peptídico de las moléculas MHC aisladas se eluyen típicamente sar.do un tratamiento ácido. Los péptidos también pueden disociarse de las moléculas de clase I por una diversidad de medios desnaturalizantes estándar, tales como calor, pH, detergentes, sales, agentes queotrópicos o una combinación de los mismos. Las fracciones peptídicas se separan adicionalmente de las moléculas MHC por cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa (HPLC) y se secuencían. Los péptidos pueden separarse por una diversidad de otros medios estándar bien conocidos al artesano, que incluyen filtración, ultrafiltración, electroforesis, cromatografía de tamaño, precipitación con anticuerpos específicos, cromatografía de intercambio iónico, iso-electroenfoque y similares. La secuenciación de los péptidos aislados puede realizarse de acuerdo a técnicas estándar tales como la degradación de Edman (Hunkapiller, M.W., et al., Methods Enzymol . 91, 399

[1983]). Otros métodos adecuados para secuenciación incluyen secuenciación por espectrometría de masas de péptidos individuales como se describió previamente (Hunt, et al., Science 225:1261 (1992), que se incorporan en la presente para referencia) . La secuenciación de aminoácidos de péptidos heterogéneos en masa (por ejemplo, fracciones HPLC reunidas) a partir de diferentes moléculas de ciase I revela típicamente un motivo de secuencia característico para cada alelo de clase I . La definición de los motivos específicos para diferentes alelos de clase I permite la identificación de epítopes peptídicos potenciales a partir de una proteína antigénica cuya secuencia de aminoácidos se conoce. Típicamente, la identificación de los epítopes peptídicos potenciales se lleva a cabo inicialmente usando una computadora para examinar la secuencia de aminoácidos de un antígeno deseado por la presencia de motivos. Las secuencias epitópicas se sintetizan después. La capacidad para enlazar moléculas de clase MHC se mide en una diversidad de formas diferentes. Un medio es una prueba de enlace de molécula de Clase I como se describe en las solicitudes relacionadas, anotadas anteriormente. Otras alternativas descritas en la literatura incluye la inhibición de la presentación del antígeno (Sette, et al., J. Immunol. 141:3893 (1991), pruebas de ensamble in vitro (Townsend, et al., Cell 62:285 (1990), y pruebas basadas en FACS usando células mutadas, tales como RMA.S (Melief, et al., Eur. J. Immunol. 21:2963 (1991)). Después, los péptidos que dan positivo en la prueba de enlace MHC clase I se prueban por la capacidad de los péptidos para inducir respuestas CTL específicas in vitro. Por ejemplo, las células que presentan antígeno que se har. incubado con un péptido pueden probarse por la capacidad para inducir respuestas CTL en poblaciones de células que responden. Las células que presentan antígeno pueden ser células normales tales como células mononucleares de sangre periférica o células dendriticas (Inaba, et ai., J. Exp. Mea. 166:182 (1987); Boog, Eur. J. Im unol. 18:219

[1988]). Alternativamente, las lineas de células de mamífero muíante que son deficientes en su capacidad para cargar moléculas de clase I con péptidos internamente procesados, tales como las líneas de células de ratón RMA-5 (Karre, et al., Nature, 319:675 (1986); Ljunggren, et al., Eur. J. Immunol. 21:2963-2970 (1991)), y el híbrido de célula T somática humana, T-2 (Cerundolo, et al., Nature 345:449-452 (1990)), y que se han transfectado con los genes de clase I humanos apropiados se usan convenientemente, cuando se agrega péptido a ellos, para probar mediante la capacidad del péptido para inducir respuestas CTL primarias in vitro. Otras líneas de células eucarióticas que podrían usarse incluyen diversas líneas de células de insectos tales como larva de mosquito (líneas de célula ATCC CCL 125, 126, 1660, 1591, 6585, 6586), gusano de seda (ATTC CRL 8851), gardama (ATCC CRL 1711), polilla (ATCC CCL 80) y líneas de células de Drosophila tales como líneas de célula de Schneider (véase Schneider J. Embryol . Exp. Morphol. 27:353-365

[1927]). Los linfocitos de sangre periférica se usar, convenientemente después de venipuntura o leucaféresis simple de donadores normales o pacientes y se usan como las fuentes de células que responden de precursores CTL. En una modalidad, las células que presentan antígeno apropiadas se incuban con 10-100 µ? de péptido libre de suero durante 4 horas bajo condiciones de cultivo apropiadas. Las células que presentan antígeno cargadas de péptido se incuban después coplas poblaciones de células que responden in vitro durante 7 a 10 días bajo condiciones de cultivo optimizadas. La activación CTL positiva puede determinarse probando los cultivos por la presencia de los CTL que destruyen células objetivos radiomarcadas, objetivos pulsados de péptido específico, así como células objetivo que expresan la forma endógenamente procesada del virus relevante o antígeno de tumor a partir del cual se derivó la secuencia peptídica. La especificidad y restricción de MHC del CTL se determina probando en contra de diferentes péptidos de células objetivo que expresan MHC clase I humana apropiada o inapropiada. Los péptidos que dan positivo en las pruebas de enlace MHC y dan origen a respuestas CTL específicas se refieren en la presente como péptidos inmunogénicos. Los péptidos inmunogénicos pueden prepararse sintéticamente, o por tecnología de ADN recombinante o a partir de fuentes naturales tales como virus completo o tumores. Aunque el péptido estuviera de preferencia sustancialmente libre de otras proteínas celulares de huésped que ocurren naturalmente y fragmentos de la misma, en algunas modalidades los péptidos pueden conjugarse sintéticasnence en fragmentos nativos o partículas. Los polipéptidos o péptidos pueden ser de una diversidad de longitudes, en sus formas neutras (no cargadas', o en formas que son sales y libres de modificaciones, tales como glicosilación, oxidación de la cadena lateral, o fosforilación, o conteniendo estas modificaciones, sujeta a la condición de que la modificación no destruye la actividad biológica de los polipéptidos como se describen en la presente . Deseablemente, el péptido será tan pequeño como sea posible manteniendo aún a la vez sustancialmente toda la actividad biológica del péptido grande. Cuando sea posible, puede ser deseable utilizar péptidos de la invención a una longitud de 9 ó 10 residuos de aminoácido, en proporción de tamaño con los péptidos virales endógenamente procesados o péptidos de célula tumoral que se enlazan a moléculas de HC clase I sobre la superficie de la célula. Los péptidos que tienen la actividad deseada pueden modificarse como sea necesario para proporcionar algunos atributos deseados, por ejemplo, características farmacológicas mejoradas, aumentando a la vez o al menos reteniendo sustancialmente toda la actividad biológica del péptido no modificado para enlazar la molécula MHC deseada y activar la célula T apropiada. Por ejemplo, los péptidos pueden someterse a diversos cambios, tales como sustituciones conservativas o no conservativas, en donde tales cambios pudieron proporcionar algunas ventajas en su uso, tales como enlace MHC mejorado. Por sustituciones conservativas se quiere decir reemplazar un residuo de aminoácido con otro que es biológicamente y/o químicamente similar, por ejemplo, un residuo hidrofóbico por otro, o un residuo polar por otro. Las sustituciones incluyen combinaciones tales como Gly, Ala; Val, lie, Leu, Met; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; y Phe, Tyr. El efecto de las sustituciones de aminoácido sencillo también pueden sondearse usando D-aminoácidos . Tales modificaciones pueden hacerse usando procedimientos de síntesis peptídica bien conocidos, como se describe en, por ejemplo, Merrifield, Science 232:341-347 (1986), Barany and Merrifield, The Peptides, Gross and Meienhofer, eds. (N.Y., Academic Press), pp. 1-284 (1979); y Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, (Rockford, 111., Pierce) , 2d Ed. (1984), incorporados en la presente para referencia. Los péptidos también pueden modificarse aumentando o disminuyendo la secuencia de aminoácidos del contexto, por ejemplo, por la adición o sustracción de aminoácidos. Los péptidos o análogos de la invención también pueden modificarse alterando el orden o composición de algunos residuos, siendo fácilmente apreciado que algunos residuos de aminoácidos esenciales para la actividad biológica, per ejemplo, aquellos en sitios de contacto críticos o residuos conservados, pueden generalmente no alterarse sin un efecto adverso en la actividad biológica. Los aminoácidos nc críticos no necesitan limitarse a aquellos que ocurren naturalmente en las proteínas, tales como L-a-aminoácidos o sus D-isómeros, pero pueden incluir aminoácidos no naturales también, tales como ß-?-d aminoácidos, así como muchos derivados de L-a aminoácidos. Típicamente, se emplea una serie de péptidos con sustituciones de aminoácidos sencillas para determinar el efecto de carga electrostática, hidrofobicidad, etc. en el enlace. Por ejemplo, una serie de sustituciones de aminoácidos positivamente cargados (por ejemplo, Lys o Arg) o negativamente cargado (por ejemplo, Glu) se hacen a lo largo de la longitud del péptido revelando diferentes patrones de sensibilidad hacia diversas moléculas MHC y receptores de célula T. Además, pueden emplearse múltiples sustituciones que usan porciones relativamente neutras, pequeñas, tales como Ala, Gly, Pro, o residuos similares. Las sustituciones pueden ser homo-oligómeros o hetero-oligómeros . El número y tipo de residuos que se sustituyen o agregan dependen del espaciamiento necesario entre los puntos de contacto esenciales y algunos atributos funcionales que se buscan (por ejemplo, hidrofobicidad versus hidrofilicidad) . La afinidad de enlace aumentada para una molécula MHC o receptor de célula T también puede lograrse por tales sustituciones, comparada con la afinidad del péptido progenitor. En cualquier caso, tales sustituciones deberían emplear residuos de aminoácido u otros fragmentos moleculares seleccionados para evitar, por ejemplo, interferencia estérica y carga que pudiera desorganizar el enlace. Las sustituciones de aminoácidos son típicamente de residuos sencillos. Las sustituciones, supresiones, inserciones o cualquier combinación de las mismas puede combinarse para llegar a un péptido final. Las variantes de sustitución son aquellas en las cuales al menos un residuo de un péptido se ha eliminado y un residuo diferente se ha insertado en su lugar. Tales sustituciones se hacen generalmente de acuerdo con la siguiente Tabla 2 cuando se desea modular finamente las características del péptido. TABLA 2 Residuo original Ejemplo de Sustitución Ala Ser Arg Lys, His Asn Gln Asp Glu Cys Ser Gln Asn Glu Asp Gly Pro His Lys; A. g He Leu ; V l Leu He; Val Lys Arg; His Met Leu; He Phe Tyr; Trp Ser Thr Thr Ser Trp Tyr; Phe Tyr Trp; Phe Val lie; Leu Pro Gly Se hacen cambios sustanciales en la función (por ejemplo, afinidad por moléculas de MHC o receptores de célula T) seleccionando sustituciones que son menos conservativas que aquellas de la Tabla 2, es decir, seleccionando residuos que difieren más significativamente en su efecto para mantener (a) la estructura de la estructura principal peptidica en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de hoja o hélice y, (b) la carga o hidrofobicidad en la molécula en el sitio objetivo o (c) la masa de la cadena lateral. Las sustituciones que en general se esperan que produzcan los cambios más grandes en las propiedades del péptido serán aquellas en las cuales (a) el residuo hidrofilico, por ejemplo serilo, es sustituido oara (o por) un residuo hidrofóbico, por ejemplo ieuciio, isoieucilo, fenilalanila, valilo o alanilo; (b) un residuo que tiene una cadena lateral eléctropositiva, por ejemplo, lisio, arginilo, o histidilo, se sustituyen para (o por) un residuo electronegativo, por ejemplo, glutamilo o aspartilo; o (c) un residuo que tiene una cadena lateral voluminosa, por ejemplo fenilalanina, se sustituye para (o por) uno que no tiene un cadena lateral, por ejemplo, glicina. Los péptidos también pueden comprender isoésteres de dos o más residuos en el péptido inmunogénico. Un isoéster como se define en la presente es una secuencia de dos o más residuos que pueden sustituirse para una segunda secuencia debido a que la conformación estérica de la primera secuencia ajusta un sitio de enlace especifico para la segunda secuencia. El término incluye específicamente modificaciones de la estructura principal peptídica bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. Tales modificaciones incluyen modificaciones del nitrógeno de amida, el a-carbono, carb'onilo de amida, reposición completa del enlace amida, extensiones, supresiones o reticulaciones de la estructura principal. Véase generalmente, Spatola, Chemistry y Biochemistry of Amino Acids. peptides and Proteins, Voi. VII (Weinstein ed., 1983). Las modificaciones de los péptidos con diversos aminoácidos miméticos de aminoácidos no naturales son particularmente útiles para aumentar la estabilidad del péptido in vivo. La estabilidad puede probarse en un número de formas. Por ejemplo, se han usado peptidasas y diversos medios biológicos, tales como plasma y suero humano, para probar la estabilidad. Véase, por ejemplo, Verhoef et al., Eur. J. Drug Metab. Pharmacokin. 11 291-302 (1986) . La vida media de los péptidos de la presente invención se determina convenientemente usando una prueba de suero humano al 25"- (v/v) . El protocolo generalmente es como sigue. El suero humano reunido (Tipo AB, no inactivado por calor) se desengrasa por centrfugación antes de usarse. El suero se diluye después a 25% con medio de cultivo de tejido RPMI y se usa para probar la estabilidad del péptido. A intervalos de tiempo predeterminados se elimina una pequeña cantidad de la solución de reacción y se agrega a ácido tricloracético acuoso al 6% o etanol. La muestra de reacción turbia se enfría (4°C) durante 15 minutos y después se gira hasta formar gránulos en proteínas de suero precipitadas. La presencia de los péptidos se determina después por HPLC de fase inversa usando condiciones de cromatografía específicas de estabilidad. Los péptidos de la presente invención o análogos de los mismos que tienen actividad que estimula CTL pueden modificarse para proporcionar atributos deseados distintos a la vida media mejorada del suero. Por ejemplo, la capacidad de los péptidos para inducir actividad de CTL puede mejorarse por enlace a una secuencia que contiene al menos un epitope que es capaz de inducir una respuesta de célula asistente T. Los péptidos inmunogénicos particularmente preferidos/conjugados de asistente T se enlazan por una molécula espadadora. La espadadora está comprendida típicamente de moléculas neutras relativamente pequeñas, tales como aminoácidos o aminoácidos miméticos, que están sustancialmente no cargados bajo condiciones fisiológicas. Las espaciadoras se seleccionan típicamente a partir de, por ejemplo, Ala, Gly, u otras espaciadoras neutras de aminoácidos no polares o aminoácidos polares neutros. Se entenderá que la espadadora opcionalmente presente no necesita estar comprendida de los mismos residuos y puede ser así un hetero- u homo-oligómero . Cuando está presente, la espadadora será comúnmente de al menos uno o dos residuos, más comúnmente tres a seis residuos. Alternativamente, el péptido CTL puede enlazarse al péptido asistente T sin una espadadora . El péptido inmunogénico puede enlazarse al péptido asistente T directamente o por medio de una espadadora en el término amino o carboxi del péptido CTL. El término amino del péptido inmunogénico o el péptido asistente T pueden acilarse. Ejemplos de péptidos asistentes T incluyen toxoide de tétanos 830-843. influenza 307-319, malaria circunesporozoita 382 - 398 y 378 - 38 9 . En algunas modalidades puede ser deseable incluir en las composiciones farmacéuticas de la invención al menos un componente que ceba CTL. Los lipidos se han identificado como agentes capaces de cebar CTL in vivo en contra de antigenos virales. Por ejemplo, pueden unirse residuos de ácido palmitico a los grupos amino alfa y épsilon de un residuo Lys y después enlazarse, por ejemplo, por medio de uno o más residuos de enlace tales como Gly, Gly-Gly-, Ser, Ser-Ser, o similares, a un péptido inmunogénico. El péptido engrasado puede inyectarse después directamente en una forr.a micelar, incorporado dentro de un liposoma o emulsificado en un adyuvante, por ejemplo, adyuvante de Freund incompleto. En una modalidad preferida un inmunógeno particularmente efectivo comprende ácido palmitico unido a grupos amino alfa y épsilon de Lys, que se une por medio de enlace, por ejemplo Ser-Ser, al término amino del péptido inmunogénico. Como otro ejemplo de cebado lipido de las respuestas CTL, lipoproteinas de E. coli, tales como tripalmitoil-S-glicerilcisteinliseril-serina (P2CSS) pueden usarse para cebar CTL especifico de virus cuando se une covalentemente a un péptido apropiado. Véase, Deres et ai., Nature 342 : 561 - 564 ( 1989 ) , incorporado en la presente para referencia. Los péptidos de la invención pueden acopiarse a P3CSS, por ejemplo, y el lipopéptido administrado a un individuo para cebar específicamente una respuesta CTL al antígeno objetivo. Adicionalmente, como la inducción de anticuerpos neutralizantes también puede cebarse con P;C5S conjugado a un péptido que muestra un epitope apropiado, las dos composiciones pueden combinarse para producir más efectivamente respuestas mediadas por célula y humorales para infección. Además, los aminoácidos adicionales pueden agregarse a los términos de un péptido para proporcionar facilidad de enlazar péptidos uno con otro para acoplar un soporte portador, o péptidos más grandes, para modificar las propiedades físicas o químicas del péptido y oligopéptido, o similares. Los aminoácidos tales como tirosina, cisteína, lisina, ácido glutámico o aspártico, o similares, pueden introducirse en el término C o N del péptido u oligopéptido. La modificación en el término C en algunos casos puede alterar las características de enlace del péptido. Además, las secuencias del péptido u oligopéptido pueden diferir de la secuencia natural al ser modificada por acilación de NK; terminal, por ejemplo, por acetilación de alcanoilo (Ci-C;-) o tioglicolilo, amidación de carboxilo terminal, por ejemplo, amoníaco, metilamina, etc. En algunos casos estas modificaciones pueden proporcionar sitios para enlazarse a un soporte u otra molécula. Los péptidos de la invención pueden prepararse en una amplia diversidad de formas. Debido a su tamaño relativamente corto, los péptidos pueden sintetizarse en solución o sobre un soporte sólido de acuerdo con técnicas convencionales. Diversos sinteti adores automáticos est n comercialmente disponibles y pueden usarse de acuerdo con protocolos conocidos. Véase, por ejemplo Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2d. ed., Pierce Chemical Co. (1984), supra. Alternativamente, la tecnología de ADN recombinante puede emplearse en donde se inserta una secuencia de nucleótidos que codifican péptido inmunogénico de interés dentro de un vector de expresión, transformado o transfectado dentro de una célula huésped apropiada y cultivado bajo condiciones adecuadas para expresión. Estos procedimientos se conocen generalmente en la técnica, como se describe generalmente en Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1982), que se incorpora en la presente para reférencia. Así, las proteínas de fusión que comprenden una o más secuencias peptídicas de la invención pueden usarse para presentar el epítope de célula T apropiado. Como la secuencia de codificación para péptidos de la longitud contemplado en la presente pueden sintetizarse por técnicas químicas, por ejemplo, el método de fosfotriéster de Matteucci et al., J. Am. Chem. Scc . 103:3185 (1981), modificaciones simplemente al sustituir la o las bases apropiadas por aquellos que codifican la secuencia peptidica nativa. La sucesión de codificación puede proporcionarse después con enlazadores apropiados y ligarse dentro de vectores de expresión comúnmente disponibles en la técnica, y los vectores usados para transformar los huéspedes adecuados para producir la proteina de fusión deseada. Un número de tales vectores y sistemas de huésped adecuados están ahora disponibles. Para expresión de las proteínas de fusión, la secuencia de codificación se proporcionará con codones de inicio y alto enlazados operablemente, secciones promotoras y terminadoras y comúnmente un sistema de replicación para proporcionar un vector de expresión para expresión en el huésped celular deseado. Por ejemplo, las secuencias promotoras compatibles con huéspedes bacterianos se proporcionan en plásmidos que contienen sitios de restricción convenientes para inserción de la secuencia de codificación deseada. Los vectores de expresión resultantes se transforman en huéspedes bacterianos adecuados. Desde luego, también pueden usarse células huésped de levadura o mamífero, empleando vectores adecuados y secuencias de control . Los péptidos de la presente invención y las composiciones farmacéuticas y de vacuna de las mismas son útiles para administración a mamíferos, particularmente humanos, para tratar y/o prevenir la infección viral y el cáncer. Ejemplos de enfermedades que pueden tratarse usando los péptidos inmunogénicos de la invención incluyen cáncer de próstata, hepatitis B, hepatitis C, SIDA, carcinoma renal, carcinoma cervical, linfoma, CMV y condlyloma acuminatum. Para composiciones farmacéuticas, los péptidos inmunogénicos de la invención se administran a un individuo que ya sufre de cáncer o está infectado con el virus de interés. Aquellos en la fase de incubación o la fase aguda de la infección pueden tratarse con los péptidos inmunogénicos separadamente o junto con otros tratamientos como sea apropiado. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones se administran a un paciente en una cantidad suficiente para producir una respuesta CTL efectiva al antígeno de virus o tumor y para curar o al menos detener parcialmente los síntomas y/o complicaciones. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como "dosis terapéuticamente efectiva". Las cantidades efectivas para este uso dependerán de, por ejemplo, la composición peptidica, la forma de administración, la etapa y severidad de la enfermedad que se trata, el peso y estado general de salud del paciente, y el juicio del médico que prescribe, pero varia generalmente para la inmunización inicial (para administración terapéutica c profiláctica) de aproximadamente 1.0 .ug hasta aproximadamente 5000 g de péptido para un paciente de 70 kg, seguido por dosificaciones de empuje de aproximadamente 1.0 uc as~a aproximadamente 1000 µg de péptido en seguimiento er. régimer. de empuje durante semanas a meses dependiendo de la respuesta y condición del paciente y midiendo la actividad CTL especifica en la sangre del paciente. Debe tenerse en mente que los péptidos y composiciones de la presente invención pueden emplearse generalmente en estados afectivos serios, esto es, situaciones que amenazan la vida o que amenazan pctencialmente la vida. En tales casos, en vista de la minimización de sustancias extrañas y la naturaleza relativamente no tóxica de los péptidos, es posible y puede sentirse deseable por el médico que trata administrar exceso sustancial de estas composiciones peptidicas. Para uso terapéutico, la administración debería comenzar con el primer signo de infección viral o la detección o eliminación quirúrgica de tumores o poco después del diagnóstico en el caso de infección aguda. Esto se sigue por dosis de empuje hasta que al menos los síntomas se disminuyen y durante un periodo posteriormente. En la infección crónica, las dosis de carga seguidos por dosis de empuje pueden requerirse. El tratamiento de un individuo infectado con la composición de la invención puede precipitar la resolución de la infección en individuos infectados agudamente. Para aquellos individuos susceptible !o predispuesto) a desarrollar infección crónica las composiciones son particularmente útiles en métodos para prevenir la evolución de la infección de aguda a crónica. En donde los individuos susceptibles se identifican antes de o durante la infección, por ejemplo, como se describe en la presente, la composición puede seleccionarse para ellos, minimizando la necesidad de administración a una población más grande. Las composiciones peptidicas también pueden usarse para el tratamiento de la infección crónica y para estimular el sistema inmune para eliminar células infectadas con virus al portador. Es importante proporcionar una cantidad de péptido inmunopotenciador en una formulación y modo de administración suficiente para estimular efectivamente una respuesta de la célula T citotóxica. Así, para el tratamiento de la infección crónica, una dosis representativa está en el rango de aproximadamente 1.0 µg hasta aproximadamente 5000 µg/ de preferencia aproximadamente 5 µg a 1000 g para un paciente de 70 kg por dosis. Las dosis de inmunización-seguidas por dosis de empuje a intervalos establecidos, por ejemplo, de una a cuatro semanas, puede requerirse, posiblemente para un período prolongado de tiempo para inmunizar efectivamente un individuo. En el caso de la infección crónica, la administración debería continuar hasta que al menos los síntomas clínicos o las pruebas de laboratorio indiquen que la infección viral se ha eliminado o disminuido sustancialmente y durante un periodo posterior. Las composiciones farmacéuticas para ei tratamiento terapéutico se pretenden para administración parenteral, tópica, oral o local. Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas se administran parenteralmente, por ejemplo, intravenosamente, subcutáneamente, intradérmicamente o intramuscularmente. Asi, la invención proporciona composiciones para administración parenteral que comprender, una solución de los péptidos inmunogénicos disueitos o suspendidos en un portador aceptable, preferiblemente un portador acuoso. Puede usarse una diversidad de portadores acuosos, por ejemplo, agua, agua regulada, 0.8% de solución salina, 0.3% de glicina, ácido hialurónico y similares. Estas composiciones pueden esterilizarse por técnicas de esterilización convencionales, bien conocidas, o pueden esterilizarse por filtrado. Las soluciones acuosas resultantes pueden empacarse para uso como están o liofilizarse, combinándose la preparación liofilizada con una solución estéril antes de la administración. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables como se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes que ajustan el pH y reguladores, agentes que ajustan la tonicidad, agentes humectantes y similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monoiaurato de sorbitan, oleato de trietanolamina, etc. La concentración de los péptidos estimuladores CTL de la invención en la formulación farmacéutica puede variar ampliamente, es decir, de menos de aproximadamente 0.1';, comúnmente a o al menos aproximadamente 2% hasta tanto como 20% a 50% o más en peso, y serán seleccionados principalmente por volúmenes de fluido, viscosidades, etc., de acuerdo copel modo particular de administración seleccionado. Los péptidos de la invención también pueden administrarse por medio de liposomas que servirán para seleccionar los péptidos en un tejido particular, tales como tejido linfoide, o seleccionados selectivamente para infectar células, asi como incrementar la vida media de la composición peptidica. Los liposomas incluyen emulsiones, espumas, micelas, monocapas insolubles, cristales líquidos, dispersiones de fosfolípido, capas lamelares y similares. En estas preparaciones el péptido a ser suministrado se incorpora como parte de un liposoma, solo o junto con una molécula que se enlaza a, por ejemplo, un receptor predominante entre las células linfoides, tales como anticuerpos monoclonales que se enlazan al antíqeno CD45, o con otras composiciones terapéuticas o inmunogénicas . Asi, los liposomas llenos o decorados con un péptido deseado de la invención pueden dirigirse al sitio de las células linfoides, en donde los liposomas suministran después las composiciones peptidicas terapéuticas/ inmunogénicas seleccionadas. Los liposomas para uso en la invención se forman a partir de lípidos que forman vesícula estándar, que generalmente incluyen fosfolípidos neutros y negativamente cargados y un esterol, tal como colesterol. La selección de lípidos se dirige generalmente por consideración de, por ejemplo, tamaño de liposoma, la capacidad y estabilidad ácida de los liposomas en la corriente sanguínea. Una diversidad de métodos está disponible para preparar liposomas, como se describe en, por ejemplo, Szoka et al., Ann. Re . Biophys. Bioeng . 9:467 (1980), Patentes Norteamericanas Nos. 4,235,871, 4,501,728, 4,837,028, y 5,019,369, incorporados en la presente para referencia. Para seleccionar a las células inmunes, un ligando a ser incorporado dentro del liposoma puede incluir, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos para determinantes de la superficie celular de las células del sistema inmune deseadas. Una suspensión de liposoma que contiene un péptido puede administrarse intravenosamente, localmente, tópicamente, etc. en una dosis que varía de acuerdo con, ínter alia, la forma de administración, el péptido que se suministra, y la etapa de la enfermedad que se trata . Para composiciones sólidas, pueden usarse portadores sólidos no tóxicos convencionales que incluyen, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio, y similares. Para administración oral, una composición no tóxica farmacéuticamente aceptable se forma incorporando cualquiera de los excipientes comúnmente empleados, tales como aquellos portadores previamente listados, y generalmente 10-95% de ingrediente activo, esto es, uno o más péptidos de la invención, y de mayor preferencia a una concentración de 25%-75% . Para la administración en aerosol, los péptidcs inmunogénicos se suministran preferiblemente en forma finamente dividida junto con un tensioactivo y propelente. Los porcentajes típicos de péptidos son 0.01%-20% en peso, preferiblemente 1%-10*. El tensioactivo debe, desde luego, ser no tóxico, y preferiblemente soluble en el propelente. Representativo de tales agentes son los ésteres o ésteres parciales de ácidos grasos que contienen de 6 a 22 átomos de carbono, tales como ácido caproico, octanoic, léurico, palmitico, esteárico, linoleico, linolénico, olestérico y oleícos con un alcohol polihídrico alifático o su anhídrido cíclico. Los ésteres mezclados, tales como glicéridos mezclados o naturales pueden emplearse. El tensioactivo puede constituir 0.1¾-20% en peso de la composición, preferiblemente 0.25-5,·-. El equilibrio de la composición es ordinariamente oropélente. Un portador también puede incluirse, como se desee, como con, por ejemplo, lecitina para el suministro intranasal . En otro aspecto la presente invención se dirige a vacunas que contienen como un ingrediente activo una cantidad inmunogénicamente efectiva de un péptido inmunogénico como se describe en la presente. El o los péptidos pueden introducirse dentro de un huésped, incluyendo humanos, enlazado a su propio portador o como un homopolimero o heteropolimero de unidades peptidicas activas. Tal polímero tiene la ventaja de reacción inmunológica aumentada y, en donde se usan péptidos diferentes para elaborar el polímero, la capacidad adicional de inducir anticuerpos y/o los CTL que reaccionan con diferentes determinantes antigénicos del virus o células tumorales. Los portadores útiles son bien conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, tiroglobulina, albúminas tales como albúmina de suero humano, toxoide de tétanos, poliaminoácidos tales como poli (lisina : ácido glutámico) , influenza, proteína núcleo del virus de hepatitis B, vacuna recombinante del virus de hepatitis 3 y similares. Las vacunas también pueden contener un diluyante fisiológicamente tolerable (aceptable) tal como agua, solución salina regulada con fosfato, o solución salina, e incluyen típica y adicionalmente un adyuvante. Los adyuvantes tales como adyuvante de Freund incompleto, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, o alumbre son materiales bien conocidos en la técnica. Y, como se mencione anteriormente, las respuestas CTL pueden cebarse conjugando péptidos de la invención con lípidos, tales como P3CSS. Durante la inmunización con una composición peptidica como se describe en la presente, por medio de inyección, aerosol, oral, transdérmica u otra ruta, el sistema inmunológico del huésped responde a la vacuna produciendo grandes cantidades de los CTL específicos para el antígeno deseado, y el huésped se vuelve al menos parcialmente inmune a infección posterior, o resistencia a desarrollar la infección crónica. Las composiciones de vacuna que contienen los péptidos de la invención se administran a un paciente susceptible a o de otra forma en riesgo de infección viral o cáncer para producir una respuesta inmune en contra del antígeno y mejorar así las capacidades de respuesta inmune propias del paciente. Tal cantidad se define ser una "dosis inmünogénicamente efectiva". En este uso, las cantidades precisas dependen de nuevo del estado de salud y peso del paciente, el modo de administración, la naturaleza de la formulación, etc., pero varía en general de aproximadamente 1.0 g hasta aproximadamente 5000 ug por paciente de 7C kilogramos, más comúnmente de apro imadamente 10 µs hasta aproximadamente 500 g por 70 kg de peso corporal.

En algunos casos puede ser deseable combinar las vacunas peptidicas de la invención con vacunas que inducen respuestas a anticuerpos neutralizantes al virus de interés, particularmente a antigenos de envoltura viral. Para propósitos terapéuticos o de inmunización, ios ácidos nucleicos que codifican uno o más de los péptidos de la invención también pueden administrarse al paciente. Un número de métodos se usa convenientemente para suministrar los ácidos nucleicos al paciente. Por ejemplo, el ácido nucleico puede suministrarse directamente, como "ADN desnudo". Esta propuesta se describe, por ejemplo, en Wolff et al., Science 247:1465-1468 (1990) asi como las Patentes Norteamericanas No. 5,580,859 y 5,589,466. Los ácidos nucleicos también pueden administrarse usando un suministro balístico como se describe, por ejemplo, en la Patente Norteamericana No. 5,204,253. Las partículas comprendidas solamente de ADN pueden administrarse. Alternativamente, el ADN puede adherirse a partículas, tales como partículas de oro. Los ácidos nucleicos también pueden suministrarse en complejo a compuestos catiónicos, tales como lípidos catiónicos. Los métodos de suministro de genes mediados por lípido se describen, por ejemplo, en WO 96/18372; WC 93/24640; annino and Gould-Fogerite (1988) BioTechniquas 6 (7) : 682-691; Rose U.S. Pat No. 5, 279,833; WO 91/06309; y Felgner et al. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84: 7413-7414. Los péptidos de la invención también pueden expresarse por huéspedes virales atenuados, tales como vacuna o pustulación avícola. Esta propuesta involucra el uso del virus de la vacuna para un vector para expresar secuencias de nucleótidos se codifican los péptidos de la invención. Durante la introducción dentro de un huésped infectado aguda o crónicamente o dentro de un huésped no infectado, el virus de la vacuna recombinante expresa el péptido inmunogénico, y con eso produce una respuesta CTL del huésped. Los vectores de la vacuna y métodos útiles en los protocolos de inmunización se describen en, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 4,722,848, incorporado en la presente para referencia. Otro vector es BCG (Bacille Calmette Guerin) . Los vectores BCG se describen en Stover et al. (Nature 351:456-460 (1991) ) que se incorpora en la presente para referencia. Una amplia diversidad de otros vectores útiles para administración o inmunización terapéutica de los péptidos de la invención, por ejemplo los vectores de Salmonella typhi y similares, serán aparentes para aquellos con experiencia en la técnica a partir de la descripción de la presente. Un medio preferido para administrar ácidos nucleicos que codifican los péptidos de la invención usa construcciones de minigen que codifican epítopes múltiples de la invención. Para crear una secuencia de ADN que codifica los epítopes de CTL seleccionado (minigen) para expresión en células humanas, las secuencias de aminoácidos de los epítopes se traducen a la inversa. Una tabla de uso de codones humanos se usa para conducir la selección del codón para cada aminoácido. Estas secuencias de ADN que codificar, epítope se adjuntan directamente, creando una secuencia polipeptídica continua. Para optimizar la expresión y/o inmunogenicidad, pueden incorporarse elementos adicionales dentro del diseño del minigen. Ejemplos de secuencias de aminoácido que podrían traducirse a la inversa e incluirse en la secuencia del minigen incluyen: epítopes de linfocito T asistente, una secuencia guía (señal) , y una señal de retención de retícula endoplasmática . Además, la presentación MHC de los epítopes CTL, pueden mejorarse incluyendo secuencias de flanqueo sintéticas (por ejemplo poli-aianina) o que ocurre naturalmente adyacente a los epítopes CTL. La secuencia del minigen se convierte en ADN ensamblando oligonucleótidos que codifican las hebras más y menos del minigen. Se sintetizan oligonucleótidos (30-100 bases de largo) que se traslapan, fosforilan, purifican y templan bajo condiciones apropiadas usando técnicas bier. conocidas. Los extremos de los oligonucleótidos se unen usando T4 de ADN ligasa. Este minigen sintético, que codifica el polipéptido del epítope CTL, puede clonarse después dentro de un vector de expresión deseado. Las secuencias reguladoras estándar bien conocidas por aquellos con experiencia en la técnica se incluyen en el vector para asegurar la expresión en las células objetivo. Se requirieron diversos elementos vectoriales: un promotor con un sitio de clonación hacia el extremo 3' para la inserción del minigen; una señal de poliadenilación para la terminación de transcripción eficiente; un origen de repiicación de E. coli; y un marcador selecciónatele de E. coli (por ejemplo resistencia a ampicilina o canamicina) . Pueden usarse numerosos promotores para este propósito, ¦ por ejemplo, el promotor de citomegalovirus humano (hC V) . Véase, las Patentes Norteamericanas Nos. 5,580,359 y 5,589,466 para otras secuencias promotoras adecuadas. Pueden desearse modificaciones vectoriales adicionales para optimizar la expresión e inmunogenicidad del minigen. En algunos casos se requieren intrones para la expresión del gen eficiente y uno o más intrones que ocurren naturalmente sintéticos podrían incorporarse dentro de la región transcrita del minigen. La inclusión de secuencias de estabilización de ARNm también puede considerarse para aumentar la expresión del minigen. Se ha propuesto recientemente que las secuencias inmunoestimuladoras (ISSs o CpGs) juegan un papel en la inmunogenicidad de las vacunas de ADN. Estas secuencias podrían incluirse en el vector, fuera de la secuencia de codificación del minigen si se encuentra que mejoran la inmunogenicidad.

En algunas modalidades, puede usarse un vec'or de expresión bioistrónico , para permitir la producción de ios epítopes codificados por el minigen y una segunda proteína incluida para mejorar o disminuir la inmunogenicidad . Ejemplos de proteínas o polipéptidos que podrían mejorar beneficiosamente la respuesta inmune si se co-ex.presa incluye citocinas (por ejemplo, IL2, IL12, GM-CSF) , moléculas que inducen citocina (por ejemplo LelF) o moléculas coestimuladoras . Los epítopes asistentes (HTL) podrían unirse a señales de selección intracelular y expresarse separadamente a partir de los epítopes CTL. Esto permitiría la dirección de los epítopes HTL a un compartimiento celular diferente de los epítopes CTL. Si se requiere, esto podría facilitar més eficientemente la entrada de los epítopes HTL dentro de la ruta de MHC clase II, mejorando con eso la inducción de CTL. En contraste con la inducción de CTL, disminuir específicamente la respuesta inmune por la co-expresión de moléculas inmunosupresoras (por ejemplo TGF-ß) puede ser de beneficio en algunas enfermedades. Una vez que se selecciona un vector de expresión, el minigen se clona dentro de la región polienlazante hacia el extremo 3' del promotor. Este plásmido se transforma dentro de una cepa de E. coli apropiada, y se prepara ADN usando técnicas estándar. La orientación y secuencia de ADN del minigen, así como los otros elementos incluidos en ei vector, se confirman usando mapeo de restricción de análisis de secuencia de ADN. Las células bacterianas que albergan el plásmico correcto pueden almacenarse como un banco de células maestras, y un banco de células de trabajo. Las cantidades terapéuticas de ADN de plásmido se producen por fermentación en E. coli, seguido por purificación. Las alícuotas a partir del banco de células de trabajo se usan para inocular el medio de fermentación (tal como un Caldo Fantástico) , y se cultivan hasta saturación en matraces agitados o un bioreactor de acuerdo a técnicas bien conocidas. El ADN plásmido puede purificarse usando tecnologías de bioseparación estándar tales como resinas de intercambio aniónico de fase sólida suministrados por Quiagen. Si se requiere, puede aislarse ADN superenrollado a partir de las formas circulares y lineales abiertas usando electroforesis de gel u otros métodos. Puede prepararse ADN de plásmido purificado para inyección usando una diversidad de formulaciones. La más simple de estas es la reconstitución de ADN liofilizado en solución salina regulada con fosfato estéril (P3S) . Se ha descrito una diversidad de métodos, y las nuevas técnicas pueden volverse disponibles. Como se anotó anteriormente, ios ácidos nucleicos se formulan convenientemente con iíoidos catiónicos. Además, glicolípidos, liposomas fuscgénicos, péptidos y compuestos preferidos colectivamente, protectores, interactivos, no condensantes (PINC) también podrían formar complejo con ADN de plásmido purificado para influencias variables tales como estabilidad, dispersión intramuscular, o tráfico a órganos específicos o tipos de células. La sensibilización de la célula objetivo puede usarse como una prueba funcional para expresión y presentación de MHC Clase I de epítopes CTL codificados por minigen. El ADN plásmido se introduce dentro de una línea de células de mamífero que sea adecuada como un objetivo para pruebas de liberación de cromo CTL estándar. El método de transfección usado será dependiente de la formulación final. Puede usarse electroporacion para ADN "desnudo", mientras que los lípidos catiónicos permitan la transfección in vitro directa. Un plásmido que expresa proteína fluorescente verde (GFP) puede cotrans ectarse para permitir el enriquecimiento de células transíectadas usando distribución de células con fluorescencia activada (SACF) . Estas células se marcar, después con cromo-51 y se usan como células objetivo para líneas de CTL específicas de epítope. La citólisis, detectada por la liberación de CR51, indica la producción de la presentación MHC de epítopes CTL codificadas por minigen. La inmunogenicidad in vivo es una segunda propuesta para la prueba funcional de formulaciones de ADN de minigen.

Los ratones transgénicos que expresan moléculas MHC humanas apropiadas se inmunizan con el producto de ADN. La dosis y ruta de administración son dependientes de la formulación (por ejemplo IN para ADN en PBS, IP para ADN en complejo de lipido) . Veintiún días después de la inmunización, se cosechan los esplenocitos y se reestimulan durante una semana en la presencia de péptidos que codifican cada epitope que se prueba. Estas células efectoras (los CTL) se prueban por citólisis de células objetivo marcadas con cromo-5I cargadas de péptido usando técnicas estándar. La lisis de las células objetivo sensibilizadas a carga de MHC de péptido que corresponden a los epitopes codificados por minigen demuestran la función de la vacuna de ADN para inducción in vivo de los CTL. Los péptidos antigénicos pueden usarse para producir CTL ex vivo también. El CTL resultante, puede usarse para tratar infecciones crónicas (virales o bacterianas) o tumores en pacientes que no responden a otras formas convencionales de terapia, o que no responderán a una propuesta de vacuna peptidica de terapia. Las respuestas CTL ex vivo a un patógeno particular (agente infeccioso o antigeno de tumor) se inducen al incubar en cultivo de tejido las células precursoras CTL del paciente (CTLp) junto con una fuente de células que presentan antigeno (APC) y el péptidc inmunogénico apropiado. Después de un tiempo de incubación apropiado (típicamente 1-4 semanas) en el cual el CTLp se activa y madura y expande dentro del CTL efector, las células se infunden de regreso dentro del paciente, en donde destruirán su célula objetivo específica (una célula infectada o una célula tumoral) . Los péptidos también pueden encontrar uso como reactivos de diagnóstico. Por ejemplo, un péptido de la invención puede usarse para determinar la susceptibilidad de un individuo particular a un régimen de tratamiento que emplee el péptido o péptidos relacionados, y así puede ser de ayuda para modificar un protocolo de tratamiento existente o para determinar una prognosis para un individuo afectado. Además, los péptidos también pueden usarse para predecir qué individuos estarán en riesgo sustancial de desarrollar infección crónica. El siguiente ejemplo se presenta a manera de ilustración, no a manera de limitación. EJEMPLO 1 Se llevó a cabo el aislamiento del antígeno Clase I como se describe en las solicitudes relacionadas, anotadas anteriormente. Los péptidos naturalmente procesados se aislaron después y se secuenciaron como se describe ahí. Un motivo específico de alelo y algoritmo se determinó y las pruebas de enlace cuantitativo se llevaron a cabo. Usando los motivos identificados anteriormente para las secuencias de aminoácidos del alelo HLA- 2. i a par~ir de un número de antigenos se analizaron por la presencia ze estos motivos. La Tabla 3 proporciona los resultados de estas búsquedas. La letra "J" representa norleucina. Los ejemplos anteriores se proporcionan para ilustrar la invención pero no para limitar su alcance. Otras variantes de la invención serán fácilmente aparentes para alguien con experiencia común en la técnica y están abarcadas por las reivindicaciones anexas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes citadas en la presente se incorporan por la presente para referencia.

Tabla 3 PéDtido AA Secuen ia Fuente A*0201 17.0317 9 LQIGKQSI Flu.24 0.0130 38.0103 9 NLSLSCHAA CEA..432 0.01 10 1233.1 1 9 YLSGANLNV CEA..605V9 0.0690 1295.03 9 SMPPPGTRV P53.149M2 0.0290 1295.04 9 SLPPPGTRV P53.149L2 0.0410 1317.24 9 KTCPVQLWV P53.139 0.0069 1323.02 9 LLPENNW p53.2 V9 0.0130 1323.04 9 ALNKMFBQV P53.129B7V9 0.0260 1323. OÍS 9 KLBPVQLWV P53.139L2B3 0.1 100 1323.08 9 BLTIHY YV P53.229B1L2V9 0.0430 1323.18 10 LLPPQHL1RV P53.188L2 0.0061 1323.29 11 YMCNSSCMGGM P53.236 0.0075 1323.31 11 YLCNSSCMGGV P53.236L2V1 1 0.2300 1323.34 1 1 KLYQGSYGFRV P53.101L2V1 1 0.0620 1324.07 9 CQLAKTCPV P53.135 0.0240 1325.01 9 RLPEAAPPV P53.65L2 0.0640 1325.02 9 GLAPPQHLV p53.187V9 0.0130 1325.04 9 KMAELVHFL MAGE3.1 12M2 0.2100 Péptido A Secuencia Fuente A*0201 1325.05 9 KLAELVHFL MAGE3.1 12L2 0.2500 1326.01 9 CLLA TCPV p53. 5L2 0.0400 1326.02 9 LSQHMTEV p53.l64L2 0.0410 1326.04 9 ELAPWAPV p53.68L2V9 0.0860 1326.06 10 QLAKTCPVQV p53.136 0.0320 1326.08 9 HLTEWRRV p53.168L2 0.0180 1329.01 11 KTYQGSYGFRL 0.0028 1329.03 10 VWPYEPPEV p53.216 0.0081 1329.14 9 BQLA TBPV P53.135B1B7 0.0490 1329.15 9 BLLAKTBPV p53.135BlL2B7 0.1100 1330.01 9 QHGYVIGT CEA.78 0.0160 1330.02 9 QLIGYVIGV CEA.78L2V9 0.5300 '1330.05 9 YVCGIQNSV CEA.569 . 0.0510 1330.06 9 YLCGIQNSV CEA.569L2 0.1000 1330.07 9 ATVGIMIGV CEA.687 0.1400 1330.08 9 ALVGIMIGV CEA.687L2 0.5000 1330.09 10 VLYGPDDPTI CEA. 11 0.0170 1330.10 10 VLYGPDDPTV CEA.411V10 0.0310 1331.02 9 DLMLSPDDV p53.42V9 1331.03 9 ALMLSPDDI p53.42Al 1331.04 9 ALMLSPDDV P53.42A1V9 1331.05 9 DLMLSPA I p53.42A7 1331.06 9 DLMLSPADV p53.42A7V9 1331.07 9 DLMLSPDAI p53.42A8 1331.08 9 DL LSPDAV p53.42A8V9 38.0007 9 AILTFGSFV KSHV.89 0.0850 38.0009 9 HL DFALAV KSHV.106 0.0183 38.0015 9 ALLGSIALL KSHV.155 0.0470 38.0018 9 ALLATHAA KSHV.161 0.0490 38.0019 9 LLATELAAV KSHV.162 0.1600 38.0022 9 RLFADELAA KSHV.14 0.0150 Peptido AA Secuencia Fuente ?*020? 8.0024 9 YLSKCTLAV KSHV.65 0.2000 8.0026 9 LVYHIYSKI KSHV.153 0.0457 8.0029 9 S YLCILSA SHV.208 0.0250 8.0030 9 YLCILSALV KSHV.210 0.3500 38.0033 9 VMFSYLQSL KSHV.268 0.5000 38.0035 9 RLHVYAYSA SHV.285 0.0270 38.0039 9 GLQTLGAFV SHV.98 0.0110 38.0040 9 FVEEQMTWA KSHV.105 0.0380 38.0041 9 QMTWAQTW KSHV.109 0.0110 38.0042 9 IILDTAIFV KSHV.130 0.6800 38.0043 9 AIFVCNAFV KSHV.135 0.0910 38.0046 9 A GNRLVEA KSHV.172 0.0200 38.0047 9 LVEAC LL KSHV.176 0.0180 38.0059 9 TLSIVTFSL SHY.198 0.2200 38.0063 9 LSVLLLEV KSHV.292 0.1400 38.0064 9 LLLEV RSV SHV.296 0.0270 38.0068 9 FVSSPTLPV KSHV.78 0.0350 38.0070 9 AMLVLLAEI KSHV.281 0.0820 38.0075 9 QMARLAWEA KSHV.1116 0.0990 38.0131 10 VLAECHFMA KSHV.10 0.0730 38.0132 10 YLYHFLLSPI KSHV.27 0.1400 38.0134 10 SLFEAMLANV KSHV.49 0.9500 38.0135 10 STTGINQLGL KSHV.62 0.0710 38:0137 10 LAILTFGSFV KSHV.88 0.0160 38.0139 10 ALLGSIALLA SHV.155 0.0360 38.0141 10 ALLATELAAV SHV.161 0.1100 38.0142 10 LLATHAAVA KSHV.162 0.0110 38.0143 10 RLFADELAAL SHV.14 0.1800 38.0148 10 YLSKCTLAVL KSHV.65 0.0300 38.0150 10 LLVYHTYSKI KSHV.152 0.0130 38.0151 10 SMYLC1LSAL KSHV.208 0.0360 Péptido ?? Secuencia Fuente A*0201 8.0153 10 HLHRQMLSFV SHV.68 0.0160 8.0163 10 LLCG TGAFL KSHV.167 0.0100 8.0164 10 ETLSIVTFSL KSHV.197 0.0180 9.0063 9 VMCTYSPPL mp53.H9 1.4000 39.0065 9 KLFCQLAKT mp53.129 0.0160 39.0067 9 ATPPAGSRV mp53.146 0.0130 39.0133 10 FLQSGTAKSV mp53.110 0.0180 39.0169 10 CMDRGLTVFV SHV.311 0.0120 39.0170 10 VLLNWWRWRL KSHV.327 0.1500 40.0070 9 GVFTGLTHI HCV.1565 0.0110 40.0072 9 QMWKCLI L HCV.1611 0.0620 40.0074 9 DvíTCMSADL HCV.1650 0.0121 40.0076 9 ALAAYCLST HCV.1674 0.2500 40.0080 9 VLSG PAH HCV.1692 0.0150 40.0082 9 FISGIQYLA HCV.1773 0.1000 40.0134 10 YIMTCMSADL HCV.1649 0.0300 40.0137 10 AIASLMAFTA HCV.1791 0.0580 40.0138 10 GLAGAAIGSV HCV.1838 0.0320 41.0058 8 MIGVLVGV CEA.692 0.0120 41.0061 9 VLPLAYISL TRP1 0.0110 41.0062 9 SLGCIFFPL TRP1 0.9700 41.0063 9 PLAYISLFL TRP1 0.0220 41.0065 9 LMLFYQVWA TRPi 0.0270 41.0071 9 N1SIYNYFV TRP1 02300 41.0072 9 NISVY YFV TRPI 0.0600 41.0075 9 FVWTHYYSV TRPI 1.5000 41.0077 9 FLTWHRYHL TRPI 0.5500 41.0078 9 LTWHRYHLL TRPI 0.1600 41.0082 MLQEPSFSL TRPI 0.6900 41.0083 9 SLPYWNFAT TRP 0.0110 41.0088 9 RLPEPQDVA TRPI 0.0180 Péotido AA Secuencia Fuente ??20? 1.0090 9 VTQCLEVRV TRP1 0.0160 41.0096 9 LLHTF1DAV TRP1 0.2700 41.0100 9 NMVPFWPPV TRP1 0.6200 41.0104 9 AWGALLLV TRP1 0.0210 41.0105 9 AWAALLLV TRP1 0.0390 41.0108 9 LLVAAIFGV TRP1 1.9000 41.0112 9 SMDEANQPL TRP1 0.0770 41.0114 9 VLPLAYISV TRP1 0.1100 41.0115 9 SLGCim>V TRP1 3.2000 41.0116 9 PLAY1SLFV TRP1 0.0310 41.0117 9 LLLFQQARV TRP1 0.1100 41.0118 9 LMLFYQVWV TRP1 2.4000 41.0119 9 LLPSSGPGV T P1 0.3700 41.0121 9 NLSIYNYFV TRP1 0.9700 41.0122 9 NLSVYNYFV TRP1 0.8700 41.0123 9 FLWTHYYSV TRP1 5.6000 41.0124 9 SL KTFLGV TRPl 0.0224 41.0125 9 FLTWHRYHV TRP1 0.3800 41.0129 9 MLQEPSFSV TRP1 1.6000 41.0130 9 SLPYWNFAV TRPl 0.5700 41.0131 9 ALGKNVCDV TRP1 0.0160 41.0132 9 SLLISPNSV TRPl 0.1300 41.0133 9 SLFSQWRW TRPl 0.0740 41.0134 9 TLGTLCNSV TRPl 0.0330 41.0136 9 . RLPEPQDW TRPl 0.1000 41.0137 9 VLQCLEVRV TRPl 0.0360 41.0138 9 SLNSFRNTV TRPl 0.0140 41.0139 9 SLDSFRNTV TRPl 0.0440 41.0141 9 FLNGTGGQV TRPl 0.0220 41.0142 9 VLLHTKl'DV TRPl 0.0180 41.0145 9 ALVGALLLV TRPl 0.2600 Péptido ?? Secuencia Fuente A*0201 41.0146 9 ALVAALLLV TRJP 1 0.5800 41.0147 9 LLVALIFGV TRP1 1.0000 41.0148 9 YLIRARRSV TRP1 0.0170 41.0149 9 SMDEA QPV TR 1 0.1600 41.0151 10 SLGCIFFPLL TRP1 0.1800 41.0157 10 GMCCPDLSPV TRP1 0.0950 41.0160 10 AACNQK-LTV TRP1 0.0120 41.0162 10 FLTWHRYHLL TRP1 0.0830 41 1166 10 SLHNLAHLFL TRP1 0.3900 41.0174 10 LLLVAAIFGV TRP1 0.3000 41.0177 10 LLVAAIFGVA TRP1 0.0820 41.0178 10 ALIFGTASYL TRP1 0.0230 41.0180 10 SMDEANQPLL TRP1 0.0250 41.0181 10 LLTDQYQCYA TRP1 0.0320 41.0183 10 SLGU PLV TRP1 0.3200 41.0186 10 FLMLFYQVWV TRP1 0.8100 41.0189 10 ALCDQRVLIV TRP1 0.0530 41.0190 10 ALC QKILTV TRP1 0.0770 41.0191 10 FLTWHRYHLV TRP1 0.0510 41.0197 10 SLHNLAHLFV TRP1 0.5000 41.0198 10 NLAHLFLNGV TRP1 0.4100 41.0199 10 NMVPFWPPW TRP1 0.2800 41.0201 10 ILWAALLLV TRP1 0.0190 4i:0203 10 LLVALIFGTV TRP1 0.1200 41.0205 10 AUFGTASYV TRP1 0.0900 41.0206 10 SMDEANQPLV TKP1 0.0350 41.0207 10 LLTDQYQCYV TRP1 0.2100 41.0212 11 LLIQNHQNDT CEA.107 0.0140 41.0214 11 nQNDTGFYTL CEA.112 0.0130 41.0221 11 TLFNVTRNDTA CEA201 0.0110 41.0235 11 LTLLSVTRNDV CEA378 0.0150 PéDtido ?? Secuencia Fuente A*0201 1.0243 11 GLYTCQANNSA CEA.473 0.0290 1.0268 11 ATVGIMIGVLV CEA.687 0.0160 4.0075 11 GLVPPQHLIRV mp53.184.V3 0.0370 4.0087 11 GLAPPVHLIRV mp53.184.V6 0.0330 44.0092 11 GLAPPEHLIRV mp53.184.E6 0.1600 1227.10 9 ILIGVLVGV CEA.691.L2 0.2300 1234.26 10 YLIMVKCWMV Her2/neu.952.L2 0.3800 VIO 1295.06 9 LLGRDSFEV mp53J261 0.2000 1319.01 9 FMYSDFHFI Flu.RRP2.446 0.4400 1319.06 9 NMLSTVLGV FIu.RRP2.446 0.1700 1319.14 9 SLENFRAYV Flu.RRP2.446 0.0430 1325.06 KMAELVHFV Mage3. 12 0.1900 1325.07 KLAELVHFV Mage3.112 0.3500 1334.01 VLIQRNPQV Her2/neu.l53.V9 0.0910 1334.02 VLLGWFGV Her2/neu.665JL2 2.1000 V9 1334.03 SUSAWGV Her2 neu.653.L2 0.7000- V9 1334.04 YMUMV BWMI Her2 neu.952.B7 0.2700 1334.05 YLIMV BWMV Her2/neu.952.L2 0.6900 B7V10 1334.06 KLWEELSW Mage3.220.L2V 0.4500 o 1334.08 AMB WGLLV Her2 neu.5.M2B 0.1400 3V9 1345.01 9 DIGVLVGV CEA.691.J2 0.0570 1345.02 9 ATVGDIGV CEA.687 J6 0.1595 1345.03 9 SJPPPGTRV p53.149J2 0.0545 1345.04 10 LVFGIELJEV MAGE3.160.J8 0.7650 918.12 8 ILGFVFTL FIILMI.59 0.7900 Peptido AA Secuencia Fuente A*0201 1095.22 9 KIFGSLAFL Her2/neu 1090.01 10 YLQLVFGIEV MAGE2 1126.01 9 MMNDQLMFL PSM 1126.02 10 ALVLAGGFFL PSM 1126.03 9 WLCAGALVL PSM 1126.05 9 MVFELA SI PSM 1126.06 10 RMM DQLMFL PSM 1126.09 9 LVLAGGFFL PSM 1126.10 9 VLAGGFFLL PSM 1126.12 9 LLHETDSAV PSM 1126.14 9 LMYSLVHNL PSM 1126.16 10 QLMFLERAFI PSM 1126.17 9 L FLERAFI PSM 1126.20 10 LGSG DFEV PSM 1129.01 10 LLQERGVAYI PSM 1129.04 10 GMPEGDLVYV PSM 1129.05 10 FLDELKAENI PS 1129.08 9 ALFDIESKV PSM 1129.10 10 GLPSIPVHPI PSM II. Motivos Non-HLA-A2 La presente invención también se refiere a la determinación de motivos peptidicos específicos de alelo para subtipos de alelos MHC Clase I humano (algunas veces referidos como HLA) . Estos motivos se usan después para definir epítopes de célula T a partir de cualquier antigeno deseado, particularmente aquéllos asociados con enfermedades virales humanas, cánceres o enfermedades autoinmunes, para los cuales se conoce la secuencia de aminoácidos de ios objetivos de antigeno potencial o de autoantigeno . Pueden identificarse los epitopes sobre un número de proteínas objetivo potenciales en esta forma. Ejemplos de antígenos adecuados incluyen antígeno específico de próstata (PSA) , antígenos del núcleo y superficie de hepatitis B (HBVc, HBVs) antígenos de hepatitis C, antígenos del virus Epstein-Barr, antígenos de melanoma (por ejemplo, MAGE-1), antígenos del virus de inmunodeficiencia humana (VIH) y antígenos del virus de papiloma humano (VPH) , virus de Lassa, mycobacterium tuberculosis (MT) , p53, CEA, y Her2/neu. Los péptidos que comprende los epitopes de estos antígenos se sintetizan y se prueban después por su capacidad para enlazarse a las moléculas MHC apropiadas en pruebas que usan, por ejemplo, moléculas de clase I purificadas y péptidos radioyodonatados y/o células que expresan moléculas de clase I vacíos por, por ejemplo, tinción inmunofluorescente y microfluorimetría de flujo, pruebas de ensamble de clase I dependiente de péptido, e inhibición de reconocimiento CTL por competencia peptídica. Aquellos péptidos que se enlazan a la molécula de clase I se evalúan adicionalmente por su capacidad para servir como objetivos para los CTL derivados a partir de individuos infectados o inmunizados, así como por su capacidad para inducir respuestas CTL in vitro o in vivo que pueden dar erigen a poblaciones CTL capaces de reaccionar con células objetive viralmente infectadas o células tumoraies como agentes terapéuticos potenciales. Los antígenos de MHC clase I se codifican por ios sitios HLA-A, B, y C. Los antigenos HLA-A y B se expresan en la superficie celular a densidades aproximadamente iguales, mientras que la expresión de HLA-C es significativamente menor (tal vez tanto como 10 veces menor) . Cada uno de estos sitios tiene un número de alelos. Los motivos de enlace peptidico de la invención son relativamente específicos para cada subtipo alélico. Para vacunas basadas en péptido, los péptidos de la presente invención comprenden preferiblemente un motivo reconocido por una molécula MHC I que tiene una amplia distribución en la población humana. Puesto que los alelos MHC ocurren a diferentes frecuencias dentro de diferentes grupos étnicos y ratas, la selección del alelo MHC objetivo puede depender de la población objetivo. La Tabla 4 muestra la frecuencia de diversos alelos en los productos del sitio HLA-A entre razas diferentes. Por ejemplo, la mayoría de la población caucasoide puede cubrirse por péptidos que se enlazan a cuatro subtipos de alelo HLA-A, específicamente HLA -A2.1, Al, A3.2, y A24.1. Igualmente, la mayoría de la población asiática está abarcada con la adición de péptides que se enlazan a un quinto alelo HLA-All.2.

TABLA 4 Subtipo/Alelo A N(69^» A(54 CÍ502) Al io.i(7) 1.8(1) 27.4(138) A2.1 11.5(8) 37.0(20) 39.8(199) A2.2 10.1(7) 0 3.3(17) A2.3 1 4(1) 5-5(3) 0.8(4) . A2.4 A2.5 A3.1 1 4(1) O 0.2(0) A3.2 5.7C4) 3 5(3) 21.5(108) AU . l O 5 5(3) O Al 1.2 5.7(4) 31.4(17) 8.7(44) A1 I .3 O 3.7(2) O A23 4.3(3) 3.9(20) A24 2.9(2) 27.7(15) 15.3(77) A24.2 A24.3 A25 1 4(1) 6.9(35) A26.1 4.3(3) 9.2(5) 5.9(30) A26.2 7.2(5) 1 -0(5) A26V 3.7(2) A28.1 10.1(7) 1.6(8) A28.2 1.4(1) 7.5(38) A29.1 1.4(1) 1.4(7) A29.2 10.1(7) 1 8(1) 5.3(27) A30. 1 8.6(6) 4.9(25) A30.2 1 4(1) 0.2(1) A30.3 7-2(5) 3.9(20) A31 4.3(3) 7.4(4) 6.9(35) A32 2.8(2) 7.1(36) Aw33. 1 8.6(6) 2.5(13) Aw33.2 2.8(2) 16.6(9) 1.2(6) Aw34. 1 1 4(1) Aw34.2 14.5(10) 0.8(4) Aw36 5.9(4) Tabla compilada a partir de 3. DuPont, Immunobiology of HLA, Vol. I, Hiscocompatibility Testinc 1987, Springer-Verlag, New York 1989. * N - negroide; A = asiático; C = Caucasoide. Los números en paréntesis representan el número de individuos incluidos en los análisis. La nomenclatura usada para describir los compuestos peptidicos sigue la práctica convencional en donde el grupo amino se presenta a la izquierda (el término N) y el grupo carboxilo a la derecha (el término C) de cada residuo de aminoácido. En las fórmulas que representan las modalidades especificas seleccionadas de la presente invención, los grupos amino- y carboxilo- terminales, aunque nc específicamente mostradas, están en la forma que asumirían a valores de pH fisiológico, a menos que se especifique lo contrario. En las fórmulas de estructura de aminoácidos, cada residuo se representa generalmente por designaciones estándar de tres letras o letra sencilla. La forma L de un residuo de aminoácido se representa por una letra mayúscula sencilla o una primera letra mayúscula de un símbolo de tres letras, y la forma D para aquellos aminoácidos se representa por una letra sencilla minúscula o un símbolo de tres letras minúsculas. La glicina no tiene átomo de carbono asimétrico y se refiere simplemente como "Gly" o G. Los procedimientos usados para identificar los péptidos de la presente invención siguen general-Tiente los métodos descritos en Falk et al., Nature 351:290 (1991) que se incorpora en la presente para referencia. Brevemente, los métodos involucran el aislamiento a gran escala de moléculas de MHC clase I, típicamente por inmunoprecipitación o cromatografía de afinidad, a partir de la célula o línea de células apropiadas. Ejemplos de otros métodos para el aislamiento de la molécula MHC igualmente bien conocidos al artesano incluyen cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de lectina, exclusión de tamaño, cromatogra ía de ligandos de alto rendimiento, y una combinación de todas las técnicas anteriores. Un gran número de células con moléculas MKC definidas, particularmente moléculas MHC Clase I, se conocen y están fácilmente disponibles. Por ejemplo, las líneas de células B transformadas de EBV humanos han mostrado ser fuentes excelentes para el aislamiento preparativo de moléculas de MHC clase I y clase II. Las líneas de células bien caracterizadas están disponibles a partir de fuentes privadas y comerciales, tales como American Type Culture Collection ("Catalogue of Cell Lines and Hybridomas", 6th edition (1988) Rockville, Maryland, U.S.A.); National Institute of General Medical Sciences 1990/1991 Catalog of Cell Lines (NIGMS) Human Genetic Mutant Cell Repository, Camden, NJ; y ASHI Repository, Bingham and Women' s Hospital, 75 Francis Street, Boston, MA 02115. La Tabla 5 lista algunas líneas de células B adecuadas para uso como fuentes de aleios HLA-A. Todas estas lineas de células pueden cultivarse en lotes grandes y son por lo tanto útiles para la producción a gran escala de moléculas MHC. Alguien con experiencia reconocerá que estos son solamente ejemplos de líneas de células y que pueden emplearse en muchas otras fuentes de células. Líneas de células EBV B similares homocigotas para HLA-B y HLA-C podrían servir como fuentes para alelos HLA-B y HLA-C, respectivamente. TABLA 5 LÍNEAS DE CÉLULAS HUMANAS (FUENTES HLA-A) alelo HLA-A línea de célula B Al MAT COX (9022) STEINLIN (9087) A2.1 JY A3.2- ?? (9080) HO301 (9055)GM3107 A24.1 T3 (9107) , TISI (9042) All BVR (GM6828A WT100 (GM8602)WT52 (GM8603) En el caso típico, se usa inmunoprecipitación para aislar el alelo deseado. Puede usarse en un cierto número de los protocolos, dependiendo de la especificidad de los anticuerpos usados. Por ejemplo, los reactivos, específicos de alelo mAb pueden usarse para la purificación de afinidad de las moléculas HLA-A, HLA-B, y HLA-C . Están disponibles diversos reactivos mAb para el aislamiento de moléculas HLA-A (Tabla 6) . Así, para cada uno de los alelos HLA-A selecionables, los reactivos están disponibles que pueden usarse para el aislamiento directo de las moléculas HLA-A. Las columnas de afinidad preparadas con estos mAb usando técnicas estándar se usan exitosamente para purificar los productos de alelo HLA-A respectivos. Además de los mAb específicos de alelo, podrían usarse los mAb anti-HLA-A, B, C, ampliamente reactivos, tales como W6/32 y B9.12.1, y un mAb Bl.23.2 de anti-HLA-3, C, en protocolos de purificación de afinidad alternativo como se describe en la sección de ejemplo posterior. TABLA 6 REACTIVOS DE ANTICUERPOS anti-HLA Nombre HLA-A1 12/18 HLA-A3 GAPA3 (ATCC, H3122) HLA-11,2 .1 A11.1M (ATCC, HB164) 6 / HLA-A, B, C W6/32 (ATCC, HB9 monomórfico B9.12.1 (INSERM-CNRS HLA-B, C B .1.23.2 ( INSERM-CNRS ) monomórfico Los péptidos enlazados al surco de enlace peptídico de las moléculas MHC aisladas se eluyen típicamente usando tratamiento ácido. Los péptidos también pueden disociarse a partir de moléculas de Clase I por una diversidad de medios de desnaturaliza estándar, tales como calor, pH, detergentes, sales, agentes caotrópicos, o una combinación de los mismos. Las fracciones peptídicas se separan adicionalmente de las moléculas MHC por cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (HPLC) y su secuenciado. Los péptidos pueden separarse bien por una diversidad de otros medios estándar bien conocidos al artesano, que incluyen filtración, ultrafiltración, electroforesis, cromatografía por tamaño, precipitación con anticuerpos específicos, cromatografía de intercambio iónico, isoelectroenfoque, y similares . La secuenciación de los péptidos aislados puede realizarse de acuerdo con técnicas estándar tales como degradación de Edman (Hunkapiller, M.W., et al., Merhods Enzymol . 91, 399

[1983]). Otros métodos adecuados para secuenciación incluyen secuenciación de espectrometría de masa de péptidos individual como se describió previamente (Hunt, et al., Science 225:1261 (1992), que se incorporan en la presente para referencia) . La secuenciación de aminoácidos de péptidos heterogéneos en masa (por ejemplo, fracciones HPLC reunidas) a partir de diferentes moléculas de clase I revela típicamente un motivo de secuencia característico para cada alelo de clase I. La definición de los motivos específicos para diferentes alelos de clase I permite la identificación de epítopes peptídicos potencial a partir de una proteína antigénica cuya secuencia de aminoácidos se conoce. Típicamente, la identificación de los epítopes peptídicos potenciales se lleva a cabo inicialmente usando una computadora para examinar la secuencia de aminoácidos de un antígeno deseado por la presencia de motivos. Las secuencias epitópicas se sintetizan después. La capacidad de enlazar moléculas de clase MHC se mide en una diversidad de formas diferentes. Un medio es una prueba de enlace de molécula de Clase I como se describe en las solicitudes relacionadas, anotadas anteriormente. Otras alternativas descritas en la literatura incluyen la inhibición de la presentación del antígeno (Sette, et al., J. Immunol. 141:3893 (1991), pruebas de ensamble in vitro (Townsend, et al., Cell 62:285 (1990), y pruebas basadas en FACS usando células mutadas, tales como RMA.S (Melief, et al., Eur. J. Immunol. 21:2963 (1991)). Después, los péptidos que dan positivo en la prueba de enlace MHC clase I se prueban por la capacidad de los péptidos para inducir respuestas CTL especificas in vitrc. Por ejemplo, las células que presentan antigeno que se han incubado con un péptido pueden probarse por la capacidad para inducir respuestas CTL en poblaciones de células que responden. Las células que presentan antigeno pueden ser células' normales tales como células mononucleares de sangre periférica o células dendriticas (Inaba, et al., J. Exp. Med. 166:182 (1987); Boog, Eur. J. Immunol . 18:219

[1988]). Alternativamente, las lineas de células de mamífero muíante que son deficientes en su capacidad para cargar moléculas de clase I con péptidos internamente procesados, tales como las líneas de células de ratón RMA-S (Karre, et al.. ature, 319:675 (1986); Ljunggren, et al., Eur. J. Immunol . 21:2963-2970 (1991)), y el híbrido de célula T somática humana, T-2 (Cerundolo, et al., Nature 345:449-452 (1990)), y que se han transfectado con los genes de clase I humanos apropiados se usan convenientemente, cuando se agrega péptido a los mismos, para probar para la capacidad del péptido para inducir respuestas CTL primarias in vitro. Otras líneas de células eucarióticas que podrían usarse incluyen diversas líneas de células de insectos tales como larva de mosquito (líneas de células ATCC CCL 125, 126, 1660, 1591, 6585, 6586), gusano de seda (ATTC CRL 8851), gardama (ATCC CRL 1711), polilla (ATCC CCL 80) y líneas de células de Drosophila tales como lineas de célula de Schneider (véase Schneider J . Embryol. Exp . Morphol. 27 : 353- 365 [ 1927 ] ) . Los linfocitos de sangre periférica se usan convenientemente siguiendo venipuntura o leucaféresis simple de donadores normales o pacientes y se usan como las fuentes de células que responden de precursores CTL. En una modalidad, las células que presentan antigeno apropiadas se incuban con 10- 100 µ de péptido libre de suero durante 4 horas bajo condiciones de cultivo apropiadas. Las células que presentan antigeno cargadas de péptido se incuban después corlas poblaciones de células que responden in vitro durante 7 a 10 días bajo condiciones de cultivo optimizadas. La activación CTL positiva puede determinarse probando los cultivos por la presencia de los CTL que destruyen las células objetivos radiomarcadas, objetivos pulsados de péptido especifico, asi como células objetivo que expresan la forma endógenamente del antigeno de virus o tumor relevante a partir del cual se derivó la secuencia peptidica. La especificidad y restricción de MHC del CTL se determina probando en contra de diferentes células objetivo peptidicas que expresan MHC I humano apropiada o inapropiada. Los péptidos que dan positivo en las pruebas de enlace MHC dan origen a respuestas CTL especificas se refieren en la presente como péptidos inmunogénicos . Los péptidos inmunogénicos pueden prepararse sintéticamente, o por tecnología de ADN recombinante o a partir de fuentes naturales tales como virus o tumores completos. Aunque el péptido estará preferible y sustancialmente libre de otras proteínas celulares huésped que ocurren naturalmente y fragmentos de las mismas, en algunas modalidades los péptidos pueden conjugarse sintéticamente con fragmentos o partículas nativas. Los polipéptidos o péptidos pueden ser una diversidad de longitudes, en sus formas neutras no cargadas) o en formas que son sales y libres de modificaciones, tales como glicosilación, oxidación de cadena lateral, o fosforilación, o conteniendo estas modificaciones, se acepta la condición de que la modificación no destruya la actividad biológica de los polipéptidos como se describen en la presente. Deseablemente, el péptido será tan pequeño como sea posible manteniendo a la vez sustancialmente toda la actividad biológica del péptido grande. Cuando sea posible, puede ser deseable optimizar péptidos de la invención a una longitud de 9 ó 10 residuos de aminoácido, proporcionar el tamaño con péptidos virales endógenamente procesados o péptidos de célula tumoral que se enlazan a moléculas de KC clase I sobre la superficie celular. Los péptidos que tienen la actividad deseada pueden modificarse como sea necesario para proporcionar los algunos atributos deseados, por ejemplo, mejoradas características farmacológicas, aumentando a la vez o reteniendo al menos sustancial ente toda la actividad biológica del péptido no modificado para enlazar la molécula MHC deseada y activar la célula T apropiada. Por ejemplo, los péptidos pueden someterse a diversos cambios, tales como sustituciones conservativas o no conservativas, en donde tales cambios tuvieron proporcionadas ventajas en su uso, tales como mejorado enlace MHC. Por sustituciones conservativas se quiere decir reemplazar un residuo de aminoácido con otro que sea biológicamente y/o químicamente similar, por ejemplo, un residuo hidrofóbico por otro, o un residuo polar por otro. Las sustituciones incluyen combinaciones tales como Gly, Ala; Val, lie, Leu, Met; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; y Phe, Tyr. El efecto de sustituciones de aminoácido sencillo pueden sondearse usando D-aminoácido . Tales modificaciones pueden hacerse en procedimientos de síntesis peptídica bien conocidos, como se describe en, por ejemplo, Merrifield, Science 232:341-347 (1986), Barany and Merrifield, The Peptides, Gross and Meienhofer, eds . (N.Y., Academic Press), pp. 1-284 (1979); y Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, (Rockford, 111., Pierce), 2d Ed. (1934), incorporados para referencia en la presente. Los péptidos también pueden modificarse aumentando o disminuyendo la secuencia de aminoácidos del contexto, por ejemplo, por la adición o supresión de aminoácidos. Les péptidos o análogos de la invención también pueden modificarse alterando el orden o composición de algunos residuos, siendo fácilmente apreciado que algunos residuos de aminoácidos esenciales para la actividad biológica, por ejemplo, aquellos en sitios de contacto críticos o residuos conservados, no pueden alterarse generalmente sin un efecto adverso en la actividad biológica. Los aminoácidos no críticos no necesitan limitarse a aquellos que ocurren naturalmente en las proteínas, tales como 1-a-aminoácidos o sus D-isómeros, pero pueden incluir aminoácidos no naturales también, tales como ß-?-d aminoácidos, también como muchos derivados de L-a aminoácidos . Típicamente, se emplea una serie de péptidos con sustituciones de aminoácidos sencillas para determinar el efecto de carga electrostática, hidro obicidad, etc. en el enlace. Por ejemplo, una serie de sustituciones de aminoácidos positivamente cargados (por ejemplo, Lys o Arg) o negativamente cargado (por ejemplo, Glu) se hacen a lo largo de la longitud del péptido revelando diferentes patrones de sensibilidad hacia diversas moléculas MHC y receptores de célula T. Además, pueden emplearse múltiples sustituciones que usan porciones relativamente neutras, pequeñas, tales como Ala, Gly, Pro, o residuos similares . Las sustituciones pueden ser homo-oligómeros o hetero-oligómeros . El número y tipo de residuos que se sustituyen o agregan dependen del espaciamiento necesario entre los puntos de contacto esenciales y algunos atributos funcionales que se buscan (por ejemplo, hidrofobicidad versus hidrofilicidad) . La afinidad de enlace aumentada para una molécula MHC o receptor de célula T también puede lograrse por tales sustituciones, en comparación a la afinidad del péptido progenitor. En cualquier caso, tales sustituciones deben emplear residuos de aminoácido u otros fragmentos moleculares seleccionados para evitar, por ejemplo, interferencia estérica y de carga que pudieran desorganizar el enlace. Las sustituciones de aminoácidos son típicamente de residuos sencillos. Las sustituciones, supresiones, inserciones o cualquier combinación de las mismas puede combinarse para llegar a un péptido final. Las variantes de sustitución son aquellas en las cuales al menos un residuo de un péptido se ha eliminado y un residuo diferente se ha insertado en su lugar. Tales sustituciones se hacen generalmente de acuerdo con la siguiente Tabla 2 cuando se desea modular finamente las características del péptido. TABLA 2 Residuo original Ejemplo de Sustitución Ala Ser Arg Lys, His Asn Gln Asp Glu Cys Ser Glu Asp Gly Pro His Lys; Arg Ile Leu; Val Leu lie; Val Lys Arg; His Met Leu; lie Phe Tyr; Trp Ser Thr Thr Ser Trp Tyr; Phe Tyr Trp; Phe Val lie; Leu Pro Gly Se hacen cambios sustanciales en la función (por ejemplo, afinidad por moléculas de HC o receptores de célula T) seleccionando sustituciones que son menos conservativas que aquellas de la Tabla 2, es decir, seleccionando residuos que difieren más significativamente en su efecto para mantener (a) la estructura de la estructura principal peptídica en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de hoja o hélice, (b) la carga o hidrofobicidatí en la molécula en el sitio objetivo o (c) la masa de la cadena lateral. Las sustituciones que en general se esperan que produzcan los cambios más grandes en las propiedades del péptido serán aquellas en las cuales (a) el residuo hidrofílico, por ejemplo serilo, es sustituido para (o por) un residuo hidrofóbico, por ejemplo leucilo, isoleucilo, fenilalanila, valilo o alanilo; (b) un residuo que tiene una cadena lateral eléctropositiva, por ejemplo, lisio, arginilo, o histidilo, se sustituyen para (o por) un residuo electronegativo, por ejemplo, glutamilo o aspartilo; o (c) un residuo que tiene una cadena lateral voluminosa, por ejemplo fenilalanina, se sustituye para (o por) uno que no tiene un cadena lateral, por ejemplo, glicina. Los péptidos también pueden comprender isoésteres de dos o más residuos en el péptido inmunogénico . Un isoéster como se define en la presente es una secuencia de dos o más residuos que pueden sustituirse para una segunda secuencia debido a que la conformación estérica de la primera secuencia ajusta un sitio de enlace especifico para la segunda secuencia. El término incluye específicamente modificaciones de la estructura principal peptidica bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. Tales modificaciones incluyen modificaciones del nitrógeno de amida, el a-carbono, carbonilo de amida, reposición completa del enlace amida, extensiones, supresiones o reticulaciones de la estructura principal. Véase generalmente, Spatola, Chemistry y Biochemistry of Amino Acids . peptides and Proteins, Voi . VII (Weinstein ed. , 1983) . Las modificaciones de los péptidos con diversos aminoácidos miméticos de aminoácidos no naturales son particularmente útiles para aumentar la estabilidad del péptido in vivo. La estabilidad puede probarse en un número de formas. Por ejemplo, se han usado peptidasas y diversos medios biológicos, tales como plasma y suero humano, para probar la estabilidad. Véase, por ejemplo, Verhoef et al-, Eur. J. Drug Metab. Pharmacokin. 11:291-302 (1986). La vida media de los péptidos de la presente invención se determina convenientemente usando una prueba de suero humano al 25% (v/v) . El protocolo generalmente es como sigue. El suero humano reunido (Tipo AB, no inactivado por calor) se desengrasa por centrfugación antes de usarse. El suero se diluye después a 25% con un medio de cultivo de tejido RPMI y se usa para probar la estabilidad del péptido. A intervalos de tiempo predeterminados se elimina una pequeña cantidad de la solución de reacción y se agrega a ácido tricloracético acuoso al 6% o etanol. La muestra de reacción turbia se enfria (4°C) durante 15 minutos y después se gira hasta formar grénulos en proteínas de suero precipitadas. La presencia de los péptidos se determina después por HPLC de fase inversa usando condiciones de cromatografía específicas de estabilidad.

Los péptidos de la presente invención o análogos de los mismos que tienen actividad que estimula CTL pueder. modificarse para proporcionar atributos deseados distintos a la vida media mejorada del suero. Por ejemplo, la capacidad de los péptidos para inducir actividad de CTL puede mejorarse por enlace a una secuencia que contiene al menos un epitope que es capaz de inducir una respuesta de célula asistente T. Los péptidos inmunogénicos particularmente preferidos/conjugados de asistente T se enlazan por una molécula espaciadora. La espadadora esté comprendida típicamente de moléculas neutras relativamente pequeñas, tales como aminoácidos o aminoácidos miméticos, que están sustancialmente no cargados bajo condiciones fisiológicas. Las espaciadoras se seleccionan típicamente a partir de, por ejemplo, Ala, Gly, u otras espaciadoras neutras de aminoácidos no polares o aminoácidos polares neutros. Se entenderá que la espaciadora opcionalmente presente no necesita estar comprendida de los mismos residuos y puede ser así un hetero- u omo-oligómero . Cuando está presente, la espaciadora será comúnmente de al menos uno o dos residuos, más comúnmente tres a seis residuos. Alternativamente, el péptido CTL puede enlazarse al péptido asistente T sin una espaciadora. El péptido inmunogénico puede enlazarse al péptido asistente T directamente o por medio de una espaciadora en el término amino o carboxi del péptido CTL. El término amino del péptido inmunogénico o el péptido asistente 7 pueder. acilarse. Ejemplos de péptidos asistentes T incluyen toxoide de tétanos 830-843. influenza 307-319, -alaria circunesporozoita 382-398 y 378-389. En algunas modalidades puede ser deseable incluir en las composiciones farmacéuticas de la invención ai menos un componente que ceba CTL. Los lipidos sé han identificado como agentes capaces de cebar CTL in vivo en contra de antigenos virales. Por ejemplo, pueden unirse residuos de ácido palmitico a los grupos amino alfa y épsilon de un residuo Lys y después enlazarse, por ejemplo, por medio de uno o más residuos de enlace tales como Gly, Gly-Gly-, Ser, Ser-Ser, o similares, a un péptido inmunogénico. El péptido engrasado puede inyectarse después directamente en una forma micelar, incorporado dentro de un liposoma o emulsificado en un adyuvante, por ejemplo, adyuvante de Freund incompleto. En una modalidad preferida un inmunógeno particularmente efectivo comprende ácido palmitico unido a grupos amino alfa y épsilon de Lys, que se une por medio de enlace, por ejemplo Ser-Ser, al término amino del péptido inmunogénico. Como otro ejemplo de cebado lipido de las respuestas CTL, lipoproteinas de E. coli, tales como tripalmitoil-S-glicerilcisteinliseril-serina (P3CSS) pueden usarse para cebar CTL especifico de virus cuando se une covalentemente a un péptido apropiado. Véase, Deres et ai., Nature 342:561-564 (1989), incorporado en la presente para referencia. Los péptidos de la invención pueden acoplarse a PJCSS, por ejemplo, y el lipopéptido administrado a un individuo para cebar específicamente una respuesta CTL ai antígeno objetivo. Adicionalmente, como la inducción de anticuerpos neutralizantes también puede cebarse con P'CSS conjugado a un péptido que muestra un epítope apropiado, las dos composiciones pueden combinarse para producir más efectivamente respuestas mediadas por célula y humorales para infección. Además, los aminoácidos adicionales pueden agregarse a los términos de un péptido para proporcionar facilidad de enlazar péptidos uno con otro, para acoplar un soporte portador, o péptidos más grandes, para modificar las propiedades físicas o químicas del péptido y oligopéptido, o similares. Los aminoácidos tales como tirosina, cisteína, lisina, ácido glutámico o aspártico, o similares, pueden introducirse en el término C o N del péptido u oligopéptido. La modificación en el término C en algunos casos puede alterar las características de enlace del péptido. Además, las secuencias del péptido u oligopéptido pueden diferir de la secuencia natural al ser modificada por acilación de NH: terminal, por ejemplo, por acetilación de alcanoilo (C.-Cr-) o tioglicolilo, amidación de carboxilo terminal, por ejemplo, amoníaco, metilamina, etc. En algunos casos estas modificaciones pueden proporcionar sitios para enlazarse a ur. soporte u otra molécula. Los péptidos de la invención pueden prepararse en una amplia diversidad de formas. Debido a su tamaño relativamente corto, los péptidos pueden sintetizarse en solución o sobre un soporte sólido de acuerdo con técnicas convencionales. Diversos sintetizadores automáticos están comercialmente disponibles y pueden usarse de acuerdo cor-protocolos conocidos. Véase, por ejemplo Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2d. ed., Pierce Chemical Co. (1984), supra. Alternativamente, la tecnología de ADN recombinante puede emplearse en donde se inserta una secuencia de nucleótidos que codifican péptido inmunogénico de interés dentro de un vector de expresión, transformado o transfectado dentro de una célula huésped apropiada y cultivado bajo condiciones adecuadas para expresión. Estos procedimientos se conocen generalmente en la técnica, como se describe generalmente en Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1982), que se incorpora en la presente para referencia. Así, las proteínas de fusión que comprenden una o más secuencias peptídicas de la invención pueden usarse para presentar el epitope de célula T apropiado. 32 Como la secuencia de codificación para pépticos de la longitud contemplado en la presente pueden sintetizarse por técnicas químicas, por ejemplo, el método de fosfotriéster de Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc. 103:3135 (1981), la modificación puede hacerse simplemente ai sustituir la o las bases apropiadas por aquellos que codifican la secuencia peptídica nativa. La sucesión de codificación puede proporcionarse después con enlazadores apropiados y ligarse dentro de vectores de expresión comúnmente disponibles en la técnica, y los vectores usados para transformar los huéspedes adecuados para producir la proteína de fusión deseada. Un número de tales vectores y sistemas de huésped adecuados están ahora disponibles. Para expresión de las proteínas de fusión, la secuencia de codificación se proporcionará con codones de inicio y alto enlazados operablemente, secciones promotoras y terminadoras y comúnmente un sistema de replicación para proporcionar un vector de expresión para expresión en el huésped celular deseado. Por ejemplo, las secuencias promotoras compatibles con huéspedes bacterianos se proporcionan en plásmidos que contienen sitios de restricción convenientes para inserción de la secuencia de codificación deseada. Los vectores de expresión resultantes se transforman en huéspedes bacterianos adecuados. Desde luego, también pueden usarse células huésped de levadura o mamífero, empleando vectores adecuados y secuencias de control. Los péptidos de la presente invención y las composiciones farmacéuticas y de vacuna de las mismas son útiles para administración a mamíferos, particularmente humanos, para tratar y/o prevenir la infección viral y el cáncer. Ejemplos de enfermedades que pueden tratarse usando los péptidos inmunogénicos de la invención incluyen cáncer de próstata, hepatitis B, hepatitis C, SIDA, carcinoma renal, carcinoma cervical, linfoma, CMV y condlyloma acuminatum. Para composiciones farmacéuticas, los péptidos inmunogénicos de la invención se administran a un individuo que ya sufre de cáncer o está infectado con el virus de interés. Aquellos en la fase de incubación o la fase aguda de la infección pueden tratarse con los péptidos inmunogénicos separadamente o junto con otros tratamientos como sea apropiado. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones se administran a un paciente en una cantidad suficiente para producir una respuesta CTL efectiva al antígeno de virus o tumor y para curar o al menos detener parcialmente los síntomas y/o complicaciones. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como "dosis terapéuticamente efectiva". Las cantidades efectivas para este uso dependerán de, por ejemplo, la composición peptídica, la forma de administración, la etapa y severidad de la enfermedad que se trata, el peso y estado general de salud del paciente, y el juicio del médico que prescribe, pero varia generalmente para la inmunización inicial (para administración terapéutica c profiláctica) de aproximadamente 1.0 g hasta aproximadamente 5000 g de péptido para un paciente de 70 kg, seguido por dosificaciones de empuje de aproximadamente 1.0 ug hasta aproximadamente 1000 µg de péptido en seguimiento en régimen-de empuje durante semanas a meses dependiendo de la respuesta y condición del paciente y midiendo la actividad CTL específica en la sangre del paciente. Debe tenerse en mente que los péptidos y composiciones de la presente invención-pueden emplearse generalmente en estados afectivos serios, esto es, situaciones que amenazan la vida o que amenazan potencialmente la vida. En tales casos, en vista de la minimización de sustancias extrañas y la naturaleza relativamente no tóxica de los péptidos, es posible y puede sentirse deseable por el médico que trata administrar exceso sustancial de estas composiciones peptidicas. Para uso terapéutico, la administración debería comenzar con el primer signo de infección viral o la detección o eliminación quirúrgica de tumores o poco después del diagnóstico en el caso de infección aguda. Esto se sigue por dosis de empuje hasta que al menos los síntomas se disminuyen y durante un período posteriormente. En la infección crónica, las dosis de carga seguidos por dosis de empuje pueden requerirse.

El tratamiento de un individuo infectado ccn la composición de la invención puede precipitar la resolución ce la infección en los individuos infectados agudamente. Para aquellos individuos susceptible (o predispuesto) a desarrollar infección crónica, las composiciones son-particularmente útiles en métodos para prevenir la evolución de la infección de aguda a crónica. En donde los individuos susceptibles se identifican antes de o durante la infección, por ejemplo, como se describe en la presente, la composición puede seleccionarse para ellos, minimizando la necesidad de administración a una población más grande. Las composiciones peptidicas también pueden usarse para el tratamiento de la infección crónica y para estimular el sistema inmune para eliminar células infectadas con virus en portadores. Es importante proporcionar una cantidad de péptido inmunopotenciador en una formulación y modo de administración suficiente para estimular efectivamente una respuesta de la célula T citotóxica. Asi, para el tratamiento de la infección crónica, una dosis representativa est en el rango de aproximadamente 1.0 g hasta aproximadamente 5000 µg, de preferencia aproximadamente 5 g a 1000 µg para un paciente de 70 kg por dosis. Las dosis de inmunización seguidas por dosis de empuje a intervalos establecidos, por ejemplo, de una a cuatro semanas, puede requerirse, posiblemente durante un periodo prolongado de tiempo para inmunizar efectivamente un individuo. En el caso de la infección crónica, la administración debería continuar hasta que al menos los síntomas clínicos o las pruebas de laboratorio indiquen que la infección viral se ha eliminado o disminuido sustancialmente y durante un período posterior. Las composiciones farmacéuticas para el tratamiento terapéutico se pretenden para administración parenterai, tópica, oral o local. Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas se administran parenteralmente, por ejemplo, intravenosamente, subcutáneamente, intradérmicamente o intramuscularmente . Así, la invención proporciona composiciones para administración parenteral que comprenden una solución de los péptidos inmunogénicos disueltos o suspendidos en un portador aceptable, preferiblemente un portador acuoso. Puede usarse una diversidad de portadores acuosos, por ejemplo, agua, agua regulada, 0.8% de solución salina, 0.3% de glicina, ácido hialurónico y similares. Estas composiciones pueden esterilizarse por técnicas de esterilización convencionales, bien conocidas, o pueden esterilizarse por filtrado. Las soluciones acuosas resultantes pueden empacarse para uso como estén, o liofilizarse, combinándose la preparación liofilizada con una solución estéril antes de la administración. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables como se requiera para 37 aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales ccir.c agentes que ajustan el pH y reguladores, agentes que ajustaría tonicidad, agentes humectantes y similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, clorure de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitan, oleato de trietanolamina, etc. La concentración de los péptidos estimuladores CTL de la invención en la formulación farmacéutica puede variar ampliamente, es decir, de menos de aproximadamente 0.1¾, comúnmente a o al menos aproximadamente 2% hasta tanto come 20% a 50% o más en peso, y serán seleccionados principalmente por volúmenes de fluido, viscosidades, etc., de acuerdo copel modo particular de administración seleccionado. Los péptidos de la invención también pueden administrarse por medio de liposomas que servirán para seleccionar los péptidos en un tejido particular, tales como tejido linfoide, o seleccionados selectivamente para infectar células, asi como incrementar la vida media de la composición peptídica. Los liposomas incluyen emulsiones, espumas, micelas, monocapas insolubles, cristales líquidos, dispersiones de fosfolípido, capas lamelares y similares. En estas preparaciones el péptido a ser suministrado se incorpora como parte de un liposoma, solo o junto con una molécula que se enlaza a, por ejemplo, un receptor predominante entre las células linfoides, tales co o 38 anticuerpos monoclonales que se enlazan al antigeno CD45, o con otras composiciones terapéuticas o in unogénicas . Asi, los liposomas llenos o decorados con un péptido deseado de la invención pueden dirigirse al sitio de las células linfoides, en donde los liposomas suministran después las composiciones peptidicas terapéuticas/inmunogénicas seleccionadas. Los liposomas para uso en la invención se forman a partir de lipidos que forman vesícula estándar, que generalmente incluyen fosfolípidos neutros y negativamente cargados y un esterol, tal como colesterol. La selección de lipidos se dirige generalmente por consideración de, por ejemplo, tamaf¿o de liposoma, la capacidad y estabilidad acida de los liposomas en la corriente sanguínea. Una diversidad de métodos está disponible para preparar liposomas, como se describe en, por ejemplo, Szoka et al., Ann. Rev. Biophys . Bioeng. 9:467 (1980), Patentes Norteamericanas Nos. 4,235,871, 4, 501,728, 4, 837, 028, y 5, 019, 369, incorporados en la presente para referencia. Para seleccionar a las células inmunes, un ligando a ser incorporado dentro del liposoma puede incluir, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos para determinantes de la superficie celular de las células del sistema inmune deseadas. Una suspensión de liposoma que contiene un péptido puede administrarse intravenosamente, localmente, tópicamente, etc. en una dosis que varía de acuerdo con, ínter alia, la forma de administración, e_ péptido que se suministra, y la etapa de la enfermedad que se trata . Para composiciones sólidas, pueden usarse portadores sólidos no tóxicos convencionales que incluyen, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio, y similares. Para administración oral, una composición no tóxica farmacéuticamente aceptable se forma incorporando cualquiera de los excipientes comúnmente empleados, tales como aquellos portadores previamente listados, y generalmente 10-95% de ingrediente activo, esto es, uno o más péptidos de la invención, y de mayor preferencia a una concentración de 25%-75%. Para la administración en aerosol, los péptidos inmunogénicos se suministran preferiblemente en forma finamente dividida junto con un tensioactivo y propelente. Los porcentajes típicos de péptidos son 0.01 -20% en peso, preferiblemente 1 -10 . El tensioactivo debe, desde luego, ser no tóxico, y preferiblemente soluble en el propelente. Representativo de tales agentes son los ésteres o esteres parciales de ácidos grasos que contienen de 6 a 22 átomos de carbono, tales como ácido caproico, octanoico, léurico, palmítico, esteárico, linoleico, linolénico, olestérico y oleicos con un alcohol polihídrico alifático o su anhídrido cíclico. Los ásteres mezclados, tales como glicéridos mezclados o naturales pueden emplearse. El tensioactivo puede constituir O.li-20% en peso de la composición, preferiblemente 0.25-5%. El equilibrio de la composición es ordinariamente propelente. Un portador también puede incluirse, como se desee, como con, por ejemplo, lecitina para el suministro intranasal. En otro aspecto la presente invención se dirige a vacunas que contienen como un ingrediente activo una cantidad inmunogénicamente efectiva de un péptido inmunogénico como se describe en la presente. El o los péptidos pueden introducirse dentro de un huésped, incluyendo humanos, enlazado a su propio portador o como un homopolímero o heteropolímero de unidades peptídicas activas. Tal polímero tiene la ventaja de reacción inmunológica aumentada y, en donde se usan péptidos diferentes para elaborar el polír.erc, la capacidad adicional de inducir anticuerpos y/o los CTL que reaccionan con diferentes determinantes antigénicos del virus o células tumorales. Los portadores útiles son bien conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, tiroglobulina, albúminas tales como albúmina de suero humano, toxoide de tétanos, poliaminoácidos tales como poli (lisina ácido glutámico) , influenza, proteína núcleo del virus de hepatitis B, vacuna recombinante del virus de hepatitis B y similares.

Las vacunas también pueden contener un diiu ente fisiológicamente tolerable (aceptable) tai como agua, solución salina regulada con fosfato, o solución salina, e incluyen típica y adicionalmente un adyuvante. Los adyuvantes tales como adyuvante de Freund incompleto, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, o alumbre son materiales bien conocidos en la técnica. Y, como se mencionó anteriormente, las respuestas CTL pueden cebarse conjugando péptidos de la invención con lípidos, tales como PiCSS. Durante la inmunización con una composición peptídica como se describe en la presente, por medio de inyección, aerosol, oral, transdérmica u otra ruta, el sistema in unológico del huésped responde a la vacuna produciendo grandes cantidades de los CTL específicos para el antígeno deseado, y el huésped se vuelve al menos parcialmente inmune a infección posterior, o resistencia a desarrollar la infección crónica. Las composiciones de vacuna que contienen íes péptidos de la invención se administran a un paciente susceptible a o de otra forma en riesgo de infección viral o cáncer para producir una respuesta inmune en contra del antígeno y mejorar así las capacidades de respuesta inmune propias del paciente. Tal cantidad se define que es ur.a "dosis inmunogénicamente efectiva". En este uso, las cantidades precisas dependen de nuevo del estado de salud y peso del paciente, el modo de administración, la naturaleza de la formulación, etc., pero varia en general ae aproximadamente 1.0 µg hasta aproximadamente 5000 µa por paciente de 70 kilogramos, más comúnmente de aproximadamente 10 µg hasta aproximadamente 500 µg por 70 kg de peso corporal . En algunos casos puede ser deseable combinar las vacunas peptidicas de la invención con vacunas que inducen respuestas a anticuerpos neutralizantes al virus de interés, particularmente a antigenos de envoltura viral. Para propósitos terapéuticos o de inmunización, los ácidos nucleicos que codifican uno o más de los péptidos de la invención también pueden administrarse al paciente. Un número de métodos se usa convenientemente para suministrar los ácidos nucleicos al paciente. Por ejemplo, el ácido nucleico puede suministrarse directamente, como "ADN desnudo". Esta propuesta se describe, por ejemplo, en Wolff et ai., Science 247:1465-1468 (1990) asi como las Patentes Norteamericanas Nos. 5,580,859 y 5,589,466. Los ácidos nucleicos también pueden administrarse usando un suministro balístico como se describe, por ejemplo, en la Patente Norteamericana No. 5,204,253. Las partículas comprendidas solamente de ADN pueden administrarse. Alternativamente, el ADN puede adherirse a partículas, tales como partículas de oro. Los ácidos nucleicos también pueden suministrarse en complejo a compuestos catiónicos, tales como lípidos catiónicos. Los métodos de suministro de genes mediados por lipido se describen, por ejemplo, en O 96/18372; WC 93/24640; Mannino and Gould-Fogerite (1988) 3ioTec niques 6 (7) : 682-691; Rose U.S. Pat No. 5,279,833; WO 91/06309; y Felgner et al. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 34: 7413-7414. Los péptidos de la invención también pueden expresarse por huéspedes virales atenuados, tales como vacuna o pustulación avícola. Esta propuesta involucra el uso del virus de la vacuna para un vector para expresar secuencias de nucleótidos se codifican los péptidos de la invención. Durante la introducción dentro de un huésped infectado aguda o crónicamente o dentro de un huésped no infectado, el virus de la vacuna recombinante expresa el péptido inmunogénico, y con eso produce una respuesta CTL del huésped. Los vectores de la vacuna y métodos útiles en los protocolos de inmunización se describen en, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 4,722,848, incorporado en la presente para referencia. Otro vector es BCG (Bacille Calmette Guerin) . Los vectores BCG se describen en Stover et al. (Nature 351:456-460 (1991)) que se incorpora en la presente para referencia. Una amplia diversidad de otros vectores útiles para administración o inmunización terapéutica de los péptidos de la invención, por ejemplo los vectores de Salmonelia typhi y similares, serán aparentes para aquellos con experiencia en la técnica a partir de la descripción de la presente.

Un medio preferido para administrar ácidos nucleicos que codifican los péptidos de la invención usa construcciones de minigen que codifican epitopes múltiples de la invención. Para crear una secuencia de ADN que codifica los epitopes de CTL seleccionado (minigen) para expresión en células humanas, las secuencias de aminoácidos de los epitopes se traducen a la inversa. Una tabla de uso de codones humanos se usa para conducir la selección del codón para cada aminoácido. Estas secuencias de ADN que codifican epítope se adjuntan directamente, creando una secuencia polipeptídica continua. Para optimizar la expresión y/o inmunogenicidad, pueden incorporarse elementos adicionales dentro del diseño del minigen. Ejemplos de secuencias de aminoácido que podrían traducirse a la inversa e incluirse en la secuencia del minigen incluyen: epitopes de linfocito T asistente, una secuencia guía (señal), y una señal de retención de retícula endoplasmática . Además, la presentación MHC de los epitopes CTL, pueden mejorarse incluyendo secuencias de flanqueo sintéticas (por ejemplo poli-alanina) o que ocurre naturalmente adyacente a los epitopes CTL. La secuencia del minigen se convierte en ADN ensamblando oligonucleótidos que codifican las hebras más y menos del minigen. Se sintetizan oligonucleótidos (30-100 bases de largo) que se traslapan, fosforilan, purifican y templan bajo condiciones apropiadas usando técnicas bien conocidas. Los extremos de los oligonucleótidos se uner. usando T4 de ADN ligasa. Este minigen sintético, que codifica el polipéptido del epitope CTL, puede clonarse después dentro de un vector de expresión deseado. Las secuencias reguladoras estándar bien conocidas por aquellos con experiencia en la técnica se incluyen en el vector para asegurar la expresión en las células objetivo. Se requirieron diversos elementos vectoriales: un promotor con un sitio de clonación hacia el extremo 3' para la inserción del minigen; una señal de poliadenilación para la terminación de transcripción eficiente; un origen de replicación de E. coli; y un marcador seleccionable de E. coli (por ejemplo resistencia a ampicilina o canamicina) . Pueden usarse numerosos promotores para este propósito, por ejemplo, el promotor de citomegalovirus humano (hCMV) . Véase, las Patentes Norteamericanas Nos. 5,580,859 y 5,589,466 para otras secuencias promotoras adecuadas. Pueden desearse modificaciones vectoriales adicionales para optimizar la expresión e inmunogenicidad del minigen. En algunos casos se requieren intrones para la expresión del gen eficiente y uno o más intrones que ocurren naturalmente sintéticos podrían incorporarse dentro de la región transcrita del minigen. La inclusión de secuencias de estabilización de ARNm también puede considerarse para aumentar la expresión del minigen. Se ha propuesto recientemente que las secuencias inmunoestimuladoras (ISSs o CpGs) juegan un papel en la inmunogenicidad de las vacunas de ADN. Estas secuencias podrían incluirse en el vector, fuera de la secuencia de codificación del minigen si se encuentra que mejoran la inmunogenicidad. En algunas modalidades, puede usarse un vector de expresión bioistrónico, para permitir la producción de ios epitopes codificados por el minigen y una segunda proteína incluida para mejorar o disminuir la inmunogenicidad. Ejemplos de proteínas o polipéptidos que podrían mejorar beneficiosamente la respuesta inmune si se co-expresa incluye citocinas (por ejemplo, IL2, IL12, GM-CSF) , moléculas que inducen citocina (por ejemplo LelF) o moléculas coestimuladoras . Los epitopes asistentes (HTL) podrían unirse a señales de selección intracelular y expresarse separadamente a partir de los epitopes CTL. Esto permitiría la dirección de los epitopes HTL a un compartimiento celular diferente de los epitopes CTL. Si se requiere, esto podría facilitar más eficientemente la entrada de los epitopes HTL dentro de la ruta de MHC clase II, mejorando con eso la inducción de CTL. En contraste con la inducción de CTL, disminuir específicamente la respuesta inmune por la co-expresión de moléculas inmunosupresoras (por ejemplo TGF-ß) puede ser de beneficio en algunas enfermedades.

Una vez que se selecciona un vector de expresión, el minigen se clona dentro de la región polienlazante hacia el extremo 3' del promotor. Este plásmido se transforma dentro de una cepa de E. coli apropiada, y se prepara ADN usando técnicas estándar. La orientación y secuencia de ADN del minigen, así como los otros elementos incluidos en el vector, se confirman usando mapeo de restricción de análisis de secuencia de ADN. Las células bacterianas que albergan el plásmido correcto pueden almacenarse como un banco de células maestras, y un banco de células de trabajo. Las cantidades terapéuticas de ADN de plásmido se producen por fermentación en E. coli, seguido por purificación. Las alícuotas a partir del banco de células de trabajo se usan para inocular el medio de fermentación (tai como un Caldo Fantástico) , y se cultivan hasta saturación en matraces agitados o un bioreactor de acuerdo a técnicas bien conocidas. El ADN plásmido puede purificarse usando tecnologías de bioseparación estándar tales como resinas de intercambio aniónico de fase sólida suministrados por Quiagen. Si se requiere, puede aislarse ADN superenrollado a partir de las formas circulares y lineales abiertas usando electroforesis de gel u otros métodos. Puede prepararse ADN de plásmido purificado para inyección usando una diversidad de formulaciones. La más simple de estas es la reconstitución de ADN liofiiizado e solución salina regulada con fosfato estéril (PBS) . Se ha descrito una diversidad de métodos, y las nuevas técnicas pueden volverse disponibles. Como se anotó anteriormente, los ácidos nucleicos se formulan convenientemente con lipidos catiónicos. Además, glicolípidos, liposomas fusogénicos, péptidos y compuestos preferidos colectivamente, protectores, interactivos, no condensantes (PINC) también podrían formar complejo con ADN de plásmido purificado para influencias variables tales como estabilidad, dispersión intramuscular, o tráfico a órganos específicos o tipos de células. La sensibilización de la célula objetivo puede usarse como una prueba funcional para expresión y presentación de MHC Clase I de epítopes CTL codificados por minigen. El ADN plásmido se introduce dentro de una línea de células de mamífero que sea adecuada como un objetivo para pruebas de liberación de cromo CTL estándar. £1 método de transfección usado será dependiente de la formulación final. Puede usarse electroporación para ADN "desnudo", mientras que los lipidos catiónicos permitan la transfección in vitro directa. Un plásmido que expresa proteína fluorescente verde (GFP) puede cotransfectarse para permitir el enriquecimiento de células transfectadas usando distribución de células con fluorescencia activada (SACF) . Estas células se arcan después con cromo-51 y se usan como células objetivo para lineas de CTL específicas de epítope. La citólisis, detectada por la liberación de CR51, indica la producción de la presentación MHC de epitopes CTL codificadas por minigen. La inmunogenicidad in vivo es una segunda propuesta para la prueba funcional de formulaciones de ADN de minigen. Los ratones transgénicos que expresan moléculas MHC humanas apropiadas se inmunizan con el producto de ADN. La dosis y ruta de administración son dependientes de la formulación (por ejemplo IN para ADN en PBS, IP para ADN en complejo de lipido) . Veintiún días después de la inmunización, se cosechan los esplenocitos y se reestimulan durante una semana en la presencia de péptidos que codifican cada epítope que se prueba. Estas células efectoras (los CTL) se prueban por citólisis de células objetivo marcadas con cromo-5i cargadas de péptido usando técnicas estándar. La lisis de las células objetivo sensibilizadas a carga de MHC de péptido que corresponden a los epitopes codificados por minigen demuestran la función de la vacuna de ADN para inducción in vivo de los CTL. Los péptidos antigénicos pueden usarse para producir CTL ex vivo también. El CTL resultante, puede usarse para tratar infecciones crónicas (virales o bacterianas) o tumores en pacientes que no responden a otras formas convencionales de terapia, o que no responderán a una propuesta de vacuna peptídica de terapia. Las respuestas CTL ex vivo a un patógeno particular (agente infeccioso o antigeno de tumor) se inducen al incubar en cultivo de te idc las células precursoras CTL del paciente (CTLp) junto con una fuente de células que presentan antigeno (APC) y el péptido inmunogénico apropiado. Después de un tiempo de incubación apropiado (típicamente 1-4 semanas) en el cual el CTLp se activa y madura y expande dentro del CTL efector, las células se infunden de regreso dentro del paciente, en donde destruirán su célula objetivo especifica (una célula infectada o una célula tumoral) . Los péptidos también pueden encontrar uso como reactivos de diagnóstico. Para optimizar las condiciones in vi tro para la generación de células T citotóxicas específicas, el cultivo de células estimuladoras se mantiene en un medio libre de suero apropiado. Antes de la incubación de las células estimuladoras con las células a ser activadas, por ejemplo, células CD8÷ precursoras, una cantidad de péptido antigénico se agrega al cultivo de células estimuladoras, en cantidad suficiente para cargarse sobre las moléculas de Clase I humanas a ser expresadas sobre la superficie de las células estimuladoras. En la presente invención, una cantidad suficiente de péptido es una cantidad que permitirá aproximadamente 200, y preferiblemente 200 o más, moléculas MHC de Clase ? humanas cargadas con péptido para ser expresadas sobre la superficie de cada célula estimuladora. Preferiblemente, las células estimuladoras se incuban con >20.uc/ml de péptido. Las células CD8+ precursoras o inactivas se incuban después en cultivo con las células estimuladoras apropiadas durante un periodo de tiempo suficiente para activar las células CD8+. Preferiblemente, las células CD8+ se activan en una forma especifica de antigeno. La proporción de células CD8+ (efectoras) precursoras o inactivas a células estimuladoras puede variar de individuo a individuo y puede depender adicionalmente de valores tales como la función de los linfocitos de un individuo a las condiciones de cultivo y la naturaleza y severidad de la condición afectiva y otra condición para la cual se usa la modalidad del tratamiento descrito en lo anterior. Preferiblemente, sin embargo, la proporción de célula de linfocito : estimuladora está en un rango de aproximadamente 30:1 a 300:1. El cultivo efector/estimulador puede mantenerse durante tanto tiempo como sea necesario para estimular un número de células CD8÷ terapéuticamente útil o efectivo. La inducción de CTL in vi tro requiere el reconocimiento especifico de péptidos que se enlazan a moléculas MHC clase I especificas de alelo sobre A?C. El número de complejos MHC/péptido específicos por APC es crucial para la estimulación de CTL, particularmente er. respuestas inmunes primarias. Mientras que pequeñas cantidades de complejos péptidos/MHC por célula sor. suficiente para volver una célula susceptible a lisis por CTL, o para estimular una respuesta CTL secundaria, la activación exitosa de un precursor CTL (pCTL) durante la respuesta primaria requiere un número significativamente superior de complejos MHC/péptido. La carga peptidica de las moléculas de complejo de histocompatabilidad principales vacias sobre las células permite la inducción de respuestas de linfocito T citotóxico primario. La carga peptidica de moléculas de complejo de histocompatibilidad principal vacio sobre las células permite la inducción de respuestas de linfocito T citotóxicos primarios. Puesto que las lineas de células mutantes no existen para cada alelo MHC humano, es ventajoso usar una técnica para eliminar los péptidos asociados a MHC endógeno a partir de la superficie de APC, seguido por carga de las moléculas de MHC vacias resultantes con los péptidos inmunogénicos de interés. El uso de células no transformadas (no tumorigénicas) , no infectadas, y preferiblemente, células autólogas de pacientes como APC es deseable para el diseño de protocolos de inducción CTL dirigidas hacia el desarrollo de terapia CTL ex vivo. Esta aplicación describe métodos para quitar los péptidos asociados con MHC endógena de la superficie de APC seguido por la carga de los péptidos deseados .

Una molécula MHC de clase I estable es un comple o trimérico formado de los siguientes elementos: 1) un. pépticc de comúnmente 8-10 residuos, 2) una cadena de proteína polimórfica pesada de transmembrana que lleva el sitio de enlace peptidico en sus dominios al y a2, 3) una cadena ligera no polimórfica no covalentemente asociada, microglobulina ß^. Eliminar los péptidos enlazados y/o disociar la microglobulina ß; del complejo vuelve las moléculas MHC de clase I no funcionales o inyectables, resultando en la rápida degradación. Todas las moléculas de MHC de clase I aisladas a partir de PBMC tienen péptidos endógenos enlazados a ellos. Por lo tanto, el primer paso es eliminar todos los péptidos endógenos enlazados a las moléculas MHC de clase I sobre el APC sin ocasionar su degradación antes que los péptidos exógenos puedan agregarse a ellas. Dos formas posibles de liberar las moléculas MHC de clase I de los péptidos enlazados incluye disminuir la temperatura del cultivo de 37 °C a 26°C durante la noche para desestabilizar la microglobulina ß2 y quitar los péptidos endógenos de la célula usando un tratamiento ácido oderable. Los métodos liberan péptidos previamente enlazados dentro del ambiente extracelular permitiendo que nuevos péptidos exógenos se enlacen a las moléculas de clase I vacias. El método de incubación de temperatura fría permite que los péptidos exógeno se enlacen eficientemente al complejo MKC, pero requiere una incubación durante la noche a 26°C que puede disminuir la velocidad metabólica de la célula. También es probable que las células que no sintetizan activamente moléculas MHC (por ejemplo, PBMC inactiva) no producirían altas cantidades de moléculas MHC de superficie vacía por el procedimiento de temperatura frío. El despojo con ácido riguroso involucra la extracción de los péptidos con ácido trifluoracético, pH 2, o desnaturalización ácida de los complejos clase I-péptido purificados por inmunoafinidad. Estos métodos no son factibles para inducción de CTL, puesto que es importante eliminar los péptidos endógenos conservando a la vez la viabilidad de APC y un estado metabólico óptimo que es crítico para la presentación del antígeno. Las soluciones ácidas moderadas de pH 3 tales como reguladores de glicina o citrato-fosfato se han usado para identificar péptidos endógenos y para identificar epítopes de célula T asociados a tumor. El tratamiento es especialmente efectivo, porque solamente se desestabilizan las moléculas MHC de clase I (y péptidos asociados liberados), mientras que otros antígenos de superficie permanecen intactos, incluyendo moléculas MHC de clase II. Más importantemente, el tratamiento de las células con las soluciones ácidas moderadas no afecta la viabilidad de la célula o el estado metabólico. El tratamiento de ácido moderado es rápido puesto que el despoje de los péptidos endógenos ocurren en dos minutos a 4°C y el APC está listo para realizar su función después que se cargan los péptidos apropiados. La técnica se utiliza en la ' "esente para hacer los APC específicos de péptido para la gei. ración-de CTL específico de antígeno primario. El resultante A?C es eficiente para inducir CD8+ CTL específico de péptido. Las células CD8+ activadas pueden separarse efectivamente de las células estimuladoras usando una diversidad de métodos conocidos Por ejemplo, anticuerpos monoclonales específicos para las células estimuladoras, para los péptidos cargados sobre las células estimuladoras, o para las células CD8+ (o un segmento del mismo) pueden utilizarse para enlazar su ligando complementario apropiado. Las moléculas marcadas de anticuerpo pueden extraerse después a partir de la mezcla de células estimuladoras-efectoras por medio de medios apropiados, por ejemplo, por medio de métodos de inmunoprecipitacion o inmunoensayo bien conocidos. Las cantidades citotóxicas efectivas de las células CD8+- activadas pueden variar entre los usos in vi tro e in vivo, así como con la cantidad y tipo de células que son el objetivo último de estas células destructivas. La cantidad también variará dependiendo de la condición del paciente y debe determinarse por medio de la consideración de todos los factores apropiados por el practicante. Preferiblemente, sin embargo, aproximadamente 1 X 10° hasta aproximadamente i Y. 10'-, de mayor preferencia aproximadamente 1 X 10r hasta aproximadamente 1 X ÍO11, y aún de mayor preferencia aproximadamente 1 X 10 hasta aproximadamente 1 X 10" células CD8+ activadas se utilizan para humanos adultos, en comparación con aproximadamente 5 X 10° - 5 X 10 células usadas en ratones. Preferiblemente, como se discutió anteriormente, las células CD8+ activadas se cosechan del cultivo de células antes de la administración de las células CD8+ al individuo que se trata. Es importante notar, sin embargo, que a diferencia de otras modalidades de tratamiento presentes y propuestas, el método presente usa un sistema de cultivo de célula que no es tumorigénico . Por lo tanto, si la separación-completa de las células estimuladoras y las células CD3÷ activadas no se logra, no existe peligro inherente r.c idc asociado con la administración de un número pequeño de células estimuladoras, mientras que la administración de las células que promueven tumor de mamífero puede ser extremadamente peligrosa. Se conocen métodos para re-introducir componentes celulares en la técnica e incluyen procedimientos tales come aquellos ejemplificados en la Patente Norteamericana No. 4,844,893 para Honsik, et al., y la Patente Norteamericana No. 4,690,915 para Rosenberg. Por ejemplo, la adirdnistraciór. de células CD8+ activadas por medio de infusión intravenosa es apropiada. Los péptidos inmunogénicos de esta invención pueden usarse también para hacer anticuerpos monoclonales . Tales anticuerpos pueden ser útiles como agentes de diagnóstico o terapéuticos potenciales. Los péptidos también pueden encontrar uso como reactivos de diagnóstico. Por ejemplo, un péptido de la invención puede usarse para determinar la susceptibilidad de un individuo particular a un régimen de tratamiento que emplea el péptido o péptidos relacionados, y asi puede ser de ayuda para modificar un protocolo de tratamiento existente o para determinar una prognosis de un individuo afectado. Además, los péptidos también pueden usarse para predecir qué individuos estarán en riesgo sustancial de desarrollar infección crónica. Para identificar los péptidos de la invención, se llevó a cabo el aislamiento del antigeno de clase I, y ei aislamiento y secuenciación de los péptidos naturalmente procesados como se describe en las solicitudes relacionadas. Estos péptidos se usaron después para definir motivos de enlace específicos para cada uno de los siguientes alelos A3.2, Al, All, y A24.1. Estos motivos se describen en la página 3, anterior. Los motivos descritos en las Tablas 8-11, posteriormente, se definen a partir de datos de secuenciaciór. 103 reunidos de péptidos naturalmente procesados como se describe en las solicitudes relacionadas. TABLA 8 Resumen Motivo Especifico del Alelo HLA-A3.2 Posición Residuos Conservados 1 2 V,L,M 3 Y,D 4 5 6 7 I 8 Q,N 9 K 10 K TABLA 9 Resumen Motivo Especifico del Alelo HLA-Al Posición Residuos Conservados 1 2 S, T 3 D,E 4 P 10 K TABLA 10 Resumen Motivo Especifico del Alelo HLA-Al 1 Posición Residuos Conservado 1 2 T,V 3 M, F 4 5 6 7 8 Q 9 K 10 K TABLA 11 Resumen Motivo Específico del Alelo HLA-A2 .1 Posición Residuos Conservado 3 ?,? 4 D,E,G,K, P 5 L, ?,? 6 V 7 N, V 8 A,E,K,Q,S 9 F,L 10 F,A Ejemplo 2 Identificación de péptidos inmunogénicos Usando los motivos identificados anteriormente para diversas secuencias de aminoácidos del alelo MHC clase I a partir de diversas proteínas relacionadas a tumor y patógeno se analizaron por la presencia de estos motivos. Se llevó a cabo la selección descrita en las solicitudes relacionadas. La Tabla 12 proporciona los resultados de las búsquedas de los antigenos.

? ? : Tabla 12 Péptido AA Secuencia Fuente A'0301 A*110! 28.0719 10 ELEQWVAGR HDV.nuc.16 0.0170 0.0012 28.0727 10 LSAGGKNLS HDV.nuc.115 0.0097 0.0150 1259.02 1 1 STDTVDTVLEK Flu.HA.29 0.0001 0.0670 1259.04 9 G1APLQLGK Hu.HA.63 0.6100 0.2000 1259.06 10 VTAACSHAG Flu.HA.149 0.0380 0.0490 1259.08 9 GIHHPSNSK Flu.HA.195 0.1300 0.0140 1259.10 10 RMNYYWTLL FKLHA.243 2.5000 2.3000 1259.12 11 rTNKVNSVDE FlulHA.392 0.0200 0.0670 1259.13 11 MNIQFTAVGK Flu.HA.402 0.0280 0.0092 1259.14 9 NIQFTAVG Flu.HA.404 0.0017 0.0330 1259.16 11 AVGKEFNKLEK Flu-HA.409 0.0210 0.0460 1259.19 11 KVKSQLKNNAK Flu-HA.465 0.0470 0.0031 1259.20 11 SVKNGTYDYPK F1U.HA495 0.0410 0.1400 1259.21 9 SHPSGPLK Flu.VMTl.13 0.7800 8.8000 1259.25 10 RMVLASTTAK Flu.VMTl.178 0.5500 0.0350 1259.26 9 MVLASTTAK Flu.VMTl.179 1.7000 1.4000 1259.28 10 RMGVQMQRFK Flu.VMTl.243 0.1000 0.0059 1259.33 10 ATEI ASVGK Flu.VNUC.22 0.1400 0.3000 1259.37 11 TMVMELVRMIK Flu.VNUC.188 0.0890 0.0310 1259.43 10 RVLSFKGTK Flu.VNUC.342 0.8000 0.0830 Fl 19.01 9 MSLQRQFLR ORF3P 0.2000 0.7200 Fl 19.02 9 LLGPGRPYR TRP.197 0.0190 0.0091 Fl 19.03 9 LLGPGRPYK TRP.197K9 2.2000 0.6800 34.0019 8 RVYPELPK CEA.139 0.0130 0.0440 34.0020 8 TVSAELPK CEA495 0.0037 0.0320 34.0021 8 TVYAEPPK CEA.317 0.0160 0.0220 34.0029 8 TINYTLWR MAGE2.74 0.0140 0.0550 34.0030 8 LVHFLLLK MAGE2.116 0.0290 0.1500 34.0031 8 SVFAHPRK MAGE2.237 0.1410 0.0810 34.0043 8 KVLHHMV MAGE3.285 0.0580 0.0190 34.0050 8 RVCACPGR p53.273 0.3500 0.0490 34.0051 8 KMFCQLAK p53.132 0.3800 0.3600 34.0062 8 RAHSSHLK p53.363 0.5500 0.0071 34.0148 9 FVSNLATGR CEA.656 0.0019 0.0490 34.0152 9 RLQLSNG K CEA.546 0.0250 0.0110 34.0153 9 JNGIPQQK CEA.628 0.0400 0.0780 34.0154 9 KffiJCYTMRK HER2/neu.681 0.0620 0.0055 34.0155 9 LVHFLLL K MAGE2.116 0.5220 1.4000 34.0156 9 SMLEVFEG MAGE2.226 0.0950 1.6000 34.0157 9 SSFSTTIN MAGE2.69 0.1600 2.0000 34.0158 9 TSYV VLHK MAGE2.281 0.5300 0.1500 34.0159 9 VIFSKASEK MAGE2.149 0.4900 0.0530 34.0160 9 GSWGNWQK MAGE3.130 0.0040 0.2060 34.0161 9 SSLPTTMNK MAGE3.69 0.6180 0.7100 34.0162 9 SVLEVFEG MAGE3.226 0.1330 0.9000 34.0171 9 SSBMGGMNK p53.240 0.5440 1.1000 34.0172 9 SSC GG p53.240 0.0090 0.0490 34.0211 10 RTLTLFNVT CEA.554 02200 1.3000 34.0212 10 TISPL TSYK CEA.241 0.1800 0.0330 34.0214 10 STTINYTLW MAGE2.72 0.0870 0.6500 34.0215 10 ASSLFTTMNK MAGE3.68 0.0420 0.0270 34.0225 10 TYQGSYGF p53.101 0.4900 0.4200 34.0226 10 WRRBPHHEK p53.172 0.1800 0.2100 34.0228 10 GLAPPQHLK P53.187 0.0570 0.0160 34.0229 10 NSSCMGGMNK P53.239 0.0071 0.0290 34.0230 10 SSBMGGMNRK p53-240 0.0420 0.1600 34.0232 10 RVCACPGRDK p53.273 0.0190 0.0250 34.0295 11 KTTTVSAELPK CEA.492 0.3600 0.1600 34.0296 11 TTTTVYAEPPK CEA.314 0.0200 0.0280 34.0298 11 PTISPSYTYYR CEA.418 (0.0002) 0.1300 34.0301 11 GLLGDNQVMPK MAGE2.188 0.0780 0.0047 34.0306 11 MVELVHFLLLK MAGE2.113 0.0200 0.0120 34.0308 11 FSTTINYTLWR MAGE2.71 0.??? 0.0170 34.0311 11 GLLGDNQIMPK MAGE3.188 0.1300 0.0570 34.0317 11 RLGFLHSGTA p53.110 0.0430 0.0001 34.0318 11 ALNKMFCQLAK p53.129 0.4400 0.0420 34.0323 11 RVCACPGRDRR p53.273 0.0290 0.0290 34.0324 11 LSQETFSDLW p53.14 (0.0009) 0.0470 34.0328 11 RAHSSHL S K P53.363 0.0270 0.0038 34.0329 11 VTCTYSPAL K p53.122 0.0700 0.1200 34.0330 11 GTRV AMAIYK p53.154 1.1000 0.3300 34.0332 11 STSRH KLMFK p53.376 0.3100 0.1300 40.0107 9 LAARNVLV Her2/neu.846 0.0580 0.0285 40.0109 9 MALESILRR Her2/neu.889 0.0034 0.0237 40.0145 10 ISWLGLRSLR Her2/neu.450 0.0410 0.0027 40.0147 10 GSGAFGTVY Her2/neu.727 0.0660 0.1300 40.0153 10 ASPLDSTFY Her2/neu.997 0.0003 0.0670 Ejemplo 3 Identificación de péptidos inmunogénicos Usando los supermotivos similares a 37 identificados en las solicitudes relacionadas descritas anteriormente, se analizaron las secuencias de diversas proteínas relacionadas a tumor y patógeno por la presencia de estos motivos. Se llevó a cabo la selección descrita en las solicitudes relacionadas. La Tabla 13 proporciona ios resultados de las búsquedas de los antigenos.

Tabla 13 Péptido Secuencia Fuente 0.0013 SPGLSAGI CEA.680I8 0.0022 KPYDGIPA Her2/neu.921 0.0023 KPYDGIPI Her2/neu.921I8 0.0050 APRMPEAA p53.63 . 40.0051 APRMPEÁI p53.63I8 40.0055 APAAPTPI p53.76I8 40.0057 APTPAAPI p53.79I8 40.0059 TPAAPAPI p53.8H8 40.0061 APAPAPSI p53.84I8 40.0062 SPALNKMF P53.127 40.0063 SPAL KMI p53.l27I8 40.0117 SPSAPPH I CEA.3I9 40.0119 PPHRWCIPI CEA.7I9 40.0120 GPAYSGREI CEA.92 40.0156 MPNQAQMRJLI Her2/neu.706I10 40.0157 MPYGCLLDHVI Her2/neu.801I10 40.0161 APPHRWCIPW CEA.6 40.0162 APPHRWCIPI CEA.6I10 40.0163 IPWQRLLLTA CEA.13 40.0164 IPWQ LLLTI CEA.13I10 40.0166 LPQHLFGYSI CEA.58I10 40.0201 RPRFRELVSEF Her2/nea.966 40.0202 RPRF ELVSEI Her2/neu.966Ill 40.0205 PPSPREGPLPA Ha2/neu.ll49 40.0206 PPSPREGPLPI Her2/neu.l 149111 40.0207 GPLPAARPAGA Her2/neu.ll55 40.0208 GPLPAARPAGI Her2 neu.1155111 40.0231 APAPAAPTPAA P53.74 40.0232 APAPAAPTPAI P53.74I11 40.0233 APAAPTPAAPA p53.76 40.0234 APAAPTPAAPI ?53.76?? 45.0003 IPWQRLLI CEA13.I8 45.0004 LPQHLFGI CEA.58J8 45.0007 RPGV LSI CEA.428.I8 45.0010 IPQQHTQI CEA.632J8 45.0011 TPN NGTI CEA646.I8 45.0016 CPLHNQEI Her2/ncu.315.18 45.0017 KPCARVCI Her2 neu.336.I8 45.0019 WPDSLPDI Her2/neu.415.I8 45.0023 SPYVSRLI Her2 ncu.779.I8 45.0024 VPIKWMAI Her2 neu.884.I8 45.0026 RPRFRELI Her2/aeu.966.I8 45.0028 APGAGGMI Her2/neu.1036.18 45.0031 SPGK GVI Her2/neu.1174.18 45.0037 SPQGASSI MAGE3.64.I8 45.0038 YPLWSQSI MAGE3.77.I8 45.0044 SPLPSQAI p53.33.I8 45.0046 MPEAAPPI p53.66J8 45.0047 APAPSWPI p53.86J8 45.0051 KPVED DAI CEA.155.19 45.0054 IPQQHTQVI CEA.632.I9 45.0060 APPVAPAPI p53.70J9 45.0062 APAAPTPAI p53.76.I9 45.0064 PPGTRVRAI p53.152.I9 45.0065 APPQHLIRI p53.189.I9 45.0071 IPQQHTQVLI CEA.632J10 45.0072 SPGLSAGATI CEA.680J10 45.0073 SPMCKGSRCI Hcr2/ncu.l96.I10 45.0074 MP PEGRYTI Her2/ne L282.I10 45.0076 CPLHNQEVTI Her2 neu.315.I10 45.0079 KPDLSYMPn Her2 nea.605.I10 45.0080 TPSGAMPNQI Her2Aieu.701.I10 45.0084 GPASPLDSTC Her2/neu.995.I10 45.0091 APPVAPAPAI p53.70.I10 45.0092 APAPAAPTPI p53.74.I10 45.0093 ?????????? p53.79J10 45.0094 APSWPLSSSI p53.88.I10 45.0103 APTISPL TSI CEA.239.il 1 45.0108 SPSYTYYRPGI CEA.421J11 45.0117 CPSGVKPDLSI Her2yneu.600.Ill 45.0118 SPLTSHSAVI Her2/neu.649.Ill 45.0119 IPDGENVKIPI Hcr2 ncu.740.Il l SPLDSTFYRSI Her2 neu.998.Il l LPAARPAGATI Hei2/neu.1157,111 HPRKLLMQDLI MAGE2.24l.Ill GPRALIETSYI MAGE2.274.il 1 GPRALVETSYI MAGE3.274.il 1 APR PEAAPPI p53.63.Ill VPSQKTYQGSI p53.97.Il l FPHCLAFAY HBV POL 541 análogo FPVCLAFSY HBV POL 541 análogo YPALMPLYAC1 HBV.pol.645 descripción anterior se proporciona ilustrar la invención pero no para limitar su alcance. Otras variantes de la invención serán fácilmente aparentes para alguien con experiencia común en la técnica y están abarcadas por las reivindicaciones anexas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes citadas en la presente se incorporan por la presente para referencia.

Claims

RE IVIND CACIONE S 1 Una composición caracterizada porque comprende un péptido inmunogénico que tiene un motivo de enlace cuyo péptido inmunogénico se selecciona a partir de un grupo que consiste AMG RLVEAC ISVY SLPYW SMDEA LSIY SLK VLQCLEV FLNGTGGQV VLLHTFTDV ALVGALLLV YLIRA SMDEA AACNQKILTV SLH LAHLFL LLLVAAIFGV ALCNQ TLFNVTR DTA GLAPPVHLI N LSTVLGV SLENF KLAELVHFV Y YLIMV L FLE LLQE y GLPSIPVHPL 2 Un método para inducir una respuesta de célula T citotóxica en contra de un antigeno preseleccionado en paciente que expresa un producto caracterizado porque el método comprende poner en contacto las células T citotóxicas del paciente con una composición que comprende un péptido inmunogénico seleccionado a partir del grupo que consiste AIFVC AMG RLVEACNLL QMA YLS LLVYHTYS KLFCQLA SLK SLPY VLQCLEV FLNGTGGQV VLLHTFTDV ALVGALLLV YLIRA SLHNLAHLFL LLLVAAIFGV S LTLLSVTR GLYTCQA GLAPPVHLI YLIMV NMLSTVLGV KLAELVHFV B YLIMV B LMYSLVH y 3 Una composición caracterizada porque un péptido inmunogénico seleccionado a partir de un grupo consiste TVSAELP TI LVHFLLL SSFSTTU VEFS SSLPTTMN SSCMGGM ASSLPTTMN MFCQLA MALES y Un método para inducir una respuesta de célula T citotóxica en contra de un antigeno preseleccionado en un caracterizado porque el método comprende poner en contacto células T citotóxicas del paciente con una composición que comprende un péptido seleccionado a partir del grupo que consiste TVSAELP TVYAEPP FVS SSBMGGM RLGFLHSGTA IS 5 Una composición caracterizada porque comprende un péptido inmunogénico seleccionado a partir de un grupo que consiste de los péptidos listados en la Tabla 6 Un método para inducir una respuesta de célula T citotóxica en contra de un antigeno preseleccionado en un caracterizado porque el método comprende poner en contacto células T citotóxicas del paciente con una composición que comprende un péptido inmunogénico seleccionado a partir del grupo que consiste de los péptidos listados en la Tabla RESUMEN La presente invención proporciona los y métodos para seleccionar péptidos y las composiciones de péptido inmunogénico capaces de unir especificamente glicoproteinas codificadas por alelos KLA y activación de células T de inducción en células restringidas por el Los péptidos son útiles para producir una respuesta inmune contra un antigeno insufficientOCRQuality