MXPA02001450A

MXPA02001450A - Matrices hibridas y mezclas de matriz hibridas.

Info

Publication number: MXPA02001450A
Application number: MXPA02001450A
Authority: MX
Inventors: Rochelle Mineau-Hanschke
Original assignee: Transkaryotic Therapies Inc
Priority date: 1999-10-05
Filing date: 2000-10-04
Publication date: 2002-08-30
Also published as: AU7854500A; ATE284674T1; CN1377257A; HK1047240B; JP2003511100A; EP1221937B1; TR200200897T2; NZ518759A; WO2001024842A3; IL148962A0; BR0014503A; CA2379971A1; DE60016775D1; AU777833B2; CN1214781C; EP1221937A2; HK1047240A1; WO2001024842A2

Abstract

Una composicion que tiene un cuerpo de material de matriz elaborado de fibrillas de colageno insolubles y colocados dentro de la misma: a) una pluralidad de celulas vertebradas; b) una pluralidad de microvehiculos; y c) un agente tal como un factor que promueve vasclarizacion, una citosina, un factor de crecimiento o acido ascorbico. La invencion tambien caracteriza un metodo para el suministro de un polipeptido a un animal. El metodo involucra la introduccion en el animal de una mezcla de fluido que contiene: a) una poblacion de celulas vertebradas cultivadas, geneticamente disenadas para expresar el polipeptido; y b) una pluralidad de microvehiculos.

Description

MATRICES HÍBRIDAS Y MEZCLAS DE MATRIZ HÍBRIDAS Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud de E. U . Serie No. 09/413,715, presentada el 5 de Octubre de 1999 y la solicitud de E. U . Serie No. 09/662,037, presentada el 14 de Septiembre del 2000. El campo de la invención son los dispositivo médicos utilizados in vivo o in vitro para la producción y suministro de substancias médicamente útiles.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los medios utilizados para suministrar substancias médicamente útiles pueden afectar significativamente su eficacia. La ruta de administración estándar para muchas de tales substancias es ya sea oral, intravenosa o subcutánea. Cada una tiene limitaciones inherentes que pueden afectar la utilidad terapéutica de las substancias que están siendo suministradas. Además, muchos fármacos en base a proteína tienen vidas medias cortas y baja biodisponibilidad, factores que deben considerarse en su formulación y suministro. Aunque se han desarrollado diversos dispositivos para suministrar substancias médicamente útiles, incluyendo bombas portátiles y catéteres, aún existe una significativa necesidad de dispositivos de suministro mejorados. Muchas substancias médicamente útiles, incluyendo proteínas, glicoproteínas y algunos péptidos y hormonas no péptidas, de producen de manera más eficaz mediante células cultivadas que a través de rutas sintéticas artificiales. Las células adecuadas se cultivan típicamente en bioreactores y el producto deseado se purifica a partir de los mismos para su administración al paciente mediante medios estándares, por ejemplo, oralmente o mediante inyección intravenosa o subcutánea. Alternativamente, las células pueden implantarse directamente en el paciente, donde producen y suministran el producto deseado (ver por ejemplo, las Patentes de E. U . Nos. 6,063,630 y 6,054,288). Aunque este método tiene varias ventajas teóricas sobre la inyección del producto en si , incluyendo la posibilidad de que los mecanismos de retroalimentación celular normales puedan aprovecharse para permitir el suministro de niveles fisiológicamente adecuados del producto, introduce complejidades adicionales. Una de estas se refiere al ambiente adecuado para las células en el momento de la implantación . Sería deseable organizar las células del implante en una forma que sea compatible con el ambiente natural in vivo del tipo de célula que comprende el implante (fibroblastos, por ejemplo, existen naturalmente en una red rica de matriz extracelular compuesta básicamente de colágeno). También existe una necesidad en ciertos casos de asegurar que las células implantadas permanezcan localizadas en un sitio definido en el cuerpo del paciente, a fin de que puedan monitorearse y tal vez retirarse cuando ya no sean necesarias. Una técnica que se ha examinado para este propósito utiliza un dispositivo de implantación que consiste en una pieza unitaria, sólida de gel de colágeno (una "matriz de colágeno") en la cual las células se incrustan (por ejemplo, Bell, U .S. Patent No. 4,485,096 and U .S. Patent No. 5,965, 125). Otras substancias, tales como fibras de politetrafluoro- etileno (PTFE) (Moullier et al. , Nature Genetics, 4: 154, 1993; WO 94/24298), pueden incluirse en el implante de colágeno para impartir resistencia u otras características deseables al gel de colágeno.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se ha encontrado que la función de las matrices de colágeno pueden mejorarse substancialmente mediante la adición de microvehículos (es decir, microesferas de cualquier forma) en al matriz de colágeno, formando así, lo que se llama en la presente una "matriz híbrida". Esto puede llevarse acabo al mezclar los microvehículos con las células y colágeno soluble antes de la gelificacíón del colágeno para formar la matriz. Con objeto de mejorar la disponibilidad, crecimiento y/o función de las células incrustadas, las matrices de la invención pueden contener substratos sólidos (por ejemplo, perlas de agarosa, perlas de colágeno, filamentos de colágeno o fibras de colágeno o diferentes a colágeno) cubiertos con o encapsulando uno o más de los agentes listados a continuación. Los solicitantes también han descubierto que las células pueden introducirse en el cuerpo de un animal al suspender microvehículos y las células (y substratos sólidos opcionales asociados con (por ejemplo, enlazados a, cubiertos con o encapsulando) uno o más de los agentes listados a continuación) en un fluido y la introducción de la suspensión en el cuerpo, por ejemplo, mediante inyección. La suspensión puede incluir colágeno soluble además de las células, microvehículos y substratos sólidos cubiertos con o encapsulando cualquiera de los agentes aquí descritos. Estos componentes se mezclan juntos y suministran en el *r cuerpo de un animal como una suspensión líquida. El suministro puede ser a través de un sistema inyectable tal como una jeringa con una aguja o catéter anexos. El uso de microvehículos macroporosos incrementa significativamente el área superficial para el anexo celular y también puede proporcionar protección para las células que se anexan y migran hacia los poros de los microvehículos. En mezclas que contienen colágeno, la porción del colágeno se polimeriza para formar una masa sólida de gel de colágeno en el cuerpo del animal en el sitio de suministro. Este gel se forma in situ alrededor de los componentes suspendidos (células, microvehículos y substratos sólidos opcionales). El gel puede ayudar a mantener los componentes inyectados en un espacio definido, las dimensiones del cual dependerán del volumen del material implantado, las dimensiones espaciales del sitio de implante y la estructura del tejido circundante. La presencia de colágeno puede proteger a las células del esfuerzo cortante que ocurre durante el proceso de implantación. Además, el colágeno puede ayudar a disminuir la destrucción potencial de las células implantadas mediante las células inflamatorias del huésped al proporcionar una barrera protectora. Las mezclas con colágeno se llaman "mezclas de matriz de colágeno" (CMM) y las matrices sólidas formadas mediante el uso de CMM (ya sea in vivo o in vitro) se llaman "matrices de colágeno" (CM). Si se desea, los microvehículos y células pueden cultivarse en conjunto durante un período que permita que las células se adhieran a los microvehículos antes de la adición de la solución de colágeno no gelificada y los substratos sólidos. Alternativamente, los tres o cuatro constituyentes ¥>er ^ - 5 - pueden mezclarse esencialmente de manera simultanea o en cualquier orden deseado, seguidos si se desea, por la gelificación del colágeno soluble in vitro, para formar una mezcla gelificada que consiste en fibrillas, células y microvehículos. La mezcla gelificada se vuelve gradualmente 5 más pequeña a través de la exclusión de líquido, para formar una unidad implantable, relativamente elástica, sólida que contiene tanto los microvehículos como las células (y substratos sólidos opcionales asociados con (por ejemplo, enlazados a, cubiertos con o encapsulando) cualquiera de los agentes listados a continuación) incrustadas en la red de 10 fibrillas de colágeno insolubles. Cuando se incluyen los microvehículos, la CMM resultante es llamada en la presente una "mezcla de matriz de colágeno híbrida" (HCMM) y una matriz producida a partir de tal HCMM es llamada una "matriz de colágeno híbrida" (HCM). Las mezclas sin colágeno o con una alternativa de colágeno (ver abajo) se llaman "mezclas 15 de matriz"; cuando tales mezclas contienen microvehículos, también se designan "mezcla de matriz híbrida" ("HMM"). Se entiende que los microvehículos pueden elaborarse de colágeno o substancias diferentes al colágeno. La invención incluye así un artículo, composición o dispositivo 0 que tiene un cuerpo elaborado de material de matriz que incluye fibrillas de colágeno insolubles y colocados dentro del cuerpo: (a) una pluralidad de células vertebradas (particularmente células de mamífero tales como células derivadas de un humano, chimpancé, ratón, rata, hámster, conejillo de indias, conejo, vaca, caballo, 5 cerdo, cabra, oveja, perro o gato); iáAá..¡Sj.Á,? dta . ¿feü . (b) uno o más agentes (ver abajo) asociado con (por ejemplo, enlazado a, cubierto sobre o encapsulado por) un substrato sólido; y (c) una pluralidad de microvehículos, cada uno de los cuales 5 consiste preferentemente, básicamente en (es decir, más del 50% de su peso seco es) una o más substancias seleccionadas a partir de una lista que incluye colágeno (preferentemente colágeno de tipo I), poliestireno, dextrano, poliacrilamída, celulosa, alginato de calcio, látex, polisulfona, vidrio (por ejemplo, vidrio cubierto con un gel tal como colágeno, para 10 mejorar la adherencia de las células) y gelatina (por ejemplo, gelatina porosa). Generalmente, al menos 70% y preferentemente al menos 80% (más preferentemente entre aproximadamente 90% y aproximadamente 100%, por ejemplo al menos 95%) de cada peso seco de microvehículo es una o más de las substancias listadas. Los ejemplos comerciales de 15 microvehículos que se describen como consistentes esencialmente de colágeno purificado incluyen perlas de ICN Cellagen™ y Hyclone Gelatin Cultispheres. Los microvehículos son preferentemente de una consistencia porosa, pero pueden ser suaves y típicamente tienen una forma aproximadamente esférica con un diámetro de aproximadamente 0.1 20 hasta 2 mm (por ejemplo, entre aproximadamente 0.3 y 1 mm). Por supuesto, la forma y el tamaño de los microvehículos de cualquier lote o preparación en particular variara dentro de las tolerancias de elaboración. El artículo puede configurarse para ser implantado en un animal, por ejemplo, un mamífero tal como un paciente humano, o puede 5 diseñarse para producir productos celulares in vitro; por ejemplo, en un *& &*. jara o e oreactor ex racorpora que tiene un medio para disparar sangre desde un animal hasta el artículo y después de regreso hacia un vaso sanguíneo del animal, o en un bioreactor u otro recipiente a partir del cual el medio que contiene el producto celular deseado puede recuperarse para purificación y la preparación de un agente farmacéutico. Las células pueden derivarse de una o más células retiradas del paciente y preferentemente son células genéticamente diseñadas (por ejemplo, transfectadas) que contienen ADN exógeno que codifica uno o más polipéptidos (por ejemplo, polipéptidos médicamente útiles) tales como una enzima, hormona, citosina, factor de estimulación de colonia, factor de angiogénesis, antígeno de vacuna, anticuerpo, factor de coagulación, proteína reguladora, factor de transcripción, receptor o proteína estructural. Los ejemplos de tales polipéptidos incluyen hormona de crecimiento humana (hGH), Factor VIII, Factor IX eritropoietína (EPO), albúmina, hemoglobina, alfa-1 antitripsina, calcitonina, glucocerebrosidasa, receptor de lípoproteína de baja densidad (LDL), receptor de IL-2 globinas, inmunoglobulinas, anticuerpos catalíticos, las interleuquinas, insulina, factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF- 1 ), insulinotropina, hormona para tiroide (PTH), leptina, un interferón (IFN) (por ejemplo, IFN-a, IFN-ß, o IFN-?), factores de crecimiento de nervios, factor de crecimiento de fibroblastos básicos (bFGF), FGF acídico (aFGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento celular endotelial, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factores de crecimiento de transformación, factor de angiogénesis de estimulación celular endotelial (ESAF), angiogenina, activador de plasmínogen de tejido (t-PA), factor de estimulación de colonias de granulosito (G-CSF), factor de estimulación de colonias de granulositos-macrófago (GM-CSF), hormona de estimulación de folículo (FSH), a-galactosidasa, ß- gluseramidasa, a-iduronidasa, iduronato 2-sulfatasa, glucosamina-N- 5 sulfatasa, a-N-acetilglucosaminidasa, acetilcoenzima A:a-glucosaminida-N- acetiltransferasa, N-acetilglucosamina-6-sulfatasa, p-galactosidasa, N- acetilgalactosamina-6-sulfatasa, p-glucordonidasa, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C Y VEGF-D. Alternativamente, el ADN exógeno puede contener una secuencia 10 reguladora y opcionalmente otros elementos que activarán la expresión del gen endógeno (por ejemplo, mediante el uso de recombinación homologa según se describe en WO94/12650-PCT/US93/1 1704, las cuales se incorporan en la presente para referencia). Generalmente, cualquier tipo de célula que es capaz de 15 anexarse a colágeno y/o los microvehículos, y que exhibe una propiedad deseable tal como expresión de un producto celular médicamente útil o desempeño de una función metabólica o estructural esencial, puede utilizarse en las matrices de la invención. Los ejemplos incluyen adipositos, astrositos, células musculares cardiacas, condrocitos, células 20 endoteliales, células epiteliales, fibroblastos, gangliocitos, células glandulares, células gliales, células hematopoyéticas, hepatocitos, queratinositos, mioblastos, células neurales, osteoblastos, células beta pancreáticas, células renales, células de músculo suave y células de músculo estriado, así como también precursores de cualquiera de los 5 anteriores. Si se desea, puede incluirse más de un tipo de célula en una ati^ .fa^» >- *i?*Ju*má.¡**i*. matriz dada. Las células pueden presentarse como poblaciones clónales o heterogéneas. Aunque las matrices de la invención no necesitan contener colágeno, preferentemente lo contienen. El colágeno en el material de matriz es preferentemente de tipo I, pero puede ser cualquier otro tipo de colágeno. El material de matriz puede incluir opcionalmente dos o más tipos de colágeno (por ejemplo, seleccionados de tipo I, II, lll, IV, V, VI, Vil, VIII , IX, X Y XI) así como también cualquier componente adicional que imparta características deseables a la matriz resultante: por ejemplo, agarosa, alginato, fibronectina, laminina, ácido hialuronico, sulfato de heparano, sulfato de dermatano, sulfato de condroitina, proteoglicanos sulfatados, fibrina, elastina, tenascina, heparina o polisacáridos tales como celulosa, almidón, dextrano o quitosan. Además, ya sea el lugar de colágeno o además del colágeno, las siguientes substancias pueden incluirse en las matrices, ya sea para dotarles las propiedades del colágeno o para mejorar tales propiedades: tejido adiposo atenuado, tejido omental atenuado, celulosa de metilo, alginato, gelatina o fibrina. Cualquiera de los componentes de colágeno y diferentes al colágeno mencionado con anterioridad, pueden derivarse de fuentes humanas o de otras fuentes animales o de plantas. Si es de una fuente animal y es potencialmente inmunogénico, preferentemente es el mismo animal que el sujeto en el cual esta por implantarse. Uno también podría incluir fibras de colágeno o diferentes al colágeno colocadas dentro del dispositivo. Las fibras de colágeno pueden encontrase en la forma de filamentos de colágeno degradados, dispersos dentro del cuerpo del material de matriz. las fibras diferentes a colágeno pueden elaborarse, por ejemplo, de un material que incluye nylon, dacron, politetrafluoroetileno, ácido poliglicolico, mezclas de polímero de ácido polilactico/poliglicolico, poliestireno, co-polímero de polivinilcloruro, cat gut, algodón, lino, poliéster o seda. Pueden contenerse grandes números de células dentro de las matrices híbridas. Por ejemplo, pueden prepararse matrices híbridas que contienen al menos aproximadamente dos (y preferentemente aproximadamente tres) veces tantas células como las matrices preparadas con colágeno soluble solamente, suponiendo que son equivalentes el número de células inoculadas y el volumen de producción inicial. La cantidad total del polipéptido (por ejemplo, un polipéptido médicamente útil) expresada por las células incrustadas en una matriz híbrida dada en un período de tiempo dado, típicamente, significativamente mayor (por ejemplo, al menos 50% mayor, preferentemente al menos 100% mayor, y más preferentemente al menos 200% mayor) que lo logrado con una matriz de colágeno estándar, preparada a partir de un volumen equivalente de material de inicio. Las matrices híbridas de la invención también contienen uno o más agentes (por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 8 o 10) propuestos para mejorar el funcionamiento de la matriz, por ejemplo, al incrementar la proliferación y/o mantenimiento de las células. Estos agentes pueden incluir, por ejemplo, factores que promueven al vascularización, citocinas o factores de crecimiento. Aunque el agente utilizado en una matriz híbrida en particular y el polipéptido (por ejemplo, un polipéptido médicamente útil) producido por las células en la matriz pueden ser la misma substancia, las dos entidades generalmente serán diferentes El agente se asocia con (por ejemplo, se enlaza a, se cubre sobre o encapsula dentro de) un substrato sólido que se agrega a la misma mezcla. El substrato sólido pueden ser los microvehículos en si o pueden ser una entidad o entidades por separado (por ejemplo, múltiples partículas del substrato sólido o una sola pieza incrustada en la matriz). El substrato sólido puede tener heparina o proteoglicano de sulfato de heparan enlazado a esta, como un medio para promover el enlace del agente. Un ejemplo de tal substrato sólido es una que consiste básicamente en agarosa (por ejemplo, Sefarosa®, Affi-Gel™, Gel de Heparina o agarosa de Heparina) , con o sin heparina o proteoglicano de sulfato de heparan enlazado al mismo; tal substrato sólido puede contener alginato de calcio. Otras substancias a partir de la cuales pueden elaborarse los substratos sólidos incluyen colágeno, gelatina, acetato de etileno-vinilo, co-polímero de ácido polilactido/glicolico, fibrina, octasulfato de sucrosa, dextrano, glicol de polietileno, un alginato, poliacrilamida, celulosa, látex, polihidroxietilmetacrilato, nylon, dacron, politetrafluoro-etileno, ácido poliglicolico, ácido polilactico, poliestireno, co-polímero de polivinilcloruro, cat gut, algodón, lino, poliéster y seda. El substrato sólido puede encontrarse en una variedad de formas físicas, por ejemplo, perlas, partículas irregulares, laminas o filamentos. Cuando el agente se encapsula en el substrato sólido, el agente se libera gradualmente con el tiempo. Estos substratos sólidos pueden funcionar como microvehículos así como también como recipientes de agente. De esta manera, cuando una matriz en particular de la invención incluye substratos sólidos que pueden funcionar como microvehículos, no es necesario que contenga ninguno de los microvehículos arriba listados. Los ejemplos de agentes que pueden utilizarse en las matrices incluyen factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF), VEGF, VEGF- A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, factor de crecimiento de fibroblastos acídícos (aFGF), factor de crecimiento celular endotelial, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de angiogénesis de estimulación celular endotelial (ESAF), leucotrieno C4, una prostaglandina, 10 factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1 ), factor de estimulación de colonias de granulositos (G-CSF), angiogenina, factor-a de crecimiento de transformación (TGF-a), factor-ß de crecimiento de transformación (TGF- ß), ácido ascórbico, factor de crecimiento epidérmico (EGF), oncostatina M, o angiopoietina 1 ,2,3 o 4. 15 La concentración bioactiva de cada agente variara enormemente. Se proporciona un rango de inicio por el fabricante y normalmente se basa en una ensayo de bioactividad estándar mediante el uso, por ejemplo, del grado de proliferación celular como el punto final. Típicamente, el agente puede enlazarse en cualquiera de un amplio rango 20 de concentraciones (siendo la ínfima la reportada como bioactiva por el vendedor, siendo la más elevada tanto como 1000x de la concentración reportada) a un substrato tal como perlas de heparina-Sefarosa® ; las perlas se incorporan en un HCM; y la liberación del agente con el tiempo in vitro se monitorea mediante el uso de un sistema de detección adecuado 25 (por ejemplo, un inmunoensayo). Para estos ensayos de liberación, las íhatríces se colocan en un medio de crecimiento que contiene 10% de suero. Una vez que se determina que las matrices liberan cantidades detectables del agente, se lleva a cabo un ensayo de bioactividad. Las matrices que contienen un rango de concentraciones de agente pueden, por ejemplo, colocarse sobre inserciones porosas (poros de 3 a 8µm) por encima de las células que se sabe proliferan en respuesta al agente (por ejemplo, células endoteliales para VEGF y bFGF, fibroblastos para bFGF y PDGF según se indica por el fabricante) Los resultados de ensayo de bioactividad in vitro se evalúan y las dosis que no se consideran bioactivas así como también las dosis que se determinan como "tóxicas" (es decir, conducen a números celulares inferiores al control) se anotan. Con objeto de determinar la concentración óptima del agente por matriz, las matrices que contienen el agente a un rango de concentración en base a los resultados de bioactividad in vitro, pueden implantarse en ratones inmunocomprometidos. La concentración de agente óptima por matriz es típicamente la concentración que permite que la cantidad máxima de proteína terapéutica se libere para la cantidad máxima del tiempo in vivo. En lugar de (o además de) el agente descrito que se encuentra en el cuerpo del material de matriz enlazado a o encapsulado dentro de un substrato sólido, las matrices híbridas pueden contener, además de la primer población de células vertebradas cultivadas, genéticamente diseñadas para expresar un polipéptido (por ejemplo, un polipéptido médicamente útil), una segunda población de células vertebradas cultivadas que expresan y segregan uno o más (por ejemplo, al menos 2,3,4,6,8, o 10) de los agentes. Las células vertebradas cultivadas, de la gunda población pueden diseñarse genéticamente (como se describe a continuación) para expresar el agente o puede ser una célula que produce el agente sin el beneficio de la ingeniería genética. En el ultimo caso, si la célula no produce de manera constitutiva al polipéptido o lo produce en cantidades muy bajas, la célula puede inducirse para producir el agente o producirlo en mayores cantidades mediante activación genética. Las matrices de la invención pueden contener poblaciones adicionales de células vertebradas cultivadas que expresan y segregan ejemplos adicionales de los agentes arriba descritos. Las células vertebradas cultivadas de las poblaciones que producen el agente pueden ser por ejemplo, adipositos, astrositos, células musculares cardiacas, condrocitos, células endoteliales, células epiteliales, fibroblastos, gangliocitos, células glandulares, células gliales, células hematopoyeticas, hepatocitos, queratinocitos, mioblastos, células neurales, osteoblastos, células beta pancreáticas, células renales, células musculares suaves, células musculares estriadas o precursores de cualquiera de los anteriores. Las células son prefereblemente células humanas, pero pueden ser células de cualquier vertebrado (por ejemplo, un mamífero tal como un primate no humano, cerdo, vaca, caballo, cabra, oveja, perro, gato, ratón, rata, conejo, conejillo de indias o hámster). Cuando las células que producen el agente se incluyen en la matriz, uno puede incluir opcionalmente el substrato sólido también, a fin de enlazar una porción del agente a medida que se segrega a partir de las células. Esto proporciona un medio para controlar la velocidad de liberación del agente de la matriz híbrida. En una modalidad preferida, las matrices híbridas de la invención contienen queratinocitos, por ejemplo, (a) como las células que producen el polipéptido (por ejemplo, un polipéptido médicamente útil), (b) como las células que producen el agente, (c) tanto (a) como (b), o (d) como una población que no produce ni el polipéptido ni el agente. Las matrices híbridas a la cual se agregan los queratinocitos preferentemente son aquellas que contienen fíbrolastos como células que producen el polipéptido arriba descrito (por ejemplo, un polípéptido médicamente útil) y/o el agente. Los queratinocitos y los fibroblastos pueden obtenerse del mismo individuo y pueden agregarse uno o más factores de diferenciación de queratinocítos (por ejemplo, iones de calcio a una concentración de 1.5- 2r¡nM, TGF-ß, o factor 1 de diferenciación de queratinocito (KDF-1 )) a la matriz híbrida. En una manera similar, las matrices híbridas de la invención pueden contener células endoteliales, preferentemente además de los fibroblastos que producen un polipéptído (por ejemplo, un polipéptido médicamente útil) e incluso en adición tanto a fibroblastos como a queratinocitos. Las células endoteliales y fibrolastos pueden obtenerse del mismo individuo. Pueden agregarse uno o más factores de diferenciación endotelial (por ejemplo, VEGF o bFGF a 10 ng- 10µg) a la matriz híbrida a fin de inducir la formación de tubos endoteliales dentro de la matriz. Los factores de diferenciación pueden agregarse directamente a la matriz durante la formación o agregarse al medio de desarrollo de la matriz o ambos. La matriz híbrida de la invención generalmente se prepara mediante un proceso que incluye las siguientes etapas: formar una mezcla que incluye (a) una pluralidad de células vertebradas; (b) una pluralidad de microvehículos, consistiendo cada uno preferentemente en básicamente una o más substancias seleccionadas de la lista que consiste en colágeno, poliestireno, dextrano, poliacrilamida, 5 celulosa, alginato de calcio, látex, polisulfona y vidrio; (c) una solución que comprende colágeno soluble; y (b) uno o más de los agentes arriba descritos, asociados con (por ejemplo, enlazados a, cubiertos sobre o encapsulados dentro) de un substrato sólido; y originar que el colágeno soluble en la mezcla forme un gel de 10 fibrillas de colágeno insolubles en el cual se incrustan las células y los microvehículos; y exponer el gel a condiciones de cultivo que originan que el gel se vuelva más pequeño mediante la exclusión de líquido, formando así el cuerpo del artículo. La gelificación típicamente se activa al elevar el pH 15 de la solución de colágeno relativamente acídica por encima de 5, por ejemplo, mediante la adición de medio de cultivo regulado, concentrado, después de lo cual el colágeno forma fibrillas insolubles. Cuando esta etapa se lleva a cabo en un molde, el gel tomará la forma del interior del molde. Generalmente, la contracción del gel se efectúa mediante las 20 células en la mezcla, las cuales se anexan a las fibrillas y originan que el gel se contraiga hasta una versión más pequeña de la forma moldeada (por ejemplo, un disco, como en el caso donde el molde es un disco de Petri que es de forma cilindrica). La matriz puede utilizarse inmediatamente después de su elaboración, puede cultivarse para incrementar el número 25 de células presentes en la matriz o para mejorar su funcionamiento o puede criopreservarse indefinidamente a una temperatura por debajo de 0°C. También pueden almacenarse temporalmente en un refrigerador de mayor temperatura a, por ejemplo, aproximadamente 4°C. Para la elaboración de aquellas matrices híbridas que contienen uno o más de los agentes arriba descritos, se agregan los agentes relevantes (enlazados a o encapsulados dentro de cualquiera de los substratos sólidos arriba descritos) , junto con los otros componentes arriba listados, a la mezcla. El agente y el substrato sólido pueden agregarse a la mezcla juntos o por separado, en cualquier orden . De manera adicional o alternativa, la mezcla puede contener una segunda población (y, opcionalmente, una tercera, cuarta, quinta, sexta o más) de células vertebradas cultivadas que segregan uno o más de los agentes descritos. La mezcla también puede contener uno o más de los substratos sólidos arriba descritos que incluyen una o más substancias (por ejemplo, heparina o sulfato de heparano) la cual se enlaza a un agente. Para la elaboración de matrices híbridas que contienen queratinocitos, los queratinocítos pueden agregarse a la mezcla antes de la etapa de contracción o pueden agregarse al cuerpo de la composición después de que se ha contraído el gel. Al elaborar cualquiera de las matrices híbridas de la invención, el gel puede conformarse en un molde de fondo plano relleno con la mezcla hasta una profundidad de aproximadamente 0.18 cm (por ejemplo, aproximadamente 0.1 cm hasta aproximadamente 0.3 cm, preferentemente aproximadamente 0.15 cm hasta aproximadamente 0.21 cm). Por ejemplo, el gel puede conformarse en un molde cilindrico de fondo plano que tiene un radio interno ( r) mediante el uso de una mezcla que tiene un volumen (V), de tal manera que r2/V es aproximadamente 1 .8 (por ejemplo, 1 .5 a 2.0) . La ¡nvención incluye matrices h íbridas que resultan del uso de la profundidad de mezcla especifica y/o el radio especifico de r /V, y que tienen así un grosor característico. El gel puede formarse, por ejemplo, en un molde cilindrico que tiene un radio de aproximadamente 2.65 cm mediante el uso de un volumen de 4 ml o en un molde del radio que es diferente a 2.65cm (es decir, mayor o más pequeños), con un cambio proporcional de volumen de la mezcla utilizada. Un polipéptído (por ejemplo, un polipéptido médicamente útil), tal como uno arriba listado, puede suministrarse a un paciente mediante un método de tratamiento que involucra la proporción de una matriz híbrida que contiene células que segregan el polipéptido de interés y la implantación del artículo en el paciente en el sitio seleccionado, tal como un sitio subcutáneo, intraperitoneal, intraumental, capsular sub-renal, inguinal, intramuscular o intratecal. Cuando el polipéptido es uno que promueve la sanación de heridas (por ejemplo, PDG F o IGF-!), la matriz puede implantarse en el sitio de una herida pre-existente. Como se discutió con anterioridad, las células pueden derivarse de una o más células retiradas del paciente y preferentemente se transfectan in vitro con ADN exógeno que codifica al polipéptído. De manera alternativa, pueden ser células que segregan de manera natural el polipéptido o llevan a cabo la función metabólica deseada (por ejemplo, hepatocitos o células betapancreaticas) las células pueden inducirse mediante activación genética para segregar el polipéptido, segregar cantidades mayores del r iifrr^^-ffirr'iti "'"VI y %. " 1 9 " polipéptido o llevar a cabo la función metabólica deseada. Las matrices híbridas adecuadas para suministrar un polipéptido a un paciente puede ser cualquiera de aquellas arriba descritas. En otra modalidad, el polipéptido (por ejemplo, un polipéptido médicamente útil) puede administrarse al paciente mediante la desviación de una porción de la sangre del paciente a través del aparato arriba descrito, a fin de que el polipéptido segregado por las células en la matriz híbrida se mezcle con la sangre. Generalmente, cualquiera de tales aparatos conocido por aquellos expertos en el campo pueda adaptarse para acomodar la matriz de la 10 invención. Por ejemplo, la sangre desviada hacia un dispositivo que contiene una membrana selectiva de permio que rodea una matriz de la presente invención , dará como resultado el suministro de un producto terapéutico de la matriz a la sangre Un dispositivo similar a un páncreas artificial (Sullivan et al. , Science 252 :718-721 , 1 991 ) puede utilizarse para 15 este propósito. Nuevamente, cualquiera de las matrices híbridas descritas en la presente puede utilizarse para tales dispositivos. Todavía otro uso para cualquiera de las matrices híbridas de la invención es como un medio de producción de un polipéptido deseado (por ejemplo, cualquiera de los polipéptidos listados en la presente) in vitro. 20 Este método incluye las etapas de colocar la matriz híbrida bajo condiciones mediante las cuales las células en la matriz expresan y segregan el polipéptido; contactar la matriz con un líquido de tal manera que las células segreguen el polipéptido hacia el líquido; y obtener el polipéptido del líquido, por ejemplo, mediante técnicas de purificación 25 estándar adecuadas para el polipéptido dado. En una modalidad, la matriz . í. ?j ?kAy.jr.. •1*0? de ancla a una superficie y se baña por el líquido; alternativamente, la matriz flota libremente en el líquido Las células incrustadas en la matriz híbrida funcionan a un elevado nivel en un pequeño espacio. Además, la primera etapa de purificación del polipéptido expresado (retiro de las células del medio) es considerablemente más eficiente con las matrices que con la mayoría de los métodos estándares del cultivo celular. La invención también incluye una mezcla de fluidos que contiene: (a) un población de células vertebradas cultivadas (por 10 ejemplo, cualquiera de las células mamíferas arriba listadas) que generalmente expresan un polipéptido; (b) una pluralidad de microvehículos tales como aquellos arriba listados; y (c) al menos un agente seleccionado del grupo que consiste 5 en un factor que promueve la vascularización, una citosina, un factor de crecimiento y ácido ascórbico, asociándose el almenos un agente con (por ejemplo enlazado a, cubierto sobre o encapsulado dentro) un substrato sólido suspendido en la solución de colágeno. Las células pueden ser cualquiera de aquellas descritas con 0 anterioridad para utilizarse en matrices y pueden diseñarse genéticamente de manera similar para expresar los mismos polipéptidos. Aunque las mezclas de fluido de la invención no necesitan contener colágeno, preferentemente lo contienen . El colágeno en la mezcla puede ser cualquiera de los tipos listados en la presente o una 5 combinación de cualquiera de estos tipos. Existe suficiente colágeno en la ííi. ? ?..? l??iá,.í...yr ?A ,-., mezcla para permitir que se mezcle con gel a un pH por encima de 5. Las mezclas de fluido también pueden contener cualquiera de los componentes adicionales arriba listados. En lugar de colágeno o en adición al colágeno, pueden incluirse las siguientes substancias en la mezcla, ya sea para dotar a las matrices generadas a partir de las mezclas con las propiedades del colágeno o para mejorar tales propiedades: tejido adiposo atenuado, tejido omental atenuado, celulosa de metilo, alginato, gelatina y fibrina. Los microvehículos permiten que elevadas concentraciones de células se contengan dentro de las mezclas de la invención. Por ejemplo, cuando se emplea colágeno soluble a fin de que la mezcla implantada forme una matriz híbrida in situ , tal matriz híbrida tendrá las ventajas de las matrices híbridas formadas in vitro (ver arriba). Las mezclas de la invención también pueden contener uno o más (por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 8 o 1 0) de los agentes arriba descritos propuestos para mejorar el funcionamiento de la matriz generada a partir de las mezclas, por ejemplo, al incrementar la proliferación y/o mantenimiento de las células. Además, los agentes pueden agregarse a la mezcla en cualquiera de las formas descritas para las matrices, por ejemplo, libre en solución o cubierto sobre sólidos substratos. Los métodos para determinar las concentraciones bioactivas de cada agente para utilizarse en mezclas de la invención son esencialmente los mismos que aquellos descritos arriba para las matrices. Además, sin embargo, las mezclas pueden introducirse en el ratón a fin de que las matrices híbridas formen in situ antes de la elaboración de las mediciones descritas in vivo. ^ ábaadj^. ^¿¿ ^^ i ttFAíi I t¿ ?? En lugar de (o en adición a) el agente descrito que se agrega en si a la mezcla, las mezclas pueden contener, además de la primer población de células vertebradas cultivadas que expresan un polipéptido (por ejemplo, un polipéptido médicamente útil) , cualquiera de la segunda población de células vertebradas cultivadas descritas arriba con respecto a las matrices de la invención . En una modalidad preferida, las mezclas de la invención contienen queratinocítos que pueden obtenerse, jugar los mismos papeles y funcionar de la misma manera que aquellas matrices. Además, las mezclas pueden contener los mismos factores de diferenciación de queratinocito arriba listados. Además, como se describe para las matrices, las mezclas de la invención pueden contener células endoteliales y opcionalmente, los factores de diferenciación endotelial listados con anterioridad. La mezcla de la invención generalmente se prepara al combinar, en una solución acuosa, (a) una población de cualquiera de las células arriba descritas; y (b) una pluralidad de cualquiera de los microvehículos arriba descritos. Preferentemente también se agrega a la mezcla el colágeno soluble o uno o más de las alternativas arriba listadas. Para la elaboración de aquellas mezclas que contienen uno o más de los agentes arriba descritos, los agentes relevantes se agregan (enlazados a o encapsulados dentro de cualquiera de los substratos sólidos arriba descritos), junto con los otros componentes arriba listados, a la mezcla. El agente y el substrato sólido puede agregarse a la mezcla en conjunto o por separado, en cualquier orden. De manera adicional o alternativa, también puede agregarse a la mezcla una segunda (y, opcionalmente, una tercera, cuarta, quinta, sexta o más) población de células vertebradas cultivadas que segregan uno o más de los agentes descritos. Además, uno o más de los substratos sólidos arriba descritos que incluyen una o más substancias (por ejemplo, heparina o sulfato de heparano) que se enlazan a un agente que puede agregarse a la mezcla. Los queratinocitos también pueden agregarse a la mezcla. Un polipéptido (por ejemplo, un polipéptido médicamente útil) tal como uno arriba listado, puede suministrarse a un paciente mediante un método de tratamiento que involucra la proporción de cualquiera de las mezclas anteriores de la invención que contienen células (por ejemplo, células que segregan un polipéptido de interés) y la introducción de la mezcla en el paciente en un sitio seleccionado, tal como un sitio subcutáneo, íntraperitoneal, intraomental, capsular sub-renal, inguinal, intramuscular o intratecal. Cuando un polipéptido producido por las células es uno que promueve la sanación de heridas (por ejemplo, PDGF o IGF-1 ), la mezcla puede introducirse en el sitio de una herida preexistente. La introducción de la mezcla en un paciente puede ser por cualquier medio adecuado para la suspensión líquida: por ejemplo, una pipeta, un catéter o una jeringa hipodérmica opcionalmente tapada con una aguja de jeringa o un catéter. La invención incluyen un método en el cual la introducción de la mezcla en un animal ocurre substancialmente al mismo tiempo que la formación de la mezcla a partir de sus componentes (por ejemplo, las células vertebradas cultivadas, microvehículos y colágeno). Como se discutió arriba, las células pueden derivarse de una o f. . . ~ - 24 - más células retiradas del paciente y preferentemente se transfectan in vitro, con ADN exógeno que codifica el polipéptido. De manera alternativa, pueden ser células que segregan de manera natural el polipéptido o llevan a cabo la función metabólica deseada (por ejemplo, hepatocitos o células 5 betapancreáticas). Las células pueden inducirse para segregar el polipéptído, segregar cantidades mayores del polipéptído, o llevar a cabo la función metabólica deseada mediante activación genética. Las mezclas liquidas adecuadas para suministrar un polipéptido a un paciente pueden ser (a) cualquiera de aquellas arriba descritas; o (b) cualquiera arriba 10 descritas pero que carecen de microvehículos. La invención también incluyen un recipiente que contiene cualquiera de las mezclas liquidas arriba descritas de la invención. Por ejemplo, el recipiente puede ser una jeringa hipodérmica de vidrio o plástico, botella, tubo de prueba, matraz o frasco. También puede ser una 15 bolsa plástica, por ejemplo, un bolsa de sangre. El recipiente puede utilizarse, por ejemplo, para transportar una mezcla de la invención de un sitio de elaboración o sitio de venta a un sitio de uso, por ejemplo, un hospital o el consultorio medico o veterinario. La gelificación anterior a la introducción de la mezcla en un paciente puede inhibirse al, por ejemplo, 20 mantener el contenido del recipiente a una temperatura por debajo de aproximadamente 8°C. Cuando se utiliza otro tipo de recipiente, por ejemplo, un frasco o una botella, la mezcla puede transferirse a un aparato que es adecuado para la introducción de la mezcla en el paciente (por ejemplo, una jeringa hipodérmica o una bolsa de sangre) antes de que 25 ocurra la gelificación substancial. Tal recipiente de la invención puede incluirse junto con material de empaque (por ejemplo, un contenedor de empaque) en un equipo. La invención también caracteriza un equipo que incluye un contenedor de empaque que contiene: (a) un primer recipiente que contiene: (i) una población de células vertebradas cultivadas que expresan un polipéptido (por ejemplo, células genéticamente diseñadas para expresar el polipéptido) y (ii) una pluralidad de microvehículos; (b) un segundo recipiente que contiene una solución de colágeno; y (c) un tercer recipiente que contiene un medio líquido. Habrá suficiente colágeno en la solución de colágeno para permitir que se forme una mezcla al mezclar los contenidos de los recipientes de (a), (b) y (c) para el gel. La solución de colágeno puede encontrarse a un pH acídico y el medio puede encontrarse a un pH alcalino. La mezcla por introducirse en un animal se prepara desde el equipo al (a) combinar los contenidos de los recipientes segundo y tercero para formar una solución de colágeno / medio; y (b) combinar la solución de colágeno / medio con el contenido del primer recipiente para formar la mezcla. La etapa (b) y la introducción de la mezcla líquida del sujeto debe ocurrir en breve después de que se forma la solución de colágeno / medio, es decir antes de la gelificación del colágeno hasta el punto en que la mezcla ya no es un líquido. El pH acídico (en el rango de aproximadamente de pH 2.0 hasta aproximadamente pH 4.0) de la solución ..-^ ^i,^....,. «. ^ AuM,^.?^,Aa^MM?an^.A.fc,^j de colágeno en el segundo recipiente evita la gelificación del colágeno durante el almacenamiento. Por lo tanto la gelificación de la mezcla para formar un matriz sólida no ocurre hasta después de la neutralización de la solución de colágeno acídica con el medio alcalino a un pH de aproximadamente 7.2 hasta aproximadamente 7.8, preferentemente aproximadamente 7.4 hasta aproximadamente 7.8. De manera alternativa, la solución de colágeno en el segundo recipiente puede encontrarse a un pH de aproximadamente 7.2 hasta aproximadamente 7.8, preferentemente, aproximadamente 7.4 hasta aproximadamente 7.8, inhibiéndose la gelificación al mantener la 'solución de colágeno a una temperatura por debajo de 10°C, (por ejemplo, a una temperatura de aproximadamente 3°C hasta 8°C) hasta inmediatamente antes de la mezcla he introducción en el animal. En cualquier caso, después de la formación de la mezcla, esta se introduce inmediatamente en un animal, es decir, antes de que proceda la polimerización más haya del punto en que la mezcla pueda transferirse fácilmente hacia el sitio de implantación. El equipo preferentemente incluirá material de empaque he instrucciones de uso de acuerdo con los métodos de la invención. De manera alternativa, el equipo puede incluir un contenedor de empaque que contiene dos recipientes con (a) el primer recipiente que contiene (i) una población de células vertebradas cultivadas que expresan un polipéptido (por ejemplo, células genéticamente diseñadas para expresar el polipéptido); y (ii) una pluralidad de microvehículos; y (b) el segundo recipiente que contiene una solución de colágeno. Existirá suficiente colágeno en la solución de colágeno para permitir que una mezcla formada al mezclar los contenidos de los recipientes de (a) y (b) se gelifique. La solución de colágeno puede encontrarse a un pH acídico. En este caso, el pH de la solución de colágeno puede ajustarse hasta aproximadamente 7.2 hasta aproximadamente 7.8, preferentemente de aproximadamente 7.4 hasta aproximadamente 7.8, inmediatamente antes de la formación de la mezcla, mediante el uso de una solución alcalina, por ejemplo, una solución de NaOH a una concentración de aproximadamente 0.01 N hasta aproximadamente 1.0N. El equipo puede incluir opcionalmente (1 ) un tercer recipiente que contiene tal solución alcalina y/o (2) un indicador de pH tal como un papel de pH, una regleta de medición o una solución que contiene tinta. De manera alternativa, la solución de colágeno en el segundo recipiente puede incluir una tintura indicadora de pH en otra modalidad, la solución de colágeno en el segundo recipiente se encuentra a un pH de aproximadamente 7.2 hasta aproximadamente 7.8, preferentemente de aproximadamente 7.4 hasta aproximadamente 7.8, inhibiéndose la gelificación al mantener el contenido del segundo recipiente por debajo de aproximadamente 8°C hasta inmediatamente antes de la formación de la mezcla. Nuevamente, la formación de la mezcla será generalmente seguida inmediatamente por la introducción de la mezcla en un animal, a menos que la mezcla se mantenga por debajo de 8°C para prevenir la gelificación. En cada caso, el equipo incluirá preferentemente material de empaque adecuado y etiquetas y/o una inserción que detalla instrucciones de uso. El material de empaque puede incluir, por ejemplo, un contenedor adecuado para empacar los componentes de la mezcla hacia un vendedor o un sito de uso, por ejemplo, un hospital o el consultorio de un médico. Los contenedores de empaque adecuados incluyen, (por ejemplo, plástico u otro polímero sintético), espuma de estireno, cajas de cartón, madera o metal. Las bolsas de papel o de plástico (u otro polímero sintético), envolturas o envases en cartulina y plástico también pueden utilizarse como contenedores de empaque. Los contenedores de empaque también pueden incluir materiales protectores de impactos tales como fibras o pedazos de plástico, (por ejemplo, poliestireno), envoltura de burbuja de aire o papel triturado o plástico moldeado con ranuras adaptadas para contener los recipientes y pueden aislarse térmicamente. Los recipientes utilizados en tales equipos pueden ser jeringas hipodérmicas de vidrio o de plástico, botellas, tubos de prueba, matraces o frascos. También pueden ser bolsas plásticas, similares a las bolsas de sangre. Pueden suministrarse en un contenedor térmicamente aislado con objeto de mantener uno o más de los componentes a una temperatura constante, por ejemplo, una temperatura por debajo de aproximadamente 8°C. En estos equipos, el colágeno puede ser cualquiera de los tipos arriba listados. Además, el colágeno puede substituirse o complementarse con cualquiera de las substancias alternativas descritas Jilaáa j A Miáii. i. ^ iAZ.r en la presente. Las células vertebradas cultivadas pueden ser, por ejemplo, cualquiera de aquellas listadas y pueden haberse derivados y/o diseñado genéticamente mediante cualquiera de los procedimientos descritos en la presente. Los polipéptidos expresados por las células y los microvehículos pueden ser, por ejemplo, cualquiera de aquellos arriba listados. Las fibras diferentes al colágeno arriba indicadas pueden presentarse en uno o más de los recipientes. Los equipos pueden contener además en cualquiera de los recipientes, uno o más (por ejemplo, dos, tres cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez) agentes, por ejemplo, un factor que promueve la vascularización, una citosina, un factor de crecimiento o ácido ascórbico. Los agentes pueden ser, por ejemplo, cualquiera de aquellos listados en la presente. Los ejemplos de substratos sólidos con los cuales se asocian opcionalmente los agentes se describen arriba. En un recipiente del equipo también se presenta opcionalmente una segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena o décima población de células vertebradas cultivadas que segregan uno o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez) agentes, por ejemplo, un factor que promueve la vascularización, una citosina o un factor de crecimiento, según se describe arriba. Cuando los equipos incluyen fibroblastos como una de las poblaciones de células vertebradas cultivadas, un recipiente del equipo puede contener además células endoteliales y/o queratinocitos y opcionalmente, un factor de diferenciación de queratinocito (por ejemplo, iones de calcio a una concentración de 1.5 - 2 mM), como se describe á í ^&^^&M&É&xte"^¿í &. arriba. Los fibroblastos y las células endoteliales y/o queratinocitos pueden haberse obtenido por ejemplo, del mismo individuo. La invención también caracteriza un aparato para la introducción de una mezcla en un paciente. El aparato incluye al menos dos (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco o seis) recipientes, cada uno de los cuales tiene una abertura en comunicación fluida con un medio de suministro. El aparato puede contener (a) una solución de colágeno acuosa en la cual el colágeno puede ser cualquiera de los colágenos listados en la presente, (b) una población de células vertebradas cultivadas que expresan cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente (por ejemplo, células genéticamente diseñadas para expresar cualquiera de tales polipéptidos) y (c) una pluralidad de cualquiera de los microvehículos arriba listados uno o más de (a), (b) o (c) puede contenerse dentro de cada recipiente. Existe suficiente colágeno en la solución de colágeno para permitir que se gelifique una mezcla formada al mezclar los componentes de (a), (b) y (c). Uno o más de los recipientes puede tener asociado con el mismo un pistón que tiene dos extremos, un primer extremo adaptado para insertarse en el interior del recipiente y un segundo extremo adaptado para extenderse desde el interior del recipiente. El medio de suministro puede ser una aguja de jeringa o un catéter u otro tubo que tiene (a) dos o más entradas adaptadas para encontrarse en comunicación fluida con las salidas de los recipientes y (b) una salida. Alternativamente, el medio de suministro puede ser una pieza adaptadora que tiene un conector en comunicación fluida con la salida de cada uno de los recipientes, una cámara de mezclado, y una salida en comunicación n. J«*fe¿¿*%A ^ t^*??áí^*AL íÍ fluida con una aguja de jeringa, catéter u otro tubo; el conector puede contener al menos dos entradas (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco o seis) cada una en comunicación fluida con la salida de solo uno de los recipientes. El aparato puede incluir además una o más conexiones que unen físicamente al menos dos recipientes. Además, el segundo extremos de cada pistón puede conectarse a una placa de presión. El aparato también puede incluir cualquiera de las otras poblaciones celulares, alternativas al colágeno, .fibras diferentes al colágeno o agentes citados en la presente. Según se utiliza en la presente, un "substrato sólido" es un objeto o una pluralidad de objetos (configurados, por ejemplo, como partículas o filamentos), que actúan como un recipiente o depósito para una substancia (por ejemplo, un factor que promueve la vascularización) que esta contenido dentro o enlazado al substrato sólido. La substancia se libera gradualmente del substrato sólido hacia su ambiente. Cuando el substrato sólido se encuentra en la forma de perlas, generalmente, las perlas tienen una forma aproximadamente esférica y tienen un diámetro de aproximadamente 0.005-2.0 mm. Cuando el substrato sólido se encuentra en la forma de filamentos, los filamentos son generalmente de aproximadamente 0.01 - 1 .0 mm de diámetro. Los filamentos pueden ser tejidos, doblados en forma de una malla o cortados en pequeñas piezas (de aproximadamente 5-10mm) antes de la formación del gel. Cuando los filamentos de doblan, su longitud debe ser, por ejemplo, de aproximadamente 1 x hasta 3x (por ejemplo, aproximadamente 2x) el diámetro de un molde utilizado para producir la matriz híbrida relevante. ?¿ y,i-.~¿¡3d.,„.,,r..y . . Ík£~£lÍ3 .J¡?lí Según se utiliza en la presente, un (substrato sólido) no es una célula. A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tiene el mismo significado comúnmente entendido por cualquiera de experiencia ordinaria en la materia a la cual pertenece esta invención. En caso de conflicto, tomarán el control las definiciones que incluye el presente documento. Los métodos y materiales preferidos se describen a continuación, aunque puedan utilizarse otros métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente en la práctica o examinación de la presente invención. Los materiales, métodos y ejemplos descritos en la presente son solamente ilustrativos y no se pretende que sean limitantes. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias mencionadas en la presente se incorporan para referencia en su totalidad. Otras características y ventajas de la invención son aparentes a partir de las reivindicaciones y a partir de la descripción detallada proporcionada a continuación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 es un mapa de la expresión plásmída h FVI I I de pXF8.198. La figura 2 es una gráfica de líneas que muestra los niveles de factor humano VI I I (h FVI I I) en plasma de ratones implantado con Matrices de Colágeno Híbridas de Heparina-Sefarosa (HSHCM) que contienen células que producen hFVI I I y perlas de heparina-Sefarosa® ya sea kiA.ímtn?<s.^ cubiertas con factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) o no cubiertas. La figura 3 es una gráfica de línea que muestra los niveles de hFVI I I en plasma de ratones implantado con células que contienen HSHCM que producen hFVI I I , uno de dos tipos de microvehículos y perlas de heparina-Sefarosa® ya sea cubiertas con bFG F o no cubiertas. La figura 4 es una gráfica de líneas que muestra los niveles de hFVI I I en plasma de ratones implantado con células que contienen HSHCM que producen hFVI I I y perlas de heparina-Sefarosa® cubiertas con concentraciones diversas de bFG F. La figura 5 es una gráfica de líneas que muestra los niveles de hFVI II en plasma de ratones implantados con HSHCM que contiene células que contienen hFVI I I y ya sea perlas de heparina-Sefarosa® cubiertas con bFGF, perlas de heparina- Sefarosa® cubiertas con factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) o una mezcla de perlas de heparina-Sefarosa® cubiertas con VEG F. La figura 6 es un diagrama que ilustra la plásmida pXVEGF. 1 . La figura 7 es una gráfica de línea que muestra los niveles de hFVIII en plasma de ratones implantados con HSHCM que contiene una primer población de células que producen hFVI I I , ya sea solo o junto con una segunda población de células que producen VEGF. La figura 8 es una gráfica de líneas que muestra los niveles de hFVI I I ín plasma de ratones inyectados subcutáneamente ya sea con 1 mL o 2mL de l-HSHCMM que contiene células que contiene h FV! 11 y perlas de heparina-Sefarosa® cubiertas con bFGF.

La figura 9 es un mapa de la plásmida de expresión de hFVIII de pXF8.186. La figura 10 es una gráfica de líneas que muestra los niveles de hFVIII en plasma de ratones inyectados de manera intraumental ya sea con células que producen hFVIII y perlas de heparina-Sefarosa® cubiertas con bFGF (50 ng) o células que producen hFVI I I y perlas de hepapna- Sefarosa® cubiertas con VEGF (100 ng). La figura 1 1 es una gráfica de líneas que muestra los niveles de hFVIII en plasma de ratones inyectados de manera intraumental ya sea con células que producen hFVIII, células que producen hFVIII y perlas de heparina-Sefarosa® cubiertas con bFGF (500 ng) o células que producen hFVIII y perlas de heparina-Sefarosa® cubiertas con VEGF (100 ng). La figura 12 es una gráfica de líneas que muestra los niveles de hFVIII en plasma de ratones inyectados de manera intraumental con células que producen hFVIII y ya sea microvehículos, microvehículos y perlas de heparina-Sefarosa® microvehículos y perlas de heparma-Sefarosa® cubiertas con bFGF (500 ng) o microvehículos y perlas de heparina-Sefarosa® cubiertas con VEGF (100 ng). La figura 13A es un diagrama de un aparato que puede utilizarse para formar simultáneamente una mezcla de la invención y suministrarla a un sujeto. La figura 13B es una vista transversal de la pieza adaptadora 4 componente del aparato ilustrado en la figura 13A. ^«y^,^...^..^^,^^ » «,*.! DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los ejemplos establecidos a continuación ilustran diversas modalidades de la invención. Estos ejemplos son solamente para propósitos ilustrativos y no significa que sean limitantes.

EJEMPLO I Descripción General de Matrices de Colágeno Híbridas de Heparina- Sefarosa (HSHCM) Las HSHCM se producen al mezclar juntos Medio de Eagle Modificado con Dulbecco concentrado (DMEM), colágeno (por ejemplo, tipo I cola de rata o una alternativa adecuada, por ejemplo, colágeno de tipo I o II placentario humano) microvehículos (por ejemplo, microvehículos macroporosos de colágeno según de describe arriba o microvehículos de gelatina porosos), perlas de heparina-Sefarosa® ya sea cubiertas o no cubiertas con un factor angiogénico, una citosina o un factor de crecimiento (por ejemplo, factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), o factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF)) y células que expresan la proteína terapéutica. En una modalidad alternativa, se mezclan múltiples estirpes celulares en la matriz, expresando una estirpe la proteína terapéutica de interés y otra estirpe expresa el factor angionénico, citosina o factor de crecimiento. También es posible utilizar una sola estirpe que exprese tanto la proteína terapéutica como el factor de crecimiento o angiogénico. En esta modalidad, el componente de perla de heparina-Sepharose® puede cubrirse con el mismo o un factor de crecimiento y- - wás. diferente a partir del expresado por la estirpe celular incorporada o puede omitirse en conjunto todo.

Preparación del Microvehículo 5 La preparación de microvehículos de colágeno para la producción de la matriz es la siguiente. Los microvehículos de colágeno (Cellex Bioscíences cat.#YB00-0015UV) se transfieren de cada envase original proporcionado por el fabricante (~10ml por botella) hacia tubos cónicos de 50 ml (1 tubo por botella). Se permite que los microvehículos 10 se asienten en el tubo y separa por aspirado la solución reguladora de almacenamiento. Se agrega el medio de enjuague del microvehículo (DMEM con 1 % de suero bovino y 1 % de penicilina/estreptomicina) a la marca de 50 ml en el tubo graduado, se permite que los microvehículos se asienten y se separa por aspirado el medio. Esta serie de etapas de 15 enjuague se repite por un total de 4 enjuagues. Los microvehículos se transfieren a un matraz de Erlenmeyer de 250 ml mediante el uso de una pipeta plástica de 25 ml, limitando el volumen de los microvehículos hasta 100 ml por matraz de 250 ml. El medio de enjuague de microvehículos se agrega hasta la marca de 250 ml y el matraz se tapa y se coloca en una 20 incubadora de cultivo de tejido a 37°C durante 2-3 horas. El matraz se retira de la incubadora, se permite que los microvehículos se asienten y se separa por aspirado el medio de enjuague. Esta serie de etapas de incubación y de enjuague se repite para un total de 3 enjuagues. La preparación de los microvehículos de gelatina se lleva a 5 cabo como sigue. Un gramo de microvehículos de gelatina seca Cultisphere-GL™ (Catálogo Hiclona #DG-1001 -00) se coloca en una botella de vidrio de 100 ml que contiene 50 ml de solución salina regulada con fosfato sin calcio ni magnesio (PBS). Los microvehículos de gelatina permiten hidratar durante al menos una hora a temperatura ambiente. Se esterilizan mediante autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Los microvehículos de gelatina se acondicionan para utilizarse en matrices mediante el retiro del PBS y el enjuague 3x en DMEM + 1 % de suero bovino + 1 % de Penicilina / Estreptomicina (50 ml por enjuague). Los microvehículos de gelatina se arremolinan suavemente y se permiten asentar entre cada enjuague. Los microvehículos de gelatina acondicionados pueden almacenarse a 4°C antes de utilizarse. Preparación de Perlas de Heparina-Sefarose® La heparina acoplada a perlas de agarosa Sefarose® proporciona un soporte sólido para el anexo de factores de crecimiento de enlace a heparina tales como bFGF, VEGF y PDGF. La Sefarose® es una resina de agarosa degradada altamente, elaborada por Farmacia Biotech y es una marca registrada del fabricante. La heparina enlazada a un tipo diferente de matriz de soporte (por ejemplo, un polímero) puede utilizarse en lugar de una perla de heparina-agarosa. Las perlas de Flujo Rápido de Heparina-Sefarose® 6 (Pharmacia Biotech Cat #17-0998-03) se enjuagan 3x en dH2O a 5x el volumen de la perla por enjuague. Las perlas se arremolinan suavemente después de la adición de dH2O y se centrifugan a 500xg entre cada etapa de enjuague. Se esteriliza mediante autoclave a 121 °C durante 20 minutos. Las perlas se equilibran a pH 7.2-7.4 mediante enjuague extensivo en PBS hasta que el pH de la perla respecto a la lA.?.? JbAxátt.. . á y& mezcla de PBS 1 : 1 se encuentra del rango de 7.2-7.4. Las perlas se almacenan a 4°C en una mezcla de 1 : 1 con PBS. Los factores de crecimiento y angiogénicos se enlazan a las perlas de Heparina-Sefarose® como sigue. Las perlas equilibradas se colocan en un tubo estéril de tamaño adecuado (por ejemplo, un tubo cónico de 15 ml o uno Eppendorf de 1.5 ml) y se centrifugan a 500xg durante 4 minutos. Se enjuagan 2x en PBS, con una etapa de centrifugación entre cada enjuague. El factor angiogénico o de crecimiento (por ejemplo, a 50µg/ml en el saco de bFGF) se agrega a las perlas en un volumen de PBS igual al volumen de la perla empaquetada para das una perla empaquetada respecto a la mezcla de PBS y el enlace se lleva a cabo bajo rotación (por ejemplo, en una plataforma Nutator™ ) a temperatura ambiente durante 1 hora. El PBS que contiene cualquier factor de crecimiento no enlazado se retira de las perlas mediante aspiración y las perlas se enjuagan 1 x en PBS a un volumen igual al volumen de perla empaquetado. El PBS se retira las perlas se colocan sobre hielo hasta la formación de la matriz.

Preparación de HSHCM Los diferentes componentes usados para preparar HSHCM se enlistan en las tablas 1 y 2. Estas tablas describen la producción de HSHCM mediante el uso de microvehículos de colágeno (Tabla 1 ) o mícrovehículos de gelatina (Tabla 2). Cada tabla da el volumen de cada componente por ml de medio de producción, así como también el volumen necesario para la producción de 10 x 4 ml HSHCM como un ejemplo. (Los L-iai=ija,. volúmenes y concentraciones dados para las matrices en lo subsiguiente se refieren al volumen de pre-contracción y de concentración respectivamente). La "pre-mezcla" de matriz consiste en 10X DMEM, 7.5% NaHCO3, 1 M de H EPES, Penicilina-Estreptomicina, L-glutamina y dH2O. La pre-mezcla se prepara generalmente una o dos antes de mezclarse con el colágeno, las células y las perlas cubiertas con factor angiogénico y se mantiene a 4°C. Las células por incrustarse en la HSHCM se recolectan mediante tripsinización y se determina el número de células. El número requerido de células (número de células por matriz multiplicado por el número total de matrices producidas) se centrífuga a 1500 rpm (500xg) durante 7 minutos a temperatura ambiente. El granulo celular se vuelve a suspender en un volumen de medio de crecimiento igual al 1 0% del volumen total de medio de producción de HSHCM según de indica en las Tablas 1 y 2. La densidad de células por ml de matriz puede variar según sea adecuado (por ejemplo, 1 .0_1 0 x 106 células por ml de matriz). Ya que la suspensión celular se agrega a un volumen que es 1 0% del volumen total del medio de producción, el número de células por ml de esta suspensión es 10x mayor que la densidad deseada de células por ml de matriz (por ejemplo, 1_100x106 células por ml). El volumen adecuado de microvehículos se coloca en un tubo cónico y la suspensión celular se agrega a los microvehículos. Utilizando una pipeta plástica de 10ml, las células y microvehículos se mezclan juntos y se separan a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 0 a 15 minutos antes de su incorporación en el medio de producción. La pre-mezcla se coloca en hielo y una solución de colágeno (por ejemplo, colágeno de cola de rata(RTC)) se agrega a la pre-mezcla refrigerada y se mezclan concienzudamente mediante el uso de una pipeta plástica de 10ml. El pH del medio de producción se ajusta entonces hasta aproximadamente 7.8 mediante la adición de 1 N NaOH al volumen indicado en la Tabla 1 o 2. La mezcla de célula/microvehículo se agrega al medio de producción neutralizado y se mezcla mediante el uso de una pipeta plástica de 1 0ml. Un volumen de medio de crecimiento igual al volumen empaquetado de perlas de heparina-Sefarose® se agrega a las perlas y las perlas se transfieren al medio de producción y se mezclan mediante el uso de una pipeta plástica de 1 0ml. Un volumen de este medio de producción final de HSHCM se agrega al disco de Petri de tamaño adecuado. Por ejemplo, 4ml del medio de producción de HSHCM se agrega generalmente a un disco de Petri de 60mm, 10ml a un disco de Petri de 100 mm y 30ml a un disco de Petri de 1 50mm. Al variar la proporción del volumen de medio de producción respecto al área superficial del disco se puede modificar el grosor de la HSHCM. Los discos que contienen el medio de producción de HSHCM se transfieren a una incubadora con una temperatura de 37°C, humedad de 95 a 98% y un nivel de CO2 de 5%. Una hora más tarde, los discos se retiran de la incubadora y se examinan. Si el medio de producción HSHCM se ha gelificado, la HSHCM se alimenta mediante la adición de 5ml de medio de crecimiento. De otro modo los discos se regresan a la incubadora durante una hora adicional o hasta que se complete la polimerización, en cuyo momento la HSHCM se alimenta mediante la adición de 5ml de medio de crecimiento. El medio de crecimiento se complementa con 10-100 ng/ml del mismo factor de Í??- ?,??^.k .St¡ÁSié .*y.M crecimiento o factor angiogénico utilizado para cubrir las perlas de heparina-Sefarose® de la HSHCM.

TABLA 1. Formulación de Medio de Producción de HSHCM: Configuración del Microvehículo de Colágeno TABLA 2. Formulación del Medio de Producción de HSHCM: Configuración de Microvehículo de Gelatina. Componente Volumen Volumen Total Conc. Final Mantenimiento y Evaluación In Vitro de HSHCM La HSHCM se mantiene en cultivo mediante la alimentación de las matrices el día 1 y después 2 o 3 veces a la semana mediante el uso del siguiente protocolo: 1. Aspirar cuidadosamente el medio de cultivo 2. Agregar el volumen requerido de medio de crecimiento adecuado tomando en consideración el tamaño del disco utilizado para cada matriz. El medio puede complementarse con 2-fosfato de ácido > ^A-?JBaM^fcfa ascórbico y/o TGF-ß (por ejemplo, 10-50 µg/ml de 2-fosfato de ácido ascórbico y/o 1 -10ng/ml TGF-ß). El volumen del medio de crecimiento utilizado para alimentar las matrices es normalmente el volumen máximo que puede agregar a cada tamaño de disco, por ejemplo, 10ml por disco de 60mm, 20-30ml por disco de 100mm y 100_150ml por disco de 150mm. El tamaño de diámetro de la matriz y el número de células por matriz se determina como sigue: El diámetro de una HSHCM puede determinarse mediante el uso del siguiente procedimiento: 1. Colocar el disco de Petri que contiene la matriz a medirse en la parte superior de un medidor métrico que descansa sobre un fondo oscuro. 2. Registrar diámetros (en centímetros) según se desee: por ejemplo, diariamente durante las dos primeras semanas, cada tercer día después de las primeras dos semanas y los días de cuantíficación celular durante el resto del experimento. Las células pueden recuperarse y cuantificarse a partir de una HSHCM como sigue: 1. Digestión Enzimática de Matrices de Colágeno Híbridas a. Preparar una solución de colagenaza IA (1.0 mg/ml para HSHCM, 2.0 mg/ml para HSHCM complementado con 2-fosfato de ácido ascórbico y/o TGF-ß) en PBS. b. Distribuir la solución de colagenasa en tubos de centrifugado cónico de 15ml a un volumen de 1 ml para matrices sembradas con 1 - 5X106 células y 5ml para matrices sembradas con más de 5x106 por matriz. Preparar tantos tubos de colagenasa como matrices por contarse existan. c. Retirar cada matriz de su disco mediante el uso de fórceps planos y manchar cuidadosamente el fluido excesivo dé la matriz mediante el uso de una toalla de papel absorbente (si las células sean descartadas después del conteo) o cojinete absorbente estéril. d. Colocar cada matriz en un tubo individual que contiene colagenaza, taparlo herméticamente y asegurarlo sobre un agitador orbital fijo a 40 rpm en una incubadora de cultivo de tejido. e. Incubar las matrices durante aproximadamente 1 hora o hasta que se complete la digestión. Para acelerar la digestión, fraccionar las matrices al pipetar en intervalos de 5 minutos. 2. Conteo Celular a. Medir el volumen total de cada suspensión celular digerida mediante el uso de las graduaciones sobre el lado del tubo de centrifugado. b. Para medir la disponibilidad celular, retirar 1.0 ml de suspensión celular y agregar a 1.0 ml de 0.08% de azul tripano en un tubo de microcentrifugado de 1.5ml. Mezclar tapando el tubo ligeramente. c. Contar las células disponibles y muertas mediante el uso de un hemacitómetro. Si es necesario, diluir aún más la suspensión celular en PBS antes de agregar el azul tripano. Calcular el número total de células, tomando en consideración el volumen total medido en la etapa 2a. .._-.>* .» , i,,..

EJEMPLO II Este ejemplo describe la implantación in vivo de HSHCM preparada como se describe en el Ejemplo I . La HSHCM que contiene ya sea perlas de heparina-Sefarose® sin cubrir o perlas de heparina-Sefarose® cubiertas con bFGF (50 µg/ml de perlas empaquetadas; 10µg de bFGF total/matriz) se prepara como se describe en la Tabla 1 . Cada matriz de 4ml se forma con 5 x 106 células de H F743 B1 -35, una clona de fibroblasto de prepucio humano que contiene la plásmida pXF8.198 (figura 1 ) y que expresa hFVIII a niveles entre 20,000-30,000 mU/24h/106 células. Los procedimientos detallados adicionales para preparar y transfectar células, adecuados para utilizarse en las matrices y mezclas de esta invención se proporcionan en la WO93/09222 (PCT/US92/09627), la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. La HSHCM se mantiene en cultivo durante 2 días antes de la implantación . Para la implantación subcutánea de las matrices, Ra9-2ratones(129S6/SvEvTac-[KO]Rag2. Taconic Farms) se anestesiaron y prepararon como sigue. Se dio a los ratones una inyección intraperítoneal de Avertin™ (solución de 2% p/v de 2,2,2-tribromoetanol y 2% v/v de 2-metil, 2-butanol) a una dosis de 0.0175 ml/g de peso corporal . Los ratones anestesiados se colocaron en recumbencia lateral y el sitio de implante se afeitó y desinfectó con alcohol y Betadine™ (0.75% de solución de yodo). Se realizó una incisión de 2 cm en la capa cutánea sobre el lado izquierdo del animal, inferior y caudal a las costillas, y se limpió la fascia entre la capa muscular oblicua cutánea y externa y se agrandó mediante el uso de tijeras sin filo estériles. La HSHCM se preparó para implantación mediante enjuague 2x en 10 ml de "^ -—*• -- ^-»»»*fc, -i » y-fc» » ,«*^a.

PBS. Cada matriz se dobló en cuartos mediante el uso de espátulas en forma de cuchara, estériles, y se insertaron en el espacio cutáneo limpio mediante el uso de una espátula estéril. La incisión se cerró mediante el uso de sujetadores de heridas. La sangre se recolectó mediante sangrado retroorbital después de colocar al ratón en un gran vaso de precipitación que contiene metoxiflurano (Pittman-Moore) hasta que se logró una ligera anestesia. Se determinó hFVI I I de plasma mediante el uso de ELISA de hFVI I I en base a dos anticuerpos monoclonales de ratón [Hornsey et al. (1992) Transfus. Med. 2(3): 223-229]. El número de células estimuladas por matriz se determinó al digerir y cuantifícar las células recuperadas de la HSHCM puesta aparte para este propósito. La HSHCM que contiene perlas de heparina-Sepharose sin cubrir, tiene un promedio de 2.8 x 106 células por matriz y la HSHCM que contiene perlas de heparina-Sepharose cubiertas con bFGF tienen un promedio de 3.1 x 106 células por matriz (n = 3 matrices por condición). La producción in vitro de hFVI I I de cada tipo de matriz el día de la implantación fue de 71 , 165 mU/24h y 85,657 mU/24h de la HSHCM que contiene perlas sin cubrir y cubiertas con bFGF, respectivamente (n = 3 matrices por condición). Como se muestra en la figura 2, la HSHCM que contiene perlas de heparina-Sepharose cubiertas con bFGF conduce a un nivel de plasma significativamente mayor de hFVI I I detectado en el ratón huésped en comparación con la HSHCM sin el factor de crecimiento (n = 10 ratones por condición). No existió hFVI I I detectable el día 0 y el nivel pico de plasma ocurrió el día 14. Los siguientes ejemplos describen estudios adicionales que involucran la implantación subcutánea de HSHCM (preparada como se describe en el Ejemplo I) en Rag.2ratones y que utilizan el hFVIII de HF743- B1-35 que segrega la clona celular arriba introducida.

EJEMPLO lll La HSHCM que contiene ya sea perlas de heparina-Sepharose sin cubrir o perlas de heparina-Sepharose cubiertas con bFGF (50µg/ml de perlas empaquetadas, 10µg de bFGF/matriz total) y ya sea microvehículos de colágeno o microvehículos de gelatina, se prepararon como se describe en las Tablas 1 y 2, respectivamente. El número promedio de células por matriz y la producción de hFVII I por matriz el día de la implantación (n = 3 matrices por condición) se lista en la Tabla 3. TABLA 3. Resumen de número celular y producción de hFVIII por HSHCM el día de la implantación Los controles celulares subcutáneos (SC) se incluyeron en , ?<?.t*J»i-**M. .„.*» A l^ .. ^,¿1.,.. . *f?» ír?fi. ?.l?aJt*M,?af**>aá.~.. ¡.t?i este experimento y se prepararon como sigue. Las células se cosecharon mediante tripsinización de la misma manera que para la preparación de HCM. Las células tripsinizadas se cuantificaron, se centrifugaron a 500xg, volvieron a suspenderse en Solución Salina Regulada de Hank (sin calcio ni magnesio), se centrifugaron y volvieron a suspender en un volumen de PBS para dar 100 x 106 células/ml en base al conteo celular original después de la cosecha. Las células en la mezcla de células/PBS se cuantificaron y la densidad de las células en la suspensión se ajustó a 50 x 106 células/ml de PBS. Para cada inyección, se aspiró un total de 0.15 ml de mezcla celular en una jeringa Glasspak™ de 1 ce y la jeringa se tapó con una aguja de 22G/1 pulgada. La mezcla celular se inyectó SC en el lado izquierdo del ratón, inferior y caudal a las costillas. Tomando en consideración el volumen vacío de la aguja, un total de 0.1 ml o 5 x 106 células se inyectó en cada animal de control (n = 5 ratones por condición). La figura 3 muestra que la HSHCM que contiene los microvehículos de gelatina y perlas de heparina-Sepharose® cubiertas con bFGF conduce a un nivel significativamente mayor de hFVI I I cuando se implanta en ratones, en comparación con las otras condiciones (n = 10 ratones por condición). El patrón de expresión fue similar al observado en el Ejemplo II , sin hFVIII detectable hasta el día 7 y la máxima expresión el día 14. No existió hFVIII detectable en el plasma de los ratones que reciben inyecciones celulares SC en cualquier punto de tiempo después del día 1 posterior a la implantación EJEMPLO IV La HSHCM que contiene perlas de heparina-Sepharose® ya sea sin cubrir o cubiertas con bFGF a 12.5, 25 o 50 µg/ml de perlas empaquetadas, se preparó mediante el uso de la formulación de microvehículo de colágeno (Tabla 1 ). La cantidad total de bFGF por matriz después de la incorporación de las perlas cubiertas se estimó en aproximadamente 2, 4 y 10 µg, respectivamente. El número promedio de células por matriz y producción de hFVIII por matriz el día de la implantación (n = 3 matrices por condición) se resumen en la Tabla 4. TABLA 4. Resumen de número celular y producción de h F VI 11 por HSHCM el día de la implantación.

La figura 4 demuestra que los niveles de plasma de h F VI 11 son significativamente mayores después de la implantación de matrices que contienen 10µg de bFGF en comparación con aquellas que contienen 4µg y 2µg de bFGF (n = 5 ratones por condición). El patrón de expresión fue similar al observado en los Ejemplos II y lll.

EJEMPLO V La HSHCM que contiene perlas de heparina-Sepharose ya sea k^tí .¡..j ^ sin cubrir, cubiertas con bFGF, cubiertas con VEGF o cubiertas tanto con bFGF como con VEGF, se prepararon de acuerdo con la formulación de microvehículo de gelatina (Tabla 2). Para el conjunto de HSHCM que contienen perlas cubiertas con ambos factores de crecimiento, cada matriz recibió 0.1 ml de perlas cubiertas con bFGF y 0.1 ml de perlas cubiertas con VEGF a fin de mantener el volumen de perlas consistente con los experimentos previos. La concentración de cubierta de cada factor de crecimiento para esta condición fue de 100µg/ml de perlas empaquetadas, dando como resultado un total de aproximadamente 10µg de cada factor de crecimiento por HSHCM. En la HSHCM+bFGF+VEGF, hubo aproximadamente 10µg de cada bFGF y VEGF. El número promedio de células por matriz y producción de hFVIII por matriz el día de la implantación (n = 3 matrices por condición) se resumen en la Tabla 5. TABLA 5. Resumen de número celular y producción de hFVIII por HSHCM el día de la implantación.

Los controles de implantación intraomental (IO) se incluyeron con objeto de comparar el suministro subcutáneo de hFVIII de la HSHCM con otro método de implantación que se ha mostrado exitoso en el suministro de hFVIII en el modelo de ratón. Los controles de IO se n^?t^'1 prepararon como sigue. Las células se cosecharon mediante tripsinización de la misma manera que para la preparación de HCM. Las células tripsinizadas se cuantificaron, se centrifugaron a 500xg, se volvieron a suspender en Solución Salina Regulada de Hank (sin calcio ni magnesio), se volvieron a centrifugar, y se volvieron a suspender en un volumen de PBS para dar 15 x 106 células/ml en base al conteo celular original después de la cosecha. Las células en la mezcla de células/PBS se cuantificaron y se distribuyó un volumen de suspensión celular igual a 5 x 106 células en tubos de microcentrifugado de 1.5 ml, estériles, y se centrifugaron a 500xg durante 4 minutos en un microcentrifugado. Los tubos que contienen el granulo celular y PBS se colocaron en hielo y cada granulo celular se implantó en el receso omental del Rag-2ratón de la siguiente manera. Antes de la implantación de las células, los ratones se anestesiaron con 1.25% de Avertin™ y se colocaron en recumbencia lateral. El flanco izquierdo entre las costillas y la babada se limpió con un cojinete de alcohol y se preparó con Betadine™. Se realizó una pequeña incisión (0.5 cm a 1.0 cm) posterior a las costillas y ventral a la espina. El bazo se expuso y exteriorizó suavemente. Las células se inyectaron a lo largo del eje del bazo después del aspecto craneal y medio y dentro de la membrana delgada adyacente a la superficie hilar del bazo. El bazo se reemplazó en la cavidad abdominal y se cerró la incisión. La figura 5 demuestra que los niveles de hFVIII de plasma son significativamente mayores a partir de la HSHCM que contiene una combinación de bFGF y VEGF en comparación con las otras condiciones los días 14 y 21 (n = 5 ratones por condición). La inyección de células IO condujo a un nivel de hFVIII de plasma significativamente mayor el día 1 , pero para el siguiente punto de tiempo (día 7), el nivel observado en controles de IO cayó por debajo del obtenido con los implantes de HSHCM que contienen factores de crecimiento (n = 5 ratones por condición).

EJEMPLO VI La HSHCM que contiene una combinación de 2 clonas celulares de fibroblasto, HF743 B1 -35 que expresa hFVIII y HF81 1 -M15 que contiene la plásmida pXVEGF.1 (figura 6) y que expresa VEGF [Koch ef al. , Science 246: 1309-1312, 1989], se preparó para implantación. La clona de HF811-M15 produjo un promedio de 85 ng de VEGF/24h/106 células al momento de la implantación. Las matrices se prepararon de acuerdo con la formulación de microvehículo de colágeno (Tabla 1 ). El componente de perlas de heparina-Sepharose® fue sin cubrir. Se prepararon dos conjuntos de HSHCM con una u otra clona a 5 x 106 células por matriz. Se prepararon dos conjuntos adicionales con un número constante (5 x 106) células de HF743 B1-35 y uno adicional 1 x 106 o 2.5 x 106 de células HF81 1 -M15. La Tabla 6 resumen las diferentes condiciones y niveles de producción in vitro de hFVIII y VEGF para cada condición (n = 5 matrices por condición).

TABLA 6. Resumen de producción de hFVIII y VEGF por HSHCM el día de la implantación.

Los niveles de hFVIII de plasma con el tiempo para cada condición de HSHCM se ilustran en la figura 7. El conjunto de HSHCM que contiene 2.5 x 106 células condujo a los máximos niveles de plasma de hFVIII, cuyo pico fue el día 14 y declinó hasta el día 42, en cuyo momento no había hFVIII detectable. La HSHCM que contiene 1 x 106 células de HF811-M15 condujo a niveles de plasma de h F VI I i ligeramente inferiores al conjunto que contiene 2.5 x 106 HF811-M15, pero significativamente mayores que la HSHCM sin las células productoras de VEGF, indicando que la VEGF producía un efecto dependiente de la dosis sobre el suministro del hFVIII mediante el implante. La cantidad de VEGF en las muestras de plasma se determinó mediante ELISA (R&D Systems VEGF Immunoassay Kit). Los resultados se resumen en la Tabla 7. Existió una declinación en el VEGF detectable del día 14 al día 28 en el plasma de ratones implantados con HSHCM elaborada con ya sea 2.5 x 106 o 5 x 106 células de HF811-M15. Los hÍA Á?.tM*i*-..± ~ - niveles de VEGF no fueron detectables en el plasma de animales implantados con HSHCM elaborada sin células de HF81 1 -M15 o con 1 x 106 células de HF81 1 -M15. Las muestras de plasma para los días 1 y 7 no se encontraron disponibles para ensayo, pero los datos sugirieron que el nivel de VEGF tuvo un pico en cierto punto entre el tiempo de la implantación y el día 14. TABLA 7. Resumen de expresión de VEGF en el plasma de Rag.2ratones implantados con HSHCM que contiene diferentes números de células HF811 -M15.

EJEMPLO Vil El volumen de la mezcla utilizada para elaborar la matrices de la invención se basa en una altura de columna líquida (es decir, profundidad) de 0.18 cm. Un volumen de 4 ml de mezcla en un disco de 60 mm(radio de 2.65 cm) se encontró que da la disponibilidad celular y expresión proteínica óptimas para ese tamaño de disco. En base a la fórmula V = pr2h, donde V = volumen de la mezcla, r = radio del disco y h = altura de la columna líquida (es decir, profundidad de la mezcla en el disco), el volumen óptimo de 4 ml = p(2.65 cm)2h, a fin de que la profundidad óptima = 0.18 cm y la proporción óptima de r2/V = 1.8. La siguiente tabla (Tabla 8) indica volúmenes óptimos para diferentes tamaños de discos, incluyendo el tamaño de 60 mm del cual se derivó la altura de 0.18 cm. TABLA 8. Volúmenes y proporciones de r2/V óptimos para diferentes tamaños de discos.

Aunque se encontró que una proporción de aproximadamente 1.8 es óptima para la disponibilidad celular y la expresión de proteínas, son adecuadas las proporciones de aproximadamente 1 .0 - 3.0, preferentemente de 1.5 hasta aproximadamente 2.0. Esto corresponde a profundidades de aproximadamente 0.21 cm y aproximadamente 0.16 cm, respectivamente.

EJEMPLO VIII La HSHCM de la invención se prepararía para implantación en humanos como sigue: Las células deseadas, típicamente células autólogas ,jíú^i¿aiy??l*»k?.l?b?A establemente transfectadas, derivadas del paciente, de cosechan a partir de discos de cultivo de tejido y se procesan para la producción de HSHCM mediante cualquiera de los métodos antes descritos. La dosis para un paciente dado (es decir, la cantidad fisiológicamente eficaz de producto terapéutico producido por la matriz) puede variar mediante el uso de una m l<atriz de mayor o menor tamaño, implantando un número diferente de m l<atrices en el paciente y/o usando células que expresan un nivel diferente del producto por célula cuando se construye la matriz. La cantidad del producto terapéutico producido en el paciente también puede variar al exponer las células en la matriz a una señal farmacológica o fisiológica que altera la expresión del gen terapéutico. Por ejemplo, si el gen terapéutico se encuentra bajo el control de un promotor que responde a glucocorticoides, entonces la exposición in vivo de las células a un fármaco tal como dexametasona (al administrar el fármaco al paciente en una manera que asegure que el fármaco alcance el implante) alterara la expresión del gen terapéutico. Típicamente, una pluralidad de matrices pequeñas (aproximadamente 1 -2 cm) de diámetro, producidas en discos de Petri de 60 mm y que contienen el orden de 1 0 x 1 06 células por matriz, se implantaría. De esta manera, aproximadamente podrían implantarse 100 millones de células mediante el uso de 1 0 matrices pequeñas. El uso de matrices con densidades celulares significativamente mayores (según se producen al incorporar, por ejemplo, 2-fosfato de ácido ascórbico) daría como resultado un menor número de matrices necesarias para un paciente dado. De manera alternativa, puede utilizarse un disco de Petri de mayor tamaño (>150 mm de diámetro) como un molde para producir matrices mayores que podrían ya sea implantarse directamente o cortarse en piezas más pequeñas que se implantan. Antes de la implantación, las matrices pueden almacenarse o transportarse en medio de crecimiento o cualquier otra solución que permita que las células permanezcan disponibles. De manera alternativa, las matrices pueden criopreservarse al congelarse en un medio de congelamiento adecuado, el cual puede separarse por enjuague antes de la implantación. Las matrices pueden implantarse en una variedad de sitios, incluyendo, pero sin limitarse, sitios subcutáneo, intraperitoneal, intrasplénico, intraumental, inguinal, intratecal, intraventricular e intramuscular, así como también dentro de nodos linfáticos o dentro de tejido adiposo. Una incisión quirúrgica en el sitio adecuado se elabora, se inserta en la matriz y se cierra la incisión.

EJEMPLO IX Existen varios sistemas de cultivo in vitro a gran escala de perfusión y estáticos que pueden adaptarse para utilizarse en la elaboración de proteínas mediante el uso de células mantenidas en matrices híbridas de la invención. Las opciones ofrecen niveles variantes de facilidad en las etapas necesarias de alimentación y cosecha de medio antes de la purificación de las proteínas objetivo. A continuación se describen varios. 1. Después de la formación y maduración de HSHCM en placas de Petri convencionales (por ejemplo, después de 10-25 días de incubación) un número de estas HSHCM puede transferirse de manera aséptica hacia un Matraz Giratorio de Microvehículo (250- 1 00 ml de capacidad) estéril. Estas HSHCM se producen y mantiene bajo condiciones que maximizan la densidad celular viable dentro de cada matriz. Típicamente, esto requiere entre 5 y 20 ml de medio para cada ml de volumen de matriz. El medio de producción de proteína se formula para comprender un mínimo de componentes no definidos (por ejemplo, suero) y puede incluir factores agregados propuestos para maximizar el rendimiento de la producción de proteína por célula. Los matraces giratorios se colocan en una incubadora humidificada con 5% ± 1 % de CO2 , a 37° ± 1 °C sobre una plataforma e agitación magnética establecida en 30-70 rpm. Después de 1 -3 días, el matraz se transfiere a un gabinete de seguridad biológica de clase 100 y el medio de producción que contiene la proteína expresada se separa asépticamente sin perturbar las matrices establecidas. Un volumen equivalente de medio de producción de proteína fresca se agrega al matraz y el matraz se regresa a la plataforma de agitación dentro de la incubadora. 2. Las matrices descritas en (1 ) arriba pueden transferirse asépticamente hacia un bioreactor 1 -5L (por ejemplo, Brunswick) con un eje propulsor de agitación controlable. El nivel del medio de producción se establece mediante el sistema de control del bioreactor. La cosecha y reabastecimiento de medio se controla dentro de un sistema de ciclo cerrado estéril para minimizar la contaminación. 3. Para la producción de HSHCM a volumen elevado, las matrices se forman a partir de los componentes constituyentes y se permiten gelificar dentro de una botella giratoria de cultivo de tejido, las botellas se incuban en una posición vertical estática hasta que la contracción de la matriz da como resultado una estructura de libre flotación (3-5 días). Se reabastece entonces el medio de crecimiento y las botellas se gasifican con 5% de CO2 y se colocan en un aparato giratorio dentro de una incubadora a 37°C. El medio de crecimiento de reabastece cada 2-3 días hasta que la HSHCM se encuentra madura (10-25 días de incubación total), en cuyo momento las HSHCM se exponen al medio de producción de proteína. Después de 1 -3 días, las botellas se transfieren a un gabinete de seguridad biológica de clase 1 00 y el medio de producción que contiene la proteína expresada se separa asépticamente sin perturbar las matrices. Un volumen equivalente de medio de producción de proteína fresca se agrega a la botella, la cual se regresa al aparato giratorio. 4. Los constituyentes de la HSHCM pueden introducirse asépticamente en bolsas de Teflon™ permeables al gas, estériles, a través de un puerto sellable. Los componentes se permiten gelificar dentro de la bolsa y tomar la forma y conformación en la misma. Las bolsas se incuban en incubadoras humidificadoras con 5% ± 1 % de CO2 a 37° ± 1 °C. A medida que la HSHCM se contrae y reduce en volumen , el volumen del medio de crecimiento se ajusta para compensar. La cosecha y reabastecimiento del medio se llevan a cabo a través de sistemas de tubo de conexión estéril conformados en las bolsas. El uso de incubadora colocadas y de tubería extendida permitiría el diseño de un sistema de bombeo de cosecha-alimentación cíclico que podría eliminar la necesidad &lr^k¿*y.ÍrM~ k&¿y&* t *ié^--J**-**~?--*-. .Jyy?.íí? ¡Í1-i?l S,t,iü j i de retirar las bolsas de las incubadoras durante una ejecución de la producción . 5. los constituyentes de la HSHCM pueden introducirse asépticamente en bandejas termoformadas diseñadas por el cliente con una capacidad de alto volumen. La conformación más simple sería una bandeja rectangular de orilla abierta con capacidades de intercambio de gas diseñada para utilizarse en una incubadora de cultivo de tejido de CO2. Otro diseño incluiría un sistema de ciclo cerrado con acceso colocado hacia el recipiente del medio para la alimentación controlada y la cosecha del medio, similar a una cámara de bioreactor.

EJEMPLO X Descripción General de Mezclas de Matriz de Colágeno, Híbridas, de Heparina-Sefarose®, Inyectables (l-HSHCMM) Las l-HSHCMM se preparan al mezclar juntos DMEM concentrado (sin rojo fenol), colágeno de tipo I de cola de rata (o una alternativa adecuada, por ejemplo, colágeno de tipo I y/o l l l placentario humano); microvehículos porosos (por ejemplo, microvehículos macroporosos de colágeno o microvehículos de gelatina porosos); perla de heparina-Sefarose® opcionales ya sea sin cubrir o cubiertas con factor angiogénico o de crecimiento (por ejemplo, factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), o factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDG F)); y células que expresan la proteína terapéutica. En una modalidad alternativa, una combinación de estirpes celulares se mezclan en la solución de colágeno, i>J^..M^^J^iai i¡¿ Í^--^^-»^fa^^*a^-f ,S3».,«,.«.... .¡.y ....AjMfcte. ittfcii expresando una estirpe ia proteína terapéutica de interés y expresando la otra estirpe el factor apgiogénico o de crecimiento. También es posible utilizar una sola estirpe que exprese tanto la proteína terapéutica como el factor angiogénico o de crecimiento. En esta modalidad, el componente de perla de heparina-Sefarosa® puede no cubrirse o cubrirse con el mismo o un factor de crecimiento diferente al expresado por la estirpe celular incorporada o puede omitirse todo junto. Las mezclas de matriz inyectables de la invención incluyen aquellas son colágeno o cualquiera de las alternativas de colágeno aquí expuestas. Además, las mezclas sin una fuente de factores angiogénicos o factores de crecimiento se incluyen en la invención. También se entiende que las mezclas pueden carecer de microvehículos, pero generalmente tales mezclas incluirán un agente tal como un factor angiogénico, una citosina, un factor de crecimiento o ácido ascórbico. Aunque no es un requisito, tales agente pueden asociarse con cualquiera de los substratos sólidos descritos en la presente. Estos substratos sólidos pueden funcionar como microvehículos a ios cuales se adhieren las células y también como recipientes de agentes relevantes.

Preparación dei Microvehículo y Preparación de la Perla de Heparina-Sefarose® Los microvehículos y las perlas de heparina-Sefarose® se prepararon como se describe arriba en el ejemplo I. Las proteínas de suero se retiraron mediante 3-5 enjuagues con PBS libre de suero antes de la formación de las mezclas. ífti,ri^?1-¡ Xyxllu Ah!lí¡f:'M*&,, Preparación de l-HSHCMM Los diferentes componentes utilizados para preparar las I- HSHCMM se listan en la Tabla 9, la cual describe la preparación de i- HSHCMM mediante el uso de perlas de gelatina como el microvehículo. La Tabla da el volumen de cada componente por mL de medio de producción , así como también el volumen necesario para la producción de 10 x 1 mL y 10 x 2mL de l-HSHCMM como un ejemplo. La "pre-mezcia" de matriz consiste en 4X DMEM sin rojo fenólico, 7.5% de NaHCO3 1 M de H EPES, Penicilina-Estreptomicina, L-giutamina y dH2O. La pre-mezcla se prepara normalmente una o dos horas antes y se mantiene a 4°C. Las células por inyectarse junto con los componentes de matriz se cosechan de recipientes de cultivo de tejido y se centrifugan a 500xg durante 10 minutos para obtener un granulo celular. El granulo celular se enjuaga 1 x en PBS, el PBS se retira y el granulo vuelve a suspenderse en 1 X DMEM sin rojo fenólico en un volumen igual a 10% del volumen total del medio de producción de l-HSHCMM como se indica en la Tabla 9. La densidad de las células por mL de medio de producción de matriz puede variar según se ha adecuado (por ejempio, 0.1 - 10 x 106 células por mL de matriz inyectable). Ya que la suspensión celular se agrega a un volumen que es 10% del volumen del medio de producción total, el número de células por mL de esta suspensión debe ser 10x mayor que la densidad deseada de células por mL de mezcla de matriz (por ejemplo, 1 -100 x 106 células por mL). El volumen adecuado de microvehículos (por ejemplo, Cultiesferas) se coloca en un tubo de centrifugado cónico y la suspensión celular se agrega a los microvehículos. Utilizando una pipeta de vidrio de 1 0mL, las células y ios microvehículos se mezclan en conjunto y se mantienen a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 0 a 1 5 minutos antes de su incorporación en el medio de producción. La pre-mezcla se colocan en hielo y se agrega una solución de colágeno (por ejemplo, colágeno de cola de rata(RTC)) a la pre-mezcla refrigerada y se mezcla concienzudamente mediante el uso de una pipeta de vidrio de 10 m L. El medio de producción se ajusta entonces a un pH de aproximadamente 7.8 mediante la adición 1 N de NaOH al volumen indicado en la Tabla 9. La mezcla de célula/microvehículo se granula mediante centrifugación a 500xg durante 5 minutos, se aspira el sobrenadante y se agrega un volumen de DMEM sin rojo fenólico al tubo para lograr un volumen final igual al volumen de la suspensión celular más el volumen de los microvehículos según se listan en la Tabla 9. La suspensión de céiuia/microvehículo se agrega ai medio de producción neutralizado y se mezcla mediante el uso de una pipeta de vidrio de 1 0mL. Un volumen de DM EM sin rojo fenólico igual al volumen empaquetado de perlas de heparina-Sefarose® se agrega a ias perlas y las perlas se transfieren al medio de producción neutralizado y se mezclan mediante el uso de una pipeta de vidrio de 10mL. El medio de producción completo se mantiene en hielo hasta inmediatamente antes de la invención, en cuyo momento se carga una jeringa de tamaño adecuado (por ejemplo, 10cc). Después de la carga, la jeringa se tapa con una aguja (por ejemplo calibre 16) y se inyecta en el sitio deseado (por ejemplo, subcutánea).

TABLA 9. Formulación del Medio de Producción Inyectable de HSHCMM.

Agregado al medio de producción después de ajustarse el pH Determinación in Vitro de Mezcla Gelificada Un volumen del medio de producción final de l-HSHCMM se agrega al disco de Petri de tamaño adecuado a través de inyección a partir de una jeringa a través de una aguja de calibre 16, según se describe arriba. Como un ejemplo, se agregan 2 mL de medio de producción de I- HSHSCMM a un disco de Petri de 35 mm, 4 mL a un disco de Petri de llÍ? ÍBÍÍ¡f1?i?l?llll .IÍIir¡íli¡fí íf i í i — *•*'*"»--- .^-?*^*t^t¡j|| 60mm, 10 mL a un disco de Petri de 100mm, y 30 mL a un disco de Petri de 150mm. Al variar la proporción del volumen dei medio de producción respecto al área superficial del disco, se puede modificar el grosor de la HSHCM gelificada. Los discos que contienen el medio de producción de I-HSHCMM se transfieren a una incubadora con una temperatura de 37°C, humedad de 95 a 98% y nivel de CO2 de 5%. Una hora más tarde, los discos se retiran de ka incubadora y se examinan. Si el medio de producción de la l-HSHCMM se ha gelificado, la HSHCM se alimenta mediante la adición de 5 mL de DMEM sin rojo fenólico, de otro modo, los discos se regresan a la incubadora durante una hora adicional o hasta que se complete la polimerización. La HSHCM se mantiene en cultivo durante la cantidad de tiempo deseada. El volumen del medio de cultivo utilizado para alimentar las matrices es normalmente el volumen máximo que puede agregarse a cada disco, por ejemplo, 5mL por disco de 35mm, 10mL por disco de 60mm, 20-30mL por disco de 100mm, y 100-150mL por disco de 150mm. El número celular, la disponibilidad celular por matriz, y el nivel de ia producción de polipéptido se determinan según se describe arriba.

EJEMPLO XI Este ejemplo describe la inyección in vivo de la mezcla líquida de l-HSHCMM preparada como se describe en el Ejemplo X. Una mezcla líquida de l-HSHCMM que contiene perlas de heparina-Sepharose® cubiertas con bFGF a 100 µg/mL de perlas empaquetadas para un volumen de inyección de 2 mL y 200 µg/mL de perlas empaquetadas para un volumen de inyección de 1 mL (10 µg de bFGF total suministrado por implante) se prepararon como se describe en la Tabla 9. Para cada volumen de inyección, HF743 B1 -35, una clona de fibroblasto de prepucio humano que contiene la plásmida Pxf8.198 (Figura 1 ) y que expresa hFVIII a niveles entre 20,000-30,000 mU/24h/106 células por inyección. Para la introducción subcutánea de la mezcla, Rag2ratones (129S6/SvEvTac- [KO]Ras.2, Taconic Farms) se anestesiaron y prepararon como se describe arriba. El sitio de implante, localizado en el lado izquierdo del inferior del animal y caudal a las costillas, se afeitó y desinfectó con alcohol y Betadine™. Inmediatamente antes de la inyección, la mezcla líquida de I- HSHCMM completa se cargó en una jeringa de 10cc a un volumen ligeramente mayor que el volumen de inyección deseado para compensar el volumen hueco de la aguja. La jeringa cargada se tapó con una aguja de calibre 16 y la l-HSHCMM se inyectó inmediatamente en el sitio subcutáneo. La solución inyectada se rocía dentro del espacio entre el tejido cutáneo y el músculo oblicuo externo. Se aplica una ligera presión al punto de inyección y la aguja se extrae lentamente de la piel. La solución inyectada comienza a solidificarse dentro de unos cuantos segundos después de la inyección. Los ratones se colocaron sobre un cojinete térmico inmediatamente después de la inyección para prevenir posible hipotermia. La sangre se recolectó y se determinó el h F VI II de plasma mediante el uso de un ELISA de hFVIII en base a dos anticuerpos monoclonales de ratón, según se describe en ei Ejemplo II. * El número estimado de células por matriz gelificada se determinó al digerir y cuantificar las células recuperadas de HSHCM formadas en discos de Petri (2mL en disco de 35mm) y puestas aparte para este propósito. Los geles de HSHCM se mantienen en cultivo durante 2 días antes de la determinación del número celular y la disponibilidad, y se mantienen en DMEM libre de suero según se describe en el Ejemplo X. La HSHCM gelificada (n = 3 matrices por condición) tuvo un promedio de 3.5 x 106 +/-0.8 x 106 células por matriz. La disponibilidad de las células recuperadas fue de 84.5 +/- 2.4% . La producción in vitro de hFVI I I a partir de las matrices gelificadas de 68,851 +/- 1 99 mU/24h. La figura 8 ilustra los niveles de plasma de h F VI 11 con el tiempo después de la inyección subcutánea del medio de producción de HSHCM en Rag-2ratones. Las barras de error indican el error estándar de la media (n = 5 ratones por volumen de inyección). La expresión pico ocurrió un día después de la inyección.

EJEMPLO XII Este ejemplo describe una inyección intraomenta! en ratonesdesnudos de fibroblastos de conejos que expresan hFVI I I , ya sea solo (es decir, sin microvehículos) o en combinación con perlas de heparina-Sepharose® cubiertas con factores de crecimiento. Las perlas de heparina-Sepharose® se cubren ya sea con bFGF (1 µg/mL de perlas empaquetadas) o VEG F (2µg/mL de perlas empaquetadas), como se describe en el Ejemplo X. Las perlas cubiertas se distribuyen en tubos de microcentrifugado de 1 .5mL de polipropileno para lograr un volumen de 50µL de perlas empaquetadas por tubo. El PBS en exceso se retira de las iáJLiy l A^ ,, ,.,«^ fHs?.-. ..amaluMn-t i|M ,!,n ..|.^ perlas mediante torsión con gasa absorbente estéril. Las células de RF261 B2- 106, una clona de fibroblasto de piel de conejo que contiene la plásmida pXF8.186 (figura 9) y que expresa hFVI I I a niveles entre 20, 000 - 25, 000 mU/24h/106 células, se cosecharon a partir de matraces de cultivo de tejido mediante métodos convencionales. Los fibroblastos tripsinizados se centrifugaron hasta un granulo (500xg durante 1 0 minutos), se enjuagaron con Solución de Sal Equilibrada de Hank (H BSS), se centrifugaron, y se volvieron a suspender en un volumen de PBS para lograr una densidad celular de aproximadamente 15 x 106 células/m L. U n volumen que iguala 5 x 106 células se agregó ya sea a tubos de microcentrifugado de 1 .5 mL vacíos o a los tubos que contienen 50 µL de perlas de heparina-Sepharose®, y las suspensiones se centrifugaron a 500xg durante 3 minutos. El volumen final en los tubos que contienen las perlas y las células se ajustó a 1 00µL al retirar el PBS. Se prepararon doce duplicados para cada condición . Los tubos que contienen los granulos celulares y las mezclas de células/perla se colocaron en hielo y se transportaron a la Instalación Animal. Para la inyección intraomental (IO) de células y perlas, los ratonesdesnudos (N I H Swiss Nude (nu/nu, Tac: N : N I H(S)-Hfh 1 nu, Taconic Farms) se anestesiaron y prepararon como se describe en el Ejemplo I I . Los animales se colocaron en recumbencia lateral y el flanco izquierdo entre las costillas y la babada se torció con un cojinete de alcohol y se prepararon con Betadine™. Se realizó una pequeña incisión (0.5 cm a 1 .0 cm) posterior a las costillas y ventral a la espina. El bazo se expuso y exteriorizó suavemente. Mediante el uso de una cánula de calibre 20, los granulos celulares y las mezclas de célula/perla se inyectaron a lo largo del eje del bazo después del aspecto craneal y medio y dentro de la membrana delgada adyacente a la superficie hilar del bazo. El bazo se reemplazó en la cavidad abdominal y se cerró la incisión. Los métodos para la recolección de sangre y la determinación de hFVII I fueron según se describe en el Ejemplo I I . La figura 1 0 muestra los niveles de plasma de hFVI I I con el tiempo después de la inyección de solo células, células y perlas de heparina-Sepharose® cubiertas con bFGF (50ng en total por implante) y células y perlas de heparina-Sepharose® cubiertas con VEGF (100ng en total por implante). Las barras de error indican el error estándar de la media (n = 12 ratones por condición). La expresión pico ocurrió el día 1 . La combinación de célula/perla/VEGF condujo a niveles de hFVI I I significativamente mayores entre los días 28 y 70 en comparación con las otras condiciones.

EJEMPLO Xlll Este ejemplo describe la inyección intraomental en ratonesd?spuc/os de fibroblastos de conejo que expresan h FVI I I , ya sea solo o en combinación con perlas de heparina-Sepharose® cubiertas con factores de crecimiento. Las perlas de heparina-Sepharose® se cubrieron o no con bFGF (1 0µg/mL de perlas empaquetadas) o VEGF (2µg/mL de perlas empaquetadas), según se describe en el Ejemplo I. Las perlas no cubiertas y cubiertas con factor de crecimiento se distribuyeron en tubos según se describe en el Ejemplo XII . Las células de RF302 B2-383, una Láaléá ^f^ clona de fibroblasto de piel de conejo que contiene la plásmida pXF8. 186 y que expresa hFVI II a niveles entre 20,000-25,000 mU/24h/106 células, se cosecharon a partir de matraces de cultivo de tejido mediante métodos convencionales. Las células se procesaron y distribuyeron en tubos de microcentrifugado vacíos o tubos que contienen las perlas de heparina-Sepharose®, según se describe en el Ejemplo VI . La inyección intraomental, la recolección de sangre, y la medición de hFVI I I se llevaron a cabo según se describe en el Ejemplo VI. La figura 1 1 ilustra los niveles de plasma de F VI 11 con el tiempo, después de la inyección de células solas, células y perlas de heparina-Sepharose® no cubiertas, células y perlas de heparina-Sepharose® cubiertas con bFGF (500 ng en total por implante) y células y perlas de heparina-Sepharose® cubiertas con VEGF (100ng en total por implante). Las barras de error indican el error estándar de la media (n = 12 ratones por condición). La expresión pico de F VI 11 ocurrió el día 1 y fue significativamente mayor para el conjunto de bFGF en comparación con todas las otras condiciones los días 1 , 7 y 14. El día 7, la combinación de célula/perla/VEGF condujo a niveles de hFVI I I significativamente mayores en comparación con células solas y la combinación de célula/perla no cubierta.

EJEMPLO XIV Este ejemplo describe la inyección intraomental en ratonesdespuc/os de fibroblastos de conejo que expresan hFVIII, ya sea con microvehículos de colágeno macroporoso o con microvehículos en ±f»¿?á* ti.'¿ a?. combinación con perlas de heparina-Sepharose® cubiertas con factores de crecimiento. Las perlas de heparina-Sepharose® se cubrieron o no con bFGF (10µg/mL de perlas empaquetadas) o VEGF (2µg/mL de perlas empaquetadas), según se describe en el Ejemplo I. Los microvehículos y perlas se prepararon como sigue. Se preparó una mezcla de microvehículos (1 : 1 volumen de microvehículos:medio de acondicionamiento) y se agregaron 0.1 mL de alícuotas a tubos de microcentrifugado de 1.5mL. Estos tubos se centrifugaron a 500xg durante 4 minutos, se aspiraron, y se enjuagaron 2x con PBS. El PBS se retiró y los tubos se almacenaron en hielo. Una mezcla de 0.1 mL de perlas de heparina-Sepharose® (sin cubrir, cubiertas con bFGF o cubiertas con VEGF) en PBS a una proporción de 1 : 1 (vol/vol) se agregó a los tubos que contienen microvehículos y las mezclas de perla/microvehículo se centrifugaron a 500xg durante 4 minutos. El PBS se retiró de cada tubo y los glóbulos de perla/microvehículo se almacenaron en hielo. Las células de RF302 B2-383 se procesaron como se describe en el Ejemplo XII. Un volumen de suspensión celular que contiene 5 x 106 células se agregó a cada tubo que contiene ya sea microvehículos solos o microvehículos y perlas de heparina-Sepharose®, y los tubos se centrifugaron a 500xg durante 4 minutos. El sobrenadante se retiró de cada tubo y se agregaron 10µ! de PBS. Los tubos se colocaron en hielo y se transportaron a la Instalación Animal. La inyección intraomental, la recolección de sangre, y la medición de hFVIII se llevaron a cabo según se describe en el Ejemplo XII.

La figura 12 ilustra los niveles de plasma de hFVIII con el tiempo, después de la inyección de células y microvehículos, células y microvehículos y perlas de heparina-Sepharose® no cubiertas, células y microvehículos y perlas de heparina-Sepharose® cubiertas con bFGF (500 ng en total por implante) y células y microvehículos y perlas de heparina-Sepharose® cubiertas con VEGF (100ng en total por implante). Las barras de error indican el error estándar de la media (n = 12 ratones por condición). La expresión pico de hFVIII ocurrió el día 1 y fue significativamente mayor para el conjunto de bFGF en comparación con todas las otras condiciones los días 1 , 7 y 14.

EJEMPLO XV Los queratinocitos son células epidérmicas de la piel y son normalmente contiguas a fibroblastos en este tejido. Estos dos tipos de células dependen entre sí para los nutrientes adecuados, las señales de diferenciación, y la producción y mantenimiento de la matriz extracelular circundante. La adición de queratinocitos de cualquiera de las matrices o mezclas inyectables descritas en la presente, que contienen fibroblastos, puede beneficiar a los fibroblastos en una manera similar a la que ocurre en la piel. Los queratinocitos y los fibroblastos pueden aislarse de la misma biopsia de piel. Los queratinocitos pueden agregarse de manera simultánea con los fibroblastos al momento de formación de la mezcla o pueden sembrarse sobre una matriz contraída que contiene fibroblastos. Los queratinocítos dentro o sobre la matriz pueden estimularse para diferenciarse o no, dependiendo de la formulación de medio de crecimiento I A?A?étVM A^???*. y de las condiciones de cultivo. Por ejemplo, un incremento en la concentración de iones de calcio en el medio de crecimiento y la exposición de un lado de la matriz al aire, puede originar que los queratinocítos dentro de la matriz se estratifiquen en una manera similar a lo que ocurre en la piel (Bell et al. J. Biomech. Eng. 1 13: 1 1 3- 1 1 9, 1991 ; Parenteau et al., J. Cell. Biochem. 45: 245-251 , 1991 ). Una vez diferenciados, los queratinocitos yacen por debajo de la lámina basal que consiste en colágeno, glicosaminoglícanos y laminina. Estos componentes de lámina basal así como también las proteínas de matriz extracelular, las cuales pueden sintetizarse mediante fibroblastos o incluirse en el medio de producción, proporcionan una estructura fisiológica que es ventajosa para la sobrevivencia de los fibroblastos, por ejemplo, después de la implantación de la matriz en un sujeto o después de la formación in vivo de matrices a partir de mezclas introducidas en un sujeto.

EJEMPLO XVI Las células endoteliales forman el lumen de vasos sanguíneos y capilares. Los recipientes se forman a partir de células endoteliales individuales que se dividen y diferencian para formar tubos contiguos. Este proceso de diferenciación puede estimularse en presencia de factores ambientales esenciales. Estos factores incluyen colágeno, proteínas de matriz extracelulares producidas mediante células tales como fibroblastos y/o queratinocitos y factores de crecimiento (por ejemplo, factor de crecimiento de fibroblasto básico o factor de crecimiento endotelial vascular). Las matrices implantadas, o matrices formadas in vivo después kJU¡L*,&AJt?tá*í«*.*?á****. .. ^j^.,,. , ...... ...^ ..^ ^.y^ ?...^y,.Ji^^a^,^^^^^f..yr,^^y . É.i de la introducción de una mezcla de la invenció en un sujeto, pueden proporcionar el ambiente adecuado para la formación de tubo endotelial si las células endoteliales se agregan al medio o mezclas de producción de matriz, respectivamente, junto con fibroblastos. La adición de queratinocitos puede ayudar a inducir la diferenciación de las células endoteliales a través de la secreción de factores tales como factor de crecimiento endotelial vascular, así como también la producción de lámina basal. La formación de tubos endoteliales dentro de la matriz puede acelerar la vascularización de la matriz después de la implantación mediante inoculación de los tubos endoteliales pre-existentes con los recipientes de sangre en crecimiento del huésped (Black et al., FASEB J . 12: 1 331 -1340, 1998; Black et al. , Cell. Biol. Toxicol. 1 5(2) : 81 -90, 1 999). Las células endoteliales también pueden ser benéficas al liberar factores que promueven la neovascularización.

EJEMPLO XVII La mezclas de la invención se prepararían para su introducción en humanos como sigue: Las células deseadas, típicamente células autólogas transfectadas de manera estable, derivadas del paciente, se cosechan a partir de discos de cultivo de tejido y se procesan para la producción de HCMM o PCHCMM mediante cualquiera de los métodos arriba descritos. La dosis para un paciente dado (es decir, la cantidad fisiológicamente eficaz del producto terapéutico producido mediante la matriz) puede variar mediante la introducción de un volumen mayor o menor de la mezcla en el paciente y/o mediante el uso de células que expresan un nivel diferente del producto por célula cuando se elabora la mezcla. La cantidad del producto terapéutico producido en el paciente puede variar también al exponer las células en la mezcla a una señal farmacológica o fisiológica que altere la expresión del gen terapéutico. Por ejemplo, si el gen terapéutico se encuentra bajo el control de un promotor que responde a glucocorticoides, entonces la exposición in vivo de las células a un fármaco tal como dexametasona (al administrar el fármaco al paciente en una manera que asegure que el fármaco alcance el implante) alterará la expresión del gen terapéutico. Otros elementos de control que responden farmacológicamente se describen en Claxon, Gene Therapy 7: 120- 125, 2000, el cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. Tales elementos incluyen aquellos regulados por tetraciclína antibiótica o sus análogos (por ejemplo, doxicilina), la ecdisona de esteroide de insecto o sus análogos, la mifepristona de antiprogestina (R U486) y los "dimerizadores" químicos tales como rapamicina y sus análogos ("rapálogos") . Las mezclas pueden contener cualquiera de los microvehículos, colágenos (o alternativas), agentes (opcionalmente anexos a substratos sólidos) y células que producen agentes descritos en la presente. También pueden contener opcionalmente queratinocitos y/o células endoteliales. Los microvehículos cargados con cualquiera de las células citadas en la presente pueden congelarse y después deshielarse antes de utilizarse en las mezclas inyectables. La mezcla puede introducirse en una variedad de sitios, incluyendo, pero sin limitarse, sitios subcutáneo, intraperitoneal, intraesplénico, intraomental, inguinal, intratecal, intraventricular, e intramuscular, así como también dentro de nodos linfáticos o dentro de tejido adiposo. La mezcla puede introducirse mediante el uso de, por ejemplo, una jeringa hipodérmica (de plástico o vidrio) opcionalmente tapada con una aguja o catéter. El diámetro de la aguja o el catéter es preferentemente mayor que el diámetro de los microvehículos (por ejemplo, mayor de 0.5 mm) para disminuir el daño a las células y microvehículos suspendidos. El suministro en un sitio interno adecuado puede facilitarse mediante el uso de un laparoscopio. Bajo ciertas circunstancias, puede ser deseable elaborar una incisión quirúrgica, introducir la mezcla y después cerrar la incisión. Las mezclas de la invención pueden formarse de manera simultánea e introducirse en un paciente (o cualquier otro animal). Un aparato adecuado puede construirse para este propósito. Un ejemplo de tal aparato se muestra en la figura 13A. El aparato puede contener dos o más recipientes 1 , todos los cuales se conectan a través de salidas 2 a entradas 3 en una pieza adaptadora 4. La figura 13B muestra una vista transversal de tal pieza adaptadora 4. Las entradas 3 en la pieza adaptadora 4 se encuentran en comunicación fluida, preferentemente en una manera hermética a líquidos, con las salidas 2 de los dos o más recipientes. De manera alternativa, la pieza adaptadora 4 puede contener un solo conector que se encuentra en comunicación fluida, preferentemente en una manera hermética a líquidos, con todas las salidas 2 de los recipientes 1. La pieza adaptadora también contiene una cámara de mezclado 5 y una salida 6 que se encuentra en comunicación fluida, preferentemente en una manera hermética a líquidos, con la única entrada en la terminal 7 de una aguja de jeringa 8. De esta manera, cuando se origina que el contenido del recipiente (al aplicar presión de manera simultánea a los pistones 12) fluya desde las salidas 2 de los recipientes 1 , entra a la cámara de mezclado 5 en la pieza adaptadora 4, donde se mezcla y la mezcla resultante fluye hacia fuera de la salida 5 en la pieza adaptadora 4 y hacia la aguja de jeringa 8. La mezcla se forza entonces hacia la porción de aguja 13 de la aguja de jeringa y, por lo tanto, hacia un tejido o espacio corporal de un animal en el cual se ha insertado la aguja. Los recipientes se unen físicamente entre sí mediante conectores sólidos 9. Una "placa de presión" 10 que conecta las partes superiores de los pistones 12 se incluye con objeto de facilitar la extrusión simultánea de los contenidos de los recipientes. En otra modalidad, en lugar de una pieza adaptadora, la sección de terminal de la aguja de jeringa puede adaptarse para tener entradas separadas que se encuentren en comunicación fluida, preferentemente en una manera hermética a líquidos, con las salidas individuales en los recipientes. Cuando se origina que el contenido de todos los recipiente fluya hacia fuera de las salidas de los recipientes (por ejemplo, al aplicar presión de manera simultánea a los obturadores, cuando los recipientes son jeringas), entran en la terminal de la aguja de jeringa a través de las entradas adecuadas en la terminal y se mezclan en la cámara pequeña formada dentro de la terminal antes de entrar en la porción de aguja del aparato. Según se utiliza en la presente, un "medio b .¿inÁ«>»Li.M. de suministro" puede ser: (a) una aguja de jeringa adaptada como se describe, (b) la pieza adaptadora 4 y la aguja de jeringa 8 arriba descritas, (c) un catéter, (d) una cánula, (e) una pipeta o cualquier objeto en forma de tubo, adecuadamente adaptado, que funcionará como se describe. En un aparato con dos recipientes, uno de los recipientes puede contener, por ejemplo, células, microvehículos y agentes en un medio nutriente, y el otro puede contener una solución de colágeno. En un aparato de tres recipientes, un recipiente puede contener, por ejemplo, células, microvehículos y agentes en un medio nutriente, el segundo recipiente puede contener una solución de colágeno a un pH acídico; y el tercero puede contener medio o diluyente a un pH alcalino, de tal manera que cuando se mezclen los contenidos de los tres recipientes, se forme una suspensión acuosa a un pH de aproximadamente 7.2 hasta aproximadamente 7.8, preferentemente de aproximadamente 7.4 hasta aproximadamente 7.8. Sin embargo, se entiende que los diversos componente de las mezclas de matriz híbridas de la ¡nvención pueden distribuirse entre los dos o tres recipientes del dispositivo en cualquier combinación conveniente. Aunque al utilizar tal aparato, la introducción de la mezcla en el animal ocurre en breve después de la formación de la mezcla a partir de sus componentes, para los propósitos de la invención, puede decirse que los dos casos ocurren de manera simultánea. La invención incluye un recipiente que contiene cualquiera de las mezclas expuestas en la presente (ver "Breve Descripción de la Invención"). Tal recipiente puede incluirse junto con el material de embarque (por ejemplo, un contenedor de embarque), en un equipo. Se evaluó la factibilidad de embarque de las mezclas inyectables en un solo recipiente que contiene todos los componentes. Se llevaron a cabo dos estudios con mezclas de fluido de HSHCM inyectable. Para ambos, el componente de perla de heparina-Sepharose® se cubrió con bFGF a una concentración de 50µg/mL de perlas empaquetadas. Un volumen de 10 mL de medio de producción completo, preparado como se perfila en la Tabla 9, se agregó a cada una de las tres jeringas plásticas de 10cc, las cuales después de taparon y almacenaron a 4°C durante 24h. Las jeringas se retiraron del ambiente a 4°C, se taparon con agujas de calibre 16 y el contenido se inyectó en discos de Petri de 100mm. Los discos se colocaron en una incubadora a una temperatura de 37°C, humedad de 95% a 98% y nivel de CO2 de 5%. Después de 1 hora, los discos se retiraron y se alimentaron mediante la adición de 20mL de DMEM sin rojo fenólico y se regresaron a la incubadora. La disminución de diámetro de la matriz sólida, con relación al diámetro de la mezcla líquida ("reducción de diámetro"), número de células y disponibilidad de las células se determinaron después de 24h de incubación a 37°C. La "reducción de diámetro" se determinó mediante la colocación de una regla más allá de cada disco, midiendo el diámetro de la matriz en centímetros, y restando el diámetro de la matriz del diámetro del disco de 100mm. La diferencia de diámetro se dividió entre el diámetro del disco de 100mm y se expresó como un porcentaje. El número y la disponibilidad celular se determinaron como se describe arriba. La Tabla 10 resume los resultados de los dos experimentos de almacenamiento. Los experimentos #1 y #2 difieren en el número de células incorporadas por mL de medio de producción según se ?&íiLÁrát ii?iÁ,, describe (n = 3 jeringas por estudio). TABLA 10. Estudio de Almacenamiento de HSHCM Inyectable De manera alternativa, ya que una solución de colágeno neutralizada se gelificará más rápidamente que una solución de colágeno acídica, podría ser ventajoso separar los componentes del material inyectable en un equipo con el propósito de embarcar el materíal hacia una ubicación externa. Por ejemplo, un equipo podría contener tres recipientes (por ejemplo, tubos, jeringas, botellas o frascos) , los contenidos de los cuales se combinan inmediatamente antes de la introducción en el paciente (es decir, antes de que la mezcla se haya solidificado hasta tal grado en que ya no fluya fácilmente desde la jeringa, cánula o cualquier medio que se utilice para suministrar la suspensión). Los componentes podrían, por ejemplo, separarse de la siguientes manera: recipiente 1 puede contener células + microvehículos y, opcionalmente perlas de heparina-Sepharose® en una mezcla; el recipiente 2 puede contener una solución de colágeno a pH acídico (aproximadamente 2.0 hasta aproximadamente 4.0); y el recipiente 3 puede contener medio concentrado (por ejemplo, medio nutriente u otro diluyente) sin suero y a un pH alcalino (aproximadamente 9.0 hasta aproximadamente 12.0). El pH del medio concentrado se seleccionaría para asegurar la neutralización de la solución de colágeno a un pH fisiológico (por ejemplo, pH 7.4) cuando se combinen el medio y las soluciones de colágeno. Inmediatamente antes de la inyección en el paciente, el contenido del recipiente 3 (medio) se mezclaría con el contenido del recipiente 2 (solución de colágeno) . El medio + el colágeno combinados, los cuales en este momento se encontrarán neutralizados a un pH fisiológico, se agregarían entonces a la mezcla de célula/microvehículo/perla de heparina-Sepharose® y se mezclarían concienzudamente para formar la mezcla final. Esta mezcla final se inyectaría entonces en el paciente, opcionalmente mediante el uso de una jeringa hipodérmica u otro aparato distribuidor de líquido suministrado con el equipo. De manera alternativa, un equipo podría contener dos recipientes, conteniendo el primer recipiente el mismo componente que el recipiente 1 en el equipo arriba descrito. El segundo componente podría contener una solución de colágeno en la cual el colágeno se disuelve, por ejemplo, en medio nutriente y el cual se encuentra a un pH acídico. Inmediatamente antes de la inyección , el pH de la solución de colágeno se ajusta hasta aproximadamente 7.2 hasta aproximadamente 7.4, preferentemente de aproximadamente 7.4 hasta aproximadamente 7 8, mediante el uso de una solución alcalina (por ejemplo, una solución de NaOH). Una alícuota de tal solución alcalina podría incluirse opcionalmente en un tercer recipiente en el equipo. En lugar de proporcionar la solución de colágeno a un pH acídíco, puede proporcionarse a un pH de aproximadamente 7.2 hasta aproximadamente 7.8, preferentemente de aproximadamente 7.4 hasta aproximadamente 7.8, siempre y cuando se mantenga frío (por ejemplo, por debajo de 8°C) hasta inmediatamente antes de mezclarse con los otros componentes y su introducción en el paciente. Los equipos de la invención pueden incluir opcionalmente etiquetas o inserciones con instrucciones de uso del equipo, por ejemplo, instrucciones sobre la manera de combinar los contenidos de los recipientes y administrar la mezcla resultante a un sujeto. El mantener fría la mezcla previene la gelificación del colágeno.

Otras Modalidades Las matrices y mezclas de la invención son adecuadas para el suministro de n amplio rango de productos celulares, incluyendo no solamente hGH y Factor VIII, sino también Factor IX, eritropoietina (EPO), albúmina, hemoglobina, alfa-1 antitripsina, calcitonina, glucocerebrosidasa, receptor de lipoproteína de baja densidad (LDL), receptor de IL-2, globina, inmunoglobulina, anticuerpos catalíticos, las ¡nterleuquinas, insulina, factor 1 de crecimiento similar a la insulina (IGF- 1 ), insulinotropina, hormona paratiroide (PTH), leptina, un I FN (por ejemplo, IFN-a, IFN-ß, o IFN-?), los factores de crecimiento nervioso, factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF), FGF acídico (aFGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento celular endotelial, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factores de crecimiento de transformación, factor de angiogénesis de estimulación celular endotelial (ESAF), angiogenina, activador de plasminogen de tejido (t-PA), factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulador de colonias de granulocitos-macrógafo (GM-CSF), a- galactosidasa, y FSH . Por ejemplo, las células en las mezclas o incrustadas en las matrices pueden ser células beta pancreáticas que segregan de manera natural insulina en respuesta a una elevación de la glucosa sanguínea y las cuales, por consiguiente, pueden complementar una respuesta de insulina inadecuada en un paciente diabético o pre- diabético. De manera alternativa, pueden ser cualquier tipo de célula genéticamente diseñada para expresar y segregar niveles elevados de un polipéptido necesario, tal como un factor de coagulación, dentro del paciente. Tal construcción puede ser bajo el control de un promotor activado de manera constitutiva o de un promotor regulado adecuadamente de manera fisiológica o farmacológica. La porción de gel de colágeno de la mezcla o matriz puede consistir por entero en colágeno o puede contener otros componentes en lugar de o en adición al colágeno: por ejemplo, agarosa; alginato; un glicosaminoglicano tal como ácido hialuronico, sulfato de heparina, sulfato de dermatano, sulfato de condroitina; un porteoglicano sulfatado; fibronectina; laminína; elastina; fibrina; tenascina; tejido adoposo atenuado; tejido omental atenuado; celulosa de metilo; o gelatina. Tales componentes (particularmente aquellos que se encuentran en la matriz extracelular de tejidos animales) contribuyen a la estabilidad estructural de las matrices híbridas de la invención y las matrices obtenidas mediante solidificación in vivo de las mezclas de la invención y/o proporcionar capacidad de anexión adicional para las células en las matrices y el tejido huésped en el sitio de implantación de la matriz. Se mezclarían en la mezcla de matriz antes de su introducción en un animal o antes de la gelificación in vitro. Aunque las mezclas de la invención preferentemente contendrán colágeno (o una o más de las alternativas arriba listadas), se entiende que la invención también incluye mezclas que carecen de colágeno (o cualquiera de las alternativas anteriores). En tal caso, (es decir, cuando no se utiliza material de matriz) , la solución inyectada nos e solidifica para formar una masa discreta dentro del animal. El grado en el cual se dispersa el material inyectado del sitio de implantación depende de las características estructurales del sitio. La dispersión de las células enlazadas a microvehículo puede preferirse en algunas situaciones. Otros aditivos potenciales incluyen citocinas y/o factores de crecimiento que son útiles en la optimización del mantenimiento de las células o que promueven la interacción benéfica con el tejido huésped (por ejemplo, vascularización), incluyendo bFGF, aFGF, factor de crecimiento celular endotelial, PDGF, factor de angiogénesis de estimulación celular endotelial (ESAF), leucotrieno C4, prostaglandinas (por ejemplo, PGEi , PGE2), IGF- 1 -, GCSF, angiogenina, TGF-a, TGF-ß, ácido ascórbico, EGF, oncostatina M, VEGF, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C y VEG F-D. Estos aditivos pueden incorporarse en la matriz al mezclarlos con la solución de colágeno antes de la gelificación o introducción en un animal, mediante su introducción en los intersticios de los microvehículos, o al incluirlos en el medio que baña las matrices. También pueden enlazarse o encapsularse dentro de substratos sólidos separados (por ejemplo, perlas de agarosa cubiertas de heparina o microcápsulas de PLGA) incluidas en las matrices o mezclas. De manera alternativa, las células pueden diseñarse genéticamente para expresar el producto deseado. Por ejemplo, las células de la matriz pueden cotransfectarse con un ADN que codifica un factor de angiogénesis y un ADN que codifica una segunda proteína terapéutica o con una sola construcción de ADN que codifica ambos tipos de proteínas enlazados a secuencias de control de expresión adecuadas. El ácido ascórbico promueve la producción de colágeno maduro mediante fibroblastos al promover la adecuada modificación post- traslacional de procolágeno. La producción de colágeno mediante fibroblastos incrustados dentro de la matriz o mezcla incrementará la resistencia física de la matriz así como también proporcionará una arquitectura fisiológica que puede incrementar la sobrevivencia en un animal. El colágeno utilizado en las matrices y mezclas puede ser de cualquier tipo adecuado (por ejemplo, tipo l-XI) o una mezcla de cualesquiera dos o más. Las fibras pueden colocarse en el molde antes de la gelificación del colágeno, a fin de que se vuelvan parte integral de la matriz y contribuyan a la fortaleza y conveniencia de manejo de la matriz. Si se agregaran las fibras, se elaborarían principalmente de colágeno (por ejemplo, catgut) o un material diferente al colágeno tal como nylon, dacron , politetrafluoroetileno (Gore-Tex™ o Teflon™), ácido poliglicolico, mezcla de ácido poliláctico/poliglicolico (Vicryl™), poliestireno, copolímero de polívinilcloruro, celulosa (por ejemplo, algodón o lino), poliéster, rayón o seda. Las fibras en las matrices pueden ser tejidas en una maya o tela o utilizarse como filamentos individuales. En lugar de los microvehículos de colágeno de Tipo I descritos en los ejemplos anteriores, uno podría utilizar microvehículos que consisten básicamente en otro tipo de colágeno, poliestireno, dextrano (por ejemplo, Cyotdex™, Pharmacia), poliacrilamida, celulosa, alginato de calcio, látex, polisulfona, vidrio (cubierto con una substancia tal como colágeno que promueve la adhesión celular), gelatina, o combinaciones de colágeno con cualquiera de los anteriores. Tales microvehículos se encuentran comercialmente disponibles o pueden elaborarse mediante métodos estándares, después se esterilizan para utilizarse en las matrices y mezclas de la ¡nvención. 10 Otras modalidades se encuentran dentro de las siguientes reivindicaciones. Lo que se reivindica es:

Claims

REIVINDICACIONES 1 . Una composición caracterizada porque comprende un cuerpo de material de matriz que comprende fibrillas de colágeno no solubles, incrustándose así dentro del cuerpo del material de matriz (a) una población de células vertebradas cultivadas, genéticamente diseñadas para expresar un polipéptido; (b) una pluralidad de microvehículos; y (c) un agente enlazado a un substrato sólido incrustado en el cuerpo del material de matriz, en donde el agente se selecciona a partir del grupo que consiste en un factor que promueve la vascularización , una citosina, un factor de crecimiento y ácido ascórbico. 2. La composición según la reivindicación 1 , caracterizada porque el substrato sólido comprende (a) heparina o (b) proteoglicano de sulfato de heparano. 3. La composición según la reivindicación 1 , caracterizada porque el substrato sólido comprende agarosa con heparina o proteoglicano de sulfato de heparano enlazado a la misma. 4. La composición según la reivindicación 3, caracterizada porque el substrato sólido comprende además alginato de calcio. 5. La composición según la reivindicación 1 , caracterizada porque el substrato sólido comprende además alginato de calcio. 6. La composición según la reivindicación 1 , caracterizada porque el substrato sólido comprende una substancia seleccionada a partir del grupo que consiste en colágeno, gelatina, acetato de etileno-vinilo, copolímero políláctido/ácido glicólico, fibrina, octasulfato de sucrosa , ?li lül É iiflrtrN t^i -M>»~****J| ' - ' f - < dextrano, glicol de polietileno, un alginato, políacrilamída, celulosa, látex y poli hidroxietil metacrilato. 7. La composición según la reivindicación 6, caracterizada porque la heparina o porteoglicano de sulfato de heparano se enlazan a la substancia. 8. La composición según la reivindicación 1 , caracterizada porque la composición comprende además un segundo agente seleccionado a partir del grupo que consiste en un factor que promueve la vascularización , una citosina y un factor de crecimiento. 9. La composición según la reivindicación 1 , caracterizada porque el substrato sólido se encuentra en forma de perlas. 10. La composición según la reivindicación 1 , caracterizada porque el substrato sólido se encuentra en forma de filamentos. 1 1 . La composición según la reivindicación 1 , caracterizada porque el agente es factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF). 12. La composición según la reivindicación 1 , caracterizada porque el agente se selecciona a partir del grupo que consiste en factor de crecimiento de fibroblasto acídico (aFG F) , factor de crecimiento celular endotelial, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDG F), factor de angiogénesis de estimulación celular endotelial (ESAF), leucotrieno C4, una prostaglandina, factor de crecimiento 1 similar a la insulina (IGF-1 ), factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF), angiogenina, factor-a de crecimiento de transformación (TGF-a), factor-ß de crecimiento de transformación (TGF-ß, ácido ascórbico, factor de crecimiento epidérmico (EGF) y oncostatina M . 13. La composición según la reivindicación 1 , caracterizada porque el agente se selecciona a partir del grupo que consiste en factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C y VEGF-D. 14. La composición según la reivindicación 1 , caracterizada porque el agente es angiopoietina 1 , 2, 3 o 4. 15. La composición según la reivindicación 1 , caracterizada porque comprende además células que segregan el agente. 16. La composición según la reivindicación 1 , caracterizada porque las células vertebradas cultivadas se seleccionan a partir del grupo que consiste en adipositos, astrositos, células musculares cardiacas, condrocitos, células endoteliales, células epiteliales, fibroblastos, gangliocitos, células glandulares, células gliales, células hematopoyeticas, hepatocitos, queratinocitos, mioblastos, células neurales, osteoblastos, células beta pancreáticas, células renales, células musculares suaves, células musculares estriadas y precursores de cualquiera de los anteriores. 17. La composición según la reivindicación 1 , caracterizada porque las células vertebradas cultivadas son células humanas. 18. La composición según la reivindicación 1 , caracterizada porque el polipéptido se selecciona a partir del grupo que consiste en enzimas, hormonas, citocinas, factores estimuladores de colonia, antígenos de vacuna, anticuerpos, factores de coagulación, proteínas reguladoras, factores de transcripción, receptores y proteínas estructurales. 19. La composición según la reivindicación 1 , caracterizada porque el polipéptido es Factor VIII. 20. La composición según la reivindicación 1 , caracterizada porque el polipéptido es hormona de crecimiento humana. 21. La composición según la reivindicación 1 , caracterizada porque el polipéptido es Factor IX. 22. La composición según la reivindicación 1 , caracterizada porque el polipéptido es eritropoietina. 23. La composición según la reivindicación 1 , caracterizada porque el polipéptido se selecciona a partir del grupo que consiste en VEGF, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C y VEGF-D. 24. La composición según la reivindicación 1 , caracterizada porque el polipéptido es insulinotropina. 25. La composición según la reivindicación 1 , caracterizada porque el polipéptido se selecciona a partir del grupo que consiste en alfa- 1 antitripsina, calcitonina, glucocerebrosidasa, receptor de lipoproteína de baja densidad (LDL), receptor de IL-2, globina, inmunoglobulina, anticuerpos catalíticos, las interleuquinas, insulina, factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1 ), hormona paratiroíde (PTH), leptina, los factores de crecimiento nervioso, factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF), FGF acídico (aFGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento celular endotelial, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factores de crecimiento de transformación, factor de angiogénesis de estimulación celular endotelial (ESAF), angiogenina, activador de plasminogen de tejido (t-PA), factor de ^.t AOÜ^.^ | Mtaa^^tfteHtfMM|tii estimulación de colonias de granulocitos (G-CSF), y factor de estimulación de colonias de granulocito-macrófago (GM-CSF). 26. La composición según la reivindicación 1 , caracterizada porque las microesferas son perlas de colágeno Tipo I. 27. La composición según la reivindicación 26, caracterizada porque los microvehículos son porosos. 28. La composición según la reivindicación 1 , caracterizada porque los microvehículos son perlas de gelatina porosa. 29. La composición según la reivindicación 1 , caracterizada porque la mayoría de los microvehículos tiene una forma aproximadamente esférica y tiene un diámetro entre aproximadamente 0.1 y aproximadamente 2 mm. 30. La composición según la reivindicación 1 , caracterizada porque el material de matriz adicionalmente comprende una substancia seleccionada a partir del grupo que consiste en un segundo tipo de colágeno, agarosa, alginato, fíbronectina, laminina, ácido hialurónico, sulfato de heparano, sulfato de dermatano, proteoglicanos sulfatados, fibrina, elastina y tenascina. 31. La composición según la reivindicación 1 , caracterizada porque comprende adicionalmente fibras diferentes a colágeno, dispersas dentro del cuerpo del material de matriz. 32. La composición según la reivindicación 31 , caracterizada porque las fibras diferentes a colágeno comprenden un material seleccionado a partir del grupo que consiste en nylon, dacron, politetrafluoroetileno, ácido poliglícólico, copolímero de ácido ><ádM? ?. **t *i.??~*~.*.^.y^„ poliláctico/poliglicólico, poliestireno, polivinilcloruro, catgut, algodón, lino, poliéster y seda. 33. La composición según la reivindicación 1 , caracterizada porque se encuentra configurada para implantarse en un paciente. 34. La composición según la reivindicación 33, caracterizada porque las células vertebradas cultivadas se derivan de una o más células retiradas del paciente. 35. La composición según la reivindicación 34, caracterizada porque las células vertebradas cultivadas consisten en una población clonal. 36. La composición según la reivindicación 1 , caracterizada porque cada uno de la pluralidad de microvehículos consiste básicamente en una o más substancias seleccionadas a partir del grupo que consiste en colágeno, poliestireno, dextrano, poliacrilamida, celulosa, alginato de calcio, látex, polisulfona y vidrio. 37. La composición según la reivindicación 1 , caracterizada porque las células vertebradas cultivadas son fibroblastos. 38. La composición según la reivindicación 1 , caracterizada porque los microvehículos tienen una forma aproximadamente esférica. 39. La composición según la reivindicación 37, caracterizada porque comprende además queratinocitos. 40. La composición según la reivindicación 39, caracterizada porque los queratinocitos y los fibroblastos se obtienen del mismo individuo. 41. La composición según la reivindicación 39, caracterizada porque comprende además uno o más factores de diferenciación de queratinocitos. 42. La composición según la reivindicación 41 , caracterizada porque el factor de diferenciación de queratinocitos comprende iones de calcio a una concentración de 1.5-2 mM. 43. La composición según la reivindicación 1 , caracterizada porque comprende además células endoteliales. 44. La composición según la reivindicación 37, caracterizada porque comprende además células endoteliales. 45. La composición según la reivindicación 44, caracterizada porque las células endoteliales y los fibroblastos se obtienen del mismo individuo. 46. La composición según la reivindicación 1 , caracterizada porque el polipéptido se selecciona a partir del grupo que consiste en interferón-a (IFN-a), interferón-ß (IFN-ß), interferón ? (IFN-?), hormona estimuladora de folículos (FSH), a-galactosidasa, ß-gluseramidasa, a-iduronidasa, 2-sulfatasa de iduronato, glucosamina-N-sulfatasa, a-N-acetilglucosaminidasa, acetilcoenzima A:a-glucosaminida-N-acetiltransferasa, N-acetilglucosam?na-6-sulfatasa, ß-galactosidasa, N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa y ß-glucorunidasa. 47. La composición según la reivindicación 1 , caracterizada porque el material de matriz adicionalmente comprende una substancia seleccionada a partir del grupo que consiste en heparina, celulosa, almidón y dextrano. 48. Un método para elaborar una composición, caracterizado ¡ tLá.íÍ.íÉL. "Üit it iÉiiiii f ni npt"*-- - ^-~ ^mi- tfrttti t*** *****^ ^^ SÉ^ÜÉÉ i el método porque comprende la formación de una mezcla que comprende: (a) una pluralidad de células vertebradas cultivadas, genéticamente diseñadas para expresar un polipéptido; (b) una pluralidad de microvehículos; (c) una solución que comprende colágeno soluble; y (d) un agente enlazado a un substrato sólido, en donde el agente se selecciona a partir del grupo que consiste en un factor que promueve la vascularización , una citosina, un factor de crecimiento y ácido ascórbico; sujetar el colágeno soluble en la mezcla a condiciones eficaces para formar un gel ; y exponer el gel a condiciones de cultivo que originan que se contraiga el gel, formando así el cuerpo de la composición. 49. El método según la reivindicación 48, caracterizado porque la solución es una solución acuosa acídica de colágeno soluble y la gelificación se lleva a cabo al elevar el pH de la solución. 50. El método según la reivindicación 48, caracterizado porque la etapa de gelificación toma lugar en un molde, a fin de que, antes de la etapa de contracción, el gel se encuentre en la forma del molde. 51 . El método según la reivindicación 48, caracterizado porque las células vertebradas cultivadas se cultivan en presencia de los microvehículos antes de mezclarse con la solución. 52. Un método para administrar un polipéptido a un paciente que necesita el mismo, caracterizado porque comprende proporcionar la composición según la reivindicación 33, en donde las células vertebradas cultivadas segregan el polipéptido; e implantar la composición en el paciente. 53. El método según la reivindicación 52, caracterizado porque las células vertebradas cultivadas se derivan de una o más células retiradas del paciente y se han diseñado genéticamente in vitro para expresar y segregar el polipéptido. 54. El método según la reivindicación 52, caracterizado porque la implantación se lleva a cabo en un sitio subcutáneo en el paciente. 55. El método según la reivindicación 52, caracterizado porque la implantación se lleva a cabo en un sitio intraperitoneal, capsular sub-renal, inguinal, intramuscular, intraventricular, ¡ntraomental o intratecal en el paciente. 56. El método según la reivindicación 52, caracterizado porque el polipéptido es uno que promueve la sanación de heridas y la implantación se lleva a cabo en el sitio de una herida pre-exístente del paciente. 57. El método según la reivindicación 48, caracterizado porque el gel se forma en un molde de fondo plano relleno con la mezcla hasta una profundidad de aproximadamente 0.18 mm. 58. U na composición producida mediante el método según la reivindicación 57. 59. El método según la reivindicación 48, caracterizado porque el gel se forma en un molde cilindrico de fondo plano con un radio interno (r); la mezcla tiene un volumen (V); y cuando r se expresa en cm y V se expresa en ml, r2/V es aproximadamente 1 .8. 60. Un método para elaborar la composición según la reivindicación 39, caracterizado porque comprende la formación de una mezcla que comprende: (a) una pluralidad de células vertebradas cultivadas, genéticamente diseñadas para expresar un polipéptido; (b) una pluralidad de microvehículos; y (c) una solución que comprende colágeno soluble; sujetar el colágeno soluble en la mezcla a condiciones eficaces para formar un gel; y exponer el gel a condiciones de cultivo que originan que se contraiga el gel, formando así el cuerpo de la composición; y agregar queratinocitos al cuerpo de la composición después de que el gel e ha contraído. 61 . Una solución caracterizada porque comprende un cuerpo de material de matriz que comprende fibrillas de colágeno insolubles, incrustándose dentro del cuerpo de material de matriz (a) una primer población de células vertebradas cultivadas, genéticamente diseñadas para expresar un polipéptido; (b) una segunda población de células vertebradas cultivadas que segregan un agente seleccionado a partir del grupo que consiste en un factor que promueve la vascularización, una citosina y un factor de crecimiento; y (c) una pluralidad de mícrovehículos. 62. La composición según la reivindicación 61 , caracterizada porque las células vertebradas cultivadas de la segunda población se diseñan genéticamente para expresar el agente. 63. La composición según la reivindicación 61 , caracterizada porque comprende además una tercer población de células vertebradas cultivadas que expresan y segregan un segundo agente seleccionado a partir del grupo que consiste en un factor que promueve la vascularización , una citosina, y un factor de crecimiento. 64. La composición según la reivindicación 61 , caracterizada porque se encuentra configurada para implantarse en un paciente. 65. Un método para elaborar la composición según la reivindicación 61 , caracterizado porque comprende la formación de una mezcla que comprende: (a) una primer población de células vertebradas cultivadas, genéticamente diseñadas para expresar un polipéptido; (b) una segunda población de células vertebradas cultivadas que segregan un agente seleccionado a partir del grupo que consiste en un factor que promueve la vascularización, una citosina y un factor de crecimiento; (c) una pluralidad de microvehículos; y (d) una solución que comprende colágeno soluble; sujetar el colágeno soluble en la mezcla a condiciones eficaces para formar un gel; y exponer el gel a condiciones de cultivo que originan que se contraiga el gel, formando así el cuerpo de la composición. 66. Un método para administrar un polipéptido a un paciente iá ^Aü^..^,. ... . ^„ •* ?- L*MM JjfoÉflffflt- T llftiitl- flt-f que necesita el mismo, caracterizado porque comprende: proporcionar la composición según la reivindicación 64, en donde las células vertebradas cultivadas de la primer población segregan el polipéptido; e implantar la composición en el paciente. 67. Un método para elaborar una composición, caracterizado el método porque comprende la formación de una mezcla que comprende: (a) una pluralidad de células vertebradas cultivadas, genéticamente diseñadas para expresar un polipéptido; (b) una pluralidad de mícrovehículos; y (c) una solución que comprende colágeno soluble; sujetar el colágeno soluble en la mezcla a condiciones eficaces para formar un gel; y exponer el gel a condiciones de cultivo que originan que se contraiga el gel, formando así el cuerpo de la composición, en donde el gel se forma en un molde de fondo plano relleno con la mezcla hasta una profundidad de aproximadamente 0. 1 8 cm . 68. Una composición producida mediante el método según la reivindicación 67. 69. Un método para elaborar una composición, caracterizado el método porque comprende la formación de una mezcla que comprende: (a) una pluralidad de células vertebradas cultivadas, genéticamente diseñadas para expresar un polipéptido; (b) una pluralidad de microvehículos; y (c) una solución que comprende colágeno soluble; sujetar el colágeno soluble en la mezcla a condiciones eficaces para formar un gel; y exponer el gel a condiciones de cultivo que originan que se contraiga el gel, formando así el cuerpo de la composición, en donde el gel se forma en un molde cilindrico de fondo plano con un radio interno (r); la mezcla tiene un volumen (V); y cuando r se expresa en cm y V se expresa en ml, r2/V es de aproximadamente 1.8. 70. Una composición caracterizada porque comprende un cuerpo de material de matriz que comprende fibrillas de colágeno insolubles, incrustándose dentro del cuerpo de material de matriz (a) una pluralidad de fibroblastos cultivados, genéticamente diseñados para expresar un polipéptido; (b) una pluralidad de queratinocitos; y (c) una pluralidad de microvehículos. 71 . La composición según la reivindicación 70, caracterizada porque los queratinocitos y los fibroblastos se obtienen del mismo individuo. 72. Un método para elaborar la composición según la reivindicación 70, caracterizada porque comprende la formación de una mezcla que comprende: (a) una pluralidad de fibroblastos cultivados, genéticamente diseñados para expresar un polipéptido; (b) una pluralidad de queratinocitos; (c) una pluralidad de microvehículos; y (d) una solución que comprende colágeno soluble; sujetar el colágeno soluble en la mezcla a condiciones eficaces para formar un gel; y exponer el gel a condiciones de cultivo que originan que se contraiga el gel, formando así el cuerpo de la composición. 73. Una composición caracterizada porque comprende un cuerpo de material de matriz que comprende fibrillas de colágeno insolubles, incrustándose así dentro del cuerpo de material de matriz (a) una pluralidad de fibroblastos cultivados, genéticamente diseñados para expresar un polipéptido; (b) una pluralidad de células endoteliales; y (c) una pluralidad de microvehículos. 74. La composición según la reivindicación 73, caracterizada porque las células endoteliales y los fibroblastos se obtienen del mismo individuo. 75. Una mezcla caracterizada porque comprende, suspendidos en una solución de colágeno acuosa, (a) una pluralidad de células vertebradas cultivadas, genéticamente diseñadas para expresar un polipéptido; (b) una pluralidad de microvehículos; y (c) al menos un agente seleccionado a partir del grupo que consiste en un factor que promueve la vascularización, una citosina, un factor de crecimiento, y ácido ascórbico, en donde el al menos un agente se enlaza a un substrato sólido suspendido en la solución de colágeno, en donde existe suficiente colágeno en la mezcla para permitir que la mezcla se gelifique a un pH por encima de 5. 76. Un método para la elaboración de una mezcla, caracterizado porque el método comprende: combinar (a) una pluralidad de células vertebradas cultivadas, genéticamente diseñadas para expresar un polipéptido, (b) una pluralidad de microvehículos, (c) al menos un agente seleccionado a partir del grupo que consiste en un factor que promueve la vascularización, una citosina, un factor de crecimiento, y ácido ascórbico y (d) una solución que comprende colágeno soluble, en donde existe suficiente colágeno en la mezcla para permitir que la mezcla se gelifique a un pH por encima de 5. 77. Una mezcla caracterizada porque comprende, suspendidos en una solución de colágeno acuoso, (a) una primer población de células vertebradas cultivadas, genéticamente diseñadas para expresar un polipéptido; (b) una segunda población de células vertebradas cultivadas que segregan un agente seleccionado a partir del grupo que consiste en un factor que promueve la vascularización, una citosina y un factor de crecimiento; y (c) una pluralidad de microvehículos, en donde existe suficiente colágeno en la mezcla para permitir que la mezcla se gelifique a un pH por encima de 5. 78. Un método para la elaboración de la mezcla según la reivindicación 77, caracterizado porque el método comprende combinar: (a) una primer población de células vertebradas cultivadas, genéticamente diseñadas para expresar un polipéptido; (b) una segunda población de células vertebradas cultivadas ¡L;LJlÁ.LÍÍ,a«Í . i- .- .a¡*fc»JJ¡ . - «fet>* - que segregan un agente seleccionado a partir del grupo que consiste en un factor que promueve la vascularización, una citosina y un factor de crecimiento; (c) una pluralidad de microvehículos; y (d) una solución que comprende colágeno soluble, en donde existe suficiente colágeno en la mezcla para permitir que la mezcla se gelifique a un pH por encima de 5. 79. El método según la reivindicación 78, caracterizado porque comprende además incluir en la mezcla un substrato sólido que comprende una substancia que se enlaza al agente. 80. Un método para administrar un polipéptido a un paciente que necesita el mismo, caracterizado el método porque comprende proporcionar una composición que comprende una población de células vertebradas cultivadas, genéticamente diseñadas para expresar un polipéptido, una pluralidad de microvehículos, al menos un agente enlazado a un substrato sólido incrustado en el cuerpo del material de matriz, en donde el al menos un agente se selecciona a partir del grupo que consiste en un factor que promueve la vascularización, una citosina, un factor de crecimiento y ácido ascórbíco, y colágeno, e introducir la composición en el paciente. 81. Un método para administrar un polipéptido a un paciente que necesita el mismo, caracterizado el método porque comprende proporcionar una composición que comprende una primer población de células vertebradas cultivadas, genéticamente diseñadas para expresar un polipéptido, una segunda población de células vertebradas cultivadas, que segregan un agente seleccionado a partir del grupo que consiste en un factor que promueve la vascularización, una citosina, y un factor de crecimiento, una pluralidad de microvehículos, y colágeno, e introducir la composición en el paciente. 82. U n método para administrar un polipéptido a un paciente que necesita el mismo, caracterizado el método porque comprende proporcionar una mezcla de fluido que comprende, suspendidos en solución acuosa una población de células vertebradas cultivadas, genéticamente diseñadas para expresar un polipéptido, y una pluralidad de microvehículos, e introducir la mezcla de fluido en el paciente. 83. El método según la reivindicación 82, caracterizado porque la mezcla comprende además colágeno soluble. 84. El método según la reivindicación 82, caracterizado porque la mezcla comprende además una substancia seleccionada a partir del grupo que consiste en tejido adiposo atenuado, tejido omental atenuado, celulosa de metilo, alginato, gelatina y fibrina. 85. El método según la reivindicación 82, caracterizado porque la introducción de la mezcla en el paciente es mediante una jeringa hipodérmica. 86. El método según la reivindicación 85, caracterizado porque la jeringa se tapa con una aguja de jeringa o un catéter. 87. El método según la reivindicación 82, caracterizado porque la introducción en el paciente es mediante un catéter. 88. El método según la reivindicación 82, caracterizado porque la introducción en el paciente es mediante una pipeta. 89. El método según la reivindicación 83, caracterizado porque la combinación de las células vertebradas cultivadas, los microvehículos y el colágeno soluble para formar la mezcla ocurre de manera simultánea con la introducción de la mezcla en el paciente. 90. Un método para administrar un polipéptido a un paciente que necesita el mismo, caracterizado el método porque comprende proporcionar una mezcla de fluido que comprende una solución acuosa de colágeno y, suspendidos en la solución, una población de células vertebradas cultivadas, genéticamente diseñadas para expresar el polipéptido, y una pluralidad de microvehículos; e introducir la mezcla de fluido en el paciente. 91. Un equipo caracterizado porque comprende un contenedor de empaque que contiene (a) un primer recipiente que comprende (i) una población de células vertebradas cultivadas, genéticamente diseñadas para expresar un polipéptido, y (ii) una pluralidad de microvehículos; (b) un segundo recipiente que comprende una solución de colágeno; y (c) un tercer recipiente que comprende el medio. 92. El equipo según la reivindicación 91 , caracterizado porque la solución de colágeno se encuentra a un pH acídico y el medio se encuentra a un pH alcalino. 93. El equipo según la reivindicación 91 , caracterizado porque la solución de colágeno se encuentra a una temperatura por debajo de 8°C. 94. Un método para preparar una mezcla mediante el uso del equipo según la reivindicación 91 , caracterizado el método porque comprende: (a) combinar el contenido del segundo y tercer recipientes para formar una solución de colágeno diluida; y (b) combinar la solución de colágeno diluida con el contenido del primer recipiente para formar una mezcla. 95. El método según la reivindicación 94, caracterizado porque comprende además la etapa de introducir la mezcla en un paciente antes de la solidificación de la mezcla. 96. Un equipo caracterizado porque comprende un contenedor de empaque que contiene (a) un primer recipiente que comprende (i) una población de células vertebradas cultivadas, genéticamente diseñadas para expresar un polipéptido, y (ii) una pluralidad de microvehículos; y (b) un segundo recipiente que comprende una solución de colágeno. 97. El equipo según la reivindicación 96, caracterizado porque la solución de colágeno se encuentra a un pH acídico. 98. El equipo según la reivindicación 96, caracterizado porque la solución de colágeno se encuentra a una temperatura por debajo de aproximadamente 8°C. 99. El equipo según la reivindicación 96, caracterizado porque comprende además un tercer recipiente que comprende una solución a un pH alcalino. 100. Un método para preparar una mezcla mediante el uso del equipo según la reivindicación 96, caracterizado el método porque comprende la combinación del contenido del primer y segundo recipientes para formar una mezcla. 101. El método según la reivindicación 100, caracterizado porque comprende además la etapa de introducir la mezcla en un paciente antes de la solidificación de la mezcla. 102. Un equipo caracterizado porque comprende un contenedor de embarque que contiene un recipiente que comprende una solución acuosa de colágeno y, suspendidos en la solución, (a) una población de células vertebradas cultivadas, genéticamente diseñadas para expresar un polipéptido; y (b) una pluralidad de microvehículos, en donde la solución acuosa se encuentra a una temperatura por debajo de aproximadamente 8°C. 103. Un método para administrar un polipéptido a un paciente que necesita el mismo, caracterizado el método porque comprende: proporcionar una mezcla de fluido que comprende, suspendidos en una solución de colágeno acuosa, una población de células vertebradas cultivadas, genéticamente diseñadas para expresar el polipéptido; e introducir la mezcla de fluido en el paciente, en donde existe suficiente colágeno en la mezcla para permitir que la mezcla se gelifique a un pH por encima de 5.0. 104. Un aparato para la introducción de una mezcla en un paciente, caracterizado el aparato porque comprende al menos dos recipientes, teniendo cada uno de los recipientes una salida en comunicación fluida con un medio de suministro, en donde el aparato comprende (a) una solución de colágeno acuosa, (b) una población de células vertebradas cultivadas, genéticamente diseñadas para expresar un polipéptido y (c) una pluralidad de microveh ículos. 105. El aparato según la reivindicación 104, caracterizado porque cada recipiente contiene uno o más de (a), (b) y (c). 106. El aparato según la reivindicación 104, caracterizado porque cada uno o más de los recipientes tiene asociado con el mismo un pistón que tiene dos extremos, un primer extremo adaptado para insertarse en el interior del recipiente y un segundo extremo adaptado para extenderse desde el interior del recipiente. 107. El aparato según la reivindicación 1 04, caracterizado porque el medio de suministro es una aguja de jeringa que tiene (a) una o más entradas adaptadas para encontrarse en comunicación fluida con las salidas de los recipientes y (b) una salida. 108. El aparato según la reivindicación 104, caracterizado porque el medio de suministro comprende una pieza adaptadora que tiene un conector en comunicación fluida con la salida de cada uno de los recipientes, una cámara de mezclado y una salida en comunicación fluida con una aguja de jeringa. 109. El aparato según la reivindicación 108, caracterizado porque el conector comprende al menos dos entradas, cada una en comunicación fluida con la salida de solamente uno de los recipientes. 1 10. El aparato según la reivindicación 1 04, caracterizado porque comprende además una o más conexiones que unen físicamente los al menos dos recipientes. 1 1 1 . El aparato según la reivindicación 1 06, caracterizado porque el segundo extremo de cada pistón se conecta a una placa de presión. 1 12. Un recipiente que comprende una mezcla, caracterizada porque comprende, suspendidos en una solución de colágeno acuosa , (a) una población de células vertebradas cultivadas, genéticamente diseñadas para expresar un polipéptido; (b) una pluralidad de microvehículos; y (c) un agente asociado con un substrato sólido, en donde el agente se selecciona a partir del grupo que consiste en un factor que promueve la vascularización, una citosina, un factor de crecimiento y ácido ascórbico, en donde existe suficiente colágeno en la mezcla para permitir que la mezcla se gelifique a un pH por encima de 5. 1 13. Un recipiente que comprende una mezcla, caracterizada porque comprende, suspendidos en una solución de colágeno acuosa, (a) una primer población de células vertebradas cultivadas, genéticamente diseñadas para expresar un polipéptido; (b) una segunda población de células vertebradas cultivadas, que segregan un agente seleccionado a partir del grupo que consiste en un factor que promueve la vascularización, una citosina y un factor de crecimiento, y (c) una pluralidad de microvehículos; en donde existe suficiente colágeno en la mezcla para permitir que la mezcla se gelifique a un pH por encima de 5.