MXPA01008362A - Analisis del receptor. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a analisis en base a la proteina de fusion receptor/reportador para detectar un efecto que los compuestos de prueba tienen en un receptor de membrana particular, asi como tambien a proteinas de fusion receptor/reportador para utilizarse en estos analisis y los compuestos identificados por los analisis como teniendo efectos interesantes/utiles. Los receptores de membrana adecuados son receptores del factor de crecimiento, receptores de citoquina, canales de ion e integrinas e incluyen cualquier subtipo, mutantes, homologos y formas quimericas de tales receptores. El analisis es particularmente adecuado para estudiar los receptores acoplados de proteina G (GPCRs).

Description

ANÁLISIS DEL RECEPTOR La presente invención se refiere a análisis en base a la proteína de fusión receptor/reportador para detectar un efecto que los compuestos de prueba tienen en un receptor de membrana particular, así como también a proteínas de fusión reportadoras/receptores para utilizarse en tales análisis y compuestos identificados por los análisis como teniendo efectos interesantes/útiles. Los procedimientos tradicionales para la medición de la actividad ligante en los receptores tales como receptores acoplados de proteína G (GPCRs) se han basado en un número de técnicas bioquímicas. Estas incluyen análisis de unión del radioligante, en las cuales se determina la habilidad de un compuesto prueba para desplazar la unión de un radioligante conocido, y se mide un número de análisis funcionales en los cuales la habilidad de un compuesto prueba para activar o inhibir un evento de transducción de señal específico. Los análisis funcionales de la actividad ligante en GPCRs expresados en células mamíferas ¡ncluyen la medición de la velocidad de intercambio de nucleótidos de guanina en la sub-unidad alfa de proteína G activada (Wise et al., 1 997), la medición de los cambios en el nivel de uno de una plétora de metabolitos mensajeros secundarios intracelulares, tales como cAMP, calcio, o fosfatos de inosítol (Guderman et al., 1996), o la activación o inhibición de un canal de ion (Walker y de Waard, 1998). En años recientes estos análisis se han complementado por el desarrollo de sistemas de gen reportador para el estudio de transduccíón de señal GPCR (Stratowa et al., 1995, Alam y Cook, 1990), así como también un número de otros análisis en base a melanofora Xenopus, levadura o célula de mamífero. GFP (Proteína Fluorescente Verde) de fotoproteína Aequorea victoria es una proteína de 238 aminoácidos que emite luz verde con una emisión máxima de 509 nm en la excitación fluorescente a 488 nm. A pesar de otras proteínas reportadoras bioluminescentes ningún cofactor o substrato adicional se requiere para la emisión de luz (Chen et al., 1 995). La fluorescencia de GFP es estable y se ha medido de manera no invasiva en células vivientes de muchas especies que incluyen células mamíferas, drosofila, C. elegans, levadura y E. coli. La fluorescencia de GFP puede detectarse por fluorimetría, por FACS y por microscopía. Como no hay reactivo de análisis o procedimiento de análisis, la atracción de GFP como una proteína reportadora es costosa , junto con la velocidad y simplicidad del análisis (Chalfie y Kain , 1 998). La disponibilidad de la secuencia de cADN para GFP ha resultado en la generación y caracterización de varios mutantes de GFP en que aumentaron la emisión de fluorescencia. La mutación de serina en el aminoácido 65 a treonina dio como resultado la generación de una proteína con un incremento de 6 veces en la intensidad de emisión de fluorescencia (Haas et al. , 1996). Además, la presencia de Ser65Thr y la mutación del residuo de fenilalanina en la posición 64 en leucina dio como resultado un incremento de 35 veces en la intensidad de fluorescencia (Haas et al., 1 996). Además, un número de nuevos mutantes de GFP ta mbién se ha identificado con características de emisión o excitación alterada . Por ejemplo, la mutación del residuo de tirosina en la posición 66 en histidina ha generado una proteína con emisión de fluorescencia azul , la así llamada proteína fluorescente azul (BFP) con un ?max para excitación de 458 nm y para emisión de 480 nm (Chalfie y Kain, 1998). Estas y muchas otras variantes de proteína GFP ahora se encuentran comercialmente disponibles. GFP se ha utilizado ampliamente en proteínas de fusión para valorar la negociación de proteína, y localízación subcelular de proteína recombinantemente expresada (Wang y Hazelrigg, 1 994). Recientemente, un número de grupos han descrito la creación y uso de proteínas de fusión GPCR-GFP para monitorear la internalización del receptor y el reciclaje después del tratamiento agonista. Por ejemplo, una proteína de fusión entre el ß2-adrenoceptor y GFP se ha utilizado para monitorear la expresión del receptor, localización en la membrana de plasma e internalización después de la estimulación del agonista (Barak et al. , 1 997). En años recientes un número de estudios ha descrito la introducción de mutaciones específicas en GPCRs que da como resultado la activación independiente de agonista de una cascada de transducción de señal por GPCR mutante cuando se expresa en células mamíferas (Scheer y Cotecchia, 1 997 , Leurs er al., 1 998). Este fenómeno se ha descrito como actividad constitutiva, y a tales receptores mutantes se les denomina receptores mutantes constitutivamente activos (CAM). Tales experimentos se han considerado generalmente para difundir luz en alteraciones estructurales posibles en GPCR que ocurre en la unión de agonista para dar como resultado la activación de una proteína G análoga y de esta manera la regulación de la actividad de enzimas efectoras aguas abajo. Tales estrategias parecen poseer validez debido a que, en el caso del ß2-adrenoceptor por ejemplo, una de las modificaciones estructurales asociadas con la unión del agonista al GPCR de tipo silvestre es un movimiento de hélice de transmembrana 6 que puede medirse por el posicionamiento del residuo Cys285 (Gether eí al., 1 997a). En una forma CAM de este GPCR este mismo residuo Cys se encuentra más cercano a la cavidad de unión ligante que en el receptor de tipo silvestre sin ocupar ligante (Javitch er al., 1997). Tal vez el más estudiado de los GPCRs de CAM es una forma del ß2-adrenoceptor humano, en el cual un segmento corto de la región terminal C del tercer ciclo intracelular se reemplazó con la región correspondiente del a1 B-adrenoceptor (Samama et al., , Samama et al., 1 994). La presente invención se basa en parte en investigaciones en la posibilidad de desarrollar el fenómeno de estabilización ligante de un GPCR de CAM para conducir a un incremento en el número de receptores en la superficie celular, como un sistema de análisis para actividad ligante en tal receptor. Como un sistema modelo presente, los presentes solicitantes describen la estabilidad y regulación, por una serie de ligantes agonistas inversos, de un ß2-adrenoceptor de CAM que ha tenido la GFP de 27 kDa agregada en estructura en la terminal C. Los presentes solicitantes han medido la eficacia ligante al determinar la habilidad de cada ligante para causar un cambio en la distribución celular de la proteína de fusión GPCR-GFP o para causar una alteración en la fluorescencia celular total. Además, los presentes solicitantes han examinado el efecto de una serie de agonistas específicos en la distribución celular, y la fluorescencia celular total, o células que expresan una proteína de fusión GFP/ß2-adrenoceptor WT como un sistema de selección para los ligantes agonistas en este receptor. De esta manera, en un primer aspecto la presente invención proporciona un análisis para detectar un efecto que un compuesto tiene en una proteína de fusión receptor/reportador de membrana, comprendiendo las etapas de: a) agregar el compuesto a una célula que comprende dicha proteína de fusión receptor/reportador de membrana; y b) detectar cualquier cambio de dicha proteína de fusión receptor/reportador. Típicamente, el análisis puede utilizarse para seleccionar compuestos por su efecto en receptores de membrana particulares. Los compuestos identificados como teniendo un efecto en un receptor de membrana particular puede ser útil, por ejemplo, para modular la actividad de los receptores de membrana mutantes y/o de tipo silvestre; pueden utilizarse para elaborar la función biológica de selecciones para identificar compuestos que interrumpen las interacciones de receptor de membrana normales, o pueden por sí mismas interrumpir tales interacciones. El análisis es particularmente adecuado para la detección de compuestos que sirven como agonistas inversos, antagonistas o agonistas del receptor de membrana. El término agonista inverso se entiende que significa un compuesto que se une a un receptor, estabiliza selectivamente y de esta manera enriquece la proporción de un receptor en una conformación o conformaciones incapaces de inducir una señal aguas abajo. Se entiende que el agonista significa un compuesto que cuando se une a un receptor se estabiliza selectivamente y de esta manera enriquece la proporción del receptor en una conformación o conformaciones capaces de inducir una señal aguas abajo. Se entiende que antagonista significa un compuesto que cuando se une a un receptor no tiene la habilidad selectiva para enriquecer conformaciones ya sea activas o inactivas y de esta manera no altera el equilibrio entre ellas. El término compuesto se entiende que incluye químicos así como también péptidos y/o proteínas. La presente invención también se refiere por lo tanto a agonistas inversos, antagonistas o agonistas de proteínas receptoras identificadas utilizando los análisis de acuerdo a la presente invención y al uso de tales agonistas, antagonistas o agonistas en el estudio de la función del receptor, o terapia. El análisis puede aplicarse a una variedad de receptores de membrana, tales como receptores del factor de crecimiento, receptores de citoquina , canales de ion e integrinas. Sin embargo, el análisis es particularmente adecuado para estudiar los efectos de los compuestos en receptores acoplados de proteína G (GCPRs). El término receptor como se utiliza en la presente se propone comprender subtipos de los receptores nombrados, y mutantes, tales como mutantes constitutivamente activos, homólogos de los mismos, y receptores quiméricos que incluyen el ácido nucleico que codifica tales receptores. Los receptores quiméricos como se utilizan en la presente se refieren a receptores que pueden formarse comprendiendo partes de receptores mamíferos encontrados de diferentes fuentes. Generalmente hablando cualquier receptor acoplado de proteína G, y las secuencias de ADN que codifican tales receptores pueden utilizarse en análisis de la presente invención. Los receptores acoplados de proteína G típicos son por ejemplo receptores de dopamina, receptores colinérgicos muscarínícos, receptores a-adrenérgicos, receptores ß-adrenérgicos, receptores opiáceos, receptores canabionides y receptores de serotonina. Los receptores de membrana mencionados en la presente se modifican típicamente por la fusión de una proteína reportadora al receptor. Típicamente, el ácido nucleico que codifica la proteína reportadora , tal como Proteína Fluorescente Verde (GFP) puede fusionarse en estructura a un extremo, que es el extremo 5' o 3', de un gen que codifica el receptor particular. De esta manera, en la expresión del gen, la proteína reportadora se expresa funcionalmente y fusiona al extremo terminal N o terminal C del receptor. La modificación del receptor es tal que la funcionalidad del receptor de membrana permanece substancialmente sin afectar por la fusión de la proteína reportadora al receptor. Como se menciona previamente, GFP emite luz verde en excitación fluorescente. La detección de esta luz verde puede llevarse a cabo por ejemplo, por fluorimetría, FACS y por técnicas de microscopía bien conocidos por un experto en la materia. De esta manera la localización y/o cuantificación de un receptor de membrana puede determinarse. Por lo tanto, la presente invención en un aspecto adicional se refiere a nuevas proteínas de fusión reportadoras/receptor de membrana para utilizarse en los análisis descritos y sus construcciones de ácido nucleico, tales como una proteína de fusión GFP/ß2-adrenoceptor y fusión de gen GFP/ß2-adrenoceptor. Aunque puede anticiparse que la unión del polipéptido de 27 KDa de GFP al extremo de un receptor tal como GPCR puede interferir significativamente con la función del receptor, se ha reportado previamente que los GPCRs modificados de esta manera despliegan farmacología sin alterar y permanecer capaces de interactuar con proteínas G para iniciar la regulación mensajera secundaria. Por ejemplo, una proteína de fusión receptor/reportadora puede proporcionarse, en la cual el término C de un receptor se enlaza directamente al término N de una proteína reportadora. La modificación menor puede llevarse a cabo a la secuencia de proteínas, por ejemplo, una etiqueta de epítopo puede agregarse al término N del receptor y/o la metionina terminal del gen reportador removerse. Muchas de tales modificaciones pueden considerarse por destinatarios expertos que proporcionan la funcionalidad de la proteína de fusión receptor/reportador q ue permanece substancialmente sin afectar. Las construcciones de ácido nucleico de la presente ¡nvención comprenden ácido nucleico, típicamente ADN, que codifica el receptor particular al cual se fusiona, en estructura, el gen apropiado que codifica la proteína reportadora. Generalmente hablando las construcciones de ácido nucleico se expresan en las células que se prueban por medio de un vector de expresión. Típicamente, aunque no exclusivamente las células son de origen mamífero y el vector de expresión elegido es uno que es adecuado para la expresión en el tipo de célula particular. Un vector de expresión es una construcción de ADN replicable en la cual el ácido nucleico se enlaza operativamente a secuencias de control adecuadas capaces de efectuar la expresión de la fusión reportadora/receptor de membrana en la célula particular. Típicamente, las secuencias de control pueden incluir un promotor transcrípcional, una secuencia que codifica los sitios de unión ribosomal de mARN adecuados, y secuencias que controlan la terminación de transcripción y/o traducción. Los vectores de expresión típicos pueden incluir por ejemplo plásmidos, bacteriófagos o virus y tales vectores pueden integrarse en el genoma del huésped o replicarse de manera autónoma en la célula particular. Con objeto de que la célula particular exprese la proteína de fusión receptor/reportador, la célula debe transformarse por el vector de expresión apropiado. "Transformación", como se utiliza en la presente, se refiere a la introducción de un fragmento de polinucleótido heterólogo en una célula h uésped, irrespectiva del método utilizado, por ejemplo toma directa , transfección o transducción. Por lo tanto, la presente invención también se refiere a células que se han transformado por construcciones de ácido nucleico que comprenden fusiones de reportador/receptor de la presente invención y expresa la proteína de fusión receptor/reportador. Además de la Proteína Fluorescente Verde (GFP) las construcciones de proteína de fusión receptor/reportador pueden hacerse utilizando otras variantes coloreadas de GFP tales como la Proteína Fluorescente Azul, la Proteína Fluorescente Amarilla o la Proteína Fluorescente Cian (Chalfie y Kain, 1998). Las fusiones del reportador/receptor similares también pueden generarse utilizando otras proteína reportadoras tales como lucíferaza de luciérnaga (Photinus pyralis) (Alam y Cook, 1990). La construcción de una fusión de luciferaza de luciérnaga/GPCR permitiría la detección de la actividad del compuesto utilizando actividad de luciferaza de luciérnaga como la lectura de salida con la detección, por ejemplo, en un luminómetro de microplaca o utilizando un sistema de formación de imágenes CCD. Los análisis de luciferaza de luciérnaga son altamente sensibles y son tratables de analizar en formatos de placa míniaturizados y para la detección por formación de imágenes CCD (Suto e Ignar, 1 997). Además de GFP o luciferaza de luciérnaga, las fusiones del reportador/receptor similares pueden generarse utilizando cualquier enzima reportadora incluyendo luciferaza de Renilla reniformis (trinitaria de mar) (DeWet et al., 1 987), fosfatasa alcalina placental secretada (SEAP) (Lorenz er al., 1 991 , ß-lactamasa (Moore et al., 1 997) y galactosidasa ß (Henthorn ef al, 1988). Cualquier cambio de dicha proteína de fusión receptor/reportador de membrana como un resultado de agregar el compuesto puede detectarse por ejemplo, como un cambio en la localización celular de la proteína de fusión receptor/reportador, semi-cuantitativamente por la síntesis o degradación de dicha proteína de fusión receptor/reportador. La detección de cualquier cambio puede fácilmente llevarse a cabo con células colocadas en la superficie de una diapositiva de microscopio o lo similar. Sin embargo, los análisis de la presente invención pueden convenientemente llevarse a cabo en células colocadas en una cavidad de una placa de microconcentración o lo similar, tal como una placa de 96 cavidades convencional. Una modificación adicional al análisis descrito en la presente puede realizarse por ejemplo, al tomar ventajas de la vía de internalízación y degradación del receptor PAR1 . A pesar de los GPCRs clásicos, tales como el ß2-adrenoceptor que posee ligantes reversiblemente unidos, PAR1 (y otros miembros de la familia PAR), se activan después de la división proteolítica del término N de la proteína receptora por proteasas tales como trombina, para generar un nuevo término amino que sirve como un "ligante trabado", uniéndose intramolecularmente al cuerpo del receptor para iniciar la señalización del receptor (Vu et al. , 1 991 a y 1 991 b). Como con otros GPCRs, después de la activación ligante, el PAR 1 se foforila rápidamente y desacopla de la señalización. Sin embargo, a pesar de los GPCRs clásicos, PAR 1 se clasifica grandemente en lisosomas para dar como resultado la degradación de proteína (Trejo et al., 1 998; Shapíro y Couglin, 1998). El tráfico de PAR 1 activado al compartimiento lisosomal en lugar del endosomal parece mediarse completamente por la parte posterior terminal C de PAR 1 (Trejo y Coughiin , 1999). El receptor de substancia P (SPR) se activa por la substancia ligante de péptido P, internaliza y recicla a la membrana de plasma como se observa para la proteína de fusión GFP-ß2-adrenoceptor. Sin embargo, el intercambio de la parte posterior citoplásmica de carboxilo del SPR por aquella del receptor de PAR1 dio como resultado la creación de una proteína de fusión SPR/PAR1 , que cuando se activa por la substancia ligante P, se vuelve un objetivo para el lisosoma para la degradación proteolítíca, en lugar de al endosoma para reciclar a la membrana de plasma en lugar de al endosoma para reciclar a la membrana de plasma (Trejo y Coughiin, 1 999). De esta manera, puede esperarse que una proteína de fusión que comprende el receptor de substancia P, el ß2-adrenoceptor o cualquier otro GPCR, en el cual la parte posterior terminal C del receptor se reemplazo con la parte posterior terminal C citoplásmica del receptor PAR 1 , podría internalizarse en los lisosomas después del tratamiento agonista para dar como resultado la degradación de la proteína receptora. Si esta proteína de fusión también contiene GFP, o cualquier otra proteína reportadora, fusionada en estructura sobre el término carboxilo de la parte posterior terminal C cítoplásmica del receptor PAR1 entonces el tratamiento agonista daría como resultado una pérdida de la señal reportadora como un resultado de la degradación lisosomal o proteína receptora. Para analizar los compuestos con actividad agonista inversa o antagonista, las células podrían pretratarse con antagonista por un periodo de tiempo antes de la adición de agonista. El antagonista evitaría la unión del agonista al receptor, y así evitar la degradación mediada por el agonista de proteína receptora. Utilizando GFP como la proteína reportadora, esta puede detectarse ya sea por microcospia confocal grupos de células o individuales, o en formatos de microplaca utilizando un fluorimetro de microplacas apropiado. Utilizando luciferaza de luciérnaga como la proteína reportadora, los cambios de receptor podrían valorarse después del análisis de la actividad de luciferaza de luciérnaga utilizando ya sea luminometria de microplaca o por formación de imágenes CCD. La presente invención se describirá ahora a manera de ejemplo solamente, con referencia a las siguientes figuras que muestran: La Figura 1 muestra la ubicación de la membrana de plasma de ß2-adrenoceptor WT-GFP e internalización en respuesta a isoprenalina. El ß2-adrenoceptor WT-GFP se expresó establemente en células HEK293 y los clones individuales se aislaron. Un parche de células de formó en imágenes en el microscopio confocal en la ausencia de agonista (A) y después de la adición de 1 0µM de isoprenalina por 5 (B), 10 (C) y 30 (D) min . La Figura 2 muestra el reciclado de ß2-adrenoceptor WT-GFP a la membrana de plasma después de la adición de alprenolol. Un parche de células HEK293 que expresa establemente la proteína de fusión ß2-adrenoceptor WT-GFP se formó en imágenes en el microscopio confocal en la ausencia de agonista (A) o después de la adición de isoprenalina (1 0µM) por 30 min (B). Después de enjuagar para remover la isoprenalina, se agregó alprenolol (1 0µM) por 30 (C) o 40 (D) min. La Figura 3 muestra la expresión de ß2-adrenoceptor CAM-GFP y la supraregulación por betaxolol. Una construcción de ß2- adrenoceptor CAM-GFP se expresó establemente en células HEK293 y se aislaron los clones individuales, (a) Las células de un solo clon se desarrollaron en cubreobjetos de vidrio en la ausencia (panel superior) o presencia (panel inferior) o betaxolol (10µM) por 24 hrs. Estas células se visualizaron entonces, (b) Las células de este clon que no se trataron o trataron con betaxolol (1 0µM) y después se enjuagaron se utilizaron para medir la unión específica de [3H]DHA en células intactas ([3H]DHA es un antagonista lipofílico que cruza la membrana de plasma y de esta manera proporciona una medición de los niveles celulares totales de los sitios de unión de ß2-adrenoceptor). La Figura 4 muestra la supraregulación del ß2-adrenoceptor CAM-GFP por otros ligantes de ß2-adrenoceptor. Las células HEK293 que expresan de manera estable las células que expresan ß2-adrenoceptor CAM-GFP de la Figura 3 se no expusieron a ningún ligante (A), carvedilol (B), Labetolol (C) o ICI 1 1 8551 (D) (cada uno en 1 µM) por 24 h. Las células se formaron entonces en imágenes en el microscopio confocal. La Figura 4 muestra la supraregulación del ß2-adrenoceptor CAM-GFP pero no del ß2-adrenoceptor WT-GFP por betaxolol. Las fracciones de membrana se prepararon de células HEK293 que expresan establemente ya sea la proteína de fusión ß2-adrenoceptor CAM-GFP o la de ß2-adrenoceptor WT-GFP que se ha mantenido por 24 horas en la ausencia o presencia de betaxolol (1 0µM) y sometido a SDS-PAGE. Después de la transferencia a nitrocelulosa, las muestras se inmunomancharon utilizando un anticuerpo anti-GFP policlonal para valorar el nivel de proteína de fusión en estas membranas.

La Figura 6 muestra la internalízación del ß -adrenoceptor CAM-GFP supraregulado por isoprenalína. (a) las células que expresan ß2-adrenoceptor CAM-GFP no se trataron (A) o expusieron a betaxolol (10µM, 24Hh) (B-D). Después del tratamiento con betaxolol, las células se enjuagaron y se agregó isoprenalina (10µM) por 0 (B), 10 (C) o 30 (D) min. (b) Las células como en la Figura 6a no se trataron, expusieron a betaxolol ( 1 0µM, 24h), o expusieron a betaxolol seguidas por la exposición adicional a isoprenalina por 30 min. Las células intactas se utilizaron entonces para medir la unión específica de [3H]CGP 121 77 ([3H]CGP 12177) es un ligante hidrofílico que no penetra la membrana de plasma y en estas condiciones registra solamente receptores de superficie celular. La Figura 7a muestra el efecto de varios agonistas/antagonistas inversos en el nivel de fluorescencia en ß2-adrenoceptor CAM-GFP determinado por fluorimetría de placa de microconcentración. Los cambios en fluorescencia se midieron en fluorimetro Plus Espectrofluor utilizando células cultivadas en una placa de 96 cavidades. La gráfica muestra las respuestas de concentración a isoprenalina, betaxolol, alprenalol o sotalol después de 22 h de contacto con el medicamento. Los valores son los porcentajes promedio de basal de al menos aproximadamente 3 experimentos llevados a cabo por duplicado + SEM. La Figura 7b muestra la dependencia por concentración de la supraregulación de ß2-adrenoceptor CAM-GFP por betaxolol determinada por fluorimetría de placa de micoconcentración. Los cambios en fluorescencia se midieron en fluorimetro Plus Epectrofluor utilizando células cultivadas en una placa de 96 cavidades. La gráfica muestra una curva de respuesta de dosis a betaxolol en tiempo de 0 h (•) y después ,22 h (A) . Los valores son los porcentajes promedio de basal de 6 experimentos llevados a cabo por duplicado + SEM. La Figura 7c muestra la dependencia por concentración de la subregulación de ß2-adrenoceptor CAM-GFP por isoprenalina determinada por fluorimetría de placa de mícroconcentración. La gráfica muestra una curva de respuesta de dosis a isoprenalina en tiempo de 0 h (•) y después 22 h (A) . LOS valores son los porcentajes promedio de basal de 6 experimentos llevados a cabo por duplicado + SEM. La Figura 8 muestra la dependencia por concentración de la supraregulación de ß2-adrenoceptor CAM-GFP por alprenolol. Estudios de unión: las células que expresan ß2-adrenoceptor CAM-GFP se trataron o expusieron a concentraciones variables de alprenolol por 24 h. Se enjuagaron subsecuentemente y la unión específica de la célula intacta de concentración únicas de ya sea [3H]DHA o [3H]CGP1277 se midieron a niveles inciertos de receptor celular total y receptor de superficie celular, respectivamente. Figura 9 Ubicación de mutaciones que la activación constitutiva de actividad C de fosfoinositidasa al a1 b-adrenoceptor. Un diagrama de banda de diagrama principal de la secuencia principal del a?b-adrenoceptor de hámster se despliega. El mutante constitutivamente activo utilizado en la presente (3CAM) tiene las siguientes alteraciones (R288K, K290H, A293L) a la secuencia de tipo silvestre.

Figura 10 Supraregulación de 3CAM pero no a?b-adrenoceptor de hámster de tipo silvestre por la demanda de antagonista/agonista inverso sostenida. Las células que expresan ya sea 3CAM (1 0A) o a1 b-adrenoceptor de hámster de tipo silvestre (1 0B) desarrolladas en cubreobjetos de vidrio se trataron con el vehículo (a), fentolamina (b), WB41 01 (c) o HV723 (d) (todos en 1 µM) por 24 h. Las células se visualizaron en un microscopio confocal. Los estudios equivalentes se llevaron a cabo en placas de células que se enjuagaron y cultivaron. Las membranas se prepararon y la capacidad de unión específica de una sola concentración (2 nm) de [3H]prazosin se valoró entonces (Figura 10C). Figura 1 1 Supraregulación de la proteína de fusión a?b-adrenoceptor CAM y WT/GFP después de la expresión estable en células HEK 293. Las gráficas muestran el efecto en la fluorescencia celular total de un tratamiento de 22 horas con (A) fenilefrina, (B) fentolamina, (C) WB 4101 y (D) HV 723. En todas las gráficas A representa los datos obtenidos de a1 b-adrenoceptor de tipo silvestre/GFP y • representa los datos de a1 -adrenoceptor CAM/GFP expresados en las células HEK 293. Todos los valores se expresan como un porcentaje de la fluorescencia basal y son el promedio de al menos 4 experimentos llevados a cabo por duplicado + SEM. Figura 1 2 Curso cronológico de la supraregulación de a1 b-adrenoceptor CAM/GFP en células NEK 293. Las gráficas muestran la supraregulación de fluorescencia causada con (A) fenilefrina, (B) WB 4101 , (C) HV 723 y (D) fentolamina . Los datos representan un experimento llevado a cabo por duplicado. Figura 1 3 Diagrama esquemático de la construcción de proteína de fusión luciferaza/ß2-adrenoceptor adrenérgico. Figura 14 Construcción y uso conceptual de un ß2-adrenoceptor constitutivamente activo enlazado a luciferaza de Renilla reniformis para identificar antagonistas en este receptor. La construcción expresada en células se trata con un ligante que se une a este receptor. Esto causa la supraregulación de la proteína con el tiempo y de esta manera niveles más elevados de actividad de luciferaza de Renilla reniformis en la célula que puede monitorearse por procedimientos estándar. Figura 15 Incrementos dependientes de la concentración en niveles de un ß2-adrenoceptor constitutivamente activo enlazado a luciferaza de Renilla reniformis. Las concentraciones variables de 3 ligantes que se unen al ß2-adrenoceptor se agregaron a las cavidades de una placa de microconcentración de 96 cavidades que contiene células que expresan de manera estable un ß2-adrenoceptor constitutivamente activo enlazado a luciferaza de Renilla reniformis. Estas placas se incubaron entonces por 24 horas, tiempo después los medios se pipetaron fuera de cada cavidad. 50 ul de medio libre de fenol rojo se agregaron entonces a cada cavidad más 50 ul de solución de luc-lite (un reactivo de equipo comercial que se optimiza para actividad de luciferaza de Renilla y también contiene un componente de lisis de célula suave). Finalmente 50 ul de 15 uM de coelenterazina en medio libre de fenol rojo se agregaron (para dar una concentración final de 5 uM). Las placas se analizaron entonces inmediatamente en un luminómetro de conteo superior para determinar la intensidad de la luz en unidades de luz relativas. Figura 16 Láser que explora imágenes confocales de células HEK 293 establemente transfectadas para expresar la proteína de fusión PAR1 mut/GFP. Tomada antes (imagen a mano izquierda) y después de 40 mins de incubación con 10 µM de TRAP (imagen a mano derecha) A y B representan dos cubreobjetos diferentes de células. Figura 1 7 Subregulación de agonista de la proteína de fusión PAR1 mut/GFP después de la expresión estable en células HEK 293. Las gráficas de barra muestran el efecto de un tratamiento de 4 horas con ya sea (A) TRAP o (B) trombina . Todos los valores se expresaron como un porcentaje de la fluorescencia basal y son el promedio de 2 experimentos llevados a cabo cuatro veces. Materiales y Métodos I [3H]DHA (64 Ci/mmol) y [3H]CGP-12177 (44 Cí/mmol) se compraron de (Amersham, RU). [3H]adenina y [3H]cAMP se compraron de Amersham International, Amersham, R. U. Todos los reactivos para el cultivo celular se compraron de Life Technologies (Paisley, Strathclyde, R. U. ). Los ligantes receptores se compraron de RBI. Todos los otros reactivos se compraron de Sigma o Fisons y fueron de la pureza más elevada disponible. La construcción de formas etiquetadas de GFP del ß2-AR de tipo silvestre de ß2-adrenoceptor humano en pcADN3 (MacEwan & Millígan 1996a) se amplificó por PCR utilizando una carga de inicio de avance Hind ///-FLAG, 5' AAAAAA AAGCTT GCCACC ATG GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAT AAG GGG CAÁ CCC GGG AAC GGC 3', y una carga de inicio inversa Bam Hl, 5' AAAAA GGATCC TCC CGC CAG CAG TGA GTC ATT TGT A 3'. Esto removió el codón de detención y la metionina de inicio (codón de inicio) de ß2-WT-AR, con un ATG iniciador estando presente en la etiqueta de epítopo FLAG™ agregada de manera terminal en N (ATG GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAT AAG). El producto de PCR se digirió con Hind lll y Bam Hl y el fragmento resultante ligado en pcADN3 para generar una construcción B2-AR/GFP de tipo silvestre. La secuencia que codifica aminoácidos 172-291 del receptor ß2 WT limitaron esta construcción utilizando Kpn l/Hpa I y se reemplazó por la región equivalente del ß2-AR CAM (Samana et al., 1993, 1994). Una forma modificada de GFP (Zernicka-Goatz et al., 1 997) también se amplificó por PCR utilizando una carga de inicio delantera Bam Hl, 5' AAAAA GGATCC AGT AAA GGA GAA GAA CTT TTC 3', y una carga de inicio inversa Xba I, 5' TGCTCTAGATTATTTGTATAGTTCATCCATGCC 3'. Esto removió la metionina de inicio de GFP y el producto de PCR resultante se digirió y enlazó en estructura para generar la construcción de ß2 CAM-AR-GFP. Transfección estable y transitoria de células HEK293 Las células HEK293 se mantuvieron en Medio Esencial Mínimo (MEM, Sigma) complementado con 0.292 g/L de L-glutamina, y 10% de suero de bovino recién nacido a 37°C en un 5% de atmósfera de CO2 húmeda. Las células se desarrollaron a 60-80% de confluencia antes de la transfección transitoria. La transfección se llevó a cabo utilizando reactivo LipofectAMINA (Life Technologies, Inc.) de acuerdo a las instrucciones de los fabricantes. Para generar líneas celulares estables, dos días antes de la transfección las células se sembraron/diluyeron y mantuvieron en medio MEM complementado con 1 mg/ml de Geneticín (Life Technologies, Inc.). El medio se reemplazó cada 3 días con medio MEM que contiene 1 mg/ml de Geneticin. La expresión clonal se examinó inicialmente por microscopía de fluorescencia para los clones que contienen GFP. Los clones seleccionados que expresan GFP y forma no etiquetadas como GFP de los receptores se expandieron y los estudios de unión del ligante [3H] se llevaron a cabo para valorar el nivel de la expresión del receptor. Microscopía de exploración láser confocal Las células se observaron utilizando un microscopio confocal de exploración láser (Zeiss Axiovert 1 00) utilizando un Zeiss Plan-Apo 63 x 1 .40 de objetivo de inmersión de aceite de NA, poro de 35, y ampliacíón-reducción óptica variable electrónica de 1 o 3. La GFP se saca utilizando una láser de argón/kríptón de 488 nm y se detectó con un filtro de paso de banda de 515-540 nm. Dos imágenes se manipularon con Zeiss LSM o software MetaMorph. Dos diferentes procedimientos para la preparación de células se utilizaron. Cuando se examina el curso cronológico de internalización y reciclaje, las células vivientes se utilizaron. Las células se desarrollaron en cubreobjetos de vidrio y montaron en la cámara de formación de imágenes. Las células se mantuvieron en regular de KRH (ver abajo) y la temperatura se mantuvo a 37°C. En otros estudios, las células fijas se utilizaron. Las células en cubreobjetos de vidrio se enjuagaron con PBS y fijaron por 20 min a temperatura ambiente utilizando 4% de paraformaldehído en PBS/5% de sucrosa pH 7.2. Después de un enjuague con cubreobjetos de PBS los cubreobjetos se montaron en las diapositivas de microscopio con 40% de glicerol en PBS. Estudios del ligante [3H] Las células ß2 CAM-AR-GFP se desarrollaron en cubetas de cultivo de 6 cm y trataron o no con 1 0 µM de betaxolol o varias concentraciones de alprenlol por 24 h. En algunos casos las células tratadas con betaxolol se expusieron subsecuentemente a 10µM de isoprenalina por 30 min . Después del tratamiento las células se enjuagaron 3 veces con salina regulada de fosfato frío (PBS; 2.7 mM KCl, 1 37 mM NaCI, 1 .5 mM KH2P04, pH 7.4). Las células se separaron entonces de las placas con PBS/0.5 mm de EDTA en pastilla y resuspendieron en regulador de Krebs-Ringer-Hepes frío (KRH; 1 30 mM de NaCI, 5 mM de KCl, 1 .2 mM de MgSO4, 1 .2 mM de CaCI2, 20 mM de HEPES, 1 .2 mM de Na2PO4, 10 mM de glucosa, 0.1 % de BSA; pH 7.4). Después de contar las células en un hemocitotometro, aproximadamente 100,000 células se agregaron a cada tubo de ensayo. Para los estudios de unión, una sola concentración de [3H]DHA (2 nM) o [3H] CGP-12771 (1 0nM) se utilizaron para medir el receptor celular total y el receptor de superficie celular, respectivamente. Los estudios paralelos con 1 0µM de propranolol permitieron la valoración de unión no específica. Los análisis de unión de [3H] DHA se llevaron a cabo a 30°C por 45 min y la unión de [3H] CGP-12771 a 14°C por 2.5 horas en regulador KRH. Todos los experimentos se terminaron por filtración rápida a través de filtros GF/C Whatman seguidos por tres enjuagues con regulador TE frío (75 mM Tris, 1 mM EDTA; pH 7.4). Mediciones de la actividad de ciclasa de adenililo de célula intacta Se llevaron a cabo esencialmente como se describe por Wong (1 994) y Mercouris et al., (1997). Las células se deslizaron en las cavidades de una placa de 12 cavidades y a las células se les permitió reunirse. Las células se incubaron entonces en medio que contiene [3H] adenina (1 .5 µCi/cavidad) por 16-24 h. La generación de [3H] cAMP en respuesta al tratamiento de las células con varios ligantes y otros reactivos se valoró entonces. Los resultados se presentan como la proporción de niveles de nucleótidos de [3H] cAMP a de [3H] adenina totales (x 1000). Estudios de inmunomanchado Análisis de Inmunomancha y electroforesis Un sistema regulador electroforético en base a borato [Podusio, J. F. (1981 ) Anal. Bíochem. 1 14, 131 -139] se empleó con algunas modificaciones. Brevemente, el gel de poliacrilamida de resolución se hizo de 10% de acrilamida, 0.0625% de bisacrilamida, 0.1 M de Tris (pH 8.5), 0.1 M de ácido bórico, 0.0025 M de EDTA, 0.1 % SDS, 0.005% TEMED y 0.1 % de persulfato de amonio. El gel de acumulación fue de la misma composición excepto que contiene 4% de acrílamida. El regulador de funcionamiento de electroforesis de borato se compone de 0.1 M Tris, 0.1 M de ácido bórico, 0.0025 M EDTA y 0.1 % SDS (pH 8.5). La electroforesis de borato y estándar funcionó por 1 h a 200 V y 150 V, respectivamente utilizando un equipo de gel Mino Protean II (BIO-RAD, Hamel Hempstead, R. U.). Después SDS-PAGE, las proteínas se transfirieron electroforéticamente a nitrocelulosa. La membrana se bloqueó por 1 h en 3% de leche libre de grasa en regulador PBS-T (PBS que contiene 0.1 % Tween 20). Después de un breve enjuague en regulador PBS-T, la membrana se incubó durante la noche a 4°C con un anticuerpo primario diluido en regulador PBS-T que contiene 1 % de leche libre de grasa. Un anticuerpo policlonal de GFP (Clontech Laboratories, R.U.) se utilizó para la detección de las construcciones. El anticuerpo primario se removió entonces y la mancha se enjuagó extensivamente en regulador PBS-T. La incubación subsecuente con anticuerpo secundario (IgG anti-ratón de burro conjugado con peroxidasa de rábano picante, Unidad de Producción de Anticuerpos Escocés , Carluke Escocia) procedió por 2 h a temperatura ambiente y después de enjuague extensivo en regulador de PBS-T la mancha se visualizó por quimíluminescencia aumentada ECL (Amersham). El análisis cuantitativo de bandas específicas se llevó a cabo por exploración con un densitometro de formación de imágenes GS-670 (BIORAD). Estudios en placas de microconcentración Las células se sembraron en placas de vista negra costar el día antes del experimento. El día del experimento, los medios se removieron de las células y el medicamento se agregó a la cavidad en un volumen final de 100 µl. El experimento se llevó a cabo en medio F12 libre de fenol rojo que contiene 1 0% de FCS. Un fluorimetro Espectrofluor Plus se utilizó para leer las lecturas de placa desde la parte inferior en una ganancia de 100. Una placa en blanco se leyó ¡nicíalmente en el fluorimetro y después las placas de células se leyeron en el tiempo 0 y después de 22 hrs de incubación a 37°C con medicamento. Los resultados se calcularon al substraer la placa en blanco de los valores de fluorescencia obtenidos para controlar la autofluorescencia de placa. Ejemplo 1 . Construcción de la proteína de fusión GPCR/GFP Se utilizó una estrategia en base a PCR para enlazar un cADN que codifica una forma de GFP con propiedades de autofluorescencia aumentadas (Zernicka-Goetz et al., 1 997) en estructura con cADNs que codifican tanto el ß2-adrenoceptor de tipo silvestre como un forma mutante constitutivamente activa de este GPCR, producido por el reemplazo de un segmento pequeño del extremo distal del tercer ciclo intracelular con el segmento equivalente del a?B-adrenoceptor de hámster. Estos se anticiparon para codificar las estructuras de lectura abierta únicas en las cuales el término C del GPCR se enlazó directamente al término N de GFP. Después de la transfección transitoria de estas construcciones y visualizacíón en un microscopio de fluorescencia para confirmar la expresión exitosa y autofluorescencia, ambas de estas construcciones y las formas no etiquetadas como GFP equivalentes de los GPCRs se expresaron establemente en células HEK293. Los clones individuales se identificaron en base a una combinación de autofluorescencia apropiada y unión específica del [3H]dihidroalprenolol Q3H]DHA) agonista de ß- adrenoceptor subsecuentemente expandido. En clones que expresan la construcción de ß2-adrenoceptor-GFP de tipo silvestre, la microscopia confocal llevada a cabo en células intactas crecidas en un cubreobjetos de vidrio, demostró el volumen de la autofluorescencia derivada de GFP para ser delineada por la membrana de plasma (Figura 1 ). La adición de la isoprenalina agonista de ß2-adrenoceptor (10~5 M) dio como resultado una internalización dependiente del tiempo de la construcción en vesículas intracelulares discretas (Figura 1 ) como se ha reportado previamente para tal construcción (Barak et al., 1997, Kallal et al., 1998). La construcción de ß2-adrenoceptor tipo silvestre-GFP se internalizó después de 30 min de tratamiento con isoprenalina y podría reciclarse a la membrana de plasma después del retiro de isoprenalina y sus reemplazas por el aprenolol antagonista de ß-adrenoceptor (1 0"5M) (Figura 2) que no promueve por sí mismo la internalización . Aunque los clones que expresan la construcción de ß2-adrenoceptor CAM-GFP también se aislaron estas no desplegaron el mismo nivel de autofluorescencia de GFP como los clones que expresan la construcción de ß2-adrenoceptor WT-GFP. Tales observaciones fueron consistentes con los niveles rutinariamente inferiores de expresión de estado fijo de la construcción de ß2-adrenoceptor CAM-GFP. Esto se confirmó por los niveles inferiores de [3H]DHA específico que se une a las fracciones de membrana aisladas de estas células en comparación con los clones que expresan la construcción de ß2-adrenoceptor tipo sílvestre-GFP. Además, aunque el ß2-adrenoceptor CAM-GFP localizado en la membrana de plasma transparente podría observarse, parece ser una fracción mayor de la autofluorescencia de GFP ubicada intracelularmente que para ß2-adrenoceptor WT-GFP (Figura 3a). Ejemplo 2 - Unión del ligante a la proteína de fusión GPCR/GFP Los presente solicitantes han postulado previamente que el tratamiento sostenido de las células NG108-15 que expresan de manera estable el ß2-adrenoceptor CAM con el betaxolol agonista inverso pueden causar un incremento en los niveles de estado fijo de este GPCR. Cuando las células que expresan la construcción de ß2-adrenoceptor CAM-GFP se trataron con betaxolol (24h, 10"5M) y después se visualizaron por microscopía confocal, un incremento marcado tanto en membrana de plasma delineada como fluorescencia ¡ntracelular se observó (Figura 3a). El enjuague de las células seguido por un experimento de unión ligante de célula intacta con [3H]DHA confirmó la supraregulación de ß2-adrenoceptor CAM-GFO en respuesta a betaxolol (Figura 3b). La supraregulación de fluorescencia también se observó por el tratamiento de las células con un rango de agonista inverso de ß2-adrenoceptor/antagonistas incluyendo ICI 1 1 8551 , labetolol, carvadilol, alprenolol y dihidroalprenolol (todos en 10"5 M) (Figura 4). Sin embargo, la selectividad farmacológica de este efecto se preservó como si no registrara por el tratamiento con prazosin antagonista de a?-adrenoceptor o la yumbina antagonista de a2-adrenoceptor (datos no mostrados). El tratamiento sostenido de las células que expresan ß2-adrenoceptor de tipo silvestre-GFP con betaxolol o los otros ligantes descritos arriba dejaron de dar como resultado una supraregulación significativa de la construcción como intensidad de fluorescencia y el patrón de distribución se modificó poco por los tratamientos con el medicamento (datos no mostrados). La supraregulación de ß2-adrenoceptor CAM-GFP por tratamiento con betaxolol podría también monitorearse en experimentos de inmunomancha para confirmar los efectos observaos por microscopía confocal. Las membranas aisladas de las células que expresan ya sea el ß2-adrenoceptor de tipo silvestre-GFP o el ß2-adrenoceptor CAM-GFP después del mantenimiento en la presencia o ausencia de betaxolol (10"5M) por 24 h se resolvieron por SDS-PAGE y las construcciones de GPCR se detectaron por el inmunomanchado con un anticuerpo anti-GFP. La supraregulación transparente de ß2-adrenoceptor CAM-GFP pero no ß2-adrenoceptor de tipo silvestre-GFP se observó (Figura 5). Después de la supraregulación inducida por betaxolol del retiro de ß2-adrenoceptor CAM-GFP de este ligante, y sus reemplazo por isoprenalina (1 0"5M), dio como resultado una internalización rápida de la construcción en vesículas puntadas intracelulares en una manera que no se distinguió de la registrada arriba para el ß2-adrenoceptor de tipo silvestre-GFP (Figura 6a). [3H]CGP-12177 es un antagonista de ß2-adrenoceptor hidrofílico que es adecuado para cruzar la membrana de plasma. Por lo tanto, en experimentos de unión específica de célula intacta identifica solamente la población de la superficie celular del ß2-adrenoceptor. Tales estudios de unión de célula intacta se llevaron a cabo en células que expresan ß2-adrenoceptor CAM-GFP, célula que se han pre-tratado con betaxolol (24h, 10"s M), y tales células después del reemplazo de betaxolol con isoprenalina (1 0 5 M) por 30 min. Estos estudios demostraron que ß2-adrenoceptor CAM-GFP supraregulado de superficie celular se internalizó grandemente por tratamiento agonista (Figura 6b). La supraregulación de ß2-adrenoceptor CAM-GFP por tratamiento sostenido con betaxolol y ligantes de antagonista de ß2-adrenoceptor/agonista inverso podría detectarse y cuantificarse directamente en un fluorimetro Epectrofluor Plus después de la siembra de las células en una placa de microconcentración de 96 cavidades. Esto permitió el análisis de la dependencia por concentración de la supraregulación de ß2-adrenoceptor CAM-GFP con varios agonistas inversos/antagonistas después de 22 h de incubación con los compuestos (Figura 7a). El betaxolol dio la respuesta más clara (Figura 7b) que produce una supraregulación de la construcción con un EC50 de 168(47-600)nM, un valor en buen acuerdo con Ki medido de betaxolol para unirse a esta construcción de GPCR (MacEwan % Milligan 1996a). El tratamiento de la fusión de ß2-adrenoceptor WT-GFP con betaxolol no dio como resultado cualquier cambio en la fluorescencia después de 1 h o 22 h de incubación de medicamento. Sin embargo, la incubación de tales células con la isoprenalina ligante agonista por 22 h dio como resultado una reducción marcada de fluorescencia celular que después de la cuantificación en el fluorimetro Espectrofluor Plus permitió un análisis de la dependencia por concentración de los cambios mediados por isoprenalina en fluorescencia celular. La isoprenalina causó una reducción en la fluorescencia celular un IC50 de 13(2.5-70) nM (Figura 7c). Esto contrasta con un EC5u reportado de 5 nM para la estimulación de cAMP por este medicamento en este receptor. En resumen, este ejemplo muestra el tratamiento con antagonista neutral o agonista inverso de células que expresan una construcción de fusión de ß2-adrenoceptor CAM-GFP que da como resultado un incremento en la fluorescencia de membrana como se detecta por microscopía confocal, y un incremento en la fluorescencia celular total como se mide por fluorimetria de mícroplaca. La dependencia por concentración de estos efectos está de acuerdo con los datos obtenidos de estudios farmacológicos tradicionales validando así el uso de este planteamiento para la caracterización de compuestos que efectúan la función de receptor. La habilidad del los ligantes antagonistas o agonista inverso para causar un incremento en la forma de fluorescencia celular de células que expresan una fusión de GPCR CAM-GFP permite la provisión de un análisis de fluorescencia en base a microplaca para nuevos compuestos con actividad similar. El tratamiento agonista de células que expresan la fusión de ß2-adrenoceptor WT-GFP se observó que da como resultado una reducción en la fluorescencia asociada con la membrana y un incremento en vesículas intracelular que por los estudios de co-inmunolocalización con un antisuero de anti-transferina se muestran que son endosomas. La reducción en fluorescencia observada por fluorimetria de microplaca después de la internalización de la proteína de fusión también puede deberse a un evento de enfriamiento de fluorescencia como una consecuencia de la concentración del receptor dentro del ambiente acídico del compartimiento de endosoma. Sin embargo, esta reducción en fluorescencia causada por ligantes agonistas tal como isoprenalina es dependiente por concentración y las mitad de concentraciones de medicamento máximas requeridas para causar este efecto es un acuerdo con los valores obtenidos en estudios de análisis del mensajero secundario tradicionales. De esta manera, el ejemplo describe un nuevo sistema de selección para compuestos con ya sea agonista, antagonista neutral o actividad agonista inversa en el ß2-adrenoceptor, en el cual la actividad da como resultado un cambio en las características de fluorescencia de células que expresan una proteína de fusión ß2-adrenoceptor-GFP. El cambio en las características de fluorescencia pueden medirse por ya sea un cambio en una localización celular utilizando el microscopio confocal, o por un cambio en fluorescencia celular total como se mide en un fluorimetro de 96 placas. Utilizando microscopía confocal como el sistema de detección, el ligante agonista podría causar un incremento en la fluorescencia de superficie celular de la proteína de fusión GPCR CAM/GFP mientras que los ligantes de antagonista/agonista inverso causan un incremento en la internalización de una proteína de fusión GPCR WT/GFP. Utilizando fluorimetria de microplaca como el sistema de detección los ligantes de antagonista o agonista inverso podrían causar un incremento en la fluorescencia celular total en células que expresan la proteína de fusión GPCR CAM/GFP mientras que los ligantes de agonista podrían causar una reducción en la fluorescencia celular total en células que expresan una proteína de fusión GPCR/GFP. Materiales y Métodos II Construcción de formas etiquetadas como GFP del 3CAMa1 B-adrenoceptor. La producción y subclonación de las formas etiquetadas como GFP terminalmente en C de tipo silvestre y formas 3CAM (R288K, K290H, A293L) del a? B-adrenoceptor de hámster se llevó a cabo en dos etapas separadas. En la primer etapa la secuencia de codificación de una forma modificada de GFP se modificó por amplificación de reacción de cadena de polimerasa (PCR). Utilizando la carga de inicio con terminal amino 5'-GGAAGGTACCAGTAAAGGAGAAGAACTT-3 el Met de inicio de GFP se removió y tanto un sitio de restricción Kpn I (subrayado) como un espaciador de 2-amino ácido (Gly-Asn) se introdujeron. Utilizando la carga de inicio con terminal carboxi 5- TGCTCTAGATTATTTGTATAGTTCATCCATGCCATG-3' un sitio de restricción Xba I (subrayado) se introdujo aguas debajo del codón de detención de GFP. El fragmento amplificado de GFP digerido con Kpn I y Xba I se subclonó en vector de expresión pcADN3 similarmente digerido (Invitrogen). Para obtener las proteínas de fusión a1 B-adrenoceptor-GFP, la secuencia de codificación de cada forma del a1 B-adrenoceptor se amplificó por PCR. Utilizando la carga de inicio con terminal amino 5'-GACGGTACCTCTAAAATGAATCCCGAT-3'. un sitio de restricción Kpn I (subrayado) se introdujo aguas arriba del Met iniciador. Utilizando la carga de inicio con terminal carboxi 5'- GTCCCTGGTACCAAAGTGCCCGGGTG-3'. un sitio de restricción Kpn I (subrayado) se introdujo inmediatamente aguas arriba del codón de detención. Finalmente, la construcción de GFP en pcADN3 se digirió con Kpn I y se ligaron juntos con el producto de PCR de la amplificación del aiB-adrenoceptor también digerido con Kpn I. Las estructuras de lectura abierta así producidas representan la secuencia de codificación de ya sea ai B-adrenoceptor-GFPs de tipo silvestre o 3CAM. Cada uno se secuenció completamente antes de su expresión y análisis. Transfección Estable y Transitoria de Células HEK293 Como se describe previamente en Material y Métodos I. Preparación de membranas Las células HEK293 que expresan cada una de las proteínas de fusión a?B-adrenoceptor-GFP se desarrollaron para confluenciar en cubetas de cultivo de 6 cm. Antes de la recolección, las células se enjuagaron dos veces con 4 ml de regulador TE frío (10 mM Tris, 0.1 mM EDTA pH 7.5) y después se rasparon en 1 ml del mismo regulador. La ruptura de las células se logró con 25 golpes de un homogeneizador Dounce de vidrio portátil en hielo. La suspensión se centrifugó a 16000 x g por 1 5 min y las pastillas resultantes se resuspendieron en regulador TE frío para concentraciones de proteína final de 0.035-0.16 mg/ml. Experimentos de unión de [3H]Prazosin Los experimentos de unión se iniciaron por la adición de 0.7-3.2 µg de proteína de membrana a un regulador de análisis (75 mM Tris/HCl (pH 7.5), 5 mM EDTA, 12.5 mM MgCI2 (regulador A) que contiene [3H]prazosin (2 nM). La unión no específica se determinó en la presencia de 1 0 µM de fantolamina. Las reacciones se incubaron por 30 min a 30°C y el ligante unido se separo del ligante libre por filtración al vacío a través de filtros GF/B. Los filtros se enjuagaron dos veces con regulador A y el ligante unido se estimó por espectrometría de centelleo líquido. La unión específica se despliega. Microscopía de exploración de láser confocal Como se describe previamente en Materiales y Métodos I. Ejemplo 3 - Supraregulación del am-adrenoceptor 3CAM pero no de tipo silvestre de hámster por demanda de antagonista/agonista inverso sostenida Las construcciones que codifican la proteíná GFP enlazada en estructura tanto con las formas de tipo silvestre como 3CAM del a?B-adrenoceptor de hámster se prepararon como arriba (Materiales y Métodos II). Una descripción más detallada de las mutaciones en la secuencia de aminoácido primaria de a1 B-adrenoceptor de tipo silvestre que da origen a varias formas (R288K, K290H, A293L), de a1 B-adrenoceptor mutante constitutivamente activo (CAM) se muestra en la Figura 9. Tales construcciones se utilizaron para transfectar células HEK293 seguidas por la selección de células transfectadas que expresan ya sea el a?B-adrenoceptor de tipo silvestre o 3CAM como antes (Materiales y Métodos I - transfección estable y transitoria de células HEK293). Tales células se utilizaron en los estudios de unión del ligante [3H] para valorar el nivel de expresión del receptor. La supraregulación de fluorescencia se observó en el tratamiento de células que expresan la construcción de fusión a?B-adrenoceptor CAM/GFP con un rango de agonista inverso/antagonista de a1 B-adrenoceptor (Figura 10A (b)-(d)). Sin embargo, el tratamiento de las células que expresan la construcción de fusión a1 B-adrenoceptor de tipo silvestre/GFP con los mismos ligantes, como para 3CAM de arriba, dejó de dar como resultado cualquier supraregulación de la construcción , como intensidad de fluorescencia y el patrón de distribución se modificó poco por los tratamientos de medicamento (Figura 10B (b) -(d)) en comparación con los tratamientos de vehículo solamente (Figura 10B (a)).- Los estudios equivalentes tanto en a1 B-adrenoceptor de tipo silvestre como 3CAM con la prazosina antagonista de ot?B-adrenoceptor se muestran en la Figura 10C. Puede observarse que la prazosin (PT) no tiene efecto en el a1 B-adrenoceptor de tipo silvestre mientras que tiene el efecto de supraregulación de la forma 3CAM mutante. Ejemplo 4 - Supraregulación ligante de la proteína de fusión OCIB-adrenoceptor CAM/GFP en células HEK 293 Métodos Las células HEK 293 que expresan de manera estable la construcción de a1 B-adrenoceptor de tipo silvestre/GFP o la proteína de fusión a1 B-adrenoceptor de mutante constitutivamente activo (CAM)/GFP se produjeron como se describe previamente en Materiales y Métodos II. Estas líneas celulares se utilizaron para investigar la supraregulación ligante de la proteína de fusión a1 B-adrenoceptor CAM/GFP. La supraregulación de la proteína de fusión se midió de acuerdo con una ganancia en fluorescencia celular total en un fluorimetro en base a placa. Las células se mantuvieron en Medio de Eagles Modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con 10% v/v de suero de bovino fetal (FCS), 2 mM L-glutamina y 1 mg/ml de geneticina (medio de crecimiento), todos los reactivos de Life Technologies) a 37°C en 5% de CO2 y 95% de humedad. Para los experimentos, las células se sembraron en placas de vista de 96 cavidades negras (Costar) el día antes del análisis. El día del análisis el medio de crecimiento se removió y reemplazó con medido DMEM libre de fenol rojo/F12 (1 : 1 ) que contiene 5% v/v de FCS, 2 mM L-glutamina en la presencia de varias concentraciones de compuestos de prueba (fenilefrina, fentolamina, WB4101 y HV723) en un volumen final de 100 µl. Las células se incubaron a 37°C por 22 horas. Después de la incubación la fluorescencia se detectó utilizando un fluorimetro Espectrofluor Plus Tecan. Para controlar la autofluorescencia de medios y de placa los resultados se calcularon al substraer una lectura de la placa en blanco de los valores de fluorescencia obtenidos en células tratadas con el medicamento. Resultados Las células HEK 293 que expresan establemente ya sea la proteína de fusión a1 B-adrenoceptor de tipo silvestre/GFP o a1 B-adrenoceptor CAM/GFP se trataron con un rango de compuestos para examinar la estabilización ligante de la expresión de la proteína de fusión. Cuatro compuestos se eligieron para este experimento, la fenilefrina agonista y tres compuestos previamente mostrados para desplegar actividad agonista inversa en este receptor; WB4101 , HV723 y fentolamina. El nivel de expresión de la proteína de fusión se determinó al detectar cambios en la expresión de GFP por fluorimetria de placa. Todos los compuestos probados no tuvieron efecto en el nivel de expresión de la proteína de fusión a1 B-adrenoceptor de tipo silvestre/GFP (Figura 1 1 ). Sin embargo, el tratamiento a largo plazo (22 hrs) de células que expresan la proteína de fusión a1 B-adrenoceptor CAM/GFP con estos compuestos causaron una supraregulación dependiente de la dosis de fluorescencia (Figura 1 1 ) con valores EC50 de 407(15-10471 )nM de fenilefrina, 676 (195-2344)nM para WB 4101 , 417(71 -2455)nM para HV 723 y 170(32-891 )nM para fentolamina. Ejemplo 5 - Curso cronológico de la supraregulación de la proteína de fusión aiB-adrenoceptor CAM/GFP en células HEK 293. Métodos El curso cronológico de la supraregulación ligante de la proteína de fusión a1 B-adrenoceptor CAM/GFP también se investigó. En este estudio, las células se sembraron y trataron con medicamento como se describe previamente pero la fluorescencia en la placa en blanco y las placas de célula se leyó en varios puntos en el tiempo entre 2-31 horas después de la adición del medicamento. Resultados Para todos los compuestos probados en la presente existe un incremento gradual en fluorescencia con el tiempo. En todos los puntos de tiempo EC50 para este efecto relacionado con la dosis no se cambiaron (Figura 12). La magnitud de la respuesta alcanzó un máximo después de aproximadamente 23 hrs de incubación con los compuestos. Después de éste tiempo, la respuesta permaneció relativamente constante. Materiales y Métodos III Construcción de proteínas de fusión ß2-receptor adrenérgico/luciferaza Tanto ß2-AR/Luc como ß2-AR/Rluc (CAM) se generaron como sigue. Un fragmento de ß2-AR se generó a través de amplificación de PCR de un gen ß2-AR existente que se ha clonado en pcADN3, la generación del fragmento de ß2-AR(CAM) también fue a través de la amplificación de PCR de una versión mutada de ß2-AR clonado en plásmido de vector pcADN3. Las mutaciones consistieron de 4 substituciones de aminoácido en ciclo intracelular 3 del receptor de dominio de transmembrana séptimo. Como estas fueron solamente las diferencias entre las dos versiones de ß2-AR, las cargas de inicio que se generaron por el procedimiento de PCR podrían utilizarse para generar tanto ß2-AR como su contraparte CAM. Las cargas de inicio son como sigue: carga de inicio delantero de extremo 5' 5'-AAA AAG CTT GCC ACC ATG GGG CAÁ CCC GGG AA-3' que incorpora tanto un sitio de clonación 5' HINDIII como secuencia Kozac. La carga de inicio de inversa de extremo 3' tuvo la secuencia 5'-CCT CTC GAG CAG TGA GTC AAT-3' que incorpora un sitio de clonación Xhol para permitir el enlace al gen de luciferaza de renilla. La introducción del sitio Xho l da como resultado una inserción de un residuo de glutamata en entre el gen ß2-AR y la luciferaza de renilla. También dio como resultado la alteración del último nucleótido en la secuencia de codificación de aminoácido de ß2-AR (G— >C), pero esto no alteró la secuencia de aminoácidos ya que el nuevo codón CTC todavía codifica un residuo de leucína. La luciferaza de renilla se generó similarmente a través de amplificación de PCR de un gen de luciferaza de renilla clonado en un vector de plásmido llamado pRLCMV(de promega). Las cargas de inicio utilizadas para la amplificación fueron como sigue: carga de inicio delantera de extremo 5' 5'-TCG CTC GAG ACT TCG AAA GTT TAT G-3', que incorpora un sitio Xhol en el extremo 5' del gen para permitir el enlace a ya sea el fragmento de ß2-AR o ß2-AR(CAM). La carga de inicio inversa tuvo la siguiente secuencia 5'-GCG TCT AGA TTA TTG TTC ATT TT-3' que incorpora un sitio Xbal en el extremo 3' del gen inmediatamente aguas abajo del codón de detención. Una vez que las reacciones de PCR se han llevado a cabo, los fragmentos resultantes se digirieron con las enzimas apropiadas y subsecuentemente se purificaron por gel, el vector de plásmido pcADN3 también se digirió con Hindlll y Xbal para proporcionar un vector recipiente para los fragmentos ligados. Las ligaciones se llevaron a cabo utilizando un equipo de ligación de ADN comercial (equipo de ligación de ADN de enlace rápido de CAMBIO), en el cual pcADN3 digerido, ß2-AR (o fragmento de ß2-AR(CAM)) y fragmento de luciferaza de Renilla se mezclaron y ligaron juntos. Esto se hizo secuencialmente, ligando los fragmentos de PCR juntos primero y después agregando el vector digerido, para producir las construcciones deseadas que se representan gramáticamente en la Figura 13. Procedimiento para medir la supraregulación mediada por medicamento de ß2-AR (CAM)/Rluc (Análisis de bioluminescencia) Una línea celular establemente transfectada de células HEK293 que expresa el ß2 (CAM)-adrenoceptor constitutivamente activo enlazado a luciferaza de Renilla reniformis de trinitaria de mar se utilizó para sembrar placas de microconcentración de 96 cavidades. La placa de 96 cavidades se incubó entonces durante la noche y el siguiente día las células fueron aproximadamente 80% confluentes. Las diluciones de medicamento se prepararon entonces: isoprenalina, betaxolol, sotalol e ICI 1 1 8 551 se pesaron frescamente el día del experimento, mientras que propranalol, salmeterol y salbutamol se prepararon utilizando 10e-2 de reservas prepesadas (disueltas en DMSO). Las soluciones de reserva para la curva de punto 10 se prepararon entonces utilizando ya sea 10e-2 o 1 0e-3 como el punto de concentración superior dependiendo del tipo de medicamento utilizado, tales diluciones se llevaron a cabo en medio libre de fenol rojo. 10 ul de cada una de ias soluciones de reserva de punto 10 se agregaron entonces a las cavidades de la placa de 96 cavidades diluyendo el medicamento 1 en 10 de manera que la concentración final más elevada del medicamento fue ya sea 10e-3 o 1 0e-4 dependiendo del tipo utilizado. Estas placas se incubaron entonces por 24 horas, tiempo después del cual los medios se pipetaron fuera de cada cavidad. 50 ui de medio libre de fenol rojo se agregaron entonces a cada cavidad más 50 ul de solución de luc-lite (un reactivo de equipo comercial que se optimiza para actividad de luciferaza de Renilla y también contiene un componente de lisis de célula suave). Finalmente 50 ul de 15 uM de coelenterazina en medio libre de fenol rojo se agregaron (para dar una concentración final de 5 uM). Las placas se analizaron entonces inmediatamente en un luminómetro de conteo superior para determinar la intensidad de la luz en unidades de luz relativas. Ejemplo 6 - Análisis de regulación inducida por ligante en niveles celulares de formas mutantes constitutivamente acticas de ß2-adrenoceptor enlazado a luciferaza de trinaría de mar Renilla reniformis Las construcciones de una forma mutante (CAM) del ß2-receptor adrenérgico (ß2-AR) enlazado a la proteína de luciferaza de Renilla reniformis se construyeron como se describe previamente (Materiales y Métodos lll; Figura 1 3). Tales construcciones se utilizaron para transfectar células HEK293, con células transfectadas que expresan las proteínas deseadas seleccionadas para uso adicional. Las células seleccionadas se trataron con diversos ligantes como se describe arriba (Materiales y Métodos lll - procedimiento para medir supraregulación medicada por medicamento de construcciones de fusión de luciferaza de ß2 (CAM)-receptor adrengérgico/ en/7/a reniformis. La Figura 14 muestra un diagrama esquemático en células tratadas con un ligante que se une a este receptor. La Figura 15 despliega los resultados obtenidos en el tratamiento de células que expresan construcciones de fusión ß2 (CAM)-adrenoceptor/f?e/7/7/a reniformis con ligantes. Puede observarse que los ligantes Isoprenalina, Betaxolol y Sotalol supraregulan la expresión del ß2 CAM-adrenoceptor en una manera dependiente por concentración. Materiales y Métodos IV Construcción de un receptor PAR1 mutado fusionado a GFP Una proteína de fusión se generó entre un mutante de PAR1 humano (Receptor Activado de Proteasa 1 ) y GFP. La internalización del receptor PAR1 ocurre a través de dos mecanismos. El receptor se internaliza constitutivamente y se recicla en la membrana celular en la ausencia de ligante. Después de la separación de trombina, y la activación del receptor, el receptor se internaliza y tiene como objetivo la degradación lisosomal (Shapiro, MJ y Coughiin, SR. J. Biol. Chem. 273, 29009-29014, 1 998). El receptor PAR1 mutante utilizado en este estudio contiene una mutación específica dentro de la parte posterior terminal C del receptor que elimina la internalízación del receptor constitutivo y el reciclado a la membrana. Esta mutación reemplaza los residuos de aminoácido 397-406 en el receptor de tipo silvestre con la secuencia AlaGIyAlaGIyAlaGIyAlaGlyGIyAla (Shapiro y Coughiin, 1998). Por lo tanto, después de la separación de trombina la proteína de fusión PAR1 /GFP mutante tendrá como objetivo el lisosoma para causar una reducción en la fluorescencia celular. El receptor PAR1 humano se clonó previamente correspondiendo al banco de gen M62424 (Vu, T et al., (1 991 ) Cell 64, 1057-1068). Como una primer etapa en la construcción de la fusión PAR1 /GFP el receptor se amplificó por PCR utilizando una carga de inicio sensible NB100 y carga de inicio antisensíble, NB101 que contiene un sitio de restricción BamHl (Tabla 1 ; subrayada). Durante PCR el codón de detención se remueve y el sitio BamHl se introduce en el extremo 3' de la estructura de lectura abierta PAR1 . El producto de PCR se ligó en Blunt pCR de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Invitrogen) para generar pCR/PAR1 -BamHI y la secuencia se verificó. Este plásmido se digirió utilizando las endonucleasas de restricción EcoR1 y BamH l para liberar la secuencia receptora que se liga entonces en pEGFP-N 1 similarmente digerido (Clontech) para generar una proteína de fusión PAR 1 WT/GFP (pPAR1 /GFP designada de plásmido). Con objeto de reemplazar los residuos de aminoácidos 397 a 406 del receptor PAR1 con la secuencia AlaGIyAlaGIyAlaGIyAlaGlyGIyAla dos reacciones de PCR se llevaron a cabo utilizando el receptor PAR1 WT en pCR/PAR1 -BamHI como el templado de PCR. La carga de inicio sensible NB102 (Tabla 1 ), que corresponde a los residuos de nucleótidos 504-526 de la estructura de lectura abierta PAR1 humana inmediatamente 5' a un sitio de restricción Pstl utilizando en las últimas etapas de clonación, y la carga de inicio antisensible NB103, que corresponde a los nucleótidos 1 167 a 1 187 que contienen una parte posterior de 13 nucleótidos que codifica los aminoácidos AlaGIyAlaGlu (negritas en la Tabla 1 ), se utilizaron el primer PCR. El segundo PCR utilizado en la carga de inicio de PCR sensible NB104 (Tabla 1 ), que corresponde a los residuos de nucleótidos 1217-1241 de la estructura de lectura abierta PAR1 humana que codifica los aminoácidos AlaGIyAlaGlyGIyAla (negritas en Tabla 1 ) y la carga de inicio antisensible NB105. Antes las cargas de inicio de PCR NB1 03 y 104 fueron 3' fosforiladas utilizando quinasa de polinucleótido T4. Después de la amplificación de PCR, los dos productos de PCR se ligaron juntos. El fragmento de ADN generado como resultado de la ligación se utilizó como templado en una reacción de PCR adicional utilizando cargas de inicio NB102 y NB101 para introducir un sitio BamHl en el extremo 3' de la estructura de lectura abierta PAR1 como antes. El producto de PCR se clonó en pCR Blunt (Stratagene). Este fragmento se secuenció para verificar que la mutación se ha introducido exitosamente. El fragmento mutado se excisó de pCR/Blunt después de la digestión con enzimas de restricción Pstl y BamHl y se subclonó en pPAR1 /GFP similarmente digerido para generar pPAR1 /mut/GFP. PARI mutGFP se excisó entonces de pPAR1 /mut/GFP después de la digestión con enzimas de restricción EcoRI y Notl y se subclonó en pCIN similarmente digerido para expresión mamífera estable (Rees, S. , ef al., Biotechniques 20, 102-1 10, 1996). Construcción de la línea celular estable Las células de CHO (Ovario de Hámster Chino) se transfectaron con pCIN/PAR1 mut/GFP utilizando el reactivo de Lipofectamina (Life Technologies) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las células transfectadas se seleccionaron en medio DMEM/F12 (1 : 1 ) que contiene 5% v/v de FCS, 2 mM L-glutamina y 1 mg/ml geneticina (todos los reactivos de Life Technologies). Después de 2 semanas, las células se clonaron por dilución para identificar los aislados clónales únicos. Los aislados clónales se expandieron sobre el pasaje y los clones que expresan la proteína de fusión PAR1 /GFP se identificaron al examinar la intensidad de fluorescencia por Elección Celular Activada por Fluorescencia (FACS). Formación de Imágenes confocales de internalización mediada por agonista de la proteína de fusión PAR1 mut/GFP Las células se desarrollaron en cubreobjetos de 24 mm en medios extraceluiares (125 mM NaCI, 5 mM KCl, 1 .8 mM CaCI2, 2 mM MgCI2, 0.5 mM NaH2PO4, 5 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 10 mM glucosa, 0.1 % BSA, pH 7.4). El cubreobjeto se montó en la cámara de formación de imágenes de un microscopio confocal de exploración láser NT TCS Lecia (Lecia RU Ltd). Las células se observaron con un lente objetivo de inmersión de agua 63XNA1 .2 Plan Apo. GFP se excitó utilizando un láser de argón/kriptón de 488 nm, se detectó una emisión de fluorescencia con un filtro de paso de banda 525 +/-. Una imagen se registró antes y 40 mín después de la adición del TRAP ligante de agonista PAR1 (1 0 µM). Las imágenes se manipularon utilizando software NT Lecia. Subregulación mediada por agonista de la proteína de fusión PAR1 mut/GFP detectada en un fluorimetro en placa. Las células se sembraron en placas de vista de 96 cavidades negras (Costar) el día antes del experimento. El medio de crecimiento se reemplazó con medido DMEM libre de fenol rojo/F12 (1 : 1 ) que contiene 2 mM L-glutamina y ya sea TRAP (10µM-1 nM) o trombina (1 -0.001 unidades/ml). Los medios también contuvieron 0.5 mM de tinte de Negro Brillante para absorber cualquier medio asociado con autofluorescencia. Las células se incubaron con compuesto por 4 horas a 37°C y la fluorescencia se detectó en el fluorimetro Espectro Plus Tecan. Para controlar la placa y la autofluorecencia de medios, los resultados se calcularon al substraer una lectura de la placa en blanco de los valores de fluorescencia obtenidos en las células tratadas con medicamento. Ejemplo 7 - Construcción de receptor PAR1 mutado fusionado a GFP u efecto del ligante agonista PAR1 en sus localización celular Resultados En las células HEK 293 establemente transfectadas para expresar la proteína de fusión PAR1 /mut/GFP, la fluorescencia de GFP se localiza principalmente en la membrana celular (Figura 16). Alguna expresión intracelular también se observa, que podría representar síntesis de proteína y tráfico a través del retículo endoplásmico y aparato de Golgi. Después de la adición de TRAP a las células la proteína de fusión migró lentamente lejos de la membrana celular en áreas intracelulares. No toda la fluorescencia se internaliza y solamente una proporción pequeña se degrada. Ejemplo 8 - Subregulación agonista de la proteína de fusión PAR1 mut/GFP Resultados Tanto TRAP como trombína causó una subregulación pequeña de la construcción de PAR1 mut/GFP cuando se midió por el fluorimetro de placa después de 4 horas de incubación (Figura 17). TRAP causó una reducción relacionada con la dosis en fluorescencia que alcanzó un máximo de aproximadamente 20% de pérdida en fluorescencia y por lo tanto la expresión. El efecto de trombina fue mucho menor, solamente causando una reducción máxima de aproximadamente 5%.

Tabla 1 Secuencia de los oligonucleótidos utilizados en este estudio 4-.

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Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1 . Un análisis para detectar un efecto que un compuesto tiene en una proteína de fusión receptor/reportador de membrana, que comprende las etapas de: a) agregar el compuesto a una célula que comprende dicha proteína de fusión receptor/reportador de membrana; y b) detectar cualquier cambio de dicha proteína de fusión receptor/reportador. 2. El análisis según la reivindicación 1 , caracterizado porque dicho análisis se utiliza para seleccionar los compuestos por su efecto en los receptores de membrana. 3. El análisis según la reivindicación 2, para seleccionar los compuestos que modulan la actividad de los receptores de membrana de tipo silvestre y/o mutantes. 4. El análisis según la reivindicación 3, caracterizado porque el receptor de membrana es un receptor de tipo silvestre y cualquier cambio se detecta como un reducción en la actividad de la proteína de fusión receptor/reportador. 5. El análisis según la reivindicación 3, caracterizado porque el receptor de membrana es un receptor mutante constitutivamente activo y cualquier cambio se detecta como un incremento en la actividad de la proteína de fusión receptor/reportador. 6. El análisis según cualquier reivindicaciones precedente, caracterizado porque dicho análisis se utiliza para identificar compuestos que interrumpen las interacciones del receptor de membrana normal, o pueden por sí misma interrumpir tales interacciones. 7. El análisis según cualquier reivindicación precedente para detectar un compuesto que sirve como un agonista inverso, antagonista o agonista del receptor de membrana. 8. El análisis según la reivindicación 7, caracterizado porque dicho agonista inverso, antagonista o agonista del receptor de membrana se utiliza en el estudio de la terapia o función del receptor. 9. El análisis según cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque dicho receptor de membrana es un receptor de factor de crecimiento, receptor de citoquina, canal de ion, integrina o receptor de proteína G. 10. El análisis según la reivindicación 9, caracterizado porque dicho receptor de membrana es un subtipo, mutante, homólogo o forma quimérica de un receptor de tipo silvestre. 1 1 . El análisis según la reivindicación 10, caracterizado porque dicho mutante es un mutante constitutivamente activo. 12. El análisis según la reivindicación 1 1 , caracterizado porque la proteína de fusión receptor/reportador mutante constitutivamente activa es inicialmente inestable, de tal manera que la actividad reportadora se detecta en un nivel basal y en donde después la unión de un compuesto a la proteína de fusión receptor/reportador se estabiliza y un incremento en la actividad reportadora se observa. 1 3. El análisis según cualquiera de las reivindicaciones 9-12, caracterizado porque dicho receptor acoplado de proteína G es un receptor de dopamina, un receptor colinérgico muscarínico, un receptor ß- adrenérgico, un receptor opiáceo, un receptor canabinoideo, un receptor de serotonina o un receptor activado de proteasa. 14. El análisis según cualquier reivindicación precedente caracterizado porque la proteína de fusión receptor/reportador se expresa de una construcción de ácido nucleico que comprende un gen que codifica dicha proteína reportadora que se fusiona en estructura al extremo 5' o 3' de un gen que codifica dicho receptor de membrana. 15. El análisis según cualquier reivindicación precedente caracterizado porque la funcionalidad de dicha proteína de fusión receptor/reportador de membrana no se afecta substancialmente por la fusión de la proteína reportadora al receptor. 16. El análisis según cualquier reivindicación precedente caracterizado porque dicha proteína reportadora es Proteína Fluorescente Verde (GFP), o variante activa de la misma. 17. El análisis según la reivindicación 16, caracterizada porque la luz emitida por dicha proteína de GFP se detecta por fluometria, FACS o técnicas de microscopía. 1 8. El análisis según cualquiera de las reivindicaciones 1 -15, caracterizado porque dicha proteína reportadora es Renilla reniformis (trinitaria de mar) proteína de luciferaza, fosfatasa alcalina placental secretada (SEAP), ß-lactamasa, galactosidasa, luciferaza de luciérnaga (Photinus pyralis), proteína fluorescente azul, proteína fluorescente amarilla, proteína fluorescente cian. 1 9. El análisis según la reivindicación 18 caracterizado porque, la proteína reportadora es luciferaza que se detecta en un luminómetro de microplaca o utilizando un sistema de formación de imágenes CCD. 20. El análisis según cualquier reivindicación precedente caracterizado porque dicha proteína reportadora se utiliza para localizar y/o cuantificar el receptor de membrana. 21 . Un análisis según cualquier reivindicación precedente caracterizado porque cualquier cambio de dicha proteína de fusión receptor/reportador de membrana se detecta como un cambio en localización celular de la proteína de fusión receptor/reportador, o semi-cuantitativamente por la síntesis o degradación de dicha proteína de fusión receptor/reportador. 22. Un análisis según cualquier reivindicación precedente caracterizado porque dicha detección de cualquier cambio de dicha proteína de fusión receptor/reportador de membrana se lleva a cabo con células colocadas en la superficie de una diapositiva de microscopio o lo similar. 23. El análisis según cualquier reivindicación precedente caracterizado porque dicha detección de cualquier cambio de s dicha proteína de fusión receptor/reportador de membrana se lleva a cabo en células colocadas en una cavidad de una placa de microconcentración o lo similar, tal como una placa de 96 cavidades. 24. Un análisis para detectar un compuesto que tiene un efecto en un receptor de membrana, que comprende las etapas de a) expresar una proteína de fusión receptor/reportador de membrana en una célula; b) detectar un nivel basal de actividad reportadora; c) agregar un compuesto prueba a la célula; y d) detectar una actividad resultante de la proteína reportadora, en donde la alteración de actividad reportadora con respecto al nivel basal se debe al compuesto prueba que tiene un efecto en el complejo de membrana . 25. El análisis según la reivindicación 24 caracterizado porque, el receptor de membrana es un receptor de tipo silvestre y la alteración es una reducción en la actividad reportadora. 26. El análisis según la reivindicación 24 caracterizado porque, el receptor de membrana es un receptor mutante constitutivamente activo y la alteración es un incremento en la actividad reportadora. 27. Una proteína de fusión receptor/reportador de membrana que comprende un receptor mutante constitutivamente activo que tiene un reportador agregado en estructura a la terminal C. 28. La proteína de fusión receptor/reportador de membrana según la reivindicación 27, caracterizada porque el receptor mutante constitutivamente activo es un GPCR. 29. La proteína de fusión receptor/reportador de membrana según cualquiera de la reivindicación 27 o 28, caracterizada porque la proteína reportadora es GFP o luciferaza. 30. Un compuesto identificado por en análisis de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 -26. 31 . El uso de un compuesto identificado por el análisis según cualquiera de las reivindicaciones 1 -26 en terapia.