MÉTODO Y APARATO PARA LA IDENTIFICACIÓN RÁPIDA DE PARTÍCULAS UTILIZANDO HISTOGRAMAS DE LU2 ESPARCIDA DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos y aparato únicos para identificar partículas microscópicas, tales como protozoarios y otros microbios suspendidos en un fluido o gas . Los métodos actualmente aceptados para la identificación de partículas microscópicas patógenas requieren proceso de trabajo intensivo relativamente largo. Por ejemplo, para determinar s Cryptosporidium parvum o Gíardia lamblia están presentes en el agua para beber, los proveedores deben" emplear el método ÜSEPA 1622, un procedimiento de trabajo intensivo y largo. Los laboratorios clínicos y los inspectores de alimentos también deben usar procedimientos de trabajo intensivo largos para ubicar e identificar bacterias perjudiciales. Desafortunadamente, existen muchas circunstancias cuando la identificación positiva de un microbio no puede esperar. Una contaminación del agua para beber por Cryptosporidium debe reconocerse inmediatamente, antes de que el agua se suministre a los hogares. Igualmente, la identificación de una causa específica de una enfermedad tal como meningitis bacteriana, muchas veces no pueden esoerar _as horas requeridas. Finalmente, la detección e identificación de bacteria en fuentes de alimentos, tales como carne, toma tanto tiempo que en la mayoría de los casos, el alimento se distribuye antes de que el problema se descubra . Existe una diversidad de métodos y aparatos para la detección de organismos microscópicos. Por ejemplo, De León, e* al., en la Patente Norteamericana No. 5,770,368 enseña métodos de detección de Cryptosporidium. La viabilidad c infectividad de las formas encistadas puede determinarse sintetizando un ADNc a partir de una plantilla de ARN HSP inducida usando un cebador que es especifico para géneros c especies particulares de protozoarios , seguido por la amplificación enzimática de ADNc. Alternativamente, la infectividac puede determinarse amplificando un ADK HSP a partir de células infectadas usando un par cebador que es específico para un género o especie particular de orctozoarios . Steele, et al. en la Patente Norteamericana No. 5,593,472 describe la detección de Cryptosporidium parvum. Un método y equipo para la detección de Cryptosporidium parvum en muestras acuáticas y biológicas tales come agua superficial o heces se describe. ?1 método confía en el uso de cebadores para detectar toda o una porción de al menos una secuencia de ADN característica de Cryptosporidium parvum, siendo la secuencia toda o parte cié las regiones genómicas referidas como 38G y HemA contenidas dentro de los plásmidos rscombinar.tes pINV38G, y pKem4 , respectivamente. PÍS3SS, et al. en la Patente Norteamericana No. 5,229,849 describe el espectrómetro Doppler láser para el estudio estadístico del comportamiento de organismos microscópicos. Un método y sistema mejorado para percibir e identificar microbiotas que nadan en un fluido o se mueven a través de superficies en un fluido proporciona un método sensible para medir rápidamente cambios muy pequeños en la actividad, y detectar e identificar microbios individuales en volúmenes relativamente grandes de fluido, aún en la presencia de detritis. El sistema comprende una estación láser, una estación recolectora de muestras, una estación que toma película y una estación de percepción. yatt, et al. en la Patente Norteamericana No.
1,548,500 enseña el proceso y aparato para identificar o caracterizar partículas pequeñas . Se describe un aparato y proceso para la caracterización y/o identificación de r.icrcpartí culas individuales basadas en la medición de algunas perceptibles ópticas producidas conforme pasa cada partícula a través de un h ce luz, u otra radiación e ectromagnética. LJn haz fine de, pref riblemente, luz r.cnocromática linealmente polarizada pasa a través ce una disposición esférica de detectores, o medio de fibras ícticas, para transmitir la luz incidente a un contuto de meaios detectores, y una corriente de partícula mtersectan el haz en el centre cié la .disposición esférica. Las perceptibles seleccionadas calculadas a partir de la radiación esparcida detectada se usan después para recuperar mapas específicos, a partir da un medio de memoria de computadora , uno para cada perceocioíe. Lee, et al., en la Patente Norteamericana No. 5,473,428 describe un sistema sensor de temperatura interferonétrico que tiene un diodo láser acoplado en donde la magnitud se ajusta correspondiente a un haz láser de retroalimentación anterior. Un sistema sensor de temperatura ínterferonétrico proporciona un diseño simplificado para procesar precisamente un patrón de margen de interferencia usando efectos autoacoplantes de un elemento de detección láser, en donde un diodo láser y un elemento de detección óptico se combinan en un paquete. La Patente Norteamericana de Curtís Thompson No. 5, 582, 985 enseña la detección de r.icocacterias . La invención proporciona un método, composiciones, y equipos útiles para detectar micobacterias en una muestra. El método incluye poner en contacte la muestra con una solución de f t rmaidehído , un solvente orgánico, y un agente que degrada croteínas antes ele hióndiiar una sonda de ácido nucleico susceptibilidad de itiiccbacteriss que causan enfermedades humanas tales como mycobacterium tuberculosis . El sistema ú ico de la presente invención proporciona medidas precisas y válidas para identificar una amplia diversidad de partículas microscópicas, tales como pr orozcarios y otros microbios suspendidos en un fluido o gas . La metodología de la invención proporciona un procedimiento para la identif cación cuantitativa y cualitativa de especies de partículas derivadas a partir de la medición de la luz dispersa por la partícula que se recolecta por una disposición ce sensores ópticos que rodean la partícula suspendida, de una forma conveniente y confiable . En más detalle, la luz dispersa por la partícula suspendida se detecta per la disposición de sensores y se convierte en una señal eléctrica, por ejemplo un voltaje. El voltaje a partir de cada sensor se mete dentro de un oorr.pcnence de medio modificador en donde los voltajes se digitalizan y los valores resultantes se usan como huellas cara la identificación de canículas . El componente modificador único comprende íórmuias de predicción derivadas a partir de uno o más conjuncos de histograma de probabilidad ci una dimensión o de dimensiones múltiples empíricamente consiste de histcgramas de probabilidad individuales, que dan la probabilidad que los "/alores percibidos de combinaciones especificas de voltajes aigitalirados se han producido por una especie de partículas especificas. Asi, el componente modificador único del sistema de la invención interpreta las señales mecidas como "especificas de especie" cuando las fórmulas de predicción resultan en valores de probabilidad que sen grandes para una especie específica. En una forma de modalidad, el método de la invención para detectar rápidamente e identificar partículas microscópicas para la medición cuantitativa y cualitativa comprende los pasos de: a) suspender la partícula para ser identificada en un fluido control contenido dentro de una cámara de muestra; b) sostener la cámara de muestra en una orientación prescrita con respecto a una fuente de luz intensa; c; iluminar la cámara de muestra con la fuente de
d) recolectar y medir la luz esparcida a partir de la cámara de muestra por medio de una disposición de sensores ¿pelees que rodean la cámara de muestra; = ) convertir una s lica de voltaje a partir de la disposición, de sensores en una señal digital conforme la partícula casa a través de la fuente de luz intensa; y histogrsmas ele probabilidad y clasiricar estadísticament los ciatos resultantes para identificar las partículas microscópicas presentes. De acuerdo con la presente invención, la biblioteca 5 consiste de histogramas para cada especie de partículas abarcadas por un algoritmo de cla ificación estadístico que calcula las probabilidades de que la señal asociada fuera producida por aquellas especies de partículas. El histograma as probabilidad se deriva empíricamente a partir de una 0 medida de frecuencia con que una especie de micropartí culas se asocia con un rango específico de valores de una combinación matemática de ios voltajes del sensor digitalí zados . Así, el histograma de frecuencia de ocurrencia puede producirse para una combinación matemática, es decir, 5 un análisis de una dimensión c alternativamente, puede producirse para combinaciones matemáticas múltiples simultáneamente, es decir, un análisis de dimensiones múltiples . ?? una forma de modalidad actualmente preferida, el C aparate ce la invención cómpreme, en combinación: a' un láser polarizacic que produce una parte central del haz; ' un armazón óptico que incluye detectores ci luz múltiples, cada detector cié luz eticado alrededor y orientado tara ver, sin oscuridad, una región común respecto a la parte central del rayo láser; c) una cámara de mués- ra para contener una muestra de fluido para ser analizada; di medios para sostener la cámara de muestra en una orientación prescrita con respecto a la parta central del rayo láser y en la región común respecto a los detectores de luz ; e) medios para causar que las partículas en la muestra circulen a través de la parte central del rayo láser, f) medios para cubrir la fuente de luz y el armazón óptico para crear un recinto obscuro; g) medios para convertir los valores de intensidad de luz medidos por los detectores en valores digitales; h) medios para ingresar continuamente los valores digitales dentro de una computadora; i) medios para determinar cuándo ha ingresado una partícula en el haz de luz en la región común de consideración con base en las medicas digitalizadas ; ? ) medios para convertir ios valores digitalizados en valores calibrados; k) medios para extraer lescriptores de Eventos a partir de los datos de eventos digitalizados y calibrados ; i'¡ medios para calcular ios valores de la Función Discriminante a partir de los Descriptores de Eventos; m; medios para definir histogramas de probabilidad que permiten el cálculo de la probabilidad de que un valor de Función Discriminante calculada a artir de que los valores de raedicrón fueran causados por una especie de partículas específicas ; n) medios para identificar las Funclon s
Discriminantes más efectivas. o) medios para almacenar los histogramas de probabilidad y las Funciones Discriminantes en una Biblioteca de Identificación, un his tograma para cada especie de partícula que puede identificarse y cada Función Discriminante ; p) medios para retirar histogramas de probabilidad previamente almacenados y Funciones Discriminantes, un nistograma de probabilidad para cada especie de partícula que puede identificarse con la Biblioteca de Idennificación y cada Función Discriminante; c medios para calcular la probabilidad para cada especie de partícula en la biblioteca para un valor dado de una Función Discriminante; r; medios para combinar las probabilidades para cada especie de partícula que puede identificarse con la Biblioteca ae Identificación: y s) medios para identificar la partícula desconocida casados en un umbral.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es un diagrama de flujo que muestra los Dssos para crear una Biblioteca cié Identificación y para identificar partículas usando la Biblioteca de Identificación usando la forma de una modalidad preferida de esta invención; la figura 2 es un esquemático del sistema de identificación completo; la Figura 3 es un acercamiento de la parte central del rayo láser. Si el láser tiene un perfil de intensidad Gausiano, las partículas esféricas que pasan a través del rayo láser esparcirán luz que tiene una forma Gausiana versus tiempo; y la Figura 4 muestra tres istogramas de frecuencia de ocurrencia normalizados. Estas gráficas muestran los resultados para los datos médicos de tres especies de partículas : una muestra de esferas ce poliestireno de 1.588 ± 3.125 mi rómetros de diámetro desviación estándar de 0.016 micrómetrcs ¡ , Giardia lambíia y Cryptosporidium parvum. La presente invención proporciona un método único y aparato para un método de identificación ele partículas microscópicas basado en un análisis estadístico de datos m didos. £1 método depende de ores partes interreiacionadas véase Figura 1) . El instrumento ce medición y los sistemas de procesamiento de datos iniciales; la creación as una Biblioteca de Identificación; y el uso de la Biblioteca de II
Identificación. Esca invención proporción.; los medies para delectar e identificar rápidamente microbios y otros tipos de partículas. El sistema se basa en una medida y análisis de la luz esparcida de partículas conforme pasan a través de una fuente de luz combinada intensa. Cuando las partículas son comparables a y algo más grande que la longitud de onda de la luz incidente, la luz se difracta predominantemente de la partícula, esparciendo energía de luz en todas las direcciones . La intensidad de la luz en las diversas direcciones depende explícitamente del tamaño y forma de la partícula y longitud de onda as la luz incidente. En principio, uno puede calcular un tamaño y forma de partícula a partir de una medida de resolución angular alta de la intensidad de la luz y la fase electromagnética de toda la radiación esparcida. Esto, de hecho, es una práctica común en el espacio aéreo cuando se trata con las sintonías de radar de ios vehículos. Sin embargo, esta técnica es impráctica cuando se trata con luz visible. Auicionalmente , el tamaño y forma exacta de las partículas, tales como bacterias, no es útil para la identificación deioide a variaciones de tamaño y forma naturales. De acuerdo con la presente invención, se crcoorcionan sistemas para la icertificación de partículas ai m dir solamente una parte pequeña de la luz esparcida. Ai comoarar el resultado medido con r. - biblioteca de med ciones previamente hechas, realizadas sobre una diversidad de tipos de partículas, se logra la ider.!::rficación de partículas recisa. Las siguientes definiciones serán de ayuda para crear una descripción más ccmpieca de las modalidades ie ieridas . El término "fluido" significará un medio líquido o gas . El término "luz" significará radiación electromagnétic . El término "región común de consideración" significará una pequeña región en el espacio que se ve simultáneamente por todos los detectores de luz. El término "sin oscuridad" significará sin bloqueo visual, combadura o viñeta. El término "transparer.ee" significará ópticamente transparente a la longitud de onda ce luz empleada. El término "cámara de muestra" significará un recinto transparente que contiene la muestra. El Término "detectores" significarán un dispositivo electrónico que es sensible a la luz y convierte la luz incidente en un volta e c corriente con magnitud proporcional 5 la intensidad de luz incidente. El término "armazón óptica" significará la armazón, El término "aplicar calibración" significará hacer correcciones a los datos medidcs iniciales tal que las mediciones de los estándares resultará en valores correeros. El término "especies de partícula" significarán una clase individual de partículas tal como una especie de un microorganismo o polen o el tipo de artículo tal como glóbulo rojo, etc. El término "evento" significará un conjunto de daros de luz esparcida medidos y tomados conforme una partícula pasa a través del haz de luz. El término "histograma ae frecuencia de ocurrencia" significará una medida de qué tan frecuentemente la medición de una especie de partícula resulta en un rango de valor específico para un cálculo dado de una combinación matemática de mediciones específicas. ?1 término "histograma de probabilidad" significará un histograma de frecuencia de ocurrencia normalizado tal que el área bajo la curva (el case de ce dimensión) o el volumen bajo la curva (el caso de dimensiones múltiples) es uno. En una forma abarcada, e_ método de la invención para detectar e identificar rápidamente partículas microscópicas para la medición cuantitativa y cualitativa (la tercera de las tres partes itterrelacionadas ) usa el instrumento de medición mostrado er. ia Figura 2 y ccrr.crende los pasos de : a) suspender la partícula para ser identificada en un agua de calidad ultra-alta ceno anida dentro de un frasco de vidrio; b) mantener el frasco ae muestra en una fuente de láser intensa tal que la parte central del haz pasa a través del centro; c) recolectar y medir la luz esparcida a partir del frasco de vidrio por medio de u a disposición de sensores ópticos que rodean la cámara de muestra; d) convertir una salida de voltaje a partir de la disposición de sensores en una señal digital conforme pasa la partícula a, través de la fuente de luz intensa; y e) comparar la señal derivada con al menos un conjunto de histogramas de probabilidad para identificar las partículas microscópicas presentes. En consecuencia, la íder.tificación de una especie de partícula procede ai medir inicialmente un número estadísticamente significativo de esa especie y deducir la información pertinente a partir de las mediciones. Después de recolectar y archivar la información relevante en una Biblioteca de Identificación, la identificación de las partículas desconocidas procede per comparación de nuevas mediciones ccri la biblioteca archivada de características de £1 sistema utiliza luz esparcida de partículas que casan a través de la fuente de .Luz intensa. La Fiqura 2 muestra un esquema de una forma acareada de un experimento para medir la luz esparcida y realizar la creación de la biblioteca y la identificación do partículas. Un armazón :prico proporciona la armadura para soportar los detectores ópticos y restringir el campo de visión a una región común sencilla de consideración. Los detectores ópticos recolectan y miden la intensidad de la luz esparcida fuera de una cámara de muestra. Un subsistema Procesador de Eventos digitaliza continuamente el voltaje generad:; por los detectores y percibe el voltaje digitali extraer dinámicamente una señal base y para determinar cuando una partícula pasa a través del rayo láser. Cuando el Procesador de Eventos detecta una partícula que pasa a través del rayo láser, el procesador mantiene el voltaje digitalizado a partir de cada detector casta que la partícula pasa completamente a través del rayo, después de que la partícula pasa a través del rayo, el Procesador de Eventos se aplica a la calibración, extrae después a partir de los datas digitaiizados , datos específicos (Descriptores de Eventos) requeridos por el a_ocritmo de identificación de partículas y pasa a los descriptores al subsistema procesador ID. 11 subsistema de Procesador ID usa ios Descrecieres de Eventos para formar valores de Función Discriminante para referencia cruzada dentro de la Biblioteca de Identificación ae especies de partículas . La biblioteca contiene numerosos conjuntos de histogramas de procabilidad que pueden usarse para calcular la probabilidad de que los valores de Función Discriminante perceptibles resultan de especies de partícula específicas . El Procesador ID usa los histogramas de probabilidad y un algoritmo de clasificación estadístico para ceducir la identidad de la partícula que pasa a través del rayo láser. El Procesador ID presenta la identidad de la partícula en el exhibidor. Así, la primera etapa de proceso de la invención crea la Biblioteca de Identificación utilizando un gran número de mediciones por el instrumento de medición. La segunda etapa del proceso de la invención usa el instrumento de medición y la biblioteca para identificar partículas desconocidas . Entender el proceso de creación de la biblioteca ciepende de entender les daros medidos para una partícula esférica. Cuando una parólenla esférica pasa a través del rayo co_inado, los fotodetectores miden una intensidad dependiente del tiempo dependiente de la velocidad de la canícula y el perfil de inmensidad de sección transversal oel láser. La Figura 3 muestra que cuando el láser tiene un perfil de intensidad de sección transversal Gausiana, una partícula esférica endra también una intensidad de luz esparcida Gausíana versus tiempo .noca: la partícula es mucho más pequeña que el diámetro del rayo) . Así, v(d,z), el voltaje medido en el detector, o, como una función del tiempo, t, es también Gausiano. La misma particula que pasa a través de la parte central cel haz a lo largo de rutas diferentes mostrará perfiles Gausianos con diferentes magnitudes. Dividiendo los valores medidos, en cada instante de tiempo, por una suma de uno o más de los valores del detector en el mismo instante de tiempo elimina alta dependencia de la ruta. Así: v' (d,t) = v(d,t) / ? :. v:d',t) . Ecuación (1)
.Aquí, df es alguno o codos los detectores. Cuando las partículas son esféricas, ios valores normalizados v'(d,t), son constantes siempre y cuando La fuerza de la señal sea suficientemente grande. Adicionalmente , el valor es independiente de la ruta tomada cor la partícula conforme pasa a través del rayo láser. ?1 valor de la 'proporción para partículas esféricas a partir de la ecuación ; 1) es preoecíble cuando se conoce la longitud de onda, diámetro de partícula y el índice de refracción de la partícula y el fluido. Así, para partículas esféricas, es suficiente usar u valor proporcionado sencillo a partir de cada detector para caracterizar la partícula que casa a través del haz. Estos valores proporcionados sencillos a partir de cada detector se llaman Descriptores de Eventos puesto que describen únicamente la fuente del evento, esto es, la partícula que causó el evento. En lo seguiente, ED (d) representará el Descriptor de Eventos para el detector d, esto es, ED (d) = v' (d,t-,) donde t es un instante especificc en ei tiempo. Cada partícula esférica con el mismo tamaño producirá los mismos Descriptores de Eventos, ED (d) . Así, dada una medición de un evento de partícula esférica, el diámetro de la partícula puede derivarse, en principio, a partir de los valores de los Descriptores de Eventos. Cuando la partícula no es una esfera, los Descriptores de Eventos de la ecuación (1) ya no son constantes. Una gráfica de v' (d,t) versus tiempo no resultará en líneas rectas. La forma de la curva depende de la orientación de la partícula conforme pasa a través del haz. La misma partícula que pasa a través del rayo láser repetidamente producirá una diversidad de formas de gráficas. Igualmente, partículas diferentes de la misma especie de partícula también producirán una diversidad de formas de gráfica. Come resultado, les Descriptores de Eventos como se describieron anteriormente dependen del tiempo. En consecuencia, para contar partículas no esféricas, ei concepto del Descriptor de Eventos se relaja para denotar dates que simplemente son característicos del evento aún cuando ei valor del descriptor puede no ser constante en el tiempo para las especies de partículas. El método de identificación requiere un esquema especifico para extraer Descriptores de Eventos a partir de les datos del evento. Existe una diversidad de esquemas. Dos son : 1. Seleccionar un valor de Descriptor de Eventos que sea el valor máximo de ED(á,z) = v'(d,t) logrado durante el evento. Esto es: EDd = max (v (d,t) /?d> v(d',t)). 2. Seleccionar un valor de Descriptor de Eventos que sea el valor de ED(d,tn) = v' (d,tn) en el tiempo, tn- , cuando el valor vf (dn,t) es un máximo para un detector específico, dnr durante el evento. Esto es: EDd = v (dr t ' n) /?d< v(dr ,t'n) en donde t'n es el tiempo cuando el detector d = n es un máximo . Puesto que los datos de eventos medidos cuando una partícula no esférica pasa a través del rayo láser dependen de su orientación, uno no puede identificar directamente la partícula aada en los valores del Descriptor de Eventos. Sin emóargo, uno puede usar un análisis estadístico para predecir que sea la partícula. Midiendo muchas partículas de las mismas especies producirán una familia de valores de Descriptor de Eventos. La familia de valeres describe el rango de valores que los Descriptores de Eventos toman. Es o
de frecuencia de ocurrencia versus valor del Descriptor de Eventos resulta en una gráfica similar a la de la Figura 4. Como indica esta gráfica, el rango de valores para los Descriptores de Eventos es limitado y, más importantemente, algunos valores son más probables que otros . Una gráfica de histograma de frecuencia de ocurrencia para una especie de partícula diferente resultará en una gráfica de histograma algo diferente puesto que las partículas tendrán diferente tamaño, forma o características ópticas. la Figura 4 muestra gráficas de histograma normalizadas para tres diferentes especies de partículas: Gíardia lamblia, Cryptosporidium parvum y una muestra de ceras de poliestireno de 1.588 micrómetros de diámetro para un Descriptor de Eventos, ED . Dado un valor medido específico para EDlr tal come el punto sobre la gráfica, uno puede decir que la partícula es probablemente una Giardia lamblia o Cryptosporidium. De igual manera, si el valor es ß, entonces la partícula es probablemente una esfera de 1.588 micrómetros de diámetro. Sin embargo, la identificación no es absoluta. En ambos puntos a y |3, aún existe una oportunidad nc cero que el evento fuera caus oo por cualquiera de tres especies de partícula. E identemente, el proceso requiere información adicional para aumentar la probabilidad de una identificación precisa, la información adicional viene de usar otro ccr.1ur.to de histogramas para un Descriptor de Eventos diferente, ED? y asi sucesivamente. El proceso de identificación se vuelve una materia para deducir una especie de partícula a partir de la probabilidad de que los valores del Descriptor de Eventos medido fueron producidos por las partículas diferentes en el conjunto de datos de las curvas prs-medidas del histograma. El conjunto de datos de ios histogramas pre-medidos normalizados se llama una Biblioteca de Identificación. La etapa de Creación de la Biblioteca inicia con los Descriptores de Eventos extraídos a partir de los datos de eventos y procesados por el instrumento de medición. Los Descriptores de Eventos se reorganizan dentro de un conjunto grande de Funciones Discriminantes. Se calculan los histogramas de probabilidad para cada función y cada especie de partícula diferente a ser incluida en la biblioteca. Se calcula la fuerza de cada Función Discriminante para proporcionar distinción de especie a especie. Las mejores Funciones Discriminantes se identifican y los datos pertinentes se guardan para uso por el procedimiento de identificación. Las Funciones Discriminantes mejoran la distinción e tre las especies de partículas. Se consideran datos para dos diferentes diámetros esféricos. "Jnc encuentra casos en donde el valor EE_- es g a de para u a esfera y pequeño para la otra esfera mientras que ED? es pequeño para la primera, esfera y grande para la segunda. En este caso, la proporción ED¡/ED_- es un buen discriminador entre dos esferas diferentes. Esta proporción es grande para un diámetro de esfera y pequeño para la otra. En este caso, un histograma para los valores que resultan a partir de la Función Discriminante DF^EDi/'ED2 mostrará mayor separación entre las curvas para las dos especies de partículas diferentes que los histogramas de los Descriptores de Eventos individuales . Las Funciones Discriminantes son simplemente generalizaciones del concepto del Descriptor de Eventos. Por ejemplo, las siguientes tres relaciones entre los Descriptores de Eventos son cada una Funciones Discriminantes: DF^EDÍ, DF2=1/ED2 y DF3=ED1/ED2. Puesto que las Funciones Discriminantes incluyen los Descriptores de Eventos individuales, la siguiente discusión solamente usará la Función Discriminante. Los histogramas son fáciles de usar cuando se normalizan. Esto es, el área bajo la curva es uno (el caso de una dimensión) o el volumen bajo la curva es uno (el caso de dimensiones múltiples) . Las curvas resultantes son entonces como densidades de probabilidad. Estes histogramas de probabilidad dan ahora directamente la probabilidad de eme un valor de Función Discriminante específico resultara a oartir de una medición de una especie de partícula específica.
Come se describió anteriormente, un histoorama de probabilidad para cada especie de partícula no puede clasificar un Evento medido como una especie de partícula específica. En consecuencia, se requiere un conjunto de densidades derivadas a partir de un conjunto de Funciones Discriminantes. Desafortunadamente, pueden existir Funciones Discriminantes que no presentan buena separación entre las curvas del histograma de probabilidad para diferentes especies de partículas como se demuestra en la Figura 4. Mientras que la separación entre Giardia y las esferas y entre Cryptosporidium y las esferas es buena, la separación entre Giardia y Cryptosporidium no es muy buena. En consecuencia, la Función Discriminante graficada en la Figura 4 no proporciona distinción de información de identificación útil entre Giardia y Cryptosporidium. La selección de cuál conjunto de Funciones Discriminantes usar para identificación es crucial: las Funciones Discriminantes no pueden seleccionarse ai azar. Adicionalmence , no existe una razón a cnci'i cara seleccionar un conjunto de Funciones Discriminantes sobre otro. Afortunadamente, dadas las capacidades de alta velocidad y el manejo de datos grandes de las computadoras modernas, uno puede calcular simplemente las l es laades para un conjunto granee de funciones, clasificar _C5 resu_taaos e identificar aquellos que proporcionan buena separación entre las curvas y el histograma de probabilidad para especies de partículas individuales. Ccn el mejor conjunto de realización de Funciones Discriminantes identificados, la Biblioteca de Identificación puede crearse y archivarse. La Biblioteca debe contener una lista de las especies abarcadas por los histogramas de probabilidad. Cada conjunto de histogramas de probabilidad debe tener su Función Discriminante asociada. Para identificar partículas desconocidas con la Biblioteca de Identificación, cargar la biblioteca dentro de la memoria de la computadora de identificación. El instrumento de medición y el procedimiento de análisis de los datos iniciales mide la partícula desconocida y extraen datos del Descriptor de Eventos como se describió. El procedimiento de identificación comienza midiendo y recolectando los datos para una partícula cesconocida conforme pasa a través del rayo láser. El Procesador de Eventos dígitaliza las señales resultantes y extrae ios datos del Descriptor de Eventos a partir del evento. El Procesador de Eventos pasa después los datos del Descriptor de Eventos al Procesador ID que intenta identificar la partícula. £1 Procesador ID comienca calculando valores para las Funciones Discriminantes a partir de los Descriptores de Eventos para el primer conjunto de histogramas de probabilidad en la biblioteca. Examinando o interpolando los valores de probabilidad a partir del histograma de probabilidad para cada especie de partículas respectivas y aplicando un algoritmo de clasificación estadístico determina la probabilidad de que una especie de partículas específicas generará estos valores de Función Discriminante. El resultado es una disposición de probabilidades asociada con estas primeras Funciones Discriminantes: p(dfr especie) , en donde df en este caso es el número de conjuntos de función discriminante, 1 en este caso - esto es, es el primer conjunto de Funciones Discriminantes. El Procesador ID repite este proceso para todos los procesos de Funciones Discriminantes y sus histogramas de probabilidad asociados en la biblioteca . Un algoritmo de clasificación estadístico posible usa el conjunto de valores de probabilidad descrito como p (df, especie) , en donde df es la Función Discriminante específica y especie es la especie de partícula, en la siguiente forma. Las probabilidades para cada especie de partícula diferente (especie) se combinan para formar un valor de probabilidad sencillo para esta especie: p (especie) = ?af W(df) x p(dfr especie) , en donde W ( df) es una ponderación del histograma de probabilidad que resulta a partir del conjunto de Función íiscrimiriante , df. La identificación de la especie de partículas ocurre por la apropiada interpretación de estos valores de probabilidad final. Una interpre ación abarcada es usar umbrales. Si p (especie) > t (especie) , en donde t (especie) es el valor de umbral para una especie de partículas específicas, y todos los otros valores son menos que sus umbrales, entonces la partícula se identifica como esa especie. Si más de una probabilidad está arriba de su umbral respectivo o si ninguna probabilidad está arriba del umbral, entonces la partícula no puede identificarse. En una forma de modalidad actualmente preferida, el aparato de la invención comprende, en combinación: a) un láser polarizado que produce una parte central del haz; b) un armazón óptico que incluye detectores de luz múltiples, cada detector de luz ubicado alrededor y orientado para ver, sin oscuridad, una región común respecto a la parte central del rayo láser; c) una cámara de muestra para contener una muestra de fluido para ser analizada; d; medios para sostener la cámara de muestra en una orientación prescrita con respecto a la parte central del rayo láser y en la reqión común respecto a los detectores de
e ; medios para causar que las partículas en la muestra circulen a través de la parte central del rayo _áser, f) medios para cubrir la fuente de luz y el armazón óptico para crear un recinto obscuro; g) medios para convertir los valores de intensidad de luz medidos por los detectores en valores digitales; h) medios para ingresar continuamente los valores digitales dentro de una computadora ; i) medios para determinar cuándo ha ingresado una partícula en el haz de luz en la región común de consideración con base en las medidas digitalizadas ; j) medios para convertir los valores digitalizados en valores calibrados; k) medios para extraer Descriptores de Eventos a partir de los datos de eventos digitalizados y calibrados; 1) medios para calcular los valores de la Función Discriminante a partir de los Descriptores de Eventos; m) medios para definir histogramas de probabilidad que permiten el cálculo de la probabilidad de que un valor de Función Discriminante calculada a partir de los valores de medición fueran causados por una especie de partículas específicas; n medios para identificar las Funciones Discriminantes más efectivas. z' medios para almacenar los histogramas de probabilidad y las Funciones Discriminantes en una Biblioteca de Identificación, un histograma para cada especie de partícula que puede identificarse y cada Función Discriminante; p) medios para retirar histogramas de probabilidad previamente almacenados y Funciones Discriminantes, un histoqrama de probabilidad para cada especie de partícula que pueoe identificarse con la Biblioteca de Identificación y cada Función Discriminante; q) medios para calcular la probabilidad para cada especie de partícula en la biblioteca para un valor dado de una Función Discriminante; r) medios para combinar las probabilidades para cada especie de partícula que puede identificarse con la Biblioteca de Identificación: y s) medios para identificar la partícula desconocida basados en un umbral.