[go: up one dir, main page]

MXPA02007619A - Moleculas de factor 23 de crecimiento de fibroblastos y su uso. - Google Patents

Moleculas de factor 23 de crecimiento de fibroblastos y su uso.

Info

Publication number
MXPA02007619A
MXPA02007619A MXPA02007619A MXPA02007619A MXPA02007619A MX PA02007619 A MXPA02007619 A MX PA02007619A MX PA02007619 A MXPA02007619 A MX PA02007619A MX PA02007619 A MXPA02007619 A MX PA02007619A MX PA02007619 A MXPA02007619 A MX PA02007619A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
polypeptide
fgf
sequence
leu
gly
Prior art date
Application number
MXPA02007619A
Other languages
English (en)
Inventor
Roland Luethy
Original Assignee
Amgen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Amgen Inc filed Critical Amgen Inc
Publication of MXPA02007619A publication Critical patent/MXPA02007619A/es

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1825—Fibroblast growth factor [FGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

La presente invencion proporciona polipeptidos de factor 23 de crecimiento de fibroblastos (FGF-23) y con moleculas de acido nucleico que codifican para estas. La invencion tambien proporciona agentes de union selectivos, vectores, celulas huespedes y metodos para producir los polipeptidos FGF-23. La invencion proporciona ademas composiciones farmaceuticas y metodos para el diagnostico, tratamiento, disminucion o prevencion de enfermedades, desordenes y condiciones asociadas con polipeptidos FGF-23.

Description

MOLÉCULAS DE FACTOR 23 DE CRECIMIENTO DE FIBROBLASTOS Y SU USO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con polipéptidos de factor 23 de crecimiento de fibroblastos (FGF-23, por sus siglas en inglés) y moléculas de ácido nucleico que codifican para las mismas. La invención también se relaciona con agentes de unión selectivos, vectores, células huéspedes y métodos para producir polipéptidos FGF-23. La invención se relaciona además con composiciones farmacéuticas y métodos para el diagnóstico, tratamiento, disminución o para evitar enfermedades, desórdenes y condiciones asociadas con los polipéptidos FGF-23.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los avances técnicos en la identificación, clonación, expresión y manipulación de moléculas de ácido nucleico y el descifrado del genoma humano han acelerado en gran medida el descubrimiento de sustancias terapéuticas novedosas . Las técnicas de secuenciado rápido de ácido nucleico ahora pueden generar información de secuencias a velocidades sin precedentes y, junto con el análisis REF' "" 40843 computacional, permiten el ensamblado de secuencias de superposición dentro del genoma parcial y completo así como la identificación de regiones que codifican para polipéptidos. Una comparación de la secuencia predicha de 5 aminoácidos contra una compilación de base de datos de secuencias conocidas de aminoácidos permite a una persona determinar el grado de homología de secuencias identificadas previamente o de elementos fundamentales estructurales. La clonación y expresión de una molécula de ácido nucleico que 10 codifica para un polipéptido proporciona un producto polipeptídico para análisis estructural y funcional. La manipulación de las moléculas de ácido nucleico y los polípéptidos codificados pueden conferir propiedades ventajosas en un producto para uso como una sustancia 15 terapéutica. Pese a los avances técnicos importantes en la investigación del genoma durante la década pasada, el potencial del desarrollo de sustancias terapéuticas novedosas basadas en el genoma humano aún no se ha llevado a 20 cabo en gran medida. Muchos genes codifican para sustancias terapéuticas polipeptídicas potencialmente benéficas o para estos polipéptidos codificantes, los cuales pueden actuar como "objetivos" para moléculas terapéuticas, las cuales aún no se han identificado. 25 En consecuencia, es un objetivo de la invención _____________ta¡.¿-identificar polipéptidos novedosos y moléculas de ácido nucleico que codifiquen para los mismos, los cuales tienen beneficio diagnóstico o terapéutico.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con moléculas novedosas de ácido nucleico para FGF-23 y polipéptidos codificados . La invención proporciona una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que se selecciona del grupo que consiste de: (a) la secuencia nucleotídica como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 1; (b) la secuencia nucleotídica de un inserto de ADN en ATCC, depósito número PTA- 1617; (c) una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 2; (d) una secuencia nucleotídica que hibridiza bajo condiciones de rigurosidad moderada o elevada, con el complemento de cualquiera de los incisos (a) - (c) ; y (e) una secuencia nucleotídica complementaria con cualquiera de los incisos (a) - (c) . La invención también proporciona una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que se selecciona del grupo que consiste de: (a) una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido que es por lo menos aproximadamente 70 por ciento ' idéntico al polipéptido que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 2, en donde el polipéptido codificado tiene una actividad del polipéptido que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 2; (b) una secuencia nucleotídica que codifica para una variante alélica o variante de empalme de la secuencia nucleotídica como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1, la secuencia nucleotídica del inserto de ADN en ATCC, depósito número PTA-1617, o en el inciso (a) ; (c) una región de la secuencia nucleotídica de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 1, el inserto de ADN en ATCC, depósito número PTA-1617, (a) o (b) que codifica para un fragmento polipeptídico de por lo menos aproximadamente 25 residuos aminoácidos, en donde el fragmento polipeptídico tiene una actividad del polipéptido codificado como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 2 , o es antigénico; (d) una región de la secuencia nucleotídica de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1, el inserto de ADN en ATCC depósito número PTA- 1617, o cualquiera de los incisos (a) - (c) que comprende un fragmento de por lo menos aproximadamente 16 nucleótidos; (e) una secuencia nucleotídica que hibridiza bajo condiciones de rigurosidad moderada o alta con el complemento de cualquiera de los incisos (a) - (d) ; y (f) una secuencia nucleotídica complementaria con cualquiera de los incisos (a) - (d) . La invención proporciona además una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que se selecciona del grupo que consiste de: (a) una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2, con por lo menos una sustitución conservadora de aminoácidos, en donde el polipéptido codificado tiene una actividad del polipéptido que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2; (b) una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2, con por lo menos una inserción de aminoácido, en donde el polipéptido codificado tiene una actividad del polipéptido como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 ; (c) una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2, con por lo menos una supresión de aminoácido, en donde el polipéptido codificado tiene una actividad del polipéptido como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 ; (d) una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2, la cual tiene una parte truncada C o N terminal, en donde el polipéptido codificado tiene una actividad del polipéptido como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 ; (e) una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2, con por lo menos una modificación que se selecciona del grupo que consiste de sustituciones, inserciones, supresiones de aminoácidos, corte en la parte C y N terminal, en donde el polipéptido codificado tiene una actividad del polipéptido como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2; (f) una secuencia nucleotídica de cualquiera de los incisos (a) - (e) , que comprende un fragmento de por lo menos aproximadamente 16 nucleótidos; (g) una secuencia nucleotídica que hibridiza bajo condiciones de rigurosidad moderada o elevada con el complemento de cualquiera de los incisos (a) - (f ) ; y (h) una secuencia nucleotídica complementaria con cualquiera de los incisos (a) - (e) . La presente invención proporciona un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácidos como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2; y (b) la secuencia de aminoácidos codificada por el inserto de ADN en ATCC, depósito número PAT 1617. La invención también proporciona un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácidos como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3, que comprende opcionalmente de manera adicional una metionina amino terminal; (b) una secuencia de aminoácidos para un ortólogo de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2; (c) una secuencia de aminoácidos la cual es por lo menos aproximadamente 70 por ciento idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2, en donde el polipéptido tiene una actividad del polipéptido como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2; (d) un fragmento de la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 que comprende por lo menos aproximadamente 25 residuos aminoácidos, en donde el fragmento tiene una actividad del polipéptido que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 , o es antigénica; y (e) una secuencia de aminoácidos para una variante alélica o variante de empalme de la secuencia de aminoácidos como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2, la secuencia de aminoácidos codificada por el inserto de ADN en ATCC, depósito número PTA-1617, o los incisos (a) - (c) . La invención proporciona además un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácidos como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2, con por lo menos una sustitución conservadora de aminoácido, en donde el polipéptido tiene una actividad del polipéptido que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 ; (b) la secuencia de aminoácidos como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2, con por lo menos una inserción de aminoácido, en donde el polipéptido tiene una actividad del polipéptido que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2; (c) la secuencia de aminoácidos como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2, con por lo menos una supresión de aminoácido, en donde el polipéptido tiene una actividad del polipéptido que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 ; (d) la secuencia de aminoácidos como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2, la cual tiene un corte en la parte C o N terminal, en donde el polipéptido tiene una actividad del polipéptido que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2; y (e) la secuencia de aminoácidos como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2, con por lo menos una modificación que se selecciona del grupo que consiste de sustituciones, inserciones, supresiones de aminoácidos, cortes en la parte C y N terminal, en donde el polipéptido tiene una actividad del polipéptido que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2. También se proporcionan polipéptidos de fusión que comprenden secuencias de aminoácidos de FGF-23. La presente invención también proporciona un vector de expresión que comprende moléculas aisladas de ácido nucleico, como se establecen en la presente, células huéspedes recombinantes que comprenden las moléculas recombinantes de ácido nucleico como se establecen en la presente, y un método para producir un polipéptido FGF-23, que comprende cultivar las células huéspedes y opcionalmente aislar el polipéptido que se produzca de esta manera.
Un animal transgénico no humano, que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido FGF-23 también está abarcado por la invención. Las moléculas de ácido nucleico para FGF-23 se introducen en el animal de una mañera que permite la expresión de niveles aumentados de un polipéptido FGF-23, el cual puede incluir niveles circulantes aumentados. Alternativamente, las moléculas de ácido nucleico FGF-23 se introducen en el animal de manera que se evita la expresión del polipéptido FGF-23 endógeno (es decir, se genera un animal transgénico que posee un gen bloqueado para el polipéptido FGF-23) . El animal transgénico no humano preferiblemente es un mamífero, y de manera más preferible es un roedor, tal como una rata o un ratón. También se proporcionan los derivados de los polipéptidos FGF-23 de la presente invención. Se proporcionan adicionalmente agentes de unión selectivos tales como anticuerpos y péptidos capaces de unir específicamente los polipéptidos FGF-23 de la invención.
Tales anticuerpos y péptidos pueden ser agonistas o antagonistas. Las composiciones farmacéuticas que comprenden nucleótidos, polipéptidos o agentes de unión selectivos de la invención y uno o más agentes de formulación farmacéuticamente aceptables también están incluidos por la invención. Las composiciones farmacéuticas se utilizan para proporcionar cantidades terapéuticamente eficaces de los nucleótidos o polipéptidos de la presente invención. La invención también se relaciona con métodos para utilizar los polipéptidos, moléculas de ácido nucleico y agentes de unión selectivos. Los polipéptidos FGF-23 y las moléculas de ácido nucleico de la presente invención se pueden utilizar para tratar, evitar, disminuir o detectar enfermedades y desórdenes, incluyendo los mencionados aquí. La presente invención también proporciona un método para realizar ensayos de moléculas de prueba para identificar una molécula de prueba que se une a un polipéptido FGF-23. El método comprende poner en contacto un polipéptido FGF-23 con una molécula de prueba para determinar el grado de unión de la molécula de prueba al polipéptido. El método comprende además determinar si tales moléculas son agonistas o antagonistas de un polipéptido FGF-23. La presente invención proporciona además un método para detectar el impacto de las moléculas sobre la expresión del polipéptido FGF-23 o sobre la actividad del polipéptido FGF-23. Los métodos para regular la expresión y modular (es decir, aumentar o disminuir) los niveles de un polipéptido FGF-23 también están abarcados por la invención. Un método comprende administrar a un animal una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido FGF-23. En otro método, se puede administrar una molécula de ácido nucleico que comprende elementos que regulan o modulan la expresión de un polipéptido FGF-23. Los ejemplos de estos métodos incluyen terapia de genes, terapia celular y terapia antisentido, como se describe adicionalmente en la presente. En otro aspecto de la presente invención, los polipéptidos FGF-23 se pueden utilizar para identificar receptores de los mismos ("receptores de polipéptido FGF-23") . Se han utilizado extensamente diversas formas de "clonación de expresión" para clonar receptores para ligandos de proteína. Véase, por ejemplo, Simonsen y Lodish, 1994, Trends Pharmacol . Sci . 15:437-41 y Tartaglia et al . , 1995, Cell 83:1263-71. El aislamiento de un receptor de polipéptido FGF-23 es útil para identificar o desarrollar agonistas y antagonistas novedosos de la vía de señalización del polipéptido FGF-23. Tales agonistas y antagonistas incluyen receptores solubles del polipéptido FGF-23, agentes de unión selectivos de receptor contra polipéptido FGF-23 (tales como anticuerpos y derivados de los mismos) , moléculas pequeñas y oligonucleótidos antisentido, cualquiera de los cuales se puede utilizar para tratar una o más enfermedades o trastornos, incluyendo los que se describen en la presente.
DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS Las figuras 1A-1B ilustran la secuencia nucleotídica del gen para FGF-23 humano (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1) y la secuencia deducida de aminoácidos del polipéptido FGFR humanos (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2) . El péptido señal predicho está indicado (subrayado) ; las figuras 2A-2G ilustran la alineación de secuencia de aminoácidos de FGF-1 humano (hu FGF-1; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4), FGF-2 humano (hu FGF-2; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5), FGF-3 humano (hu FGF-3; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 6), FGF-4 humano (hu FGF-4; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 7), FGF-5 humano (hu FGF-5; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 8), FGF-6 humano (hu FGF-6; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 9), FGF-7 humano (hu FGF-7; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 10), FGF-8 humano (hu FGF-8; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 11), FGF-9 humano (hu FGF-9; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 12), FGF-10 humano (hu FGF-10; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 13), FGF- 11 humano (hu FGF- 11; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 14), FGF-12 humano (hu FGF-12; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 15), FGF-13 humano (hu FGF-13; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 16) , FGF-14 humano (hu FGF-14; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 17), FGF-16 humano (hu FGF-16; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 18), FGF-17 humano (hu FGF-17; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 19), FGF-18 humano (hu FGF-18; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 20), FGF-19 humano (hu FGF-19; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 21) , FGF-23 humano (hu FGF-23; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 22), FGF-1 murino (mu FGF-1; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 23), FGF-2 murino (mu FGF-2; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 24), FGF-3 murino (mu FGF-3; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 25), FGF-4 murino (mu FGF-4; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 26), FGF-5 murino (mu FGF-5; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 27), FGF-6 murino (mu FGF-6; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 28), FGF-7 murino (mu FGF-7; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 29), FGF-8 murino (mu FGF-8; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 30), FGF-9 murino (mu FGF-9; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 31), FGF-10 murino (mu FGF-10; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 32), FGF-11 murino (mu FGF- 11; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 33), FGF-12 murino (mu FGF-12; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 34), FGF-13 murino (mu FGF-13; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 35), FGF-14 murino (mu FGF-14; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 36), FGF-15 murino (mu FGF-15; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 37), FGF-16 de rata (rat FGF-16; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 38), FGF-17 murino (mu FGF-17; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 39); la figura 3 ilustra la expresión de ARNm para FGF-23 como se detecta por hibridación in si tu en el cerebro y músculo cardíaco (corazón) de ratón adulto normal (tinción de contraste H&E = hematoxilina y eosina; ISH = hibridación in si tu) ; la figura 4 ilustra la expresión de AR?m para FGF-23 como se detecta por hibridación in si tu en la región subcapsular del nodulo linfático (nodulo linfático) , médula tímica (timo) , laguna del hueso cortical de la tibia (tibia) y hueso trabecular en la cabeza (cabeza) de un ratón transgénico no expresante (tinción de contraste H&E hematoxilina y eosina; ISH = hibridación in si tu) ; la figura 5 ilustra la expresión de AR?m para FGF- 23 detectada por hibridación in si tu en hígado, bazo, médula tímica (timo) y megacariocitos en la médula ósea (médula ósea) de un ratón transgénico de alta expresión (tinción de contraste H&E = hematoxilina y eosina; ISH = hibridación in situ) ; la figura 6 ilustra la expresión de AR?m para FGF-23, detectado por hibridación in si tu en tejido de músculo liso cerca de la próstata (músculo liso), tejido muscular de la mandíbula (músculo) , condrocitos en la tibia (tibia) y condrocitos en las vértebras (vértebras) de ratones transgénicos con alta expresión (tinción de contraste H&E = hematoxilina y eosina; ISH = hibridación in si tu) .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los encabezados de sección que se utilizan en la presente son únicamente con propósitos de organización y no se consideran como limitantes de la materia objeto que se describe. Todas las referencias mencionadas en esta solicitud se incorporan expresamente como referencia en la presente .
Definiciones Los términos "gen para FGF-23" o "molécula de ácido nucleico para FGF-23" o "polinucleótido FGF-23" se refieren a una molécula de ácido nucleico que comprende o que consiste de una secuencia nucleotídica como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1, una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2, una secuencia nucleotídica de un inserto de ADN en ATCC, depósito número PTA- 1617, y moléculas de ácido nucleico como se definen en la presente. El término "variante alélica del polipéptido FGF-23" se refiere a una o varias formas alternativas posibles que se presentan de manera natural de un gen que ocupa un locus dado en un cromosoma de un organismo o una población de organismos. El término "variante de empalme de polipéptido FGF-23" se refiere a una molécula de ácido nucleico, habitualmente ARN, el cual se genera por procesamiento alternativo de secuencias de intrón de un transcrito de ARN de la secuencia de aminoácidos del polipéptido FGF-23, como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2. El término "molécula aislada de ácido nucleico" se refiere a una molécula de ácido nucleico de la invención que: (1) se ha separado de por lo menos 50 por ciento de proteínas, lípidos, carbohidratos u otros materiales con los cuales se encuentra naturalmente cuando se aisla ácido nucleico total de las células fuente, (2) no se encuentra unido a la totalidad o a una porción de un polinucleótido al cual se une en la naturaleza una "molécula aislada de ácido nucleico", (3) se une operablemente a un polinucleótido al cual no está unido en la naturaleza, o (4) no se presenta en la naturaleza como parte de una secuencia polinucleotídica más grande. Preferiblemente, la molécula aislada de ácido nucleico de la presente invención está sustancialmente libre de cualquier otra molécula contaminante de ácido nucleico u otros contaminantes que se encuentren en su ambiente natural que pudieran interferir con su uso en la producción del polipéptido o en su uso terapéutico, de diagnóstico, profiláctico o de investigación. El término "secuencia de ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" se refiere a una secuencia de ADN o ARN. El término abarca moléculas que se forman de cualquiera de los análogos de bases conocidas de ADN y ARN tales como, pero sin limitarse a 4-acetilcitosina, 8-hidroxi-N6-metiladenosina, aziridinileítosina, pseudoisocitosina, 5- (carboxihidroxilmetil) uracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudouracilo, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetil-guanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-mannosilqueosina, 5 ' -metoxicarbonil -metiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, metiléster del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, oxibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido N-uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosine y 2 , 6-diaminopurina. El término "vector" se utiliza para referirse a cualquier molécula (por ejemplo ácido nucleico, plásmido o virus) utilizado para transferir información codificante a una célula huésped. El término "vector de expresión" se refiere a un vector que es adecuado para la transformación de una célula huésped y que contiene secuencias de ácido nucleico que dirigen o controlan la expresión de las secuencias insertadas heterólogas de ácido nucleico. La expresión incluye, pero no se limita a procedimientos tales como transcripción, traducción y empalme de ARN, si están presentes intrones . El término "unido operablemente" se utiliza en la presente para referirse a una distribución de secuencias flanqueantes en donde las secuencias flanqueantes descritas de esta manera se configuran o se ensamblan de manera que realizan su función habitual. Así, una secuencia flanqueante unida operablemente a una secuencia codificante puede ser capaz de llevar a cabo la replicación, transcripción o traducción de la secuencia codificante. Por ejemplo, la secuencia codificante está unida operablemente a un promotor cuando el promotor es capaz de dirigir la transcripción de esa secuencia codificante. Una secuencia flanqueante no necesita ser contigua a la secuencia codificante, en la medida en que funcione correctamente. Así, por ejemplo, las secuencias no traducidas interpuestas aunque transcritas pueden estar presentes entre la secuencia promotora y una secuencia codificante de la secuencia promotora aún se pueden considerar "unidas operablemente" a la secuencia codificante. El término "célula huésped" se utiliza para referirse a una célula la cual ha sido transformada o es capaz de ser transformada con una secuencia de ácido nucleico y después expresar un gen seleccionado de interés. El término incluye la progenie de la célula original, ya sea que la progenie sea o no idéntica en morfología o en su constitución genética a la célula original de manera que esté presente el gen seleccionado. El término "polipéptido FGF-23" se refiere a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 y polipéptidos relacionados. Los polipéptidos relacionados incluyen los fragmentos de polipéptido FGF-23, ortólogos del polipéptido FGF-23, variantes del polipéptido FGF-23 y derivados del polipéptido FGF-23, los cuales poseen por lo menos una actividad del polipéptido como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2. Los polipéptidos FGF-23 pueden ser polipéptidos maduros, como se definen en la presente, y pueden o no tener un residuo metionina amino terminal, en base en el método mediante el cual se preparen. El término "fragmento de polipéptido FGF-23" se refiere a un polipéptido que comprende una parte truncada en la parte amino terminal (con o sin una secuencia líder) o un corte en la parte carboxilo terminal del polipéptido como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2. El término "fragmento de polipéptido de FGF-23" también se refiere a una parte cortada amino o carboxi terminal de los ortólogos del polipéptido FGF-23, derivados del polipéptido FGF-23 o variantes del polipéptido FGF-23, o con los cortes en la parte amino o carboxilo terminal de los polipéptidos codificados por las variantes alélicas del polipéptido FGF-23 o de las variantes de empalme del polipéptido FGF-23. Los fragmentos del polipéptido FGF-23 pueden resultar de un empalme de ARN alternativo o a partir de actividad de proteasa in vivo . Las formas unidas a membrana de un polipéptido FGF-23 también se contemplan por la presente invención. En modalidades preferidas, los cortes o supresiones comprenden aproximadamente 10 aminoácidos, o aproximadamente 20 aminoácidos o aproximadamente 50 aminoácidos, o aproximadamente 75 aminoácidos o aproximadamente 100 aminoácidos o más de aproximadamente 100 aminoácidos. Los fragmentos polipeptídicos producidos de esta manera comprenderán aproximadamente 25 aminoácidos contiguos, o aproximadamente 50 aminoácidos, o aproximadamente 75 aminoácidos, o aproximadamente 100 aminoácidos o aproximadamente 150 aminoácidos, o aproximadamente 200 aminoácidos, o más de aproximadamente 200 aminoácidos. Tales fragmentos de polipéptido de FGF-23 opcionálmente pueden comprender un residuo metionina amino terminal . Se apreciará que tales fragmentos se pueden utilizar, por ejemplo, para generar anticuerpos para polipéptidos FGF-23. El término "ortólogo de polipéptido FGF-23" se refiere a un polipéptido de otra especie que corresponde a la secuencia de aminoácidos del polipéptido FGF-23, como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2. Por ejemplo, los polipéptidos FGF-23 de ratón y de humano se consideran ortólogos entre si. El término "variantes de polipéptido FGF-23" se refiere a polipéptidos FGF-23 que comprenden secuencias de aminoácidos que tienen en la secuencia de aminoácidos, una o más sustituciones, supresiones (tales como supresiones internas o fragmentos de polipéptido FGF-23) o adiciones (tales como adiciones internas o polipéptidos de fusión FGF-23) en comparación con la secuencia de aminoácidos del polipéptido FGF-23 que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 2 (con o sin una secuencia líder) . Las variantes pueden ser las que se presentan de manera natural (por ejemplo variantes alélicas del polipéptido FGF-23, ortólogos del polipéptido FGF-23 y variantes de empalme del polipéptido FGF-23) , o se pueden construir artificialmente. Tales variantes del polipéptido FGF-23 se pueden preparar a partir de moléculas de ácido nucleico correspondientes que tengan una secuencia de ADN que varía en consecuencia de la secuencia de ADN como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1. En las modalidades preferidas, las variantes tienen de l a 3, o de l a 5, o de l a 10, o de l a 15, o de 1 a 20, o de 1 a 25, o de 1 a 50, o de 1 a 75, o de l a 100, o más de 100 sustituciones, inserciones, adiciones o supresiones de aminoácidos, en donde las sustituciones pueden ser conservadoras o no conservadoras, o cualquier combinación de las mismas. El término "derivados del polipéptido FGF-23" se refiere al polipéptido como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2, los fragmentos de polipéptido FGF-23, los ortólogos de polipéptido FGF-23 o variantes de polipéptido FGF-23 como se definen en la presente, que se han modificado químicamente. El término "derivados de polipéptido FGF-23" también se refiere a los polipéptidos codificados por las variantes alélicas del polipéptido FGF-23 de las variantes de empalme del polipéptido FGF-23, como se definen en la presente que se han modificado químicamente . El término " polipéptido FGF-23 maduro" se refiere a un polipéptido FGF-23 que carece de una secuencia líder. Un polipéptido FGF-23 maduro también puede incluir otras modificaciones tales como un procesamiento proteolítico de la parte amino terminal (con o sin una secuencia líder) o la parte carboxilo terminal, la separación de un polipéptido más pequeño a partir de un precursor más grande, glucosilación N unida u O-unida y similares. Un polipéptido CHL maduro ejemplar se muestra por la secuencia de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3. El término "polipéptido de fusión de FGF-23" se refiere a la fusión de uno o más aminoácidos (tales como una proteína o péptido heterólogo) de la parte amino o carboxilo terminal del polipéptido, como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2, fragmentos de polipéptido FGF-23, ortólogos del polipéptido FGF-23, o variantes polipeptídicas de FGF-23 o derivados de FGF-23, como se definen en la presente. El término " polipéptido de fusión FGF-23" también se refiere a una fusión de uno o más aminoácidos en la parte amino o carboxilo terminal del polipéptido codificado por las variantes alélicas del polipéptido FGF-23 o las variantes de empalme del polipéptido FGF-23, como se definen en la presente. El término "polipéptido FGF-23 biológicamente activos" se refiere a polipéptidos FGF-23 que tienen por lo menos una actividad característica del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2. Además, un polipéptido FGF-23 puede ser activo como un inmunógeno; es decir, el polipéptido FGF-23 contiene por lo menos un epitopo para el cual se pueden generar anticuerpos. El término "polipéptido aislado" se refiere a un polipéptido de la presente invención que: (1) se han separado de por lo menos 50 por ciento de los polinucleótidos, lípidos, carbohidratos u otros materiales con los cuales se encuentra de manera natural cuando se aisla de la célula fuente, (2) no está unido (por interacción covalente o no covalente) a la totalidad o a una porción de un polipéptido al cual el "polipéptido aislado se encuentra unido en la naturaleza, (3) está unido operablemente (por interacción covalente o no covalente) a un polipéptido con el cual no está unida la naturaleza, o bien (4) no se presenta en la naturaleza. Preferiblemente, el polipéptido aislado está sustancialmente libre de cualquier otro polipéptido contaminante o de otros contaminantes que se encuentran en su ambiente natural y que pueden interferir son su uso terapéutico, diagnóstico, profiláctico o de investigación. El término "identidad", como se conoce en la técnica se refiere a la relación entre las secuencias de dos o más moléculas polipeptídicas o dos o más moléculas de ácido nucleico, determinadas al comparar las secuencias. En la técnica "identidad" también significa el grado de relación de secuencias entre moléculas de ácido nucleico o polipéptidos según sea el caso, determinado por la coincidencia entre cadenas de dos o más secuencias nucleotídicas o dos o más secuencias de aminoácidos. La "identidad" mide el por ciento de coincidencias idénticas entre las más pequeñas de las dos o más secuencias con separaciones de alineación (si las hay) resueltas por un modelo matemático particular o un programa de computadora (es decir, "algoritmos"). El término "similitud" es un concepto relacionado, pero en contraste con "identidad", "similitud" se refiere a una medida de relación la cual incluye tanto coincidencias idénticas como coincidencias por sustitución conservadora. Por ejemplo si dos secuencias polipeptídicas tienen 10/20 aminoácidos idénticos, y el resto son sustituciones no conservadoras, entonces el por ciento de identidad y de similitud en ambos casos sería de 50%. Si en el mismo ejemplo, existieran cinco posiciones adicionales en donde hubiera sustituciones conservadoras, entonces el por ciento de identidad permanece en 50% pero el por ciento de similitud sería de 70% (15/20) . Por lo tanto, en los casos en donde existen sustituciones conservadoras, el por ciento de similitud entre dos polipéptidos será mayor que el por ciento de identidad entre estos dos polipéptidos. El término "que se presenta de manera natural" o "nativo", cuando se utiliza en relación con materiales biológicos tales como moléculas de ácido nucleico, polipéptidos, células huéspedes y similares, se refiere a materiales los cuales se encuentran en la naturaleza y no son manipulados por el hombre. De manera similar "que no se presenta de manera natural" o "no nativo" como se utiliza en la presente, se refiere a un material que no se encuentra en la naturaleza o que ha sido modificado estructuralmente o sintetizado por el hombre. Los términos "cantidad eficaz" y "cantidad terapéuticamente eficaz" se refieren cada una a la cantidad de un polipéptido FGF-23 o una molécula de ácido nucleico para FGF-23 utilizada para sustentar un nivel observable de una o más actividades biológicas de los polipéptidos FGF-23, como se establecen en la presente. El término "portador farmacéuticamente aceptable" o "portador fisiológicamente aceptable" como se utiliza en la presente, se refiere a uno o más materiales de formulación adecuados para llevar a cabo o para mejorar el suministro del polipéptido FGF-23, la molécula de ácido nucleico para FGF-23 o el agente de unión selectivo de FGF-23, como una composición farmacéutica. El término "antígeno" se refiere a una molécula o una porción de una molécula capaz de unirse mediante un agente de unión selectivo, tal como un anticuerpo, y adicionalmente capaz de ser utilizada en un animal para producir anticuerpo capaces de unirse a un epitopo de ese antígerio. Un antígeno puede tener uno o más epitopos. El término "agente de unión selectivo" se refiere a una o varias moléculas que tienen especificidad por un polipéptido FGF-23. Como se utiliza en la presente, los términos "específico" y "especificidad" se refieren a la capacidad de los agentes de unión selectivos para unirse a polipéptidos FGF-23 humanos y para no unirse a polipéptidos diferentes de FGF-23 humanos. Sin embargo, se apreciará que los agentes de unión selectivos también pueden unir ortólogos del polipéptido como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2, esto es, versiones entre especies de los mismos, tales como los polipéptidos FGF-23 de ratón y de rata. El término "transducción" se utiliza para referirse a la transferencia de genes de una bacteria a otra, habitualmente por un fago. "Transducción" también se refiere a la adquisición y transferencia de secuencias celulares eucariotas por retrovirus. El término "transfección" se utiliza para referirse a la captación de ADN extraño o exógeno por una célula, y una célula ha sido "transfectada" cuando el ADN exógeno se ha introducido dentro de la membrana celular. Se conocen bien en la técnica muchas técnicas de transfección y se describen en la presente. Véase, por ejemplo, Graham et al . , 1973, Virology 52:456; Sambrook et al . , Molecular 5 Cloning, A . Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratories, 1989); Davis et al . , Basic Methods in Molecular Biology (Elsevier, 1986); y Chu et al . , 1981. Gene 13:197. Tales técnicas se pueden utilizar para introducir una o más porciones de ADN exógeno en las células huéspedes 10 adecuadas. El término "transformación" como se utiliza en la presente, se refiere a un cambio en las características genéticas de la célula, y una célula que ha sido transformada cuando ha sido modificada para contener un ADN 15 nuevo. Por ejemplo, una célula es transformada cuando ha sido modificada genéticamente con respecto a su estado nativo. Después de la transfección o transducción, el ADN transformante se puede recombinar con el de la célula al intercambiar físicamente en el cromosoma de la célula, y se 20 puede mantener de manera transitoria como un elemento episómico sin que se replique, o puede ser replicado independientemente como un plásmido. Una célula se considera que ha sido transformada de manera estable cuando el ADN se replica con la división de la célula. 25 ^gj£g Relación de las Moléculas de Ácido Nucleico y Polipéptidos Se entiende que las moléculas de ácido nucleico relacionadas incluyen variantes alélicas o de empalme de la 5 molécula de ácido nucleico de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: i, e incluyen secuencias las cuales son complementarias con cualquiera de las secuencias nucleotídicas anteriores. Las moléculas de ácido nucleico relacionadas también incluyen una secuencia nucleotídica que 10 codifica para un polipéptido que comprende o que consiste esencialmente de una sustitución, modificación, adición o supresión de uno o más residuos aminoácidos en comparación con el polipéptido de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 2. Tales polipéptidos FGF-23 relacionados pueden comprender, 15 por ejemplo, una adición o una supresión de uno o más sitios de glucosilación ? u O-unidos o una adición o supresión de uno o más residuos cisteína. Las moléculas de ácido nucleico relacionadas también incluyen fragmentos de molécula de ácido nucleico 20 para FGF-23 el cual codifica para un polipéptido de por lo menos aproximadamente 25 aminoácidos contiguos, o aproximadamente 50 aminoácidos, o aproximadamente 75 aminoácidos, o aproximadamente 100 aminoácidos, o más de 100 residuos aminoácidos del polipéptido FGF-23 de la SECUENCIA 25 DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2. __M_____^_______áttíH_____? Además, las moléculas de ácido nucleico para FGF-23 relacionadas también incluyen aquellas moléculas las cuales comprenden secuencias nucleotídicas que hibridizan bajo condiciones de rigurosidad moderada o elevada como se define en la presente, con una secuencia totalmente complementaria de la molécula de ácido nucleico para FGF-23 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1, o de una molécula que codifica para un polipéptido, polipéptido el cual comprende la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 , o un fragmento de ácido nucleico como se define en la presente, o de un fragmento de ácido nucleico que codifica para un polipéptido como se define en la presente. Las sondas de hibridación se pueden preparar utilizando las secuencias de FGF-23 que se proporcionan en la presente para cribar ADNc, bibliotecas de ADN genómico o sintético para secuencias relacionadas. Las regiones del ADN o de la secuencia de aminoácidos para el polipéptido FGF-23 que muestren identidad significativa con secuencias conocidas se determinan fácilmente utilizando algoritmos de alineación de secuencia como se describe en la presente y estas regiones se pueden utilizar para diseñar sondas para cribado o identificación sistemática. El término "condiciones altamente rigurosas" se refiere a aquellas condiciones que se diseñan para permitir la hibridación de cadenas de ADN cuyas secuencias son altamente complementarias, y excluir la hibridación de los ADN con mal pareamiento significativo. La rigurosidad de hibridación se determina principalmente por temperatura, fuerza iónica y la concentración de los agentes desnaturalizantes tales como formamida. Los ejemplos de "condiciones altamente rigurosas" para hibridación elevado son cloruro de sodio 0.015M, citrato de sodio 0.0015M a 65-68°C, o cloruro de sodio 0.015M, citrato de sodio 0.0015M y formamida 50% a 42 °C. Véase Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, 1989); Anderson et al . , Nucleic Acid Hybridi sa tion : A Practical Approach Ch. 4 (IRL Press Limited) . Las condiciones más rigurosas (tales como mayor temperatura, menor fuerza iónica, una mayor concentración de formamida o de otro agente desnaturalizante) también se pueden utilizar - sin embargo, se alterará la velocidad de hibridación. Se pueden incluir otros agentes en la hibridación y amortiguadores de lavado con el propósito de reducir la hibridación no específica o de fondo. Los ejemplos son albúmina sérica bovina 0.1%, polivinilpirrolidona 0.1%, pirofosfato de sodio 0.1%, dodeciisulfato de sodio 0.1% NaDodS0 , (SDS), ficoll, solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (u otro ADN no complementario) y sulfato de dextrano, aunque también se pueden utilizar otros agentes adecuados. La concentración y tipos de estos aditivos pueden cambiar sin alterar sustancialmente la rigurosidad de las condiciones de hibridación. Los experimentos de hibridación habitualmente se llevan a cabo a un pH de 6.8-7.4; sin embargo, en condiciones típicas de fuerza iónica, la velocidad de hibridación depende mucho del pH. Véase Anderson et al . , Nucleic Acid Hibridisation : A Practical Approach Ch. 4 (IRL Press Limited) . Los factores que afectan la estabilidad de una cadena doble de ADN incluyen composiciones de base, longitud y grado de mal pareamiento de pares de bases. Se pueden ajustar las condiciones de hibridación por los expertos en la técnica con el fin de adaptar estas variables y permitir que los ADN con relaciones de secuencias diferentes formen híbridos. Se puede determinar la temperatura de fusión de un ADN doble pareado perfectamente por la siguiente ecuación: Tm(°C) = 81.5 +16.6 (log [Na+] ) + 0.41 (% de G+C) - 600/N - 0.72 (% de formamida), en donde N es la longitud de la cadena doble que se forma, [Na+] , y la concentración molar del ion sodio en la solución de hibridación o de lavado, % de G+C es el porcentaje de bases (guanina + citosina) en el híbrido. Para híbridos f~* -*¿-¡-*- - pareados de manera imperfecta, la temperatura de fusión se reduce en aproximadamente 1°C por cada 1% de mal pareamiento. El término "condiciones de rigurosidad moderada" se refiere a condiciones bajo las cuales se puede formar una cadena de ADN doble con un mayor grado de mal pareamiento de pares de bases que el que se podría producir bajo "condiciones de rigurosidad elevada" . Los ejemplos de "condiciones de rigurosidad moderada" son cloruro de sodio 0.015 M, citrato de sodio 0.0015 M a 60-65°C, o cloruro de sodio 0.015 M, citrato de sodio 0.0015 M y formamida 20% a 37-50°C. A modo de ejemplo, las "condiciones de rigurosidad moderada" de 50°C en iones de sodio 0.015 M permitirán aproximadamente un mal pareamiento de 21%. Se apreciará por aquellos expertos en la técnica que no hay una diferenciación absoluta entre "condiciones de alta rigurosidad" y "condiciones de rigurosidad moderada". Por ejemplo, a una concentración de ion sodio 0.015 M (sin formamida) , la temperatura de fusión de ADN largo perfectamente pareado es de aproximadamente 71°C. Con un lavado a 65 °C (a la misma fuerza iónica) , esto puede permitir aproximadamente un mal pareamiento de 6%. Para retener secuencias relacionadas de manera más distante, una persona experta en la técnica simplemente puede disminuir la temperatura o bien incrementar la fuerza iónica. _» . . . - r _,t _.. »_ .
Una buena determinación de la temperatura de fusión en NaCl 1M* para sondas oligonucleotídicas de hasta aproximadamente 20 nt está dada por: Tm = 2°C por pares de bases A-T + 4°C por pares de bases G-C *La concentración del ion sodio en citrato de sodio en solución salina 6X (SSC) es 1M. Véase Suggs et al . , Developmental Biology Using Purified Genes 683 (Brown and Fox, eds. , 1981) . Las condiciones de lavado de alta rigurosidad para oligonucleótidos habitualmente son a una temperatura de 0-5°C por debajo de la Tm del oligonucleótido en 6X SSC, SDS 0.1%. En otra modalidad, las moléculas relacionadas de ácido nucleico comprenden o consisten de una secuencia nucleotídica que es por lo menos aproximadamente 70 por ciento idéntica a la secuencia nucleotídica como se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1, o comprenden o consisten esencialmente de una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido que es por lo menos aproximadamente 70 por ciento idéntico al polipéptido como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2. En las modalidades preferidas, las secuencias nucleotídicas son de aproximadamente 75 por ciento, o aproximadamente 80 por ciento, o aproximadamente 85 por ciento, o aproximadamente 90 por ciento, o aproximadamente 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento idénticas a la secuencia nucleotídica como se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1, o las secuencias nucleotídicas que codifican para un polipéptido son aproximadamente 75 por ciento, o aproximadamente 80 por ciento, o aproximadamente 85 por ciento, o aproximadamente 90 por ciento, o aproximadamente 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento idéntico a la secuencia polipeptídica como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2. Las moléculas relacionadas de ácido nucleico que codifican para polipéptidos que poseen por lo menos una actividad del polipéptido como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2. Las diferencias en la secuencia de ácido nucleico pueden resultar en modificaciones conservadoras o no conservadoras de la secuencia de aminoácidos en relación a la secuencia de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2. Las modificaciones conservadoras de las secuencias de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 (y las modificaciones correspondientes a los nucleótidos codificantes) producirán un polipéptido que tengan características funcionales y químicas similares a los de los polipéptidos FGF-23. En contraste, se pueden llevar a cabo modificaciones sustanciales en las características funcionales o químicas de los polipéptidos FGF-23 al seleccionar sustituciones en la secuencia de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 que difieren significativamente en su efecto en mantener: (a) la estructura de la estructura principal molecular en el área de sustitución, por ejemplo, como una conformación de lámina o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o bien (c) el volumen de la cadena lateral . Por ejemplo, una "sustitución conservadora de aminoácidos" puede involucrar una sustitución de un residuo aminoácido nativo con un residuo no nativo de manera que exista poco o nulo efecto en la polaridad o la carga del residuo aminoácido en esa posición. Además, cualquier residuo nativo en el polipéptido también puede estar sustituido con alanina, como se ha descrito previamente para la "mutagénesis de exploración de alanina" . Las sustituciones conservadoras de aminoácidos también abarcan residuos aminoácidos que no se presentan de manera natural y que habitualmente se incorporan por síntesis peptídica química en vez de realizarlo por síntesis en sistemas biológicos. Estos incluyen péptido miméticos y otras formas revertidas o invertidas de porciones de aminoácidos. Los residuos que se presentan de manera natural se pueden dividir en clases en base en sus propiedades de cadena lateral común: 1) hidrofóbicos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; 2) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr; 3) ácidos: Asp, Glu; 4) básicos: Asn, Gln, His, Lys, Arg; 5) residuos que alteran la orientación de la cadena: Gly, Pro; y 6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe. Por ejemplo, las sustituciones no conservadoras pueden involucrar el cambio de un miembro de estas clases por el miembro de otra clase. Tales residuos sustituidos se pueden introducir en regiones del polipéptido FGF-23 humano que son homologas con los polipéptidos FGF-23 no humanos o en las regiones no homologas de la molécula. Al realizar tales cambios, debe considerarse el índice hidropático de los aminoácidos. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático en base en su hidrofobicidad y sus características de carga. Los índices hidropáticos son: isoleucina (+4.5); valina (+4.2); leucina (+3.8); fenilalanina (+2.8); cisteína/cistina (+2.5); metionina (+1.9); alanina (+1.8); glicina (-0.4); treonina (-0.7); serina (-0.8); triptofano (-0.9); tirosina (-1.3) prolina (-1.6); histidina (-3.2); glutamato (-3.5) glutamina (-3.5); aspartato (-3.5); asparagina (-3.5) lisina (-3.9); y arginina (-4.5). La importancia del índice hidropático de los aminoácidos para conferir una función biológica interactiva en una proteína se entiende generalmente en la técnica (Kyte et al . , 1982, J. Mol . Biol . 157:105-31). Se sabe que algunos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos que tengan un índice o calificación hidropática similar y retener aún la actividad biológica similar. Al realizar cambios en base en el índice hidropático, se prefiere a la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos estén dentro de + 2 , prefiriéndose particularmente aquellos que están dentro de + 1, y prefiriéndose de manera mucho más particularmente aquellos que están dentro de + 0.5. También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares se puede llevar a cabo de manera efectiva en base en la hidrofilicidad, particularmente cuando la proteína funcionalmente equivalente de manera biológica o el péptido de esta manera generado se diseña para uso en modalidades inmunológicas, como en el presente caso. La mayor hidrofilicidad promedio local de una proteína, gobernada por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con su - inmunogenicidad y antigenicidad, es decir, con una propiedad biológica de la proteína. Se han asignado los siguientes valores de hidrofilicidad para estos residuos aminoácidos: arginina (+3.0);' lisina (+3.0); aspartato (+3.0 + 1); glutamato (+3.0 + 1); serina (+0.3); asparagina (+0.2); glutamina (+0.2); glicina (0); treonina (-0.4); prolina (-0.5 + 1); alanina (-0.5); histidina (-0.5); cistina (-1.0); metionina (-1.3); valina (-1.5); leucina (-1.8); isoleucina (-1.8); tirosina (-2.3); fenilalanina (-2.5); y triptofano (-3.4). Al realizar cambios en base en valores de hidrofilicidad similares, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de +2, prefiriéndose aquellos los cuales están dentro de +1, y prefiriéndose de manera más particularmente aquellos dentro de +0.5. Uno también puede identificar epitopos de secuencias de aminoácidos primarias en base en la hidrofilicidad. Estas regiones También se denominan como "regiones de núcleo epitópico" . Se pueden determinar las sustituciones deseadas de aminoácidos (conservadoras o no conservadoras) por aquellos expertos en la técnica en el momento en que se deseen tales sustituciones. Por ejemplo, se pueden utilizar sustituciones de aminoácidos para identificar residuos importantes del polipéptido FGF-23, o para aumentar o disminuir la afinidad - de los polipéptidos FGF-23 descritos en la presente. Las sustituciones ejemplares de aminoácidos se establece en la tabla I.
Tabla 1 Sustituciones de Aminoácidos Residuo Original Sustituciones Sustituciones Ejemplares Preferidas Ala Val, Leu, lie Val Arg Lys, Gln, Asn Lys Asn Gln Gln Asp Glu Glu Cys Ser, Ala Ser Gln Asn Asn Glu Asp Asp Gly Pro, Ala Ala His Asn, Gln, Lys, Arg Arg lie Leu, Val, Met, Ala, Leu Phe, Norleucina Leu Norleucina, lie, lie Val, Met, Ala, Phe Lys Arg, ácido 1, 4 -diamino-- Arg butírico, Gln, Asn Met Leu, Phe, lie Leu Phe Leu, Val, lie, Ala, Leu Tyr Pro Ala Gly Ser Thr, Ala, Cys Thr Thr Ser Ser Trp Tyr, Phe Tyr Tyr Trp, Phe, thr, Ser Phe Val lie, Met, Leu, Phe, Leu Ala, Norleucina Una persona experta en la técnica será capaz de determinar las variantes adecuadas del polipéptido como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 utilizando técnicas bien conocidas. Para identificar áreas adecuadas de la molécula que se pueden cambiar sin destruir la actividad biológica, una persona experta en la técnica puede dirigirse a áreas que no consideren de importancia para la actividad. Por ejemplo, cuando se conocen polipéptidos similares con actividades similares de la misma especie o de otra especie, una persona experta en la técnica puede comparar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido FGF-23 con tales polipéptidos similares. Con tal comparación, uno puede identificar residuos y porciones de r. ... I... ... las moléculas que se conservan entre polipéptidos similares. Se apreciará que los cambios en las áreas de la molécula de FGF-23 que no conserven tales polipéptidos similares es menos probable que alteran adversamente la actividad biológica o la estructura de un polipéptido FGF-23. Un experto en la técnica también puede saber que, incluso en regiones conservadas relativamente, uno puede sustituir aminoácidos químicamente similares por residuos que se presenten de manera natural mientras retengan actividad (sustituciones conservadores de residuos aminoácidos) . Por lo tanto, incluso las áreas que pueden ser importantes para actividad biológica o para estructura se pueden someter a sustituciones conservadoras de aminoácidos sin destruir la actividad biológica o sin alterar de manera adversa la estructura del polipéptido. De manera adicional, una persona experta en la técnica pueda revisar los estudios de estructura y función que identifican residuos en polipéptidos similares que sean importantes para actividad o estructura. En vista de tal comparación, uno puede predecir la importancia de residuos aminoácidos en un polipéptido FGF-23 que correspondan a los residuos aminoácidos que son importantes para actividad o estructura en polipéptidos similares. Una persona experta en la técnica puede optar por sustituciones de aminoácidos químicamente similares para tales residuos de aminoácidos importantes predichos de los polipéptidos FGF-23. Una persona experta en la técnica también puede analizar la estructura tridimensional y la secuencia de aminoácidos en relación a esa estructura en polipéptidos similares. En vista de tal información, una persona experta en la técnica puede predecir la alineación de residuos aminoácidos del polipéptido FGF-23 respecto a su estructura tridimensional . Una persona experta en la técnica puede elegir no realizar cambios radicales en los residuos aminoácidos predichos que estén en la superficie de la proteína, dado que tales residuos pueden estar relacionados en interacciones importantes con otras moléculas. Además, una persona experta en la técnica puede generar variantes de prueba que contengan una sola sustitución de aminoácido en cada residuo aminoácido. Las variantes pueden ser examinadas utilizando ensayos de actividad conocidos por aquellos expertos en la técnica. Tales variantes pueden ser utilizadas para obtener información acerca de variantes adecuadas. Por ejemplo, si uno descubre que un cambio en un residuo aminoácido particular resulta en una actividad destruida, reducida indeseablemente o inadecuada, se deben evitar variantes con tal cambio. En otras palabras, en base en la información que se obtenga de tales experimentos de rutina o sistemáticos, una persona experta en la técnica puede determinar con facilidad los aminoácidos en donde se deben evitar sustituciones adicionales ya sea solos o en combinación con otras mutaciones. Se han realizado muchas publicaciones científicas para la predicción de la estructura secundaria (véase Moult, 1996, Curr. Opin . Biotechnol . 7:422-27; Chou et al . , 1914 , Biochemistry 13:222-45; Chou et al . , 1974, Biochemistry 113:211-22; Chou et al . , 1978, Adv. Enzymol . Relat . reas Mol . Biol . 47:45-48; Chou et al . , 1978, Ann . Rev. Biochem . A l :251-276; y Chou et al . , 1979, Biophys . J. 26:367.84. Además, actualmente se disponen de programas de computadora para ayudar a la predicción de la estructura secundaria. Un método para predecir la estructura secundaria se basa en el modelado de homología. Por ejemplo, dos polipéptidos o proteínas que tengan una identidad de secuencia mayor de 30%, o una similitud mayor de 40%, con frecuencia tienen topologías estructurales similares. El avance reciente en la base de datos de proteínas estructurales (PDB) ha proporcionado una capacidad de predicción mejorada en la estructura secundaria, incluyendo el número potencial de pliegues dentro de la estructura de un polipéptido o proteína. Véase Holm et al . , 1999, Nucleic Acids Res . 27:244-47. Se ha sugerido que existe un número limitado de pliegues en un polipéptido o proteína dado y que, una vez que se han resuelto un número crítico de estructuras, la predicción estructural será notablemente más precisa (Brenner et al . , 1997, Curr. Opin . Struct . Biol . 7:369-76). Los métodos adicionales para predecir una estructura secundaria incluyen "secuenciado o establecimiento de cadenas" (Jones, 1997, Curr. Opin . Struct." Biol . 7:377-87; Sippl et al . , 1996, Structure 4:15-19), "análisis de perfil" (Bowie et al . , 1991, Sciences, 253:164-170; Gribskov et al . , 1990, Method Enzymol . 183:146-59; Gribskov et al . , 1987, Proc . Natl . Acad. Sci . U. S.A . 84:4355-58), y "enlace evolutivo" (Véase Holm et al . , supra, y Brenner et al . , supra) . Las variantes preferidas del polipéptido FGF-23 incluyen variantes de glicosilación en donde se ha alterado el número o tipo de sitios de glicosilación en comparación con la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2. En una modalidad, las variantes del polipéptido FGF-23 comprenden un número mayor o menor de sitios de glicosilación unidos a N en comparación con la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2. Un sitio de glicosilación unido a N se caracteriza por la secuencia: Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, en donde el residuo aminoácido designado como X puede ser cualquier residuo aminoácido menos prolina. La sustitución de los residuos aminoácidos para crear esta secuencia proporciona un sitio potencial nuevo para la adición de una cadena de carbohidrato unida a N. Alternativamente, las sustituciones que eliminan esta secuencia eliminarán una cadena existente de carbohidrato unido a N. También se proporciona un rearreglo de las cadenas de carbohidrato unidas N en donde se eliminan uno o más sitios de glicosilación unidos a N (típicamente aquellos que se presentan de manera natural) , y se generan uno o más sitios nuevos unidos a N. Las variantes de FGF-23 preferidas adicionales incluyen variantes de cisteína, en donde se suprimen o sustituyen uno o más residuos cisteína con otro aminoácido (por ejemplo serina) en comparación con la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2. Las variantes de cisteína son útiles cuando los polipéptidos de FGF-23 deben ser renaturalizados en una conformación biológicamente activa por ejemplo después del aislamiento de cuerpos de inclusión insolubles. Las variantes de cisteína generalmente tienen menos residuos cisteína que la proteína nativa y típicamente tienen un número par para minimizar interacciones que resulten de cisteínas no pareadas. En otras modalidades, las moléculas relacionadas de ácido nucleico comprenden o consisten de una secuencia no nucleotídica que codifica para un polipéptido como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 con por lo menos una inserción de un aminoácido y en donde el polipéptido tiene una actividad del polipéptido como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2, o una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 2 con por lo menos una supresión de un aminoácido y en donde el polipéptido tiene una actividad del polipéptido como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2. Las moléculas relacionadas de ácido nucleico también comprenden o consisten de una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2, en donde el polipéptido tiene una parte truncada carboxilo o amino terminal y además en donde el polipéptido tiene una actividad del polipéptido que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2. Las moléculas relacionadas de ácido nucleico también comprenden o consisten de una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2, con por lo menos una modificación que se selecciona del grupo que consiste de sustituciones, inserciones y supresiones de aminoácidos, cortes en la parte carboxilo terminal y cortes en la parte amino terminal, y en donde el polipéptido tiene una actividad del polipéptido que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2. Además, el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2, u otro polipéptido FGF-23, se puede fusionar a un - polipéptido homólogo para formar un homodímero o un polipéptido heterólogo para formar un heterodímero. Los péptidos y polipéptidos heterólogos incluyen, pero no se limitan a: un epítopo para permitir la detección y aislamiento de un polipéptido de fusión FGF-23; una proteína receptora transmembrana o una porción de la misma, tal como un dominio extracelular o un dominio transmembranal e intracelular; un ligando o una porción del mismo el cual se une a una proteína de receptor transmembranal; una enzima o una porción de la misma la cual es catalíticamente activa, un polipéptido o péptido el cual promueve la oligomerización tal como un dominio de cremallera de leucina; un polipéptido o péptido que aumenta la estabilidad tal como una región constante de inmunoglobulina; y un polipéptido el cual tiene una actividad terapéutica diferente del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2, u otro polipéptido FGF-23. Las fusiones se pueden realizar ya sea en la parte amino terminal o en la parte carboxilo terminal del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2, u otro polipéptido FGF-23. Las fusiones se pueden llevar a cabo sin una molécula enlazante o adaptadora, o bien a través de una molécula enlazante o adaptadora. Una molécula enlazante o adaptadora puede ser uno o más residuos aminoácidos, típicamente de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 residuos aminoácidos. Una molécula enlazante o adaptadora también se puede diseñar con un sitio 5 de separación para una endonucleasa de restricción por ADN o para una proteasa con el fin de permitir la separación de las porciones fusionadas. Se apreciará que una vez construidos, los polipéptidos de fusión pueden formar derivados de acuerdo con los métodos que se describen en la 10 presente. En una modalidad adicional de la invención, el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 u otro polipéptido FGF-23, se fusiona a uno o más dominios de una región Fe de 15 IgG humana. Los anticuerpos comprenden dos partes funcionalmente independientes, un dominio variable conocido como "Fab", que une un antígeno, y un dominio constante conocido como "Fe", que está relacionado con las funciones efectoras tales como activación del complemento y ataque por 20 células fagocíticas. Un Fe tiene una vida media en suero prolongada, mientras que el Fab tiene una duración corta. Capón et al . , 1989, Nature 337:525-31. Cuando se construyen junto con una proteína terapéutica, un dominio Fe puede proporcionar una vida media más prolongada o incorporar 25 funciones tales como unión a receptor Fe, unión de proteína -______*____._.-.^ _.., - A, fijación de complemento y tal vez incluso transferencia placentaria. La tabla II resume el uso de ciertas fusiones de Fe conocidas en la técnica.
Tabla II Fusiones Fe con Proteínas Terapéuticas 10 15 20 25 ^gj*^j^ En un ejemplo, una región de IgG humana de bisagra, CH2 y CH3 se puede fusionar ya sea en la parte amino terminal o carboxilo terminal de los polipéptidos FGF-23 utilizando métodos conocidos por los expertos en la técnica. En otro ejemplo, la región de IgG humana de bisagra, CH2 y CH3 se puede fusionar ya sea en la parte amino terminal o carboxilo terminal de un fragmento del polipéptido FGF-23 (por ejemplo, la porción extracelular predicha del polipéptido FGF-23) . El polipéptido de fusión FGF-23 resultante se puede purificar mediante el uso de una columna de afinidad de proteína A. Los péptidos y proteínas fusionados a una región Fe se ha encontrado que muestran una vida media sustancialmente mayor in vivo en comparación con sus contrapartes no fusionadas. Además, una fusión a una región Fe permite la dimerización/multimerización del polipéptido de fusión. La región Fe puede ser una región Fe que se presente de manera natural, o puede estar alterada para mejorar ciertas calidades, tales como calidad terapéutica, tiempo de circulación o agregación reducida. La identidad y similitud de moléculas de ácido nucleico relacionadas y de los polipéptidos se calcula fácilmente por métodos conocidos. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a los descritos en Computational Molecular Biology (A.M. Lesk, ed., Oxford University Press 1988) ; Biocomputing : Informa tics and Genome Projects (D.W. Smith, ed. , Academic Press 1993) : Computer Analysis of Sequence Data (Part 1, A.M. Griffin and H.G. Griffin, eds., Humana Press 1994) ; G. von Heinle, Sequence Analysis in 5 Molecular Biology (Academic Press 1987) ; Sequence Analysis Primer (M. Gribskov and J. Devereux, eds., M. Stockton Press 1991); y Carillo et al . , 1988, SIAM J. Applied Math . , 48:1073. Los métodos preferidos para determinar identidad o 10 similitud se diseñan para proporcionar la mayor coincidencia entre las secuencias probadas. Los métodos para determinar identidad y similitud se describen en programas de computadora disponibles de manera pública. Los métodos de programa de computadora preferidos para determinar identidad 15 y similitud entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan al paquete de programa GCG, que incluye GAP (Devereux et al . , 1984, Nucleic Acids Res . 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wl) , BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul et al . , 1990, J". Mol . Biol . 20 215:403-10). El programa BLASTX está disponible públicamente del National Center for Biotechnology Information (NCBI) y otras fuentes (Altschul et al . , BLAST Manual (NCB NLM NIH, Bethesda, MD) ; Altschul et al . , 1990 supra) . También se puede utilizar el algoritmo bien conocido de Smith Waterman 25 para determinar identidad. -|-|*tñt_i'_'^µf*-***-'"•to¿-*- Ciertos esquemas de alineación para alinear dos secuencias de aminoácidos pueden resultar en el pareamiento de únicamente una región corta de las dos secuencias, y esta región alineada pequeña puede tener una identidad de 5 secuencia muy alta aunque no haya una relación importante entre las dos secuencias de longitud completa. En consecuencia, en una modalidad preferida, el método de alineación seleccionado (programa GAP) resultará en una alineación que abarca por lo menos 50 aminoácidos contiguos 10 del polipéptido reivindicado. Por ejemplo, utilizando el algoritmo de computadora GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wl) , se alinean dos polipéptidos para los cuales se va a determinar el por ciento de identidad de 15 secuencia, para pareamiento óptimo de sus aminoácidos respectivos ("la cadena pareada" determinada por el algoritmo) . Se utilizan un castigo por abertura de separación (que se calcula como 3X la diagonal promedio; la "diagonal promedio" es el promedio de la diagonal de la 20 matriz de comparación que se utiliza; la "diagonal" es la calificación o el número asignado para cada coincidencia perfecta de aminoácidos por la matriz de comparación particular) , y un castigo por extensión de separación (el cual habitualmente es de 0. IX el castigo de abertura de 25 separación) así como una matriz de comparación tal como PAM 250 o BLOSUM 62, junto con el algoritmo. También se puede utilizar una matriz de comparación estándar por el algoritmo (véase Dayhoff et al . , 5 Atlas of Protein Sequence and Structure (Supp. 3 1978) (matriz de comparación PAM250) ; Henikoff et al . , 1992, Proc . Natl . Acad . Sci USA 89:10915-19 (matriz de comparación BLOSUM 62)). Los parámetros preferidos para la comparación de secuencia de polipéptidos incluyen los siguientes: Algoritmo: Needleman and Wunsch, 1970, J". Mol . Biol . 48:443-53; Matriz de comparación: BLOSUM 62 (Henikoff et al . , supra) ; Castigo por separación: 12 Castigo por longitud de separación: 4 Umbral de similitud: 0 El programa GAP es útil con los parámetros anteriores. Los parámetros mencionados antes son parámetros por omisión para comparaciones de polipéptidos (además de no presentar castigo por finalización de separaciones) utilizando el algoritmo GAP. Los parámetros preferidos para comparación de secuencias de moléculas de ácido nucleicos incluyen los siguientes : Algoritmo: Needleman y Wunsch, supra; Matriz de comparación: pareamiento = +10, mal pareamiento = 0 Castigo por separación: 50 Castigo por longitud de separación: 3 El programa GAP también es útil con los parámetros anteriores . Los parámetros mencionados antes son los parámetros por omisión para comparaciones de molécula de ácido nucleico. Se pueden utilizar otros algoritmos ejemplares, castigos de abertura de separación, castigos por extensión de separación, matrices de comparación y umbrales de similitud, incluyendo los establecidos en el Program Manual, Wisconsin Package, Versión 9, septiembre de 1997. Las elecciones particulares que se realicen serán evidentes para los expertos en la técnica y dependerán de la comparación específica que se realice, tal como ADN a ADN, proteína a proteína, o proteína a ADN; y adicionalmente, si la comparación es entre pares dados de secuencias (en cuyo caso, se prefieren generalmente GAP o BestFit) o entre una secuencia y una base de datos grande de secuencias (en cuyo caso se prefieren FASTA o BLASTA) .
Moléculas de Ácido Nucleico Las moléculas de ácido nucleico que codifican para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de - - un polipéptido FGF-23 se pueden obtener fácilmente de diversas maneras que incluyen, sin limitación, síntesis química, cribado de ADNc de una biblioteca genómica, cribado de una biblioteca de expresión o bien amplificación por PCR 5 de ADNc. Los métodos de ADN recombinantes utilizados en la presente generalmente son los establecidos en Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) o Current Protocols in 10 Molecular Biology (Ausubel et al . , eds., Green Publishers Inc. and Wiley and Sons 1994). La invención proporciona moléculas de ácido nucleico como se describen en la presente así como métodos para obtener tales moléculas. Cuando se ha identificado de una especie un gen 15 que codifica para la secuencia de aminoácidos de un polipéptido FGF-23, la totalidad o una porción de ese gen se puede utilizar como una sonda para identificar ortólogos o genes relacionados para la misma especie. Las sondas o cebadores se pueden utilizar para cribar bibliotecas de ADNc 20 a partir de diversas fuentes de tejido que se cree expresen el polipéptido FGF-23. Además, parte o la totalidad de la molécula de ácido nucleico que tenga la secuencia que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1 se puede utilizar para examinar una biblioteca genómica para 25 identificar y aislar un gen que codifica para la secuencia ^^^^Sfcj? - de aminoácidos de un polipéptido FGF-23. Típicamente, las condiciones de rigurosidad moderada o elevada se utilizarán para cribar con el fin de minimizar el número de resultados falsos positivos que se obtengan del cribado. 5 ' Las moléculas de ácido nucleico que codifican para la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos FGF-23 también se pueden identificar por clonación de expresión que utiliza la detección de clones positivos en base en una propiedad de la proteína expresada. Típicamente, se criban 10 las bibliotecas de ácido nucleico por la unión de un anticuerpo u otro asociado de unión (por ejemplo, receptor o ligando) a proteínas clonadas que se expresan y que se exhiben en la superficie de una célula huésped. El anticuerpo o asociado de unión se modifica con una etiqueta 15 detectable para identificar aquellas células que expresan el clon deseado. Las técnicas de expresión recombinante llevadas a cabo de acuerdo con las descripciones que se establecen a continuación se pueden seguir para generar estos 20 polinucleótidos y para expresar los polipéptidos codificados. Por ejemplo, al insertar una secuencia de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de un polipéptido FGF-23 en un vector apropiado, una persona experta en la técnica puede producir fácilmente grandes 25 cantidades de la secuencia del nucleótido deseado. Las secuencias se pueden utilizar después para generar sondas de detección o cebadores de amplificación. Alternativamente, se puede insertar en un vector de expresión un polinucleótido que codifique para la secuencia de aminoácidos de un 5 polipéptido FGF-23. Al introducir un vector de expresión en un huésped apropiado, se puede producir en grandes cantidades el polipéptido FGF-23 codificado. Otro método para obtener una secuencia adecuada de ácido nucleico es la reacción en cadena de polimerasa (PCR) . 10 En este método, se prepara ADNc a partir de poli (A) +ARN o bien ARN total utilizando la enzima transcriptasa inversa. Dos cebadores, que habitualmente son complementarios para dos regiones separadas de ADNc que codifican para la secuencia de aminoácidos de un polipéptido FGF-23, después 15 se agregan al ADNc junto con una polimerasa tal como polimerasa Taq, y la polimerasa amplifica la región de ADNc entre los dos cebadores. Otro medio para preparar una molécula de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de un 20 polipéptido FGF-23 es la síntesis química utilizando métodos bien conocidos por los expertos en la técnica tales como los descritos por Engels et al . , 1989, Angew. Chem. Intl . Ed. 28:716-34. Estos métodos incluyen, por ejemplo, los métodos fosfotriéster, fosforoamidita y H-fosfonato para síntesis de 25 ácido nucleico. Un método preferido para tal síntesis ^gtea^^^^» - química es la síntesis soportada en polímero utilizando la química estándar de fosforoamidita. Típicamente, el ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos de un polipéptido FGF-23 será de varios cientos de nucleótidos de longitud. Los ácidos nucleicos son más grandes de aproximadamente 100 nucleótidos y se pueden sintetizar como varios fragmentos utilizando estos métodos. Los fragmentos después se pueden unir por ligación para formar la secuencia nucleotídica de longitud completa de un gen para FGF-23. Habitualmente, el fragmento de ADN que codifica para la parte amino terminal del polipéptido tendrá un ATG, el cual codifica para un residuo metionina. Esta metionina puede o no estar presente en la forma madura en el polipéptido FGF-23, dependiendo de si el polipéptido producido en la célula huésped se diseña para ser secretado de esa célula. Se pueden utilizar también otros métodos conocidos por los expertos en la técnica. En algunas modalidades, se han alterado variantes de ácido nucleico que contienen codones para su expresión óptima en un polipéptido FGF-23, en una célula huésped dada. Las alteraciones particulares de los codones dependerán del polipéptido FGF-23 y de la célula huésped seleccionada para expresión. Tal "optimización de codón" se puede llevar a cabo por diversos métodos, por ejemplo, al seleccionar codones que sean preferidos para uso en genes altamente expresados en una célula huésped dada. Los algoritmos de computadora los cuales incorporan tablas de frecuencia de codones tales como "Eco_high.Cod" para preferencia de codones de genes bacterianos altamente expresados se pueden utilizar y se proporcionan por la University of Wisconsin Package Versión 9.0 (Genetics Computer Group, Madison, Wl) . Otras tablas de frecuencia de codones útiles incluyen "Celegans_high. cod" , "Celegans_low. cod" , "Drosophila_high.cod" , "Human_high. cod" , "Maize_high. cod" y "Yeast_high.cod" . En algunos casos, puede ser deseable preparar moléculas de ácido nucleico que codifiquen para variantes del polipéptido FGF-23. Las moléculas de ácido nucleico que codifican para variantes se pueden generar utilizando mutagénesis dirigida al sitio, amplificación por PCR u otros métodos apropiados en donde el o los cebadores tengan las mutaciones puntuales deseadas (véase Sambrook et al . , supra y Ausubel et al . , supra para descripciones de técnicas de mutagénesis) . También se puede utilizar la síntesis química utilizando métodos descritos por Engels et al . , supra para preparar tales variantes. También se podrán utilizar otros métodos conocidos por los expertos en la técnica.
Vectores y Células Huéspedes Se inserta una molécula de ácido nucleico que ratftf ?f- r i* i ***-*** -•— - -=--"*• - —**».**.*-. codifica para la secuencia de aminoácidos de un polipéptido FGF-23, dentro de un vector de expresión apropiado utilizando técnicas de ligación estándar. El vector típicamente se selecciona para que sea funcional en la 5 célula huésped particular utilizada (es decir, el vector es compatible con los organelos de la célula huésped de manera que puede producirse amplificación del gen o expresión del gen) . Una molécula de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de un polipéptido FGF-23 se puede 10 amplificar/expresar en células huéspedes procariotas, de levadura, de insectos (sistemas de baculovirus) y eucariotas. La selección de la célula huésped dependerá, en parte, de si un polipéptido FGF-23 va a ser modificado post- traduccionalmente (por ejemplo glucosilado o fosforilado) . 15 De ser así, las células huéspedes de levadura, insecto o mamífero son preferibles. Para una revisión de los vectores de expresión véase Meth . Enz . , vol. 185 (D.V. Goeddel, ed. , Academic Press 1990) . Típicamente, los vectores de expresión utilizados 20 en cualquiera de las células huéspedes contendrán secuencias para el mantenimiento de plásmidos y para la clonación y expresión de secuencias nucleotídicas exógenas. Tales secuencias, denominadas colectivamente como "secuencias flanqueantes" en algunas modalidades incluirán típicamente 25 una o más de las siguientes secuencias nucleotídicas: un promotor, una o más secuencias mejoradoras, un origen de replicación, una secuencia de terminación de transcripción, una secuencia de intrón completa que contiene un sitio de empalme donador y aceptor, una secuencia que codifica una secuencia líder para secreción de polipéptido, un sitio de unión de ribosoma, una secuencia de poliadenilación, una región polienlazante para insertar el ácido nucleico que codifica para el polipéptido que se va a expresar, y un elemento marcador seleccionable. Cada una de estas secuencias se discute en lo siguiente. Opcionalmente, el vector puede contener una secuencia codificante "etiqueta" es decir, una molécula localizada en el extremo 5' o 3' de la secuencia que codifica para el polipéptido FGF-23; la secuencia oligonucleotídica codifica para poliHis (tal como hexaHis) , u otra "etiqueta" tal como FLAG, HA (hemaglutinina de virus de influenza) o myc a partir de la cual existen anticuerpos disponibles comercialmente. Esta etiqueta típicamente se fusiona al polipéptido ante la expresión del polipéptido y puede servir como un medio para purificación por afinidad del polipéptido FGF-23 a partir de la célula huésped. La purificación por afinidad se puede llevar a cabo, por ejemplo, por cromatografía en columna utilizando anticuerpos contra la etiqueta, como una matriz de afinidad. Opcionalmente, la etiqueta se puede separar subsecuentemente - a partir del polipéptido FGF-23 purificado por varios medios tales como la utilización de ciertas peptidasas para separación. Las secuencias flanqueantes pueden ser homologas (es decir, de la misma especie o cepa que la célula huésped) , heterólogas (es decir, de una especie diferente de la especie o cepa de la célula huésped) , híbrida (es decir, una combinación de secuencias flanqueantes de más de una fuente), o sintéticas, o bien las secuencias flanqueantes pueden ser secuencias nativas las cuales habitualmente funcionan para regular la expresión del polipéptido FGF-23. De esta manera, la fuente de una secuencia flanqueante puede ser cualquier organismo procariota o eucariota, cualquier organismo vertebrado o invertebrado, o cualquier planta, con la condición de que la secuencia flanqueante sea funcional y pueda ser activada por los organelos de la célula huésped. Las secuencias flanqueantes que se utilizan en los vectores de esta invención se pueden obtener por cualquiera de diversos métodos bien conocidos en la técnica. Típicamente, las secuencias flanqueantes se utilizan en la presente - diferentes de las secuencias flanqueantes del gen para FGF-23 - se han identificado previamente por mapeo o por digestión con endonucleasa de restricción y de esta manera se pueden aislar a partir de una fuente de tejido apropiada utilizando las endonucleasas de restricción apropiadas. En algunos casos, se puede conocer la secuencia nucleotídica completa de una secuencia flanqueante. Aquí, la secuencia flanqueante puede ser sintetizada utilizando los métodos descritos en la presente para la síntesis o clonación de ácido nucleico. Cuando se conoce la totalidad o solo una porción de la secuencia flanqueante, se puede obtener utilizando PCR o cribado de una biblioteca genómica con un oligonucleótido o un fragmento de secuencia flanqueante adecuados para la misma u otra especie. Cuando no se conoce la secuencia flanqueante, se puede aislar un fragmento de ADN que contenga una secuencia flanqueante a partir de una pieza más grande de ADN que puede contener, por ejemplo, una secuencia codificante o incluso otro gen o genes. El aislamiento se puede llevar a cabo por digestión con endonucleasa de restricción para producir un fragmento apropiado de ADN, seguido por aislamiento utilizando purificación en gel de agarosa, cromatografía en columna QiagenMR (Chatsworth, CA) u otros métodos conocidos por los expertos en la técnica. La selección de enzimas adecuadas para llevar a cabo este propósito serán evidentes con facilidad para una persona habitualmente experta en la técnica. Un origen de replicación típicamente es una parte de los vectores de expresión de procariota adquiridos comercialmente, y los auxiliares de origen en la - amplificación del vector en una célula huésped. La amplificación del vector a cierta cantidad de copias en algunos casos puede ser importante para la expresión óptima de un polipéptido FGF-23. Si el vector de elección no contiene un sitio de origen de replicación se puede sintetizar uno químicamente en base en una secuencia conocida, y se puede ligar en el vector. Por ejemplo, el origen de replicación del plásmido pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA) es adecuado para la mayor parte de las bacterias gramnegativas y los diversos orígenes (por ejemplo SV40, polioma, adenovirus, virus de estomatitis vesicular (VSV, por sus siglas en inglés) o papilomavirus tal como HPV o BPV) son útiles para clonar vectores en células de mamífero. Generalmente, el componente de origen de replicación no es necesario para vectores de expresión de mamíferos (por ejemplo, con frecuencia se utiliza el origen SV40 únicamente debido a que contiene el promotor temprano) . La secuencia de terminación de transcripción típicamente se encuentra 3 ' respecto al extremo de una región que codifica para un polipéptido y sirve para finalizar la transcripción. Habitualmente, la secuencia de terminación de transcripción en células procariotas es un fragmento rico en G-C, seguido por una secuencia poli-T. Aunque la secuencia se clona fácilmente a partir de una biblioteca o incluso se adquiere comercialmente como parte de un vector, también se puede sintetizar con facilidad utilizando métodos para la síntesis de ácido nucleico tales como los descritos en la presente. Un elemento de gen marcador seleccionable codifica para una proteína necesaria para la supervivencia y crecimiento de una célula huésped que crece en un medio de cultivo selectivo. Los genes marcadores de selección típicos codifican para proteínas que: (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo a ampicilina, tetraciclina o kanamicina para células huéspedes procariotas; (b) complementan deficiencias auxotróficas de la célula; o (c) proporcionan nutrientes fundamentales no disponibles a partir de medios complejos. Los marcadores seleccionables preferidos son el gen de resistencia a kanamicina, el gen de resistencia a ampicilina y el gen de resistencia a tetraciclina. También se puede utilizar un gen de resistencia a neomicina para la selección en células huéspedes procariotas y eucariotas. Se pueden utilizar otros genes de selección para amplificar el gen que se expresará. La amplificación es el procedimiento en el que los genes que se requieren más para la producción de una proteína indispensable para el crecimiento, se colocan de manera reiterada en tándem dentro de los cromosomas de generaciones sucesivas de células recombinantes. Los ejemplos de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero incluyen dihidrofolato reductasa (DHFR) y timidina cinasa. Los transformantes de célula de mamífero se colocan bajo la presión de selección en donde únicamente los transformantes se adaptan de manera única para sobrevivir en virtud del gen de selección presente en el vector. La presión de selección se impone al cultivar las células transformadas bajo condiciones en las cuales se cambia sucesivamente la concentración del agente de selección en el medio, por lo que se lleva a la amplificación tanto del gen de selección como del ADN que codifica para un polipéptido FGF-23. Como resultado, se sintetizan cantidades incrementadas del polipéptido FGF-23 a partir del ADN amplificado. El sitio de unión de ribosoma habitualmente es necesario para el inicio de traducción del ARNm y está caracterizado por una secuencia de Shine-Dalgarno (procariotas) o por una secuencia Kozak (eucariotas) . El elemento típicamente se localiza 3' respecto al promotor y 5 ' respecto a la secuencia codificante de un polipéptido FGF-23 que se va a expresar. La secuencia de Shine-Dalgarno varía, pero típicamente es una polipurina (es decir, que tiene un alto contenido de A-G) . Se han identificado muchas secuencias de Shine-Dalgarno, cada una de las cuales se puede sintetizar fácilmente utilizando métodos que se establecen en la presente y que se utilizan en un vector - procariota. Una secuencia líder o señal se puede utilizar para dirigir un polipéptido FGF-23 fuera de la célula huésped. Típicamente, se coloca una secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de señal en la región codificante de una molécula de ácido nucleico para FGF-23, o directamente en el extremo 5 ' de una región que codifica para el polipéptido FGF-23. Se han identificado muchas secuencias de señal, y cualquiera de estas que sea funcional en la célula huésped seleccionada se puede utilizar junto con una molécula de ácido nucleico para FGF-23. Por lo tanto, una secuencia de señal puede ser homologa (que se presenta de manera natural) o heteróloga respecto a la molécula de ácido nucleico para FGF-23. Adicionalmente, se puede sintetizar químicamente una secuencia de señal utilizando métodos que se describen en la presente. En la mayor parte de los casos, la secreción de un polipéptido FGF-23 de la célula huésped vía la presencia de un péptido señal resultará en la separación del péptido señal del polipéptido FGF-23 secretado. La secuencia de señal puede ser un componente del vector, o puede ser parte de una molécula de ácido nucleico para FGF-23 que se inserta dentro del vector. Incluido dentro del alcance de esta invención está el uso ya sea de una secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia de señal para el polipéptido FGF-23 nativo unido a una región que codifica para el polipéptido FGF-23, o bien una secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia señal heteróloga unida a una región que codifica para el polipéptido FGF-23. La secuencia de señal heteróloga seleccionada debe ser una que se reconoce y que se procesa, es decir, que se separa por una peptidasa de señal, por la célula huésped. Para células huéspedes procaritas que no reconocen y que procesan la secuencia de señal polipeptídica FGF-23 nativa, la secuencia de señal se sustituye por una secuencia de señal procariótica seleccionada, por ejemplo, del grupo de fosfatasa alcalina, penicilinasa o líderes de enterotoxina II termoestables. Para secreción de levadura, la secuencia de señal del polipéptido FGF-23 nativa se puede sustituir por invertasa de levadura, factor a o líderes de fosfatasa acida. En expresión en células de mamífero, la secuencia de señal nativa es satisfactoria, aunque pueden ser adecuadas otras secuencias de señal de mamífero. En algunos casos, tales como en aquellos en donde se desea glucosilación en un sistema de expresión de célula huésped eucariota, uno puede manipular las diversas presecuencias para mejorar la glucosilación o el rendimiento. Por ejemplo, uno puede alterar el sitio de separación de peptidasa de un péptido señal particular, o - agregar prosecuencias las cuales también pueden alterar la glucosilación. El producto de proteína final en la posición -1 (en relación a los primeros aminoácidos de la proteína madura) uno o más aminoácidos adicionales incidentes a la 5 expresión, los cuales pueden no haber sido separados totalmente. Por ejemplo, el producto de proteína final puede tener uno o dos residuos aminoácidos encontrados en el sitio de separación de peptidasa, unidos en la parte amino terminal. De manera alternativa, el uso de algunos sitios de 10 separación de enzima pueden resultar en una forma ligeramente truncada del polipéptido FGF-23 deseado, si la enzima corta en tal área dentro del polipéptido maduro. En muchos casos, se incrementa la transcripción de una molécula de ácido nucleico por la presencia de uno o más 15 intrones en el vector; esto es particularmente cierto cuando el polipéptido se produce en células huéspedes eucariotas, especialmente células huéspedes de mamífero. Los intrones utilizados pueden presentarse naturalmente dentro del gen para FGF-23 especialmente en donde el gen se utiliza como 20 una secuencia genómica de longitud completa o un fragmento de la misma. Cuando el intrón no se presente de manera natural dentro del gen (como es el caso para la mayor parte de los ADNc), el intrón se puede obtener de otra fuente. La posición del intrón con respecto a las secuencias 25 flanqueantes y el gen para FGF-23 generalmente es ^^^J^^g^^^^^^^j^^ importante, dado que el intrón debe ser transcrito para ser eficaz. Por lo tanto, cuando se transcribe una molécula de ADNc para FGF-23, la posición preferida para el intrón está 3 ' respecto al sitio de inicio de transcripción y 5 ' respecto a la secuencia de terminación de transcripción poli-A. Preferiblemente, el intrón o intrones se localizarán uno al lado del otro (es decir, 5' o 3') del ADNc, de manera que no interrumpe la secuencia codificante. Cualquier intrón de cualquier fuente, incluyendo organismos virales, procariotas y eucariotas (vegetales o animales) , se pueden utilizar para llevar a la práctica esta invención, con la condición de que sea compatible con la célula huésped dentro de la cual se inserta. También se incluyen en la presente intrones sintéticos. Opcionalmente, se puede utilizar en el vector más de un intrón. Los vectores de expresión y clonación de la presente invención típicamente contendrán un promotor que se reconoce por el organismo huésped y que está unido operablemente a la molécula que codifica para el polipéptido FGF-23. Los promotores son secuencias no transcritas que se localizan hacia el extremo 5' respecto al codón de inicio de un gen estructural (generalmente dentro de aproximadamente 100 a 1000 pb) que controla la transcripción del gen estructural . Los promotores se agrupan convencionalmente en una de dos clases: promotores inducibles y promotores constitutivos. Los promotores inducibles inician niveles aumentados de transcripción a partir de ADN bajo su control en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo, tales como la presencia o ausencia de un nutriente, o un cambio en la temperatura. Por otra parte, los promotores constitutivos inician la producción de un producto de gen continuo; esto es, existe poco o nulo control sobre la expresión del gen. Una gran cantidad de promotores, reconocidos por diversas células huéspedes potenciales, son bien conocidos. Un promotor adecuado está unido operablemente al ADN que codifica para el polipéptido FGF-23 al separar el promotor del ADN fuente por digestión con enzima de restricción e insertar la secuencia promotora deseada dentro del vector. La secuencia promotora para FGF-23 nativa se puede utilizar para dirigir la amplificación o expresión de una molécula de ácido nucleico para FGF-23. Sin embargo, se prefiere un promotor heterólogo, si se permite una mayor transcripción con rendimientos más elevados de la proteína expresada en comparación con el promotor nativo, y si es compatible con el sistema de células huéspedes que se han seleccionado para uso. Los promotores adecuados para uso con huéspedes procariotas incluyen los sistemas de promotor de ß-lactamasa y de lactosa; fosfatasa alcalina; un sistema promotor de tríptofano (trp) , y promotores híbridos tales como promotor _^^^^¡ !"-« •**-*' - - tac. También son adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Sus secuencias se han publicado, por lo que permiten a una persona experta en la técnica ligarlos en la secuencia de ADN deseada utilizando enlazadores o 5 adaptadores según se necesiten para suministrar sitios de restricción útiles. Los promotores adecuados para uso con huéspedes de levadura también son bien conocidos en la técnica. Los mejoradores de levadura ventajosamente se utilizan con 10 promotores de levadura. Los promotores adecuados para uso con células huéspedes de mamífero son bien conocidos e incluyen, pero no se limitan a aquellos que se obtienen en los genomas de virus tales como virus de polioma, virus de viruela aviar, adenovirus (tal como adenovirus 2) , virus de 15 papiloma bovino, virus de sarcoma aviar, citomegalovirus, retrovirus, virus de hepatitis B y de manera más preferible virus simio 40 (SV40) . Otros promotores adecuados para mamífero incluyen promotores heterólogos de mamífero, por ejemplo, promotores de choque térmico y promotor de actina. 20 Los promotores adicionales los cuales pueden ser de interés para controlar la expresión del gen para FGF-23 incluyen, pero no se limitan a: la región promotora temprana SV40 (Bernoist and Chambón, 1981, Nature 290:304-10); el promotor CMV; el promotor contenido en la secuencia repetida 25 terminal larga 3' de virus de sarcoma Rous (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22:787-97); el promotor de timidina cinasa de herpes (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1444-45); las secuencias reguladoras del gen para metalotionina (Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42); los vectores de expresión de procariota tales como el promotor de ß-lactamasa (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl, Acad. Sci. U.S.A., 75:3727-31) ; o el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:21-25) . También son de interés las siguientes regiones de control de transcripciones de animales, las cuales muestran especificidad de tejido y se han utilizado en animales transgénicos: la región de control del gen I de elastasa la cual es activa en células acinares pancreáticas (Swift et al., 1984, Cell 38:639-46; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol, 50:399-409 (1986); MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); la región de control de gen de insulina la cual es activa en células ß pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315:115-22); la región de control del gen para inmunoglobulina, la cual es activa en células linfoides (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-58; Adames et al., 1985, Nature 318:533-38; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol., 1 : 1436-44) ; la región de control del virus de tumor mamario de ratón el cual es activo en células testiculares, de mama, linfoides y células cebadas (Leder et al., 1986, Cell 45:485-95); la región de control del gen - - para albúmina la cual es activa en hígado (Pinker et al . , 1987, Genes and Devel . 1:268-76); la región de control del gen para la a- feto-proteína, la cual es activa en hígado (Krumlauf et al . , 1985, Mol . Cell . Biol . , 5:1639-48; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58); la región de control de gen para antitripsina-1 a la cual es activa en el hígado (Kelsey et al . , 1987, Genes and Devel . 1:161-71) ; esta región de control del gen de ß-globina el cual es activo en células mieloides (Mogram et al . , 1985, Nature 315:338-40; Kollias et al . , 1986, Cell 46:89-94); la región de control del gen para la proteína básica de mielina la cual es activa en células oligodendrocíticas en el cerebro (Readhead et al . , 1987, Cell 48:703-12); la región de control del gen de la cadena ligera 2 de miosina, la cual es activa en músculo esquelético (Sani, 1985, Nature 314:283-86); y la región de control del gen de hormona de liberación gonadotrópica la cual es activa en el hipotálamo (Masón et al . , 1986, Science 234:1372-78) . Se puede insertar un mejorador de secuencia en el vector para aumentar la transcripción de un ADN que codifica para un polipéptido FGF-23 de la presente invención por eucariotas superiores. Los mejoradores son elementos de acción cis de ADN, donde habitualmente una longitud de 10 a 300 pb que actúan sobre el promotor para aumentar la transcripción. Los mejoradores son relativamente independientes de orientación y posición. Se han encontrado 5' y 3' respecto a la unidad de transcripción. Se conocen varias secuencias mejoradoras disponibles de genes de mamífero (por ejemplo globina, elastasa, albúmina, a-feto- 5 proteína e insulina) . Típicamente, sin embargo se utilizará un mejorador de un virus. El mejorador de SV40, el mejorador del promotor temprano del citomegalovirus, el mejorador de polioma y los mejoradoras de adenovirus son elementos mejoradores ejemplares para la activación de promotores 10 eucariotas. Aunque un mejorador se puede empalmar dentro del vector en una posición 5' o 3' respecto a una molécula de ácido nucleico para FGF-23, típicamente se localiza en un sitio 5' respecto del promotor. Los vectores de expresión de la invención se 15 pueden construir a partir de un vector inicial tal como un vector disponible comercialmente. Tales vectores pueden o no contener la totalidad de las secuencias flanqueantes deseadas. Cuando una o más de las secuencias flanqueantes descritas en la presente no están presentes de antemano en 20 el vector, se pueden obtener individualmente y ligar en el vector. Los métodos utilizados para obtener cada una de las secuencias flanqueantes son bien conocidos por los expertos en la técnica. Los vectores preferidos para llevar a la práctica 25 esta invención son aquellos los cuales son compatibles con - - células huéspedes bacterianas, de insecto y de mamífero. Tales vectores incluyen, por ejemplo, pCRII, pCR3 y pcDNA3.1 (Invitrogen, San Diego, CA) , pBSII (Stratagene, La Jolla, CA) , pET15 (Novagen, Madison, Wl) , pGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) , pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, CA) , pETL (BlueBacII, Invitrogen), pDSR-a (Publicación PCT No. WO 90/14363) y pFastBacDual (Gibco-BRL, Grand Island, NY) . Los vectores adecuados adicionales incluyen, pero no se limitan a cósmidos, plásmidos o virus modificados pero se apreciará que el sistema de vector debe ser compatible con la célula huésped seleccionada. Tales vectores incluyen, pero no se limitan a plásmidos tales como los derivados del plásmido BluescriptMR (un fagémido basado en ColEl con un número alto de copias, Stratagene Cloning Systems, La Jolla CA) , plásmidos de clonación de PCR diseñados para clonar productos de PCR amplificados por Taq (por ejemplo el equipo TOPOMR, TA CloningMR, derivados de plásmido PCR2.1MR, Invitrogen, Carlsbard, CA) , y vectores de mamífero, levadura o virus tales como un sistema de expresión de baculovirus (derivados del plásmido pBacPAK, Clontech, Palo Alto, CA) . Después de que se ha construido el vector y se ha insertado una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido FGF-23 dentro del sitio apropiado del vector, el vector completado se puede insertar dentro de una célula huésped adecuada para amplificación o expresión del r* * • * polipéptido. La transformación de un vector de expresión para un polipéptido FGF-23 dentro de una célula huésped seleccionada se puede llevar a cabo por métodos bien conocidos que incluyen métodos tales como transfección, infección, cloruro de calcio, electroporación, microinyección, lipofección, método de DEAE-dextrano u otras técnicas conocidas. El método seleccionado en parte será una función del tipo de célula huésped que se utilice. Estos métodos y otros métodos adecuados son bien conocidos por los expertos en la técnica y se establecen, por ejemplo, en Sambrook et al . , supra . Las células huéspedes pueden ser células huéspedes procariotas (tales como E. coli ) , o células huéspedes eucariotas (tales como células de levadura, insecto o vertebrados) . Cuando se cultivan bajo las condiciones apropiadas, las células huéspedes sintetizan un polipéptido FGF-23 el cual después se puede recolectar del medio de cultivo (si las células huéspedes lo secretran al medio) o directamente de las células huéspedes que lo producen (cuando no se secretan) . La selección de una célula huésped apropiada dependerá de diversos factores tales como los niveles de expresión deseados, las modificaciones de polipéptido que sean deseables o necesarias para actividad (tales como glucosilación o fosforilación) y la facilidad de plegado o naturalización en una molécula biológicamente activa . Se conocen en la técnica muchas células huéspedes adecuadas y muchas están disponibles de American Type Culture Collection (ATCC) , Manassas, VA. Los ejemplos 5 incluyen pero no se limitan a células de mamífero tales como células de ovario de hámster chino (CHO) , células CHO DHFR(-) (Urlaub et al . , 1980, Proc . Natl . Acad. Sci . U. S .A . 97:4216-20), células 293 o 293T de riñon de embrión humano (HEK) , o células 3T3. Se conocen en la técnica la selección 10 de células huéspedes de mamífero adecuadas y métodos de transformación, cultivo, amplificación, cribado, elaboración de producto y purificación. Otras líneas de células de mamífero adecuadas son las líneas de células de mono COS-1 y COS-7 asi como la línea de células CV-1. Las células 15 huéspedes de mamífero ejemplares adicionales incluyen líneas de células de primate y líneas de células de roedor que incluyen líneas de células transformadas. Las células diploides normales, cepas de células derivadas de un cultivo in vi tro de tejido primario así como explantes primarios 20 también son adecuados. Las células candidato pueden ser genotípicamente defectuosas en el gen de selección, o pueden contener un gen de selección que actúe de manera dominante. Otras líneas de células de mamífero adecuadas incluyen, pero no se limitan a células N2A de neuroblastoma de ratón, HeLa, 25 células L-929 de ratón, líneas 3T3 derivadas de ratones _.Jt.-^-^^_a<e«_i_acfe.?ah»a.a. -> _._* ,*-_ c,. ^___ ..w-^c'-....(.. yr~. . . . .. :. .-. rr Iry._...__..»& Swiss, Balb-C o NIH, y líneas de células de hámster BHK o HaK. Cada una de estas líneas celulares es conocida y está disponible para los expertos en la técnica de expresión de proteínas . 5 Las células bacterianas son similarmente útiles como células huéspedes adecuadas para la presente invención. Por ejemplo, son bien conocidas las diversas cepas de E. coli (por ejemplo HB101, DH5a, DH10 y MC1061) como células huéspedes en el campo de la biotecnología. También se pueden 10 utilizar en este método diversas cepas de B . subtilis, Pseudomonas spp., otras Bacillus spp . , Streptomyces spp . , y similares . También están disponibles muchas cepas de células de levadura conocidas por aquellos expertos en la técnica, 15 como células huéspedes para la expresión de los polipéptidos de la presente invención. Las células de levadura preferidas incluyen, por ejemplo, Sacharomyces cerevisiae y Pichia pastoris . Adicionalmente, cuando se desea, se pueden 20 utilizar sistemas de célula de insecto en los métodos de la presente invención. Tales sistemas se describen, por ejemplo, en Kitts et al . , 1993, Biotechniques, 14:810-17; Lucklow, 1993, Curr. Opin . Biotechnol . 4:564-72; y Lucklow et al . , 1993, J". Virol . , 67:4566-79. Las células de insecto 5 preferidas con Sf-9 y Hi5 (Invitrogen) .
También se pueden utilizar animales transgénicos para expresar polipéptidos FGF-23 glucosilados. Por ejemplo, se puede utilizar un animal transgénico que produzca leche (una vaca o chivo, por ejemplo) y obtener un polipéptido 5 glucosilado presente en la leche del animal. También se pueden utilizar plantas para producir polipéptidos FGF-23, sin embargo en general, la glucosilación que se produce en plantas es diferente a la que se produce en células de mamífero, y puede resultar en un producto glucosilado el 10 cual no sea adecuado para uso terapéutico humano.
Producción de Polipéptido Se pueden cultivar células huéspedes que 15 comprenden al vector de expresión del polipéptido FGF-23 utilizando medios estándar bien conocidos por los expertos en la técnica. Los medios habitualmente contendrán todos los nutrientes necesarios para el crecimiento y supervivencia de las células. Los medios adecuados para cultivo de células de 20 E. coli incluyen, por ejemplo, caldo Luria (LB, por sus siglas en inglés) o caldo Terrific (TB, por sus siglas en inglés) . Los medios adecuados para cultivo de células eucariotas incluyen medio de Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) , medio esencial mínimo (MEM) o medio de 25 Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, por sus siglas en •AMa*,aM*a,i'li* i *- " * -> *-*-***'—- —• *- —- - - — - *-«-" y~* r~~~?. -~*~. r -inglés) , la totalidad de los cuales se puede complementar con suero o factores de crecimiento según se necesiten para la línea de células particular que se cultive. Un medio adecuado para cultivos de insecto es el medio de Grace complementado con levadura lato, hidrolizado de lactalbúmina o suero bovino fetal, según se necesite. Típicamente, se agrega como un suplemento al medio un antibiótico u otro compuesto útil para el crecimiento selectivo de las células transfectadas o transformadas. El compuesto que se va a utilizar estará determinado por el elemento marcador seleccionable presente en el plásmido con el cual se va a transformar la célula huésped. Por ejemplo, cuando el elemento marcador seleccionable es resistente a kanamicina, el compuesto agregado al medio de cultivo será kanamicina. Otros compuestos para crecimiento selectivo incluyen ampicilina, tetraciclina y neomicina. La cantidad de un polipéptido FGF-23 producido por una célula huésped se puede evaluar utilizando métodos estándar conocidos en la técnica. Tales métodos incluyen, sin limitación, análisis de transferencia Western, electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, electroforesis en gel no desnaturalizante, separación por cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) , inmunoprecipitación o ensayos de actividad tales como ensayos de desplazamiento de gel de unión de ADN.
Si se ha diseñado un polipéptido FGF-23 para ser secretado de las células huéspedes, la mayor parte del polipéptido se puede encontrar en el medio de cultivo celular. Sin embargo, si el polipéptido FGF-23 no se secreta de las células huéspedes, estará presente en el citoplasma o núcleo (para células huéspedes eucariotas) o en el citosol (para células huéspedes de bacterias gramnegativas) . Para un polipéptido FGF-23 que se encuentra en el citoplasma o núcleo de la célula huésped (para células huéspedes eucariotas) o en el citosol (para células huéspedes bacterianas) , se puede extraer el material intracelular (que incluye cuerpos de inclusión para bacterias gramnegativas) de la célula huésped utilizando cualquier técnica estándar conocida por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las células huéspedes pueden ser usadas para liberar el contenido del periplasma/citoplasma por una prensa francesa, homogeneización o sonicación seguida por centrifugación. Si un polipéptido FGF-23 ha formado cuerpos de inclusión en el citosol, los cuerpos de inclusión con frecuencia se pueden unir a las membranas celulares interior o exterior y de esta manera se encontrarán principalmente en el material sedimentado después de la centrifugación. El material sedimentado después se puede tratar a pH extremos o con un agente caotrópico tal como detergente, guanidina, derivados de guanidina, urea o derivados de urea en presencia de un agente reductor tal como ditiotreitol a pH alcalino o tris carboxietilfosfina a pH ácido para liberar, separar y solubilizar los cuerpos de inclusión. El polipéptido FGF-23 solubilizado después se puede analizar utilizando electroforesis en gel, inmunoprecipitación o similar. Si se desea aislar el polipéptido FGF-23, el aislamiento se puede llevar a cabo utilizando métodos estándar tales como los descritos en la presente y en Marston et al . , 1990, Meth . Enz . , 182:264-75. En algunos casos, un polipéptido FGF-23 puede no ser biológicamente activo cuando se aisle. Se pueden utilizar diversos métodos para "renaturalizar" o convertir al polipéptido a su estructura terciaria y generar enlaces disulfuro para restaurar la actividad biológica. Tales métodos incluyen exponer el polipéptido solubilizado a un pH habitualmente superior a 7 y en presencia de una concentración particular de un caotropo. La selección de caotropo es muy similar a las selecciones utilizadas para solubilización del cuerpo de inclusión, pero habitualmente el caotropo se utiliza a una concentración menor y no necesariamente la misma que los caotropos utilizados para la solubilización. En la mayor parte de los casos, la solución de renaturalización/oxidación también contendrá un agente reductor o el agente reductor más la forma oxidada en una relación específica para generar un potencial redox particular que permite que se produzca el desplazamiento disulfuro en la formación de los puentes de cisteína de la proteína. Algunos de los pares redox utilizados habitualmente incluyen cisteína/cistamina, glutation (GSH) /ditiobis GSH, cloruro cúprico, ditiotreitol (DTT) /ditiano DTT y 2,2- mercaptoetanol (bME) /ditio-b (ME) . En muchos casos, se puede utilizar un cosolvente o puede ser necesario para aumentar la eficiencia de la renaturalización, y los reactivos más comunes utilizados para este propósito incluyen glicerol, polietilenglicol de diversos pesos moleculares, arginina y similares . Si no se forman cuerpos de inclusión en un grado significativo ante la expresión de un polipéptido FGF-23, entonces el polipéptido se encontrará principalmente en el sobrenadante después de la centrifugación del homogeneizado celular. El polipéptido se puede aislar adicionalmente a partir del sobrenadante utilizado métodos tales como los descritos en la presente. Se puede llevar a cabo la purificación de un polipéptido FGF-23 de una solución utilizando diversas técnicas. Si el polipéptido se ha sintetizado de manera que contenga una etiqueta tal como hexahistidina (polipéptido FGF-23/hexaHis) u otro péptido pequeño tal como FLAG (Eastman Kodak Co . , New Haven, CT) o myc (Invitrogen, Carisbad, CA) , ya sea en su parte carboxilo o amino terminal, se puede purificar en un procedimiento de una etapa al hacer pasar la solución a través de una columna de afinidad en donde la matriz de la columna tenga una alta afinidad por la etiqueta. Por ejemplo, la polihistidina se une con gran afinidad y especificidad al níquel. De esta manera, se puede utilizar una columna de afinidad de níquel (tales como las columnas de níquel QiagenMR) para la purificación del polipéptido FGF-23/poliHis. Véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology § 10.11.8 (Ausubel et al . , eds., Green Publishers Inc. and Wiley and Sons 1993). Adicionalmente, se pueden purificar polipéptidos FGF-23 mediante el uso de un anticuerpo monoclonal que sea capaz de reconocer específicamente y de unirse a un polipéptido FGF-23. Otros procedimientos adecuados para purificación incluyen, sin limitación, cromatografía de afinidad, cromatografía de inmunoafinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía en tamiz molecular, CLAR, electroforesis (que incluye electroforesis en gel nativa) , seguido por elución en gel y enfoque isoeléctrico preparativo (máquina/técnica "Isoprime", Hoefer Scientific, San Francisco, CA) . En algunos casos, se pueden combinar dos o más técnicas de purificación para obtener mayor pureza. Los polipéptidos FGF-23 también se pueden preparar por métodos de síntesis química (tales como síntesis de péptido en fase sólida) utilizando técnicas conocidas en la técnica tales como las que se establecen por Merrifield et al . , 1963, ". Am. Chem . Soc . 85:2149; Houghten et al . , 1985, Proc . Natl Acad. Sci . USA 82:5132; y Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis (Pierce Chemical Co. 1984) . Tales polipéptidos se pueden sintetizar con o sin una metionina en la parte amino terminal. Los polipéptidos FGF-23 sintetizados químicamente se pueden oxidar utilizando métodos que se establecen en estas referencias para formar puentes disulfuro. Se espera que los polipéptidos FGF-23 sintetizados químicamente tengan actividad biológica comparable con los polipéptidos FGF-23 correspondientes producidos de manera recombinante o purificados a partir de fuentes naturales y de esta manera se pueden utilizar de manera intercambiable con un polipéptido FGF-23 recombinante o natural . Otro medio para obtener el polipéptido FGF-23 es por medio de purificación a partir de muestras biológicas tales como fuentes de tejidos o fluidos en los cuales se encuentra de manera natural al polipéptido FGF-23. Tal purificación se puede llevar a cabo utilizando métodos para purificación de proteína, como se describe en la presente.
Se puede vigilar la presencia del polipéptido FGF-23 durante la purificación, por ejemplo, utilizando un anticuerpo preparado contra el polipéptido FGF-23 producido de manera recombinante o fragmentos peptídicos del mismo. 5 Se conocen en la técnica muchos métodos adicionales para producir ácidos nucleicos y polipéptidos, y los métodos se pueden utilizar para producir polipéptidos que tengan especificidad por el polipéptido FGF-23. Véase, por ejemplo Roberts et al . , 1997, Proc . Natl . Acad . Sci . 10 U. S . A . 94:12297-303, la cual describe la producción de proteínas de fusión entre un ARNm y su péptido codificado. Véase también Roberts, 1990, Curr. Opin . Chem. Biol . 3:268- 73. Adicionalmente, la patente de E.U.A. número 469 describe métodos para obtener oligonucleótidos capaces de 15 llevar a cabo una función biológica específica. El procedimiento involucra generar un acumulado heterogéneo de oligonucleótidos, cada uno con una secuencia aleatorizada 5 ' , una secuencia seleccionada previamente central y una secuencia aleatorizada 3 ' . El acumulado heterogéneo 20 resultante se introduce en una población de células que no muestra la función biológica deseada. Las subpoblaciones de las células después se someten a identificación sistemática para determinar aquellas que muestran una función biológica determinada de antemano. A partir de esta subpoblación, se 25 aislan los oligonucleótidos capaces de llevar a cabo la __te___a____a...s .... _,..__J_A¿^_» * función biológica que se desea. Las patentes de E.U.A. números 5,763,192; 5,814,476; 5,723,323; y 5,817,483 describen procedimientos para elaborar péptidos o polipéptidos. Esto se realiza al elaborar genes estocásticos o fragmentos de los mismos, y después introducir estos genes en células huéspedes que producen una o más proteínas codificadas por los genes estocásticos. Las células huéspedes después se someten a cribado o identificación sistemática para identificar aquellos clones que producen péptidos o polipéptidos que tienen la actividad deseada. Otro método para producir péptidos o polipéptidos se describe en PCT/US98/20094 (WO99/15650) presentado por Athersys, Inc. Conocido como "activación aleatoria de la expresión del gen para descubrimiento de genes" (RAGE-GD) , el procedimiento involucra la activación de la expresión de gen endógeno o la sobreexpresión de un gen mediante métodos de recombinación in si tu . Por ejemplo, la expresión de un gen endógeno se activa o aumenta al integrar una secuencia reguladora en una célula objetivo la cual es capaz de activar la expresión del gen mediante recombinación no homologa o ilegítima. El ADN objetivo primero se somete a radiación, y se inserta el promotor genético. El promotor finalmente localiza una interrupción en la parte frontal de un gen, iniciando la transcripción del gen. Esto resulta en la expresión del péptido o polipéptido deseado. Se apreciará que estos métodos también se pueden utilizar para crear bibliotecas de expresión del polipéptido FGF-23 comprensivas, las cuales pueden ser utilizadas posteriormente para cribado fenotípico de alto rendimiento en diversos ensayos, tales como ensayos bioquímicos, ensayos celulares y ensayos con organismos completos (por ejemplo plantas, ratones, etc).
Síntesis Se apreciará por los expertos en la técnica que el ácido nucleico y las moléculas polipeptídicas que se describen en la presente se pueden elaborar por medios recombinantes u otros medios.
Agentes de Unión Selectivos El término "agente de unión selectivo" se refiere a una molécula que tiene especificidad por uno o más polipéptidos FGF-23. Los agentes de unión selectivos adecuados incluyen, pero no se limitan a anticuerpos y derivados de los mismos, polipéptidos y moléculas pequeñas. Los agentes de unión selectivos adecuados se pueden preparar utilizando métodos conocidos en la técnica. Un agente de unión selectivo para el polipéptido FGF-23 ejemplar de la presente invención es capaz de unir cierta porción del polipéptido FGF-23 y de esta manera inhibir la unión del polipéptido a un receptor para el polipéptido FGF-23. Están dentro del alcance de la presente invención los agentes de unión selectivos tales como anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que se unan a polipéptidos FGF-23. Los anticuerpos pueden ser policlonales incluyendo policlonales monoespecíficos; monoclonales (MAb) ; recombinantes; quiméricos; humanizados tales como CDR-injertado; humano; de cadena sencilla; o biespecíficos; así como fragmentos; variantes o derivados de los mismos. Los fragmentos de anticuerpo incluyen aquellas porciones del anticuerpo que se unen a un epitopo del polipéptido FGF-23. Los ejemplos de tales fragmentos incluyen los fragmentos Fab y F(ab') generados por separación enzimática de anticuerpos de longitud completa. Otros fragmentos de unión incluyen aquellos generados por técnicas de ADN recombinante, tales como la expresión de plásmidos recombinantes que contienen secuencias de ácido nucleico que codifican para regiones variables de anticuerpo. Los anticuerpos policlonales dirigidos a un polipéptido FGF-23 generalmente se producen en animales (por ejemplo conejos o ratones) por medio de inyecciones múltiples subcutáneas o intraperitoneales del polipéptido FGF-23 y un adyuvante. Puede ser útil conjugar un polipéptido FGF-23 a una proteína portadora que es inmunogénica en la especie que se va a inmunizar, tal como hemocianina de lapa de ojo de cerradura, suero, albúmina, 5 tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soya. Además, se utilizan agentes de agregación tales como alumbre para mejorar la respuesta inmunitaria. Después de la inmunización, se extrae sangre de los animales y el suero se somete a pruebas para determinar el título de anticuerpos 10 contra FGF-23. Los anticuerpos monoclonales dirigidos hacia los polipéptidos FGF-23 se producen utilizando cualquier método que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas de células continuas en cultivo. Los 15 ejemplos de métodos adecuados para preparar anticuerpos monoclonales incluyen métodos de hibridoma de Kohler et al . , 1975, Nature 256:495-97 así como el método de hibridoma de linfocito B humano (Kozbor, 1984, J. Immunol . 133:3001; Brodeur et al . , Monoclonal Antibody Production Techniques 20 and Applications 51-63 (Marcel Dekker, Inc., 1987). También se proporcionan por la invención líneas de células de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales reactivos con los polipéptidos FGF-23. Los anticuerpos monoclonales de la invención se 25 pueden modificar para uso como sustancias terapéuticas. Una - modalidad es un anticuerpo "quimérico" en el cual una porción de la cadena pesada (H, por sus siglas en inglés) o ligera (L, por sus siglas en inglés) es idéntico u homólogo a una secuencia correspondiente de anticuerpos derivados de 5 una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase particular de anticuerpo, mientras que el resto de la o las cadenas son idénticas u homologas a una secuencia correspondiente en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo. 10 También se incluyen fragmentos de tales anticuerpos, en la medida en que muestren la actividad biológica deseada. Véase la patente de E.U.A. número 4,816,567; Morrison et al . , 1985, Proc . Natl . Acad . Sci . 81:6851-55. En otra modalidad, el anticuerpo monoclonal de la 15 invención es un anticuerpo "humanizado" . Se conocen bien en la técnica los métodos para humanizar anticuerpos no humanos. Véanse las patentes de E.U.A. números 5,585,089 y 5,693,762. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos aminoácidos introducidos en el mismo a partir 20 de una fuente que no es humana. La humanización se puede llevar a cabo, por ejemplo, utilizando métodos descritos en la técnica (Jones et al . , 1986, Nature 321:522-25; Riechmann et al . , 1998, Nature 332:323-27; Verhoeyen et al . , 1988, Science 239:1534-36), al sustituir por lo menos una porción 25 de una región determinadora de complementariedad (CDR) de ^^^j j^gggl^^yy^^ ^yggj|^^^y^B^^^^agg^^^^^^^^^^^^^^^ttít^—t¿tjßa roedor por las regiones correspondientes de un anticuerpo humano . También se abarcan por la invención anticuerpos humanos que unen polipéptidos FGF-23. Mediante la utilización de animales transgénicos (por ejemplo ratones) que sean capaces de producir una gama de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena, tales anticuerpos se producen por inmunización con un antígeno para el polipéptido FGF-23 (es decir, que tienen por lo menos 6 aminoácidos contiguos) opcionalmente conjugados con un portador. Véase, por ejemplo, Jakobovits et al . , 1993, Proc . Natl . Acad . Sci . 90:2551-55; Jakobovits et al . , 1993, Nature 362:255-58; Bruggermann et al . , 1993, Year in Im uno . 7:33. En un método, tales animales transgénicos se producen al incapacitar los loci endógenos que codifican para las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina en la misma, e insertando loci que codifican para las proteínas de cadena pesada y ligera humanas dentro del genoma del mismo. Los animales modificados parcialmente, esto es, aquellos que tienen menos de el complemento completo de modificaciones, después se someten a cruza para obtener un animal que tenga la totalidad de las modificaciones deseadas en el sistema inmunitario. Cuando se administra un inmunógeno, estos animales transgénicos producen anticuerpos con secuencias de aminoácidos de un humano (en vez de, por ejemplo, de ratón) e incluyen regiones variables las cuales son inmunoespecíficas para estos antígenos. Véanse las solicitudes PCT números PCT/US96/05928 y PCT/US93/06926. Se describen métodos adicionales en la patente de E.U.A. número 5,545,807, la solicitud PCT números PCT/US91/245 y PCT/GB89/01207, y en las patentes Europeas números 546073B1 y 546073A1. También se pueden producir anticuerpos humanos por la expresión de ADN recombinante en células huéspedes o por expresión en células de hibridoma, como se describe en la presente. En una modalidad alternativa, también se pueden producir anticuerpos humanos a partir de bibliotecas de exhibición de fago (Hoogenboom et al . , 1991, J". Mol . Biol . 227:381; Marks et al . , 1991, J". Mol . Biol . 222:581). Estos procedimientos imitan la selección inmunitaria a través de la exhibición de repertorios de anticuerpos sobre la superficie de bacteriófagos filamentosos, y la selección subsecuente del fago por su unión a un antígeno de elección. Una de tales técnicas se describe en la solicitud PCT número PCT/US98/17364, la cual describe el aislamiento de anticuerpos agonísticos de alta afinidad y funcionales para receptores MPL- y msk- utilizando tal enfoque. Los anticuerpos quiméricos, insertados con CDR y humanizados típicamente se producen por métodos recombinantes. Los ácidos nucleicos que codifican para los anticuerpos se introducen en las células huéspedes y se expresan utilizando materiales y procedimientos descritos en la presente. En una modalidad preferida, los anticuerpos se producen en células huéspedes de mamífero, tales como 5 células CHO. Se pueden generar anticuerpos monoclonales (por ejemplo humanos) mediante la expresión de ADN recombinante en células huéspedes o por expresión en células de hibridoma, como se describe en la presente. Los anticuerpos contra FGF-23 de la invención se 10 pueden utilizar en cualquier método de ensayo conocido, tal como los ensayos de unión competitiva, ensayos de interposición directa e indirecta y ensayos de inmunoprecipitación (Sola, Monoclonal Antibodies A Manual of Techniques 147-158 (CRC Press, Inc., 1987)) para la 15 detección y cuantificación de polipéptidos FGF-23. Los anticuerpos se unirán a polipéptidos FGF-23 con una afinidad que es apropiada para el método de ensayo que se utiliza. Para aplicaciones de diagnóstico, en algunas modalidades, los anticuerpos contra FGF-23 se pueden marcar 20 con una porción detectable. La porción detectable puede ser cualquiera que sea capaz de producir, directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, la porción detectable puede ser un radioisótopo, tal como 3H, 1C, 32P, 35S, 125I, 99Tc, lxlIn o 67Ga; un compuesto fluorescente 25 o quimioluminiscente tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina o luciferina; o una enzima, tal como fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa o peroxidada de rábano (Bayer, et al . , 1990, Meth . Enz . 184:138-63). Los ensayos de unión competitivos se basan en la 5 capacidad de un estándar marcado (por ejemplo un polipéptido FGF-23 o una porción inmunológicamente reactiva del mismo) para competir con el analito de muestra de prueba (un polipéptido FGF-23) para unión con una cantidad limitada de anticuerpo contra FGF-23. La cantidad de un polipéptido FGF-10 23 en la muestra de prueba es inversamente proporcional a la cantidad de estándar que se une a los anticuerpos. Para facilitar la determinación de la cantidad de estándar que se une, los anticuerpos típicamente se insubilizan antes o después de la competencia, de manera que el estándar y en 15 analito que se unen a los anticuerpos se pueden separar convenientemente del estándar y analito que permanecen sin unirse . Los ensayos de interposición (emparedado o sandwich) típicamente involucran el uso de dos anticuerpos, 0 cada uno capaz de unirse a una porción inmunogénica diferente, o epitopo de la proteína que se va a detectar o cuantificar. En un ensayo de interposición, el analito de muestra de prueba típicamente se une a un primer anticuerpo el cual se inmoviliza sobre un soporte sólido y 5 posteriormente un segundo anticuerpo se une al analito y de najJMÉ.JJj. ^i, Bi t... ^. esta manera se forma un complejo insoluble de tres partes. Véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. número 4,376,110. El segundo anticuerpo en si mismo puede estar marcado con una porción detectable (ensayos de interposición directa) , o 5 se puede medir utilizando un anticuerpo contra inmunoglobulina que se marca con una porción detectable (ensayos de interposición indirecta) . Por ejemplo, un tipo de ensayo de interposición es un ensayo inmunosorbente unido a enzima (ELISA, por sus siglas en inglés) , en cuyo caso la 0 porción detectable es una enzima. Los agentes de unión selectivos, que incluyen anticuerpos contra FGF-23, también son útiles para la formación de imágenes in vivo. Se puede administrar a un animal un anticuerpo marcado con una porción detectable, 5 preferiblemente en la corriente sanguínea, y en presencia de la posición del anticuerpo marcado en el cuerpo que se somete a ensayo. El anticuerpo se puede marcar con una porción que es detectable en un animal, ya sea por resonancia magnética nuclear, radiología o por otro medio de 0 detección conocido en la técnica. Se pueden utilizar como sustancias terapéuticas agentes de unión selectivos de la invención incluyendo anticuerpos. Estos agentes terapéuticos generalmente son agonistas o antagonistas en la medida en que pueden mejorar 5 o reducir, respectivamente, por lo menos una de las actividades biológicas de un polipéptido FGF-23. En una modalidad, los anticuerpos antagonistas de la invención son anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos los cuales son capaces de unirse específicamente a un polipéptido FGF- 5 23 y los cuales sean capaces de inhibir o eliminar la actividad funcional de un polipéptido FGF-23 in vivo o in vi tro . En las modalidades preferidas, el agente de unión selectivo, por ejemplo un anticuerpo antagonista inhibirá la actividad funcional de un polipéptido FGF-23 en al menos 10 aproximadamente 50% y preferiblemente de al menos aproximadamente 80%. En otra modalidad, el agente de unión selectivo puede ser un anticuerpo contra el polipéptido FGF- 23 que sea capaz de interactuar con un asociado de unión del polipéptido FGF-23, (un ligando o receptor) y de esta manera 15 se inhibe o elimina la actividad del polipéptido FGF-23 in vi tro o in vivo . Los agentes de unión selectivos, que incluyen anticuerpos contra el polipéptido FGF-23 agonistas o antagonistas, se identifican por ensayos de cribado y son bien conocidos en la técnica. 20 La invención también se relaciona con un equipo que comprende agentes de unión selectivos para FGF-23 (tales como anticuerpos) y otros reactivos útiles para detectar los niveles o concentraciones del polipéptido FGF-23 en muestras biológicas. Tales reactivos pueden incluir una marca 25 detectable, suero bloqueador, muestras de control positivas •¡2^2^¿g¡ y negativas y reactivos de detección.
Microarreglos Se apreciará que se puede utilizar la tecnología de microarreglo de ADN, de acuerdo con la presente invención. Los microarreglos de ADN son arreglos de alta densidad y miniatura de ácidos nucleicos colocados sobre un soporte sólido, tal como vidrio. Cada célula o elemento dentro del arreglo contiene numerosas copias de una sola especie de ácido nucleico que actúa como un objetivo para la hibridación con una secuencia complementaria de ácido nucleico (por ejemplo ARNm) . En el perfilado de la expresión utilizando la tecnología de microarreglo de ADN, el ARNm primero se extrae de una célula o muestra de tejido y después se convierte enzimáticamente a ADNc marcado fluorescentemente. Este material se somete a hibridación al microarreglo y en ADNc que no se une se elimina por lavado. Después se visualiza la expresión de genes separados representados en el arreglo por cuantificación de la cantidad de ADNc marcado que se une específicamente a cada molécula objetivo de ácido nucleico. De esta manera, se puede cuantificar la expresión de miles de genes con alto rendimiento de una forma de manera paralela en una sola muestra de material biológico.
Este perfilado de expresión de alto rendimiento tiene una amplia gama de aplicaciones con respecto a las moléculas de FGF-23 de la invención que incluyen, pero que no se limitan la identificación y validación de los genes relacionados con la enfermedad de FGF-23 como objetivos para sustancias terapéuticas; toxicología molecular de moléculas FGF-23 relacionadas e inhibidores de las mismas; estratificación de poblaciones y generación de marcadores asociados para ensayos clínicos; y el descubrimiento de medicamentos de moléculas pequeñas de polipéptido FGF-23 relacionadas mejoradas que ayudan en la identificación de compuestos selectivos en cribados de alto rendimiento.
Derivados Químicos Se pueden preparar por los expertos en la técnica derivados modificados químicamente de los polipéptidos FGF-23, dado lo que se describe en la presente. Los derivados del polipéptido FGF-23 se modifican de una manera que es diferente - ya sea en el tipo o localización de las moléculas unidas naturalmente al polipéptido. Los derivados pueden incluir moléculas que se forman por supresión de uno o más grupos químicos unidos de manera natural . El polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 u otro polipéptido de FGF-23, se pueden modificar por la unión covalente de uno o más polímeros. Por ejemplo, el polímero seleccionado típicamente es hidrosoluble de manera que la proteína la cual se une no precipite en un ambiente acuoso, tal como un ambiente fisiológico. Se incluyen dentro del alcance de los polímeros adecuados las mezclas de polímeros. Preferiblemente, para uso terapéutico de la preparación de producto final, el polímero será farmacéuticamente aceptable. Cada uno de los polímeros puede tener cualquier peso molecular y puede estar ramificado o son ramificar. Cada uno de los polímeros típicamente tiene un peso molecular promedio de entre aproximadamente 2 kDa y aproximadamente 100 kDa (el término "aproximadamente" indica que, en las preparaciones de polímeros hidrosolubles, algunas moléculas pesarán más, algunas menos que el peso molecular indicado) . El peso molecular promedio de cada polímero preferiblemente está entre aproximadamente 5 kDa y aproximadamente 50 kDa, de manera más preferible entre aproximadamente 12 kDa y aproximadamente 40 kDa, y de manera más preferible entre aproximadamente 20 kDa y aproximadamente 35 kDa. Los polímeros hidrosolubles o mezclas de los mismos, adecuados, incluyen, pero no se limitan a carbohidratos N unidos u O unidos, azúcares, fosfatos, polietilenglicol (PEG) (que incluye las formas de PEG que se han utilizado para formar derivados de proteínas, que incluyen monoalcoxi de 1 a 10 átomos de carbono o ariloxi -polietilenglicol), monometoxipolietilenglicol , dextrano (tal como dextrano de peso molecular bajo, por ejemplo de aproximadamente 6 kD) , celulosa u otros polímeros basados en carbohidratos, poli- (N-vinilpirrolidona) polietilenglicol , homopolímeros de propilenglicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polietoxilados (por ejemplo glicerol) y alcohol polivinílico. También se abarcan por la presente invención las moléculas de reticulación bifuncionales las cuales se pueden utilizar para preparar multímeros de polipéptido FGF-23 unidos covalentemente. En general, la formación química de derivados se puede llevar a cabo bajo cualquier condición adecuada utilizada para hacer reaccionar una proteína con una molécula polimérica adecuada. Los métodos para preparar derivados químicos de polipéptidos generalmente comprenderán las etapas de: (a) hacer reaccionar el polipéptido con una molécula de polímero activada (tal como un éster reactivo o un derivado de aldehido de la molécula de polímero) bajo condiciones en las cuales el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 u otro polipéptido FGF-23, se une a una o más moléculas de polímero, y (b) obtener los productos de reacción. Las condiciones de reacción óptimas se determinarán en base en parámetros conocidos y el resultado deseado. Por ejemplo, cuanto mayor sea la relación de moléculas de polímero respecto a la proteína, mayor será el porcentaje de molécula de polímero unida. En una modalidad, el derivado de polipéptido FGF-23 puede tener una porción de molécula de polímero única en la parte amino terminal. Véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. número 5,234,784. La pegilación (formación de un derivado con PEG) se puede llevar a cabo específicamente utilizando cualquier reacción de pegilación conocida en la técnica. Tales reacciones se describen, por ejemplo, en las siguientes referencias: Francis et al . , 1992, Focus on Growth Factors 3:4-10; Patentes Europeas Números 0154316 y 0401384; y en la Patente de E.U.A. número 4,179,337. Por ejemplo, se puede llevar a cabo la pegilación vía una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula reactiva de polietilenglicol (o un polímero hidrosoluble reactivo análogo), como se describe en la presente. Para las reacciones de acilación, un polímero seleccionado tendrá un solo grupo éster reactivo. Para alquilación reductiva, un polímero seleccionado tendrá un solo grupo aldehido reactivo. Un aldehido reactivo es, por ejemplo, polietilenglicol propionaldehído, el cual es estable al agua, un monoalcoxi de 1 a 10 átomos de carbono o derivados de ariloxi del mismo (véase la patente de E.U.A. número 5,252,714) . En una modalidad, los polipéptidos FGF-23 se pueden acoplar químicamente a biotina. Después se permite que las moléculas de biotina/polipéptido FGF-23 se unan a avidina, lo que resulta en moléculas tetravalentes de avidina/biotina/polipéptido FGF-23. Los polipéptidos FGF-23 también se pueden acoplar covalentemente a dinitrofenol (DNP) o trinitrofenol (TNP) , y los conjugados resultantes se precipitan con IgM contra DNP o contra TNP para formar conjugados decaméricos con una valencia de 10. Generalmente, las condiciones que se pueden aliviar o modular por la administración de los presentes derivados del polipéptido FGF-23 incluyen las que se describen en la presente para polipéptidos FGF-23. Sin embargo, los derivados del polipéptido FGF-23 que se describen en la presente pueden tener actividades adicionales, actividad biológica aumentada o reducida, u otras características tales como una vida media aumentada o disminuida, en comparación con las moléculas que no forman derivados .
Animales No Humanos Sometidos a Ingeniería Genética Se incluyen adicionalmente dentro del alcance de la presente invención animales no humanos tales como ratones, ratas u otros roedores, conejos, chivos, borregos u otros animales de granja, en los cuales se ha interrumpido genes que codifican para el polipéptido FGF-23 nativo (es decir, se han "bloqueado") de manera que el nivel de expresión del polipéptido FGF-23 disminuye de manera significativa o se suprime por completo. Tales animales se pueden preparar utilizando técnicas y métodos tales como las que se describen en la patente de E.U.A. número 5,557,032. La presente invención incluye además animales no humanos tales como ratones, ratas u otros roedores; conejos, chivos, borregos u otros animales de granja, en los cuales la forma nativa de un gen para FGF-23 para ese animal, o bien un gen heterólogo para FGF-23 se sobreexpresa por el animal, por lo que se genera un animal "transgénico". Tales animales transgénicos se pueden preparar utilizando métodos bien conocidos tales como los que se describen en la patente de E.U.A. número 5,489,743 y la publicación PCT número WO 94/28122. La presente invención incluye además animales no humanos en los cuales el promotor de uno o más de los polipéptidos FGF-23 de la presente invención se activa o inactiva (por ejemplo mediante la utilización de métodos de recombinación homologa) para alterar el nivel de expresión de uno o más polipéptidos FGF-23 nativos.
Estos animales no humanos se pueden utilizar para identificación sistemática de medicamentos candidato. En tal identificación sistemática o cribado, se puede medir el impacto de un medicamento candidato en el animal . Por ejemplo, los medicamentos candidatos pueden disminuir o aumentar la expresión del gen para FGF-23. En algunas modalidades se puede medir la cantidad de polipéptido FGF-23 que se produce después de la exposición del animal al medicamento candidato. Adicionalmente, en algunas modalidades, uno puede detectar el impacto real del medicamento candidato en el animal. Por ejemplo, la sobreexpresión de un gen particular puede resultar en, o se puede asociar con una enfermedad o trastorno patológico, en tales casos, uno puede probar la capacidad de un medicamento candidato para disminuir la expresión de un gen o su capacidad para evitar o inhibir una condición patológica. En otros ejemplos, la producción de un producto metabólico particular tal como un fragmento de un polipéptido, puede resultar que en, o estar asociado con una enfermedad o condición patológica. En tales casos, uno puede probar la capacidad de un medicamento candidato para disminuir la producción de tal producto metabólico o su capacidad para evitar o inhibir una condición patológica.
Ensayo para Otros Moduladores de la Actividad del polipéptido FGF-23 En algunas situaciones, puede ser deseable 5 identificar moléculas que son moduladores, es decir, agonistas o antagonistas de la actividad del polipéptido FGF-23. Las moléculas naturales o sintéticas que modulan al polipéptido FGF-23 se pueden identificar utilizando uno o más ensayos de cribado, tales como los que se describen en 10 la presente. Tales moléculas se pueden administrar ex vivo o in vivo por inyección o por suministro oral, dispositivo de implantación o similar. La "molécula de prueba" se refiere a una molécula que está bajo evaluación para determinar la capacidad para 15 modular (es decir, aumentar o disminuir) la actividad de un polipéptido FGF-23. De manera más común, una molécula de prueba interactuará directamente con un polipéptido FGF-23. Sin embargo, también se contempla que una molécula de prueba también module indirectamente la actividad del polipéptido 20 FGF-23, por ejemplo al alterar la expresión del gen FGF-23 o al unir un asociado de unión de polipéptido FGF-23 (por ejemplo, un receptor o ligando) . En una modalidad, una molécula de prueba se unirá a un polipéptido FGF-23 con una constante de afinidad de por lo menos aproximadamente 10"6M, 25 de manera preferible aproximadamente 108M, de manera más ¡WMttiMiffifYt - -rtí -*-*-* ^"*- - * .-*»-»-"--.*«-- --*-* ^ « ..*y-^ ~~*~»~^*ja~»~ ~..~. preferible aproximadamente 10"9M, e incluso de manera más preferible aproximadamente 10"10M. Los métodos para identificar compuestos que interactúen con los polipéptidos FGF-23 están incluidos por 5 la presente invención. En algunas modalidades, se incuba un polipéptido FGF-23 con una molécula de prueba bajo condiciones que permiten la interacción de la molécula de prueba con un polipéptido FGF-23, y se mide el grado de interacción. La molécula de prueba puede ser sometida a 10 identificación sistemática en una forma sustancialmente purificada o en una mezcla cruda. En algunas modalidades, un agonista o antagonista de polipéptido FGF-23 puede ser una proteína, péptido, carbohidrato, lípido o molécula de peso molecular pequeño 15 que interactúa con el polipéptido FGF-23 para regular su actividad. Las moléculas que regulan la expresión del polipéptido FGF-23 incluyen ácidos nucleicos los cuales son complementarios a ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido FGF-23, o son complementarios a secuencias de 20 ácidos nucleicos los cuales dirigen o controlan la expresión del polipéptido FGF-23 y los cuales actúan como reguladores antisentido de expresión. Una vez que se ha identificado una molécula de prueba, elemento que interactúa con un polipéptido FGF-23, 25 la molécula puede ser evaluada adicionalmente para determinar su capacidad para aumentar o disminuir la actividad del polipéptido FGF-23. La medición de la interacción de la molécula de prueba con el polipéptido FGF-23 se puede llevar a cabo en diversos formatos, que incluyen ensayos de unión basados en células, ensayos de unión de membrana, ensayos en fase en solución e inmunoensayos. En general, se incuba una molécula de prueba con un polipéptido FGF-23 por un período de tiempo especificado, y se determina la actividad del polipéptido FGF-23 por uno o más ensayos para medir la actividad biológica. También se puede realizar un ensayo para determinar la interacción de las moléculas de prueba con los polipéptidos FGF-23 directamente utilizando anticuerpos policlonales o monoclonales en un inmunoensayo. De manera alternativa, se pueden utilizar las formas modificadas de los polipéptidos FGF-23 que contienen etiquetas de epitopo como se describe en la presente, en solución e inmunoensayos . En el caso en el que los polipéptidos FGF-23 muestren actividad biológica mediante una interacción con un asociado de unión (por ejemplo, un receptor o un ligando) , se pueden utilizar diversos ensayos in vi tro para medir la unión de un polipéptido FGF-23 al asociado de unión correspondiente (tal como un agente de unión selectivo, receptor o ligando) . Estos ensayos se pueden utilizar para cribar moléculas de prueba para determinar su capacidad para aumentar o disminuir la velocidad o el grado de unión de un polipéptido FGF-23 a su asociado de unión. En un ensayo, se inmoviliza un polipéptido FGF-23 en los pozos de una placa de microtitulación. El asociado de unión del polipéptido FGF-23 radiomarcado (por ejemplo, el asociado de unión del polipéptido FGF-23 yodado) y la molécula de prueba después se pueden agregar ya sea una a la vez (en cualquier orden) o simultáneamente a los pozos. Después de incubación, se lavan las paredes y se realiza una cuenta de radioactividad utilizando un contador de centelleo, para determinar el grado con el cual el asociado de unión se une al polipéptido FGF-23. Típicamente se probará una molécula sobre una gama de concentraciones, y se puede utilizar una serie de pozos control que carezcan de uno de o más elementos de los ensayos de prueba para determinar la precisión en la evaluación de los resultados. Una alternativa a este método involucra invertir las "posiciones" de las proteínas, es decir, inmovilizar el asociado de unión del polipéptido FGF-23 a los pozos de la placa de microtitulación, incubar con la molécula de prueba y polipéptido FGF-23 radiomarcado, y determinar el grado de unión del polipéptido FGF-23. Véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, chap. 18 (Ausubel et al . , eds., Green Publishers Inc. and Wiley and Sons 1995) .
Como una alternativa al radiomarcado, se pueden conjugar con biotina un polipéptido FGF-23 o su asociado de unión, y se puede detectar después la presencia de la proteína biotinada utilizando estreptavidina unida a una enzima, tal como peroxidasa de rábano (HRP, por sus siglas en inglés) o fosfatasa alcalina (AP, por sus siglas en inglés) , la cual se puede detectar colorimétricamente o por etiquetado fluorescente de estreptavidina. Un anticuerpo dirigido contra un polipéptido FGF-23 o a un asociado de unión de polipéptido FGF-23 y el cual se conjuga a biotina también se puede utilizar para propósitos de detección después de incubación del complejo con estreptavidina unida a enzima, unida a AP o HRP. Un polipéptido FGF-23 o un asociado de unión de polipéptido FGF-23 también se pueden inmovilizar por unión a esferas de agarosa, esferas acrílicas u otros tipos tales como sustratos en fase sólida inertes. El complejo sustrato-proteína se puede colocar en una solución que contenga una proteína complementaria y el compuesto de prueba. Después de la incubación, las esferas se pueden precipitar por centrifugación y se puede determinar la cantidad de unión entre el polipéptido FGF-23 y su asociado de unión utilizando métodos descritos en la presente. Alternativamente, se puede inmovilizar el complejo de sustrato-proteína en una columna con la molécula de prueba y la proteína complementaria que pasa a través de la columna. La formación de un complejo entre el polipéptido FGF-23 y su asociado de unión después se puede determinar utilizando cualquiera de las técnicas que se describen en la presente (por ejemplo radiomarcado o unión de anticuerpo) . Otro ensayo in vi tro que es útil para identificar una molécula de prueba la cual aumenta o disminuye la formación de un complejo entre una proteína de unión de polipéptido FGF-23 y el asociado de unión de polipéptido FGF-23 es el sistema detector de resonancia de plasmón de superficie tal como el sistema de ensayo BIAcore (Pharmacia, Piscataway, NJ) . Se utiliza el sistema BIAcore como se específica por el fabricante. Este ensayo involucra esencialmente la unión covalente ya sea del polipéptido FGF-23 o de un asociado de unión de polipéptido FGF-23 a un chip detector recubierto con dextrano que se localiza en un detector. El compuesto de prueba y la otra proteína complementaria después se pueden inyectar, simultánea o secuencialmente, dentro de la cámara que contiene el chip detector. Se puede determinar la cantidad de proteína complementaria que se une en base en el cambio y la masa molecular que se relaciona físicamente con el lado recubierto con dextrano del chip detector, y el cambio en la masa molecular se mide por el sistema detector. En algunos casos, puede ser deseable evaluar dos o más compuestos de prueba juntos para determinar su capacidad para aumentar o disminuir la formación de un complejo entre un polipéptido FGF-23 y un asociado de unión del polipéptido FGF-23. En estos casos, los ensayos que se establecen en la presente se pueden modificar fácilmente al agregar tales compuestos de prueba adicionales, de manera simultánea o subsecuente al primer compuesto de prueba. El resto de las etapas en el ensayo son como se establecen en la presente. Los ensayos in vi tro tales como los descritos en la presente se pueden utilizar ventajosamente para examinar grandes cantidades de compuestos para determinar un efecto en la formación de un complejo entre el polipéptido FGF-23 y un asociado de unión del polipéptido FGF-23. Los ensayos pueden ser automatizados para analizar compuestos generados en exhibición de fagos, péptidos sintéticos y bibliotecas de síntesis química. Los compuestos que aumentan o disminuyen la formación de un complejo entre un polipéptido FGF-23 y un asociado de unión de polipéptido FGF-23 también pueden ser examinados en cultivos celulares utilizando células y líneas de células que expresen el polipéptido FGF-23 o el asociado de unión del polipéptido FGF-23. Se pueden obtener células y líneas de células de cualquier mamífero, pero preferiblemente serán de fuentes humanas o de primate, caninas o de roedor. La unión de un polipéptido FGF-23 a las - - células que expresan el asociado de unión del polipéptido FGF-23 en la superficie se evalúan en presencia o ausencia de las moléculas de prueba y se puede determinar el grado de unión, por ejemplo, mediante citometría de flujo utilizando un anticuerpo biotinado a un asociado de unión de polipéptido FGF-23. Se pueden utilizar ventajosamente los ensayos de cultivo celular para evaluar adicionalmente los compuestos que dan resultado positivo en los ensayos de unión de proteína que se describen en la presente. También se pueden utilizar cultivos celulares para cribar el impacto de un medicamento candidato, . Por ejemplo, los medicamentos candidatos pueden disminuir o aumentar la expresión del gen FGF-23. En algunas modalidades, la cantidad del polipéptido FGF-23 o un fragmento del polipéptido FGF-23 que se produce se puede medir después de la exposición del cultivo celular al medicamento candidato. En algunas modalidades, uno puede detectar el impacto, real del medicamento candidato sobre el cultivo celular. Por ejemplo, la sobreexpresión de un gen particular puede tener un impacto particular sobre el cultivo celular. En tales casos, uno puede probar la capacidad del medicamento candidato para aumentar o disminuir la expresión del gen o su capacidad para evitar o inhibir un impacto particular en el cultivo celular. En otros ejemplos, la elaboración de un producto metabólico particular tal como un fragmento de un polipéptido, puede resultar o estar asociada con una enfermedad o una condición patológica. En tales casos, uno puede probar la capacidad de un medicamento candidato para disminuir la producción de tal producto metabólico en un cultivo celular.
Internalización de Proteínas Se puede utilizar la secuencia de proteína tat (de VIH) para internalizar proteínas en una célula. Véase por ejemplo, Falwell et al . , 1994, Proc . Natl . Acad . Sci . U. S.A . 91:664-68. Por ejemplo, se ha descrito una secuencia de 11 aminoácidos (Y-G-R-K-K-R-R-Q-R-R-R; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 40) de la proteína tat de VIH (denominado el "dominio de transducción proteínico" o TAT PDT, por sus siglas en inglés) como elemento que media la liberación a través de la membrana citoplásmica y la membrana nuclear de una célula. Véase Schwarze et al . , 1999, Science 285:1569-72; y Nagahara et al . , 1998, Nat . Med. 4:1449-52. En estos procedimientos, se preparan montajes (plásmidos recombinantes) unidos a FITC (G-G-G-G-Y-G-R-K-K- R-R-Q-R-R-R marcada con FITC; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 41) los cuales penetran tejidos después de su administración intraperitoneal, y la unión de tales montajes a las células se detecta por análisis de clasificación de células activado por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés) . Las células tratadas con proteína de fusión tat-ß-gal mostrarán actividad ß-gal. Después de la inyección, la expresión de tales montajes se puede detectar en muchos tejidos que incluyen, hígado, riñon, pulmón, corazón y tejido cerebral. Se considera que tales montajes experimentan cierto grado de desnaturalización con el fin de entrar a la célula, y como tales pueden requerir renaturalización después de entrar a la célula. Por lo tanto, se apreciará que se puede utilizar la secuencia de la proteína tat para internalizar un polipéptido deseado a una célula. Por ejemplo, utilizando la secuencia de la proteína tat, se puede administrar intracelularmente un antagonista de FGF-23 (tal como un agente de unión selectivo contra FGF-23, una molécula pequeña, un receptor soluble o un oligonucleótido antisentido) , para inhibir la actividad de una molécula FGF-23. Como se utiliza en la presente, el término "molécula FGF-23" se refiere tanto a moléculas de ácido nucleico para FGF-23 como a polipéptidos FGF-23 como se definen en la presente. Cuando se desea, la proteína FGF-23 misma también puede ser administrada internamente a una célula utilizando estos procedimientos. Véase también Straus, 1999, Science 285:1466-67.
Identificación de la Fuente Celular Utilizando el Polipéptido FGF-23 De acuerdo con algunas modalidades de la invención, puede ser útil poder determinar la fuente de cierto tipo de célula relacionado con un polipéptido FGF-23. Por ejemplo, puede ser útil determinar el origen de una enfermedad o condición patológica como un auxiliar en la selección de una terapia adecuada. En algunas modalidades, los ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido FGF-23 se pueden utilizar como una sonda para identificar células descritas en la presente por cribado de los ácidos nucleicos de las células con tal sonda. En otras modalidades, uno puede utilizar anticuerpos contra el polipéptido FGF-23 para determinar la presencia de polipéptido FGF-23 en células y de esta manera determinar si tales células son de los tipos que se describen aquí.
Composiciones de Polipéptido FGF-23 y Administración Las composiciones terapéuticas están dentro del alcance de la presente invención. Tales composiciones farmacéuticas del polipéptido FGF-23 pueden comprender una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido FGF-23 o una molécula de ácido nucleico para FGF-23 en mezcla con un agente de formulación farmacéutica o fisiológicamente aceptable que se selecciona por su condición adecuada con el modo de administración. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más agentes de unión selectivos para el polipéptido FGF-23 en mezcla con un agente de formulación farmacéutica o fisiológicamente aceptable que se selecciona para adecuarlo al modo de administración. Los materiales de formulación aceptables preferiblemente son no tóxicos a los receptores a las dosificaciones y concentraciones utilizadas. La composición farmacéutica puede contener materiales de formulación para modificar, mantener o conservar, por ejemplo, el pH, osmolaridad, viscosidad, transparencia, color, isotonicidad, olor, esterilidad, estabilidad, velocidad de disolución o de liberación, adsorción o penetración de la composición. Los materiales de formulación adecuados incluyen, pero no se limitan a aminoácidos (tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina) , sustancias antimicrobianas, antioxidantes (tales como ácido ascórbico, sulfito de sodio o sulfito ácido de sodio) , amortiguadores (tales como borato, bircarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos u otros ácidos orgánicos) , agentes de volumen (tales como manitol o glicina) , agentes quelantes (tales como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) ) , agentes formadores de complejos (tales como cafeína, polivinilpirrolidona, ß-ciclodextrina o hidroxipropil-ß-ciclodextrina) , rellenos, monosacáridos, disacáridos u otros carbohidratos (tales como glucosa, mañosa o dextrinas) , proteínas (tales como albúmina cérica, gelatina o inmunoglobulinas) , agentes colorantes, saborizantes y diluyentes, agentes emulsificantes, polímeros hidrofílicos (tales como polivinilpirrolidona) , polipéptidos de peso molecular bajo, contraiones formadores de sales (tales como sodio) , conservadores (tales como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico, o peróxido de hidrógeno) , solventes (tales como glicerina, propilenglicol o polietilenglicol) alcoholes de azúcar (tales como manitol o sorbitol) agentes que mejoran la suspensión, tensioactivos o agentes humectantes (tales como Pluronics; PEG; esteres de sorbitano; polisorbatos tales como Polysorbato 20 o Polysorbato 80; Tritón; trometamina; lecitina; colesterol o tiloxapal) , agentes mejoradores de estabilidad (tales como sacarosa o sorbitol) , agentes mejoradores de tonicidad (tales como haluros de metal alcalino -preferiblemente cloruro de sodio o de potasio- o manitol o sorbitol) , vehículos de suministro, diluyentes, excipientes o adyuvantes farmacéuticos. Véase Remington ' s Pharmaceutical .*.*» .» AtJliB t^afc^.. - -»~.«a¿ »¿.« ^^^^^^^¿¿_ Sciences (18th Ed. , A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990) . La composición farmacéutica óptima estará determinada por un experto en la técnica, en base, por ejemplo en la vía de administración que se utilice, el formato de suministro y la dosificación que se desee. Véase, por ejemplo Remington ' s Pharmaceutical Sciences, supra . Tales composiciones pueden alterar el estado físico, estabilidad, velocidad de liberación in vivo y velocidad de depuración de la molécula FGF-23. El vehículo o portador primario en una composición farmacéutica puede ser de naturaleza acuosa o no acuosa. Por ejemplo, un vehículo o portador adecuado para inyección puede ser agua, solución salina fisiológica o líquido cefalorraquídeo artificial, posiblemente suplementado con otros materiales comunes en las composiciones para administración parenteral. La solución salina amortiguada neutra o la solución salina mezclada con albúmina sérica son vehículos ejemplares adicionales. Otras composiciones farmacéuticas ejemplares comprenden amortiguador Tris de aproximadamente pH 7.0-8.5, o amortiguador de acetato de aproximadamente pH 4.0-5.5, el cual puede incluir además sorbitol o un sustituto adecuado. En una modalidad de la presente invención, las composiciones de polipéptido FGF-23 se pueden preparar para almacenamiento al mezclar la composición seleccionada que tenga el grado de pureza deseado, con agentes de formulación opcionales (Remington ' s Pharmaceutical Sciences, supra) en forma de una torta liofilizada o una solución acuosa. Además, el producto de polipéptido FGF-23 se puede formular como un liofilizado utilizando excipientes apropiados tales como sacarosa. Las composiciones farmacéuticas de polipéptido FGF-23 se pueden seleccionar para suministro parenteral. Alternativamente, las composiciones se pueden seleccionar para inhalación del suministro a través del tracto digestivo, por ejemplo por vía oral. La preparación de tales composiciones farmacéuticamente aceptables está dentro de la habilidad de la técnica. Los componentes de formulación están presentes en concentraciones que son aceptables para el sitio de administración. Por ejemplo, los amortiguadores que se van a utilizar para mantener la composición a pH fisiológica o un pH ligeramente menor habitualmente están dentro de un intervalo de pH desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 8. Cuando se contempla la administración parenteral, las composiciones terapéuticas para uso en esta invención pueden estar en forma de una solución acuosa libre de pirógenos y parenteralmente aceptable, que comprende la molécula FGF-23 deseada en un vehículo farmacéuticamente TMI I J G* f ftirt-rr-if frt—-* aceptable. Un vehículo particularmente adecuado para inyección parenteral es agua destilada estéril en la cual la molécula de FGF-23 se formula como una solución isotónica estéril conservada adecuadamente. Otra preparación adicional puede involucrar la formulación de la molécula deseada con un agente tal como microesferas inyectables, partículas bioerosionables, compuestos poliméricos (tales como ácido poliláctico o ácido poliglicólico) , esferas o liposomas que proporcionen la liberación controlada o sostenida del producto que después se puede suministrar por medio de inyección de deposición. También se puede utilizar ácido hialurónico y éste puede tener el efecto de promover la duración sostenida en la circulación. Otro medio adecuado para la introducción de la molécula deseada incluye dispositivos de suministro de medicamentos implantables. En una modalidad, se puede formular una composición farmacéutica para inhalación. Por ejemplo, se puede formular el polipéptido FGF-23 como un polvo seco para inhalación. Las soluciones de inhalación de polipéptido FGF-23 o molécula de ácido nucleico también se pueden formular con un propelente para suministro en aerosol. En otra modalidad adicional, las soluciones se pueden nebulizar. La administración pulmonar se describe adicionalmente en PCT Publicación No. WO 94/20069, la cual describe el suministro pulmonar de proteínas modificadas químicamente.
También se contempla que algunas formulaciones se puedan administrar oralmente. En una modalidad de la presente invención, los polipéptidos FGF-23 que se administran de esta manera se pueden formular con o sin aquellos portadores utilizados habitualmente en la elaboración de compuestos de formas de dosificación sólidas tales como tabletas y cápsulas. Por ejemplo, se puede diseñar una cápsula para liberar la porción activa de la formulación en un punto en el tractointestinal en donde se maximice la biodisponibilidad y se minimice la degradación presistémica. Se pueden incluir agentes adicionales para facilitar la absorción del polipéptido FGF-23. También se pueden utilizar diluyentes, agentes saborizantes, ceras con temperatura de fusión baja, aceites vegetales, lubricantes, agentes que mejoren la suspensión, agentes desintegrantes de tableta y aglutinantes. Otra composición farmacéutica puede involucrar una cantidad efectiva de polipéptidos FGF-23 en una mezcla con excipientes no tóxicos que sean adecuados para la elaboración de tabletas. Al disolver las tabletas en agua estéril, u otro vehículo apropiado, se pueden elaborar soluciones en forma de dosificación unitaria. Los excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a diluyentes inertes tales como carbonato de calcio, carbonato o bicarbonato de sodio, lactosa o fosfato de calcio; o ^?wfctf??? ? c c^^ g^i^^^^^^^ agentes aglutinantes tales como almidón, gelatina o, acacia; o agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Las composiciones farmacéuticas adicionales de polipéptido FGF-23 serán evidentes para aquellos expertos en la técnica, incluyendo formulaciones que involucran polipéptidos FGF-23 en formulaciones de suministro sostenido o controlado. Las técnicas para la elaboración de formulaciones de diversos medios de suministro sostenido o controlado, tales como portadores de liposomas, micropartículas bioerosionables y esferas porosas así como inyecciones de deposición también se conocen por aquellos expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, el documento PCT/US93/00829, el cual describe la liberación controlada de micropartículas poliméricas porosas para el suministro de composiciones farmacéuticas. Los ejemplos adicionales de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices de polímeros semipermeables en forma de artículos conformados, por ejemplo películas o microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida pueden incluir poliésteres, hidrogeles, polilactidas (Patente de E.U.A. NO. 3,773,919 y la Patente Europea No. 058481), copolímeros de ácido L-glutámico y L-glutamato de y etilo (Sidman et al . , 1983, Biopolymers 22:547-56), poli (metacrilato de 2 -hidroxietilo) (Langer et , ;.^.? i j?» * t?.~. J...^.,.* .»-... .. - - al . , 1981, J. Biomed. Mater. Res . 15:167-277 y Langer, 1982, Chem . Tech . 12:98- 105), vinilacetato de etileno (Langer et al . , supra) o ácido poli-D (-) -3-hidroxibutírico (Patente Europea No. 133988) . Las composiciones de liberación sostenidas también pueden incluir liposomas los cuales se pueden preparar por cualquiera de los diversos métodos conocidos en la técnica. Véase por ejemplo, Eppstein et al . , 1985, PROC. Natl . Acad. Sci . USA 82:3688-92; y las Patentes Europeas Nos. 036676, 088046 y 143949. La composición farmacéutica de FGF-23 para ser utilizada para administración in vivo típicamente debe ser estéril. Esto se puede llevar a cabo por filtración a través de membranas para esterilización por filtración. Cuando la composición es liofilizada, la esterilización utilizando este método se puede llevar a cabo antes de o después de liofilización y disolución. La composición para administración parenteral se puede almacenar en forma liofilizada o en una solución. Además, las composiciones parenterales generalmente se colocan en un recipiente que tiene un orificio de acceso estéril, por ejemplo una bolsa de solución intravenosa o un frasco que tiene un tapón perforable por una aguja para inyección hipodérmica. Una vez que se han formulado las composiciones farmacéuticas, se pueden almacenar en frascos estériles como una solución, suspensión, gel, emulsión, sólido o como un polvo deshidratado o liofilizado. Tales formulaciones se pueden almacenar en una forma lista para usarse o en una forma (por ejemplo liofilizada) que requiere disolución antes de su administración. En una modalidad específica, la presente invención se relaciona con equipos para producir una unidad de administración de una sola dosis. Los equipos pueden contener cada uno tanto el primer recipiente que tiene la proteína seca así como un segundo recipiente que tiene una formulación acuosa. También se incluyen dentro del alcance de esta invención equipos que contengan jeringas llenadas previamente con una sola cámara o con cámaras múltiples (por ejemplo jeringas con líquido y lisojeringas) . La cantidad efectiva de una composición farmacéutica de FGF-23 que se va a utilizar terapéuticamente dependerá, por ejemplo, del contexto y objetivos terapéuticos. Una persona experta en la técnica apreciará que los niveles de dosificación apropiados para el tratamiento de esta manera variarán en base, en parte, en la molécula suministrada, la indicación para la cual se utiliza la molécula de FGF-23, la vía de administración y el tamaño (peso corporal, superficie corporal o tamaño de los órganos) y la condición (la edad y salud general) del paciente. En consecuencia, el médico puede adecuar la dosificación y modificar la vía de administración para obtener el efecto terapéutico óptimo. Una dosificación típica puede variar entre aproximadamente 0.1 µg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg o más, en base en los factores mencionados antes. En otras modalidades, la dosificación puede variar de 0.1 µg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg; o de 1 µg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg; o 5 µg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg. La frecuencia de dosificación dependerá de los parámetros farmacocinéticos de la molécula de FGF-23 en la formulación que se utilice. Habitualmente, un médico administrará la composición hasta que se alcance una dosificación que genere el efecto que se desea. La composición por lo tanto se puede administrar como una sola dosis, o como dos o más dosis (las cuales pueden o no contener la misma cantidad de la molécula deseada) con respecto al tiempo, o como una infusión continua vía un dispositivo de implantación o catéter. Un ajuste adicional de la dosificación apropiada se realiza habitualmente por aquellos expertos en la técnica y está dentro del ámbito de las tareas realizadas habitualmente por ellos. Las dosificaciones apropiadas se pueden determinar mediante el uso de datos apropiados de dosis y respuesta. La vía de administración de la composición farmacéutica concuerda con los métodos conocidos, por ejemplo por vía oral; a través de inyección por vía intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (dentro del parénquima) intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraarterial , intraportal o intralesional ; por sistemas de liberación sostenida o bien por dispositivos de implantación. Cuando se desea, las composiciones se pueden administrar por inyección rápida y continua o bien continuamente por infusión, o por un dispositivo de implantación . De manera alternativa o adicional, la composición se puede administrar localmente por implantación de una membrana, esponja u otro material apropiado en el cual se ha absorbido o encapsulado la molécula deseada. Cuando se utiliza un dispositivo de implantación, se puede implantar en cualquier tejido u órgano adecuado, y el suministro de la molécula deseada puede ser vía difusión, inyección rápida de liberación sincronizada o bien por administración continua. En algunos casos es deseable utilizar composiciones farmacéuticas del polipéptido FGF-23 de una manera ex vivo . En tales casos, las células, tejidos u órganos que han sido extraídos del paciente se exponen a las composiciones farmacéuticas del polipéptido FGF-23 después de lo cual las células, tejidos u órganos se implantan nuevamente en el paciente. En otros casos, el polipéptido FGF-23 se puede suministrar al implantar ciertas células que han sido sometidas a ingeniería genética, utilizando métodos como los descritos en la presente para expresar y secretar el polipéptido FGF-23. Tales células pueden ser células animales o humanas, y pueden ser autólogas, heterólogas o xenogeneicas . Opcionalmente, las células pueden ser inmortalizadas. Para disminuir la probabilidad de una respuesta inmunológica, las células pueden ser encapsuladas para evitar infiltración de los tejidos circundantes. Los materiales de encapsulación típicamente son biocompatibles, son recintos o membranas poliméricas semipermeables que permiten la liberación de el o los productos proteínicos pero que impiden la destrucción de las células por el sistema inmunitario del paciente o por otros factores dañinos de los tejidos circundantes. Como se discute en la presente, puede ser deseable tratar las poblaciones de células aisladas (por ejemplo tales como hemocitoblastos, linfocitos, eritrocitos, condrocitos, neuronas y similares) con uno o más polipéptidos FGF-23. Esto se puede llevar a cabo al exponer las células aisladas al polipéptido directamente, cuando está en una forma que es permeable a la membrana celular. Las modalidades adicionales de la presente invención se relacionan con células y métodos (por ejemplo recombinación homologa u otros métodos de producción recombinante) tanto para la producción in vi tro de polipéptidos terapéuticos como para la producción y suministro de polipéptidos terapéuticos por terapia de genes o por terapia de células. Se pueden utilizar métodos de recombinación homologa u otros métodos de recombinación para modificar una célula que contenga un gen FGF-23 que normalmente es transcripcionalmente silencioso (no se transcribe) o un gen subexpresado, y por lo tanto producir una célula que exprese cantidades terapéuticamente eficaces de los polipéptidos FGF-23. La recombinación homologa es una técnica desarrollada originalmente para genes objetivo para inducir o corregir mutaciones en genes transcripcionalmente activos. Kucherlapati, 1989, Prog. in Nucí . Acid Res . & Mol . Biol . 36:301. La técnica básica fue desarrollada como un método para introducir mutaciones específicas dentro de regiones específicas del genoma de los mamíferos (Thomas et al . , 1986, Cell 44:419-28; Thomas y Capecchi, 1987, Cell 51:503-12; Doetschman et al . , 1988, Proc. Natl . Acad. Sci . U. S.A . 85:8583-87) o bien para corregir mutaciones específicas dentro de genes defectuosos (Doetschman et al . , 1987, Nature 330:576-78) . Las técnicas de recombinación homologa ejemplares se describen en la Patente de E.U.A. No. 5,272,071; las Patentes Europeas Nos. 9193051 y 505500; PCT/US90/07642 y Publicación PCT NO. WO 91/09955) . A través de la recombinación homologa, la ^^^ j^^^^g?^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^*^^^^^^^^^^^^ secuencia de ADN que se va a insertar en el genoma se puede dirigir a una región específica del gen de interés al unirlo a ADN objetivo. El ADN objetivo es una secuencia de nucleótidos que es complementaria (homologa) a una región del ADN genómico. Las piezas pequeñas de ADN objetivo que son complementarias para una región específica del genoma se ponen en contacto con la cadena original durante el procedimiento de replicación de ADN. Una propiedad general del ADN es que se ha insertado en una célula para hibridizar y por lo tanto se recombina con otras piezas de ADN endógeno mediante regiones homologas compartidas. Si esta cadena complementaria se une a un oligonucleótido que contenga una mutación o una secuencia diferente o un nucleótido adicional, también se incorpora en la cadena recién sintetizada como resultado de la recombinación. Como resultado de la función de verificación de lectura, es posible que la secuencia nueva de ADN sirva como una plantilla. Así, el ADN transferido se incorpora en el genoma . Unido a estas piezas de ADN dirigido están regiones de ADN que pueden interactuar con, o controlar la expresión de un polipéptido FGF-23, por ejemplo, las secuencias flanqueantes. Por ejemplo, un elemento promotor/mej orador, un supresor o un elemento modulador de transcripción exógena se inserta en el genoma de la célula huésped propuesta en proximidad y orientación suficientes para influir en la transcripción de ADN que codifica para el polipéptido FGF-23 deseado. El elemento de control controla una porción del ADN presente en el genoma de la célula huésped. De esta manera, se puede obtener la expresión del polipéptido FGF-23 deseado no por transfección de ADN que codifica para el gen para FGF-23 mismo, sino más bien mediante el uso de ADN dirigido (que contiene regiones de homología con el gen endógeno de interés) acoplado con segmentos reguladores de ADN que proporcionan la secuencia del gen endógeno con señales reconocibles por transcripción de un gen FGF-23. En un método ejemplar, la expresión de un gen dirigido deseado en una célula (es decir, un gen celular endógeno deseado) se altera vía recombinación homologa en el genoma celular en un sitio seleccionado de antemano, por la introducción de ADN que incluye por lo menos una secuencia reguladora, un exon y un sitio donador de empalme. Estos componentes se introducen en el ADN cromosómico (genómico) de manera tal que este, en efecto, resulta en la producción de una unidad de transcripción nueva (en la cual la secuencia reguladora, elexón y el sitio donador de empalme están presentes en el montaje de ADN y unidos operablemente al gen endógeno) . Como resultado de la introducción de estos componentes en el ADN cromosómico, se altera la expresión i£ ie¡ 1 -C.l .?~rÍ - tlÁ~A i*. del gen endógeno deseado. La expresión alterada del gen, como se describe en la presente, abarca activar un gen (o provocar que se exprese) el cual habitualmente no se expresa en la célula como se obtiene, así como un aumento en la expresión de un gen que no se expresa a concentraciones fisiológicamente significativas en la célula como se obtiene. Las modalidades comprenden además cambiar el patrón de regulación o inducción de manera que sea diferente del patrón de regulación o inducción que se presente en la célula como se obtiene, y reducir (incluso eliminar) la expresión de un gen el cual se expresa en la célula como se obtiene. Un método mediante el cual se puede utilizar la recombinación homologa para aumentar o provocar la producción del polipéptido FGF-23 a partir del gen para FGF- 23 endógeno de la célula involucra utilizar primero recombinación homologa para establecer una secuencia de recombinación a partir de un sistema de recombinación específico de sitio (por ejemplo, Cre/loxP, FLP/FRT) (Sauer, 1994, Curr. Opin . Biotechnol . , 5:521-27; Sauer, 1993, Methods Enzymol . , 225:890-900) hacia el extremo 5' respecto a la región codificante genómica endógena para el polipéptido FGF-23. Se coloca un plásmido que contiene un sitio de recombinación homólogo al sitio justo hacia el extremo 5' de la región codificante genómina del polipéptido FGF-23 dentro de la línea de células modificadas junto con la enzima recombinasa apropiada. Esta recombinasa provoca que el plásmido se integre, vía el sitio de recombinación del plásmido, en el sitio de recombinación que se localiza justo corriente arriba de la región codificante genómica del polipéptido FGF-23 en la línea celular (Baubonis and Sauer, 1993, Nucleic Acids Res . 21:2025-29; 0 • Gorman et al . , 1991, Science 251:1351-55). Cualquier secuencia flanqueante que se sepa aumenta la transcripción (por ejemplo un mej orador/promotor, intrón, mejorador de traducción) si se coloca apropiadamente en este plásmido, puede integrarse de manera tal que genera una unidad transcripción nueva o modificada lo que resulta en una producción de novo o aumentada del polipéptido FGF-23 a partir del gen endógeno de la célula para FGF-23. Un método adicional para utilizar la línea celular en la cual se ha colocado la secuencia de recombinación específica de sitio justo hacia el extremo 5' de la región codificante genómica endógena de la célula para el polipéptido FGF-23 es utilizar recombinación homologa para introducir un segundo sitio de recombinación en otra parte en el genoma de la línea de las células. La enzima recombinasa apropiada después se introduce en una línea de células con dos sitios de recombinación, lo que provoca un fenómeno de recombinación (supresión, inversión y translocación) (Sauer, 1994, Curr. Opin . Biotechnol . , 5:521- 27; Sauer, 1993, Methods Enzymol . , 225:890-900) que puede generar una unidad transcripcional nueva o modificada que resulta en una producción de novo o aumentada del 5 polipéptido FGF-23 a partir del gen endógeno de la célula para FGF-23. Un enfoque adicional para aumentar o provocar la expresión del polipéptido FGF-23 a partir del gen endógeno de la célula para FGF-23 que involucre aumentar o provocar 0 la expresión de un gen o genes (por ejemplo factores de transcripción) o disminuir la expresión de un gen o genes (por ejemplo represores de transcripción) de una manera que resulte en una producción de novo o aumentada del polipéptido FGF-23 a partir del gen endógeno de la célula 5 para FGF-23. Este método incluye la introducción de un polipéptido que no se presenta de manera natural (por ejemplo, un polipéptido que comprende un dominio de unión de ADN específico de sitio fusionado a un dominio de factor de transcripción) dentro de la célula, de manera que resulta en 0 la producción de novo o aumentada del polipéptido FGF-23 a partir del gen endógeno de la célula para FGF-23. La presente invención se relaciona además con montajes (plásmidos recombinantes) de ADN útiles en el método para alterar la expresión de un gen objetivo. En 5 algunas modalidades, los montajes de ADN ejemplares ^m^^^^^í? comprenden: (a) una o más secuencias dirigidas, (b) una secuencia reguladora, (c) un exón y (d) un sitio donador de empalme no pareado. La secuencia dirigida en el montaje de ADN dirige la integración de los elementos (a) - (d) en el gen 5 objetivo en una célula de manera que los elementos (b) - (d) están unidos operativamente a las secuencias del gen objetivo endógeno. En otra modalidad, el montaje de ADN comprende: (a) una o más secuencias dirigidas, (b) una secuencia reguladora, (c) un exón, (d) un sitio donador de 10 empalme, (e) un intrón y (f) un sitio aceptor de empalme, en donde la secuencia dirigida dirige la integración de los elementos (a) - (f) de manera que los elementos de (b)-(f) estén unidos operativamente al gen endóngeno. La secuencia dirigida es homologa a un sitio seleccionado previamente en 15 el ADN cromosómico celular en el cual se produce la recombinación homologa. En el montaje, el exon generalmente está 3 ' respecto a la secuencia reguladora y el sitio donador de empalme se encuentra 31 respecto al exon. Si se conoce la secuencia de un gen particular, 20 tal como la secuencia de ácido nucleico para el polipéptido FGF-23 que se presenta aquí, se puede sintetizar u obtener de alguna otra manera una pieza de ADN que es complementaria a una región seleccionada del gen, por ejemplo por restricción apropiada del ADN nativo en sitios 25 de reconocimiento específicos que unen la región de interés.
IMÜtBltlIÉ ?t mi ?Tt if ri' J ¡n-i t f;tti?rlgfaa°«A"'-»«>--'--aia'~--'t-"t - *- -—*-"— - • - -Esta pieza sirve como una secuencia dirigida ante la inserción en la célula e hibridizará a su región homologa dentro del genoma. Si esta hibridación se produce durante la replicación del ADN, esta pieza de ADN, y cualquier secuencia adicional unida a la misma actuará como un fragmento de Okazaki y se incorporará en la cadena hija recién sintetizada de ADN. Por lo tanto, la presente invención incluye nucleótidos que codifican para un polipéptido FGF-23, nucleótidos los cuales se pueden utilizar como secuencias objetivo. También se contempla la terapia con células que contengan polipéptido FGF-23, por ejemplo, la implantación de células que produzcan polipéptidos FGF-23. Esta modalidad involucra implantar células capaces de sintetizar y secretar una forma biológicamente activa del polipéptido FGF-23. Tales células productoras del polipéptido FGF-23 pueden ser células que sean productoras naturales de polipéptidos FGF-23 o pueden ser células recombinantes en las cuales se haya aumentado la capacidad para producir polipéptidos FGF-23 por transformación con un gen que codifica para el polipéptido de FGF-23 deseado o con un gen que aumente la expresión del polipéptido FGF-23. Tal modificación se puede llevar a cabo por medio de un vector adecuado para suministrar el gen e igualmente promover su expresión y secreción. Para minimizar la reacción inmunológica potencial en pacientes a los que se les administra un polipéptido FGF-23, que pudiera presentarse con la administración de un polipéptido de una especie extraña, se prefiere que las células naturales que producen el polipéptido FGF-23 sean de origen humano y produzcan polipéptido FGF-23 humano. De igual manera, se prefiere que las células recombinantes que producen el polipéptido FGF-23 se transformen con un vector de expresión que contiene un gen que codifica para un polipéptido FGF-23 humano . Las células implantadas se pueden encapsular para evitar la infiltración del tejido circundante. Se pueden implantar células no humanas o células de animales en pacientes en recintos o membranas poliméricas semipermeables biocompatibles que permitan la liberación del polipéptido FGF-23, pero que eviten la destrucción de las células por el sistema inmunitario del paciente o por otros factores dañinos del tejido circundante. Alternativamente, se pueden implantar directamente en el paciente, sin tal encapsulación, células propias del paciente transportadas ex vivo para producir polipéptido FGF-23. Se conocen la técnica las maneras para encapsular células vivas, y se puede llevar a cabo de manera habitual la preparación de células encapsuladas y su implantación en pacientes. Por ejemplo, Baetge et al . , (Publicación PCT No. WO 95/05452 y PCT/US95/09299) describen cápsulas de membrana que contienen células sometidas a ingeniería genética para el suministro efectivo de moléculas biológicamente activas. Las cápsulas son biocompatibles y son fácilmente recuperables. Las cápsulas encapsulan células transfectadas con moléculas recombinantes de ADN que comprenden secuencias de ADN que codifican para moléculas biológicamente activas unidas operablemente a promotores que no se someten a regulación por disminución in vivo ante la implantación en un huésped mamífero. Los dispositivos proporcionan el suministro de las moléculas a partir de células vivas en sitios específicos dentro de un receptor. Además, véanse las Patentes de E.U.A. Nos. 4,892,538; 5,011,472; y 5,106,627. Se describe un sistema para encapsular células vivas en la Publicación PCT No. WO 91/10425 (Aebischer et al . ) . Véase también la Publicación No. WO 91/10470 (Aebischer et al . ) ; Winn et al . , 1991, Exper, Neurol . 113:322-29; Aebischer et al . , 1991, Exper. Neurol . 111:269-75; y Tresco et al . , 1992, ASAIO 38:17-23. También se considera el suministro por terapia de genes in vivo e in vi tro de los polipéptidos FGF-23. Un ejemplo de una técnica de terapia de genes es utilizar el gen para FGF-23 (ya sea ADN genómico, ADNc o bien ADN sintético) que codifica para un polipéptido FGF-23 el cual se puede unir operablemente a un promotor constitutivo o inducible para formar un "montaje de ADN de terapia de gen".
El promotor puede ser homólogo o eterólogo al gen endógeno para FGF-23, con la condición de que sea activo en la célula o tipo de tejido en el cual se va a insertar el montaje. Otros componentes del montaje de ADN de terapia de gen opcionalmente pueden incluir moléculas de ADN diseñadas para integración específica en el sitio (por ejemplo secuencias endógenas útiles para recombinación homologa) , promotores específicos de tejido, mejoradores o bloqueadores de expresión de un gen, moléculas de ADN capaces de proporcionar una ventaja selectiva sobre una célula original, moléculas de ADN útiles como etiquetas para identificar células transformadas, sistemas de selección negativa, agentes de unión específicos de célula (tales como por ejemplo para direccionamiento de células) , factores de internalización específicos de célula, factores de transcripción que mejoran la expresión de un vector y vectores que permiten la producción del vector. De esta manera se puede introducir en las células un montaje de ADN de terapia de gen (ya sea ex vivo o in vivo) utilizando vectores virales o no virales. Un medio para introducir el montaje de ADN de terapia de gen es por medio de vectores virales, como se describe en la presente. Algunos vectores, tales como los vectores retrovirales, suministrarán el montaje de ADN al ADN cromosómico de las células, y el gen se puede integrar al ADN cromosómico.
Otros vectores funcionarán como episomas, y el montaje de ADN de terapia de gen permanecerá en el citoplasma. En otras modalidades adicionales, se pueden incluir elementos reguladores para la expresión controlada del gen para FGF-23 en la célula objetivo. Tales elementos se activan en respuesta a un efector apropiado. De esta manera, se puede expresar cuando se desee el polipéptido terapéutico. Un medio de control convencional involucra el uso de dimerizadores o rapálogos de moléculas pequeñas para dimerizar proteínas quiméricas que contengan un dominio pequeño de unión a molécula y un dominio capaz de iniciar un procedimiento biológico tal como una proteína que se une a ADN o una proteína de activación de transcripción (véanse las publicaciones PCT Nos. WO 96/41865, WO 97/31898 y WO 97/31899) . La dimerización de las proteínas se puede utilizar para iniciar la transcripción del transgen. Una tecnología de regulación alternativa utiliza un método para almacenar proteínas que se expresan del gen de interés dentro de la célula como un agregado o agrupado. El gen de interés se expresa como una proteína de fusión que incluye un dominio de agregación condicional que resulta en la retención de la proteína agregada en el retículo endoplásmico. Las proteínas almacenadas son estables e inactivas dentro de la célula. Sin embargo, las proteínas pueden ser liberadas al administrar un medicamento (por U- -a ? ifaj .±* t-*.... .* ^.^ .. ejemplo un ligando de molécula pequeña) que elimina el dominio de agregación condicional y de esta manera separa específicamente los agregados o agrupados de manera que las proteínas pueden ser secretadas de la célula. Véanse Aridor et al . , 2000, Science 287:816-17 y Rivera et al . , 2000, Science 287:826-30. Otro medio de control adecuado de activación de genes incluye, pero no se limita a los sistemas que se describen en la presente. Se utiliza Mifepristone (RU486) como un antagonista de progesterona. La unión de un receptor de progesterona modificado de un dominio de unión de ligando a un antagonista de progesterona activa la transcripción para formar un dímero de dos factores de transcripción y después pasa al núcleo para unir ADN. El ligando-dominio de unión se modifica para eliminar la capacidad del receptor para unirse al ligando natural . El sistema receptor de hormona esteroide modificado se describe adicionalmente en la Patente de E.U.A. No. 5,364,791 y Publicaciones PCT Nos. WO 96/40911 y WO 97/10337. Otro sistema de control adicional utiliza ecdisona (una hormona esteroide de la mosca de la fruta) el cual se une y activa un receptor de ecdisona (receptor citoplásmico) . El receptor después se dirige al núcleo para unirse a un elemento de respuesta de ADN específico (un promotor del gen que responde a ecdisona) . El receptor de ecdisona incluye un dominio de transactivación, un dominio de unión de ADN, un dominio de unión de ligando para iniciar la transcripción. El sistema de ecdisona se describe adicionalmente en la Patente de E.U.A. No. 5,514,578 y 5 en las Publicaciones PCT Nos. WO 97/38117, WO 96/37609 y WO 93/03162. Otro medio de control utiliza un transactivador controlable por tetraciclina positivo. Este sistema involucra un dominio de unión de ADN de proteína represora 10 tet mutada (el aminoácidos R-4 tet mutado cambia, lo que resulta en un proteína transactivadora regulada por tetraciclina inversa, es decir, se une a un operador tet en presencia de tetraciclina) unido a un polipéptido el cual activa la transcripción. Tales sistemas se describen se 15 describen en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,464,758, 5,650,298 y 5,654,168. Los sistemas de control de expresión adicionales y montajes (plásmidos recombinantes) de ácido nucleico se describen en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,741,679 y 20 5,834,186 para Innovir Laboratories Inc. La terapia de genes in vivo se puede llevar a cabo al introducir el gen que codifica para el polipéptido FGF-23 dentro de células por medio de inyección local de una molécula de ácido nucleico para FGF-23 o por otro vector de 25 suministro viral o no viral apropiado. Hefti, 1994, Neurobiology 25:1418-35. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido FGF-23 puede estar contenida en un vector de virus adenoasociados (AAV, por sus siglas en inglés) para su suministro a células objetivo (véase, por ejemplo, Johnson, Publicación PCT No. WO 95/34670; Solicitud PCT No. PCT/US95/07178) . El genoma de AAV recombinante habitualmente contiene secuencias repetidas terminales invertidas de AW que flanquean una secuencia de ADN que codifica para un polipéptido FGF-23 unido operablemente a un promotor funcional así como secuencias de poliadenilación. Los vectores virales adecuados alternativos incluyen, pero no se limitan a retrovirus, adenovirus, virus de herpes simple, lentivirus, virus de hepatitis, parvovirus, papovavirus, poxvirus, alfavirus, coronavirus, rabdovirus, paramixovirus y vectores de virus de papiloma. La Patente de E.U.A. No. 5,672,344 describe un sistema de transferencia de gen mediado por virus in vivo que involucra un vector HSV-1 neurotrófico recombinante. La Patente de E.U.A. No. 5,399,346 proporciona ejemplos de un procedimiento para proporcionar a un paciente con proteína terapéutica mediante el suministro de células humanas las cuales se han tratado in vi tro para insertar un segmento de ADN que codifica para una proteína terapéutica. Los métodos y materiales adicionales para la práctica de las técnicas de terapia de genes se describen en las Patentes de E.U.A. No. 5,631,236 (relacionada con vectores adenovirales) , 5,672,510 (relacionada con vectores retrovirales) , y 5,635,399 (relacionada con vectores retrovirales que expresan citocinas) . Los métodos de suministro no virales incluyen, pero no se limitan a transferencia mediada por liposomas, suministro de ADN desnudo (inyección directa) , transferencia mediada por receptor (complejo de ligando-ADN) , electroporación, precipitación con fosfato de calcio y bombardeo de micropartículas (por ejemplo pistola de genes) . Los materiales de terapia de genes así como los métodos también pueden incluir promotores inducibles, mej oradores-promotores específicos de tejido, secuencias de ADN diseñadas para integración específica en el sitio, secuencias de ADN capaces de proporcionar una ventaja selectiva sobre la célula original, etiquetas para identificar células transformadas, sistema de selección negativos y sistemas de control de expresión (medidas de seguridad) , agentes de unión específicos de célula (para direccionamiento de células) , factores de internalización específicos de células y factores de transcripción para mejorar la expresión por un vector así como métodos de fabricación de vectores. Tales métodos y materiales adicionales para la práctica de las técnicas de terapia de genes se describen en las Patentes de E.U.A. Nos. 4,970,154 (que se relaciona con técnicas de electroporación) , 5,679,559 (que describe un sistema que contiene lipoproteína para el suministro de genes), 5,676,954 (relacionado con portadores de liposama) , 5,593,875 (que describe métodos para transfección con fosfato de calcio) y 4,945,050 (que describe un procedimiento en el que se impulsan partículas biológicamente activas en las células a una velocidad por la cual las partículas penetran la superficie de las células y se incorporan en el interior de las células) , y la Publicación PCT No. WO 96/40958 (relacionada con ligandos nucleares) . También se contempla que la terapia de genes con FGF-23 o la terapia celular pueda incluir además el suministro de uno o más polipéptidos adicionales en una misma célula o bien en células diferentes. Tales células se pueden introducir por separado en el paciente, o las células pueden estar contenidas en un solo dispositivo implantable, tal como una membrana encapsulante, descrita antes, o bien las células se pueden modificar por separado, por medio de vectores virales. Una manera para aumentar la expresión endógena del polipéptido FGF-23 en una célula vía terapia de genes es insertar uno o más elementos mejoradores en el promotor para el polipéptido FGF-23, en donde los elementos mejoradores pueden servir para aumentar la actividad transcripcional del gen para FGF-23. Los elementos mejoradores utilizados se seleccionarán en base en el tejido en el cual uno desea activar el gen -los elementos mejoradores se sabe que confieren activación de promotor en aquel tejido que se seleccione. Por ejemplo, si un gen codifica para un polipéptido FGF-23 va a ser "activado" en linfocitos T, se puede utilizar el elemento mejorador promotor lck. Aquí, la porción del elemento transcripcional que se va a agregar se puede insertar dentro de un fragmento de ADN que contiene el promotor del polipéptido FGF-23 (y opcionalmente se puede insertar dentro de un vector y en las secuencias flanqueantes 51 o 3') utilizando técnicas de clonación estándar. Este montaje, conocido como un "montaje de recombinación homólogo", después se puede introducir en las células deseadas ya sea ex vivo o in vivo . La terapia de genes también se puede utilizar para disminuir la expresión del polipéptido FGF-23 al modificar la secuencia de nucleótidos del promotor endógeno. Tal modificación típicamente se lleva a cabo vía métodos de recombinación homologa. Por ejemplo, una molécula de ADN que contenga la totalidad o una porción del promotor del gen para FGF-23 seleccionado para inactivación se puede someter a ingeniería genética para separar o sustituir piezas del promotor que regulan la transcripción. Por ejemplo, la secuencia TATA o el sitio de unión de un activador transcripcional del promotor se pueden suprimir utilizando técnicas de biología molecular estándar o convencionales; tal supresión puede inhibir la actividad promotora y de esta manera se reprime la transcripción del gen correspondiente para FGF-23. La supresión de la secuencia TATA del sitio de unión de activador de transcripción en el promotor se puede llevar a cabo al generar un montaje de ADN que comprende la totalidad o la porción relevante del promotor del polipéptido FGF-23 (para la misma especie o especies relacionadas respecto al gen para FGF-23 que se va a regular) , en el cual se mutan uno o más de los nucleótidos de la secuencia TATA o del sitio de unión de activador transcripcional por medio de sustitución, supresión o inserción de uno o más nucleótidos. Como un resultado, la secuencia TATA o el sitio de unión de activador tienen actividad disminuida o se vuelven completamente inactivos. Este montaje, el cual típicamente contendrá por lo menos aproximadamente 500 bases de ADN que corresponden a las secuencias nativas (endógenas) 51 y 3' de ADN adyacentes al segmento promotor que se ha modificado, se pueden introducir en células apropiadas (ex vivo o in vivo) directamente o por medio de un vector viral, como se describe en la presente. Típicamente, la integración del montaje dentro del ADN genómico de las células será vía recombinación homologa, en donde las secuencias de ADN 5' y 3' en el montaje promotor pueden servir para ayudar a integrar la región promotora modificada vía hibridación al ADN cromosómico endógeno.
Usos Terapéuticos Las moléculas de ácido nucleico para FGF-23, polipéptidos, agonistas y antagonistas de los mismos se pueden utilizar para tratar, diagnosticar, disminuir o impedir muchas enfermedades, desórdenes o condiciones que incluyen los que se mencionan en la presente. Los agonistas y antagonistas del polipéptido FGF-23 incluyen aquellas moléculas que regulan la actividad del polipéptido FGF-23 y aumentan o disminuyen por lo menos una actividad de la forma madura del polipéptido FGF-23. Los agonistas o antagonistas pueden ser cofactores tales como una proteína, péptido, carbohidrato, lípido o molécula de peso molecular pequeño que interactúe con el polipéptido FGF-23 y de esta manera regule su actividad. Los agonistas o antagonistas potenciales del polipéptido incluyen anticuerpos que reaccionan con las formas soluble o unida a membrana de polipéptidos FGF-23 que comprenden parte o la totalidad de los dominios extracelulares de las proteínas. Las moléculas que regulan la expresión del polipéptido FGF-23 típicamente incluyen ácidos nucleicos que codifican para el polipéptido FGF-23 que pueden actuar como reguladores antisentído de expresión. Las moléculas de ácido nucleico para FGF-23, los polipéptidos, agonistas y antagonistas de los mismos de la presente invención son útiles para los mismos propósitos para los cuales se sabe que son útiles los miembros de la familia de polipéptidos de FGF. Por lo tanto, los polipéptidos FGF-23 de esta invención son mitógenos potentes para diversas células de origen mesodérmico, ectodérmico y endodérmico, que incluyen fibroblastos, células de la córnea y vasculares endoteliales, granulocitos, células de la corteza suprarrenal, condrocitos, mioblastos, células de músculo liso vascular, células epiteliales del cristalino, melanocitos, queratinocitos, oligodendrocitos, astrocitos, osteoblastos y células hematopoyéticas. Entre estas actividades biológicas se incluye la capacidad de estimular la proliferación de células endoteliales vasculares y que permite que las células endoteliales penetren la membrana basal. Consistente con estas propiedades, los polipéptidos FGF-23 de esta invención pueden estimular la angiogénesis y promover el sanado de heridas (es decir, facilitar la reparación o sustitución de daños de tejido enfermo que resulta de quemaduras, daños traumáticos, cirugía o úlceras) . Estos polipéptidos también pueden inducir formación de mesodermo y modular la diferenciación de células neuronales, adipositos y células de musculoesquelético. Los polipéptidos también se pueden utilizar para evitar o disminuir el envejecimiento de la piel debido a exposición al sol al estimular el crecimiento de queratinocitos. Además, los polipéptidos de esta invención se pueden utilizar para mantener órganos antes de su trasplante o para nutrir cultivos de células primarias y de tejidos. Además, estos polipéptidos se pueden utilizar para evitar la pérdida de pelo dado que los miembros de la familia de FGF activan células formadoras de pelo y promueven el crecimiento de melanocitos. También se pueden utilizar para estimular el crecimiento y diferenciación de células hematopoyéticas y células de médula ósea cuando se utilizan en combinación con otra citocinas. Se ha unido FGF-23 con la enfermedad genética dominante autosómica humana, raquitismo hipofosfatémico (ADHR, por sus siglas en inglés) (The ADHR Consortium, 2000, Nature Genetics 26:345-48). En consecuencia, las moléculas de ácido nucleico para FGF-23, los polipéptidos, agonistas y antagonistas de los mismos de la presente invención se pueden utilizar para tratar, diagnosticar, disminuir o evitar ADHR. Se ha demostrado que el gen para FGF-23 se encuentra mucho más relacionado con FGF-21 humano (Yamashita et al . , 2000, Biochem . Biophys . Res . Commun . 277:494-98), un gen el cual se expresa de manera más abundante en el hígado y a concentraciones inferiores en el timo (Nishimura et al . , 2000, Biochim . Biophys . Acta 1492:203-06). En consecuencia, las moléculas de ácido nucleico de FGF-23, polipéptidos y agonistas y antagonistas del mismo se pueden utilizar para tratar, diagnosticar, disminuir o evitar enfermedades, desórdenes o condiciones que se relacionan con el hígado o timo. Una lista, que no es exhaustiva, de otras enfermedades, desórdenes o condiciones los cuales pueden ser tratados, diagnosticados, disminuidos o evitados con las moléculas de ácido nucleico para FGF-23, polipétidos, agonistas y antogonistas del mismo de la presente invención incluyen: heridas dérmicas, epidermálisis bulosa, alopecia con patrón masculino, úlcera gástrica, úlcera duodenal, gastritis erosiva, esofagitis, enfermedad de reflujo esofágico, enfermedad de intestino inflamatorio, toxicidad intestinal inducida por radiación o quimioterapia, enfermedad de membrana hialina, necrosis del epitelio respiratorio, enfisema, inflamación pulmonar, fibrosis pulmonar, cirrosis hepática, falla hepática fulminante, hepatitis viral y diabetes. Los agonistas o antagonistas de la función del polipéptido FGF-23 se pueden utilizar (de manera simultánea o secuencial) en combinación con una o más citocinas, Á. ÍiA*Í?U..¿i-* ?** factores de crecimiento, antibióticos, antiinflamatorios o agentes quimioterapéuticos según sea apropiado para la condición que se trate. Otras enfermedades causadas o mediadas por concentraciones indeseables de polipéptidos FGF-23 están abarcadas dentro del alcance de la invención. Las concentraciones no deseables incluyen concentraciones excesivas de polipéptidos FGF-23 y concentraciones subnormales de polipéptidos FGF-23.
Usos de los Ácidos Nucleicos y Polipéptidos de FGF-23 Las moléculas de ácido nucleico de la invención (que incluyen aquellas que en sí mismas no codifican para polipéptidos biológicamente activos) se pueden utilizar para mapear las posiciones del gen para FGF-23 y genes relacionados en cromosomas. El mapeo se puede realizar por técnicas conocidas en el arte, tales como amplificación por PCR e hibridación in si tu . Las moléculas de ácido nucleico para FGF-23 (que incluyen aquellas que en sí mismas no codifican para polipéptidos biológicamente activos) , pueden ser útiles como sondas de hibridación en ensayos de diagnóstico para probar, cualitativa o cuantitativamente, la presencia de una molécula de ácido nucleico para FGF-23 en tejido de mamífero o muestras de fluido corporal . También se pueden utilizar otros métodos en donde es deseable inhibir la actividad de uno o más polipéptidos FGF-23. Tal inhibición se puede llevar a cabo por moléculas de ácido nucleico que sean complementarias y que hibridicen con las secuencias de control de expresión (formación de triple hélice) o con ARNm para FGF-23. Por ejemplo, moléculas de ADN antisentido o ARN, las cuales tienen una secuencia que es complementaria a por lo menos una porción de un gen para FGF-23 se pueden introducir en la célula. Se pueden diseñar sondas antisentido por técnicas disponibles utilizando la secuencia del gen FGF-23 descrito en la presente. Típicamente, cada molécula antisentido será complementaria al sitio de inicio (extremo 5') de cada gen para FGF-23 seleccionado. Cuando la molécula antisentido después hibridiza con el ARNm para FGF-23 correspondiente, se evita o reduce la traducción de este ARNm. Los inhibidores antisentido proporcionan información en relación a la disminución o ausencia de un polipéptido FGF-23 en una célula u organismo. Alternativamente, se puede utilizar la terapia de genes para crear un inhibidor dominante negativo o uno o más polipéptidos FGF-23. En esta situación, se puede preparar un ADN que codifique para un polipéptido mutante de cada polipéptido FGF-23 seleccionado y se introduce en las células de un paciente utilizando métodos virales o no virales, como se describe en la presente. Cada uno de tales mutantes típicamente se diseña para competir con el polipéptido endógeno en su papel biológico. Además, se puede utilizar un polipéptido FGF-23, ya sea biológicamente activo o no, como un inmunógeno, es decir, el polipéptido contiene por lo menos un epitopo para el cual se pueden generar anticuerpos. Se pueden utilizar agentes de unión selectivos que se unen a un polipéptido FGF-23 (como se describe en la presente) para propósitos de diagnóstico in vivo o in vi tro que incluyen, pero que no se limitan el uso en forma marcada para detectar la presencia del polipéptido FGF-23 en un fluido corporal o en una muestra de células. También se pueden utilizar los anticuerpos para evitar, tratar o diagnosticar muchas de las enfermedades y desórdenes que incluyen los mencionados en la presente. Los anticuerpos que se pueden unir a un polipéptido FGF-23 de manea que disminuyen o bloquean por lo menos una actividad característica de un polipéptido FGF-23, o que se pueden unir a un polipéptido para aumentar por lo menos una característica de actividad de un polipéptido FGF-23 (incluida por aumento de la farmacocinética del polipéptido FGF-23) . Los polipéptidos FGF-23 de la presente invención se pueden utilizar para clonar receptores de polipéptido FGF-23, utilizando una estrategia de clonación de expresión. El polipéptido FGF-23 radiomarcado (125I) o el polipéptido FGF-23 etiquetado por afinidad/actividad (tal como una fusión de Fe o una fusión de fosfatasa alcalina) se puede utilizar en ensayos de unión para identificar un tipo de célula o línea celular o tejido que exprese receptores para el polipéptido FGF-23. El ARN aislado de tales células o tejidos se puede convertir a ADNc, clonar en un vector de expresión de mamífero y transfectar en células de mamífero (tales como las células COS o 293) para crear una biblioteca de expresión. Después se puede utilizar un polipéptido FGF- 23 radiomarcado o etiquetado como un ligando de afinidad para identificar y aislar a partir de esta biblioteca el subconjunto de células que expresan receptores para el polipéptido FGF-23 en su superficie. Después se puede aislar el ADN de estas células y se transfecta a células de mamífero para crear una biblioteca de expresión secundaria en la cual la fracción de las células que expresan receptores para el polipéptido FGF-23 es muchas veces mayor que la biblioteca original. Se puede repetir este procedimiento de enriquecimiento una y otra vez hasta que se aisle un solo clon recombinante que contenga un receptor para el polipéptido FGF-23. El aislamiento de los receptores para el polipéptido FGF-23 es útil para identificar o desarrollar agonistas y antagonistas novedosos de la vía de señalización del polipéptido FGF-23. Tales agonistas y antagonistas incluyen receptores solubles del polipéptido FGF-23, anticuerpos contra el receptor del polipéptido FGF- 23, moléculas pequeñas u oligonucleótidos antisentido, y pueden ser utilizados para tratar, evitar o diagnosticar una o más de las enfermedades o desórdenes que se describen en la presente. Se realizó un depósito de ADNc que codifica para el polipéptido FGF-23 humano, subclonado en el vector pGEM-t y que tiene el número de acceso No. PTA- 1617, ante la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 el 31 de Marzo del 2000. Los siguientes ejemplos se diseñan únicamente con propósitos de ilustración y no se deben considerar como limitantes del alcance de la invención de manera alguna.
Ejemplo 1: Clonación del gen para el polipéptido FGF-23 humano Para aislar secuencias de ADNc que codifican para el polipéptido FGF-23 humano, se realizan investigaciones BLAST basadas en homología de una base de datos del genoma humano. Se identifica una secuencia codificante supuesta que comparte homología con la familia del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF, por sus siglas en inglés) en un clon i???-?Jiijaifk ? M** . ^. ..y**..... *^- -* •»*«. *. t&tálBítí . .i .?yk? JÉ de genoma humano (GenBank, Acceso No. AC008012) . La secuencia codificante supuesta consiste de tres exones potenciales separados por intrones de 6.6 kb y 1.87 kb. Se utiliza esta secuencia para diseñar oligonucleótidos específicos de gen para la identificación de fuentes de ADNc y la generación de clones de ADNc, utilizando diversas estrategias de PCR. Se analizan muchas bibliotecas de ADNc en reacciones de amplificación que contienen 10 pmol cada una de los amplímeros (cebadores de amplificación) (5'-C-T-A-T- C-C-C-A-A-T-G-C-C-T-C-C-C-C-A-C-T-G-3 ' ; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 42 y 5 ' -C-G-C-C-C-C-T-G-A-C-C-A-C-C-C-C- T-A-A-T-G-3 • ; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 43) y esferas PCR Ready-To-Go (Pharmacia, Piscataway, NJ) , en un volumen de reacción total de 250 µl . Las reacciones se llevan a cabo a 95°C durante 5 minutos durante un ciclo; 95°C durante 30 segundos, 68 °C durante 15 segundos y 72 °C durante 1 minuto por 35 ciclos; y 72 °C durante 7 minutos durante un ciclo. Se identifica un producto de PCR del tamaño esperado (616 pb) en muchas de las bibliotecas de ADNc, que incluyen bibliotecas derivadas del tumor T25 de colon (cebado aleatoriamente) , mesenterio fetal (cebador con oligo-dT) , vesícula biliar fetal (cebado aleatoriamente) y corazón fetal (cebado con oligo-dT) . El producto de PCR generado a partir de la biblioteca de ADNc de mesenterio fetal se subclona utilizando el equipo de clonación TopoTA 4.0 (Invitrogen) y se secuencian cuatro clones para verificar que los clones contienen la secuencia de ADNc para FGF-23 que se predice. Se selecciona la biblioteca de ADNc de mesenterio fetal para experimentos de amplificación adicionales para aislar secuencias de ADNc de longitud completa que codifiquen para el polipéptido FGF-23. Se prepara como sigue la biblioteca de ADNc de mesenterio fetal . Se extrae ARN total de mesenterio fetal humano utilizando procedimientos de extracción de ARN estándar o convencional y se selecciona AR? poli-A+ a partir de este AR? total utilizando procedimientos estándar. Se sintetizan AD?c cebados con oligo-dT a partir de ste AR? poli-A+ utilizando el Superscript Plasmid System para síntesis de AD?c y el equipo Plasmid Cloning (Gibco-BRL) de acuerdo con los procedimientos sugeridos por el fabricante. El AD?c resultante se digiere con las endonucleasas de restricción Sal I y ?ot I, y después se liga en pSPORT-1. Los productos de ligación se transforman en E. coli utilizando técnicas estándar y los transformantes bacterianos se seleccionan en placas de cultivo que contienen ampicilina. La biblioteca de AD?c consiste de la totalidad o de un subgrupo de estos transformantes. Se realizan las reacciones 5 ' RACE y 3 ' RACE con el fin de generar una frecuencia de AD?c de longitud completa para el polipéptido FGF-23. Para aislar secuencias de ADNc que corresponden al extremo 5 ' de la secuencia de ADNc para el polipéptido FGF-23, se realiza 5' RACE utilizando el equipo de amplificación de ADNc Smart RACE (Clontech) , la biblioteca de ADNc de mesenterio fetal humano cebado aleatoriamente en pSPORTl, y los cebadores 5 ' -G-T-G-T-G-G-A- A-T-T-G-T-G-A-G-C-G-G-A-T-A-A-C-3' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 44) y 5 ' -C-T-G-A-T-G-G-G-G-T-G-C-G-C-C-A- T-C-C-A-C-A-3 ' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 45). Las reacciones se llevan a cabo a 94 °C durante 1 minuto por un ciclo; 94 °C durante 5 segundos, 68 °C durante 10 segundos y 72 °C durante 3 minutos por 35 ciclos; y 72 °C durante 7 minutos por un ciclo. El PCR alojado se realiza utilizando una porción del producto de amplificación 5 ' RACE (diluido 1/100) y los cebadores 5 ' -C-T-A-T-G-A-C-C-A-T-G-A-T-T-A-C-G- C-C-A-A-G-C-3 ' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 46) y 5 ' -C- A-T-T-C-T-T-G-T-G-G-A-T-C-T-G-C-A-G-G-T-G-G-T-3 ' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 47) . Las reacciones de PCR alojado se realizan a 94°C durante 5 minutos por un ciclo; 94°C durante 15 segundos, 68°C durante 15 segundos y 72 °C por 3 minutos, por 30 ciclos; y 72 °C durante 7 minutos por un ciclo. Los productos de amplificación se analizan por electroforesis en gel de agarosa y se aisla un producto de PCR prominente de 200 pb y se subclona utilizando el equipo de clonación TopoTA 4.0. El análisis de secuenciado de los clones - aislados indica que el producto 5 ' PCR no extendió la secuencia conocida. Se realizan experimentos adicionales 5 'RACE para aislar las secuencias de ADNc adicionales que corresponden 5 al extremo 5' de la secuencia ADNc para el polipéptido FGF- 23. Se realizan experimentos 5 'RACE adicionales utilizando el equipo Advantage-2 PCR (Clontech) , una biblioteca de ADNc de corazón humano MarathonMR (Clontech), y los cebadores 5'- C-T-G-A-T-G-G-G-G-T-G-C-G-C-C-A-T-C-C-A-C-A-3 ' (SECUENCIA DE 10 IDENTIFICACIÓN NO: 45) y API (Clontech) . Se realizan reacciones a 94 °C durante 30 segundos por un ciclo y 94 °C durante 5 segundos y 68 °C durante 4 minutos por 30 ciclos. Se realiza PCR alojado utilizando una porción del producto de amplificación 5 ' RACE (diluido 1/100), y los cebadores 5'- 15 C-A-T-T-C-T-T-G-T-G-G-A-T-C-T-G-C-A-G-G-T-G-G-T-3 ' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 47) y AP2 (Clontech) . Las reacciones de PCR alojadas se realizan a 94 °C durante 30 segundos por un ciclo y a 94°C durante 30 segundos, 68°C durante 4 minutos por 30 ciclos. Los productos de 20 amplificación se analizan por electroforesis en gel de agarosa y se aisla su producto de PCR más prominente (350 pb) y se subclona utilizando el equipo de clonación TopoTA 4.0. Los análisis de secuenciado de los clones aislados indican que el producto 5 ' PCR se extiende en la secuencia 25 conocida por aproximadamente 143 pb. -feí^H^^feÍ^lttMffitfMti rAiif ' ?ifr ^^ fr^'**8"^ ^ ^'^^i?i^£M^^'^^^^fej^^tea?*^ ** ™' - -* •*-**«i*iag^tf»*»*i^^ - Para aislar secuencias de ADNc que corresponde al extremo 3 ' de la secuencia de ADNc para el polipéptido FGF-23, se realiza 3 'RACE utilizando el equipo de amplificación de ADNc Smart RACE (Clontech) , la biblioteca de ADNc de mesenterio fetal humano cebado aleatoriamente en pSPORTl, y los cebadores 5 ' -C-G-G-C-C-T-C-C-T-G-T-T-C-A-C-A-G-G-A-G-C-T-C-3' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 48) y 5 ' -C-G-G-G-C-C-T-C-T-T-C-G-C-T-A-T-T-A-C-G-C-3 ' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 49) . Las reacciones se llevan a cabo a 94 °C durante 1 minuto por un ciclo; 94 °C durante 5 segundos, 68 °C durante 10 segundos y 72 °C durante 3 minutos por 35 ciclos; y 72 °C durante 7 minutos por un ciclo. El PCR alojado se realiza utilizando una porción del producto de amplificación 5 'RACE (diluido 1/100) y los cebadores 5 ' -G-C-G-C-C-G-A-G-G-A-C-A-A-C-A-G-C-C-C-G-A-3 ' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 50) y 5 ' -T-G-G-C-G-A-A-A-G-G-G-G-G-A-T-G-T-G-C-T-G-3' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 51). Las reacciones de PCR alojadas se realizan a 94 °C durante 5 minutos por un ciclo; 94°C durante 15 segundos, 68°C por 15 segundos y 72°C por 3 minutos durante 30 ciclos; y 72°C durante 7 minutos por un ciclo. Los productos de amplificación se analizan por electroforesis en gel de agarosa y un producto de PCR prominente de 650 pb se aisla y se subclona utilizando el equipo de clonación TopoTA 4.0. El análisis de secuenciado de los clones aislados indicado en tu. i ^^^^^* ^^^^^^^^£^^^ ^^ ^^l:^^^-- í^-ii*a^-^*^fca-g ^ eeeeefafi»j^& -AceeJJC.J fe — - el producto 3 ' PCR se extiende a la secuencia conocida por 433 pb, incluyendo la región poli-A. Se genera una secuencia contigua que parece contener el marco de lectura abierto de longitud completa para el gen FGF-23 utilizando la secuencia derivada de la amplificación por PCR inicial y las amplificaciones 5' y 3 'RACE. El análisis de secuencia de esta secuencia de consenso indica que el gen para FGF-23 comprende un marco de lectura abierta de 753 pb que codifica para una proteína de 251 aminoácidos (figura 1A-1B) . El análisis de secuencia también muestra que el polipéptido FGF-23 comparte homología con la familia del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) . Las figuras 2A-2G ilustran la alineación de secuencia de aminoácidos de FGF-1 humano (FGF-1 hu; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 4) ; FGF-2 humano (FGF-2 hu; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5), FGF-3 humano (FGF-3 hu; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 6), FGF-4 humano (FGF-4 hu; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 7) ; FGF-5 humano (FGF-5 hu; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 8), FGF-6 humano (FGF-6 hu; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 9), FGF-7 humano (FGF-7 hu; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 10), FGF-8 humano (FGF-8 hu; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 11), FGF-9 humano (FGF-9 hu; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 12), FGF-10 humano (FGF-10 hu; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 13), FGF-11 humano (FGF-11 hu; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN Ji i^fcft?AJfi_i4ftfrrtiif'fralrttf^*-^^ NO: 14), FGF-12 humano (hu FGF-12; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 15), FGF-13 humano (FGF-13 hu; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 16), FGF-14 humano (FGF-14 hu; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 17) , FGF-16 humano (FGF-16 hu; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 18), FGF-17 humano (FGF- 17 hu; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 19), FGF-18 humano (FGF-18 hu; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 20), FGF-19 humano (FGF-19 hu; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 21), FGF- 23 humano (FGF-23 hu; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 22), FGF-1 murino (FGF-1 mu SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 23), FGF-2 murino (FGF-2 mu SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 24), FGF-3 murino (FGF-3 mu SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 25), FGF-4 murino (FGF-4 mu SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 26), FGF-5 murino (FGF-5 mu SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 27), FGF-6 murino (FGF-6 mu SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 28), FGF-7 murino (FGF-7 mu SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 29), FGF-8 murino (FGF-8 mu SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 30), FGF-9 murino (FGF-9 mu SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 31), FGF-10 murino (FGF-10 mu; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 32), FGF-11 murino (FGF-11 mu; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 33), FGF-12 murino (FGF-12 mu; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 34), FGF-13 murino (FGF-13 mu; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 35), FGF-14 murino (FGF-14 mu; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 36), FGF-15 murino (FGF-15 mu; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 37) , FGF-16 de rata (FGF-16 de rata; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 38), FGF-17 murino (FGF-17 mu; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 39) . Para el análisis de secuencia de aminoácidos que se muestra en las figuras 2A-2G, el gen para FGF-23 parece estar relacionado estrechamente con FGF-15 murino y con FGF-19 humano. El patrón restringido regionalmente de FGF-15 en el sistema nervioso en desarrollo sugiere que FGF-15 puede jugar un papel importante en regular la división celular y la formación de patrones dentro de regiones específicas del cerebro embriónico, la médula espinal y órganos sensoriales (McWhirter et al . , 1997, Development 124:3221-32). En consecuencia, las moléculas de ácido nucleico para FGF-23, los polipéptidos y agonistas y antagonistas de los mismos pueden ser útiles para el diagnóstico o tratamiento de enfermedades que involucran al sistema nervioso en desarrollo. FGF-19 humano, el cual se expresa en cartílago fetal, piel y retina, vesícula biliar y de adulto y una línea de células de adenocarcinoma de colon, mapea a una región del cromosoma 11 que se asocia con un síndrome de osteoporosis-pseudoglioma de defectos esqueléticos y de retina (Xie et al . , 1999, Cytokine 11:729-35). En consecuencia, las moléculas de ácido nucleico FGF-23, los polipéptidos y agonistas y antagonistas de los mismos pueden ser útiles para el diagnóstico o tratamiento de enfermedades que involucran el sistema esquelético o la retina. »ti<á&<É.át¿t*¿¡?l^^.AMto¡l?¡»M^?.»»^,?fa^ -'--ti i "1**aa Se ha demostrado que el gen para FGF-23 está relacionado más estrechamente con FGF-21 humano (Yamashita et al . , 2000, Biochem. Biophys Res . Commun . 277 :494-98) , un gen el cual se expresa de manera más abundante en el hígado y a niveles inferiores en el timo (Nishimura et al . , 2000, Biochim. Biophys Acta 1492:203-06). En consecuencia, las moléculas de ácido nucleico para FGF-23, los polipéptidos y agonistas y antagonistas de los mismos pueden ser útiles para el diagnóstico o tratamiento de enfermedades que involucran el hígado o timo.
Expresión de ARNm para FGF-23 Se analiza la expresión de FGF-23 por RT-PCR. Se prepara un ARN total a partir de varios tejidos fetales humanos utilizando técnicas estándar. Se preparan mezclas de plantilla y cebador utilizando 2 µg de ARN total y 50 ng de cebador aleatorio (Gibco-BRL) en un volumen de 12 µl . Las mezclas se calientan a 70 °C durante 10 minutos y después se enfrían en hielo. Se realiza transcripción inversa al agregar 4 µl de amortiguador de la primera cadena 5X (Gibco-BRL) , 2 µl de DTT 0.1 M y 1 µl de dNTP 10 mM a la mezcla de plantilla-cebador, se calienta la mezcla de reacción a 37°C durante 2 minutos, se agrega 1 µl de Superscript II RT (Gibco-BRL) y después se incuba la mezcla de reacción a 37°C durante 1 hora . Las diferencias en la concentración en ARN y la eficiencia de conversión de ADNc se normalizan al realizar amplificaciones de PCR control sobre cada muestra de ADNc utilizando cebadores específicos para gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (G3PDH) , un gen que se espera se exprese aproximadamente al mismo nivel en todos los tejidos que se van a examinar. Se realizan amplificaciones de PCR control utilizando los amplímeros 5 ' -T-C-C-A-C-C-A-C-C-C-T-G-T-T-G-C-T-G-T-A-G-3 ' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 52) y 5 ' -G-A-C-C-A-CA-G-T-C-C-A-T-G-C-C-A-T-C-A-C-T-3 ' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 53) y esferas de PCR Ready- To-Go (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) . Las reacciones se llevan a cabo a 95 °C durante 1 minuto por un ciclo; 92 °C durante 30 segundos, 55°C durante 45 segundos y 72 °C durante 1 minuto por 25 ciclos; y 72 °C durante 5 minutos por un ciclo. Los productos de reacción de control se analizan sobre geles de agarosa 2%, se determinan las intensidades relativas de los productos de control y se ajusta la concentración de las muestras de ADNc de manera que las muestras de ADNc generen bandas de G3PDH de intensidad igual. El análisis de expresión de FGF-23 se lleva a cabo utilizando muestras de ADNc normalizadas en cuanto a concentración. Se analiza la expresión de FGF-23 en tá^.^..* act¿*^*^lc-«^l tfci ,.¿j Jat.j.i..j nj-ra ai'jt' ; amplificaciones de PCR que contienen los amplímeros 5 ' -C-T- A-T-C-C-CA-A-T-G-C-C-T-C-C-C-C-A-C-T-G-3 ' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 54) y 5 ' -C-G-C-C-C-C-T-G-A-C-C-A-C-C-C-C- T-A-A-T-G-3' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 55) y esferas 5 PCR Ready-To-Go. Las reacciones se llevan a cabo a 95 °C durante 5 minutos por un ciclo; 95 °C durante 30 segundos, 68 °C durante 30 segundos y 72 °C durante 1 minuto por 30 ciclos; y 72 °C durante 7 minutos por un ciclo. Los productos de PCR se analizan en geles de agarosa 2% y se determinan 10 las intensidades relativas de los productos de PCR (utilizando el producto de PCR más puro como un punto de comparación) . Los resultados de este análisis se muestran en la Tabla III. 15 Tabla III Expresión relativa de FGF-23 20 25 i ni ii ' ífWiiMiÉiliiiÉÉiiiií ii t j ?i^íi?f-^k¡^?,i^''*'-'--''--v^^-- --- * --*»-«**• **^" - •***• <*• * ¿** * -* - Tejido Nivel de expresión relativo Médula espinal +++ Vejiga +++ Suprarrenal + Hueso +/- Placenta ++ Intestino ++++ Mesenterio ++ Pulmón ++ Timo +/- Páncreas + Sangre del cordón umbilical +++ Útero +/- Corazón ++ Testículos +++ Ojo - Se analiza la expresión de ARNm para FGF-23 en transferencias Northern. Se someten a sondeo múltiple tejidos humanos por transferencia Northern (Clontech) con un fragmento de restricción adecuado aislado de un clon de ADNc para el polipéptido FGF-23 humano. La sonda se marca con 32P-dCTP utilizando técnicas estándar. Las transferencias Northern se prehibridizan durante 2 horas a 42 °C en solución de hibridación (SSC 5X, formamida desionizada 50%, 5X de solución de Denhardt, SDS 0.5% y 100 mg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado), y después se hibridiza a 42 °C durante la noche en solución de hibridación fresca que contiene 5 ng/ml de la sonda marcada. Después de la hibridación, los filtros se lavan dos veces durante 10 min a temperatura ambiente en SSC 2X y SDS 0.1% y después dos veces durante 30 minutos a 65 °C en SSC 0. IX y SDS 0.1%. Las manchas después se exponen a autorradiografía. La expresión de ARNm para FGF-23 en tejido de ratón adulto normal y en tejido de ratón transgénico de tres semanas de edad con alto nivel de expresión y sin expresión (véase Ejemplo 5) se localiza por hibridación in situ. Los tejidos de ratones embriónicos normales y adultos se fijan por inmersión, se embeben por parafina y se cortan a 5 µm. Se realiza hibridación in si tu utilizando técnicas estándar. Los tejidos cortados se hibridizan durante la noche a 60 °C en solución de hibridación que contiene una ribosonda antisentido marcada con 33P complementaria al gen FGF-23 humano. La ribosonda se obtiene mediante transcripción in vi tro de un clon que contiene secuencias de ADNc para FGF-23 humano utilizando técnicas estándar. Después de la hibridación, los cortes se tratan con ARNasaA para digerir la sonda no hibridizada y se lavan en SSC 0. IX a 55 °C durante 30 minutos. Los cortes después se sumergen en emulsión NTB-2 (Kodak, Rochester, NY) , se exponen durante 3 semanas a 4°C, se revelan y se someten a tinción contrastante con hematoxilina y eosina. La morfología del tejido y la señal de hibridación se analizan Ici éeáto. simultáneamente mediante iluminación en campo oscuro y convencional para las muestras de cerebro, sistema gastrointestinal (parótida, glándula submandibular y sublingual; esófago, estómago; duodeno, yeyuno, ileón; colon 5 proximal y distal; hígado y páncreas), sistema cardiopulmonar (corazón, pulmón, tráquea y vasos sanguíneos) ; sistema hematolinfoide (nodulos linfáticos, bazo, timo y médula ósea) , sistema urinario (riñon y vejiga), sistema endocrino (glándula suprarrenal, glándula 10 tiroides e hipófisis) , sistema reproductor (testículo, próstata y gónada; ovario, útero y oviducto; placenta) ; y sistema de músculo esquelético (hueso, músculo esquelético, piel y tejido adiposo) . Los embriones de ratones normales en E18 y E14.5 con placenta también se analizaron por 15 hibridación in si tu . Se detecta en los tejidos de ratones adultos normales una expresión baja a moderada y difusa de FGF-23. Se lleva a cabo un ensayo de protección de ARNasa en una muestra limitada de tejidos de ratón en las cuales se 20 detecta una señal difusa mediante hibridación in si tu, para determinar si esta señal se debe a unión inespecífica. Los resultados del ensayo de protección de ARNasa indican que FGF-23 se expresa solo débilmente en corazón y cerebro y no se detecta en hígado, tiroide/paratiroide y estómago. Estos 25 resultados sugieren que la señal difusa detectada mediante hibridación in si tu se debe muy probablemente a la unión no específica, especialmente en tipos de células epiteliales. Dado que el ensayo de protección de ARNasa indica que FGF-23 se expresa débilmente en corazón y cerebro, la señal baja 5 que se observa en estos tejidos por hibridación in si tu puede ser real. En cerebro, generalmente se observa una expresión baja, en la mayor parte de las neuronas que incluyen áreas del tálamo, putamen caudado, septo e hipótalamo. Sin embargo, se observa marcado moderado en el 10 hipocampo granular y células piramidales, la neocorteza (figura 3) y la corteza piriforme. Se encuentra una expresión baja en el epéndima y el plexo coroide. Tanto el músculo cardíaco como el esquelético también muestran bajos niveles de expresión de FGF-23. En músculo cardíaco, es 15 evidente una señal difusa baja en los ventrículos izquierdo y derecho con una señal un poco mayor en la aurícula (figura 3) . También se encuentra una señal difusa baja en músculo esquelético . No se encuentra expresión ya sea en embriones de 20 ratón E14.5 o E18. Ninguno de los ratones transgénicos de 3 semanas de edad compañeros de carnada mostraron señal no específica difusa que fuera detectable en ratones adultos normales. En ratones transgénicos que no expresan, se detecta una expresión fuerte de FGF-23 en células 25 dispersadas en los nodulos linfáticos (figura 4) , médula tímica (figura 4) y hueso (figura 4) . Aunque no es posible la identificación positiva de las células marcadas, la expresión en hueso parece estar en células del mesénquima difundidas en la parte de laguna y trabécula en los huesos de las extremidades posteriores, las vértebras, las costillas y las cavidades nasales. En ratones transgénicos con alto nivel de expresión, la distribución de las células marcadas se encuentra más difundida. En el ligando, se observa una fuerte expresión de FGF-23 en los hepatocitos (figura 5) . También se detecta un marcado fuerte en células dispersadas de la médula tímica (figura 5) , al igual que se observa en ratones transgénicos que no expresan. Sin embargo, en ratones transgénicos con alto nivel de expresión, las células marcadas en pozo también se encuentran en la pulpa roja del bazo (figura 5) , el músculo liso adyacente a la glándula próstata (figura 6) y el músculo estriado de la mandíbula (figura 6) . También se detecta una expresión fuerte en algunos metacariocitos identificados en médula ósea y en muchos condrocitos y en las articulas traseras y en las vértebras (figura 6) .
Ejemplo 3: Producción de polipéptidos FGF-23 A. Expresión de polipéptidos FGF-23 en bacterias rf.t^ i ii Se utiliza PCR para amplificar secuencias de ADN plantilla que codifican para un polipéptido FGF-23 utilizando cebadores que corresponden a los extremos 5' y 3' de la secuencia. Los productos amplificados de ADN se pueden 5 modificar para que contengan sitios de enzima de restricción que permitan la inserción en vectores de expresión. Los productos de PCR se purifican en gel y se insertan dentro de vectores de expresión utilizando metodología de ADN recombinante estándar. Un vector ejemplar, tal como pAMG21 10 (ATCC No. 98113) que contiene el promotor lux y un gen que codifica para resistencia a canamicina se digiere con Bam Hl y Nde I para clonación direccional del ADN insertado. La mezcla ligada se transforma en una célula huésped de E. coli por electroporación y los transformantes se seleccionan por 15 resistencia a canamicina. El ADN plasmídico de las colonias seleccionadas se aisla y se somete a secuenciado de ADN para confirmar la presencia del inserto. Las células huéspedes transformadas se incuban en medio 2xYT que contiene 30 µg/ml de canamicina a 30°C, antes 20 de su inducción. Se induce la expresión del gen por adición de N- (3 -oxohexanoil) -di -homoserina lactona hasta una concentración final de 30 ng/ml seguido por incubación ya sea a 30°C o 37°C durante seis horas. Se evalúa la expresión del polipéptido FGF-23 por centrifugación del cultivo, la 25 resuspensión y lisis de los sedimentos bacterianos y el jMJfcj aaa Í- -•tf ^-.i ^é,A Ía Áá?,^^?? análisis de las proteínas de la célula huésped por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. Los cuerpos de inclusión que contienen el polipéptido FGF-23 se purifican como sigue. Se sedimentan células bacterianas por centrifugación y se resuspenden en agua. La suspensión celular se lisa por sonicación y se centrifuga a 195,000 xg durante 5 a 10 minutos. Se desecha el sobrenadante y el sedimento se lava y se transfiere a un homogeneizador. El sedimento se homogeneiza en 5 ml de una solución Percoll (75% de líquido Percoll y NaCl 0.15 M) hasta que se suspende uniformemente y después se diluye y se centrifuga a 21,600 xg durante 30 minutos. Se recuperan y acumulan las fracciones de gradiente que contienen los cuerpos de inclusión. Los cuerpos de inclusión aislados se analizan por SDS-PAGE. Se corta del gel una sola banda sobre un gel de SDS-poliacrilamida que corresponde al polipéptido FGF-23 producido en E. coli , y se determina la secuencia de aminoácidos N terminal esencialmente como se describe por Matsudaira et al . , 1987, J. Biol . Chem. 262:10-35.
B. Expresión del polipéptido FGF-23 en células de mamífero Se utiliza PCR para amplificar secuencias de ADN plantilla que codifican para un polipéptido FGF-23 utilizando cebadores que corresponden a los extremos 5' y 3' de la secuencia. Los productos de ADN amplificados se pueden modificar para contener sitios de enzima de restricción que permitan la inserción en vectores de expresión. Los productos de PCR se purifican en gel y se insertan en vectores de expresión utilizando metodología de ADN recombinante estándar. Se puede utilizar un vector de expresión ejemplar, pCEP4 (Invitrogen, Carisbad, CA) , que contiene un origen de replicación del virus de Epstein-Barr como para la expresión de los polipéptidos FGF-23 en células 293-EBNA-l. Los productos de PCR amplificados y purificados en gel se ligan en el vector pCEP4 y se introducen en células 293-EBNA por lipofección. Las células transfectadas se seleccionan en 100 µg/ml de higromicina y se hacen crecer hasta confluencia los cultivos resultantes resistentes a medicamentos. Las células después se cultivan en medio libre de suero durante 72 horas. Se retira el medio acondicionado y se analiza la expresión del polipéptido FGF-23 por SDS- PAGE. Se puede detectar la expresión del polipéptido FGF-23 mediante tinción con plata. Alternativamente, se produce un polipéptido FGF-23 como una proteína de fusión con una etiqueta de epitopo tal como un dominio constante de IgG o un epitopo FLAG, el cual se puede detectar por análisis de transferencia Western utilizando anticuerpos para la etiqueta peptídica. Se pueden cortar los polipéptidos FGF-23 de un gel de SDS-poliacrilamida, o las proteínas de fusión de FGF-23 se purifican por cromatografía de afinidad a la etiqueta del epitopo y se someten a análisis de secuencia de aminoácidos N terminal como se describe en la presente.
C. Purificación del polipéptido FGF-23 de células de mamífero Se introducen montajes (plásmidos recombinantes) de expresión del polipéptido FGF-23 dentro de células 293 EBNA o CHO ya sea por lipofección o por protocolo de fosfato de calcio. Para llevar a cabo los estudios funcionales sobre los polipéptidos FGF-23 que se producen, se generan grandes cantidades de medio acondicionado a partir de un acumulado de clones de 293 EBNA seleccionados por higromicina. Las células se cultivan en matraces Nunc triple de 500 cm, hasta 80% de confluencia antes de cambiar a medio libre de suero una semana antes de cosechar el medio. El medio acondicionado se cosecha y congela a -20 °C hasta que la proteína va a ser purificada. El medio acondicionado se purifica por cromatografía de afinidad como se describe en lo siguiente.
El medio se recalienta y después se hace pasar a través de un filtro de 0.2 µm. Se equilibra con PBS a pH 7.0 una columna de proteína G, y después se carga con el medio filtrado. La columna se lava con PBS hasta que la absorbancia a A280 alcanza un valor inicial . Se eluye el polipéptido FGF-23 de la columna con clorhidrato de glicina 0.1 M a pH 2.7 y se neutraliza de inmediato con Tris-HCl 1 M a pH 8.5. Las fracciones que contienen el polipéptido FGF-23 se acumulan, se dializan en PBS y se almacenan a -70 °C. La separación del factor Xa del polipéptido de fusión del polipéptido FGF-23 humano-Fe, la proteína purificada por cromatografía de afinidad se dializa en Tris-HCl 50 mM, NaCl 100 mM, CaCl2 2 mM a pH 8.0. El factor Xa de proteasa de restricción se agrega a la proteína dializada a 1/100 (p/p) y la muestra se digiere durante la noche a temperatura ambiente.
Ejemplo 4: Producción de anticuerpos contra el polipéptido FGF-23 Se pueden obtener anticuerpos contra los polipéptidos FGF-23 por inmunización con proteína purificada o con péptidos FGF-23 producidos por síntesis biológica o química. Los procedimientos adecuados para generar anticuerpos incluyen los que se describen en Hudson y Bay, - Practical Immunology (2a. ed. , Blackwell Scientific Publications) . En un procedimiento para la elaboración de anticuerpos, se inyecta a animales (típicamente ratones o conejos) con un antígeno FGF-23 (tal como un polipéptido FGF-23) , y aquéllos con niveles de título sérico suficientes, determinados por ELISA, se seleccionan para producción de hibridoma. Se recolectan y preparan los bazos de los animales inmunizados como suspensiones celulares únicas a partir de las cuales se recuperan los esplenocitos. Los esplenocitos se fusionan a células de mieloma de ratón (tales como células Sp2/0-Agl4) , y se incuban primero en DMEM con 200 U/ml de penicilina, 200 µg/ml de sulfato de estreptomicina y glutamina 4 mM, y después se incuban en un medio de selección HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) . Después de la selección, los sobrenadantes de cultivo de tejido se captan a partir de cada pozo de fusión y se prueban para determinar la producción de anticuerpo contra FGF-23 mediante ELISA. También se pueden utilizar procedimientos alternativos para obtener anticuerpos contra FGF-23 tales como la inmunización de ratones transgénicos que albergan loci Ig humanos para producción de anticuerpos humanos, y el cribado de bibliotecas de anticuerpos sintéticos, tales como las generadas por mutagénesis de un dominio variable de anticuerpo.
Ejemplo 5: Expresión del polipéptido FGF-23 en ratones transgénicos Para determinar la actividad biológica del polipéptido FGF-23, se prepara un montaje (plásmido recombinante) que codifica para el polipéptido FGF-23 bajo el control del promotor ApoE (TH00-026) . Se espera que la expresión del gen para FGF-23 provoque cambios patológicos en el ratón transgénico que puedan ser indicativos de la función del polipéptido FGF-23. Se produce un fenotipo distintivo en ratones BDF1 de 3 semanas de edad después de la transferencia del montaje THO0-026 en donde sus compañeros de camada presentan números inusualmente elevados de animales más pequeños que los de su especie. Aunque no la totalidad de los ratones expresores son más pequeños y algunos de sus compañeros de camada que no expresan el gen son de tamaño más pequeño, la proporción de animales de tamaño más pequeño es mayor entre los ratones que expresan el gen. La totalidad de los animales más pequeños incluyen muchos animales pequeños que no expresan el gen, se toman antes de la destetada para examen. Los cráneos de todos los ratones que expresan el gen se acortan y son más redondeados y la mandíbula inferior se desarrolla apropiadamente. Como un resultado, todos los ratones que expresan el gen tienen dientes inferiores sobresalientes. Esta condición es evidente en un examen externo y una evaluación radiográfica. Además, se ha encontrado que los dos ratones con mayor expresión presentan concentraciones bajas de fósforo sérico y de calcio sérico. Sin embargo, no se observan otros signos de raquitismo - tal como mineralización inadecuada, sobre crecimiento de los cartílagos de la epífisis, organización desorganizada de los cartílagos y sobrecrecimiento de los capilares {Pathologic Basis of Disease (Cotran ed. , 1994)) -. La morfología ósea en los animales más pequeños que expresan el gen no es diferente a la de los animales más pequeños que no la expresan y ambos tipos de animales pequeños difieren de sus compañeros de camada que no son animales más pequeños. Se realizó hepatectomía parcial en 22 ratones ADN positivos y 4 ratones ADN negativos. Todos los ratones sometidos a hepatectomía se sometieron a extracción de sangre y se realizaron determinaciones séricas de calcio, fósforo y de fosfatasa alcalina. También se realizaron exámenes en los animales para determinar el fenotipo de diente inferior sobresaliente. Los grupos de ratones que fueron evaluados incluyen: controles o testigos, animales que expresan el fenotipo macroscópicamente, animales con alto nivel de expresión no fenotípicos y animales que expresan el gen de manera moderada. Todos los ratones fenotípicos se encuentra que son animales que expresan el gen de manera fuerte o muy fuerte. Los niveles de calcio sérico están disminuidos en cierta medida en los ratones fenotípicos en comparación con los otros grupos, pero esta diferencia no es estadísticamente significativa. Sin embargo, se encontró que las concentraciones de fósforo sérico están disminuidas de manera significativa en los animales que expresan el gen fenotípico y en los animales con alta expresión del gen no fenotípicos en comparación con los animales que expresan el gen de manera moderada y los controles. La fosfatasa alcalina sérica (ALP, por sus siglas en inglés) se encuentra elevada de manera significativa en los grupos fenotípicos versus los controles y los animales que presentan expresión moderada (véase la Tabla IV) . La variabilidad en el fenotipo de los animales que expresan el gen se puede deber a la variación genética en los ratones BDF1, una línea exogámica que es una cruza entre cepas de ratones C57/B6 y DBA.
Tabla IV Calcio, fósforo y ALP séricos en ratones transgénicos THOO-026 10 Aunque la presente invención se ha descrito en términos de las modalidades preferidas, se entiende que se le ocurrirán a los expertos en la técnica variaciones y modificaciones a la misma. Por lo tanto, se pretende que las reivindicaciones abarquen la totalidad de tales variaciones 15 equivalentes que se encuentren dentro del alcance de la invención como se reclama. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por el solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la 20 presente descripción de la invención.
LISTA DE SECUENCIAS <110> Luethy, Roland Yang , Robert Suggs , Sidney V . Saroei , Ildi o <120> Moléculas de factor 23 de crecimiento de fibroblastos y su uso <130> 01 - 004 <U40> 60/ 182 , 442 < 141> 2000 -02 - 15 «=160:» 54 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 753 <212> DNA <213> Homo sapiens «220> <221> CDS <222> (1)..(753) <220> <221> sig peptide <222> (1) . - (72) <400> 1 atg ttg ggg gcc cgc etc agg etc tgg gtc tgt gcc ttg tgc age gtc 48 Met Leu Gly Ala Arg Leu Arg Leu Trp Val Cyß Ala Leu Cys Ser Val 1 5 10 15 tgc age atg age gtc etc aga gcc tat ecc aat gcc tec cca ctg etc 96 Cys Ser Met Ser Val Leu Arg Ala Tyr Pro Asn Ala Ser Pro Leu Leu 20 25 30 ggc tec age tgg ggt ggc ctg ate cae ctg tac acá gcc ac gcc agg 144 Gly Ser Ser Trp Gly Gly Leu lie Ris Leu Tyr Thr Ala Thr Ala Arg 35 40 45 aac age tac cae ctg cag ate cae aag aat ggc cat gtg gat ggc gca 192 Asn Ser Tyr His Leu Gln He His Lys Asn Gly Mis Val Asp Gly Ala 50 55 60 ecc cat cag acc ate tac agt gcc ctg atg ate aga tea gag gat gct 240 Pro His G n Thr He Tyr Ser Ala Leu Met He Arg Ser Glu Aßp Ala 65 70 75 80 ggc ttt gtg gtg att ac ggt gtg atg age aga aga tac etc tgc atg 288 Gly Phe val Val He Thr Gly Val Met Ser Arg Arg Tyr Leu Cys Met 85 90 95 gat ttc aga ggc aac att ttt gga tea cae tat ttc gac ccg gag aac 336 Asp Phe Arg Gly Aen He Phe Gly Ser His Tyr Phe Asp Pro Glu Asn 100 105 110 tgc agg ttc caá cae cag acg ctg gaa aac ggg tac gac gtc tac cae 384 ri llÜÍÍfláT?lilll1MÍ~T i 1 - ' '-* *fft— " ' » ". ---> - ^^¡a. ... . .. . . .....?.?. i..
Cys Arg Phe Gln His Gln Thr Leu Glu Asn Gly Tyr Asp Val Tyr His 115 120 125 tet ect cag tat cae ttc ctg gtc agt ctg ggc cgg gcg aag aga gcc 432 Ser Pro Gln Tyr His Phe Leu Val Ser Leu Gly Arg Ala Lye Arg Ala 130 135 140 ttc ctg cca ggc atg aac cca CCC ccg tac tec cag ttc ctg tec cgg 4T0 Phe Leu Pro Gly Met Asn Pro Pro Pro Tyr Ser Gln Phe Leu Ser Arg 145 150 155 160 agg aac gag ate CCC cta att cae ttc aac acc CCC ata cca cgg cgg 528 Arg Asn Glu He Pro Leu He His Phe Asn Thr Pro He Pro Arg Arg 165 170 175 cae acc cgg age gcc gag gac gac teg gag cgg gac ecc ctg aac gtg 576 Hiß Thr Arg Ser Ala Glu Asp Asp Ser Glu Arg Asp Pro Leu Asn Val 180 185 190 ctg aag CCC cgg gcc cgg atg acc ccg gcc ccg gec tec tgt tea cag 624 Leu Lys Pro Arg Ala Arg Met Thr Pro Ala Pro Ala Ser Cye Ser Gln 195 200 205 gag etc ccg age gcc gag gac aac age ccg atg gcc agt gac cca tta 672 Glu Leu Pro Ser Ala Glu Asp Asn Ser Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu 210 215 220 ggg gtg gtc a99 ggc ggt cga gtg aac acg cae gct 999 gga acg ggc 720 Gly Val Val Arg Gly Gly Arg Val Asn Thr His Ala Gly Gly Thr Gly 225 230 235 240 ccg gaa ggc tgc cgc ecc ttc gcc aag ttc ate 753 Pro Glu Gly Cys Arg Pro Phe Ala Lys Phe He 245 250 <210> 2 <211> 251 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Leu Gly Ala Arg Leu Arg Leu Trp Val Cys Ala Leu Cys ser Val 1 5 10 15 Cys Ser Met Ser Val Leu Tyr Pro Asn Ala ser Pro Leu Leu 20 25 30 Gly Ser Ser Trp Gly Gly Leu He His Leu Tyr Thr Ala Thr Ala Arg 35 40 45 Asn Ser Tyr His Leu Gln He His Lys Asn Gly His Val Asp Gly Ala 50 55 60 Pro His Gln Thr He Tyr Ser Ala Leu Met He Arg Ser Glu Asp Ala 65 70 75 80 Gly Phe Val Val He Thr Gly Val Met Ser Arg Arg Tyr Leu Cys Met 85 90 95 Asp Phe Arg Gly Asn He Phe Gly Ser His Tyr Phe Asp Pro Glu Asn j-t-n -¡ f? trli^^^**8*^ *J ?uA Í? ¡Lit *dt?tt¿ .Í.? . 100 105 110 Cye Arg Phe Gln His Gln Thr Leu Glu Asn Gly Tyr Asp Val Tyr His 115 120 125 Ser Pro Gln Tyr His Phe Leu Val Ser Leu Gly Arg Ala Lys Arg Ala 130 135 140 Phe Leu Pro Gly Met Asn Pro Pro Pro Tyr Ser Gln Phe Leu Ser Arg 145 150 155 160 Arg Asn Glu He Pro Leu He His Phe Asn Thr Pro He Pro Arg Arg 165 170 175 His Thr Arg Ser Ala Glu Asp Asp Ser Glu Arg Asp Pro Leu Aan Val 180 185 190 Leu Lys Pro Arg Ala Arg Met Thr Pro Ala Pro Ala Ser Cye Ser Gln 195 200 205 Glu Leu Pro Ser Ala Glu Asp Asn Ser Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu 210 215 220 Gly val Val Arg Gly Gly Arg Val Asn Thr His Ala Gly Gly Thr Gly 225 230 235 240 Pro Glu Gly Cys Arg Pro Phe Ala Lys Phe He 245 250 <210> 3 <211> 227 <212> PRT c213> Homo sapiens <400> 3 Tyr Pro Asn Ala Ser Pro Leu Leu Gly Ser Ser Trp Gly Gly Leu He 1 5 10 15 His Leu Tyr Thr Ala Thr Ala Arg Asn Ser Tyr His Leu Gln He His 20 25 30 Lys Asn Gly His Val Asp Gly Ala Pro His Gln Thr He Tyr Ser Ala 35 40 45 Leu Met He Arg Ser Glu Asp Ala Gly Phe Val Val He Thr Gly Val 50 55 60 Met Ser Arg Arg Tyr Leu Cys Met Asp Phe Arg Gly Asn He Phe Gly 65 70 75 80 Ser His Tyr Phe Asp Pro Glu Asn Cys Arg Phe Gln Hie Gln Thr Leu 85 90 95 Glu Aen Gly Tyr Asp Val Tyr His Ser Pro Gln Tyr His Phe Leu Val 100 105 110 Ser Leu Gly Arg Ala Lys Arg Ala Phe Leu Pro Gly Met Aßn Pro Pro 115 120 125 Pro Tyr Ser Gln Phe Leu Ser Arg Arg Asn Glu He Pro Leu He His tf^fc 130 135 140 Phe Asn Thr Pro He Pro Arg Arg His Thr Arg Ser Ala Glu Aep Asp 145 150 15S 160 Ser Glu Arg Asp Pro Leu Asn Val Leu Lys Prc Arg Ala Arg Met Thr 165 170 175 Pro Ala Pro Ala Ser Cye Ser Gln Glu Leu Pro Ser Ala Glu Asp Asn 1B0 185 190 Ser Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Gly Val Val Arg Gly Gly Arg Val 195 200 205 Asn Thr His Ala Gly Gly Thr Gly Pro Glu Gly Cys Arg Pro Phe Ala 210 215 220 Lys Phe He 225 <210> 4 <211> 155 c212> PRT c213> Homo sapiens <400> 4 Met Ala Glu Gly Glu He Thr Thr Phe Thr Ala Leu Thr Glu Lye Phe 1 5 10 15 Aen Leu Pro Pro Gly Asn Tyr Lye Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Cye Ser 20 25 30 Asn Gly Gly His Phe Leu Arg He Leu Pro Asp Gly Thr Val Asp Gly 35 40 45 Thr Arg Asp Arg Ser Asp Glp His He Gln Leu Gln Leu Ser Ala slu 50 55 60 Ser Val Gly Glu Val Tyr He Lys Ser Thr Glu Thr Gly Gln Tyr Leu 65 70 75 80 Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gln Thr Pro Asn Glu 85 90 95 Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr 100 105 110 He Ser Lys Lys His Ala Glu Lys Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys 115 120 125 Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr Gly Gln Lys Ala 130 135 140 He Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp 145 150 155 <210> 5 <211> 155 < 12> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Ala Ala Gly Ser He Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Aep Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu 20 25 30 Tyr Cye Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg He His Pro Asp Gly Arg 35 40 45 Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His He Lys Leu Gln Leu 50 55 60 Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser He Lys Gly Val Cye Ala Asn 65 70 75 80 Arg Tyr Leu Ala Met Lyß Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lye Cyß 85 90 95 Val Thr Aap Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Aen Asn Tyr 100 105 110 Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys 115 120 125 Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys 130 135 140 Ala He Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 145 150 155 <210> 6 <211> 239 <212> PRT c2l3> Ho o sapiens e400> 6 Met Gly Leu He Trp Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu Glu Pro Gly Trp 1 5 10 15 Pro Ala Ala Gly Pro Gly Ala Arg Leu Arg Arg Asp Ala Gly Gly Arg 20 25 30 Gly Gly Val Tyr Glu His Leu Gly Gly Ala Pro Arg Arg Arg Lys Leu 35 40 45 Tyr Cys Ala Thr Lys Tyr His Leu Gln Leu His Pro Ser Gly Arg Val 50 55 60 Asn Gly Ser Leu Glu Asn Ser Ala Tyr Ser He Leu Glu He Thr Ala 65 70 75 80 Val Glu Val Gly He Val Ala He Arg Gly Leu Phe Ser Gly Arg Tyr 85 90 95 Leu Ala Met Asn Lys Arg Gly Arg Leu Tyr Ala Ser Glu His Tyr ser 100 105 110 Ala Glu Cys Glu Phe Val Glu Arg He Hxs Glu Leu Gly Tyr Asn Thr 115 120 125 Tyr Ala Ser Arg Leu Tyr Arg Thr Val Ser Ser Tnr Pro Gly Ala Arg 130 ' 135 140 Arg Gln Pro Ser Ala Glu Arg Leu Trp Tyr Val Ser Val Asn Gly Lys 145 150 155 160 Gly Arg Pro Arg Arg Gly Phe Lys Thr Arg Arg Thr Gln Lys Ser Ser 165 170 175 Leu Phe Leu Pro Arg Val Leu Asp His Arg Asp His Glu Met Val Arg 180 185 190 Gln Leu Gln Ser Gly Leu Pro Arg Pro Pro Gly Lys Gly Val Gln Pro 195 200 205 Arg Arg Arg Arg Gln Lyß Gln Ser Pro Asp Asn Leu Glu Pro Ser His 210 215 220 Val Gln Ala Ser Arg Leu Gly Ser Gln Leu Glu Ala Ser Ala HIG 225 230 235 <210> 7 <211> 206 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Ser Gly Pro Gly Thr Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu 1 5 10 15 Leu Ala Leu Leu Ala Pro Trp Ala Gly Arg Gly Gly Ala Ala Ala Pro 20 25 30 Thr Ala Pro Aen Gly Thr Leu Glu Ala Glu Leu Glu Arg Arg Trp Glu 35 40 45 Ser Leu Val Ala Leu Ser Leu Ala Arg Leu Pro Val Ala Ala Gln Pro 50 55 60 Lys Glu Ala Ala Val Gln Ser Gly Ala Gly Asp Tyr Leu Leu Gly He 65 70 75 80 Lys Arg Leu Arg Arg Leu Tyr Cys Asn Val Gly He Gly Phe His Leu 85 90 95 Gln Ala Leu Pro Asp Gly Arg He Gly Gly Ala His Ala Asp Thr Arg 100 105 110 Asp Ser Leu Leu Glu Leu Ser Pro Val Glu Arg Gly Val Val Ser He 115 120 125 Phe Gly Val Ala Ser Arg Phe Phe Val Ala Met Ser Ser Lys Gly Lye 130 135 140 Leu Tyr Gly Ser Pro Phe Phe Thr Asp Glu Cye Thr Phe Lys Glu He 145 150 155 160 Leu Leu Pro Asn Asn Tyr Asn Ala Tyr Glu Ser Tyr Lys Tyr Pro Gly 165 170 175 Met Phe lie Ala Leu Ser Lys Asn Gly Lys Thr Lys Lys Gly Asn Arg 180 185 190 Val Ser Pro Thr Met Lys Val Thr His Phe Leu Pro Arg Leu 195 200 205 <210> 8 <211> 268 c212> PRT <213> Ho o sapiens <400> 8 Met Ser Leu Ser Phe Leu Leu Leu Leu Phe Phe Ser His Leu He Leu 1 5 10 15 Ser Ala Trp Ala His Gly Glu Lys Arg Leu Ala Pro Lys Gly Gln Pro 20 25 30 Gly Pro Ala Ala Thr Asp Arg Asn Pro He Gly Ser Ser Ser Arg Gln 35 40 45 Ser Ser Ser Ser Ala Met Ser Ser Ser Ser Ala Ser Ser Ser Pro Ala 50 55 60 Ala Ser Leu Gly Ser Gln Gly Ser Gly Leu Glu Gln Ser ser Phe Gln 65 70 75 80 Trp Ser Pro Ser Gly Arg Arg Thr Gly Ser Leu Tyr Cys Arg Val Gly 85 90 95 He Gly Phe Hiß Leu Gln He Tyr Pro Asp Gly Lys Val Asn Gly Ser 100 105 110 His Glu Ala Asn Met Leu Ser Val Leu Glu He Phe Ala Val Ser Gln 115 120 125 sly He Val sly He Arg sly Val Phe Ser Asn Lys Phe Leu Ala Met 130 135 140 Ser Lys Lys Gly Lys Leu His Ala Ser Ala Lys Phe Thr Asp Asp Cys 145 150 155 160 Lys Phe Arg Glu Arg Phe Gln Glu Asn Ser Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser 165 170 175 Ala He His Arg Thr Glu Lys Thr Gly Arg Glu Trp Tyr Val Ala Leu 180 185 190 Asn Lys Arg Gly Lys Ala Lys Arg Gly Cys Ser Pro Arg Val Lye Pro 195 200 205 Gln His He Ser Thr His Phe Leu Pro Arg Phe Lye Gln Ser Glu Gln 210 215 220 Pro Glu Leu Ser Phe Thr Val Thr Val Pro Glu Lys Lys Asn Pro Pro 22S 230 235 240 rti i *?i lfi flütir nn¡ ?IMIÍ Ser Pro He Lys Ser Lys He Pro Leu Ser Ala Pro Arg Lys Asn Thr 245 250 255 Asn Ser Val Lys Tyr Arg Leu Lys Phe Arg Phe Gly 260 265 <210> 9 <211 208 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Ala Leu Gly Gln Lys Leu Phe He Thr Met Ser Arg Gly Ala Gly 1 5 10 15 Arg Leu Gln Gly Thr Leu Trp Ala Leu Val Phe Leu Gly He Leu Val 20 25 30 Gly Met Val Val Pro Ser Pro Ala Gly Thr Arg Ala Asn Asn Thr Leu 35 40 45 Leu Asp Ser Arg Gly Trp Gly Thr Leu Leu Ser Arg Ser Arg Ala Gly 50 55 60 Leu Ala Gly Glu He Ala Gly Val Asn Trp Glu Ser Gly Tyr Leu Val 65 70 75 80 Gly He Lys Arg Gln Arg Arg Leu Tyr Cys Asn Val Gly He Gly Phe 85 90 95 His Leu Gln Val Leu Pro Aep Gly Arg He Ser Gly Thr Hie Glu Glu 100 105 110 Asn Pro Tyr Ser Leu Leu Glu He Ser Thr Val Glu Arg Gly Val Val 115 120 125 Ser Leu Phe Gly Val Arg Ser Ala Leu Phe Val Ala Met Aen Ser Lys 130 135 140 Gly Arg Leu Tyr Ala Thr Pro Ser Phe Gln slu Glu Cys Lye Phe Arg 145 150 155 160 Glu Thr Leu Leu Pro Asn Asn Tyr Asn Ala Tyr Glu Ser Asp Leu Tyr 165 170 175 Gln Gly Thr Tyr He Ala Leu Ser Lys Tyr Gly Arg Val Lys Arg sly 180 185 190 Ser Lys Val Ser Pro He Met Thr Val Thr His Phe Leu Pro Arg He 195 200 205 <210> 10 c211> 194 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met His Lys Trp He Leu Thr Trp He Leu Pro Thr Leu Leu Tyr Arg 1 5 10 15 Ser Cys Phe His He He Cys Leu Val Gly Thr He Ser Leu Ala Cys 20 25 30 Asn Asp Met Thr Pro Glu Gln Met Ala Thr Asn Val Asn Cys Ser Ser 35 40 45 Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp He 50 55 60 Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gln Trp Tyr Leu Arg He Asp 65 70 7S 80 Lys Arg Gly Lys Val Lyß sly Thr Gln Glu Met Lyß Asn Aßn Tyr Asn 85 90 95 He Met Glu He Arg Thr Val Ala Val Gly He Val Ala lie Lye Gly 100 105 110 Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lyß Leu Tyr 115 120 125 Ala Lys Lys Glu Cys Aßn Glu Asp Cys Asn Phe Lyß Glu Leu He Leu 130 135 140 Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly 145 150 155 160 Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn Gln Lys Gly He Pro Val Arg Gly 165 170 175 Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gln Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala 180 185 190 He Thr <210> 11 <211> 233 <212> PRT < 13> Homo sapiens <400> 11 Met Gly Ser Pro Arg Ser Ala Leu Ser Cys Leu Leu Leu His Leu Leu 1 5 10 15 Val Leu Cys Leu Gln Ala Gln Glu Gly Pro Gly Arg Gly Pro Ala Leu 20 25 30 Gly Arg Glu Leu Ala Ser Leu Phe Arg Ala Gly Arg slu Pro Gln Gly 35 40 45 Val Ser Gln Gln His Val Arg Glu Gln Ser Leu Val Thr Asp Gln Leu 50 55 60 Ser Arg Arg Leu He Arg Thr Tyr Gln Leu Tyr Ser Arg Thr Ser Gly 65 70 75 80 Lys His Val Gln Val Leu Ala Asn Lys Arg He Asn Ala Met Ala Glu 85 90 95 Asp Gly Asp Fro Phe Ala Lys Leu He Val Glu Thr Asp Thr Phe Gly 100 105 110 Ser Arg Val Arg Val Arg Gly Ala Glu Thr Gly Leu Tyr He Cys Met 115 120 125 Asn Lys Lys Gly Lye Leu He Ala Lys Ser Asn Gly Lys Gly Lys Asp 130 135 140 Cys Val Phe Thr Glu He Val Leu Glu Asn Asn Tyr Thr Ala Leu Gln 145 150 155 160 Asn Ala Lys Tyr Glu sly Trp Tyr Met Ala Phe Thr Arg Lys Gly Arg 165 170 175 Pro Arg Lys Gly Ser Lys Thr Arg Gln His Gln Arg Glu Val Hie Phe 180 185 190 Met Lys Arg Leu Pro Arg Gly His His Thr Thr Glu Gln Ser Leu Arg 195 200 205 Phe Glu Phe Leu Asn Tyr Pro Pro Phe Thr Arg Ser Leu Arg Gly Ser 210 215 220 Gln Arg Thr Trp Ala Pro Glu Pro Arg 225 230 <210> 12 e211> 208 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Ala Pro Leu Gly Glu Val Gly Asn Tyr Phe Gly Val Gln Asp Ala 1 5 10 15 val Pro Phe Gly Asn Val Pro Val Leu Pro Val Asp Ser Pro Val Leu 20 25 30 Leu Ser Asp His Leu Gly Gln Ser Glu Ala Gly Gly Leu Pro Arg Gly 35 40 45 Pro Ala Val Thr Asp Leu Asp His Leu Lys Gly He Leu Arg Arg Arg 50 55 60 Gln Leu Tyr Cye Arg Thr Gly Phe His Leu Glu He Phe Pro Asn Gly 65 70 75 80 Thr lie Gln Gly Thr Arg Lys Aep His Ser Arg Phe Gly He Leu Glu 85 90 95 Phe He Ser He Ala Val Gly Leu Val Ser He Arg Gly Val Asp Ser 100 105 110 Gly Leu Tyr Leu Gly Met Asn Glu Lys Gly Glu Leu Tyr Gly Ser Glu 115 120 125 Lys Leu Thr Gln Glu Cys Val Phe Arg Glu Gln Phe Glu Glu Asn Trp 130 135 140 Tyr Asn Thr Tyr Ser Ser Asn Leu Tyr Lys His Val Asp Thr Gly Arg 145 150 155 160 Arg Tyr Tyr Val Ala Leu Asn Lys Asp Gly Thr Pro Arg Glu Gly Thr 165 170 175 Arg Thr Lys Arg His Gln Lyß Phe Thr His Phe Leu Pro Arg Pro Val 180 185 190 Aep Pro Asp Lys Val Pro Glu Leu Tyr Lye Aep He Leu Ser Gln Ser 195 200 205 <210> 13 <211> 208 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Met Trp Lys Trp He Leu Thr His Cys Ala Ser Ala Phe Pro Hie Leu 1 5 10 15 Pro Gly Cys Cys Cys Cys Cye Phe Leu Leu Leu Phe Leu Val Ser Ser 20 25 30 val Pro Val Thr Cys Gln Ala Leu Gly sln Asp Met Val Ser Pro slu 35 40 45 Ala Thr Asn Ser Ser Ser Ser Ser Phe Ser Ser Pro Ser Ser Ala Gly 50 55 60 Arg His Val Arg Ser Tyr Asn His Leu Gln Gly Asp Val Arg Trp Arg 65 70 75 80 Lys Leu Phe Ser Phe Thr Lys Tyr Phe Leu Lys He Glu Lys Asn Gly 85 90 95 Lys Val Ser Gly Thr Lye Lyß Glu Asn Cye Pro Tyr Ser He Leu Glu 100 105 110 He Thr Ser Val Glu He Gly Val Val Ala Val Lys Ala He Aßn Ser 115 120 125 Asn Tyr Tyr Leu Ala Met Asn Lys Lys Gly Lys Leu Tyr Gly Ser Lys 130 135 140 Glu Phe Asn Aen Asp Cys Lys Leu Lye slu Arg He Glu Glu Asn Gly 145 150 155 160 Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Phe Asn Trp Gln Hie Asn Gly Arg sln Met 165 170 175 Tyr Val Ala Leu Asn Gly Lys Gly Ala Pro Arg Arg Gly Gln Lys Thr 180 185 190 Arg Arg Lys Asn Thr Ser Ala His Phe Leu Pro Met Val Val His Ser 195 200 205 c210> 14 <211> 225 <212> PRT <213> Homo sapiene <400> 14 Met -Ala Ala Leu Ala Ser Ser Leu He Arg Gln Lyß Arg slu Val Arg 1 5 10 15 Glu Pro sly Gly Ser Arg Pro Val Ser Ala Gln Arg Arg Val Cye Pro 20 25 30 Arg sly Thr Lys ser Leu Cys Gln Lys Gln Leu Leu He Leu Leu Ser 35 40 45 Lys Val Arg Leu Cyß Gly Gly Arg Pro Ala Arg Pro Asp Arg Gly Pro 50 55 60 Glu Pro Gln Leu Lys Gly He Val Thr Lys Leu Phe Cys Arg Gln sly 65 70 75 80 Phe Tyr Leu Gln Ala Asn Pro Aep Gly Ser He Gln sly Thr Pro Glu 85 90 95 Asp Thr Ser Ser Phe Thr Hie Phe Asn Leu He Pro Val Gly Leu Arg 100 105 110 Val Val Thr He Gln Ser Ala Lys Leu Gly His Tyr Met Ala Met Asn 115 120 125 Ala Glu Gly Leu Leu Tyr Ser Ser Pro Hiß Phe Thr Ala Olu Cys Arg 130 135 140 Phe Lys Glu Cys Val Phe Glu Aen Tyr Tyr Val Leu Tyr Ala Ser Ala 145 150 155 160 Leu Tyr Arg Gln Arg Arg Ser Gly Arg Ala Trp Tyr Leu Gly Leu Aep 165 170 175 Lys slu sly Gln Val Met Lys Gly Aßn Arg Val Lys Lys Thr Lys Ala 180 185 190 Ala Ala His Phe Leu Pro Lys Leu Leu Glu Val Ala Met Tyr Gln Glu 195 200 205 Pro Ser Leu His Ser Val Pro Glu Ala Ser Pro Ser Ser Pro Pro Ala 210 215 220 Pro 225 <210> 15 i AAA 'x-^ ^ -' -»- .. ...... i..i » -iaa.i.i??i. «rtniSi <211> 243 <212> PRT <213 > Homo sapiens <400> 15 Met Ala Ala Ala He Ala Ser Ser Leu He Arg Gln Lys Arg Oln Ala 1 5 10 15 Arg Glu Ser Asn Ser Aep Arg Val Ser Ala Ser Lye Arg Arg Ser Ser 20 25 30 Pro Ser Lys Asp Gly Arg Ser Leu Cys Glu Arg His Val Leu Gly Val 35 40 45 Phe Ser Lys Val Arg Phe Cys Ser Gly Arg Lys Arg Pro Val Arg Arg 50 55 60 Arg Pro Glu Pro Gln Leu Lys Oly He Val Thr Arg Leu Phe Ser Oln 65 70 75 80 Gln Gly Tyr Phe Leu Gln Met His Pro Asp Gly Thr He Asp Gly Thr 85 90 95 Lys Asp Glu Asn Ser Asp Tyr Thr Leu Phe Asn Leu He Pro Val Gly 100 105 110 Leu Arg Val Val Ala He Gln Gly Val Lys Ala Ser Leu Tyr Val Ala 115 120 125 Met Asn Gly Glu Gly Tyr Leu Tyr Ser Ser Asp Val Phe Thr Pro Glu 130 135 140 Cys Lys Phe Lys Glu Ser Val Phe Glu Asn Tyr Tyr Val He Tyr Ser 145 150 155 160 Ser Thr Leu Tyr Arg Gln Gln Glu Ser Gly Arg Ala Trp Phe Leu Gly 165 170 175 Leu Asn Lys Glu Gly Gln He Met Lyß Gly Aen Arg Val Lyß Lyß Thr 180 185 190 Lyß Pro Ser Ser Hie Phe Val Pro Lys Pro He Glu Val Cys Met Tyr 195 200 205 Arg Glu Pro Ser Leu His Glu He Gly Glu Lys Gln Gly Arg Ser Arg 210 215 220 Lys Ser Ser Gly Thr Pro Thr Met Asn Gly Gly Lys Val Val Asn Gln 225 230 235 240 Asp Ser Thr <210> 16 c211> 245 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Met Ala Ala Ala lie Ala Ser Ser Leu lie Arg Gln Lys Arg Gln Ala íi?.A'Í?irÍ¡ - -Í¡?A*L~~ ? Xt^.-^uL.y ?¿ .t * - —^tac....f^Jm 10 15 Arg Glu Arg Glu Lys Ser Asn Ala Cys Lye Cye Val Ser Ser Pro Ser 20 25 30 Lys Gly Lys Thr Ser Cys Asp Lys A3n Lys Leu Asn Val Phe Ser Arg 35 40 45 Val Lys Leu Phe Gly Ser Lys Lys Arg Arg Arg Arg Arg Pro Glu Pro 50 55 60 Gln Leu Lys Gly He Val Thr Lys Leu Tyr Ser Arg Gln Gly Tyr His 65 70 75 80 Leu Gln Leu Gln Ala Asp Gly Thr He Asp Gly Thr Lys Asp Glu Asp 85 90 95 Ser Thr Tyr Thr Leu Phe Asn Leu He Pro Val Gly Leu Arg Val Val 100 105 110 Ala He Gln Gly Val Gln Thr Lys Leu Tyr Leu Ala Met Asn Ser Glu 115 120 125 Gly Tyr Leu Tyr Thr Ser Glu Leu Phe Thr Pro Glu Cys Lys Phe Lys 130 135 140 Glu Ser Val Phe Glu Aßn Tyr Tyr Val Thr Tyr Ser Ser Met He Tyr 145 150 155 160 Arg Gln Gln Gln Ser Gly Arg Gly Trp Tyr Leu Gly Leu Asn Lys Glu 165 170 175 Gly Glu He Met Lys Gly Aen His Val Lye Lyß Aßn Lye Pro Ala Ala 180 185 190 His Phe Leu Pro Lys Pro Leu Lyg Val Ala Met Tyr Lys Glu Pro Ser 195 200 205 Leu His Asp Leu Thr Glu Phe Ser Arg Ser Gly Ser Gly Thr Pro Thr 210 215 220 Lys Ser Arg Ser Val Ser Gly Val Leu Asn Gly Gly Lys Ser Met Ser 225 230 235 240 His Asn Glu Ser Thr 245 <210> 17 <211=. 247 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Met Ala Ala Ala He Ala Ser Gly Leu He Arg Gln Lys Arg Gln Ala 1 5 10 15 Arg Glu Gln His Trp Asp Arg Pro Ser Ala Ser Arg Arg Arg Ser Ser 20 25 30 Pro Ser Lys Aen Arg Gly Leu Cyß Asn Gly Asn Leu Val Asp He Phe >A aaaBwif?J?l¡ iitiii1 faw c?-?e.íífea-^A* 35 40 45 Ser Lys Val Arg He Phe Gly Leu Lys Lys Arg Arg Leu Arg Arg Gln 50 55 60 Asp Pro Gln Leu Lys Gly He Val Thr Arg Leu Tyr Cys Arg Gln sly 65 70 75 80 Tyr Tyr Leu sln Met His Pro Asp Gly Ala Leu Asp Gly Thr Lys Asp 85 90 95 Asp Ser Thr Asn Ser Thr Leu Phe Asn Leu He Pro Val Gly Leu Arg 100 105 110 Val Val Ala He Gln Gly Val Lys Thr Gly Leu Tyr He Ala Met Asn 115 120 125 Gly Glu Gly Tyr Leu Tyr Pro Ser Glu Leu Phe Thr Pro Glu Cys Lyß 130 135 140 Phe Lys Glu Ser Val Phe Glu Asn Tyr Tyr Val He Tyr Ser Ser Met 145 150 155 160 Leu Tyr Arg Gln Gln Glu Ser Gly Arg Ala Trp Phe Leu Gly Leu Aen 165 170 175 Lys Glu Gly Gln Ala Met Lyß Gly Asn Arg Val Lys Lys Thr Lyß Pro 180 185 190 Ala Ala Hie Phe Leu Pro Lys Pro Leu Glu Val Ala Met Tyr Arg Glu 195 200 205 Pro Ser Leu Hie Aßp Val Gly Glu Thr Val Pro Lys Pro Gly Val Thr 210 215 220 Pro Ser Lys Ser Thr Ser Ala Ser Ala He Met Aßn Gly Gly Lyß Pro 225 230 235 240 Val Asn Lys Ser Lys Thr Thr 245 <210> 18 <211> 207 <212> PRT <2 3> Homo ßapiens 400> 18 Met Ala Glu Val Gly Gly Val Phe Ala Ser Leu Asp Trp Asp Leu His 1 5 10 15 Gly Phe Ser Ser Ser Leu Gly Asn Val Pro Leu Ala Asp Ser Pro Gly 20 25 30 Phe Leu Asn Glu Arg Leu Gly Gln He Glu Gly Lye Leu Gln Arg Gly 35 40 45 Ser Pro Thr Asp Phe Ala His Leu Lys Gly He Leu Arg Arg Arg Gln 50 55 60 Leu Tyr Cys Arg Thr Gly Phe His Leu Glu He Phe Pro Asn Gly Thr 65 70 75 80 Val His Gly Thr Arg His Asp His Ser Arg Phe Gly He Leu Glu Phe 85 90 95 He Ser Leu Ala Val Gly Leu He Ser He Arg Gly Val Asp Ser Gly 100 105 110 Leu Tyr Leu Gly Met Asn Glu Arg Gly Glu Leu Tyr Gly Ser Lys Lys 115 120 125 Leu Thr Arg Glu Cys Val Phe Arg Glu Gln Phe Glu Glu Asn Trp Tyr 130 135 140 Asn Thr Tyr Ala Ser Thr Leu Tyr Lys Hie Ser Asp Ser Glu Arg Gln 145 150 155 160 Tyr Tyr Val Ala Leu Asn Lys Asp Gly Ser Pro Arg Glu Gly Tyr Arg 165 170 175 Thr Lys Arg His Gln Lye Phe Thr Hiß Phe Leu Pro Arg Pro Val Asp 180 185 190 Pro Ser Lye Leu Pro Ser Met Ser Arg Aep Leu Phe His Tyr Arg 195 200 205 c210> 19 <211> 207 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Met Tyr Ser Ala Pro Ser Ala Cys Thr Cys Leu Cys Leu His Phe Leu 1 5 10 15 Leu Leu Cys Phe Gln Val Gln Val Leu Val Ala slu slu Asn Val Asp 20 25 30 Phe Arg He His Val Glu Asn Gln Thr Arg Ala Arg Asp Asp Val Ser 35 40 45 Arg Lys Gln Leu Arg Leu Tyr Gln Leu Tyr Ser Arg Thr Ser Gly Lys 50 55 60 His He Gln Val Leu Gly Arg Arg He Ser Ala Arg Gly Glu Asp Gly 65 70 75 80 Aep Lye Tyr Ala Gln Leu Leu Val Glu Thr Asp Thr Phe Gly Ser Gln 85 90 95 Val Arg He Lye sly Lys Glu Thr slu Phe Tyr Leu Cye Met Asn Arg 100 105 110 Lye Gly Lys Leu Val Gly Lys Pro Asp Gly Thr Ser Lys Glu Cys Val 115 120 125 Phe He Glu Lys Val Leu Glu Aßn Aan Tyr Thr Ala Leu Met Ser Ala 130 135 140 Lys Tyr Ser Gly Trp Tyr Val Gly Phe Thr Lys Lys Gly Arg Pro Arg 145 150 155 160 Lys Gly Pro Lye Thr Arg Glu Asn Gln Gln Asp Val His Phe Met Lys 165 170 175 Arg Tyr Pro Lys Gly sln Pro Glu Leu Gln Lye Pro Phe Lye Tyr Thr 180 185 190 Thr Val Thr Lys Arg Ser Arg Arg He Arg Pro Thr His Pro Ala 195 200 205 <210> 20 <211> 216 <212> PRT <213> Homo sapiene <400> 20 Met Arg Ser Gly Cys Val Val Val HIE Val Trp He Leu Ala Gly Leu 1 5 10 15 Trp Leu Ala Val Ala Gly Arg Pro Leu Ala Phe Ser Aep Ala Gly Pro 20 25 30 His Val His Tyr Gly Trp Gly Asp Pro He Arg Leu Arg Hiß Leu Tyr 35 40 45 Thr Ser Gly Pro His Gly Leu Ser Ser Cys Phe Leu Arg He Arg Ala 50 55 60 Asp Gly Val Val Asp Cys Ala Arg Gly Gln Ser Ala His Ser Leu Leu 65 70 75 80 Glu He Lys Ala Val Ala Leu Arg Thr Val Ala He Lys Gly Val His 85 90 95 Ser Val Arg Tyr Leu Cys Met Gly Ala Asp Gly Lys Met Gln Gly Leu 100 105 110 Leu Gln Tyr Ser Glu Glu Asp Cys Ala Phe Glu Glu Glu He Arg Pro 115 120 125 Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Arg Ser Glu Lys His Arg Leu Pro Val Ser 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Lys Gln Arg Gln Leu Tyr Lys Asn Arg Gly Phe Leu 145 150 155 160 Pro Leu Ser Hiß Phe Leu Pro Met Leu Pro Met Val Pro Glu Glu Pro 165 170 175 Glu Asp Leu Arg Gly His Leu Glu Ser Asp Met Phe Ser Ser Pro Leu 180 185 190 Glu Thr Asp Ser Met Asp Pro Phe Gly Leu Val Thr Gly Leu Glu Ala 195 200 205 Val Arg Ser Pro Ser Phe Glu Lye 210 215 <210> 21 <211> 233 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Met Ser Val Leu Arg Ala Tyr Pro Asn Ala Ser Pro Leu Leu Gly Ser 1 5 10 15 Ser Trp Gly Gly Leu He His Leu Tyr Thr Ala Thr Ala Arg Asn Ser 20 25 30 Tyr His Leu Gln He His Lys Asn Gly His Val Asp Gly Ala Pro His 35 40 45 Gln Thr He Tyr Ser Ala Leu Met He Arg Ser Glu Asp Ala Gly Phe 50 55 60 Val Val He Thr Gly Val Met Ser Arg Arg Tyr Leu Cys Met Asp Phe 65 70 75 80 Arg Gly Asn He Phe Gly Ser His Tyr Phe Aßp Pro Glu Asn Cys Arg 85 90 95 Phe Gln His Gln Thr Leu Glu Aßn Gly Tyr Aßp Val Tyr Hiß Ser Pro 100 105 110 Gln Tyr His Phe Leu Val Ser Leu Gly Arg Ala Lyß Arg Ala Phe Leu 115 120 125 Pro Gly Met Asn Pro Pro Pro Tyr Ser Gln Phe Leu Ser Arg Arg Asn 130 135 140 Glu He Pro Leu He Hiß Phe Asn Thr Pro He Pro Arg Arg His Thr 145 150 155 160 Arg Ser Ala Glu Aßp Aßp Ser Glu Arg Asp Pro Leu Asn Val Leu Lys 165 170 175 Pro Arg Ala Arg Met Thr Pro Ala Pro Ala Ser Cys Ser Gln Glu Leu 180 185 190 Pro Ser Ala Glu Asp Asn Ser Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Gly Val 195 200 205 Val Arg Gly Gly Arg Val Asn Thr His Ala Gly Gly Thr Gly Pro Glu 210 215 220 Gly Cys Arg Pro Phe Ala Lys Phe He 225 230 «210:» 22 <211> 155 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 22 Met Ala Glu Gly Glu He Thr Thr Phe Ala Ala Leu Thr Glu Arg Phe 1 S 10 15 t*l -i..a-» . -....t^^tfriaitártiifr''*"***»'"- - •-*" --"-- ti-tfutel Asn Leu Pro Leu Gly Asn Tyr Lyß Lyß Pro Lyß Leu Leu Tyr Cys Ser 20 25 30 Asn Gly Gly His Phe Leu Arg He Leu Pro Asp Gly Thr Val Asp Gly 35 40 45 Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gln His He sln Leu sln Leu Ser Ala slu 50 55 60 Ser Ala Gly Glu Val Tyr He Lys Gly Thr Glu Thr Gly Gln Tyr Leu 65 70 75 80 Ala Met Asp Thr Glu Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gln Thr Pro Asp Glu 85 90 95 Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr 100 105 110 Thr Ser Lys Lys His Ala Glu Lys Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys Lyß 115 120 125 Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr Gly Gln Lys Ala 130 135 140 He Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp 145 150 155 c210> 23 <211> 154 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 23 Met Ala Ala Ser Gly He Thr Ser Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly 1 5 10 15 Gly Ala Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr 20 25 30 Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg He His Pro Asp Gly Arg Val 35 40 45 Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Val Lyß Leu Gln Leu Gln 50 55 60 Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser He Lyß Gly Val Cyß Ala Asn Arg 65 70 75 80 Tyr Leu Ala Met Lye Glu Aep Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lye Cye Val 85 90 95 Thr Glu Glu Cyß Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Aßn Asn Tyr Asn 100 105 110 Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Ser Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg 115 ' 120 125 Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala 130 135 140 .ce.- ^ubSÁ.eH . a i. .^...± Á He Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 145 150 <210> 24 <211> 245 <212> PRT <213> Muß mueculus <400> 24 Met Gly Leu He Trp Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu Glu Pro Ser Trp 1 5 10 15 Pro Thr Thr Gly Pro Gly Thr Arg Leu Arg Arg Asp Ala Gly Gly Arg 20 25 30 Gly Gly Val Tyr Glu His Leu Gly Gly Ala Pro Arg Arg Arg Lys Leu 35 40 45 Tyr Cys Ala Thr Lys Tyr His Leu Gln Leu His Pro Ser Oly Arg Val 50 55 60 Asn Oly Ser Leu Glu Asn Ser Ala Tyr Ser He Leu slu He Thr Ala 65 70 75 80 Val Glu val Gly Val Val Ala He Lys Gly Leu Phe Ser sly Arg Tyr 85 90 95 Leu Ala Met Asn Lys Arg Gly Arg Leu Tyr Ala Ser Asp Hie Tyr Asn 100 105 110 Ala Glu Cys Glu Phe Val Glu Arg He His Glu Leu Gly Tyr Asn Thr 115 120 125 Tyr Ala Ser Arg Leu Tyr Arg Thr Gly Ser Ser Gly Pro Gly Ala Gln 130 135 140 Arg Gln Pro Gly Ala Gln Arg Pro Trp Tyr Val Ser Val Aen Gly Lys 145 150 155 160 Gly Arg Pro Arg Arg Gly Phe Lys Thr Arg Arg Thr Gln Lys Ser Ser 165 170 175 Leu Phe Leu Pro Arg Val Leu Gly His Lys Asp His Glu Met Val Arg 180 185 190 Leu Leu Gln Ser Ser sln Pro Arg Ala Pro Gly Glu Gly Ser Gln Pro 195 200 205 Arg sln Arg Arg Gln Lys Lys Gln Ser Pro sly Asp His Gly Lys Met 210 215 220 Glu Thr Leu Ser Thr Arg Ala Thr Pro Ser Thr Gln Leu His thr Gly 225 230 235 240 Gly Leu Ala Val Ala 245 <210> 25 c211> 202 ..ie.. -^^^.A.^..>.- ......^aihtoü, , tos.abaüfca m" - •*• ' -?fr?Wflfflifi <212> PRT <213> Mus musculus <400> 25 Met Ala Lys Arg Gly Pro Thr Thr Gly Thr Leu Leu Pro Arg Val Leu 1 5 10 15 Leu Ala Leu Val Val Ala Leu Ala Asp Arg Gly Thr Ala Ala Pro Asn 20 25 30 Gly Thr Arg Hxs Ala Glu Leu Gly His Gly Trp Asp Gly Leu Val Ala 35 40 45 Arg Ser Leu Ala Arg Leu Pro Val Ala Ala Gln Pro Pro Gln Ala Ala 50 55 60 al Arg Ser Gly Ala Gly Asp Tyr Leu Leu Gly Leu Lys Arg Leu Arg 65 70 75 60 Arg Leu Tyr Cys Asn Val Gly He Gly Phe His Leu Gln Val Leu Pro 85 90 95 Asp Gly Arg He Gly Gly Val His Ala Asp Thr Arg Asp Ser Leu Leu 100 105 110 Glu Leu Ser Pro Val Gln Arg Gly Val Val Ser He Phe Gly Val Ala 115 120 125 Ser Arg Phe Phe Val Ala Met Ser Ser Arg Gly Lys Leu Phe Gly Val 130 135 140 Pro Phe Phe Thr Asp Glu Cys Lys Phe Lys Olu He Leu Leu Pro Asn 145 150 155 160 Asn Tyr Asn Ala Tyr Glu Ala Tyr Ala Tyr Pro Gly Met Phe Met Ala 165 170 175 Leu Ser Lys Asn Gly Arg Thr Lys Lys Gly Asn Arg Val Ser Pro Thr 180 185 190 Met Lye Val Thr Hiß Phe Leu Pro Arg Leu 195 200 210> 26 <211> 264 «:212> PRT <213> Mus musculus <400> 26 Met Ser Leu Ser Leu Leu Phe Leu He Phe Cys Ser His Leu He His 1 5 10 15 Ser Ala Trp Ala Hie Gly Glu Lys Arg Leu Thr Pro Glu Gly Gln Pro 20 25 30 Ala Pro Pro Arg Asn Pro Gly Asp Ser Ser Gly Ser Arg Gly Arg Ser 35 40 45 Ser Ala Thr Phe Ser Ser Ser Ser Ala Ser Ser Pro Val Ala Ala Ser 50 55 60 k?úul. =.StA?.ÍA ? , AB»«jt?^^M...«_j .j . » ..e-n.Mj«a'» jja Aj Pro Gly Ser Gln Gly Ser Gly Ser Glu His Ser Ser Phe Gln Trp Ser 65 70 75 80 Pro Ser 01y Arg Arg Thr Gly Ser Leu Tyr Cys Arg Val Gly He Gly 85 90 95 Phe His Leu Gln He Tyr Pro Asp Gly Lys Val Asn Gly Ser His Glu 100 105 110 Ala Ser Val Leu Ser He Leu Glu He Phe Ala Val Ser Gln Gly He 115 120 125 Val Gly He Arg Gly val Phe Ser Asn Lys Phe Leu Ala Met Ser Lye 130 135 140 Lys Gly Lye Leu His Ala Ser Ala Lys Phe Thr Asp Asp Cys Lys Phe 145 150 155 160 Arg Glu Arg Phe Gln Glu Asn Ser Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala He 165 170 175 Hie Arg Thr Glu Lys Thr Gly Arg Glu Trp Tyr Val Ala Leu Aen Lye 180 185 190 Arg Gly Lys Ala Lys Arg Gly Cys Ser Pro Arg Val Lys Pro Gln His 195 200 205 Val Ser Thr His Phe Leu Pro Arg Phe Lye Gln Ser Glu Gln Pro slu 210 215 220 Leu Ser Phe Thr Val Thr Val Pro Glu Lys Lys Lys Pro Pro Val Lye 225 230 235 240 Pro Lys Val Pro Leu Ser Gln Pro Arg Arg Ser Pro Ser Pro Val Lys 245 250 255 Tyr Arg Leu Lys Phe Arg Phe Gly 260 <210> 27 <211> 208 <212 PRT <213> Mus musculus <400> 27 Met Ala Leu Gly Gln Arg Leu Phe He Thr Met Ser Arg c / Ala Gly 1 5 10 15 Arg Val Gln Gly Thr Leu Gln Ala Leu Val Phe Leu Gly Val Leu Val 20 25 30 Gly Met Val Val Pro Ser Pro Ala Gly Ala Arg Ala Asn Gly Thr Leu 35 40 45 Leu Asp Ser Arg Oly Trp Gly Thr Leu Leu Ser Arg Ser Arg Ala Gly 50 55 60 Leu Ala Gly Glu He Ser Gly Val Asn Trp Glu Ser Gly Tyr Leu val 65 70 75 80 Gly He Lys Arg Gln Arg Arg Leu Tyr Cys Asn Val Gly He Gly Phe 85 90 95 His Leu Gln Val Pro Pro Asp Gly Arg He Ser Gly Thr Hxs Glu Glu 100 105 110 Asn Pro Tyr Ser Leu Leu Glu He Ser Thr Val Glu Arg Gly Val Val 115 120 125 Ser Leu Phe Gly Val Lys Ser Ala Leu Phe He Ala Met Asn Ser Lys 130 135 140 Gly Arg Leu Tyr Thr Thr Pro Ser Phe Hia Aßp Glu Cys Lys Phe Arg 145 150 155 160 Glu Thr Leu Leu Pro Asn Asn Tyr Asn Ala Tyr Glu Ser Asp Leu Tyr 165 170 175 Arg Gly Thr Tyr He Ala Leu Ser Lys Tyr Gly Arg Val Lyß Arg Gly 180 185 190 Ser Lys Val Ser Pro He Met Thr Val Thr His Phe Leu Pro Arg He 195 200 205 <210> 28 <211> 194 <212> PRT <213> Mus musculus <400 > 28 Met Arg Lys Trp He Leu Thr Arg He Leu Pro Thr Leu Leu Tyr Arg 1 5 10 15 Ser Cys Phe His Leu Val Cys Leu Val Gly Thr He Ser Leu Ala Cys 20 25 30 Asn Asp Met Ser Pro Glu Gln Thr Ala Thr Ser Val Asn Cye Ser Ser 35 40 45 Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly sly Asp He 50 55 60 Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg thr sln Trp Tyr Leu Arg He Asp 65 70 75 80 Lys Arg Gly Lys Val Lye Gly Thr Gln Glu Met Lys Asn Ser Tyr Asn 85 90 95 He Met Glu He Arg Thr Val Ala Val Gly He Val Ala He Lys Gly 100 105 110 Val Glu Ser Glu Tyr Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr 115 120 125 Ala Lye Lye Glu Cys Asn Glu Aßp Cyß Asn Phe Lye Glu Leu He Leu 130 135 140 &,A_.^j>,^.*..»se>¡att«^&4jafaa*3rit^ .¡..jlt. i .
Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Ser Gly 145 150 155 160 Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Aen Gln Lys Gly He Pro Val Lys Gly 165 170 175 Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gln Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala 180 185 190 He Thr <21-0> 29 <211> 268 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 29 Met Gly Ser Pro Arg Ser Ala Leu Ser Cys Leu Leu Leu Hie Leu Leu 1 5 10 15 Val Leu Cys Leu Gln Ala Gln Val Arg Ser Ala Ala Gln Lys Arg Gly 20 25 30 Pro Gly Ala Gly Asn Pro Ala Asp Thr Leu Gly Gln Gly Hie Glu Asp 35 40 45 Arg Pro Phe Gly Gln Arg Ser Arg Ala Gly Lys Asn Phe Thr Asn Pro 50 55 60 Ala Pro Asn Tyr Pro Glu Glu Gly Ser Lys Glu Gln Arg Asp Ser Val 65 70 75 80 Leu Pro Lys Val Thr Oln Arg His Val Arg slu Gln Ser Leu Val Thr 85 90 95 Asp Gln Leu Ser Arg Arg Leu He Arg Thr Tyr Gln Leu Tyr Ser Arg 100 105 110 Thr Ser Gly Lys His Val Gln Val Leu Ala Aßn Lys Arg He Asn Ala 115 120 125 Met Ala Glu Asp Gly Asp Pro Phe Ala Lys Leu He Val Glu Thr Asp 130 135 140 Thr Phe Gly Ser Arg Val Arg Val Arg Gly Ala Glu Thr Gly Leu Tyr 145 150 155 160 He Cys Met Asn Lye Lye Gly Lye Leu He Ala Lys Ser Asn Gly Lys 165 170 175 Gly Lys Asp Cys Val Phe Thr Glu He Val Leu Glu Asn Asn Tyr Thr 180 185 190 Ala Leu Gln Asn Ala Lys Tyr Glu Gly Trp Tyr Met Ala Phe Thr Arg 195 200 205 Lys Gly Arg Pro Arg Lys Gly Ser Lys Thr Arg Gln His Gln Arg Glu 210 215 220 Val His Phe Met Lys Arg Leu Pro Arg Gly Hie His Thr Thr Glu Gln 225 230 235 240 Ser Leu Arg Phe Glu Phe Leu Asn Tyr Pro Pro Phe Thr Arg Ser Leu 245 250 255 Arg Gly Ser Gln Arg Thr Trp Ala Pro Glu Pro Arg 260 265 <210> 30 «211> 208 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 30 Met Ala Pro Leu Gly Glu Val Gly Ser Tyr Phe Gly Val Gln Asp Ala 1 5 10 15 Val Pro Phe Gly Aen Val Pro Val Leu Pro Val Aßp Ser Pro Val Leu 20 25 30 Leu Asn Asp His Leu Gly sln Ser Glu Ala Gly Gly Leu Pro Arg Gly 35 40 45 Pro Ala Val Thr Asp Leu Asp His Leu Lys Gly He Leu Arg Arg Arg 50 55 60 Gln Leu Tyr Cys Arg Thr Gly Phe His Leu Glu He Phe Pro Aan Gly 65 70 75 80 Thr He Gln Gly Thr Arg Lys Aßp His Ser Arg Phe Gly He Leu Glu 85 90 95 Phe He Ser He Ala Val Gly Leu Val Ser He Arg Gly Val Asp Ser 100 105 110 Gly Leu Tyr Leu sly Met Asn Glu Lys Gly Glu Leu Tyr Gly Ser Glu 115 120 125 Lys Leu Thr Gln Glu Cys Val Phe Arg Glu Gln Phe Glu Glu Asn Trp 130 135 140 Tyr Asn Thr Tyr Ser Ser Aen Leu Tyr Lys Hie Val Asp Thr Gly Arg 145 150 155 160 Arg Tyr Tyr Val Ala Leu Aen Lyß Aep Gly Thr Pro Arg Glu Gly Thr 165 170 175 Arg Thr Lys Arg Hiß Gln Lye Phe Thr Hie Phe Leu Pro Arg Pro Val 180 IBS 190 Asp Pro Aap Lys Val Pro Glu Leu Tyr Lys Asp He Leu Ser Gln Ser 195 200 205 <210> 31 f •*--* --*•"'•^jÉJi-JüiMüMiihM'"'''»'--*-*»*-**—*°trr^j* 'fB'i?m k £ée^ga| ££ ^^i <211> 209 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 31 Met Trp Lys Trp He Leu Thr Hxß Cys Ala Ser Ala Phe Pro His Leu 1 5 10 15 Pro Gly Cys Cys Cys Cys Phe Leu Leu Leu Phe Leu Val Ser Ser Phe 20 25 30 Pro Val Thr Cye Gln Ala Leu Gly Gln Asp Met Val Ser Gln slu Ala 35 40 45 Thr Asn Cys Ser Ser Ser Ser Ser Ser Phe Ser Ser Pro Ser Ser Ala 50 S5 60 Gly Arg Hiß Val Arg Ser Tyr Asn His Leu Gln Gly Asp Val Arg Trp 65 70 75 80 Arg Arg Leu Phe Ser Phe Thr Lys Tyr Phe Leu Thr He Glu Lye Asn 85 90 95 Gly Lys Val Ser Gly Thr Lys Asn Glu Asp Cys Pro Tyr Ser Val Leu 100 105 110 Glu He Thr Ser Val Glu He Gly Val Val Ala Val Lys Ala He Asn 115 120 125 Ser Asn Tyr Tyr Leu Ala Met Aen Lyß Lyß Gly Lye Leu Tyr Gly Ser 130 135 140 Lys Glu Phe Asn Asn Asp Cys Lys Leu Lys Glu Arg He Glu Glu Aen 145 150 155 160 Gly Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Phe Asn Trp Gln His Asn Gly Arg Gln 165 170 175 Met Tyr Val Ala Leu Asn Gly Lys Gly Ala Pro Arg Arg Gly Gln Lys 180 185 190 Thr Arg Arg Lys Asn Thr Ser Ala His Phe Leu Pro Met Thr He Gln 195 200 205 Thr <=210> 32 <213> Mus musculus <400> 32 Met Ala Ala Leu Ala Ser Ser Leu He Arg Gln Lys Arg Glu Val Arg 1 5 10 15 Glu Pro Gly Gly Ser Arg Pro Val Ser Ala Gln Arg Arg Val Cys Pro 20 25 30 Arg Gly Thr Lys Ser Leu Cye Gln Lys Gln Leu Leu He Leu Leu Ser 35 40 45 Lys Val Arg Leu Cys Gly Gly Arg Pro Thr Arg Gln Asp Arg Gly Pro 50 55 60 Glu Pro Gln Leu Lys Gly He Val Thr Lys Leu Phe Cys Arg Gln sly 65 70 75 80 Phe Tyr Leu Gln Ala Asn Pro Asp Gly Ser He Gln sly Thr Pro Glu 85 90 95 Asp Thr Ser Ser Phe Thr Hie Phe Asn Leu He Pro Val Gly Leu Arg 100 105 110 Val Val Thr He Gln Ser Ala Lys Leu Oly His Tyr Met Ala Met Asn 115 120 125 Ala Glu Gly Leu Leu Tyr Ser Ser Pro His Phe Thr Ala Glu Cys Arg 130 135 140 Phe Lys Glu Cys Val Phe Glu Asn Tyr Tyr Val Leu Tyr Ala Ser Ala 145 150 155 160 Leu Tyr Arg Gln Arg Arg Ser Gly Arg Ala Trp Tyx Leu Gly Leu Asp 165 170 175 Lyß Glu Gly Arg Val Met Lys Gly Asn Arg Val Lys Lys Thr Lys Ala 180 185 190 Ala Ala His Phe Val Pro Lys Leu Leu Glu Val Ala Met Tyr Arg Glu 195 200 205 Pro Ser Leu His Ser Val Pro Glu Thr Ser Pro Ser Ser Pro Pro Ala 210 215 220 HlS 225 <210> 33 <211> 243 <212> PRT <213> Mus musculus «400> 33 Met Ala Ala Ala He Ala Ser Ser Leu He Arg Gln Lys Arg Gln Ala 1 5 10 15 Arg Glu Ser Asn Ser Aep Arg Val Ser Ala Ser Lye Arg Arg Ser Ser 20 25 30 Pro Ser Lys Asp Gly Arg Ser Leu Cys Glu Arg Hie Val Leu Gly Val 35 40 45 Phe Ser Lys Val Arg Phe Cys Ser Gly Arg Lys Arg Pro Val Arg Arg 50 55 60 Arg Pro Glu Pro sln Leu Lys Gly He Val Thr Arg Leu Phe Ser Gln 65 70 75 80 Gln sly Tyr Phe Leu Gln Met His Pro Asp Gly Thr He Asp Gly Thr ??i?á**¿~ - JAi. » yy.j,? . ,lr.y.--&.~rt.ak, ,...... A M.* Uiály ?llLyl. -_. -<- r. ... Mt.? ., 85 90 95 Lys Asp Glu Asn Ser Asp Tyr Thr Leu Phe Asn Leu He Pro Val Gly 100 105 110 Leu Arg Val Val Ala He Gln sly Val Lys Ala Ser Leu Tyr Val Ala 115 120 125 Met Asn Gly Glu Gly Tyr Leu Tyr Ser Ser Asp Val Phe Thr Pro Glu 130 135 140 Cys Lys Phe Lys Glu Ser Val Phe Glu Asp Tyr Tyr Val He Tyr Ser 145 150 15S 160 Ser Thr Leu Tyr Arg Gln Gln Glu Ser Gly Arg Ala Trp Phe Leu Gly 165 170 175 Leu Asn Lys Glu Gly Gln He Met Lys Gly Asn Arg Val Lys Lys Thr 180 185 190 Lys Pro Ser Ser His Phe Val Pro Lys Pro He Glu Val Cys Met Tyr 195 200 205 Arg Glu Pro Ser Leu Hie Glu He Gly Glu Lys sln Oly Arg Ser Arg 210 215 220 Lys Ser Ser Gly Thr Pro Thr Met Aen Gly Gly Lye Val Val Asn Gln 225 230 235 240 Asp Ser Thr <210> 34 «211> 245 <212> PRT c213> Mus musculus <400> 34 Met Thr Ala Ala He Ala Ser Ser Leu He Arg Gln Lys Arg Gln Ala 1 5 10 „ 15 Arg Glu Arg Glu Lys Ser Asn Ala Cys Lys Cys Val Ser Ser Pro Ser 20 25 30 Lys Gly Lye Thr Ser Cyß Aep Lye Asn Lyß Leu Asn Val Phe Ser Arg 35 40 45 Val Lys Leu Phe Gly Ser Lye Lyß Arg Arg Arg Arg Arg Pro Glu Pro 50 55 60 Gln Leu Lys Gly He Val Thr Lys Leu Tyr Ser Arg Gln sly Tyr Hie 65 70 75 80 Leu sln Leu Gln Ala Asp Gly Thr He Asp Gly Thr Lys Asp Glu Asp 85 90 95 Ser Thr Tyr Thr Leu Phe Asn Leu He Pro Val Gly Leu Arg Val Val 100 105 110 Ala He Gln Gly Val Gln Thr Lys Leu Tyr Leu Ala Met Asn Ser slu 115 120 125 Gly Tyr Leu Tyr Thr Ser Glu His Phe Thr Pro Glu Cys Lys Phe Lys 130 135 140 Glu Ser Val Phe Glu Asn Tyr Tyr Val Thr Tyr Ser Ser Met He Tyr 145 150 155 160 Arg Gln Gln Gln Ser Gly Arg Gly Trp Tyr Leu Gly Leu Asn Lys Glu 165 170 175 Gly Glu He Met Lys Gly Asn Hiß Val Lys Lys Asn Lys Pro Ala Ala 180 185 190 Hie Phe Leu Pro Lye Pro Leu Lyß Val Ala Met Tyr Lys Glu Pro Ser 195 200 205 Leu His Asp Leu Thr Glu Phe Ser Arg Ser Gly Ser Gly Thr Pro Thr 210 215 220 Lys Ser Arg Ser Val Ser Gly Val Leu Asn Gly Gly Lys Ser Met Ser 225 230 235 240 His Asn Glu Ser Thr 245 «210> 35 <211> 247 <212> PRT <213> Mus musculus «400> 35 Met Ala Ala Ala He Ala Ser Gly Leu He Arg Gln Lyß Arg Gln Ala 1 5 10 15 Arg Glu Gln His Trp Asp Arg Pro Ser Ala Ser Arg Arg Arg Ser Ser 20 25 30 Pro Ser Lys Asn Arg sly Leu Phe Asn sly Asn Leu Val Asp He Phe 35 40 45 Ser Lys Val Arg He Phe Gly Leu Lys Lys Arg Arg Leu Arg Arg Gln 50 55 60 Asp Pro sln Leu Lys Gly He Val Thr Arg Leu Tyr Cys Arg Gln Gly 65 70 75 80 Tyr Tyr Leu Gln Met His. Pro Asp Gly Ala Leu Aep Gly Thr Lys Asp 85 90 95 Asp Ser Thr Asn Ser Thr Leu Phe Asn Leu He Pro Val Gly Leu Arg 100 105 110 Val Val Ala He Gln Gly Val Lys Thr Gly Leu Tyr He Ala Met Asn 115 120 125 Gly Glu Gly Tyr Leu Tyr Pro Ser Glu Leu Phe Thr Pro Glu Cys Lys 130 135 140 Phe Lys Glu Ser Val Phe Glu Asn Tyr Tyr Val He Tyr Ser Ser Met 145 150 155 160 Leu Tyr Arg Gln sln Glu Ser Oly Arg Ala Trp Phe Leu Oly Leu Asn 165 170 175 Lys Glu Gly Gln Val Met Lye Gly Asn Arg Val Lys Lys Thr Lys Pro 180 185 190 Ala Ala His Phe Leu Pro Lys Pro Leu Glu Val Ala Met Tyr Arg Glu 195 200 205 Pro Ser Leu His Asp Val Gly Glu Thr Val Pro Lys Ala Gly Val Thr 210 215 220 Pro Ser Lys Ser Thr Ser Ala Ser Ala He Met Asn sly Gly Lye Pro 225 230 235 240 Val Asn Lys Cys Lys Thr Thr 245 <210> 36 <211 218 <212=> PRT <213> Mus musculus <400> 36 Met Ala Arg Lys Trp Asn Gly Arg Ala Val Ala Arg Ala Leu Val Leu 1 5 10 15 Ala Thr Leu Trp Leu Ala Val Ser Gly Arg Pro Leu Ala Gln Gln Ser 20 25 30 Gln Ser Val Ser Asp Glu Asp Pro Leu Phe Leu Tyr Gly Trp Gly Lys 35 40 45 He Thr Arg Leu Gln Tyr Leu Tyr Ser Ala Gly Pro Tyr Val Ser Asn 50 55 60 Cys Phe Leu Arg He Arg Ser Asp Gly Ser Val Asp Cye Glu Glu Aep 65 70 75 80 Sin Aen Glu Arg Aen Leu Leu Glu Phe Arg Ala Val Ala Leu Lye Thr 85 90 95 He Ala He Lys Asp Val Ser Ser Val Arg Tyr Leu Cye Met Ser Ala 100 105 110 Asp Gly Lys He Tyr Gly Leu He Arg Tyr Ser Glu Glu Asp Cys Thr 115 120 125 Phe Arg Glu Glu Met Asp Cys Leu Gly Tyr Asn Gln Tyr Arg Ser Met 130 135 140 Lys His His Leu His He He Phe He sln Ala Lys Pro Arg Glu Gln 145 150 155 160 Leu Gln Asp Gln Lys Pro Ser Asn Phe He Pro Val Phe His Arg Ser 165 170 175 Phe Phe Glu Thr Gly Asp Gln Leu Arg Ser Lys Met Phe Ser Leu Pro 180 185 190 Leu Glu Ser Asp Ser Met Asp Pro Phe Arg Met Val Glu Asp Val Aep 195 200 205 His Leu Val Lys Ser Pro Ser Phe Glr. Lys 210 215 <210> 37 <211> 207 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 37 Met Ala Glu Val Gly Gly Val Phe Ala Ser Leu Asp Trp Asp Leu Gln 1 5 10 15 Gly Phe Ser Ser Ser Leu Gly Asn Val Pro Leu Ala Asp Ser Pro Gly 20 25 30 Phe Leu Asn Glu Arg Leu Gly Gln He Glu Gly Lys Leu Gln Arg Gly 35 40 45 Ser Pro Thr Asp Phe Ala Hiß Leu Lys Gly He Leu Arg Arg Arg Gln 50 55 60 Leu Tyr Cys Arg Thr Gly Phe His Leu Glu He Phe Pro Asn Gly Thr 65 70 75 80 Vai His Gly Thr Arg His Asp His Ser Arg Phe Gly He Leu Glu Phe 85 90 95 He Ser Leu Ala Val Gly Leu He Ser He Arg Gly Val Asp Ser Gly 100 105 110 Leu Tyr Leu Gly Met Asn Glu Arg Gly Glu Leu Phe Gly Ser Lyß Lye US 120 125 Leu Thr Arg Glu Cys Val Phe Arg Glu Gln Phe Glu Glu Asn Trp Tyr 130 135 140 Asn Thr Tyr Ala Ser Thr Leu Tyr Lys His Ser Asp Ser Glu Arg Gln 145 150 1SS 160 Tyr Tyr Val Ala Leu Asn Lyß Asp Gly Ser Pro Arg Glu Gly Tyr Arg 165 170 175 Thr Lyß Arg His Oln Lys Phe Thr Hiß Phe Leu Pro Arg Pro Val Aep 180 185 190 Pro Ser Lys Leu Pro Ser Met Ser Arg Asp Leu Phe Arg Tyr Arg 195 200 205 <210> 38 <211> 207 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 38 Met Tyr Ser Ala Pro Ser Ala Cys Thr Cys Leu Cys Leu His Phe Leu 1 5 10 15 Leu Leu Cys Phe Gln Val Gln Val Leu Ala Ala Glu Glu Asn Val Asp 20 25 30 Phe Arg He His Val Glu Asn Gln Thr Arg Ala Arg Asp Asp val ser 35 40 45 Arg Lys Gln Leu Arg Leu Tyr sln Leu Tyr Ser Arg Thr Ser sly Lye 50 SS 60 His He Gln al Leu Gly Arg Arg He Ser Ala Arg Gly Glu Asp Gly 65 70 75 80 Asp Lys Tyr Ala sln Leu Leu Val Glu Thr Asp Thr Phe Gly Ser Gln 85 90 95 Val Arg He Lys Gly Lys Glu Thr Glu Phe Tyr Leu Cys Met Asn Arg 100 105 110 Lye Gly Lye Leu Val Gly Lyß Pro Aßp Gly Thr Ser Lye Glu Cys Val 115 120 125 Phe He Glu Lys Val Leu Glu Aßn Aen Tyr Thr Ala Leu Met Ser Ala 130 135 140 Lys Tyr Ser Gly Trp Tyr Val Gly Phe Thr Lys Lys Gly Arg Pro Arg 145 150 155 160 Lys Gly Pro Lys Thr Arg Glu Asn Gln Qln Asp Val His Phe Met Lys 165 170 175 Arg Tyr Pro Lys Gly Gln Ala Glu Leu Gln Lys Pro Phe Lys Tyr Thr 180 185 190 Thr Val Thr Lys Arg Ser Arg Arg He Arg Pro Thr His Pro Gly 195 200 205 <210> 39 <211> 11 <212> PRT <213> Human immunodeficieney virus type 1 <400> 39 Tyr Gly Arg Lyß Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 40 <211> 15 «:212a PRT <2 3> secuencia artificial <220> <223> descripción de secuencia artificial: dominio de internalización derivado de la proteína tat de VIH <400> 40 sly Gly Gly Gly Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg .¿^1^^^^ g^^ 10 15 c210 41 <211> 22 <212> ADN <213 > secuencia artificial <220> <223 > descripción de secuencia artificia oligonucleótido; cebador PCR <400> 41 ctatcccaat gcctccccac tg 22 <210> 42 «211> 21 «=212> ADN <2i3> secuencia artificial <220> «223 > descripción de secuencia artificiaholigonucleótido; cebador PCR <400> 42 cgcccctgac cacccctaat g 21 <210> 43 <211> 23 <212> ADN c2 secuencia artificial <220> <223> descripción de secuencia artificiaholigonucleótido; cebador 5' RACE e400> 43 gtgcggaatt gtgagcggat aac 23 <210> 44 < 13 > secuencia artificial <220> <223? descripción de secuencia artificiaholigonucleótido; cebador 5' RACE <400> 44 ctgatggggt gcgccatcca ca 22 <211> 23 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <223 > descripción de secuencia artificiaholigonucleótido; cebador PCR alojado <400> 45 ctatgaccat gattacgcca age 23 <210> 46 <211> 24 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <223> descripción de secuencia artificiaholigonucleótido; cebador PCR alojado <400> 46 cattcttgtg gatctgcagg tggt 24 <210> 47 <211> 23 «212? ADN <2i3> secuencia artificial <220> <2 3 descripción de secuencia artificiaholigonucleótido; cebador 3' RACE <400> 47 cggcctcctg ttcacaggag etc 23 <210> 48 <211> 21 <212> ADN <2i3> secuencia artificial c220> <223> descripción de secuencia artificiaholigonucleótido; cebador 3' RACE <400> 48 cgggcctctt cgctattacg c 21 <210> 49 <211> 21 <212> ADN <213 > secuencia artificial 220> <223 > ddeessccrr iippcciióónn ddee sseeccuueeincia artificiaholigonucleótido; cebador PCR alojado <400> 49 gcgccgagga caacagcccg a 21 <210> 50 <211> 21 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <223> descripción de secuencia artificlaholigonucleótido; cebador PCR alojado <400> 50 tggcgaaagg gggatgtgct g 21 <210> 51 <211> 21 <212> ADN c2i3 > secuencia artificial <220> <223 > descripción de secuencia artificiaholigonucleótido; cebador PCR <400> 51 tccaceaccc tgttgctgta g 21 <210> 52 <211> 22 <212> ADN <2i3> secuencia artificial <220> <223> descripción de secuencia artificiaholigonucleótido; cebador PCR c400> 52 gaccacagtc catgccatca ct 22 <210> 53 <211> 22 <212> ADN < i3 > secuencia artificial <220> <223 > descripción de secuencia artificiaholigonucleótido; cebador PCR <400> 53 ctatcccaat gcctccccac tg 22 <210> 54 <211> 21 <212> ADN <213> secuencia artificial <220 > <223> descripción de secuencia artificiaholigonucleótido; cebador PCR c4007 54 cgcccctgac cacccctaat g 21 trß«i

Claims (57)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Una molécula aislada de ácido nucleico, que comprende una secuencia nucleotídica caracterizada porque se selecciona del grupo que consiste de: (a) la secuencia nucleotídica como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 1 ; (b) la secuencia nucleotídica del inserto de ADN en ATCC, depósito No. PTA- 1617; (c) una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido como se establece en la SECUENCIA DE
IDENTIFICACIÓN NO: 2 ; (d) una secuencia nucleotídica que hibridiza bajo condiciones de rigurosidad moderadas o elevadas con el complemento de cualquiera de las secuencias de los incisos (a)-(c) ; y (e) una secuencia nucleotídica complementaria con cualquiera de las secuencias de los incisos (a) - (c) . 2. Una molécula aislada de ácido nucleico, que comprende una secuencia nucleotídica caracterizada porque se selecciona del grupo que consiste de: (a) una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido que es por lo menos aproximadamente 70 por ciento idéntico al polipéptido como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2, en donde el polipéptido codificado tiene una actividad del polipéptido que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 ; (b) una secuencia nucleotídica que codifica para una variante alélica o variante de empalme de la secuencia nucleotídica como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 1, la secuencia nucleotídica del inserto de ADN en ATCC, depósito No. PTA-1617, o del inciso (a) ; (c) una región de la secuencia nucleotídica de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 1, el inserto de ADN en ATCC, depósito No. PTA-1617, (a), o (b) que codifica para un fragmento polipeptídico de por lo menos 25 residuos aminoácidos, en donde el fragmento polipeptídico tiene una actividad del polipéptido codificado, como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 , o es antigénico; (d) una región de la secuencia nucleotídica de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 1, el inserto de ADN en
ATCC, depósito No. PTA-1617, o cualquiera de las secuencias de los incisos (a) - (c) que comprende un fragmento de por lo menos aproximadamente 16 nucleótidos; (e) una secuencia nucleotídica que hibridiza, bajo condiciones de rigurosidad moderadas o elevadas, con el ^,i>^^tafcs^^rt,,-^ife«..atote^.. complemento de cualquiera de las secuencias de los incisos (a)-(d) ,- y (f) una secuencia nucleotídica complementaria con cualquiera de las secuencias de los incisos (a) - (d) . 3. Una molécula aislada de ácido nucleico, que comprende una secuencia nucleotídica, caracterizada porque se selecciona del grupo que consiste de: (a) una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2, con por lo menos una sustitución conservadora de aminoácidos, en donde el polipéptido codificado tiene una actividad del polipéptido como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 ; (b) una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido como se establece en la SECUENCIA DE
IDENTIFICACIÓN NO: 2, con por lo menos una inserción de aminoácido, en donde el polipéptido codificado tiene una actividad del polipéptido que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 ; (c) una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2, con por lo menos una supresión de un aminoácido, en donde el polipéptido codificado tiene una actividad del polipéptido como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 ; - - (d) una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2, el cual tiene un corte en la parte C o N terminal, en donde el polipéptido codificado tiene una actividad del polipéptido como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2; (e) una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido, como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2, con por lo menos una modificación que se selecciona del grupo que consiste de sustituciones, inserciones y supresiones de aminoácidos, cortes en la parte C o N terminal, en donde el polipéptido codificado tiene una actividad del polipéptido que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2; (f) una secuencia nucleotídica de cualquiera de los incisos (a) - (e) que comprende un fragmento de por lo menos aproximadamente 16 nucleótidos; (g) una secuencia nucleotídica que hibridiza bajo condiciones de rigurosidad moderadas o elevadas con el complemento de cualquiera de las secuencias de los incisos (a)-(f) ,- y (h) una secuencia nucleotídica complementaria con cualquiera de las secuencias de los incisos (a) - (e) . 4. El vector que comprende la molécula de ácido nucleico, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3.
5. La célula huésped, caracterizada porque comprende el vector de conformidad con la reivindicación 4.
6. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque es una célula eucariota .
7. La célula huésped, de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque es una célula procariota.
8. Un procedimiento para producir un polipéptido FGF-23, que comprende cultivar la célula huésped de conformidad con la reivindicación 5 bajo condiciones adecuadas para que exprese el polipéptido, y opcionalmente aislar el polipéptido del cultivo.
9. El polipéptido, caracterizado además porque se produce por el procedimiento de conformidad con la reivindicación 8.
10. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque la molécula de ácido nucleico comprende un ADN promotor diferente del ADN promotor para el polipéptido FGF-23 nativo unido operablemente al ADN que codifica para el polipéptido FGF-23.
11. La molécula aislada de ácido nucleico, de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además -*vr ti¡1" ^ ¡d^i?¡&¡¡^ mj^^ porque el por ciento de identidad se determina utilizando un programa de computadora que se selecciona del grupo que consiste de GAP, BLASTN, FASTA, BLASTA, BLASTX, BestFit y el algoritmo de Smith- aterman.
12. Un procedimiento para determinar si un compuesto inhibe la actividad del polipéptido FGF-23 o la producción del polipéptido FGF-23, caracterizado porque comprende exponer a una célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5, 6 ó 7, al compuesto, y medir la actividad del polipéptido FGF-23 o la producción del polipéptido FGF-23 en tales células.
13. Un polipéptido aislado, que comprende la secuencia de aminoácidos caracterizada porque se selecciona del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácidos como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2; y (b) la secuencia de aminoácidos codificada por el inserto de ADN en ATCC, depósito No. PTA-1617.
14. Un polipéptido aislado, que comprende la secuencia de aminoácidos caracterizada porque se selecciona del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácidos como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 3, que comprende opcionalmente de manera adicional una metiotina amino terminal; ^^l^^^^j (b) una secuencia de aminoácidos para un ortólogo de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2; (c) una secuencia de aminoácidos la cual es por lo menos aproximadamente 70 por ciento idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2, en donde el polipéptido tiene una actividad del polipéptido que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 ; (d) un fragmento de la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2, que comprende por lo menos aproximadamente 25 residuos aminoácidos, en donde el fragmento tiene una actividad del polipéptido que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2, o es antigénico; y (e) una secuencia de aminoácidos para una variante alélica o variante de empalme de la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2, la secuencia de aminoácidos es codificada por el inserto de ADN en ATCC, depósito No. PTA-1617, o de los incisos (a) - (c) .
15. Un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácidos como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2, con por lo menos ffmni-fírM-Tf^8^^^ - una sustitución de un aminoácido conservador, en donde el polipéptido tiene una actividad del polipéptido que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2; (b) la secuencia de aminoácidos como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2, con por lo menos una inserción de aminoácido, en donde el polipéptido tiene una actividad del polipéptido como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 ; (c) la secuencia de aminoácidos como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 con por lo menos una supresión de aminoácidos, en donde el polipéptido tiene una actividad del polipéptido que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2; (d) la secuencia de aminoácidos, como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2, la cual tiene un corte en la parte C o N terminal, en donde el polipéptido tiene una actividad del polipéptido que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2; y (e) la secuencia de aminoácidos, como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2, con por lo menos una modificación que se selecciona del grupo que consiste de sustituciones, inserciones y supresiones de aminoácidos, cortes en la parte C y N terminal, en donde el polipéptido tiene una actividad del polipéptido que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2. - •f-A"-
16. Un polipéptido aislado, codificado por la molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3, caracterizado porque el polipéptido tiene una actividad del polipéptido que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2.
17. El polipéptido aislado, de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el por ciento de identidad se determina utilizando un programa de computadora que se selecciona del grupo que consiste de GAP, BLASTP, FASTA, BLASTA, BLASTX, BestFit, y el algoritmo de Smith- Waterman.
18. Un agente de unión selectivo o un fragmento del mismo, caracterizado porque une específicamente el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13, 14 ó 15.
19. El agente de unión selectivo o un fragmento del mismo, de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque une específicamente al polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o un fragmento de la misma .
20. El agente de unión selectivo, de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque es un anticuerpo o un fragmento del mismo.
21. El agente de unión selectivo, de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque es un anticuerpo humanizado.
22. El agente de unión selectivo, de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque es un anticuerpo humano o un fragmento del mismo.
23. El agente de unión selectivo, de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque es un anticuerpo policlonal o un fragmento del mismo.
24. El agente de unión selectivo, de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque es un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo.
25. El agente de unión selectivo, de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque es un anticuerpo quimérico o fragmento del mismo.
26. El agente de unión selectivo, de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque es un anticuerpo injertado con CDR o un fragmento del mismo.
27. El agente de unión selectivo, de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque es un anticuerpo antiidiotípico o un fragmento del mismo.
28. El agente de unión selectivo, de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque es un fragmento de región variable.
29. El fragmento de región variable, de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque es un fragmento Fab o Fab1.
30. Un agente de unión selectivo o un fragmento del mismo, caracterizado porque comprende por lo menos una región determinante de complementariedad con especificidad por un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2.
31. El agente de unión selectivo, de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque se une a una etiqueta detectable.
32. El agente de unión selectivo, de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque antagoniza la actividad biológica del polipéptido FGF-23.
33. Un método para tratar, evitar o disminuir una enfermedad, condición o desorden relacionado con el polipéptido FGF-23, caracterizado porque comprende administrar a un paciente una cantidad efectiva de un agente de unión selectivo, de conformidad con la reivindicación 18.
34. Un agente de unión selectivo, caracterizado porque se produce al inmunizar un animal con un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2.
35. Un hibridoma, caracterizado porque produce un agente de unión selectivo que es capaz de unir un polipéptido, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3.
36. Un método para detectar o cuantificar la cantidad de polipéptido FGF-23, caracterizado porque utiliza el anticuerpo contra FGF-23 o un fragmento del mismo, de conformidad con la reivindicación 18.
37. Una composición, caracterizada porque comprende el polipéptido de conformidad con con cualquiera de las reivindicaciones 13, 14 ó 15, y un agente de formulación farmacéuticamente aceptable.
38. La composición, de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada además porque el agente de formulación farmacéuticamente aceptable es un portador, adyuvante, solubilizante, estabilizante o antioxidante.
39. La composición, de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada además porque el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 3.
40. Un polipéptido, caracterizado porque comprende un derivado del polipéptido de conformidad con con cualquiera de las reivindicaciones 13, 14 ó 15.
41. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado además porque está modificado covalentemente con un polímero hidrosoluble.
42. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada además porque el polímero hidrosoluble se selecciona del grupo que consiste de - polietilenglicol, monometoxipolietilenglicol, dextrano, celulosa, poli- (N-vinilpirrolidona) polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados y alcohol polivinílico.
43. Una composición, caracterizada porque comprende una molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3 , y un agente de formulación farmacéuticamente aceptable.
44. La composición de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada además porque la molécula de ácido nucleico está contenida en un vector viral .
45. Un vector viral, caracterizado porque comprende una molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3.
46. Un polipéptido de fusión, caracterizado porque comprende el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13, 14 ó 15, fusionado a una secuencia heteróloga de aminoácidos.
47. El polipéptido de fusión, de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado además porque la secuencia heteróloga de aminoácidos es un dominio constante de IgG o un fragmento de la misma.
48. Un método para tratar, evitar o disminuir una condición médica, caracterizado porque comprende administrar a un paciente el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13, 14 ó 15, o el polipéptido codificado por el ácido nucleico de conformidad con con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3.
49. Un método para tratar, evitar o disminuir una condición médica, caracterizado porque comprende administrar a un paciente un agonista o antagonista de la actividad biológica del polipéptido de conformidad con con cualquiera de las reivindicaciones 13, 14 ó 15, o del polipéptido codificado por el ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3.
50. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 48 ó 49, caracterizado porque además por la condición médica que se trata, se evita o se disminuye es raquitismo hipofosfatémico dominante autosómico (ADHR, por sus siglas en inglés) .
51. Un método para diagnosticar una condición patológica o la susceptibilidad a una condición patológica en un sujeto, el método está caracterizado porque comprende: (a) determinar la presencia o cantidad de expresión del polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13, 14 ó 15, o el polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3, en una muestra; y .^.^^ ^t^.^..,^ - (b) diagnosticar una condición patológica o la susceptibilidad a una condición patológica con base en la presencia o cantidad de expresión del polipéptido.
52. Un dispositivo, caracterizado porque comprende : (a) una membrana adecuada para implantación; y (b) células encapsuladas dentro de la membrana, en donde las células secretan una proteína, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13, 14 ó 15; y la membrana es permeable a la proteína e impermeable a materiales dañinos a las células.
53. Un método para identificar un compuesto el cual se une a un polipéptido FGF-23, el método está caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto el polipéptido de conformidad con las reivindicaciones 13, 14 ó 15, con un compuesto; y (b) determinar el grado de unión del polipéptido FGF-23 con el compuesto.
54. El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado además porque comprende determinar la actividad del polipéptido cuando se une al compuesto .
55. Un método para modular los niveles de un polipéptido en un animal, caracterizado porque comprende HfrA¿*fc J. ttf»^**"^ - administrar al animal la molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3.
56. Un mamífero no humano transgénico, caracterizado porque comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3.
57. Un procedimiento para determinar si un compuesto inhibe la actividad del polipéptido FGF-23 o la producción del polipéptido FGF-23, el procedimiento está caracterizado porque comprende exponer a un mamífero transgénico de conformidad con la reivindicación 56 al compuesto y medir la actividad del polipéptido FGF-23 o la producción del polipéptido FGF-23 en el mamífero.
MXPA02007619A 2000-02-15 2001-02-15 Moleculas de factor 23 de crecimiento de fibroblastos y su uso. MXPA02007619A (es)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US18244200P 2000-02-15 2000-02-15
US19890300P 2000-04-20 2000-04-20
US74858101A 2001-02-15 2001-02-15
PCT/US2001/004778 WO2001061007A2 (en) 2000-02-15 2001-02-15 Fibroblast growth factor-23 molecules and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MXPA02007619A true MXPA02007619A (es) 2002-12-13

Family

ID=27391551

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MXPA02007619A MXPA02007619A (es) 2000-02-15 2001-02-15 Moleculas de factor 23 de crecimiento de fibroblastos y su uso.

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP1257645A2 (es)
JP (1) JP2005508131A (es)
AU (1) AU3976701A (es)
CA (1) CA2398603A1 (es)
MX (1) MXPA02007619A (es)
WO (1) WO2001061007A2 (es)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030105302A1 (en) * 2000-03-08 2003-06-05 Nobuyuki Itoh Human FGF-23 gene and gene expression products
EP1261638A2 (en) * 2000-03-08 2002-12-04 Chiron Corporation Human fgf-23 gene and gene expression products
EP2184296A1 (en) 2000-07-19 2010-05-12 Advanced Research And Technology Institute, Inc. Fibroblast growth factor (fgf23) and methods for use
AU8009601A (en) * 2000-08-11 2002-02-25 Kirin Brewery Polypeptides controlling phosphoric acid metabolism, calcium metabolism, calcification and vitamin d metabolism and dnas encoding the same
AU2002302581A1 (en) * 2001-04-26 2002-11-11 Geneprot, Inc. Human fibroblast growth factor-related compositions
EP1466925B1 (en) * 2001-12-28 2009-09-02 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Antibodies against fibroblast growth factor 23
US7094551B2 (en) 2002-09-17 2006-08-22 Zahradnik Richard J Immunoassays, assay methods, antibodies and method of creating antibodies for detecting FGF-23
US7883705B2 (en) 2007-02-14 2011-02-08 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Anti FGF23 antibody and a pharmaceutical composition comprising the same
EP2271943A1 (en) * 2008-04-29 2011-01-12 Novartis AG Methods of monitoring the modulation of the kinase activity of fibroblast growth factor receptor and uses of said methods
ES2748038T3 (es) 2011-07-01 2020-03-12 Ngm Biopharmaceuticals Inc Composiciones, usos y métodos para el tratamiento de trastornos y enfermedades metabólicos
US9290557B2 (en) 2012-11-28 2016-03-22 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions comprising variants and fusions of FGF19 polypeptides
EP2925775B1 (en) 2012-11-28 2020-09-16 NGM Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treatment of metabolic disorders and diseases
US9273107B2 (en) 2012-12-27 2016-03-01 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Uses and methods for modulating bile acid homeostasis and treatment of bile acid disorders and diseases
EP2938740B1 (en) 2012-12-27 2022-04-20 NGM Biopharmaceuticals, Inc. Chimeric fgf19 peptides for use in treating bile acid disorders
KR102178945B1 (ko) 2013-10-28 2020-11-13 엔지엠 바이오파마슈티컬스, 아이엔씨. 암 모델 및 관련 방법
PE20170256A1 (es) 2014-01-24 2017-04-22 Ngm Biopharmaceuticals Inc Proteinas de union y sus metodos de uso
US10398758B2 (en) 2014-05-28 2019-09-03 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions comprising variants of FGF19 polypeptides and uses thereof for the treatment of hyperglycemic conditions
WO2015195509A2 (en) 2014-06-16 2015-12-23 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods and uses for modulating bile acid homeostasis and treatment of bile acid disorders and diseases
IL251834B2 (en) 2014-10-23 2023-09-01 Ngm Biopharmaceuticals Inc Pharmaceutical compositions containing peptide variants and methods of using them
US10434144B2 (en) 2014-11-07 2019-10-08 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods for treatment of bile acid-related disorders and prediction of clinical sensitivity to treatment of bile acid-related disorders
KR20170084332A (ko) 2014-12-04 2017-07-19 노파르티스 아게 Klotho 변이체 폴리펩티드를 사용하는 방법 및 조성물
WO2017019957A2 (en) 2015-07-29 2017-02-02 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Binding proteins and methods of use thereof
ES2871036T3 (es) 2015-11-09 2021-10-28 Ngm Biopharmaceuticals Inc Método para el tratamiento de trastornos relacionados con ácidos biliares
WO2018039557A1 (en) 2016-08-26 2018-03-01 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods of treating fibroblast growth factor 19-mediated cancers and tumors

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL136055A0 (en) * 1997-11-25 2001-05-20 Genentech Inc Fibroblast growth factor -19
WO2000060085A1 (en) * 1999-04-02 2000-10-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Fibroblast growth factor-20
AU3774300A (en) * 1999-06-02 2000-12-18 Genentech Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
WO2001049740A1 (en) * 2000-01-05 2001-07-12 Zymogenetics, Inc. Novel fgf homolog zfgf12

Also Published As

Publication number Publication date
WO2001061007A2 (en) 2001-08-23
WO2001061007A3 (en) 2002-03-14
EP1257645A2 (en) 2002-11-20
CA2398603A1 (en) 2001-08-23
AU3976701A (en) 2001-08-27
WO2001061007A9 (en) 2002-04-18
JP2005508131A (ja) 2005-03-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20060160181A1 (en) Fibroblast Growth Factor-23 molecules and uses thereof
MXPA02007619A (es) Moleculas de factor 23 de crecimiento de fibroblastos y su uso.
JP2009278975A (ja) 線維芽細胞増殖因子レセプター様分子およびその使用
JP2004519205A (ja) 胸腺間質リンホポイエチンレセプター分子およびその使用
US7531321B2 (en) Fibroblast growth factor-like molecules and uses thereof
MXPA02008506A (es) Moleculas semejantes a chordin-2 y sus usos.
CA2481509A1 (en) Her-2 receptor tyrosine kinase molecules and uses thereof
AU2003300395A1 (en) Wnt-1 inhibitory factor-1 (wif-1) molecules and uses thereof
JP2006238894A (ja) 線維芽細胞成長因子−２３分子およびその使用
US7482324B2 (en) Chordin-like molecules and uses thereof
US20020151695A1 (en) Transforming growth factor-beta-related molecules and uses thereof
WO2001098497A1 (en) Secreted epithelial colon stromal-1 polypeptides, nucleic acids encoding the same and uses thereof
US20140273089A1 (en) Fibroblast Growth Factor Receptor-Like Molecules and Uses Thereof
EP1947182A1 (en) Fibroblast growth factor-23 molecules and uses thereof
JP2004520083A (ja) Ａｔｐ結合カセットトランスポーター様分子およびそれらの使用
AU2006200820A1 (en) Fibroblast Growth Factor-23 Molecules and Uses Thereof
AU2005209710A1 (en) Fibroblast Growth Factor Receptor-Like Molecules and Uses Thereof